FI85282C - Foerfarande foer framstaellning av permanenta djur- och humancellinjer. - Google Patents

Description

Menetelmä jatkuvien eläin- ja humaanisolulinjojen valmis tamiseksi ja niiden käyttäminen 1 85282

Keksintö koskee menetelmää, jonka avulla voidaan valmistaa jatkuvasti viljeltäviä eläin- tai humaanisolulinjoja ja käyttää näin saatuja solulinjoja solun aineiden valmistukseen.

Jo kauan on yritetty sekä tieteellisistä että käytännöllisistä syistä viljellä pysyvästi ihmis- ja eläinsoluja normaalista eläin- tai ihmiskudoksesta riippumattomina. Tämä ei ole tähän asti onnistunut tyydyttävästi ja ainoastaan harvoissa erikoistapauksissa on saatu aikaan joillakin verisoluilla pysyvä viljely.

On tunnettua käyttää monoklonaalisten vasta-aineiden valmistukseen, joilla on määrätty antigeenin sitomisspesifisyys, ns. hybridomatekniikkaa. Tämän Köhler'in ja Milstein'in kehittämän menetelmän mukaisesti /Continous culture of fused cells secreting antibody of predefined specifity, Nature 256, 495-497 (1975j7 voidaan yksittäinen vasta-aineita (AK) muodostava solu tehdä potentiaalisesti "kuolemattomaksi" ja lisäännyttää sitä mielin määrin. Fuusioimalla AK-muodostavia soluja (B-lymfosyytti) maligniksi muuttuneen solun (myeloman) kanssa voidaan luoda soluhybridejä, joissa yhdistyvät molempien emosolujen ominaisuudet: kyky valmistaa vasta-aineita ja kyky kasvaa jatkuvasti. Uusi sana "hybridoma" on muodostettu hybridi-solun ja myeloman yhdistämisestä.

Tämän tekniikan erikoisuuksien helpommin ymmärtämiseksi esitetään vasta-aineiden (immunoglobuliini, Ie) rakenteen ja synteesin eräitä perusteita. Ig-molekyyli muodostuu kahdesta identtisestä kevyt-(L)— ja kahdesta identtisestä raskas(H)-ketjusta. Kukin H- ja L-ketju on jakautunut geneettisesti ja funktionaalisesti erilaisiin osiin. Vasta-aineen antigeenin sitoutumispaikat (englanniksi: combining sites) ovat muodostuneet ns. muuttuviin alueisiin, joissa on korkea-asteinen sekvenssiheterogeenisyys. Useat aminohappovaihdokset synnyttävät suuren valikoiman kolmi- 2 85282 ulotteisia rakenteita, jotka ovat antigeenien suuren joukon kanssa komplementtisiä muodoltaan. Arvioidaan, että imettäväisellä on 106-107 erilaista antigeenin sitoutumispaikkaa.

Vasta-aineet ovat B-lymfosyyttien synteesituotetta. B-solun onkogeenisen kehityksen aikana kantasolusta kombinoituu yksi useista käytettävissä olevista muuttuvan alueen geeneistä suhteellisesti harvojen, pysyvien-alueiden-geenien kanssa, sekä L- että H-ketjussa. Niin pian kuin geeni-assosioituminen on tapahtunut, on kyseessä oleva B-solu jo määräytynyt siten, että se muodostaa vain yhden ainoan vasta-ainemolekyylityypin, ja tämä määräytyminen periytyy sen tytärsoluihin. Ilman antigeenin stimulointia B-solu pysyy lepotilassa eikä proliferoidu. Se tuottaa ja erittää vain vähän immunoglobuliinia, mutta se kantaa solumembraa-niinsa lujasti kiinnittyneenä vasta-aineita, joilla on tarkasti sama antigeenin sitoutumispaikka kuin eristetyillä vasta-aineilla. Kun jokin antigeeni tunkeutuu organismiin, se esitellään B-soluille lukuisten monimutkaisten solujen vuorovaikutusten yhteydessä.

B-solun, jonka membraanin immunoglobuliini reagoi antigeeniin spesifisesti, on pakko jakautua ja muodostaa klooni tytärso-luista, jotka erilaistuvat vasta-aineita tuottaviksi soluiksi (plasmasoluiksi). Koska B-soluklooni muodostaa vasta-aineita, joilla on identtinen rakenne ja identtiset antigeenin sitoutu-mispaikat, nimitetään tällaisen kloonin tuotetta "monoklonaali-seksi vasta-aineeksi" . Kompleksisen rakenteen omaavat antigeenit kuten proteiinit, mikro-organismit tai solut sisältävät useita erilaisia antigeeni-vaikutuskohtia (determinantit, epitoopit) ja ser. johdosta stimuloituvat useat eri B-solut jakautumaan ja muodostamaan klooneja. Tämän vuoksi muodostuu suuri joukko vasta-aineita, jotka eroavat toisistaan suuruutensa, varauksensa, ”1 spesifisyytensä ja af f initeettinsä suhteen ja esiintyvät immuniseerumissa yhdessä. Mutta myös yhtä ainoata determinanttia vastaan suunnattu immunivaste on tavallisesti polyklonaa- 3 linen. On tunnettua, että hiiret voivat muodostaa jopa 10 erilaista vasta-ainetta yhtä yksinkertaista hapteenia vastaan, so. yhtä eristettyä determinanttia vastaan. Nämä tosiseikat 3 85282 valaisevat, että on erittäin vaikeata, ellei mahdotonta tuottaa uudelleen jäljennettäväsi antiseerumia jotakin antigeeniä vastaan. Sen vuoksi on useita vuosia etsitty menetelmää, jonka avulla voitaisiin yksittäisiä B-soluja laajentaa klonaali-sesti, jotta päästäisiin tällä tavoin homogeenisiin monoklonaa-lisiin vasta-aineisiin. Luonnollisia esikuvia ovat olleet myelomat tai plasmasytomit, joita on tunnettu jo kauan malignei-na sairauksina hiirillä, rotilla ja ihmisillä. Myeloma syntyy, jos B-solu muuttuu maligniksi ja proliferoituu hillittömästi, jolloin klooni muodostaa tytärsoluista suuria määriä homogeenisiä vasta-aineita. Myelomia voidaan indusoida joihinkin umpisii-toshiirilaatuihin kemiallisen manipuloinnin avulla. Kaikki yritykset päästä kombinoimalla hyperimmunisointi ja myeloma-indusointi monoklonaalisiin vasta-aineisiin, joilla on tunnettu antigeenin sitoutumisspesifisyys, ovat kuitenkin jääneet tuloksettomiksi. Nämä ponnistelut ovat kuitenkin johtaneet myeloma-solulinjoihin, joita voitiin viljellä in vitro ja jotka ovat tulleet hybridoma-teknologian perusteeksi. Milstein'in ja Köhler'in perusidea oli kehittää hybridisolu fuusioimalla immunisoiduista eläimistä saatuihin normaaleihin B-soluihin viljeltävä ja jatkuvasti kasvava myelomasolu.

Ensimmäisissä kokeissaan he yhdistivät myelomasoluja hiiren pernasta oleviin lymfosyytteihin, jotka oli immunisoitu lampaan erytrosyyttien kanssa. He saivat 10 elinkykyistä hybridiä, joista kaksi muodosti vasta-aineita spesifisesti lampaan erytrosyyttejä vastaan. Vasta-aineita tuottavat hybridit olivat niin paljon myelomasolujen kaltaisia, että ne kasvoivat jatkuvasti viljelyssä ja muodostivat tuumoreita, kun ne istutettiin syngee-nisiin hiiriin. Suuri käytännön hyöty oli myös siitä, että hybridisoluja samoin kuin myelomasoluja voitiin varastoida nestemäisessä typessä ja säilyttää ne elinkykyisinä pitkiä aikoja.

Hybridoman valmistuksen tekniikka

Hiiret immunisoidaan kuten konventionaalisessa antiseerumin valmistuksessa antigeenillä, ja tavallisesti tämä toistetaan 4 85282 useiden viikkojen välein. Välittömästi ennen fuusioimista hiiri tapetaan ja sen perna leikataan pois aseptisissa olosuhteissa. Pernapussi avataan ja pernapulpa työnnetään varovaisesti ulos.

g

Pernalyirifosyytit ( noin 10 solua) suspendoidaan soluviljelyn elatusaineeseen ja sekoitetaan myelomasolujen kanssa suhteessa 1:1-10:1. Soluseos sentrifugoidaan ja painetaan tiiviisti putken pohjalle ja kun yläpuolella oleva neste on poistettu, sitä käsitellään fuusioväliaineen kanssa (30-50-prosenttinen polyetyleeni-glykoliliuos tai suspendoituja inaktivoituja Sendai-viruksia). Kun fuusioväliaine on pesty pois, siirretään soluseos, jonka solutiheys on noin 10° solua/ml steriilei-hin viljelyastioihin (täplälevyt) ja niitä viljellään inkubaat-torissa, johon johdetaan CO^-kaasua. 2-4 viikon kuluttua fuusiosta tulee hybridoma-kloonin kasvu näkyviin mikroskoopissa.

Tästä ajankohdasta lähtien voidaan viljelyn yläpuolella olevasta nesteestä tutkia vasta-aineiden olemassaoloa, jotka ovat halutun spesifisyyden omaavia. Tähän tarvitaan analyysimenetelmiä, joiden avulla saadaan selville alle mikrogramman suuruusluokkaa olevat vasta-aineet (RlA, ELISA, immunofluoresenssi). Positiivisten osaviljelyjen solut sen jälkeen kloonataan, so. perustetaan yksittäissoluviljelyjä. Eristetyt kloonit, jotka muodostavat "oikeata" vasta-ainetta, laajennetaan ja ne ruiskutetaan tuumorin indusointia varten Pristanilla esikäsiteltyjen syngeenisten hiirien vatsaonteloon (tavallisesti Balb/c umpi-siitettyjä hiiriä). 6-20 päivän kuluttua ymppäyksen jälkeen voidaan saada tuumorin alettua kasvaa verestä tai etupäässä vatsaontelosta (aszites) homogeenisiä vasta-aineita (tuotos on 30-150 mg monoklonaalisia vasta-aineita hiirtä kohti).

Fuusion jälkeen on olemassa hyvin heterogeeninen seos hybridejä ja ei-fuusioituneita soluja. Sellaisesta erästä, joka sisältää g 10 hiiren pernasolua, voidaan laskea saatavan maksimaalisesti 103 elinkykyistä hybridomasolua. Koska hybridisolut tarvitsevat määrätyn käynnistysajan ennen kuin ne voivat alkaa proliferoi-tumisen, mutta ei-fuusioituneet myelomasolut sen sijaan jatkavat heti kasvuaan, on varmistettava valintamenetelmällä vähien hybridomien eloonjääminen. Standardivalintamenettely hybridoma- 5 85282 tekniikassa perustuu ns. HAT-valintaelatusaineeseen /Littlefield, J.w.: Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science 145, 709-710 (1964//.

A tarkoittaa aminopteriinia, foolihappo-antagonistia, joka salpaa DNA-synteesin päätien. Normaalit solut voivat väistää aminopteriinisalpauksen tymidiini-kinaasin (TK) ja hypoksantiini-guaniini-fosforibosyyli-transferaasin (HGPRT) avulla, mikäli niille annetaan viljelyelatusaineeseen tymidiiniä (t) ja hypoksantiinia (H). Jos solulta puuttuu toinen näistä kahdesta entsyymistä, silloin se ei ole HAT-väliaineessa elinkelpoinen. Hybridoma-kehittämisessä käytetään sen vuoksi myelomasolujen mutantteja, joilta puuttuu TK tai HGPRT. Nämä solut ovat HAT-väliaineessa vain silloin elinkelpoisia, kun ne ovat fuusioituneita normaalin solun kanssa, joka tuo geenipoolinsa kanssa puuttuvan entsyymin hybridisoluun. Ei-fuusioituneilla pernan lymfosyyteillä on viljelyssä luonnollisesti rajoittunut elinikä, eivätkä ne sen vuoksi merkitse mitään uhkaa hybridomalle.

Hybridoman valmistuksessa esiintyy nyt seuraavia ongelmia: 1. Selektio HAT-väliaineen avulla

Ei-fuusioituneiden myelomasolujen kasvun selektiivinen tukahduttaminen on, kuten edellä on esitetty, hybridoma-kloonien tuottamisen olennainen edellytys. Mutta HAT-selektio on myös normaaleille, ei-vajaille soluille erittäin epäfysiologinen menetelmä, joka vaikuttaa solujen jakaantumis- ja elinkelpoisuuskykyyn. Erikoisesti ihmisen lymfosyyttien tapauksessa on äärettömän vaikeata sovittaa HAT-väliaineen komponentteja konsentraation puolesta siten, että HGPRT-negatiiviset solut kuolevat varmasti ja HGPRT-positiiviset solut sen sijaan voivat jäädä eloon.

Epäsuhdetta yhtäältä käytettyjen lymfosyyttien ja myelomasolujen lukumäärän ja toisaalta lisääntymiskykyisten hybridien tuotoksen välillä valaisevat seuraavat luvut: kun lisätään 10® hiiri- lymfosyyttiä tyypilliseen fuusioliuokseen, pidetään 500 hybridoma-kloonia yleensä oikein hyvänä tuloksena. Koska yhden hiiren pernassa - vaikka se on usein (hyper)-immunisoitu - ainoastaan yksi 10 -10 solusta muodostaa vasta-ainetta immunogeeniä 6 85282 vastaan (kuten on osoitettu Jerne'n levytekniikassa, N.V. Jerne ja A. A. Nordin: Science 140, 405 (1963))» täytyisi puhtaasti 3 4 sattumanvaraisessa hybridoman muodostamisessa kasvattaa 10 -10 kloonia, jotta voisi odottaa yhtäkään kloonia, jolla on haluttu vasta-ainespeisifisyys. Ihmishybridoman valmistuksessa on epäsuhde vieläkin karkeampi: pidetään hyvänä tuloksena, jos fuusiota kohti saadaan 4-10 hybridi-kloonia.

2. Kromosomimenetykset

Onnistuneen fuusion jälkeen täytyy vastasyntyneen hybridisolun tulla toimeen noin kaksinkertaisen kromosomimäärän kanssa kuin mitä luonto on alunperin aikonut. Kuten käytännön kokemus on osoittanut, on hybridisoluilla taipumuksena "kadottaa" kromosomeja. Jokaisessa solun jakautumisessa on olemassa vaara, koska kromosomeja on epäfysiologinen ylimäärä, että nämä eivät jakaudu tasan molempiin tytärsoluihin. Sillä tytärsolulla, joka saa vähemmän tästä ylimäärästä ja jota ei sen vuoksi enää pidetä luksustuotannossa mukana, on muihin nähden valintaetu ja siitä tulee dominoiva solu viljelyssä. Mutta immunoglobuliinin synteesi ei ole hybridisolun elinkelpoisuudelle tärkeätä, vaan se merkitsee "luksus" synteesisuoritusta. Tuottamattomien varianttien ilmestyminen hybridoma-kloonissa on sen vuoksi tavallinen tapahtuma ja vaatii hankalia uudelleenkloonaustoimenpitei-tä kloonin tuotantokyvyn varmistamiseksi. Taipumus, menettää kro-. . mosomeja on erikoisen voimakkaasti esillä lajien välisten hybridien kohdalla.

3. Hybridi-immunoglobuliini

Myelomasolut ovat maligneja B-soluja ja muodostavat itse immuno-globuliinia (antigeenien sitoutumisspesifisyys on tuntematon). Tämän kyvyn tuo myelomasolu kuten normaali B-solu mukanaan hybridomaan. Koska Ig-molekyylin eri ketjut syntetisoidaan erillään ja vasta jälkeenpäin kootaan täydellisiksi vasta-aineiksi, syntyy yhdessä hybridomasolussa, johon on syntetisoitu kaksi erilaista L- ja H-ketjua, sattumasta riippuen 10 erilaista kombinaatiota, joista etsitty "oikea" vasta-aine on ainostaan 7 85282 1/16 koko Ig-määrästä. Sen vuoksi on jo kehitetty suurin kulutuksin hiiri-myeloma-solu-mutantteja, jotka itse eivät muodosta mitään H- tai L-ketjuja. Ihmislymfosyyttien fuusiota varten ei kuitenkaan vielä tähän mennessä ole käytettävissä yhtä pitkälle kehitettyä myelomalinjaa.

Vielä vakavampia ongelmia on olemassa hybridomatekniikan vaihtoehdoissa: 1. B-lymfosyyttien tekeminen kuolemattomiksi virusten avulla Normaalilta luovuttajalta saatuja ihmisen B-lymfosyyttejä voidaan muuttaa maligneiksi infektoimalla Epstein-Barr-viruksen (EBV) avulla. EBV-ympättyjä, lymfoblastoideja soluja voidaan viljellä in vitro jatkuvasti ja kloonata. Verrattuna hybrido-maan tuottavat EBV-lymfoblastoidilinjat kuitenkin vain 1/10 tai vähemmän immunoglobuliineja ja tuottamisstabiilisuus on epätyydyttävä. Oletetaan/ että B-sclut jossakin aikaisemmassa erilaistumisvaiheessa määräytyvät EBV:n vaikutuksesta ja sen vuoksi saadaan suhteettoman usein klooneja, jotka tuottavat IgM:ää hyvin pienessä määrin.

Analogisella tavalla voidaan hiiren B-lyir.fosyyttejä muuntaa Abelsonin hiirileukemiaviruksen (MuLV) avulla. Myös tässä tapauksessa määräytyvät lymfosyytit epäedullisesti varhaisessa erilaistumisvaiheessa ja ovat huonoja vasta-aineen tuottajia.

2. Ei-muunnettujen B-lymfosyyttien pitkäaikaisviljelyt Uusimmat julkaisut /B. Spredni et ai. Long-term culture and cloning of nontransformed human B-lymhocytes. J. Exp. Med. 154, 1500-1516 (1981), M. Howard et ai. Long-term culture of normal mouse B-lymphocytes. Proc.Natl.Acad.Sei. USA lehdistössä/ tekevät selkoa mahdollisuudesta viljellä ja kloonata B-lymfosyytte-jä jatkuvasti ilman muuntamista erikoisissa viljelyolosuhteissa (jatkuva mitogeeninen stimulointi; lymfokiini-konditioidut ela-tusaineet jne.). Monoklonaalisten vasta-aineiden rutiininomaiseen valmistukseen eivät nämä menetelmät kuitenkaan varmasti vielä sovellu.

8 85282

Tekniikan taso voidaan sen vuoksi esittää yhteenvetona seuraavasti :

Normaaleilta luovuttajilta saatuja B-lymfosyyttejä voidaan tehdä keinotekoisesti "kuolemattomiksi". Hybridomatekniikka käyttää eläviä, viljelyssä rajattomasti lisääntymiskykyisiä myelomasoluja, jotka fuusioidaan antigeenillä stimuloitujen B-lymfosyyttien kanssa. Solu-solu-fuusion kautta aikaansaadut hybridisolut eristetään HAT-valinnan avulla ja kloonataan perustamalla yksittäissoluviljelyjä. Hybridomakloonit, jotka muodostavat vasta-aineita, joilla on haluttu spesifisyys, pannaan lisääntymään monoklonaalisten vasta-aineiden massatuotantoa varten. Huomattavia haittoja esiintyy kuitenkin HAT-valinnan yhteydessä kromosomien häviön ja hybridin immunoglobuliinin vuoksi.

Eräässä toisessa menetelmässä muunnetaan B-lymfosyyttejä malig-neiksi infektoimalla spesifisten virusten avulla ja muutetaan ne jatkuvasti kasvaviksi soluiksi säilyttämällä vasta-aine-synteesi. Ne ovat kuitenkin tunnetusti heikkoja vasta-aineen tuottajia.

Mitä tulee monoklonaalistenvasta-aineiden massatuotantoon, joilla on määrätty antigeenin sitoutumisspesifiteetti, on hybridomatekniikka selvästi parempi kuin vaihtoehtoinen tekniikka.

Mutta myös hybridomatekniikassa on painavia varjopuolia. Tärkein varjopuoli on siinä, että menetelmä rajoittuu yhtäältä HAT-herkkiin fuusion osapuoliin, toisaalta harvoihin solulajei-hin, nimittäin lymfosyytteihin ja herraosoluihin. Keksinnön tehtäväksi on asetettu poistaa nämä varjopuolet ja luoda uusi edullinen menetelmä, jolla voidaan jatkuvasti viljellä eläin-ja humaanisolulinjoja.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti menetelmän avulla, jolla saadaan jatkuvasti viljeltäviä eläin- ja humaanisolulinjoja fuusioimalla normaaleja eläin- ja humaanisoluja biologisten komponenttien kanssa, jotka aiheuttavat in vitro viljeltävyys-kyvyn, ja menetelmä on tunnettu siitä, että normaaleja eläin- 9 85282 ja humaanisoluja fuusioidaan muunnettujen solujen solufrag-menttien kanssa, jotka eivät yksinään ole lisääntymiskykyisiä, ja viljellään näitä viljelyn elatusaineessa ilman valinta-aineita .

Keksinnön mukaisessa menetelmässä on oleellista, että fuusiossa käytetyt fragmentit ovat täysin vapaita soluista, jotka ovat vielä lisääntymiskykyisiä, eivätkä ne yksinään voi myöskään enää lisääntyä.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä partnerin, joka ei ole suvustaan huonontunut, siis normaalin solun, sytoplasmaosan liikapaino ei yllättäen johda suvustaan huonontuneiden solujen malignien ominaisuuksien loppumiseen ja siten jatkuvan kasvukyvyn ehkäisyyn, vaikka on tunnettua, että muunnettujen solujen ja normaalien, ei-malignien solujen sytoplasman fuusion kautta malignisuus häviää /W.J. Shay et ai.: Supression of tumorigeni-city in Hybrids J. Supramol.St.Cell.Biochem. 16, 75-62 (1981j7· Samoin ei voitu etukäteen tietää yhtyvätkö solutumat malignien solujen eristettyjen tumien kanssa, esimerkiksi myelomatumien kanssa yhdeksi yhteiseksi genomiksi, jos myeloman sytoplasmaa ei tuoda mukana hybridiin.

Fuusioituminen tapahtuu tunnettujen menetelmien mukaan tarkoituksenmukaisesti fuusiogeenisten aineiden, etupäässä polyety-leeniglykolin tai Sendai-virusten läsnäollessa, koska tämän kautta, analogisesti hybridomatekniikan kanssa, aikaansaadaan fuusioitumistuloksen paraneminen. Ammattimies tuntee muitakin fuusiogeenisiä aineita ja niitä voidaan myös käyttää.

Muunnettujen solujen esimerkiksi myelomasolujen fragmentteja voidaan saada tunnetuilla menetelmillä. Solun seinämä etupäässä joko liuotetaan tai särjetään mekaanisesti. Tarvittaessa voidaan sentrifugoimalla erottaa tumafraktiot sytoplasma-fraktioista ja käyttää fraktioita yksinään. Parhaana pidetään liuottamista siten, että annetaan solujen paisua glyseriinissä ja siirretään ne sitten glyseriinivapaaseen puskuriliuokseen. Tämä aiheuttaa solun membraanien puhkeamisen. Eräässä toisessa ίο 8 5282 suositussa menetelmässä valmistetaan karyoplasteja ja syto-plasteja käsittelemällä soluja Cytochalasin B:n avulla, joka on kaupasta saatavaa antibioottia. Tämä menetelmä on tunnettu Biochem. Biophys. Res. Comm. 63:sta, 669-674 (1975). Tässä menetelmässä esiintyy eräänlainen "solunjakaminen" yhtäältä ainoastaan solun membraanin ympäröimään solutumaan, karyoplastiin ja toisaalta samoin membraanin ympäröimään, tumattomaan sytoplasmaan niin sanottuun sytoplastiin. Molemmat ovat osoittautuneet keksinnön piirissä samalla tavoin fuusioon sopiviksi kuin joko liuottaen tai mekaanisesti saadut solufragmentit tai tumat tai sytoplasmatraktiot, joita ei enää ympäröi solu-membraani. Mekaaninen aukaisu voi tapahtua ammattimiehen hyvin tuntemien menetelmien avulla, joita ei tässä ole tarpeen selostaa.

Solufragmentit voidaan käyttää tuoreina välittömästi valmistuksensa jälkeen tai vasta myöhemmin fuusioimisessa, jolloin jälkimmäisessä tapauksessa on osoittautunut säilytyksessä lyofili-soitu tila edulliseksi.

Muunnetuilla soluilla tarkoitetaan sellaisia, jotka in vitro ja in vivo eivät enää tottele normaaleja kasvusääntömekanis-meja. Esimerkkejä tästä ovat maligneiksi muuttuneet solut kuten syöpäsolut, virusinfektion muuttamat solut (esimerkiksi Eppstein-Barr-virus) ja karsinogeenisten aineiden muuttamat solut.

Jos keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään solufraktioita, ei näiden tarvitse olla täysin puhtaita, mutta ne eivät kuitenkaan saa sisältää mitään kokonaisia lisääntymiskykyisiä soluja.

Keksinnön olennainen tuntomerkki on se, että saatuja hybridejä ei panna kilpailemaan lajistaan huonontuneiden, ei-hybridien in vitro kasvatettavien solujen kanssa ja sen vuoksi niiden kasvua ei myöskään saa estää HAT-valinta-aineilla. Tällä tavoin poistetaan HAT-valinta-aineen hyvin epäedullinen vaikutus 11 85282 hybrideihin ja saavutetaan ratkaiseva parannus tuotoksessa ja jatkuvasti viljeltävien solujen elinkyvyssä.

Lisäksi ei keksinnön mukaan ole enää edellytyksenä hybridin muodostukselle käyttää lajistaan huonontuneena soluna HAT-herkkää solua. On useita jatkuvasti kasvavia solulinjoja, joilla ei ole lainkaan HAT-herkkyyttä ja jotka eivät ole olleet konventionaaliselle hybridoma-tekniikalle käyttökelpoisia, mutta joita voidaan käyttää keksinnön piirissä fragmenttien valmistukseen fuusiota varten.

Solut pakotetaan cytochalasin B:n avulla (sienimetaboliitti) hyvin voimakkaasti pullistuen "pursottamaan" tumansa. Painovoimien vaikutuksesta (esimerkiksi sentrifugoiminen) repeää ohut sidos helposti poikki. Tällöin syntyy tumaton soluruumis (sytoplasti) ja tuma, jota ympäröi solun membraani ja kapea sytoplasmareuna (karyoplasti tai minisolu). Karyoplasti ja sytoplasti eivät ole kumpikaan lisääntymiskykyisiä, mutta ne säilyttävät spesiaalifunktionsa joistakin tunneista muutamiin päiviin. Tuman pursottaminen ulos vaatii suhteellisen korkean cytochalasin B:n konsentraation ja on niin kauan kuin yhteys ei katkea, täysin reversiibeli. Pienemmät cytochalasin B:n konsentraatiot estävät solun jakautumisen mitoosin jälkeen ilman tuman pursottamista. Standardimenetelmän sytoplastin ja karyoplastin valmistamiseksi ei-adherenteille soluille ovat selostaneet M.H. Wigler ja I.B. Weinstein: Preparative method for obtaining enucleated mammalian cells, Biochem.Biophys.

Res.Comm. 63, 669-674 (1975).

On käynyt vielä selville, etteivät ainoastaan edellä mainitut B-lymfosyytit vaan myös kaikki muut tähän asti tutkitut eläin-ja ihmissolut voidaan tehdä "kuolemattomiksi" keksinnön mukaisesti (kts. esimerkit 6-8). Niin erilaisia solutyyppejä kuin T-lymfosyyttejä (solujen välittämän immuniteetin kantajat ja immunisysteemin säätäjäsolut), endoteelisoluja (ihmisen napanuoralaskimoiden seinämäsolut) ja melanomasoluja (eristetty alhaisessa lämpötilassa säilytetystä tuumorimetastaasimateriaa-lista) voitiin keksinnön mukaisen menetelmän avulla saada i2 85282 jatkuvasti kasvamaan (kuolemattomiksi).

Täten on keksinnön mukaisen menetelmän avulla mahdollista ottaa viljelyyn mitä tahansa eläin- ja ihmissoluja ja ratkaista tällä tavoin probleema kuinka voidaan valmistaa solun tuotteita kuten esimerkiksi vasta-aineita, hyytymistekijöitä, entsyymejä ja muita solun syntetisoimia aineita in.vitro. Keksinnön mukaiset viljelyt mahdollistavat myös sen, että kemiallisten aineiden tutkimuksissa käytetyt koe-eläimet tulevat suuressa määrin tarpeettomiksi.

Keksinnön kohteena on vielä keksinnön mukaisen menetelmän avulla valmistetun, jatkuvasti kasvatettavan solulinjan käyttäminen solun tuotteiden kuten monoklonaalisten vasta-aineiden, hyyty-- mistekijoiden, lymfokiinien, entsyymien ja muiden proteiineihin tai toisiin aineryhmiin kuuluvien solutuotteiden saamiseksi.

Keksinnön tämän toteutusmuodon mukaisesti voidaan erikoisesti, kun käytetään jatkuvasti kasvatettavia B-lymfosyyttejä, valmistaa monoklonaalisia vasta-aineita, kun käytetään jatkuvasti kasvatettavia endoteelisoluja, melanomasoluja, hepatosyyt-tejä, munuaissoluja ja muita niiden kaltaisia, saada hyytymistekijöitä, kun käytetään jatkuvasti kasvatettavia T-lymfosyyt-tejä + B-lymfosyyttejä tai/ja makrofageja saada lymfokiinejä, kun käytetään jatkuvasti kasvatettavia rauhassoluja saada rauhasten erittämiä tuotteita kuten hormoneja ja senkaltaisia. Huomataan siis, että aina keksinnön mukaisesti kuolemattomaksi tehtävien käytettyjen eläinsolujen laadun mukaan voidaan saada kaikkia hyödyllisiä solutuotteita, joten ei ole tarpeen tehdä niistä selkoa yksityiskohtaisesti.

Solutuotteiden saaminen ei ole kuitenkaan rajoittunut lähtö-solujen tuotteisiin, siis homologisiin solutuotteisiin. Keksinnön mukaisesti saatuja jatkuvasti kasvatettavia solulinjoja voidaan käyttää myös sellaisten solutuotteiden ottamiseen solusta, joita lähtösolut eivät ole muodostaneet, siis jotka ovat heterologisia ja joiden geneettinen informaatio tuodaan vasta 13 85282 geenien uudelleenkombinaation menetelmien mukaan jo pysyväiseen hybridisoluun, jotka siis ovat heterologisia. Hetero-logisten solutuotteiden valmistaminen pysyväisen hybridisolun avulla voidaan saada aikaan esimerkiksi muuntamisen avulla. Kokeet ovat osoittaneet, että keksinnön mukaiseen pysyväiseen soluun voidaan tuoda vektorin avulla DNA:ta ja käyttää siten soluun tuodun DNA:n koodilla varustettujen tuotteiden ottamiseen solusta.

Keksinnön mukaisia jatkuvasti kasvatettavia soluja voidaan käyttää vielä, kuten mainittu, myös vaikutusaineiden kokeilun kohteina. Sen lisäksi voidaan keksinnön mukaan saatuja kuolemattomia hybridisoluja käyttää myös geneettisen informaation lähteenä, joka koodaa halutut solutuotteet siten, että saadaan geneettisen informaation sisältävä hybridisolun osa siis sen genomi, genomin osia tai RNA:ta ja geenien uudelleenkombinoimis-menetelmien mukaan muunnetaan sopivaksi mikro-organismiksi ja saadaan tästä jälkimmäisestä haluttua solutuotetta.

Keksinnön erään muunnelman mukaan voi solutuotteiden valmistaminen kuten monoklonaalisten vasta-aineiden ja muiden solu-aineiden valmistaminen tapahtua myös niin, että muodostettuja hybridisoluja ei kasvateta suoraan solun tuotteiden valmistamista varten tai aineiden synteesiä varten, vaan muutetaan niiden genomi tai genomin osia tai RNA:ta geenien uudelleen-kombinoimismenetelmien mukaisesti sopivaksi mikro-organismiksi ja tätä jälkimmäistä kasvatetaan monoklonaalisten vasta-aineiden tai soluaineiden saamiseksi. Tässä keksinnön toteutusmuodossa eristetään hybridisolujen genomi ammattimiehen tuntemien menetelmien mukaisesti ja muutetaan se sopivan vektorin avulla, johon käytetään kaupasta saatuja vektoreja, tähän tarkoitukseen kehitettyjen standardimenetelmien mukaan sopivaksi mikro-organismiksi.

Muunnettua mikro-organismia viljellään sitten tavalliseen tapaan ja saadaan siitä haluttua solutuotetta. Mikro-organismina käytetään etupäässä erästä geenien uudelleenkombinoimi-sessa hyväksi osoittautunutta E.coli-kantaa.

i4 85282

Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä lisää. Niissä käytetään seuraavia lyhennyksiä ja tavaramerkkejä: AK Vasta-aine

Ig Immunoglobuliini H- tai L-ketju "Raskas" tai "kevyt" Ig-molekyylien proteiiniketju

Pristan 2,6,10,14-tetrametyyli-pentadekaani HAT-valintaelatus- Elatusaine, joka sisältää hypoksantiinia, aine aminopteriiniä, tymidiiniä TK Tymidiini-kinaasi HGPRT Hypoksantiini-guaniini-fosforibosyyli- transferaasi EBV Epstein-Barr-virus

MuLV Abelson-hiirileukemia-virus CB Cytochalasin B-antibiootti (Aldrich

Biochemicals, Milwaukee, USA) DMSO Dimetyylisulfoksidi DMEM Dulbecco'n minimal essential medium FKS Vasikan sikiön seerumi

Ficoll Polymeerinen raakasokeri (Pharmacia) PEG Polyetyleeniglykoli PBS Fosfaattipuskuroitu suolaliuos POD Peroksidaasi ABTS 2,2'-atsino-di-(3-etyylibentsotiatsoliini- 6-sulfonihapon ammoniumsuola) EBSS Earle'n tasapainoitettu suolaliuos RPMI 1640 Rosewell Park Memory Institut (Medium) RPMI-(elatusaine)

Tris Tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani PBL Perifeeriset veri-imusolut MNC Mononukleaariset solut (lymfosyytit, monosyytit) hTSH Humaani tyreoideaa stimuloiva hormoni β-hTSH ...n β-ketju FA Freund'in apuaine CFA Täydellinen Freund'in apuaine IFA Epätäydellinen Freund'in apuaine

Methocel 1500 Metyyliselluloosa (FLUKA) is 85282 CMV Sytoplasma-membraani-vesikkeli FITC-Covaspheres Fluoresein-isotiosyanaatti kuulien muodossa (Covalent Technicals Ann Arbor, Mich., USA) EAZ Ehrlich'in aszites-solut (ATCC; CCL 77)

Esimerkki 1 A. Linjan P 3X63 Ag 8.653 ATCC N0-CRL-1580 hiiren myelomaso-lujen karyoplastien ja sytoplastien valmistaminen analogisesti menetelmän kanssa, jonka ovat selostaneet M.H. Wigler ja I.B. Weinstein: A preparative method for obtaining enucleated mammalian cells. Biochem.Biophys.Res.Comm. 6_3, 669-674 (1975).

A.1 Ainekset.Cytochalasln B (CB, Aldrich Biochemicals, Milwaukee, USA) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO, Merck) (2 mg/ml) ja varastoitiin perusliuoksena 4°C:ssa.

Ficoll-400 (Pharmacia; polymeerinen ruokosokeri) liuotettiin uudelleentislattuun veteen (1 g/ml), pidettiin autoklaavissa ja varastoitiin 50-prosenttisena perusliuoksena -20°C:ssa.

Kertaalleen ja kahteen kertaan konsentroitu Dulbecco'n minimum essential medium (DMEM), vasikansikiön seerumi (FKS), L-gluta-miini (200 mmol/1), streptomysiini-penisilliini, valmistaja Boehringer Mannheim.

Selluloosanitraatti-putket steriloitiin UV-säteilyllä.

Myelomasolulinja Ag 8.653 ATCC CRL-1580: Linja on selostettu julkaisussa J.F. Kearney et ai.: A new mouse myeloma cell line that has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibodysecreting hybrid cell lines. J.Immunol. 123, 1548-1550 (1979). Se on atsaguaniiniresistentti, HAT-herkkä ja se ei syntetisoi H- eikä L-Ig-ketjuja. Sitä pidetään elatusaineessa DMEM + 15 % FKS + glutamiini + penisilliini-spreptomysiini + pyruvaatti (= DMEM-täyselatusaine) 37°C:ssa 7-prosenttisessa C02-atmosfäärissä.

ie 85282 7 A. 2 Menetelmät, Nukleonin poisto: 8 x 10 Ag 8.653-solua 3 sentrifugoitiin 5 min 10 UpM ja uudelleen suspendoitiin 12 ml:aan 12,5-prosenttista Ficoll-DMEM-CB-DMSO-liuosta niin kauan, kunnes oli saatu solukimpaleista vapaa suspensio.

Aina 3 ml solususpensiota pantiin neljä,12 h aikaisemmin esikäsi-teltyjen Ficoll-gradienttien päälle ja päällystettiin 2 ml:11a Ficoll-vapaata DMEM-CB-DMSO-liuosta. Putket gradienttien kanssa sentrifugoitiin ultrasentrifugissa 60 min ajan 25 000 UpM (31°C).

Kun sentrifugoiminen oli päättynyt, makroskooppisesti näkyvät fraktiot ("juovat") koottiin erikseen käyttäen apuna injektio-ruiskua, jossa on pitkä kanyyli, ylhäältäpäin, ja kuhunkin pantiin laimennukseksi 20 ml elatusainetta (DMEM ilman lisäaineita), sedimentoitiin sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen DMEM:ään.

Saatiin seuraavat 4 fraktiota: a) solujätettä (0 ja 12,5 % Ficoll-määrän rajalla), b) tumattomia sytoplasteja alueella, jossa 15-16 % Ficoll’ia, c) tumia ilman havaittavissa olevaa plasmareunaa ja noin 2 % tumattomia "soluja" 17 ja 25 % Ficoll-määrän rajalla, d) tuman sisältäviä, morfologisten kriteerioiden mukaan kokonaisia soluja, joissa on hyvin tunnistettavissa oleva plasma-reuna ja joitakin tumia ilman plasmareunaa sedimenttinä putken pohjalla.

7

Solujen laskennasta kävi selville, että 8 x 10 Ag 8r653-solus- C. f.

ta on b) kohdassa 1,25 x 10 sytoplastia, c) kohdassa 4 x 10 7 karyoplastia ja d) kohdassa 1,1 x 10 todennäköisesti kokonaista solua.

B. Hiiren pernasolujen fuusioiminen eristettyjen, kokeesta A saatujen myeloma-karyoplastien, -sytoplastien ja -sedimentti-solujen kanssa.

B.1 Ainekset

Fuusiointiaine: 20 g polyetyleeniglykolia (PEG-4000) sulatettiin i7 85282 autoklaavissa, jäähdytettiin 56°C:een ja sekoitettiin tässä lämpötilassa 20 ml:n kanssa DMEM:ää.

HAT-valinta-aine: DMEM-täyselatusaineeseen pantiin aminopte- «7 <| riiniä (4 x 10 M), tymidiiniä (1 x 10~ M) ja hypoksantiinia (3,1 x 10"5 M) .

Viljelysastiat: Costar-firman, Cambridge, Mass. USA valmistamaa harsokankaista viljelyalustaa Tissue Culture Cluster-24 ja Cluster-96.

B.2 Menetelmät

Fuusioiminen: Kokeessa A preparoidut fraktiot b), c) ja d) sekoitettiin erillisissä astioissa, joissa oli pernasoluja, suhteessa 10:1 ja sedimentoitiin sentrifugoimalla. Yläpuolella oleva neste otettiin varovasti pois. Sedimenttiin lisättiin 0,8 ml 50-prosenttista PEG-liuosta (37QC:ssa, tasaisesti 1 min aikana ja koko ajan kevyesti ravistelemalla) ja sitten 5 ml DMEM:ää (huoneen lämmössä, tasaisesti 5 min aikana). Kun oli vielä lisätty 20 ml DMEM:ää, solut sedimentoitiin, suspendoitiin uudelleen tuotteeseen DMEM-täyselatusaineeseen (5 ml) ja jaettiin 10:een,"feeder-soluilla" päällystettyyn Costar-24 täplä-kudosviljely-astiaan. Yksittäisviljelyjä "ruokittiin" DMEM-täyselatusaineella päivinä 1, 2, 3, 5, 7, 10 ja 13.

Feeder-solut (vatsaontelon makrofagit): Fuusion edellisenä päi vänä tapettiin iskemällä umpisiitettyjä (Balb/c)-hiiriä. Steriileissä olosuhteissa ruiskutettiin 4-5 ml PBS:ää vatsaonteloon ja 1 min kuluttua imettiin se takaisin. Solut huuhdottiin, pestiin DMEM:ssä, suspendoitiin täyselatusaineeseen tihey- 5 dellä 2 x 10 solua/ml ja jaettiin 0,5 ml:n annoksina Costar-24 täpläastioihin.

Pernasolut: Balb/c-hiireltä otettiin välittömästi ennen fuu sioimista aseptisissa olosuhteissa perna ja sen solut suspendoitiin DMEM:ään. Soluaggregaatit ja kudospalaset suodatettiin harsokankaan läpi.

18 85282 ELISA-hiiri-immunoglobuliini: Mikrotiitterilevyjen päälle pantiin lampaasta saatuja hiiri-Ig-vasta-aineita (IgG-frak-tio; 10 ^.ug/ml 0/9-prosenttinen NaCl-liuos; 150 ^ul vasta-aine-liuosta täpläastiaa kohti). 100 ^ul viljelyn päällä olevaa nestettä pipetoitiin kaikkiin päällystettyihin täpläastioihin ja inkuboitiin tunnin ajan huoneen lämmössä. Imettiin pois yläpuolella oleva neste ja pestiin kaksi kertaa täpläastiat, pantiin niiden päälle 100 ^ul anti-hiiri-Ig-POD-konjugaatti-liuosta (samaa vasta-ainetta kuin edellä; kovalentisti sidottuna piparjuuri-peroksidaasiin) ja inkuboitiin yksi tunti huoneen lämmössä. Pestiin kolme kertaa ja pipetoitiin täplä-astiaa kohti 100 ^,ul substraattiliuosta (ABTS) ja määrättiin värinmuutos fotometrisesti.

B.3 Tulokset A kohdan mukaisesti preparoidut sytoplasti-/ karyoplasti- ja sedimenttifraktiot fuusioitiin paralleellisesti Balb/c-hiiren pernasolujen kanssa ja jaettiin 10:een 1 ml;n viljelyyn. Osa-viljelyistä 5 ravittiin ilman (levy I), ja 5 HAT-lisän kanssa (levy II).

21:seen päivään saakka fuusiosta (n.F.) ei voitu missään täplä-astiassa nähdä lymfoidisolujen kasvua makroskooppisesti eikä mikroskooppisesta paitsi täplissä 4A, 4B, 4C, 3C ja 3D levyllä 1/ jotka sisälsivät sedimenttifraktion fusionaattia ilman KAT-elatusainetta. Näissä täplissä voitiin havaita jo 5 päivää fuusion jälkeen (n.F.) pesäkkeitä, jotka suurenivat nopeasti. Päivänä 8 n.F. annettiin näihin täpliin HAT-elatusainetta: 4 päivän kuluessa olivat kaikki näkyvät pesäkkeet kuolleet.

Päivänä 27 n.F. tuli ensiksi yksitellen, sitten lähes kaikissa täplissä pesäkkeitä näkyviin, ja ne muodostuivat suurista kuu-lamaisista läpinäkyvistä ei-adherenteistä kasvavista soluista. Päivänä 65 n.F. olivat kaikki täplät palatsi I-3B, II-1A, II-4A täynnä multippeleita lymfoidisolujen pesäkkeitä. Kun tutkittiin viljelyjen yläpuolella olevan nesteen hiiri-Ig-pitoisuutta sinä päivänä, huomattiin, kuten yhteenveto taulukossa 1 osoittaa, positiivia - voimakkaan positiivisia ELISA-arvoja kaikissa u 85282 osaviljelyissä paitsi edellä mainituissa pesäkkeettömissä täpläastioissa:

Taulukko 1 ELISA-hiiri-immunoglobuliinin osoittamista varten kokeen B viljelyjen yläpuolella olevissa nesteissä (päivä 65 fuusioimisen jälkeen) Täplä-viljelylevy I; ilman HAT'ia (Poikkeukset: 4A, 4B, 4C, 3C, 3D: + HAT, päivä 8 - päivä 15 " i 1 2 3 4 5 6 A 664 601 706 632 B 526 766 011 633 C 576 769 855 623 D 794 1500 791 t t ΐ 12 3 1 = Sytoplasti-fusionaatti 2 = Karyoplasti-fusionaatti 3 = Sediir.enttisolu-fusionaatti 2o 85282 Täplä-viljelylevy II: HAT'in kanssa (päivä 1 - päivä 14) 1 2 3 4 5 6 A 008 568 580 000 B 267 538 539 547 C 656 530 729\ 822 D 848 570 605 r t t 12 3

Negatiivinen kontrolli 1 (DMEM-täyselatusaine): · 010 Negatiivinen kontrolli 2 (DMEM, ilman FKS:ää): · 040 _ 3

Positiivinen kontrolli 1 (Hiiriseerumi 1 x 10 ): · 723 _ 2

Positiivinen kontrolli 2 (Hiiriseerumi 1 x 10 ): > 1500 a) Karyoplastien fuusioiminen hiiren pernasolujen kanssa johti in vitro lisääntyviin, immunoglobuliinia erittäviin soluihin. Vaikka ainoastaan pieni osa sytoplasmaa malignista partnerista tuotiin hybridiin, ei se aiheuttanut "jatkuvan kasvamisen" ominaisuuden häviämistä.

b) Karyoplastien kanssa synnytetyt hybridisolut syntetisoivat ja erittivät hiiri-immunoglobuliinia "hybridoman" määriä.

Ag 8.653:n sytoplasmaosan puuttuminen ei sen mukaan haitannut karyoplasti-pernasolu-hybridin tuottamis- ja erittämiskykyä.

c) Sytoplastien ja pernasolujen fuusiosta syntyi myös solu-klooneja, jotka proliferoituivat ja erittivät vasta-aineita in vitro. Tyydyttävää selitystä tälle erikoisen yllättävälle ilmiölle ei tällä hetkellä voida antaa.

2i 85282

Esimerkki 2

Solun fragmentoiminen glyseriinillä liuottamalla ja fuusioiminen humaaniveren lymfosyyttien kanssa.

Ainekset

Earle'n Balanced Salt Solution (EBSS), elatusaine APMI 1640, vasikan sikiön seerumi (FKS), valmistaja Boehringer Mannheim.

8-Azaguanin (8-Ag), valm. Serva (Heidelberg), Agar (Bacto-Agar 1614) valmistaja Difco (Fa. Hedinger KG, Stuttgart). Humaani-plasmasytotna-linja HS Sultan ATCC CRL-1484 sulatettiin kylmä-varastoidusta solumateriaalista ATCC-ohjeiden mukaan ja otettiin viljelyyn.

Menetelmän mukaan, joka on selostettu Proc.Natl.Acad.Sci. USA Tl, 2679-2633 (1974) viljeltiin 8 x 107 HS Sultan-solua 100 ml:ssa RPMI 1640-täyselatusainetta, joka sisälsi 20 ^uM 8-Ag, 48 h ajan. Eloonjäävät solut otettiin 10 ml:aan RPMI 1640-täys-elatusainetta, joka on ilman 8-Ag:tä, ja annettiin lisääntyä 10 vrk. Sitten solut istutettiin pehmeä-agarlevyille (P.COFFINO et ai.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA J58, 219-223 (1971), jotka oli valmistettu käyttäen RPMI 1640-täyselatusainetta + 20 ^,uM 8-Ag (noin 500 solua Petrimaljaa kohti) ja pidettiin C02~inkubaat-torissa. 9 päivän kuluttua otettiin erillään kasvavat koloniat steriilisti agarin yläpinnalta ja pantiin lisääntymään RPMI : 1640-täyselatusaine + 8-Ag:ssä. Yhtä kloonia (sitä merkittiin HS-SULTAN-6 Ag-Rl) , joka kasvoi siten,että se kaksinkertaistui noin 20 h:ssa, käytettiin seuraavaan kokeeseen. HS-Rl-solut olivat HAT-herkkiä: solut, joita viljeltiin tiheydellä 1-5 κ 105/ ml HAT-elatusainetta (RPMI 1640-täyselatusaine ja 0,1 mM hypoksantiinia, 400 nM aminopteriinia, 31 ^,uM tymidiiniä) eivät lisääntyneet ja kuolivat kaikki 7 päivän sisällä.

Humaanilymfosyytit (perifeerisestä verestä: PBL): 300 ml laski-moverta koottiin steriilisti hepariiniliuokseen (2 U/ml verta) ja eristettiin mononukleaaristen solujen fraktio (MNC: lymfosyy-

O

txt, monosyytit) standardimenetelmillä. 3 x 10 MNC suspen-doitiin 100 ml:aan RPMI 1640 + 10 % FKS, ja inkuboitiin mono-syyttien erottamiseksi 24 h viljelyastioissa 37°C:ssa 22 8 5 282 5<-prosenttisessa CC^-atmosfäärissä.

Menetelmät HS-Rl:n fragmentoiminen: M.Jett et al.: Isolation and characterization of plasma membranes and intact nuclei from lymphoid cells, J.Biol.Chem. 252, 2134-2142 (1977) selostuksen mukaisesti soluihin pantiin runsaasti glyseriiniä ja ne hajotettiin inkuboimalla 10 mM tris-HCl-puskurissa. Tumat erotettiin sentrifugoimalla, 200 g (10 min, 4°C) membraani-vesikkeleistä, jotka puolestaan sedimentoitiin sentrifugin avulla, 5000 g (4 min, 4°C).

g

Fuusioiminen: Noin 1 x 10 729 HS-Rl-tumia suspendoitiin humaanilymfosyyttien kanssa RPMI 1640:ssä suhteessa 1:1, ja kuten esimerkissä 1, B.2 on selostettu fuusioitiin PEG:n kanssa.

g

Membraanivesikkelien sedimentti noin 1 x 10 HS-Rl-solusta päällystettiin 1 x 107 humaanilymfosyytistä saadulla suspensiolla ja fuusioitiin PEG:n kanssa.

Kontrolliastiaan otettiin noin 2 x 107 HS-Rl-tumaa RPMI 1640-täyselatusaineeseen (ilman HAT'ia) ja viljeltiin neljässä Costar-24-täpläastiassa (X^-inkubaattorissa.

Kaikkia fusionaatteja ja kontrolliviljelyjä viljeltiin hiiren vatsaontelomakrofagien päällä kuten esimerkissä 1 on selostettu feeder-soluina.

Humaani-Ig:n osoittaminen viljelyn päällä olevasta nesteestä: Mikrotiitteri-ELISA kuten esimerkissä 1, B.2 on selostettu. Päällykseksi käytettiin immuniadsorptiivisesti puhdistettua anti-humaani-Ig:tä lampaasta. Samaa AK-preparaattia käytettiin anti-humaani-Ig-POD-konjugaatin valmistukseen. Lammas-AK reagoi kaikkien humaani-Ig-luokkien kanssa eikä osoittanut mitään ristireaktiivisuutta naudan tai hiiren Ig:n suhteen.

23 85282

Tulokset:

Fragmentoiminen glyseriini-tris-HCl-liuotuksen avulla: Käsit tely rikkoi HS-Rl-solut tumia sisältäväksi fraktioksi, joka sedimentoitui 200 g, ja tumattomaksi sytoplasma-membraani-vesikkeli-fraktioksi, joka sedimentoitui 5000 g:llä. Mikroskoopissa ei voitu havaita kummassakaan fraktiossa kokonaisia HS-Rl-soluja. Tumia ympäröi enemmän tai vähemmän säännöt-tömästi rajoittuneita sytoplasmariekaleita. Laskemalla saatiin tumasaaliiksi 85 %. Vesikkelifraktio sisälsi vähäisten solujen jäännösten lisäksi massaltaan 0,5-2 ^,um suuruisia vesik-keleitä ilman tunnettavia tuman osasia.

Viljely, jossa oli 2 x 10^ tumaa RPMI-täyselatusaineessa (ilman HAT'ia) ei johtanut 12 viikon tarkkailuaikana HS-Rl-solujen kasvuun.

Fusionaattien viljely: Tuma-lymfosyytti- ja sytoplasma- vesikkeli-lymfosyytti-fusionaatit jaettiin 96 tai 10 Costar-24-täpläastiaan ja viljeltiin puoliksi HAT-lisän kanssa ja puoliksi ilman sitä RPMI-täyselatusaineessa hiiri-makrofagien päällä. Toisesta viikosta lähtien fuusion jälkeen tulivat lymfoidi-solujen pesäkkeet näkyviin ja ne kasvoivat jatkuvasti suuremmiksi.

Humaani-immunoglobuliinin tuottaminen: Päivänä 21 fuusion jäl keen tutkittiin viljelyjen päällä olevat nesteet (päivänä 19 oli suoritettu täydellinen elatusaineen vaihto) humaani-immunoglobuliinin suhteen. Tulokset ovat taulukoissa 2a ja 2b.

24 85282

Taulukko 2a ELISA-koe humaani-immunoglobuliinin osoittamiseksi viljelyn päällä olevasta nesteestä (karyoplasti-fuusio, 21 päivää fuusioimisen jälkeen).

I + HAT I - HAT

123456 123456 A 029 147 286 147 228 270 A 660 233 175 270 410 322 B 171 086 050 144 846 121 B 103 264 229 253 271 260 C 118 156 250 082 179 059 C 045 343 370 128 150 126 ____i i ______________________L__ ! i D 120 1148 024 096 023 ! 151 D 171 173 141 116 218 1699' ||i _; 1__1_;

II + HAT II - HAT

-— --f" - - "T T" | ~~ f 123456 123456 A 135 290 107 279 530 674 A 381 235 489 514 608 217 B 116 500 469 315 315 627 B 348 239 214 158 367;163 .

C 120 050 068 159 226 145 C 185 275J235 234 j 322 316 1 i I 1 : . i d' 191 078 686 j 110 242 561 |D 1219 202 2 92 283 220 052 25 8 5282

Taulukko 2b

Sytoplasti-fuusio, 21 päivää fuusioimisen jälkeen 1 2 3 4 5 6 ! A 052 627 917 i ; B 041 326 715 ! ie 071 400 8261 0889 I D 079 917 1 494 1016 ΐ r i 12 3 1 = tuma-kontrolliviljely 2 = HAT'in kanssa 3 = ilman HAT'ia

Jos arvioidaan ekstinktioarvot 0-99 negatiivisesta epäilyttäviin, arvot 100-200 positiivisiksi, arvot yli 200 voimakkaan positiivisiksi, saadaan tumafuusion avulla saaduista viljelyistä seuraava jaottelu:

Tuma-lymfosyytit- Humaani-inmunoglobuliinin ETJSA-koe ^ot^a negatiivinen positiivinen voimakkaasti viljeltiin_^^___positiivinen n 11 18 19 HAT'in kanssa (n = 48) (%) (23) (37) (40) n 2 12 34

Ilman HAT'ia (n * 48) (%) (4) (25) (71)

Tuloksista käy seuraavaa ilmi: 26 85282

Fusionaatit, jotka valmistettiin käyttäen liuottamalla hajotettuja fraktiota, voidaan viljellä ilman HAT-valintaa. Menetelmä on paljon vähemmän työtä vaativa kuin Cytochalasin E-pursotus ja tuottaa fuusiokykyistä materiaalia hyvän tuotoksen. Selvää erottelua"tuma"- ja "sytoplasma-membraani"-fraktioihin ei synny kummassakaan menetelmässä. Sekä pääasiassa tuma-materiaalia sisältävä että pääasiassa sytoplasma-membraani-vesikkeliä sisältävä fraktio tuottaa fuusioituneena verestä saatujen humaani-lymfosyyttien kanssa in vitro lisääntymiskykyisiä, AK-tuottavia soluklooneja.

Rinnakkaiskoe tuma-lymfosyytti-hybridit HAT-lisän kanssa ja ilman sitä todistaa valinta-aineen negatiivisia vaikutuksia: HAT:in kanssa on 23 % primääriviljelyistä Ig-negatiivisia ja vain 40 % voimakkaasti positiivisia, ilman HAT:ia on yli 70 % voimakkaasti positiivisia ja vain 4 % Ig-negatiivisia.

Esimerkki 3

Immunisoidun hiiren pernasolujen fuusioiminen natiivisten ja fragmentoitujen myelomasolujen Ag 8.653 kanssa.

Ainekset

Tyreoideaa stimuloiva humaanihormoni (hTSH) ja sen eristetty β-ketju (β-hTSH) olivat peräisin Boehring'ilta Mannheimista.

•I Täydellinen ja epätäydellinen Freund'in apuaine (CFA, IFA) oli Difco'sta, Methocel 1500 oli Fluka'sta ja FITC-Covaspheres oli Covalent Tech. Co:sta, Ann Arbor, Michigan, USA.

Menetelmät

Immunisointi: Balb/c-hiiret immunisoitiin primäärisesti β- hTSH:11a (40 ^,ug CFA:ssa, intraperitoneaalisesti) (päivä 1) ja ne "tehostettiin" päivänä 196 hTSH:lla (50 yug IFA:ssa, i.p.), päivänä 266 hTSH:11a ilman apuainetta i.p. samoin kuin päivänä 294 hTSH: 11a intravenöösisti.

8

Pernasoluja (noin 1 x 10' ) saatiin yhdeltä immunisoidulta hiireltä 3 päivää viimeisen tehostusimmunisoimisen jälkeen kuten 27 85282 esimerkissä 1, B.2 on selostettu ja ne käytettiin puoliksi kahteen fuusioon.

7 7

Fuusio 1: 5 x 10 pernasolua ja 1 x 10 Ag 8.653-solua sekoi tettiin keskenään kuten esimerkissä 1, B.2 on selostettu ja viljeltiin niitä 48:ssa täplä-24-astiassa hiiren makrofagi-solujen kanssa HAT-pitoisessa DMEM-täyselatusaineessa.

Fuusio 2: 1 x 107 Ag 8.653-solua hajotettiin liuottamalla kuten esimerkissä 2 on selostettu käsittelemällä vaiheittain glyseriinillä ja 10 mM tris-HCl-puskurilla. Sytoplasma-membraani-vesikkeli-(CMV)-fraktio pelletoitiin (5000 g, 40 min, 4°C). Tumafraktio sekoitettiin 7 x 107 pernasolun kanssa, sentrifugoimalla kerrostettiin CMV-sedimentin päälle ja PEG:n kanssa, kuten esimerkissä 1 on selostettu B.2 kohdassa, fuusioitiin standardimenetelmän mukaan. Fusionaatti jaettiin DMEM-täyselatusaineessa 24:ään Costar-24-täpläastiaan makro-fagien kanssa ja viljeltiin ilman HAT-lisää.

Hybridisolujen antigeenispesifinen merkitseminen ja kloonaus: (FITC)-Covaspheres-pallosia päällystettiin valmistajan yleisen ohjeen mukaisesti hTSH:lla kovalentisti (TSH-CS) ja varastoi-: . - tiin 5 o/oo-natriumatsidiliuoksessa. D.R. Parks et ai.: ____: Proc.Natl.Acad.Sci. USA 1982-1966 (1979) selostetun menetelmän mukaan merkittiin solut päällystetyillä Covaspheres-pallosilla ja käyttäen apuna sytofluorigraafia pantiin suuria, fluoriloiste-positiivisia soluja yksitellen täpläastioihin ja Costar-96-levyille. Täpläastiat oli 24 h aikaisemmin päällystetty hiiri-makrofageilla DMEM-täyselatusaineessa.

ELISA-koe TSH-spesifisille vasta-aineille: Viljelyjen yläpuolella olevan osan päällystys, inkubointi, substraattireaktio ja arvostelu kuten esimerkissä 1, B.2 on selostettu. Anti-hiiri-Ig-P0D:n asemesta käytettiin TSH-POD-konjugaattia. Positiivisena kokeena laimennettiin erään hTSH-hyperimmunisoidun -3 hiiren seerumi 10 :een ja pantiin mukaan; negatiivisena kontrollina käytettiin kloonia, joka muodosti vasta-aineita erisukuis-ta antigeeniä vastaan (hiiri-anti-digoksiini).

28 85282

Tulokset

Sekä fuusiosta 1 tehdyissä viljelyissä (kokonaisia Ag-8.653-soluja) että myös fuusiosta 2 (Ag-8.653-liuotusfragmentteja) tehdyissä oli päivänä 14 kaikissa täpläastioissa nähtävissä suuria lymfoidi-solujen kolonioita. Viljelyjen yläpuolella olevasta osasta päivältä 14 suoritetussa ELISA-kokeessa TSH-spesifisten vasta-aineiden osoittamiseksi saatiin taulukkoon 3 kootut arvot: Kaikissa osaviljelyissä voitiin osoittaa anti-TSH:ta.

Taulukko 3 a) b) 123456 123456 A 235j236 212 149'; 119 212. A 271 268 267 286 194 29] B 1091221 119 104 176 068 B 288 278. 362 317 280:305 C 116j 108 135 139 093 135 C 207 292 252 226. 292.273 | | | D 1711128 120 228 137 145 D 295 376 370 338 310 333 I I_________.___ L- I——---i

Negatiivinen-kontrolli (DMEM-täyselatusaine) : OOO Positiivinen-kontrolli (anti-TSH-hiiriseerumi) : 362 ELISA-koe anti-TSH:n osoittamiseksi, viljelyjen yläpuolella olevasta osasta päivänä 14 fuusioimisen jälkeen, a) fuusio 1 (kokonaisia Ag 8.653-soluja), b) fuusio 2 (Ag 8-653-fragment-teja) .

Päivänä 15 huuhdottiin ei-adherentit solut yksittäistäplä-astioista, jotka olivat peräisin fuusiosta 1 ja 2, merkittiin ne erillisissä astioissa TSH-antigeeni-spesifisesti (peruste: hybridomissa on tavallisesti kuten B-lymfosyyteissä osa syntetisoimastaan vasta-ainemolekyylistä kiinnittyneenä solun membraaniin "ulospäin" suunnattunne antigeeni-sitoutumis- paikkoineen) ja kloonattiin käyttäen apuna solujen valikoi- mislaitetta.

29 8 5 2 8 2

Esimerkki 4

Humaani-P3L:n fuusioiminen kokonaisten ja fragmentoitujen Ag 8.653-solujen kanssa.

Ainekset

Inaktivoitua hepatiitti-B-pinta-antigeeniä (HB ; Biotesti)

S X

puhdistettiin immunoadsorption avulla seerumiproteiineista.

ELISA-koe humaani-HBs-vasta-aineiden osoittamiseksi: mikro- tiitterilevyt päällystettiin puhdistetulla HB .:llä (20 .ug/ml s x / 0,9-prosenttinen NaCl-liuos). Viljelyn yläpuolella olevan nesteen inkuboiminen, konjugaatti- ja substraatti-reaktiot sekä arviointi kuten on selostettu esimerkissä 1 B.2. Anti-hiiri-Ig-P0D:n asemesta käytettiin (lammas)-anti-humaani-Ig-POD:tä.

Suoritus

HPBLiää eräältä luovuttajalta, jolla oli korkea anti-HBs-tiit-teri, eristettiin 200 mlssta laskimoverta Ficoll-gradientti-sentrifugoimalla. B-lymfosyyttien rikastamiseksi T-soluja kerättiin rosettimuotoon lammaserytrosyyttien kanssa (standardimenetelmä) ja toisen Ficoll-gradientti-sentrifugoi-misen avulla erotettiin ne. Ei-roseteiksi kerättyjen solujen (HPBL(B)) fraktiota tiheydellä 5 x 107 solua RPMI 1640:ssä + 10 % autologem. plasmaa (joka oli inaktivoitu 30 min/56°C

kuumassa), viljeltiin noin 10 ,ug:n kanssa HB . :tä C0„-inku- / si 2 baattorissa (elatusaineen vaihto aina 12 h kuluttua).

Fuusio 1: 1 x 107 esikäsiteltyä HPBL(B):tä sekoitettiin 7 1 x 10 Ag 8.653-solun kanssa ja kuten esimerkissä 1, B.2 on selostettu, fuusioitiin PEG:n kanssa. Fusionaattia viljeltiin ·...' RPMI 1640: ssä + 10 % ihmisen plasmaa + HAT neljässä Costar-24-täpläastiassa.

3o 85282 g

Fuusio 2: 1/1 x 10 Ag 8.653-solua fragmentoitiin glyseriini- 7 liuotuksen avulla. 1 x 10 Ag 8.653-tumaa sekoitettiin 7 1 x 10 HPBL(B):n kanssa ja kerrostettiin membraani-sytoplasma-

O

vesikkelien sedimentin (1 x 10 Ag 8.653-solusta) päälle. Fuusion jälkeen PEG:n kanssa viljeltiin fusionaattia neljässä Costar-24-täpläastiassa RPMI 1640:ssä + 10 % ihmisplasmaa (ilman HAT-lisää).

Tulokset

Kaikissa fuusion 1 ja 2 täpläastioissa esiintyi päivä 3:sta lähtien suurten adherenttien solujen kasvua. Päivänä 5 suspen-doitiin ei-adherenttien solujen päämassa varovasti ja jaettiin kahteen uuteen Costar-24-täpläastiaan (esimerkiksi AI, B1 ja Cl). Päivänä 28 fuusiossa 1: pieniä kolonioita A2:ssa ja A3:ssa, muissa täplissä vain adherentteja soluja; fuusio 2: multippelien kolonioiden massiivista kasvua kaikissa täplissä paitsi C 3:ssa. Viljelyjen päällysnesteen kanssa päivänä 35 suoritettu ELISA-koe ihmisen immunoglobuliinien suhteen, joilla on spesifisyys hepatiitti-B-antigeeniä vastaan, antoi taulukossa 4 kootun tuloksen: fuusiosta 1 ei saatu mitään positiivista viljelyä (kokonaisia Ag 8.653-soluja, viljely HAT-elatusaineen kanssa); sitä vastoin olivat fuusion 2 viljelyistä 5-12 (Ag 8.653-fragmentteja, viljely normaalissa ela-tusaineessa) selvästi anti-HBs-positiivisia.

Taulukko 4 a) b)

Il 2 3 | 4 1 2 3 4 i t i i A| 000 000 000 j 000 A OIO 000 189 553 ! !

! 1 i ! j I

;; B j 000 001 Oli j OOO B OOO 003 198 032 υ___1 _____ ! :;· C 005 000 i 000 004 C 000 173 000 107 . l 1 i i—1_:___ ; ____ 3i 85282

Negatiivinen-kontrolli (anti-HB -neg. ihmisseerumi): 000 s

Positiivinen-kontrolli (anti-HB -pos. ihmisseerumi): 185 s ELISA-koe ihmis-anti-HBs:n osoittamiseksi viljelysten päällys-nesteestä päivänä 35 fuusion jälkeen. a) fuusio 1 (kokonaisia Ag 8.653-soluja), b) fuusio 2 (Ag 8.653-fragmentteja).

Esimerkki 5 HPBL:n fuusio fragmenttien kanssa humaani-plasmasytomi-linjas-ta HS Suitan.

Ainekset HS Suitan tilattiin American Type Culture Collection, (ATCC):stä koodilla CRL-1484 pakastevarastoituna solumateriaalina ja sulatettiin ATCC-ohjeiden mukaisesti ja pantiin viljelyyn.

Suoritus HPBL valmisteltiin kuten esimerkissä 4 on selostettu samalta luovuttajalta ja in vitro "tehostettiin" HBsi:n kanssa.

Fuusio: 4 x 10^ HS Sultan-solua fragmentoitiin glyseriini- liuotuksen avulla. Membraani-sytoplasma-vesikkeli-fraktio sedimentoitiin 5500 g (40 min) ja päällystettiin seoksella noin 4 x 10^ HS Sultan-tumia ja 4 x 10^ HPBL(B):tä. PEG-fuusio tapahtui esimerkki 4:n mukaisesti. Fusionaatti kylvetään 12:een Costar-24-täpläastiaan, joissa on RPMI 1640 + 20 % KKS + pyru-vaatti + insuliini (Novo 2 U/ml) + 1 % ei-välttämätöntä aminohappoa (BM) + 1 % Methocel 1500 ilman Hat-lisää.

Tulokset Päivä 14 fuusion jälkeen: suurten, ei-adherenttien lymfoidi-solukolonioiden kasvua.

Esimerkki 6

Ihmisen T-lymfosyyttien tekeminen kuolemattomiksi 6.1. Ainekset ja menetelmät T-lymfosyyttejä eristettiin standardimenetelmien mukaisesti : (rosettien muodostus lammaserytrosyyttien kanssa, Ficoll- 32 85282 gradienttisentrifugoiminen) lymfosyyttien kokonaisfraktiosta ja niitä käsiteltiin joko heti tai 3-päiväisen viljelyn jälkeen. Ehrlich-Aszites-soluja (ATCC; CCL 77) viljeltiin DMEM:ssä 10 % kanssa hevosseerumia ja niitä käytettiin muun-televien fragmenttien luovuttajina. EAZ:n fragmentoiminen suoritettiin Jett et ai. (J.Biol.Chem. 252, 2134-2142 (1977) mukaisesti glyseriini-liuotuksen avulla. Etupäässä tuma-materiaalia sisältävä fraktio erotettiin sentrifugoimalla ja heitettiin pois. Mitokondrioita sisältävä sytoplasman membraani-vesikkelifraktio (CBV) käytettiin muuntamiseen.

5 x 10^ T-lymfosyyttiin lisättiin ylimäärä PHA-lektiiniä (Difco), sekoitettiin EAZ:stä saadun CMV-fraktion kanssa ja inkuboitiin 20 min ajan huoneen lämmössä. Seos sedimentoi-tiin sentrifugin kanssa, nestemäinen päällyskerros poistettiin täysin ja korvattiin 1 ml:11a 50-prosenttista PEG-liuosta. Annettiin vaikuttaa 1 min ajan, jonka jälkeen PEG-liuokseen lisättiin RPMI-1640-elatusainetta laimennusta varten ja sentri-fugoitiin solujen erottamiseksi. Solut otettiin RPMI-elatus-aineeseen 20-prosenttisen vasikan sikiöseerumin kanssa (FKS, BM), jaettiin 12:en 1-ml-viljelytäplään ja viljeltiin 37°C:ssa 5-prosenttisessa C02~atmosfäärissä. Solujen tunnistaminen pin-tatunnusmerkkien perusteella tapahtui standardimenetelmien mukaisesti lammaserytrosyyttien E-rosettien avulla (M.E.

Kaplan et ai: J.Immunol.Methods 5, 131 (1974) ja immunofluore-senssin avulla ja käyttämällä molempia T-solu-spesifisiä vasta-aineita. OKT-3 /Ortho; E.L. Reinherz et ai.: J.Immunol. 123, 1312 (1979) tai MAK 4-11 (P.Rieber et ai.: Hybridoma 1, 59 (1981/7 ja fluoriloisteella merkittyä anti-humaani-immuno-globuliinia (Ig; firma Dako) B-solutyyppisen membraani-Ig:n osoittamiseksi.

6.2. Tulokset

Ensimmäisten 14 päivän aikana kuoli suurin osa soluista viljelyksissä. Päivästä 21 lukien tuli solujätteissä näkyviin pienten ja keskisuurten solujen pesäkkeitä, jotka lisääntyivät jatkuvasti. Pesäkkeiden kasvua havaittiin kaikissa 12:ssa täplässä ja jopa 50 pesäkettä täpläastiaa kohti. Päivänä 30 33 85282 siirrettiin koloniat suurempiin viljelyastioihin ja annettiin lisääntyä jatkuvasti. Solut analysoitiin pintamerkkiensä perusteella ja saatiin seuraavat tulokset: a) E-rosetti-positiiviset > 95 % b) 0KT-3-positiiviset ^ 90 % c) 4-11-positiiviset > 90 % d) Igs~positiiviset ^ 5 % 6.3. Arvostelu

Fragmentit, jotka voidaan saada EAZ:sta (jatkuva hiirisolulin-ja) glyseriiniliuotuksen avulla, tuottavat PEG-fuusion jälkeen eristettyjen T-lymfosyyttien kanssa jatkuvasti viljelyssä kasvavia soluja, jotka voidaan pintamerkkiensä ansioista kiistattomasti identifioida T-lymfosyyteiksi.

Esimerkki 7

Ihmisen endoteelisolujen tekeminen kuolemattomiksi 7.1. Ainekset ja menetelmät

Kaikki viljelyastiat päällystettiin ennen solujen levittämistä gelatiinilla. Elatusaine muodostui 1:1 seoksesta RPMI-1640 ja elatusaine 199 (BM) ja 20 % FKS. Ihmisen endoteelisoluja saatiin Jaffe et ai. mukaan /J.Clin.Invest. 52, 2745-2756 (19732.7 kollagenaasiliuoksen avulla (Gibco) tuoreista napanuoran laskimoista ja ennen muuntamista ne pantiin primääriviljelyyn noin .. , 14 vrk ajaksi lisääntymään. Muuntamista varten adherentisti kasvavat endoteelisolut liuotettiin erilleen trypsiini-EDTA-liuoksen avulla (BM) ja fuusioitiin ne EAZ:sta saadun CMV-frak-tion kanssa suspensiossa kuten esimerkissä 6.1 on selostettu.

Näin käsiteltyjä soluja levitettiin solutiheyden ollessa 5 x 10^/75 cm^-viljelyastiaa kohti ja viljeltiin COj-inkubaat-torissa. Kontrollia varten käsiteltiin kulloinkin määräosa endoteelisoluja primääriviljelyistä ilman CMV-fraktiota PEG-liuoksella (näennäisfuusio) ja viljeltiin uudelleen. Niin pian kuin solut olivat viljelyastian pohjalla muodostaneet aukottoman solukentän, ne liuotettiin erilleen trypsiini-EDTA-liuoksella ja siirrettiin suhteessa 1:3 tuoreisiin viljelyastioihin ( = pasaasi).

34 85282 7.2. Tulokset CMV-fraktion kanssa fuusioidut endoteelisolut kiinnittyivät kylvämisen jälkeen 20-30 prosentin tehokkuudella ja kasvoivat 2-3 päivän sisällä yhteenliittyviksi solukentiksi. Näennäisesti fuusioidut solut kiinnittyivät suunnilleen yhtä tehokkaasti kiinni, mutta tuskin lisääntyivät ja kuolivat - ilman yhteen-liittyvän solukentän muodostamista - noin 21 päivän sisällä täydelleen. Täysin käsittelemättömät endoteelisolut lisääntyivät maksimaalisesti kolmanteen pasaasiin asti, lopettivat sitten kasvunsa, irtosivat viljelyastian pohjalta ja hajosivat.

8 eri astiassa, joissa oli endoteelisoluja yhteensä 18 eri napanuorasta, kasvoivat CMV-käsitellyt solut ilman probleemeja 10. pasaasin yli. Muunnellut endoteelisolut voitiin ilman elin- ja jakautumiskyvyn menettämistä varastoida nestemäisessä typessä ja ottaa varastosta pois.

7.3. Arvostelu

Humaani-umbilikaali-endoteelisoluja ei voitu ilman keksinnön mukaista muuntelumanipulaatiota viljellä 3.pasaasin yli, jolla todettiin oikeiksi kirjallisuudessa ilmoitetut kokemukset ^/esimerkiksi M.A. Grimbrone, Progress in Haemostasis and Thrombosis, osa 3; T.Maciag et ai., J.Cell.Biol. £1, 420-426 (1981_)y. Mitokondrioita sisältävän Ehrlich-Aszites-soluista saadun CMV-fraktion kanssa suoritetun fuusion kautta muuttuivat endoteelisolujen viljelyominaisuudet siten, että niitä voitiin lisäännyttää yli kriittisen kolmannen pasaasin ilman probleemeja (ja vielä 23. pasaasissa niillä ei esiintynyt "väsymysilmiöitä").

Esimerkki 8

Ihmisen melanomasolujen kuolemattomiksi tekeminen 8.1. Ainekset ja menetelmät

Melanomasoluja sisältävää kudosta saatiin poistamalla kirurgisesti lantio-lymfasolmuke-metastaasista steriileissä olosuhteissa pieninä kuutioina ja säilytettiin fuusioimiseen asti nestemäisessä typessä. Valmistettiin CMV-fraktioita EAZrsta, kuten esimerkissä 6.1 on selitetty.

35 B5282

Ennen fuusiota melanomasoluja sisältävä materiaali sulatettiin ja trypsiinikäsittelyllä valmistettiin yksittäissolu-suspensio. Suurten, ruskeanpunaisten myelomasolujen fraktio vapautettiin Ficoll-gradientti-sentrifugoimisen avulla mukana olevista lymfosyyteistä ja kuten esimerkissä 6.1. on selostettu, fuusioitiin CMV-fraktion kanssa PEG-vaikutuksen alaisena (noin 4 x 10^ melanomasolua CMV:n kanssa noin 1 x 10® EAZrstä). Fuusion kontrollia varten käytettiin 4 x 10** melanomasolua, joita käsiteltiin ilman CMV:tä PEG:n kanssa. Fuusion jälkeen solut kylvettiin tiheyden ollessa 1 x 10^ solua/täpläastiaa kohti, jossa oli RPMI 1640 + 20 % FKS, ja viljeltiin 37°C:ssa 5-prosenttisessa CC^-atmosfäärissä.

8.2. Tulokset

Kaikissa 4:ssä CMV:n kanssa fuusioitujen melanomasolujen osa-viljelyssä kasvoi päivästä 28 lähtien tyypillisen värin omaa-vien solujen pesäkkeitä semiadherenttien solukasojen muodossa, jotka jatkuvasti suurenivat. Näennäisesti fuusioitujen solujen kontrolliviljelyssä ei esiintynyt mitään solujen lisääntymistä, päin vastoin solut osoittivat päivästä 8 lähtien lisääntyvää granuloitumista, ja päivästä 22 lähtien oli viljelyssä jäljellä enää vain solujäännöksiä.

8.3. Arvostelu

Humaaneja melanomasoluja pakastesäilytetystä metastaasikudok-sesta voitiin CMV-fuusion kautta in vitro muuttaa viljelyjä lisääntymiskykyisiksi soluiksi. Näennäisesti fuusioidut, samaa alkuperää olevat melanomasolut sen sijaan kuolivat muuten samoissa viljelyolosuhteissa.

Esimerkki 9

Eukaryoottisen DNA-vektorin tuominen ihmisen kuolemattomiksi tehtyihin endoteelisoluihin.

9.1. Transfisoidun aineksen osoittaminen soluissa kosketutta-malla (Southern'in imupaperimenetelmä) Hirt'in päällyskerrok-sia.

36 85282 9.1.1 Ainekset

PlasmidiZ-pBR 322/RchrBG-A425 B (P.Dierks et ai. Proc.Natl. Acad.Sci. USA J78, 1411-1415 (1981) sisältää 2070 emäsparin (Bp)-kaniini-3-globiini-geenifragmentin.

pBR 322:n Cla-Pvu I-fragmentti korvattiin 3039 Bp Hpa I-Bam H 1-fragmentilla, joka sisältää koko aikaisten geenien alueen ja myöhäisten geenien alun SV 40:stä (J.Tooze (1980), "DNA Tumor Viruses", J. Tooze, 2.painos, Cold Spring Harbor Laboratory ja B.Wieringa et ai, Cetus-UCLA symposium aiheena "Gene regulation" 1982). Tätä plasmidia nimitetään seuraavassa pBR 322 R3G SV 40:ksi.

9.1.2 Menetelmät

Ihmisen endoteelisoluja, kuten esimerkissä 7 on selostettu, tehtiin kuolemattomiksi ja annettiin kasvaa. 10^ solua transfisioi-tiin 6 yUg:n kanssa pBR 322 RgG SV 40:ää ja 4 ^ug ultraäänellä käsitellyn vasikan kateenkorvan DNA kanssa käyttämällä kalsium-fosfaattisaostusmenetelmää /F.L.Graham et ai. Virology 52, 456-467 (1973) ja M.Wigler et ai., Cell 14, 725-731 (1978).

10 h ja 40 h transfektion jälkeen valmistettiin Hirt'in viljelyn päällysnesteitä (B.Hirt, J.Mol.Biol. 26_, 365-369, (I967j_/.

Hirt'in viljelyn päällysnesteet erotettiin 1-prosenttiseen agaroosigeeliin ja Southern'in menetelmän mukaan /E.M.Southern, J.Mol.Biol. _98, 503-517 (1975J_7 siirrettiin nitroselluloosa- 32 paperin päälle. Plasmid pBR 322 R G SV 40 merkittiin P:llä käyttämällä Nick-translaatiomenetelmää, P.W. Rigby et ai.

J.Mol.Biol. 113, 237-251 (1977) ja hybridisoitiin siirtyneen DNA:n kanssa nitroselluloosasuodattimille, kuten on selostanut T. Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Suodatin valotettiin röntgenfilmille -70°C:ssa.

9.1.3 Tulokset

Ihmisen endoteelisolut, jotka transformoitiin plasmidilla pBR 322 R3G SV 40, antavat voimakkaan hybridisoimissignaalin, 37 85282 joka vastaa autenttista plasraidia sen liikkuvuuden suhteen agaroosigeelissä. Kun verrattiin solujen Hirt-päällyskerrok-sien signaaleja 40 h transfektion jälkeen signaaleihin 10 h jälkeen transformoinnista tuli ilmi neljä-viisinkertainen intensiteetin kasvu hybridisoimissignaaleissa.

Hybridisoitumista DNA-lajeihin, jotka ovat pienempiä kuin tuotu plasmidi, havaittiin myös. Näitä signaaleja ei ollut todettavissa transformoiduissa kuolemattomiksi tehdyissä ihmisen endoteelisoluissa.

Sama intensiteetin jakautuminen hybridisoimissignaaleissa havaittiin, jos He-La-soluja transformoitiin plasmidilla pBR 322 R0G SV 40.

9.1.4 Arvostelu

Se tosiasia, että ihmisen kuolemattomaksi tehtyjen epiteelisolujen Hirt-päällyskerroksessa, jotka oli transfisioitu plasmidipBR 322 Rf3G SV 40:n kanssa, todettiin DNA-hybridisoitu-minen tuotuun P-merkittyyn plasmidiin, ei kuitenkaan soluissa, jotka eivät olleet transformoituja, on todiste siitä, että vektori oli tuotu eukaryoottiseen solulinjaan. Havainto, että hybridisoimissignaali transformoiduissa soluissa 40 h transfektion jälkeen osoitti neljä-viisinkertaista intensiteettiä verrattuna soluihin 10 h transfektion jälkeen, antaa tehdä sen loppupäätelmän, että transformoitu plasmidi soluissa replikoitui.

9.2 Kaniinin β-globiinin spesifisten transskriptioiden osoittaminen kuolemattomiksi tehdyissä ihmisen endoteelisoluissa, jotka oli transformoitu plasmidilla pBR 322 R6G SV 40.

9.2.1 Ainekset

Nukleaasi S^, polynukleotidikinaasi ja vasikan suolen-fosfataasi olivat Boehringer Mannheim’in kaupasta saatavia preparaatteja.

38 85282 9.2.2 Menetelmät

Kuolemattomiksi tehtyjä ihmisen epiteelisoluja lisäännytet-tiin, kuten 9.1.2,0η selostettu, ja transformoitiin kaniinin 8-globiinigeenin sisältävän vektorin kanssa. 48 h transfek-tion jälkeen hajotettiin liuottamalla 1-2 x 10® solua ja RNA uutettiin LiCl-virtsa-ainemenetelmän mukaisesti /C. Auffrav et ai. Eur.J.Biochem. 107, 303-314 (198027-

Kaniinin S-globiinispesifisen hybridisoimissondin valmistaminen

Plasmici pBr 322 R3G SV 40 hajotettiin Hae III:n kanssa ja fragmentti, joka ulottui +135 - -75 asti /P.Dierks et ai.

Proc.Natl.Acad.Sci, USA 78' 1411-1415 (19812/ ja A. Van Oyen et ai. Science 206, 337-344 (19 ) eristettiin 2-prosenttiseen agaroosigeeliin ja puhdistettiin edelleen DEAE-selluloosa- kromatografisesti /W.Muller et ai. J.Mol.Biol. 124, 343-358 — — 32 (19782./. Fragmentti P-defosforiloitiin vasikan suolifosfa- 32 taasin kanssa ja merkittiin γ- P-ATP:n ja polynukleotidi-kinaasin kanssa, kuten on selostanut /N.Mantei et ai. Gene 10, 1-8 (198027-

Nukleaasi-S^-kartoitus

Kinaasin kanssa käsitelty fragmentti saostettiin 10 ^ug:n kanssa E.coli t-RNA (Boehringer Mannheim) etanolin avulla ja liuotettiin seokseen , jossa oli 100 ^ultaan 0,4 M/l NaCl, 1 mM/1 EDTA, 40 mM/1 Pipes-puskuria, pH 6,4 ja 80 %-formamidia /N.Mantei et ai. Nature 281, 40-46 (197927. Sellulaarinen RNA (= 25 ^,ug) vakuumikuivattiin, ja liuotettuna 10 ^ul:n sondissa (0,01 pMol, 30 000 cpm) puskuriin, kuten edellä on selostettu, se denaturoitiin, sulatettiin lasikapillaarin sisään ja hybridi-soitiin 16 h lämpötilassa 48°C. Kontrollikokeessa hybridisoitiin sondi kaniini-B-globiini m-RNA:n kanssa (Miles) . Koenäyte laimennettiin seoksella, jossa oli 100 ^ul 0,2 M/l NaCl, 50 mM/1 natriumasetaattipuskuria pH 4,5, 1 mM/1 ZnSO^ ja 0,5 % glyse-riiniä ja inkuboitiin 50 yksikön kanssa nukleaasi-S^:tä 60 min 30°C:ssa /R.Weaver et ai. Nucl.Axid Res 7, 1175-1193 (19792/.

Näytteitä käsiteltiin fenolilla, saostettiin 10 ^ug:n kanssa E.coli t-RNA etanolin avulla, pestiin 80-prosenttisella 39 85282 etanolilla (20 min -70°C:ssa), vakuumikuivattiin, liuotettiin 5 ^uljaan väriliuosta (0,05 % bromifenolisinistä, 0,05 % ksylo-liksyanolia, 1 mM/1 EDTArta, 90 % V/V formamidia) , kuumennettiin 2 min kiehuvassa vesihauteessa ja suoritettiin elektroforeesi 5-prosenttisessa polyakryyliamidigeelissä (89 mM/1 trisemästä, 89 mM/1 boorihappoa, 1 mM/1 EDTA ja 7 mM/1 virtsa-ainetta) . Geeli autoradiografioitiin Fuji-firman röntgen-filmille käyttäen vahvistinlevyä -70°C:ssa.

9.2.3 Tulokset

Suojattujen fragmenttien suuruutta voitiin arvioida vertaa- 3 2 maila koonmerkitsijöihin ( P-merkitty pBR 322 x Hinf 1 ja pBR 322 x Hae III). Ei-transfisioidut solut eivät antaneet minkäänlaisia globiinispesifisiä hybridisoimissignaaleja (paitsi renaturoitu hybridisoimissondi = 210 Bp). Transfisioiduista, kuolemattomiksi tehdyistä ihmisen epiteelisoluista uutettu RNA suojasi kahta fragmenttia, joiden suuruus määrättiin 80-90 Bprllä. Samanlaisia transskriptioita ovat havainneet myös Grosveld et ai. Nature 295, 120-126 (1982) ja U.Weidle et ai., Nature (1981) ja niiden katsotaan johtuvan sisäisistä kryptisistä halkeamakohdista kaniini-6-globiini-geenissä. Transskriptioita, jotka ovat peräisin kaniini-g-globiini-geenin cap-kohdasta ei voitu todeta. Eräässä vertailukokeessa trasnformoi-tiin HeLa-soluja plasmidilla pBR 322 RBG SV 40. Virheettömästi aloitettuja transskriptioita (135 Bp suojattuja) samoin kuin transskriptioita, jotka voivat johtua sisäisen kryptisen halkeamakohdan olemassaolosta /g.Grosveld et ai. Nature 295, 120-126 (1982) ja U.Weidle et ai. Nature (19832.7, todettiin Sj^-kartoituksen avulla.

9.2.4 Arvostelu

Se tosiseikka, että kaniini-S-glob iirti-spesif isiä transskriptioita voidaan todeta kuolemattomiksi tehdyissä ihmisen epiteelisoluissa, jotka oli transformoitu SV 40:stä peräisin olevalle eukaryoottisella vektorilla, joka sisältää kaniini-β- globiini-geeniä, todistaa, että tämä solulinja soveltuu isäntä-systeeminä uudelleen tuotujen kloonattujen geenien saamiseen solusta.

Claims (7)

40 8 5 282

1. Menetelmä, jonka avulla voidaan saada jatkuvasti viljeltäviä eläin- ja humaanisolulinjoja fuusioimalla normaaleja eläin- ja humaanisoluja biologisten komponenttien kanssa, jotka aikaansaavat viljeltävyyskyvyn in vitro, tunnettu siitä, että fuusioidaan normaaleja eläin- ja humaanisoluja sellaisten solufragmenttien kanssa, jotka on saatu muunnetuista soluista, ja jotka eivät yksinään ole lisääntymiskykyisiä, ja viljellään fuusioituja soluja elatusaineessa ilman valinta-aineita.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioiminen tapahtuu polyetyleeniglykolin tai Sendai-virusten läsnäollessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään solufragmentteina muunnettujen solujen cytochalasin B -käsittelyllä saatuja karyoplasteja tai sytoplasteja.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään liuotuksen tai mekaanisen hajotuksen avulla muunnetuista soluista saatuja solufragmentte-ja, erikoisesti tumafraktioita tai sytoplasmafraktioita.

5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioimiseen käytetään mitokondrioita sisältävää sytoplasmafraktiota.

6. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muunnettuina soluina käytetään myeloomasoluja, Eppstein-Barr-viruksilla infektoituja soluja tai ascites-tuumorisoluja.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisen menetelmän mukaan valmistetun, jatkuvasti viljeltävän humaani- tai eläinsolulinjan käyttäminen homologisten tai/ja heterologis-ten solutuotteiden ilmentämiseen, kuten monoklonaalisten 4i 85282 vasta-aineiden, hyytymistekijöiden ja lymfokiinien, tai vaikutusaineiden kokeiluun.