CS276448B6 - Způsob výroby permanentních buněčných lini-í živočišného i lidského původu - Google Patents
Způsob výroby permanentních buněčných lini-í živočišného i lidského původu Download PDFInfo
- Publication number
- CS276448B6 CS276448B6 CS833148A CS314883A CS276448B6 CS 276448 B6 CS276448 B6 CS 276448B6 CS 833148 A CS833148 A CS 833148A CS 314883 A CS314883 A CS 314883A CS 276448 B6 CS276448 B6 CS 276448B6
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- fusion
- human
- culture
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 223
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 11
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims abstract description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 77
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 29
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 claims description 6
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 claims 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 30
- 239000000463 material Substances 0.000 description 30
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 27
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 27
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 23
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 21
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 19
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 19
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 12
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 9
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 9
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 8
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 8
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 8
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 8
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 5
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 5
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 5
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 3
- 229920003091 Methocel™ Polymers 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-4,5,6-trinitrooxy-2-(nitrooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-3,5-dinitrooxy-6-(nitrooxymethyl)oxan-4-yl] nitrate Chemical compound O([C@@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O1)O[N+]([O-])=O)CO[N+](=O)[O-])[C@@H]1[C@@H](CO[N+]([O-])=O)O[C@@H](O[N+]([O-])=O)[C@H](O[N+]([O-])=O)[C@H]1O[N+]([O-])=O FJWGYAHXMCUOOM-QHOUIDNNSA-N 0.000 description 3
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 8-azaguanine Chemical compound NC1=NC(O)=C2NN=NC2=N1 LPXQRXLUHJKZIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012594 Earle’s Balanced Salt Solution Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 208000002854 epidermolysis bullosa simplex superficialis Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFFPVEVGHKMWLT-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;3,7-dihydropurin-6-one Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 BFFPVEVGHKMWLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150017816 40 gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005508 8-azaguanine Drugs 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000304921 Charybdis maritima Species 0.000 description 1
- 241001432959 Chernes Species 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- 102100022404 E3 ubiquitin-protein ligase Midline-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710102210 E3 ubiquitin-protein ligase Midline-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 208000003468 Ehrlich Tumor Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241001331845 Equus asinus x caballus Species 0.000 description 1
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 240000002657 Thymus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000007303 Thymus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 101150115889 al gene Proteins 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108060002020 cyanase Proteins 0.000 description 1
- JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N cytochalasin Natural products N1C(=O)C2(C(C=CC(C)CC(C)CC=C3)OC(C)=O)C3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 JVHIPYJQMFNCEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N cytochalasin-A Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(=O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 ZMAODHOXRBLOQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N dmso dimethylsulfoxide Chemical compound CS(C)=O.CS(C)=O CETRZFQIITUQQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 210000000540 fraction c Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- LSMIOFMZNVEEBR-ICLSSMQGSA-N scilliroside Chemical compound C=1([C@@H]2[C@@]3(C)CC[C@H]4[C@@]([C@]3(CC2)O)(O)C[C@H](C2=C[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)CC[C@@]24C)OC(=O)C)C=CC(=O)OC=1 LSMIOFMZNVEEBR-ICLSSMQGSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000001585 thymus vulgaris Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Způsob výroby permanentních buněčných linií živočišného i lidského původu fúzí normálních buněk lidského i živočišného původu s biologickými složkami, které působí udržitelnost kultury in vitro, tím, že se podrobí fúzi normální lidské nebo živočišné buňky s karyoplasty, cytoplasty, jadernou nebo cytoplasmatickou frakcí, bohatou na mitochondrie lymfatických nebo epithe- liálních nádorových buněk, které samy o sobě nejsou schopny pomnožení a pocházejí z transformovaných buněk, fúze se provádí za přítomnosti polyethylenglykolu nebo viru Sendai, a získané buňky se pěstují ■ v živném prostředí bez selekčních látek.
Description
Vynález se týká způsobu výroby permanentních buněčných linií živočišného i lidského původu. Takto získané buněčné linie je možno použít k získání buněčných produktů; Již dlouhou dobu byly konány pokusy trvale pěstovat buňky živočišného i lidského původu nezávisle na původních tkáních, a to jak z vědeckých, tak z praktických důvodů. Až dosud nebyly výsledky uspokojivé a' jen v některých případech bylo možno permanentně pěstovat určité krevní buňky.
Je známo použít pro výrobu monoklonálních protilátek s definovanou specificitou vazby antigenu tak zvanou techniku hybridomů. Tento postup byl popsán v publikaci Kohler a Milstein Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefinec specificity, Nature 256, 495 až 497 (1975) a je jím možno získat prakticky nesmrtelné buňky, vytvářející protilátky (AK) a tyto buňky dále libovolně množit. Fúzí buněk produkujících protilátky (B-lymfocyt) s maligní buňkou (Myelom) je možno získat buněčné hybridy, které spojují · vlastnosti obou původních buněk, to je schopnost tvořit protilátky a schopnost permanentního růstu. Nové slovo hybridom bylo vytvořeno z pojmů hybridní buňka a myelom.
Ke snadnějšímu pochopení zvláštností této techniky je zapotřebí uvést základy struktury a syntézy protilátek, například imunoglobulinu Ig. Molekula imunoglobulinu sestává ze dvou totožných lehkých řetězců L a dvou identických těžkých řetězců H, jak je zřejmé z obr. 1. Každý řetězec H a L je rozdělen geneticky i funkčně na různé úseky. Vytečkované části molekuly jsou měnitelné oblasti, protože v těchto oblastech dochází k daleko vyššímu stupni heterogenity sledu než v jiných stálejších oblastech. Místa pro vazbu antigenu a protilátky se nachází právě v měnitelných oblastech. Možnost různé výměny aminokyselin vytváří veliké možnosti vzniku trojrozměrných struktur, které mohou být komplementární k velkému počtu antigenů. Savec může obvykle vytvořit 106 až 10? různých míst pro vazbu antigenu.
Protilátky jsou produkt syntézy B-lymfocytů. V průběhu ontogenetického vývoje těchto buněk ze základní kmenové buňky se kombinuje celá řada variabilních genových oblastí s poměrně malým počtem stálých oblastí, stejně jako v případě řetězců L a H. Jakmile dojde ke spojení genů, vzniká buňka, která vytváří pouze jediný typ protilátky a tuto vlastnost předává i dceřinným buňkám. Bez přítomnosti antigenu zůstává B-buňka v klidu. Produkuje a vyměšuje jen malé množství imunoglobulinu, nese však v buněčné membráně protilátky, které mají stejná vazebná místa pro antigen jako vylučovaná protilátka. Při vstupu antigenu do organismu dochází k sérii komplexních buněčných interakcí B-buněk.
B-buňky jejíž imunoglobulin membrány specificky reaguje s antigenem se pak dělí a vytváří klony dceřinných buněk, které se odlišují od různých dalších krevních buněk. V případě, že klon B-bunky produkuje antibiotikum se stejnou strukturou a stejným místem pro vazbu antigenu, je protiduktem monoklonální protilátka. Komplexní antigeny, jako bílkoviny, mikroorganismy nebo buňky však obsahují nejrůznější antigenně účinná místa (determinanty, epitopy) a vyvolávají proto tvorbu různých B-buněk, které se dělí a vytvářejí různé klony. Tím vzniká velké množství protilátek, které se od sebe liší velikostí, specifičností i afinitou. Je tedy zřejmé, že imunologická odpověň bude polyklonální. Je známo, že myš vyrábí až 10^ různých protilátek proti jednoduchému haptenu, to je izolované determinanty. Je tedy zřejmé, že je nesmírně obtížné, ne-li nemožné získat reprodukovatelné antisérum proti určitému antigenu. Řadu let byly vyvíjeny snahy získat postup, který by dovoloval pomnožit jednotlivé klony B-buněk, aby bylo možno získat homogenní, monoklonální protilátku. Bylo užíváno například plasmacytonu nebo myelomu, známého jako zhoubné onemocnění u myší, krys i u člověka. Myelom vzniká v případě, že se B-buňka zhoubně zvrhne a bez zábrany se množí, přičemž klon vzniklých buněk produkuje velké množství homogenní protilátky. Myelom je možno u některých kmenů myší vyvolat chemicky. Všechny pokusy získat hyperimunizací a indukcí myelomu monoklonální protilátku se známou specifičností vazby proti určitému antigenu byly bez výsledku. Vznikly však buněčné linie myelomu, které bylo možno pěstovat in vitro a použít při získání hybridomů. Základní myšlenkou Milsteina a Kohlera bylo získat hybridní buňku fúzí normálních B-buněk z imunizovaných zvířat a buňkou myelomu, která permanentně roste a je možno ji pěstovat.
CS 276 448 86 2
V prvních pokusech byla provedena fúze buněk myelomu s lymfocyty myší sleziny, slezina byla odebrána z myší, imunizovaných červenými krvinkami ovce. Tímto způsobem bylo získáno 10 životaschopných hybridů, z nichž dva produkovaly protilátky, specifické proti ovčím červeným krvinkám. Hybridy, produkující protilátky byly natolik podobné buňkám myelomu, že rostly kontinuálně v kultuře a vytvářely nádory při implantaci myším. Velký praktický význam spočíval v tom, že hybridní buňky bylo možno stejně jako buňky myelomu skladovat v kapalném dusíku a Uchovat jejich životaschopnost tímto způsobem po dlouhou dobu.
Získání hybridomů
Myši se imunizují stejně jako při výrobě běžného antiséra, to je opakovaně vždy po několika týdnech. Bezprostředně před fúzí se myš usmrtí a slezina se antiseptický vyjme. MM R
Obal sleziny se nařízne a dřen se opatrně vytlačí. Buňky dřeně, to je přibližně 10 lymfocytů sleziny se uvedou v suspenzi v živném prostředí a smísí s buňkami myelomu v poměru 1 : 1 až 10 : 1. Buněčná směs se odstředěním přitlačí na dno zkumavky a po odstranění kapalného supernatantu se přidá prostředí, usnadňující fúzi, to je 30 až 50% roztok polyethylenglykolu nebo suspendovaný inaktivovaný virus Sendai. Po vymytí tohoto prostředí se buněčná směs převede při koncentraci 10^ buněk v 1 ml do sterilních nádob a kultivuje v inkubátoru za přítomnosti oxidu uhličitého. 2 až 4 týdny po fúzi je mikroskopicky zřejmý růst klonů hybridomů. Od této doby je také možno sledovat přítomnost protilátek v supernatantu. K tomuto účelu je nutno provádět analýzu způsobem, kterým je možno zjistit protilátky v množství menším než 1 /ig (RIA, ELISA, Imunofluorescence). Buňky z pozitivních částečných kultur se pak klonují, to jest zakládají se kultury s jedním typem buněk. Izolované klony, které vytvářejí požadované protilátky se dále pěstují a jejich schopnost vyvolat nádor je možno prokázat vstřiknutím suspenze buněk do břišní dutiny myší, kterým byl předem podán Přistaň, obvykle jde o inbrední myši Balb C. 6 až 20 dnů po naočkování je možno z krve nebo z kapaliny, která se vytvoří z břišní dutiny získat protilátky, jde obvykle o 50 až 150 mg monoklonální protilátky od jedné myši.
Těsně po fúzi se získá velmi heterogenní směs hybridních buněk a buněk, které se fúze 8 3 neúčastnily. Při použití 10 buněk myší sleziny je možno počítat nejvýš s 10 životaschopnými buňkami hybridomů. Hybridní buňky potřebují určitou dobu před svou proliferencí, naproti tomu buňky, které se fúze neúčastnily rostou okamžitě dále, takže je nutno podrobit směs selekci k zajištění přežití malého množství buněk hybridomů. Standardním postupem při vzniku hybridomů je tzv. HAT-selekční prostředí, známé z publikace Littlefield, J. W.: Selection of hybrids from matings of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. Science 145, 709 - 710 (1964). V názvu prostředí znamená Aminopterin, látku, antagonizující kyselinu listovou a blokující hlavní cesty syntézy DNK. Normální buňky obcházejí aminofterinový blok pomocí thimidinkyanázy TK a hypoxanthinguaninfosforibosyltransferázy ((HGPRT), pokud jim je v živném prostředí dostupný thymidin T a hypoxanthin Η. V případě, že buňce jeden z obou enzymů chybí, nemůže v prostředí HAT přežít. Pro vznik hybridomů se proto užívá mutant myelomových buněk, které neobsahují TK ani HGPRT. Tyto buňky přežívají v prostředí HAT pouze v tom případě, že dojde k jejich fúzi s normální buňkou, která přinese do hybridní buňky chybějící enzym. Lymfocyty ze sleziny, které se neúčastní fúze mají přirozeně nízkou životnost v kultuře a proto nebrání v růstu buňkám hybridomů.
Při vzniku buněk hybridomů dochází k následujícím problémům:
1. Selekce pomocí prostředí HAT
Selektivní potlačení růstu buněk myelomu je, jak bylo shora uvedeno základní podmínkou pro vznik klonu hybridomů. Selekce pomocí tohoto prostředí je však i pro normální buňky nefyziologická, takže mění schopnost přežít i schopnost sé rozmnožovat. Zvláště při použití lidských lymfocytů je velmi těžké volit koncentraci jednotlivých složek prostředí HAT tak, aby HGPRT-negativní buňky byly usmrceny, kdežto HGPRT-pozitivní buňky mohly pře žít.
CS 276 448 B6
Poměr mezi počtem buněk lymfocytů a buněk myelomu a vznikem hybridů na druhé straně n je takový, že při použití 10 myších lymfocytů při typickém postupu je vznik 500 klonu hybridomu velmi dobrý výsledek. Protože ve slezině myši i v případě, že byla myš opakovaně imunizována vytváří protilátky pouze 104 až IQ·5 buněk, jak bylo popsáno v publikaci Jerne N. V. a Nordin A. A. Science 140, 405 (1963) je zapotřebí při tvorbě hybridomu 10^ až 104 klonu, aby bylo možno získat jediný klon s požadovanou specifičností protilátky. II lidského hybridomu je poměr ještě horší a za dobrý výsledek je možno považovat získání 4 až 10 hybridních klonů při jedné fúzi.
2. Ztráta chromosomů
Po proběhlé fúzi musí nová hybridní buňka mít zdvojené množství chromosomů. Jak se ukazuje, mají hybridní buňky sklon k tomu, ztrácet chromosomy. Při každém buněčném děle·ní dochází při příliš velkém množství Chromosomů k tomu, že se tyto chromosomy nerozdělí rovnoměrně do obou dceřinných buněk, Dcerinná buňka, která má menší množství chromosomů má proti jiným buňkám při selekci výhodu a stává se převažující buňkou v kultuře. Syntéza imunoglobulinu však není pro životaschopnost hybridní buňky podstatná, tb znamená, že jako přebytečný chromosom může být odstraněn právě ten, který se týká této luxusní syntézy. . Vznik variant v klonu hybridomu, které neprodukují protilátky je tedy velmi častým jevem a je zapotřebí celé řady opatření, zejména opakované selekce, aby bylo možno zajistit u klonu schopnost produkce protilátky. Tendence ke ztrátě chromosomů je zvláště vysoká u hybridních buněk z nestejných druhů. -
3. Hybridní imunoglobuliny
Buňky myelomu jsou zhoubné B-buňky a samy vytváří imunoglobuliny s neznámou specifičností vazby antigenu. Tuto schopnost přináší buňka myelomu stejně jako normální B-buňka do hybridomu. Protože různé řetězce molekul Ig se syntetizují odděleně a teprve potom se skládají na hotové protilátky, dochází k tomu, že v buňce hybridomu vzniká syntéza dvou různých řetězců L a H a přibližně 10 možných kombinací, z nichž správná kombinace tvoří pouze 1/16 celkového množství Ig. Z tohoto důvodu byly velmi pracně již vyvinuty buňky myšího myelomu jako mutanty, které samy o sobě nevytváří žádný řetězec H nebo L. Pro fúzi lidských lymfocytů však není dosud k dispozici žádná podobná buněčná linie myelomu.
Další problémy vznikají při dalších možných postupech vzniku hybridomu.
I. Imortalizace B-lymfocytů působením virů
Lidské B-lymfocyty z normálního dárce je možno transformovat na zhoubné infekcí virem Epstei.n-Barr (EBV). Buňky, infikované EBV jsou lymfoblastoidní a je možno je pěstovat in vitro kontinuálně a klonovat. Ve srovnání s hybridomem produkují lymfoblastoidní EBV linie pouze 1/10 nebo menší množství imunoglobulinu při neuspokojivé produkční stálosti. Bylo by zapotřebí, fixovat B-buňky v rannějším stádiu diferenciace působením EBV a tak získat častější výskyt klonů, které produkují IgM v malém množství. .
Analogickým způsobem je možno myší B-lymfocyty transformovat působením viru Abelsonovy myší leukemie (MuLV). Také v tomto případě dochází k nepříznivému fixování a k.velmi špatné produkci protilátek. .
2. Dlouhodobé kultury netransformovaných B-lymfocytů
Nejnovější výsledky,popsané v publikacích Špredni B. a další· Long-term culture and cloning of nontransformed human B-lymfocytes. J. Exp. Med. 154., 1500 až 1516 (1981), Howard,' M . a další: Long-therm culture of normal mouse B-lymfocytes. Proc. Natl. cad. Sci. USA in press) ukazují na možnost, pěstovat a klonovat lymfocyty permanentně bez transformace při zachování zvláštních podmínek při pěstování, například permanentní mitogenní stimulace prosCS 276 448 B6 4 tředí s obsahem lymofokinu a podobně. Pro běžnou výrobu monoklonálních protilátek nejsou tyto postupy dosud vhodné.
Dosavadní stav techniky je tedy možno shrnout následujícím způsobem:
B-lymfocyty normálních dárců je možno uměle imortalizovat. Při technice vzniku hybridomu se užívá živých buněk myelomu, které se v kultuře pomnožují neomezeně k fúzi s B-lymfocyty, stimulovanými antigenem. Takto získané hybridní buňky se izolují, selekcí HAT a klonují v jednotlivých kulturách. Klony hybridomů, které vytváří protilátky s požadovanou specifičností se pak pomnoží k produkci monoklonální protilátky. Podstatné nevýhody má dosud selekce HAT vzhledem ke ztrátám chromosomů a ke vzniku hybridních imunoglobulinů.
Při jiném postupu je možno infikovat B-lymfocyty specifickými viry za vzniku zhoubných buněk, které trvale rostou a tím získat protilátky. Tyto buňky však vytvářejí pouze malé množství protilátek. .
Vzhledem k větší produkci monoklonálních protilátek s definovanou specifičností vazby antigenu je daleko nejvýhodnější technika hybridomů.
Technika hybridomů má však rovněž velké nevýhody. Nejvážnější nevýhoda spočívá v tom, že buňky, užité k fúzi jsou omezeny na několik druhů, zejména lymfocyty a nervové buňky.
Vynález si klade za úkol odstranit tyto nevýhody a navrhnout nový, výhodný způsob výroby trvale udržovatelných buněčných linií živočišného i lidského původu.
Předmětem vynálezu je způsob výroby permanentních buněčných linií' živočišného i lidského původu fúzí normálních buněk lidského i živočišného původu s biologickými složkami, které působí udržitelnost kultury in vitro, vyznačující se tím, že se podrobí fúzi normální lidské nebo živočišné buňky s karyoplasty, cytoplasty, jadernou nebo cytoplasmatickou frakcí, bohatou na mitochondrie lymfatických nebo epitheliálních nádorových buněk, které samy o sobě nejsou schopny pomnožení a pocházejí z transformovaných buněk, fúze se provádí za přítomnosti polyethylenglykolu nebo viru Sendai, a získané buňky se pěstují v živném prostředí bez selekčních látek.
Podstatné pro způsob podle vynálezu je to, že fragmenty, použité při fúzi jsou úplně prosté reprodukce schopných buněk a samy o sobě se také nemohou pomnožit.
Je překvapující, že při provádění způsobu podle vynálezu nevede převaha podílu cytoplasmatu normální buňky k vyloučení zhoubných vlastností druhého partnera a z tohoto důvodu k odstranění schopnosti permanentního růstu, přestože je známo, že při fúzi transformovaných buněk s normální cytoplasmou nezhoubných buněk se zhoubnost Ztrácí jak bylo popsáno v publikaci: Shay W. J. a další: Supression of tumorigenicity in Cybrids.
Nebylo také možno předpokládat, že se buněčná jádra spojí s izolovanými jádry například buněk myelomu na společný genom v případě, že se cytoplasma myelomu do hybridní buňky nepřenáší.
Fúze se provádí známým způsobem s výhodou za přítomnosti polyethylenglykolu nebo viru Sendai, protože v tomto případě je možno stejně jako při vzniku hybridomů dosáhnout vyššího podílu fúze. Další známé prostředky k usnadnění tohoto postupu jsou rovněž použitelné.
Fragmenty transformovaných buněk je možno získat například z buněk myelomu známým způsobem. S výhodou se buněčná stěna rozruší, například se po odstředění odstraní frakce jader z frakce cytoplasmy a frakce se použijí jednotlivě. Rozrušení buněk se s výhodou provádí nabobtnáním glycerolu a přenesením do pufru, prostého glycerolu. Další výhodný způsob spočívá ve výrobě karyoplastů a cytoplastů tak, že se na buňky působí cytochalasinem B, což je antibiotikum, které se běžně dodává. Postup je znám z publikace Biochem. Biophys. Res. Comm. 63, 669 až 674 (1975). Při tomto postupu je možno získat například pouze buněčné jádro, obklopené membránou, dále karyoplasty a cytoplasty. Použít je možno jádra nebo
CS 276 448 B6 frakce cytoplasmy, které již nejsou obklopeny buněčnou membránou. Mechanické rozdrcení buněk, kterého je rovněž možno užít je známé a nepotřebuje žádné vysvětlení.
Buněčné fragmenty je možno užít v čerstvém stavu bezprostředně po získání nebo později, v tomto případě se konzervují lyofilizací.
Transformované buňky jsou takové buňky, které in vitro a in vivo neodpovídají normálním podmínkám růstu. Příkladem mohou být zhoubné buňky, například buňky rakoviny, buňky změněné injekcí viru (například Eppstein Barr) a buňky pozměněné jinými karcerogenními látkami.
V případě, žé se užije buněčných frakcí, nemusí tyto frakce být zcela čisté, nesmí však obsahovat neporušené rozmnožování schopné buňky.
Podstatným znakem způsobu podle vynálezu je skutečnost, že získané hybridy nejsou vystaveny konkurenci nehybridních, in vitro pěstovatelných buněk a že tedy růst takových buněk není nutno potlačovat například selekcí HAT. Tímto způsobem je také možno vyloučit velmi nevýhodný vliv selekčního prostředí na hybridy a tím zlepšit výtěžek i životaschopnost permanentně pěstovatelných buněk.
Dále již není zapotřebí při tvorbě hybridů užít buněk, citlivých na prostředí HAT. Je možno získat celou řadu permanentně rostoucích buněčných linií, které tuto vlastnost nemají a pro běžnou techniku hybridomu by nebyly použitelné.při provádění způsobu podle vynálezu je však možno fragmenty užít k fúzi.
Buňky je s výhodou možno zpracovat cytochalasinem B, čímž dochází k vytlačení jádra do extrémní polohy. Pak je možno například odstředěním získat buněčnou plasmu, prostou jádra a jádro, obklopené buněčnou membránou a malým množstvím cytoplasmy (karyoplast nebo minibuňka). Jak karyoplast, tak cytoplast již nejsou schopné pomnožování, udržují si však své specifické funkce několik hodin až dnů. Tento postup vyžaduje poměrně vysokou koncentraci cytochalasinu B a je plně reversibilní. Menší koncentrace potlačují buněčné dělení, aniž by však došlo k vytlačení jádra. Standardní způsob výroby cytoplastu a karyoplastu pro volné buňky byl popsán v publikaci Wigler Μ. N. a Weinstein I. B.s Preparative metod for obtaining enucleated mammalian cells Biochem. Biophys. Res. Comm. 63, 669 až 674 (1975).
Bylo prokázáno, že je možno při provádění způsobu podle vynálezu užít nejen B-lymfocyty, nýbrž také řadu dalších buněk živočišného i lidského původu, které je rovněž možno imortalizovat, jak je zřejmé z příkladů 6 až 8. Jde zejména o různé buněčné typy jako T-lymfocyty, které přenášejí buněčnou imunitu a regulují imunologický systém, endotelové buňky, to je buňky z žilní stěny u lidí a buňky melanomu, izolované z nádorových metastáž.
Způsob podle vynálezu umožňuje převést do stálé kultury řadu buněk a tím také řeší problém produkce protilátek, enzymů, srážecích faktorů a podobných buňkami syntetizovaných látek in vitro. Kultury,získané způsobem podle vynálezu umožňují nahradit v některých oblastech pokusná zvířata i při zkoušení chemických látek.
Získané buněčné linie je tedy možno užít k získání buněčných produktů, například ,monoklonálních protilátek, srážecích faktorů, lymfokinů, enzymů a zvláště bílkovin a dalších produktů.
Zvláště důležitá je produkce monoklonálních protilátek permanentně pěstovatelnými Blymfocyty, buňkami endotelu, melanomu, jaterními buňkami, buňkami ledvin, dále získáním srážecích faktorů z T-lymfocytů + B-lymfocytů a/nebo makrofágů a získání lymfokinů ze žlázových buněk, stejně jako hormonů a podobně. Je zřejmé, že způsobem podle vynálezu bude možno získat ještě další zajímavé buněčné produkty.
. Získání buněčných produktů není omezeno na výchozí buňky. Permanentně pěstovatelné buněčné linie je možno užít také k expresi buněčných produktů, které původní buňka nevyráběla a které jsou heterologní a to tak, že se genetická informace předá získáním nové kombinace genů v hybridní buňce. To je možno provést například transformací. Pokusy ukázaly, že do permanentně pěstované buňky, získané způsobem podle vynálezu je možno pomocí vektoru
CS 276 448 B6 6 přenést informaci a dosáhnout exprese produktu, pro jehož produkci byl vektor kódem.
Permanentně pěstovatelné buňky je také možno užít jako zkušební objekty pro různé účinné látky. Může také jít o zdroje genetické informace, a to tak, že se část hybridní buňky, která nese genetickou informaci, to je genom, část genomu nebo RNA izoluje a pak známým způsobem transformuje do vhodného mikroorganismu. Z něhož se pak získá požadovaný buněčný produkt. .
Tímto způsobem je možno získat buněčné produkty, například monoklonální protilátky a další buněčné produkty, a to tak, že se vzniklá hybridní buňka neužije přímo k produkci buněčného produktu, nýbrž pouze k přenesení genomu, části genomu nebo RNA do mikroorganismu, který se pak užije k získání monoklonální protilátky nebo jiné buňkou produkované látky. Při tomto provedení způsobu podle vynálezu se izoluje genom hybridní buňky známým způsobem a transformuje se pomocí vhodného vektoru, k čemuž je možno užít známých vektorů a standardních metod při použití vhodného mikroorganismu.
Transformovaný mikroorganismus se pák pěstuje běžným způsobem a získává se z něho požadovaný buněčný produkt. Jde zejména o kmeny E.coli.
Vynález bude osvětlen následujícími příklady, v nichž budou užity následující zkratky
| a obchodní názvy: | |
| AK | protilátka |
| íg | imunoglobulin |
| řetězec H a L | těžký a lehký řetězec molekuly Ig |
| Přistaň | 2, 6, 10, 14-tetramethylpentadekan |
| HAT-selekční prostředí | prostředí obsahující hypoxanthin, aminopterin a thy- |
| midin | |
| TK | thymidinkináza |
| HGPRT | hypoxanthin-guanin-fosforibosytransferáza |
| EBV | virus Epstein-Barr |
| MuLV | virus Abelsonovy myší leukemie |
| CB | cytochalasin 8 antibiotikum (ALDRICH BIOCHEMICALS |
| ’ Milwaukee USA) | |
| DMSO | dimethylsulfoxid |
| OMEM | Dulbecco minimální základní prostředí |
| FKS | fetální telecí sérum |
| Ficoll | polymerní třtinový cukr (PHARMACIA) |
| PEG | polyethylenglykol |
| PBS | chlorid sodný, pufrovaný fosfátem |
| POD | peroxidáza |
| ABTS | amonná sůl kyseliny 2,2’-azinodi(3-ethylbenzothiazoli |
| -6-sulfonové) | |
| EBSS | Earleho vyvážený sojový roztok |
| RPMI 1640 | Rosewell Park Memory Institut (živné prostředí) |
| Tris | tris(hydroxymethyDaminomethan |
| PBL | lymfocyty periferní krve |
| MNC | jednojaderné buňky (lymfocyty, monocyty) |
| hTSH | lidský hormon, stimulující štítnou žlázu |
| 7 | CS 276 448 B6 |
| /3 -hTSH | β -řetězec uvedeného hormonu |
| FA | Freundovo pomocné činidlo |
| CFA | kompletní Freundovo pomocné činidlo |
| IFA Methocel 1500 | nekompletní Freundovo pomocné činidlo methylcelulóza (FLUKA) |
| CMV | cytoplasmatická membrána |
| FITC-Covaspheres | fluoresceinisothiokyanát ve formě kuliček (COVALENT TECHNICALS Ann Arbor, Mich. USA) |
| EAZ | buňky Ehrlichova karcinomu (ATCC, CCL 77) |
Příklad 1
A Výroba karyoplastů a cytoplastů z buněk myšího myelomu linie P3X63 Ag 8.653 ATCC No-CRL-1580 způsobem podle publikace Wigler, Μ. H. a Weinstein, I. B.: A preparative method for obtaining enucleated mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 63, 669 až 674 (1975).
A.l Materiály
Cytochalasin B (CB, Aldrich Biochemicals, Milwaukee, USA) se rozpustí v dimethylsulfoxidu (DMSO Merck) v koncentraci 2 mg/ml a skladuje se jako Zásobní roztok při teplotě 4 °C.
Ficoll-400 (Pharmacia, polymerovaný třtinový cukr) se rozpustí v redestilované vodě v koncentraci 1 g/ml, sterilizuje se v autoklávu a užívá se jako 50¾ zásobní roztok, skladovaný při teplotě -20 °C.
Dulbecco minimální základní prostředí (DMEM) v jednoduché a dvojnásobné koncentraci, obsahuje fetální telecí sérum, (FKS), L-glutamin v koncentraci 200 mmol/litr, streptomycin a penicilin (Boehringer Mannheim). Zkumavky z nitrátu celulózy se sterilizují ultrafialovým zářením.
Buňky myelomu linie Ag 8.653 ATCC CRL-15B0: Linie je popsána v publikaci Kearney, ΰ. F. a další. A new mouse myeloma cell line that hat lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibodysecreting hybrid cell lines. J. Immunol. 123, 1548 až 1550 (1979). Linie je odolná proti azachininu, citlivá ná HAT a nesyntetizuje ani řetězec H ani řetězec L imunoglobulinu Ig. Udržuje se v DMEM + 15 % FKS + glutamin + penicilin-streptomycin + pyrohroznan (plné prostředí DMEM při teplotě 37 °C v atmosféře se 7 % oxidu uhličitého.
A.2 Metody ' >3
Enukleace: Θ x 10 buněk Ag 8^653 se odstředuje 5 minut při 10 otáček za minutu a buňky se tak dlouho uvádějí v suspenzi ve 12 ml 12,5¾ roztoku Ficoll-DMEM-CB-DMSO, až vznikne suspenze, prostá buněčných shluků. Vždy 3 rol této suspenze se převrství na 12 hodin předem připravený gradient Ficoll a převrství se 2 ml roztoku OMEM-CB-DMSO, prostého Ficollu. Zkumavky s uvedeným gradientem se odstřelují v ultraodstředivce 60 minut při 25 000 otáčkách za minutu a při teplotě 31 °C.
Po skončeném odstřelování se makroskopicky viditelné frakce (pásy) pomocí injekční stříkačky s dlouhou kanylou shora odděleně odebírají, ředí se vždy 20 ml živného prostředí DMEM bez přísad, znovu se odstředí a znovu se uvedou v suspenzi v čerstvém prostředí DMEM.
Získají se následující 4 frakce. .
a) Buněčná drť, na rozhraní 0 až 12,5 ¾ prostředku Ficoll,
CS 276 448 86
b) bezjaderné cytoplasty v oblasti 15 až 16 % prostředku Ficoll,
c) jádra bez zjistitelného plasmatu a přibližně 2 % bezjaderných buněk v rozmezí 17 až 25 % prostředku Flcoll,
d) podle morfologických kritérií intaktní buňky s jádrem a dobře odlišitelným plasmatem, frakce obsahuje malé množství jader bez plasmatu jako sediment na dně zkumavky.
Při počítání buněk bylo možno prokázat, že bylo obsaženo 8 x 107 Ag 8.653-buněk ve frakci b), 1,25 χ 106 cytoplastů ve frakci c) 4 χ 10é karyoplastů a ve frakci d) 1,1 χ 107 intaktních buněk.
B Fúze buněk myší sleziny s izolovanými myelomovými karyoplasty, cytoplasty a buňkami sedimentu z pokusu A.
B.l Materiál.
Činidlo k uskutečnění fúze: 20 g polyethylenglykolu (PEG-4000) se roztaví v autoklávu, zchladí se na teplotu 56 °C a při této teplotě se smísí s 20 ml prostředí DMEM.
HAT-selekční prostředí: k plnému prostředí OMEM se přidá 4 χ 10-7 M aminopterinu, -4-5 x 10 M thymidinu a 3,1 x 10 M hypoxanthinu.
Nádoby pro pěstování: nádoby pro pěstování tkáňových kultur (Cluster 24 a Cluster 96, firma Costar, Cambridge, Mass., USA.
B.2 Metody
Fúze: frakce b), c) a d), připravené v pokusu A se odděleně smísí š buňkami sleziny v poměru 10 : 1 a odstředěním se vytvoří sediment. Supernatant se opatrně oddělí. K sedimentu se přidá 0,8 ml 50% roztoku PEG při teplotě 37 °C 1 minutu se směs mísí za opatrného stálého protřepávání, pak se přidá 5 ml prostředí DMEM v průběhu 5 minut při teplotě místnosti. Po přidání dalších 20 ml prostředí DMEM se buňky nechají sedimentovat, znovu se uvedou v suspenzi v 5 ml čerstvého plného prostředí OMEM a rozdělí se na 10 tkáňových kultur (Costar), převrstvených makrofágy břišní dutiny. Oo jednotlivých kultur se ve dnech 1, 2, 3, 5, 7, 10 a 13 přidává plné prostředí DMEM.
Makrofágy břišní dutiny jako živné buňky: den před fúzí se usmrtí myši kmene Balb/c a za sterilních podmínek se do břišní dutiny vstřikne 4 až 5 ml PBS a po 1 minutě se tento .materiál opět odsaje. Vymyté buňky se promyjí prostředím DMEM. Plné prostředí se upraví na hustotu buněk 2 χ 105 a rozdělí se po podílech 0,5 ml do nádob pro pěstování buněk (Costar).
Buňky sleziny: myším kmenem Balb/c se bezprostředně před fází za aseptických podmínek vyjme slezina a její buňky se uvedou v suspenzi v prostředí DMEM. Shluky buněk a části tkáně se odfiltrují přes vrstvu mulu.
Elisa pro myší imunoglobulin: mikrotitrační plotny se převrství myšími protilátkami Ig z ovce (IgG frakce: 10 mikrogramů/ml 0,9% chloridu sodného, 150 mikrolitrů roztoku protilátek na jednu komůrku). Vždy 100 mikrolitrů supernatantu se napipetuje do každé komůrky a plotny se nechají inkubovat hodinu při teplotě místnosti. Po odsátí supernatantu a dvojím promytí se komůrky převrství 100 mikrolitry roztoku konjugátu Ig-POD proti myšímu séru, kovalentně vázaného peroxidázou z mořské cibule a směs se hodinu inkubuje při teplotě místnosti. Po trojím promytí se do každé komůrky napipetuje 100 mikrolitrů roztoku substrátu (ABTS) a zabarvení se stanoví fotometricky.
B.3 Výsledky
Frakce cytoplastů, karyoplastů a sedimentu, připravené podle pokusu A se podrobí fúzi paralelně s buňkami sleziny myší kmene Balb/c a rozdělí se do 10 kultur o objemu 1 ml.
CS 276 448 B6
Vždy 5 kultur se pěstuje bez HAT (plotna I) a 5 kultur s přísadou HAT (plotna II).
Až do dne 21 po fúzi (n. F.) se v žádné komůrce nepozoruje růst lymfoidních buněk makroskopicky ani mikroskopicky s výjimkou komůrek 4A, 4B, 40, 30 a 3D na plotně I, které obsahovaly materiál sedimentu bez prostředí HAT po fúzi. V těchto komůrkách bylo možno pozorovat již 5 dnů po fúzi kolonie, které se rychle zvětšovaly. 8. dne po fúzi bylo do těchto komůrek přidáno prostředí HAT. V průběhu 4 dnů všechny kolonie uhynuly.
27. dne po fúzi bylo možno pozorovat nejprve v některých, později v téměř všech komůrkách kolonie, které byly tvořeny velkými kulovitými, transparentními buňkami, které nelnuly k podkladu. 65. dne po fúzi byly s výjimkou komůrek I-3B, II-1A a II-4A všechny komůrky naplněny koloniemi lymfoidních buněk. Při zkoumání supernatantu na obsah myšího Ig v této době bylo možno prokázat, jak ukazují údaje v tabulce I pozitivní až silně pozitivní hodnoty při Zkoušce ELISA ve všech dílčích kulturách s výjimkou Svrchu uvedených ' komůrek, v nichž nedošlo k vývoji kultur.
Tabulka 1
ELISA ke zjištění myšího imunoglobulinu v supernatantu pokusu B (den 65 po fúzi).
Plotna I s komůrkami: bez HAT (Výjimky: 4A, 4B, 4C, 3C, 3D: + HAT, den 8 až 15)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 664 | 601 | 706 | 632 | ||
| B | 526 | 766 | 011 | 633 623 | ||
| C | 576 | 769 | 855 | |||
| D | 794 | 1500 | 791 |
= cytoplasty po fúzi = karyoplasty po fúzi = buňky sedimentu po fúzi
CS 276 448 B6
Plotna II s komůrkami: s HAT (den 1 až 14)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 008 | 568 | 580 | 000 | ||
| B | 267 | 538 | 539 | 547 | ||
| C | 656 | 530 | 729 | 822 | ||
| 0 | 848 | 570 | 605 |
3 negativní-Ktr. 1 (DMEM - plné prostředí): '010 negativní-Ktr. 2 (DMEM, bez FKS): '040 pozitivní-Ktr. 1 (myší sérum 1 x 10-3): '723 pozitivní-Ktr. 2 (myší sérum 1 x 10~2): > 1500
a) Fúze karyoplastů s buňkami myší sleziny vedla ke vzniku buněk, které bylo možno množit in vitro a které vylučovaly imunoglobulin. Přestože bylo do hybridu přeneseno jen malé množství cytóplasmatu maligních buněk, nedošlo k možnému vyloučení vlastností permanentního růstu.
b) Hybridní buňky, vyvolané působením karyoplastů vytvářely a vylučovaly myší imunoglobulin v množství, které odpovídá hybridomu. Znamená to, že nedostatek podílu cytoplasmatu Ag 8.653 neovlivnil schopnost produkce a sekrece hybridu karyoplastů a buňky sleziny.
c) Z fúze cytoplastů a buněk sleziny vznikly buněčné klony, které se množily in vitro a vytvářely protilátky. Uspokojivé vysvětlení tohoto překvapujícího jevu prozatím není k dispozici.
Příklad 2
Fragmentace buněk rozrušením glycerolem a fúze s lidskými krevními lymfocyty
Materiál ’ >
Earlovo vyvážené prostředí s obsahem solí (EBSS), živné prostředí APMI 1640, fetální telecí sérum (FKS) (Boehringer Mannheim), 8-azaguanin (8-Ag) (Serva Heidelberg), agar (Bacto-agar 1614) (Difco, firma Hedinger KG, Stuttgart). Linie plasmacytomů HS SULTAN ATCC CRL-1484 byla rozmražena jako buněčný materiál konzervovaný zmrazením podle pokynů ATCC a pěstována v kultuře.
Podle způsobu, který byl popsán v publikaci Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 71, 2679 až 2683 (1974) se pěstuje 8 x 107 buněk HS Sultan ve 100 ml plného prostředí RPMI 1640, které obsahuje 20 mikromolú 8-Ag, kultura se pěstuje 48 hodin. Přežívající buňky se dále pěstují v 10 ml plného prostředí RPMI 1640 bez 8-Ag celkem 10 dnů. Buňky se pak přenesou na agarové plotny Coffino, P. a další: Proč. Nati. Acad. Sci. USA. £8, 219 až 223 (1971), které byly doplněny prostředím RPMI 1640 + 20 mikromolú 8-Ag, bylo užito přibližně 500 buněk na petrihó misku, kultura byla pěstována v inkubátoru v prostředí s obsahem kysličníku uhličitého. Po 9 dnech se izolovaně rostoucí kolonie sterilně odeberou z povrchu agaru a množí se v plném prostředí RPMI 1640 s přísadou 8-Ag. Klon, který byl označen HS
CS 276 448 B6
-SULTAN-8Ag-Rl, jehož buňky se pomnožovaly na dvojnásobný počet vždy po 20 hodinách byl užit k dalšímu pokusu. Tyto buňky byly citlivé na HAT. Buňky, které byly pěstovány v hustotě 1 až 5 x 10^ na ml v prostředí HAT (prostředí RPMI 1640 s 0,1 mmolu hypoxanthinu, 400 mmolu aminopterinu a 31 mikromolu thymidinu) se nepomnožovaly a úplně uhynuly v průběhu 7 dnů.
Lidské lymfocyty z periferní krve (PBL) ve 300 ml žilní krve se sterilně izolují do roztoku heparinu o koncentraci 2 jednotky/ml krve a frakce mononukleárních buněk (MNC: O lymfocyty, monocyty) se izolují standardním způsobem. 3 x 10 MNC se uvede v suspenzive 100 ml RPMI 1640 + 10 % FKS a k oddělení monocytů se Směs inkubuje 24 hodin v nádobách pro pěstování tkáňových kultur při teplotě 37 °C v prostředí s 5 % COg.
Metody .
Fragmentace HS-R1: Buňky se smísí způsobem podle publikace Jett M. a další: Isolation and characterization of plasma membranes and intact nuclei from lymphoid cells. 3. Biol. Chern. 252, 2134 až 2142 (1977) a rozruší se inkubací v 10 mmolech tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou, jádra se oddělí odstředěním při 200 g 10 minut při teplotě 4 °C od zbytků membrán, které se podrobí sedimentaci odstředěním při 5 000 g 40 minut při teplotě 4 °C.
O
Fúze: Přibližně 1 x 10 729 HS-Rl-jader se uvede v suspenzi s lidskými lymfocyty v prostředí RPMI 1640 v poměru 1:1a pak se podrobí fúzi působením PEG, tak jak bylo popsáno v příkladu 1 8.2.
O
Sediment zbytku buněčných membrán z přibližně 1 x 10 buněk HS-R1 se převřství suspenzí 1 x 107 lidských lymfocytů a podrobí fúzi působením PEG.
Při kontrolním pokusu se smísí 2 x 10? jader HS-R1 v plném prostředí RPMI 1640 bez HAT a materiál se pěstuje na 4 plotnách s 24 komůrkami (Costar) v inkubátoru v atmosféře s obsahem oxidu uhličitého.
Všechny kultury po fúzi i kontrolní kultury se kultivují na plotnách s obsahem makrofágů z břišní dutiny myši jako na živných buňkách, jak bylo popsáno v příkladu 1.
Sledováním lidského Ig v supernatantu kultur: Mikrotitrace způsobem ELISA se provádí jako v příkladu 1 B.2. K převrstvení se užije Ig ovce proti lidskému séru, čištěný imunoadsorptivním způsobem. Stejné prostředky AK byly užity k získání konjugátu Ig-POD proti lidskému séru. AK z ovce reaguje s každým lidským Ig a není možno prokázat zkříženou reaktivitu s Ig skotu nebo krysy. ·
Výsledky
Fragmentace působením směsi glycerinu, tris-pufru a kyseliny chlorovodíkové: Tímto způsobem se rozkládají buňky HS-R1 na frakci s obsahem jader, která sedimentuje při 200 g a na bezjadernou frakci cytoplasmy a membrány, která sedimentuje při 5 000 g. Pod mikroskopem není možno pozorovat v žádné z těchto frakcí neporušené buňky HS-R1. Jádra byla obklopena menším nebo větším množstvím nerovnoměrně ohraničného cytoplasmatu. Výtěžek jader byl přibližně 85 %. Frakce s obsahem zlomků buněčné membrány obsahovala kromě malého množství drti membrány o velikosti 0,5 až 2 mikrometry bez zjistitelných součástí jader. '
Kultura s obsahem 2 x 107 jader v plném prostředí RPMI bez HAT nevedla v průběhu pozorovací doby 12 týdnů k žádnému růstu buněk HS-RI.
r Kultura po fúzi: Lymfocyty s jádry a lymfocyty s cytoplasmatickou membránou po fúzi byly rozděleny do 10 ploten s 24 komůrkami (Costar) a vždy polovina komůrek byla pěstována bez HAT a polovina s přísadou HAT v plném prostředí RPMI s přísadou myších makrofágů. Druhý týden po fúzi je možno pozorovat kolonie lymfoidních buněk, které se postupně zvětšují.
Produkce lidského imunoglobulinu: 21. den po fúzi byly zkoumány supernatanty na obsah
CS 276 448 86 lidského imunoglobulinu (19. dne bylo živné byly tímto způsobem získány, jsou uvedeny v
Tabulka 2a
ELISA ke zjištění lidského imunoglobulinu v
I + HAT prostředí úplně vyměněno). Výsledky, které následujících tabulkách 2a a 2b.
supernatantů (karyoplasty, 21 dnů po fúzi).
I - HAT
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 029 | 147 | 286 | 147 | 228 | 270 |
| B | 171 | 086 | 050 | 144 | 846 | 121 |
| C | 118 | 156 | 250 | 082 | 179 | 059 |
| 0 | 120 | 1148 | 024 | 096 | 023 | 151 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 660 | 233 | 175 | 270 | 410 | 322 |
| B ’ | 103 | 264 | 229 | 253 | 271 | 260 |
| C | 045 | 343 | 370 | 128 | 150 | 126 |
| D | 171 | 173 | 141 | 116 | 218 | 699 |
II + HAT
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 135 | 290 | 107 | 279 | 530 | 674 |
| 8 | 116 | 500 | 469 | 315 | 315 | 627 |
| C | 120 | 050 | 068 | 159 | 226 | 145 |
| D | 191 | 078 | 686 | 110 | 242 | 561 |
II - HAT
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 381 | 235 | 489 | 514 | 608 | 217 |
| B | 348 | 239 | 214 | 158 | 367 | 163 |
| C | 185 | 275 | 235 | 234 | 322 | 316 |
| 0 | 219 | 202 | 292 | 283 | 220 | 052 |
Tabulka 2b
Cytoplasty, 21 dnů po fúzi
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 052 | 627 | 917 | |||
| B | 041 | 326 | 715 | |||
| C | 071 | 400 | 826 | 0889 | ||
| 0 | 079 | 917 | 494 | 1016 |
t T
2 = kontrolní kultura s jádry = s HAT .= bez HAT . V případě, že se uvádějí extinkční hodnoty 0 až 99 jako negativní až pochybné, hodnoty 100 až 200 jako pozitivní a hodnoty vyšší než 200 jako silně pozitivní, je možno uvádět pro kultury, získané fúzí jader následující rozdělení.
| 13 | CS 276 448 86 | ||||
| Pěstované hybridy lymfocytů s jádry | ELISA na lidský imunoglobulin | ||||
| negativní | pozitivní | silně pozitivní | |||
| s HAT | n | 11 | 18 | 19 | |
| (n = 48) | (¾) | (23) | (37) | (40) | |
| bez HAT | n | 2 | 12 | 34 | |
| (n = 48) | (¾) | (4) | (25) | (71) |
Z výsledků je možno vyvodit následující závěry:
Kultury po fúzi, které je možno získat s použitím frakcí z rozrušených buněk je možno dále pěstovat bez selekce pomocí HAT. Toto pěstování je daleko méně namahavé než příprava kultur působením cytochalasinu B a poskytuje materiál, schopný fúze ve vysokém výtěžku. Čisté rozdělení na frakci jader a na frakci cytoplasmatické membrány se nedosahuje ani jedním způsobem. Frakce, která obsahuje převážně jádra i frakce, která obsahuje převážně cytoplasma a buněčnou membránu poskytuje po fúzi s lidskými lymfocyty z krve in vitro klony buněk, schopné pomnožování a produkující AK. Paralelní pěstování hybridů lymfocytů a jader s přísadou HAT a bez této přísady prokazuje negativní působení selekčního prostředí. S přísadou HAT je 23 % primárních kultur Ig-negátivních a pouze 40 % silně pozitivních. Bez HAT je přes 70 % kultur silně pozitivních a pouze 4 % kultur Ig-negativních.
Příklad 3
Fúze buněk sleziny imunizované myši s nativními a fragmentovanými buňkami myelomu Ag 8.653
Materiál
Lidský hormon stimulující štítnou žlázu (hTSH) a jeho izolovaný β-řetězec (jí-hTSH), (Boehringer Mannheim). Dále se užije kompletní a inkompletní Fřeundovo pomocné činidlo (CFA, IFA) (Oifco, Methocel 1500, Fluka) a FITS-Covaspheres (Covalent Tech. Co., Ann. Arbor, Michigan, USA).
Metody
Imunizace; Myši kmene Balb/c se v dni 1 primárně imunizují působením j3-hTSH, 40 mikrogramů v CFA intraperitoneálně a v den 196 se imunologická reakce podpoří podáním hTSH, 50 mikrogramů v IFA intraperitoneálně, v den 266 hTSH bez pomocného činidla intraperitoneálně a v den 294 podáním hTSH nitrožilně. v R
Buňky sleziny v množství přibližně 1 x 10 se odeberou z imunizovaných myší 3 dny po poslední injekci způsobem podle příkladu 1, B.2 a užijí se ke dvěma fúzím. 7 7
Fúze 1: 5 x 10 buněk sleziny a 1 x 10 Ag 8.653 se smísí způsobem podle příkladu 1 8.2 a materiál po fúzi se pěstuje ve 48 plotnách s 24 komůrkami s obsahem DMEM plného prostředí s přísadou HAT a myších makrofágů. ’
Fúze 2: 1 x 10 buněk Ag 8.653 se rozruší způsobem podle příkladu 2 postupným působením glycerolu a 10 mmolů tris-pufru s kyselinou chlorovodíkovou. Frakce cytoplasmatu a buněčné membrány CMV se peletuje při 5 000 g 40 minut při teplotě 4 °C. Frakce jader se smísí s 7 x 107 buněk sleziny, odstředěním Se navrství na sediment CMV a fúze se provádí standardním způsobem při použití PEG stejně jako v příkladu 1 B.2, Takto získaný materiál
CS 276 448 B6 se pěstuje v plném prostředí DMEM na 24 plotnách s 24 jamkami s přísadou makrofágu bez HAT.
Značení a klonování hybridních buněk podle antigenu: (FITC-) Covaspheres se převrství podle doporučení výrobce kovalentně hTSH (TSH-CS) a skladuje v 5 % roztoku azidu sodného. Způsobem popsaným v publikaci Parks 0. R. a další: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 1982 až 1966 (1979) se tímto způsobem buňky označí a pomocí cytofluorografu se velké, při fluorescenci pozitivní buňky jednotlivé uloží do jamek v plotnách, tyto plotny se 24 hodin před tímto pokusem naplní plným prostředím DMEM s obsahem nižších makrofágů.
Elisa pro protilátky, specifické proti TSH: Převrstvení, inkubace supernatantu kultury, reakce substrátu a vyhodnocení je stejné jako v příkladu 1 B.2. Místo Ig-POO proti myšímu séru se užije konjugát TSH-POD. Pozitivní kontrolou je sérum hTSH-hyperimunizované myši v ředění 1Ό-·5, negativní kontrolou je klon, který vytváří protilátky proti nepoužitému antigenu (myší protilátka proti digoxinu).
Výsledky
Jak v kulturách z fúze 1 s intaktními buňkami Ag 8.653 tak v kulturách z fúze 2 s fragmenty buněk Ag 8.653 je možno pozorovat 14. dne ve všech jamkách kolonie velkých lymfoidních buněk. Test Elisa, prováděný se supernatantem kultur 14. dne ke zjištění protilátek, specifických proti TSH poskytl výsledky, které jsou souhrnně uvedeny v následující tabulce 3. Ve všech dílčích kulturách bylo možno prokázat protilátky proti TSH.
Tabulka 3
ELISA ke zjištění anti-TSH v supernatnatu, den 14 po fúzi, a) fúze 1 (intaktní Ag 8.653), b) fúze 2 (Ag653-fragmenty)
a) b)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 235 | 236 | 212 | 149 | 119 | 212 |
| B | 109 | 221 | 119 | 104 | 176 | 068 |
| C | 116 | 108 | 135 | 139 | 093 | 135 |
| D | 171 | 128 | 120 | 228 | 137 | 145 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| A | 217 | 268 | 267 | 286 | 194 | 291 |
| B | 288 | 278 | 362 | 317 | 280 | 305 |
| C | 207 | . 292 | 252 | 226 | 292 | 271 |
| 0 | 295 | 376 | 370 | 338 | 310 | 333 |
Negativní-kontrola (DMEM-plné prostředí): 000
Pozitivní-kontrola (anti-TSH-myší sérum): 362
15. dne se buňky, které nelnou k podkladu z jednotlivých jamek po fúzi 1 a 2 vymyjí a po jednotlivých vsázkách se specificky značí antigenem TSH. Podkladem této reakce je skutečnost, že buňky hybridomu zpravidla nesou stejně jako B-lymfocyty určitý podíl syntetizovaných protilátek v buněčné membráně, přičemž vazná místa antigenu směřují směrem ven, takže je možno tuto skutečnost užít k odlišení jednotlivých klonů a tyto klony pěstovat.
Příklad 4
Fúze lidských PBL s intaktními a fragmentovanými buňkami Ag 8.653
Materiál
Inaktivovaný povrchový antigen hepatitidy B (HB^Biotest) se imunoadsorpcí čistí od zbytků sérových bílkovin. ELISA ke zjištění lidských HBs-protilátek: Mikrotitrační plotny
CS 276 448 B6 se převrství čištěným HBgl, užije se 20 mikrůgramů/ml v 0,9¾ roztoku chloridu sodného. Inkubace supernatantu kultury, reakce konjugátu a substrátu i vyhodnocení je stejné jako v příkladu 1 B.2.- Místo Ig-POD proti myšímu séru se užije Tg-POD proti lidskému séru z ovce.
Provedení
HPBL od dárce s vysokým titrem anti-HBg se izoluje z 200 ml žilní krve odstředěním v gradientu prostředku Ficoll. K obohacení B-lymfocyty se buňky T rozetují standardním způsobem pomocí erythrocytů ovce a pak druhým odstředěním v gradientu prostředku Ficoll se frakce oddělí. Frakce buněk, které nevytváří rozety (HPBL(B)) se pěstuje v hustotě 5 x lO^ buněk v prostředí RPMI 1640 s přísadou 10 % autologního plasmatu, inaktivace se provádí zahřátím na 30 minut na teplotu 53 °C, kultivace s 10 mikrogramy HBgi v inkubáto-. ru za přítomnosti oxidu uhličitého, výměna prostředí každých 12 hodin.
Fúze 1: 1 x 10? předem zpracovaných buněk HPBL(B) se smísí six 10? buněk Ag 8.653 a fúze se provádí za přítomnosti PEG stejně jako v příkladu 1 B.2. Materiál získaný fúzí se pěstuje v prostředí RPMI 1640 s přísadou 10 ¾ lidské plasmy a HAT na 4 plotnách s 24 jamkami (Costar).
7
Fúze 2: 1,1 x 10 buněk Ag 8.653 se fragmentuje působením glycerolu. 1 x 10 jader Ag 8.653 se smísí six 10^ HPBL(B) a převrství na sediment cytoplasmatu a buněčné memO brány z 1 x 10 buněk Ag 8.653. Po fúzi působením PEG se materiál pěstuje ve 4 plotnách s 24 komůrkami v prostředí RPMI 1640 s 10 ¾ lidské plasmy bez HAT.
Výsledky
Ve všech jamkách po fúzi 1 a 2 dojde 3. dne k silnému růstu velikých lnoucích buněk. 5. dne se opatrně uvedou v suspenzi nelnoucí buňky, které se rozdělí na 2 nové plotny o 24 jamkách. (Například Al, Bl a Cl). 28. dne je možno pozorovat v materiálu po fúzi 1 malé kolonie v A2 a A3, ve zbývajících komůrkách pouze lnoucí buňky, v materiálu po fúzi 2 masivní růst mnohočetných kolonií ve všech komůrkách s výjimkou C3. 35. dne se provádí ELISA ke zjištění lidských imunoglobulinů, specifických proti antigénu hepatitidy B, výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 4. V materiálu po fúzi 1, to znamená intaktní buňky Ag 8.653, kultura v prostředí HAT nebylo možno pozorovat pozitivní kulturu, naproti tomu 5 z 12 kultur po fúzi 2, to je fragmenty buněk Ag 8.653, kultura v normálním prostředí bylo jednoznačně anti-HBg-pozitivních.
Příklad 5
Fúze HPBL s fragmenty linie HS SULTAN lidského plasmacytomu
Materiál '
Buňky HS SULTAN byly získány ze sbírky American Type Culture Collection (ATCC) pod označením CRL-1484 jako buněčný materiál, konzervovaný zmrazením a byly rozmraženy podle doporučení ATCC a převedeny do kultury.
Provedení .
HPBL bylo získáno stejně jako v příkladu 4 od stejného dárce a při stejném zpracování.
Fúze;4 x 10^ buněk HS SULTAN se rozruší působením glycerinu. Frakce cytoplasmatu a membrány se podrobí sedimentaci při 5 500 g po dobu 40 minut a převrství se směsí 4 x 10? jader HS SULTAN a 4 x 10? HPBL(B). Fúze působením PEG se provádí podle příkladu 4, takto získaný materiál se pěstuje na 12 plotnách s 24 jamkami (Costar) v prostředí RPMI 1640 +
CS 276 448 B6 + 20 % FKS + pyrohroznan + inzulín (Novo 2 jednotky/ml) + 1 % neesenciálních aminokyselin (BM) + 1 % Methocel 1500 bez HAT.
Výsledky dnů po fúzi je možno pozorovat růst velkých, neadherujících lymfoidních buněčných kolonií.
Příklad 6
Imortalizace lidských T-lymfocytů
6.1 Materiál a metody
T-lymfocyty se izolují známým způsobem rozetováním pomocí červených krvinek ovce s následným odstředěním v gradientu prostředku Ficoll z lymfocytární frakce a dále se zpracovávají buS okamžitě nebo po třídenním pěstování v kultuře. Buňky Ehrlichova ascitického nádoru (ATCC, CC1 77) se pěstují v prostředí DMEM s 10 % koňského séra a jsou dárcem fragmentů pro transformaci. Fragmentace buněk tohoto nádoru (EAZ) se provádí způsobem podle publikace 3ett a další (3. Biol. Chem. 252, 2134 až 2142 (1977)) působením glycerolu. Frakce, která obsahuje převážně jádra se oddělí odstředěním a odloží. Frakce s obsahem cytoplasmatické membrány, bohatá na mitochondrie (CMV) se užije pro transformaci. 5 x 10? T-lymfocytů se převrství přebytkem PHA-lektinu (Difco), smísí s frakcí CMV z EAZ a inkubuje 20 minut při teplotě místnosti. Sedimentace směsi se dosáhne odstředěním, kapalný supernatant se úplně odstraní a nahradí 1 ml 50% roztoku PEG. Po 1 minutě působení se roztok PEG zředí přidáním prostředí RPMI 1640 a pak oddělí od buněk odstředěním. Buňky se smísí s prostředím RPMI s 20 % fetálního telecího séra (FKS, BM), rozdělí se do 12 ploten s komůrkami a pěstují při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % kysličníku uhličitého. Charakterizace buněk podle povrchových vlastností se provádí rozetováním působením červených krvinek ovce způsobem podle publikace Kaplan, Μ. E. a další 3. Immunol. Methods, £, 131 (1974) a imunofluorescencí při použití obou protilátek OKT-3, které jsou specifické proti T-buňkám (Ortho, Reinherz E. L. a další 3. Immunol. 123, 1312 (1979)) nebo MAK 4 až 11 (Rieber P. a další Hybridoma £, 59 (1981)) a pomocí imunoglobulinu proti lidskému séru značenému fluorescencí (Ig, Fa. Dako), čímž je možno prokázat Ig membrány, typický pro B-buňky.
6.2 Výsledky
V průběhu prvních 14 dnů uhyne většina buněk v kulturách. 21. dne je možno v buněčné drti pozorovat kolonie malých až středně velkých buněk, které se kontinuálně množí. Růst kolonií je možno pozorovat ve všech komůrkách až 50 kolonií v jedné komůrce. 30. dne se ‘přenesou kolonie do větších nádob a dále se množí. Buňky se analyzují na základě povrchových vlastností, byly získány následující výsledky:
| a) | materiál | pozitivní | na | E-rozety | > | 95 | q, 'i |
| b) | materiál | pozitivní | na | OKT-3 | > | 90 | *0 |
| c) | materiál | pozitivní | na | 4-11 | > | 90 | 9, *9 |
| d) | materiál | pozitivní | na | l9s | < | 5 | O, *0 |
6.3 Poznámka
Fragmenty, které je možno získat z EAZ (permanentní myší linie) působením glycerolu poskytují při fúzi působením PEG s izolovanými T-lymfocyty buňky, které v kultuře trvale rostou a které je možno identifikovat na základě povrchových vlastností jednoznačně jako T-lymfocyty.
CS 276 448 86
Příklad 7
Imortalizace buněk lidského endothelu
7.1 Materiál a metody
Všechny nádoby pro pěstování se převrství želatinou. Supernatant živného prostředí ze směsi živného prostředí RPMI 1640 a prostředí 199 (BM) s 20 % FKS v poměru 1:1. Buňky lidského endothelu se získávají způsobem podle publikace Jaffe a další, J. Clin. Invest. 52, 2745 až 2756 (1973) působením roztoku kolagenázy (Difcó) z čerstvých pupečních šňůr a před transformací se primární kultura pěstuje přibližně 14 dnů. K transformaci se užijí adherentně rostoucí buňky endothelu, které se uvolní působením roztoku trypsinu a kyseliny ethylendiamintetraoctové (BM) a podrobí se fúzi v suspenzi způsobem popsaným v 6.1 s frakcí CMV z EAZ. Takto zpracované buňky se dále pěstují při počáteční koncentraci 5 x 105 na nádobu o obsahu 75 ml v inkubátoru prostředí s oxidem uhličitým. Kontrolou je vždy podíl endothelových buněk z primární kultury bez frakce CMV s přísadou PEG a s preočkováváním. Jakmile buňky vytváří na dně nádoby souvislou plochu, oddělí se působením trypsinu a EDTA a přenášejí se do čerstvé nádoby v poměru 1 ; 3 běžným pasážováním.
7.2 Výsledky
Buňky endothelu po fúzi s frakcí CMV lnou ke dnům nádoby obvykle alespoň ve 20 až 30 % a v průběhu 2 až 3 dnů vytváří souvislou buněčnou vrstvu. Kontrolní buňky se málo množí a obvykle uhynou, aniž by vytvořily souvislou buněčnou vrstvu v průběhu 21 dnů. Buňky endothelu bez přísady PEG se množí maximálně do třetí pasáže, pak se růst zastaví a buňky se na dně nádoby rozpouští. V 8 různých vzorcích buněk endothelu, které byly odebrány celkem z 18 pupečních šňůr bylo možno pěstovat buňky po fúzi CMV zcela bez problémů po více než 10 pasáží. Transformované buňky endothelu je také možno skladovat bez ztráty životaschopnosti a schopnosti množení v kapalném dusíku.
7.3 Poznámky
Endotheliální buňky lidského pupečníku není možno bez transformace způsobem podle vynálezu pěstovat po více než 3 pasáže, jak je také popsáno v literatuře, například v publikacích Grimbrone M. A. Progress in Haemostasis and Thrombosis, sv. 3, Maciag, T. a další, J. Cell Biol. 91, 420 až 426 (1981). Fúzí pomocí frakce CMV, bohaté na mitochondrie z EAZ se tak změní vlastnosti buněk endothelu v kultuře, že je možno je bez potíží převést přes kritickou třetí pasáž a dále množit, v současné době se buňky nachází ve 23. pasáži, aniž by došlo k únavě kultury.
Příklad 8 '
Imortalizace buněk lidského melanomu
8.1 Materiál a metody
Tkáň obsahující buňky melanomu byla získána chirurgickým vyjmutím metastázy v lymfatické uzlině za sterilních podmínek, byla rozdělena na malé podíly a až do fuze uchovávána v kapalném dusíku. Frakce CMV z EAZ byla získána stejně jako v 6.1,
Před fúzí byl materiál s obsahem buněk melanomu rozmražen á působením trypsinu byla získána suspenze jednotlivých buněk. Frakce velkých, hnědočerveně pigmentovaných buněk melanomu byla zbavena odstředěním fragmentu prostředku Ficoll balastních lymfocytů a podrobena fúzi. Fúze se provádí způsobem podle příkladu 6.1 s frakcí CMV za přítomnosti PEG, užije se přibližně 4 x 105 buněk melanomu a CMV z 1 x 10é EAZ. Kontrolou byly buňky 4 x 105
CS 276 448 B6 18 melanomu, které byly pěstovány dále za přítomnosti PEG bez fúze s CMV. Po fúzi byly buňky rozděleny při hustotě 1 x 10^ do komůrek s obsahem RPMI 1640 + 20 % FKS a pěstovány při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % oxidu uhličitého.
8.2 Výsledky
Ve všech čtyřech dílčích kulturách po fúzi CMV s buňkami melanomu vyrostly do dne 28 kolonie typicky pigmentovaných buněk ve formě semiadherentních shluků buněk, které se kontinuálně zvětšovaly. V kontrolní kultuře došlo pouze k nepatrnému pomnožení, pak však od 8. dne docházelo ke granulaci buněk a 22. dne bylo možno pozorovat v kultuře pouze zbytky buněk.
8.3 Poznámky
Buňky lidského melanomu ze zmrazené tkáně metastázy bylo možno transformovat fúzi z CMV a pak, že bylo možno získat buňky, rostoucí a množící se in vitro. Kontrolní buňky melanomu téhož původu uhynuly za týchž podmínek pěstování.
Příklad 9
Zavádění éukaryontického DNA vektoru do imortalizovaných buněk lidského endothelu
9.1 Zjištění přeneseného materiálu v buňkách v Hirtově supernatantu
9.1.1 Materiál
Plasmid Z-pBR322/Rchr βG- A 425 B (Dierks, P. a další, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1411 až 1415 (1981) obsahuje 2,070 párů baží (Bp) fragmentu genu pro jS-globin králíka.
Fragment Cla-Pvu I plasmidu pBR322 se nahradí fragmentem 3,039 Bp HPa Ι-Bam Η 1, který obsahuje celou oblast předchozího genu a počátek oblasti genu SV 40 (Tooze, 3. (1980) v DNA Tumor Viruses, Harbor Laboratory und B. Wieringa a další, Cetus-UCLA Symposium on Gene regulation 1982). Tento plasmid bude dále uváděn jako pBR322 Rfa G SV 40.
9.1.2 Metody
Buňky lidského endothelu se imortalizújí a nechají růst stejně jako v příkladu 7. Vždy 10č buněk se podrobí transformaci při použití 6 mikrogramů pBR322 Rfa G SV 40 se 4 mikrogramy DNA z telecího brzlíku po zpracování ultrazvukem při použití srážecí metody s fosforečnanem vápenatým způsobem podle publikací Graham F. L. a další, Virology 52, 456 až 467 (1973) a Wigler M. a další Cell 14, 725 až 731 (1978). 10 hodin a 40 hodin po transformaci se získá Hirtův supernatant podle publikace Hirt B., 3. Mol. Biol. 26, 365 až 369 (1967).
Tyto súpernatanty se dělí na 1% agarózovém gelu a přenesou se způsobem podle publikace Southern E. M., 3. Mol. Biol. 98, 503 až 517 (1975) na nitrocelulózový papír. Plasmid pBR322 R^G SV 40 se označí pomocí P při použití translační metody podle publikace Rigby P. W. a další, 3. Mol. Biol. 113, 237 až 251 (1977) a podrobí se hybridizaci přenesenou DNA na nitrocelulózovém filtru způsobem podle publikace Maniatis T. a další, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). Filtr se ozáří při -70 °C, použije se rentgenového filmu.
9.1.3 Výsledky
Buňky lidského endothelu, transformované plasmidem pBR322 R^G SV 40 vydávají silný hybridizační signál, který odpovídá autentickému plasmidu vzhledem k pohyblivosti na agarózovém gelu. Srovnání signálů Hirtova supernatantu buněk 40 hodin po transformaci a 10
ES 276 448 86 hodin po transformaci je možno získat průkaz čtyř až pětinásobného vzestupu intenzity tohoto signálu,
Hybridizace DNA, která je menší než včleněný plasmid je také možná. Signály však nebylo u imortalizovaných buněk lidského endothelu bez transformace možno zjistit.
Stejné rozdělení intenzity hybridizačního signálu bylo možno prokázat v případě, že byly transformovány HeLa-buňky působením plasmidu pBR322 R^G SV 40.
9.1.4 Shrnutí
Skutečnost, že v Hirtově supernatantu lidských imortalizovaných buněk epitelu po transformaci plasmidem pBR322 R^G SV 40 je možno prokázat DNA-hybridizaci na včleněném plasmidu, značeném ^2P, kterou není možno prokázat na buňkách bez přenosu je důkazem toho, že vektor byl včleněn do eukaryontové buněčné linie. Pozorování, že hybridizační signál po transformaci je po 40 hodinách 4 až 5x silnější než po 10 hodinách dovoluje dospět k závěru, že došlo k replikaci přeneseného plasmidu v buňkách.
9.2 Zjištění specifických transkriptů králičího ^-globinu v buňkách imottalizovaného lidského endothelu, transformovaného plasmide pBR322 R^G SV 40.
9.2.1 Materiál
Nukleáza S*, polynukleotidkináza a fosfatáza z telecího střeva se užívají ve formě běžných prostředků (Boehringer Mannheim).
9.2.2 Metody
Imortalizované buňky lidského epithelu se pomnoží způsobem, uvedeným v odstavci 9.1.2 a pak se transformují vektorem, získaným z genu pro králičí -globin. 48 hodin po transformaci se 1 až 2 x 106 buněk rozruší a RNA se extrahuje při použití chloridu lithného a močoviny způsobem podle publikace Auffray, 0. a další, Eur. 3. Biochem. 107, 303 až 314 (1980).
Získání hybridizační sondy, specifické pro králičí β-globin.
Plasmid pBR322 R^ G SV 40 se odbourá enzymem HaelII a fragment, který zahrnuje +135 až -75 podle publikací Dierks P. a další Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1411 až 1415 (1981) a Van Oyen A. a další Science 206, 337 až 344 se izoluje na 2% agarózovém gelu a chromatografuje na DEAE-celulóze způsobem podle publikace Muller W. a další 3. Mol. Biol. 124. 343 až 358 (1978). Fragment se podrobí defosforylaci působením fosfatázy z telecího střeva a
P a pak se značí f/-32P-ATP a T4-polynukleotidkinázou způsobeny popsaným v publikaci Mantei N. a další Gene £0, 1 až 8 (1980).'
Průkaz nukleázy
Fragment po působení kinázy se vysráží spolu s 10 mikrogramy E. coli T-RNA (Boehringer Mannheim) ethanolem a pak se rozpustí ve 100 mikrolitrech 0,4 M/l chloridu sodného, 1 mM/1 kyseliny ethylendiamintetraoctové, 40 mM/1 pipes-pufru o pH 6,4 a 80 % formamidu způsobem podle publikace Mantei N. a další Nature 281, 40 až 46 (1979). Buněčná RNA v množství 25 mikrogramů se suší ve vakuu, rozpustí se v 10 mikrolitrech sondy (0,01 pMol 30 000 cpm) svrchu popsaným způsobem se denaturuje, zataví se do skleněné kapiláry a podrobí hybridizaci 16 hodin při teplotě 48 °C. V kontrolním pokusu se sonda hybridizuje m-RNA králičího -globinu (Miles). Vzorek se zředí 100 mikrolitry 0,2 M/l chloridu sodného 50 mM/1 octanu sodného o pH 4,5 1 mM/1 síranu zinečnátého a 0,5 % glycerolu a pak se inkubuje s 50 jednotkami nukleázy S.^ při teplotě 30 °C celkem 60 minut podle publikace Weaver R. á další, Nucl. Acid. Res. £, 1175 až 1193 (1979).
CS 276 448 86 20
Vzorky se zpracují působením fenolu, vysráží se společně s 10 mikrogramy t-RNA z E. coli éthanolem a pak se promyjí 80% ethanolem 20 minut při teplotě -70 °C ve vakuu, rozpustí se v 5 mikrolitrech barevného roztoku, který obsahuje 0,05 % bromfenolové modři, 0,05 % xylolxyanolu, 1 mM/1 kyseliny ethylendiamintetraoctové v 90 objemových % formamidu, směs se zahřívá 2 minuty na vroucí vodní lázni a pak se podrobí elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu. (89 mM/1 tris-pufru, 89 mM/1 kyseliny borité, 1 mM/1 kyseliny ethylendiamintetraoctové a 7 M/l močoviny). Gel se podrobí autoradiografii při použití rentgenového filmu a zesilovacího stínidla při teplotě -70 °C (Firma Fuji).
9.2.3 Výsledky
Velikost chráněného fragmentu je možno zjistit srovnáním s fragmentem známé velikosti. ( P-značený plasmid pBR322 x Hinf 1 a pBR322 x Hae III). Netransformované buňky nevydávají žádné hybridizační signály, specifické pro globin s výjimkou renaturované hybridizační sondy (210 Bp). RNA extrahovaná z imortalizovaných buněk lidského epithelu po transformaci obsahuje dva fragmenty o velikosti 80 až 90 Bp. Podobné transkripty byly prokázány také v publikacích Grosveld a další Nature 295, 12p až 126 (1982) a Weidle U. a další Nature (1981) a byly připisovány přítomnosti vnitřní kryptické polohy v genu pro králičí ^-globin. Transkripty, jejichž původ se nachází v poloze cap genu pro králičí -globin nebylo možno prokázat. Ve srovnávacím pokusu byly HeLa-bunky podrobeny transformaci působení plasmidu pBR322 R/JG SV 40. Byly prokázány správné transkripty (135 Bp) a transkripty, které bylo možno odvodit od přítomnosti vnitřní kryptické polohy podle publikací Grosveld G. a další, Nature 295, 120 až 126 (1982) a Weidle U.a další Nature (1983). '
9.2.4 Shrnutí
Skutečnost, že je možno prokázat transkripty, specifické pro králičí β-globin v imortalizovaných buňkách lidského epithelu, které obsahují vektor odvozený od SV 40 z genu pro králičí /S-globin ukazuje, že po transformaci je tato buněčná linie vhodná pro expresi včleněných klonovaných genů.
Claims (4)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob výroby permanentních buněčných linií živočišného i lidského původu fúzí normálních buněk lidského i živočišného původu s biologickými složkami, které působí udržitelnost kultury in vitro, vyznačující se tím, že se podrobí fúzi normální lidské nebo ’ živočišné buňky s karyoplasty, cytoplasty, jadernou nebo cytoplasmatickou frakcí, bohatou na mitochondrie lymfatických nebo epitheliálních nádorových buněk, které samy o sobě nejsou schopny pomnožení a pocházejí z transformovaných buněk, fúze se provádí za přítomnosti polyethylenglykolu nebo viru Sendai, a získané buňky se pěstují v živném prostředí bez selekčních látek.
- 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se užijí karyoplasty nebo cytoplasty transformovaných buněk po působení cytochalasinu B.
- 3. Způsob podlé bodu 1, vyznačující se tím, že se užijí buněčné fragmenty, zejména frakce jader nebo frakce cytoplasmy z transformovaných buněk, po působení lytickou látkou nebo po mechanickém rozdrcení buněk.
- 4. Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující se tím, že se jako transformované buňky užijí buňky myelomu nebo buňky, infikované virem Epstein-Barr.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3216650 | 1982-05-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS314883A3 CS314883A3 (en) | 1992-02-19 |
| CS276448B6 true CS276448B6 (cs) | 1992-06-17 |
Family
ID=6162672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS833148A CS276448B6 (cs) | 1982-05-04 | 1983-05-04 | Způsob výroby permanentních buněčných lini-í živočišného i lidského původu |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58201988A (cs) |
| CS (1) | CS276448B6 (cs) |
| ZA (1) | ZA833121B (cs) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2565995B1 (fr) * | 1984-03-07 | 1987-10-23 | Centre Nat Rech Scient | Cellules hybrides productrices d'un polypeptide determine et obtenu a partir de cellules primaires naturellement capables d'exprimer ce polypeptide ou un polypeptide equivalent, procede pour l'obtention de ces cellules hybrides et application de celles-ci a la production dudit polypeptide |
| FR2581393B2 (fr) * | 1985-05-02 | 1989-07-21 | Grp Genie Genetique | Cellules hybrides productrices d'un antigene caracteristique du virus de l'hepatite b obtenu a partir d'hepatocytes et de cellules etablies de singe, procede pour l'obtention de ces cellules hybrides et application de celles-ci a la production de l'antigene susdit |
-
1983
- 1983-05-02 JP JP58076344A patent/JPS58201988A/ja active Granted
- 1983-05-03 ZA ZA833121A patent/ZA833121B/xx unknown
- 1983-05-04 CS CS833148A patent/CS276448B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6239999B2 (cs) | 1987-08-26 |
| JPS58201988A (ja) | 1983-11-25 |
| CS314883A3 (en) | 1992-02-19 |
| ZA833121B (en) | 1984-02-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4489710A (en) | Composition and method for transplantation therapy | |
| JP2648419B2 (ja) | モノクローナル抗体混合物 | |
| CA1201396A (en) | Process for the preparation of permanent animal and human cell lines and their use | |
| CA1188642A (en) | Human nonsecretory plasmacytoid cell line | |
| GB2113715A (en) | Process for the production of human mono-clonal antibodies | |
| JPH02291298A (ja) | 抗体の生産方法 | |
| Siraganian et al. | [2] Methods of enhancing the frequency of antigen-specific hybridomas | |
| US8394368B2 (en) | Method for producing a composition for promoting survival of transplanted hematopoietic stem cell | |
| EP1299524B1 (en) | Human myeloma cell line | |
| AU2001269300A1 (en) | Human myeloma cell line | |
| US4652522A (en) | Continuous lymphocyte cell lines, their production and use | |
| CS276448B6 (cs) | Způsob výroby permanentních buněčných lini-í živočišného i lidského původu | |
| Treves et al. | Establishment of cell lines from somatic cell hybrids between human monocytes and mouse myeloma cells. | |
| JPS63126482A (ja) | 抗ヒト精子不動化単一クロ−ン抗体を産生する細胞株 | |
| JP4493882B2 (ja) | 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体 | |
| KR900007950B1 (ko) | 모노클로날 항체의 제조방법 | |
| RU1808872C (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток MUS мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к М @ зависимой ДНКазе хроматина печени крыс | |
| JPS59186923A (ja) | ヒト前立腺癌治療用薬剤 | |
| Brown | The Production of Monoclonal Antibodies by Cell Fusion |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20010504 |