JPS61238800A - モノクロ−ナル抗体ａｍｆ及びその製造法 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体ａｍｆ及びその製造法Info
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- JPS61238800A JPS61238800A JP7930185A JP7930185A JPS61238800A JP S61238800 A JPS61238800 A JP S61238800A JP 7930185 A JP7930185 A JP 7930185A JP 7930185 A JP7930185 A JP 7930185A JP S61238800 A JPS61238800 A JP S61238800A
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- monoclonal antibody
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒト筋線維芽細胞に反応するモノクローナル抗
体ＡＭＦとその製造法に関するものである。
体ＡＭＦとその製造法に関するものである。
一般に、筋線維芽細胞は腫瘍、腫瘍状病変、肉芽組織、
痩痕等に多くみられ、線維芽細胞とは一応区別されるも
のである。また、筋線維芽細胞は腫瘍に胞でないにも拘
らず、腫瘍、肉芽組織等で増加し、しかも株化細胞にな
り得るなど、正常細胞とはかなシ変った態様を示してい
る。
痩痕等に多くみられ、線維芽細胞とは一応区別されるも
のである。また、筋線維芽細胞は腫瘍に胞でないにも拘
らず、腫瘍、肉芽組織等で増加し、しかも株化細胞にな
り得るなど、正常細胞とはかなシ変った態様を示してい
る。
ま九、ヒト筋線維芽細胞は、紡錘形又は多角形をなし、
粗面小胞体、ゴルジ装置、アクチンフィラメント束、中
間フィラメントなどいずれもよく発達しているなど形態
的特徴についてはよく観察されているのであるが、その
本態、機能、由来、線維芽細胞や間葉系細胞等との関係
、免疫生物学的意義などについてはほとんど解明されて
いない状態にある。
粗面小胞体、ゴルジ装置、アクチンフィラメント束、中
間フィラメントなどいずれもよく発達しているなど形態
的特徴についてはよく観察されているのであるが、その
本態、機能、由来、線維芽細胞や間葉系細胞等との関係
、免疫生物学的意義などについてはほとんど解明されて
いない状態にある。
従来、腫瘍細胞や正常細胞に対して反応するモノクロー
ナル抗体は種々得られているが、ヒト筋線維芽細胞に反
応するモノクローナル抗体は全く知られていない。
ナル抗体は種々得られているが、ヒト筋線維芽細胞に反
応するモノクローナル抗体は全く知られていない。
本発明者らは、ヒト筋線維芽細胞に反応するモノクロー
ナル抗体が得られればヒト筋線維芽細胞の免疫生物学的
意義等の解析にきわめて有用であるとの想定のもとに鋭
意研究したところ、本発明においてヒト筋線維芽細胞に
反応するモノクローナル抗体を得ることに成功したので
ある。
ナル抗体が得られればヒト筋線維芽細胞の免疫生物学的
意義等の解析にきわめて有用であるとの想定のもとに鋭
意研究したところ、本発明においてヒト筋線維芽細胞に
反応するモノクローナル抗体を得ることに成功したので
ある。
本発明ではじめて得られたヒト筋線維芽細胞に反応する
モノクローナル抗体は、アンチ・ミオフィブロプラスト
（Ａｎｔｉ−Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ） （抗筋
線維芽細胞）の意味からモノクローナル抗体ＡＭＦと命
名された。
モノクローナル抗体は、アンチ・ミオフィブロプラスト
（Ａｎｔｉ−Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ） （抗筋
線維芽細胞）の意味からモノクローナル抗体ＡＭＦと命
名された。
抗体ＡＭＰ生産細胞は、抗原としてヒト筋線維芽細胞を
マウスに免疫し、摘牌することによって得ることができ
る。ヒト筋線維芽細胞としてはいずれでもよいが１本発
明者らが先に樹立した乳児指址線維腫症株化細胞ＩＤＦ
−３及び／又はＩＤＦ−４（キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ
） ５２巻、９号１６５３−１６６１ （１９８３年
））を用いるのが好ましい。
マウスに免疫し、摘牌することによって得ることができ
る。ヒト筋線維芽細胞としてはいずれでもよいが１本発
明者らが先に樹立した乳児指址線維腫症株化細胞ＩＤＦ
−３及び／又はＩＤＦ−４（キャンサー（Ｃａｎｃｅｒ
） ５２巻、９号１６５３−１６６１ （１９８３年
））を用いるのが好ましい。
株化細胞ＩＤＦ−３及び／又はＩＤＦ−４は培養ビン等
で培養し、増殖した細胞をトリプシン処理等によって分
離し、これを細胞懸濁液とし、細胞Ｉ Ｘ １０’個を
ＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔内に５週間隔で２回注射し、最
終免疫の６日後に摘牌する。
で培養し、増殖した細胞をトリプシン処理等によって分
離し、これを細胞懸濁液とし、細胞Ｉ Ｘ １０’個を
ＢＡＬＢ／Ｃマウス腹腔内に５週間隔で２回注射し、最
終免疫の６日後に摘牌する。
肺細胞（感作りンパ球）は細切することによって分散さ
せ、肺細胞２Ｘ１０’個と別に分散させたマウス骨髄腫
細胞Ｉ Ｘ １０’〜２Ｘ１０’個を４５％、＋？リエ
チレングリコールの存在下に、ケーラーとミルスタイン
（Ｋδｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ） の方法
（ネイチャーＶｏｌ ２５６ 、４９５−４９７頁（１
９７５））に準じて細胞融合を行う。
せ、肺細胞２Ｘ１０’個と別に分散させたマウス骨髄腫
細胞Ｉ Ｘ １０’〜２Ｘ１０’個を４５％、＋？リエ
チレングリコールの存在下に、ケーラーとミルスタイン
（Ｋδｈｌｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ） の方法
（ネイチャーＶｏｌ ２５６ 、４９５−４９７頁（１
９７５））に準じて細胞融合を行う。
細胞融合後、ＨＡＴ培地で７〜１０日培養し、融合した
細胞のみを生育させて、ノ・イブリドーマを得る。
細胞のみを生育させて、ノ・イブリドーマを得る。
得られた多数のハイブリドーマを限界希釈法を用い２回
のクローニングを行い、それぞれの培養液中に生産した
抗体をＥＬＩＳＡによって定量し。
のクローニングを行い、それぞれの培養液中に生産した
抗体をＥＬＩＳＡによって定量し。
抗体価の高い３種類のモノクローナル抗体を検出した。
まず、これらのモノクローナル抗体を順次ＡＭ１−１．
ＡＭＦ−２，ＡＭＦ−３と命名し、これらのモノクロー
ナル抗体を生産する各ハイブリドーマをそれぞれＨＭＦ
−１，ＨＭＦ−２、ＨＭＦ−３と命名した。
ＡＭＦ−２，ＡＭＦ−３と命名し、これらのモノクロー
ナル抗体を生産する各ハイブリドーマをそれぞれＨＭＦ
−１，ＨＭＦ−２、ＨＭＦ−３と命名した。
各ハイブリドーマＨＭＦ−１，）（ＭＰ−２、ＨＭＦ−
３はそれぞれビン培養、タンク培養、生体内培養等によ
ってモノクローナル抗体ＡＭＦ−１、ＡＭＦ−２、ＡＭ
Ｆ−５を生産させることができる。
３はそれぞれビン培養、タンク培養、生体内培養等によ
ってモノクローナル抗体ＡＭＦ−１、ＡＭＦ−２、ＡＭ
Ｆ−５を生産させることができる。
好ましいのは、マウス腹腔内におけるハイブリドーマＩ
ＭＦの培養である。即ち、ハイブリドーマＩＭＦ’１．
２又は３を細胞数１×１０７の懸濁液としてＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔内に接種する。
ＭＦの培養である。即ち、ハイブリドーマＩＭＦ’１．
２又は３を細胞数１×１０７の懸濁液としてＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔内に接種する。
ハイブリドーマの接種の１週〜６週間前にシリスタン（
ｐｒｉｓｔａｎｅ ）を０．５プ腹腔内に注射しておく
とよい。ハイブリドーマ接種後１〜２週間で腹水が貯留
してくるので、腹水を順次採取し、−匹あた）約１０ｄ
の腹水を得ることができる。
ｐｒｉｓｔａｎｅ ）を０．５プ腹腔内に注射しておく
とよい。ハイブリドーマ接種後１〜２週間で腹水が貯留
してくるので、腹水を順次採取し、−匹あた）約１０ｄ
の腹水を得ることができる。
ハイブリドーマＨＭＦ−１を接種して得た腹水にはモノ
クローナル抗体ＡＭＦ−１が生産され。
クローナル抗体ＡＭＦ−１が生産され。
ＨＭＦ−２の接種ではＡＭＦ−２が、ＨＭＦ −３の接
種ではＡＭＦ−３が生産されていた。
種ではＡＭＦ−３が生産されていた。
それぞれの腹水からＡＭＰを精製するには、一般的な塩
析等の精製法や固着させた株化細胞ＩＤＦ−３及び／又
はＩＤＦ−４への結合と解離のくシかえしなどによって
容易に行うことができる。
析等の精製法や固着させた株化細胞ＩＤＦ−３及び／又
はＩＤＦ−４への結合と解離のくシかえしなどによって
容易に行うことができる。
次に、かくして得られたモノクローナル抗体ＡＭＦの各
性質を示す。
性質を示す。
１、 ＡＭＦ−１：Ｉρで、各種のヒト筋線維芽細胞
と反応する。また、一部のリンパ球や血管内皮と反応す
る。ヒト筋線維芽細胞質内フィラメントの一部であるビ
メンテンと反応する。しかしながら、上皮細胞、骨格筋
細胞、平滑筋細胞とは反応しない。
と反応する。また、一部のリンパ球や血管内皮と反応す
る。ヒト筋線維芽細胞質内フィラメントの一部であるビ
メンテンと反応する。しかしながら、上皮細胞、骨格筋
細胞、平滑筋細胞とは反応しない。
２、 ＡＭＦ−２：ＡＭＦ−１の性質と同じであるが
、ただし平滑筋の一部と反応する点で相違している。
、ただし平滑筋の一部と反応する点で相違している。
３、 ＡＭＦ−３：ＡＭＦ−１の性質と同じであるが
、ただし上皮細胞の一部と反応する点で相違している。
、ただし上皮細胞の一部と反応する点で相違している。
本発明のモノクローナル抗体ＡＭＦはヒト筋線維芽細胞
に関する本態９機能、由来、線維芽細胞との関係１間葉
系細胞との関係などの研究にきわめて有用なものである
とともに、腫瘍細胞などの形態学的診断薬としての用途
が期待される。
に関する本態９機能、由来、線維芽細胞との関係１間葉
系細胞との関係などの研究にきわめて有用なものである
とともに、腫瘍細胞などの形態学的診断薬としての用途
が期待される。
次に、本発明の実施例を示す。
実施例１゜
モノクローナル抗体ＡＭＦ−１の作製
（抗原となる細胞の培養及び免疫）
抗原として先に樹立された乳児指址線維腫症株化細胞Ｉ
ＤＦ−３及びＩＤＦ−４（キャンチー５２巻、９号１６
５３−１６６１ ）を用いた。
ＤＦ−３及びＩＤＦ−４（キャンチー５２巻、９号１６
５３−１６６１ ）を用いた。
両セルラインは共に均一なヒト筋線維芽細胞からなって
おシその特性上、差は認められない。
おシその特性上、差は認められない。
この培養ヒト筋線維芽細胞を５〜４日毎に１：２〜１：
４で継代増殖させて、トリプシン処理並びに機械的剥離
によって集め、遠心分離によって細胞数を約ｌＸ１０７
！ｆａ胞／マウ、Ｘ（ＩＸ１０’〜２Ｘ１０’細胞／マ
ウスの範囲であればよい）に調整し、これを１ｄのＤＭ
ＥＭで細胞懸濁液とし免疫動物として採用したＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内へ接種する。
４で継代増殖させて、トリプシン処理並びに機械的剥離
によって集め、遠心分離によって細胞数を約ｌＸ１０７
！ｆａ胞／マウ、Ｘ（ＩＸ１０’〜２Ｘ１０’細胞／マ
ウスの範囲であればよい）に調整し、これを１ｄのＤＭ
ＥＭで細胞懸濁液とし免疫動物として採用したＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内へ接種する。
初回免疫後、同様の操作を行ない、５週後に再免疫を行
なう。
なう。
（細胞融合）
最終免疫後６日月に免疫したＢＡＬＢ／Ｃマウスから無
菌的操作にて、膵臓を摘出し、細切、破砕し、ＤＭＥＭ
で肺細胞懸濁液を調製する。
菌的操作にて、膵臓を摘出し、細切、破砕し、ＤＭＥＭ
で肺細胞懸濁液を調製する。
このＢＡＬＢ／Ｃマウス由来の脾細胞とマウス骨髄腫細
胞（Ｐ６−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ ）とを４５％ポリエ
チレングリコール（３５００Ｓｉｇｍａ製）下で細胞融
合を行なった。
胞（Ｐ６−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕｌ ）とを４５％ポリエ
チレングリコール（３５００Ｓｉｇｍａ製）下で細胞融
合を行なった。
この時脾細胞は、 Ｉ Ｘ １０” ｃｅｌｌｓ 、
骨髄腫細胞は、１×１０７〜２ Ｘ １０７ｃｅｌｌｓ
、つまり脾細胞：骨髄腫細胞は１０：１〜５：１の比率
で細胞融合を行なった。
骨髄腫細胞は、１×１０７〜２ Ｘ １０７ｃｅｌｌｓ
、つまり脾細胞：骨髄腫細胞は１０：１〜５：１の比率
で細胞融合を行なった。
（バイブリド−・マクローンの選択）
細胞融合後、ＨＡＴ培地（アミノプテリン＋ヒポキサン
チン＋チミジン含有の１０チ牛脂児血清を添加されたＤ
ＭＢＭ ）下で約１週間から１０日培養してハイブリド
ーマのみを増殖させる。
チン＋チミジン含有の１０チ牛脂児血清を添加されたＤ
ＭＢＭ ）下で約１週間から１０日培養してハイブリド
ーマのみを増殖させる。
（第１回スクリーニング）
ＨＡＴ培地下で、ハイブリドーマの増殖に伴なってコロ
ニーが形成されて来ると抗体産生の有無を知るため、ス
クリーニングを行なう。種々の方法があるが、ここでは
、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ：エンザイムーリンクド
・イムノソルベント・アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎ
ｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ ）
）を使用した。
ニーが形成されて来ると抗体産生の有無を知るため、ス
クリーニングを行なう。種々の方法があるが、ここでは
、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ：エンザイムーリンクド
・イムノソルベント・アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎ
ｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ ）
）を使用した。
ＢＬＩＳＡにて反応の高いものからクローニングを行な
う。
う。
（第１回クローニング）
細胞融合に使った骨髄腫細胞の培養で得られた培養上清
とＤＭＥＭを１：１の比で混ぜ、牛胎児血清を全部で１
５チになるように入れて、調整培地（コンディションメ
ディウム（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ ） ）を
あらかじめ用意しておく。
とＤＭＥＭを１：１の比で混ぜ、牛胎児血清を全部で１
５チになるように入れて、調整培地（コンディションメ
ディウム（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ ） ）を
あらかじめ用意しておく。
限界希釈法によシタ６ウエルプレー） （ｗｅｌｌｐｌ
ａｔｅ ）あたりハイブリドーマ細胞が６０個になるよ
うに調整し、′ｆＡ整培地を加えて、クローニングを行
なう。
ａｔｅ ）あたりハイブリドーマ細胞が６０個になるよ
うに調整し、′ｆＡ整培地を加えて、クローニングを行
なう。
（第１ζクリーニング）
上記クローニング後ハイブリドーマ細胞の増殖並びにコ
ロニー形成を見た後、第２回スクリーニングを行なう。
ロニー形成を見た後、第２回スクリーニングを行なう。
第１回スクリーニングと同様ＥＬＩａ人にて陽性の高い
ものを選び、これをさらに人乳腺組織と人肺組織におい
てＡＢＣ法（アビジンビオチンペルオキシダーゼコンブ
レタス（Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎｐｅｒｏｘｉｄａ
ｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ） ）による免疫ペルオキシダ
ーゼ染色を行ない、少なくとも上皮成分には染まらず１
間葉系細胞に染まるものを選択した。
ものを選び、これをさらに人乳腺組織と人肺組織におい
てＡＢＣ法（アビジンビオチンペルオキシダーゼコンブ
レタス（Ａｖｉｄｉｎ Ｂｉｏｔｉｎｐｅｒｏｘｉｄａ
ｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ） ）による免疫ペルオキシダ
ーゼ染色を行ない、少なくとも上皮成分には染まらず１
間葉系細胞に染まるものを選択した。
（第２回クローニング）
第１回クローニングと同様に行なう。
（第６回スクリーニング）
第１回並びに第２回スクリーニングと同じくＥＬＩＳＡ
及び入組織においてＡＢＣ法による免疫ペルオキシダー
ゼ染色を行ない１選択し、ノ・イブリドーマＨＭＦ−１
、ＨＭＦ−２、ＨＭＦ−３の３株細胞を得た。
及び入組織においてＡＢＣ法による免疫ペルオキシダー
ゼ染色を行ない１選択し、ノ・イブリドーマＨＭＦ−１
、ＨＭＦ−２、ＨＭＦ−３の３株細胞を得た。
（モノクローナル抗体産生）・イブリドーマの培養と抗
体回収） １０％牛脂児血清含有ＤＭＥＭで、第６回スクリーニン
グで最終的に選択した抗体を産生ずる単一クローンのハ
イブリドーマＨＭＦ−１，ＨＭＦ−２及びＨＭＦ−３を
増殖させ、その培地上清からはモノクローナル抗体を回
収する。
体回収） １０％牛脂児血清含有ＤＭＥＭで、第６回スクリーニン
グで最終的に選択した抗体を産生ずる単一クローンのハ
イブリドーマＨＭＦ−１，ＨＭＦ−２及びＨＭＦ−３を
増殖させ、その培地上清からはモノクローナル抗体を回
収する。
（ハイブリドーマの動物移植によるモノクロ・−ナル抗
体の製造） 増殖させた各ハイブリドーマｌＸ１０’細胞をＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内に接種する。
体の製造） 増殖させた各ハイブリドーマｌＸ１０’細胞をＢＡＬＢ
／Ｃマウスの腹腔内に接種する。
ハイブリドーマを接種する１週から３週前にプリスタン
（ｐｒｉｓｔａｎｅ ： ２ 、６ ＋ １０ ｐ １
４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ ）ア
ルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ ＱＪｊｅｍｉｃ
ａｌ ）製）を０．５ｍｌ／マウス腹腔内にあらかじめ
注射しておく。
（ｐｒｉｓｔａｎｅ ： ２ 、６ ＋ １０ ｐ １
４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−
ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ ）ア
ルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ ＱＪｊｅｍｉｃ
ａｌ ）製）を０．５ｍｌ／マウス腹腔内にあらかじめ
注射しておく。
ハイブリドーマ接種後１，２週後から腹水が貯留してく
る。マウスが生きた状態で腹水を採取してゆき、マウス
−匹あたシ約１０ゴ以上の腹水を得る事ができた。
る。マウスが生きた状態で腹水を採取してゆき、マウス
−匹あたシ約１０ゴ以上の腹水を得る事ができた。
（抗体の単クローン性の確認）
各ハイブリドーマを増殖しｌＸ１０’細胞としこれを３
回ＤＭＢＭのみで洗浄し、遠沈して１０あるいは２Ｏｆ
ｆ＋７のＤＭＥＭ内に入れ、３日間培養し、死滅細胞が
、８割程度見られたらその培養上清を採取する。この培
養上清には各モノクローナル抗体が含まれている。
回ＤＭＢＭのみで洗浄し、遠沈して１０あるいは２Ｏｆ
ｆ＋７のＤＭＥＭ内に入れ、３日間培養し、死滅細胞が
、８割程度見られたらその培養上清を採取する。この培
養上清には各モノクローナル抗体が含まれている。
、この無血清培地による上清を抗原として抗マウスイム
ノグロブリンサブクラス（ａｎｔｉ ｍＯＬＩｓｅｉｍ
ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ５ｕｂｃｌａｓｓ ） （
ＩｇＧ１ ｒ ２ａ ＋２ｂ ｒ３）を抗体として、抗
原抗体反応を、ＫＬＩＳＡとオフタロニー法（免疫沈降
反応）を使って単一クローン性を確認した。
ノグロブリンサブクラス（ａｎｔｉ ｍＯＬＩｓｅｉｍ
ｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ５ｕｂｃｌａｓｓ ） （
ＩｇＧ１ ｒ ２ａ ＋２ｂ ｒ３）を抗体として、抗
原抗体反応を、ＫＬＩＳＡとオフタロニー法（免疫沈降
反応）を使って単一クローン性を確認した。
ハイブリドーマＨＭＦ−１から得られた抗体をモノクロ
ーナル抗体ＡＭＦ−１，ハイブリドーマＨＭＦ−２から
得られた抗体をモノクローナル抗体ＡＭＦ−２，ハイブ
リドーマＨＭＦ−３から得られた抗体をモノクローナル
抗体ＡＭＦ−３と命名した。
ーナル抗体ＡＭＦ−１，ハイブリドーマＨＭＦ−２から
得られた抗体をモノクローナル抗体ＡＭＦ−２，ハイブ
リドーマＨＭＦ−３から得られた抗体をモノクローナル
抗体ＡＭＦ−３と命名した。
次に、確認した各抗体のマウスエρの亜群（サブクラス
（５ａｂｃｌａｓｓ ） ）を示す。
（５ａｂｃｌａｓｓ ） ）を示す。
ＡＭＦ −１： ＩｇＧ ２ ａ 、入ＡＭＦ−２：
ＩｇＧ ２ ａ 、 ＩＣＡＭＦ−３： Ｉｇ
Ｇ ２ ａ 、に実施例２゜ モノクローナル抗体ＡＭＦ−１の抗原を同定するのに形
態学的方法並びに生化学的方法の２種により決定するこ
とができた。
ＩｇＧ ２ ａ 、 ＩＣＡＭＦ−３： Ｉｇ
Ｇ ２ ａ 、に実施例２゜ モノクローナル抗体ＡＭＦ−１の抗原を同定するのに形
態学的方法並びに生化学的方法の２種により決定するこ
とができた。
ル形態学的同定
１、抗原となったヒト筋線維芽細胞における局在
抗原となった株化細胞ＩＤＦ−３及びＩＤＦ−４に対し
、ＡＭＦ−１を一次抗体として、ＡＢＣ法による免疫ペ
ルオキシダーゼ染色を行なった。
、ＡＭＦ−１を一次抗体として、ＡＢＣ法による免疫ペ
ルオキシダーゼ染色を行なった。
その結果はヒト筋線維芽細胞の細胞質内の線維成分がＡ
ＭＦ−１と特異的に反応していた。同様にして蛍光抗体
法を使用しだが、その結果もヒト筋線維芽細胞の細胞質
内線維成分がＡＭＦ−１と特異的に反応している事が確
認できた。
ＭＦ−１と特異的に反応していた。同様にして蛍光抗体
法を使用しだが、その結果もヒト筋線維芽細胞の細胞質
内線維成分がＡＭＦ−１と特異的に反応している事が確
認できた。
以上より、ＡＭＦ−１は、中間フィラメントの一棟に反
応する抗体であると考えられた。
応する抗体であると考えられた。
次にヒト筋線維芽細胞を対象とする免疫電顕法によるよ
シ詳細な局在性の確認を行なった。
シ詳細な局在性の確認を行なった。
手法としては、プレエンベディング
（Ｐｒｅｅｍｂｅｄｄｉｎｇ ）法によ、９ＡＭＦ−１
を一次抗体として、ＰＡＰ法で染色した。さらにフェリ
チン（ｆｅｒｒｉｔ’ｉｎ ）抗体法、プロティンＡゴ
ールド（ｐｒｏｔｅｅｎ Ａ ｇｏｌｄ ）法を併用し
た。この３種は。
を一次抗体として、ＰＡＰ法で染色した。さらにフェリ
チン（ｆｅｒｒｉｔ’ｉｎ ）抗体法、プロティンＡゴ
ールド（ｐｒｏｔｅｅｎ Ａ ｇｏｌｄ ）法を併用し
た。この３種は。
共に同様の結果を示した。っまシ、ＡＭＦ−１と特異的
に反応したものは、細胞質内の中央部に存在する線維成
分であった。以上よ勺中間フィラメントの内ビメンチン
がＡＭＦ−１に特異的に反応する灰原と考えられた。
に反応したものは、細胞質内の中央部に存在する線維成
分であった。以上よ勺中間フィラメントの内ビメンチン
がＡＭＦ−１に特異的に反応する灰原と考えられた。
２、人正常組織内分布
人の正常組織を対象とし、ＡＭＦ−１を一次抗体として
、ＡＢＣ法による免疫ペルオキシダーゼ染色を行ないＡ
ＭＦ−１と反応する抗原の人体内分布を検索した。その
結果は各種の開業系細胞に反応したが、横絞筋及び上皮
性細胞には反応しなかった。以上の結果から、ビメンチ
ンを抗原とする考えを否定するものはなく、ビメンチン
の人体内分布とむしろ一致するものであった。
、ＡＢＣ法による免疫ペルオキシダーゼ染色を行ないＡ
ＭＦ−１と反応する抗原の人体内分布を検索した。その
結果は各種の開業系細胞に反応したが、横絞筋及び上皮
性細胞には反応しなかった。以上の結果から、ビメンチ
ンを抗原とする考えを否定するものはなく、ビメンチン
の人体内分布とむしろ一致するものであった。
６、徨特異性の有無
中間フィラメントであるビメンチンは種によシ、相違が
あると一般に考えられている。このため各種の動物を対
象とし、その組織を、ＡＭＦ−１を一次抗体としてＡＢ
Ｃ法による免疫はルオキシダーゼ染色を行なったが、現
在の時点では、ウサギ。
あると一般に考えられている。このため各種の動物を対
象とし、その組織を、ＡＭＦ−１を一次抗体としてＡＢ
Ｃ法による免疫はルオキシダーゼ染色を行なったが、現
在の時点では、ウサギ。
ニワトリ、人の６種において相違は認められなかった。
Ｂ、生化学的同定
１０％ＦＯ８を含むＤＭＥＭで培養したＩＤＦ細胞を機
械的に培養フラスコから剥ぎ取り、遠心分離して細胞ペ
レットを得た。このベレットにＤＮａｓｅおよびＲＮａ
ｓｅをそれぞれ５０μ９ ／ ｒｖｌ含むハイソルトパ
ツ７アー（Ｈ７ｇｈ ５ａｌｔ Ｂｕｆｆｅｔ ）を加
えてテフロンホモジナイザーでホモジナイズした後、３
７℃、１時間インキュベートする。この操作によってホ
モジネートは粘稠性がとれる。その後遠心分離して得九
はレットに０．５ ％ ）ライドン（Ｔｒｉｔｏｎ ）
Ｘ −１００を含む十分な量のハイソルトパツ７アー
を加えて、ホモジナイズと遠心分離を５回繰り返す。こ
の操作によシ界面活性剤に不溶性の中間フィラメントは
スレッド内に残存するので、これを濃縮し、界面活性剤
に可溶性の蛋白質は溶出する。このようにして得られた
はレットは高濃度の塩を除去するために十分な量の蒸留
水で洗われる。その後、遠心分離して上清をすてはレッ
トは電気泳動を行うため一時的にストックされる。
械的に培養フラスコから剥ぎ取り、遠心分離して細胞ペ
レットを得た。このベレットにＤＮａｓｅおよびＲＮａ
ｓｅをそれぞれ５０μ９ ／ ｒｖｌ含むハイソルトパ
ツ７アー（Ｈ７ｇｈ ５ａｌｔ Ｂｕｆｆｅｔ ）を加
えてテフロンホモジナイザーでホモジナイズした後、３
７℃、１時間インキュベートする。この操作によってホ
モジネートは粘稠性がとれる。その後遠心分離して得九
はレットに０．５ ％ ）ライドン（Ｔｒｉｔｏｎ ）
Ｘ −１００を含む十分な量のハイソルトパツ７アー
を加えて、ホモジナイズと遠心分離を５回繰り返す。こ
の操作によシ界面活性剤に不溶性の中間フィラメントは
スレッド内に残存するので、これを濃縮し、界面活性剤
に可溶性の蛋白質は溶出する。このようにして得られた
はレットは高濃度の塩を除去するために十分な量の蒸留
水で洗われる。その後、遠心分離して上清をすてはレッ
トは電気泳動を行うため一時的にストックされる。
電気泳動はドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリル
アミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＩ１３）を行った
。その結果、最終的なはレットは分子量約５７，０００
のバンドを認め、中間フィラメントの１種であるビメン
チン（ｖｉｍｅｎｃｉｎ ）と推測された。
アミドゲル電気泳動（５ＤＳ−ＰＡＧＩ１３）を行った
。その結果、最終的なはレットは分子量約５７，０００
のバンドを認め、中間フィラメントの１種であるビメン
チン（ｖｉｍｅｎｃｉｎ ）と推測された。
次に、このバンド（ビメンチン）がＡＭＦ −１の抗原
であることを証明するために、蛋白質のポリアクリルア
ミドゲルからニトロセルロースメンブレンへの転写（イ
ムノプロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ
） ）を行い、ＡＭＰ−１と一次抗体とするＡＢＣ染色
を行った。その結果、このバンド（ビメンチン）はＡＢ
Ｃ染色で陽性であった。
であることを証明するために、蛋白質のポリアクリルア
ミドゲルからニトロセルロースメンブレンへの転写（イ
ムノプロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ
） ）を行い、ＡＭＰ−１と一次抗体とするＡＢＣ染色
を行った。その結果、このバンド（ビメンチン）はＡＢ
Ｃ染色で陽性であった。
同様に全細胞を超音波ホモジナイザーでホモジナイズし
て、５ＤＳ−ＰＡＧ］１３およびイムノブロッティング
を行ない、前記と同様の結果を得た。
て、５ＤＳ−ＰＡＧ］１３およびイムノブロッティング
を行ない、前記と同様の結果を得た。
Claims (3)
- （１）ヒト筋線維芽細胞に反応するモノクローナル抗体
ＡＭＦ。 - （２）ハイブリドーマＨＭＦを培養し、培養物からモノ
クローナル抗体ＡＭＦを採取することを特徴とするモノ
クローナル抗体ＡＭＦの製造法。 - （３）ハイブリドーマＨＭＦが、乳児指趾線維腫症株化
細胞ＩＤＦをマウスに免疫して得たマウス脾細胞とマウ
ス骨髄腫細胞の融合で得られたハイブリドーマである特
許請求の範囲第２項記載のモノクローナル抗体ＡＭＦの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7930185A JPS61238800A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | モノクロ−ナル抗体ａｍｆ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7930185A JPS61238800A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | モノクロ−ナル抗体ａｍｆ及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61238800A true JPS61238800A (ja) | 1986-10-24 |
Family
ID=13686017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7930185A Pending JPS61238800A (ja) | 1985-04-16 | 1985-04-16 | モノクロ−ナル抗体ａｍｆ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61238800A (ja) |
-
1985
- 1985-04-16 JP JP7930185A patent/JPS61238800A/ja active Pending
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