EA006310B1 - Ассоциированные с ганглиозидами рекомбинантные антитела и их применение в диагностике и лечении опухолей - Google Patents
Ассоциированные с ганглиозидами рекомбинантные антитела и их применение в диагностике и лечении опухолей Download PDFInfo
- Publication number
- EA006310B1 EA006310B1 EA200301098A EA200301098A EA006310B1 EA 006310 B1 EA006310 B1 EA 006310B1 EA 200301098 A EA200301098 A EA 200301098A EA 200301098 A EA200301098 A EA 200301098A EA 006310 B1 EA006310 B1 EA 006310B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- replaced
- chain
- monoclonal antibody
- antibodies
- human
- Prior art date
Links
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 title claims description 14
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title abstract description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 9
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 6
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 6
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims description 4
- 101150060303 SOK2 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims 2
- 101150041075 AIM4 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100282455 Arabidopsis thaliana AMP1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000015347 COP1 Human genes 0.000 claims 1
- 108060001826 COP1 Proteins 0.000 claims 1
- 101100218464 Haloarcula sp. (strain arg-2 / Andes heights) cop2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 8
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 abstract 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 22
- 229940059082 douche Drugs 0.000 description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 4
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 4
- -1 0.45 μg / ml Chemical compound 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000219357 Cactaceae Species 0.000 description 2
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 101001057508 Homo sapiens Ubiquitin-like protein ISG15 Proteins 0.000 description 2
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 2
- 208000009277 Neuroectodermal Tumors Diseases 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 240000005499 Sasa Species 0.000 description 2
- 102100027266 Ubiquitin-like protein ISG15 Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- WFVKOTYYEOGHGI-FDFHNCONSA-N (2s)-2-amino-n-[(6s,12r)-6-benzyl-1-methyl-5,8,11-trioxo-1,4,7,10-tetrazacyclotridec-12-yl]-3-(4-hydroxyphenyl)propanamide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCCN(C[C@H](C(=O)NCC(=O)N1)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C)C1=CC=CC=C1 WFVKOTYYEOGHGI-FDFHNCONSA-N 0.000 description 1
- OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N (3-hydroxy-1-adamantyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound C1C(C2)CC3CC2(O)CC1(OC(=O)C(=C)C)C3 OOIBFPKQHULHSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033830 Amphiphysin Human genes 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 101100310637 Arabidopsis thaliana SON1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 208000001382 Experimental Melanoma Diseases 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 101000693598 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase SBK1 Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100284914 Mus musculus Higd1c gene Proteins 0.000 description 1
- 101000799460 Mus musculus Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101100417245 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPN4 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025554 Serine/threonine-protein kinase SBK1 Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150039027 ampH gene Proteins 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 125000000102 trisulfanyl group Chemical group [*]SSS[H] 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/739—Lipopolysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
- C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
- C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
- C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/686—Anti-idiotype
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к получению модифицированных антител с использованием технологии рекомбинантных ДНК из мышиного моноклонального антитела P3 (MAb P3), продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонированной в соответствии с Будапештским договором с номером доступа ЕСАСС 94113026, и из антиидиотипического мышиного моноклонального антитела 1Е10 (MAbai 1E10), продуцируемого гибридомной клеточной линией с депозитным номером ЕСАСС 97112901, с целью получения моноклональных антител, которые сохраняют биологическую функцию специфического связывания с антигеном исходных антител, но являются в то же самое время менее иммуногенными. Химерные антитела данного изобретения содержат вариабельные домены мышиного иммуноглобулина и константные области иммуноглобулина человека; и при гуманизации, наряду с содержанием константных областей иммуноглобулинов человека, они являются модифицированными в районе мышиных областей рамки считывания (FR) иммуноглобулина и, в частности, в тех зонах, которые могли бы находиться в антигенном сайте для Т-клеток, таким образом несколько положений этих FR являются также происходящими из иммуноглобулина человека. Эти антитела могут быть использованы в диагностике и терапии различных типов опухолей. Данное изобретение относится также к применению этих антител для терапевтических и диагностических целей.
Description
Данное изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым рекомбинантным антителам, полученным с помощью генной инженерии, конкретно к химерным и гуманизированным антителам, полученным из мышиного моноклонального антитела Р3 (МЛЬ Р3) и его антиидиотипического мышиного моноклонального антитела 1Е10 (МАЬа1 1Е10).
Более конкретно, данное изобретение относится к антителам, которые связываются с ганглиозидами, содержащими Ν-гликолилированную сиаловую кислоту, но не с ацетилированными формами ганглиозидов и не с нейтральными гликолипидами. Ганглиозиды, содержащие Ν-гликолилированную сиаловую кислоту, являются антигенами, экспрессируемыми на высоком уровне при раке молочной железы и меланомах. С другой стороны, противоопухолевое действие МАЬа1 1Е10 было также продемонстрировано на экспериментальных моделях.
Данное изобретение относится также к фармацевтическим композициям, которые содержат вышеописанные рекомбинантные антитела, применимым к диагностике и терапии рака, в частности рака молочной железы и меланом.
Предпосылки изобретения
Ганглиозиды являются гликосфинголипидами, которые содержат сиаловую кислоту, и они присутствуют в плазматической мембране клеток позвоночных. (8!и1!к е! а1. (1989): 01усокрйшдойр1бк: к1тис!ите, Ью1ощса1 коигсе апб рторетбек, Ме!йобк Еп/уто1оду, 179:167-214). О некоторых из этих молекул сообщалось в литературе как об антигенах, ассоциированных с опухолями или опухолевыми маркерами (Накотоп е! а1. (1991): Рокк1Ь1е Гцпсйопк оГ 1итог аккоаа!еб сагЬойубга!е апйдепк, Сигг. Орт. 1ттипо1., 3: 646653), и на основании этого применение антигликозидных антител было описано как применимое в диагностике и терапии рака (Ноид!оп е! а1. (1985): Мойке топос1опа1 апНЬобу 1дС3 апйЬобу бе!ес!тд ΟΌ3 дапдйок1бе: !о рйаке I 4па1 ш рабеЫк νίΐΐι тайдпап! те1апота, ΡΝΑ8 И8А, 82:1242-1246; ΖΙππίβ е! а1. (1997): 8е1есйоп оГ сагЬойубга!е !итог апйдепк ак !агде!к Гог нптипе а!!аск икшд 1ттипоЫк!осйет1к1гу. I. Еосик оп дапдйок1бек, 1п!. 1. Сапсег, 73: 42-49).
Сиаловые кислоты, более часто экспрессирующиеся у животных, являются Ν-ацетилнейраминовой кислотой (№иАс) и Ν-гликолилнейраминовой кислотой (№иОс) (Сотйе1б е! а1. (1982): Оссигепсе оГ к1айс ас1бк. Се11. Бю1. Моподг., 10: 5-50). №иСс обычно не экспрессируется в нормальных тканях человека и курицы, но широко распространена у других позвоночных (Ьеебеп апб Уи, (1976): Сйетэкйу апб апа1ук1к оГ к1айс ас1б. 1п: Вю1одюа1 Во1е оГ 81а1ю Ас1б. ВокетЬегд А апб 8йепд!типб СЬ (Ебк). Р1епит Ргекк, Νονν Уотк, 1-48; Ка\\ш е! а1. (1991): ОиапШабуе бе!еттта1юп оГ Х-д1усо1у1пеигат1п1с ас1б ехргеккюп т йитап сапсегоик бккиек апб ау1ап 1утрйота се11 1шек ак а !итог аккос1а!еб к1айс ааб Ьу дак сйгота!одгарйу-такк крес1готе!гу. Сапсег Векеагсй, 51: 1242-1246). Однако имеются сообщения, которые показывают, что антитела анти-ЫеиОс узнают некоторые опухоли человека и линии опухолевых клеток (Н1дакй1 е! а1. (1988): Ое!ес1юп оГ дапд1юк1бек ак Х-д1усо1у1пеигат1п1с ас1б кресблс !итот-аккос1а!еб Напдапийи-Оекйег апбдеп т йитап ге!шоЬ1ак!ота се11к, 1рп. 1. Сапсег Век., 79: 952-956; Еикш е! а1. (1989): Ое!ес!юп оГ д1усорго!ешк ак !итог аккос1а!еб НапдапиШи-Оеюйег апйдеп ш йитап дакйгс сапсег се11 йпе, Nυ6С4, Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип., 160: 1149-1154). Повышенные уровни ганглиозидов ОМ3 (№иОс) были обнаружены при раке молочной железы человека (Мащиша е! а1. (1996): Оапдйоыбек ехргеккеб т йитап Ьгеак! сапсег. Сапсег Векеагсй, 1996; 56: 5165-5171), этот результат делает привлекательным применение этой молекулы в качестве мишени при раковой терапии.
Моноклональное антитело (МАЬ) Р3, продуцируемое клеточной линией, депонированной с номером доступа ЕСАСС 94113026 (Европейский патент ЕР 0657471 В1), является мышиным моноклональным антителом 1дМ-изотипа, которое получали путем слияния спленоцитов мышей Ва1Ь/с, иммунизированных липосомами, содержащими ОМ3(№иОс) и столбнячный токсоид, с клеточной линией Р3-Х63Ад8.653, которая является мышиной миеломой. Это антитело МАЬ Р3 реагирует сильно с ганглиозидами, содержащими Ν-гликолилированную сиаловую кислоту, но не с ацетилированными формами ганглиозидов и не с нейтральными гликолипидами. Иммуноцитохимическими и иммуногистохимическими исследованиями, проводимыми с клеточными линиями и тканями из доброкачественных и неопластических опухолей, было показано, что антитело МАЬ Р3 узнает рак молочной железы (Уахцнех е! а1. (1995): Оепетайоп оГ тигте топос1опа1 апйбобу кресблс Гог Х-д1усо1у1пеигатйнс ас1б-соп!аштд дапд1юк1бек !йа! а1ко гесодш/ек ки1Га!еб д1усойр1бк, НуЬпбота, 14: 551-556) и меланому.
Антитело МАЬ Р3 индуцировало антиидиотипическую иммунную реакцию (АЬ2) у мышей Ва1Ь/с (сингенная модель), даже без адъюванта и белка-носителя (Уа/с.|ие/ е! а1. (1998): 8упдепею ап11-1бю1ур1с топос1опа1 апИЬоб1ек !о ап апи-№иСс-соп1айнпд дапд1юк1бе топос1опа1 апНЬобу, НуЬпбота, 17: 527534). Роль электроотрицательных групп, сиаловой кислоты (для ганглиозидов) и 8О3,- (для сульфатидов) в свойствах узнавания этого антитела определяли иммунохимическим анализом (Могепо е! а1., (1998): Иейпеайоп оГ ерйоре гесодш/еб Ьу ап апНЬобу кресблс Гог Х-д1усо1у1пеигатйнс ас1б-соп!а1шпд дапдйок1бек, О1усоЬю1оду, 8: 695-705).
Антиидиотипическое антитело МАЬ 1Е10 (МАЬа1 1Е10) подтипа 1дО1 получали у мыши Ва1Ь/с, иммунизированной МАЬ Р3, связанным с КЬН (гемоцианином моллюска) (патент США 6063379, клеточная линия с номером доступа ЕСАСС 97112901). МАЬа1 1Е10 узнавало специфически МАЬ Р3 и не
- 1 006310 связывало другие антигликозидные 1дМ-антитела. Кроме того, антитело МАЬа1 1Е10 ингибировало специфическое связывание МАЬ Р3 с бМЗ(Ыеибс) и с клеточной линией МОА-МВ-435, полученной из рака протоков молочной железы (положительной в отношении связывания МАЬ РЗ). Антитело МАЬа1 1Е10 индуцировало сильную иммунную реакцию антител АЬЗ при иммунизации мышей из сингенных и аллогенных моделей, эти антитела АЬЗ не проявляли ту же самую специфичность, что и МАЬ РЗ, даже когда они несут идиотопы, сходные с идиотопами антитела АЬ1 (Уахдиех е! а1. (1998): Зупдепе1с αηΐί-ίύίοΐνр1с топос1опа1 апйЬоб1ек !о ап апй-№иОс-соп1ашшд дапДюйбе топос1опа1 апйЬобу, НуЬйбота, 17: 5275З4). Антитело МАЬа1 1Е10 индуцировало сильное противоопухолевое действие у сингенных, а также аллогенных мышей. Рост клеточной линии рака молочной железы ЕЗ11 значимо уменьшался при периодическом введении дозы МАЬа1 1Е10, связанного с КЕН, в адъюванте Фрейнда при вакцинации мышей Ва1Ь/с. После вакцинации уменьшалось также число спонтанных легочных метастазов. Внутривенное введение МАЬа1 1Е10 мышам С57ВБ/6 спустя 10-14 дней после внутривенной инокуляции клеток меланомы В16 вызывало разительное уменьшение числа легочных метастазов в сравнении с мышами, обработанными посторонним 1дО. Эти результаты предполагают, что запускается не один механизм противоопухолевого действия (Уахдиех е! а1. (2000): Апйитот рторетйек оГ ап апП-1Шо1ур1с топос1опа1 апйЬобу ш те1а!юп !о №Дусо1у1-соп1аттд дапд1юк1бек, Опсо1. Кер., 7: 751-756, 2000).
Даже при том, что гибридомная технология развивается на протяжении 15 лет (Коей1ег апб Мй1к!еш (1975): Сопйпиоик си1!игек оГ Гикеб се11к кестейпд апйЬобу оГ ртебейпеб кресййу, №!ите, 256: 495-497), и несмотря на то, что моноклональные антитела все еще очень применимы в диагностике, а также в исследованиях, не показана их терапевтическая эффективность у человека. Это обусловлено в основном их коротким периодом полужизни в крови и тем, что мышиные эффекторные функции не пригодны для иммунной системы человека, а также для иммунной реакции человеческих антимышиных антител (НАМА-реакции).
С другой стороны, технология генной инженерии революционизировала потенциал применимости МАЬ, так как манипуляция генами иммуноглобулинов позволяет получать модифицированные антитела с уменьшенной антигенностью, а также улучшать их эффекторные функции для лечения или диагностики определенных патологий. Способы уменьшения иммуногенности иммуноглобулинов имеют в качестве главной цели уменьшение различий между мышиным антителом и иммуноглобулином человека, без изменения специфичности узнавания антигенов (Мотйкоп е! а1. (1989): Оепейсайу епдшеетеб апйЬобу то1еси1е§, Абу 1ттипо1., 44: 65-92).
Недавно было разработано несколько способов гуманизации мышиных и крысиных антител и, таким образом, уменьшения ксеногенной иммунной реакции против чужеродных белков при их инъецировании человеку. Одним из первых подходов к уменьшению антигенности были химерные антитела, в которых вариабельные домены мышиного белка встроены в константные домены молекул человека, которые проявляют ту же самую специфичность, но уменьшенную иммуногенность в сравнении с их мышиными копиями, причем эффекторные функции иммуноглобулинов человека сохраняются химерными антителами (Мотйкоп е! а1. (1984): СЫтейс йитап апйЬобу то1еси1ек: Мойке апйдеп-Ьшбшд ботатк \\йй йитап сопк!ап! гедюп ботатк, ΡΝΛ8 ИЗА, 81: 6851-6855). Даже когда химерные антитела имеют ту же самую специфичность, что и мышиная копия, часто наблюдается иммунная реакция на вариабельные области (антител) грызунов.
В попытке дополнительного уменьшения иммуногенности химерных антител только СЭК (гипервариабельные области) из моноклонального антитела грызуна прививали на каркасные районы человека, и этот гибридный вариабельный район экспрессировался с константными районами человека (1опек е! а1. (1986): Кер1асшд !йе сотр1ешеп1агу-бе!етт1птд гедюпк ш а йитап апйЬобу \\йй !йоке Ггот а тоике. №1Шге З21: 522-524; Уегйоеуеп е! а1. (1988): Кекйаршд йитап ап!1Ьоб1ек: дгайшд ап апЫукохуте асйуйу, Заепсе 2З9, 15З4-15З6). Однако этот подход имеет несколько недостатков: часто полученное антитело имеет уменьшенную аффинность, и ряд каркасных остатков должны быть обратно мутированы в соответствующие мышиные остатки для восстановления связывания (К1е!сйтапп е! а1. (1988: Кекйаршд йитап ап!1Ьоб1ек Гог !йегару, №!ите, ЗЗ2: З2З-З27; Онееп е! а1. (1989): А йшпашхеб апйЬобу !йа! Ьшбк !о !йе ш!ейеикш 2 гесер!ог, РNАЗ ИЗА, 86: 10029-100ЗЗ; Тетрек! е! а1. (1991): Кекйаршд а йитап топос1опа1 апйЬобу !о шй1Ьй йитап гекриа!огу купсуйа1 У1тик шйес!юп ш у1уо, Вю!есйпо1оду, 9: 266-272). Кроме того, стойкая иммуногенность часто наблюдается в СЭК-пришитых антителах.
Ма!ео е! а1. (патент США с номером 5712120) описали процедуру для уменьшения иммуногенности мышиных антител. Согласно этому способу модификации ограничиваются вариабельными доменами и конкретно мышиными ЕК (каркасными областями) химерных антител. Кроме того, часто проводят замены в районах ЕК, которые имеют амфипатические последовательности, и, следовательно, они являются потенциальными эпитопами, узнаваемыми Т-клетками. Этот способ предусматривает разумную замену нескольких аминокислотных остатков, локализованных в потенциально иммуногенных эпитопах, соответствующими остатками из наиболее гомологичной последовательности человека, причем аминокислоты, которые являются в основном ответственными за канонические структуры, а также остатки в непосредственной близости от СЭК или в зоне Уетшет должны быть сохранены.
- 2 006310
Полученное антитело сохраняет антигенсвязывающую специфичность и является менее иммуногенным, чем его мышиный или химерный предшественник (Ма1ео е! а1. (2000): Кетоуа1 оГ Т се11 ерйорез йот депейсаНу епдшеегеб апййоШез: Ргобисйоп оГтосйПес! 1штипод1оЬи1т§ νΐΐή гебисеб 1ттиподетсйу, НуЬпбота 19: 463-71), и эти свойства увеличивают их терапевтическую применимость. С использованием этой новой процедуры необходимо только малое число мутаций и, конечно, меньше генетических манипуляций.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение относится к рекомбинантным антителам, полученным с помощью технологий генной инженерии. Конкретно, данное изобретение относится к химерному антителу, произведенному из мышиного моноклонального антитела Р3, продуцируемого гибридомной клеточной линией с депозитным номером ЕСАСС 94113026. Антитело МАЬ Р3 узнает антиген, экспрессируемый в опухолевых клетках молочной железы и меланомах. МАЬ Р3 характеризуется следующими последовательностями гипервариабельных областей (СПК) тяжелой и легкой цепей:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
СОН1: ΗΥδνΗ
СОН2: Μΐνν(3668ΤΟΥΝ8Αυ<5
СДОЗ: δΟνΗΕΟΚΑΟΑΥνΕΑΥ
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
СОК1: ΚΑβΟΟνβΤΑνΑ
СОК2:8Α8ΥΗΥΤ СЭЯЗ: ΟΟΗΥδΤΡννΤ
Предпочтительно, последовательности РК тяжелой и легкой цепи являются следующими:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ:
РЯ1: αναΐΚΕ50Ρ0ΐνΑΡ5Ο815ΓΓ0Τν5ΟΕ5ί5
РЮ; УЛ/КОРРСК61ЛМ.Э
РЮ: Η15Ι5ΚΟ№Κ5θνΡΙΚΜΝ5ίΟΤΟΟΤΑΜΥΥΟΑΚ
РН4: νναοοττν
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
ЕРИ: 0ΐνΜΤ08ΗΚΡΜ8Τ3νβ0Κν8ΐΤ0 рю: ютоакрбаеркшу
РЮ: ΘνΡΟΗΡΤ<3308ΘΤΟΡΤΡΤ)38νθΑΕΟΙΑνΥΥΟ рад: ροοσπα.
В предпочтительном варианте химерное антитело данного изобретения содержит константную область тяжелой цепи 1дО1 человека и константную область легкой цепи Ск человека. В другом аспекте данное изобретение относится к гуманизированному антителу, произведенному из МАЬ Р3, продуцируемого гибридомной клеточной линией с депозитным номером ЕСАСС 94113026, характеризующемуся тем, что оно содержит константную область тяжелой цепи 1д61 человека и константную область легкой цепи Ск человека, и районы РК легкой цепи человека содержат любую из следующих точковых мутаций:
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ:
Положение 8: Нхз заменен Рго
Положение 9: Ьуз заменен Зег
Положение 10: РЬе заменен Зег
Положение 11: Мек заменен Ьеи Положение 13. ТЬг заменен А1а.
В другом аспекте данное изобретение относится к химерному антителу, произведенному из мышиного моноклонального антитела 1Е10, продуцируемого гибридомной клеточной линией с депозитным номером ЕСАСС 97112901, и оно является антиидиотипическим антителом, которое узнает МАЬ Р3. МАЬа1 1Е10 характеризуется следующими последовательностями гипервариабельных районов (СОК) тяжелой и легкой цепей:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
ΟΟΗ1:8Υ[ΜΝ
СОЮ: ννίΡΡΘΟΟδΤΚΥΝΕΚΡΚβ
СОЮ: Ε0ΥΥ0Ν8ΥΥΡ0Υ
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
СОК1: ΚΑ800Ι8ΝΥίΝ союутзи-нзо
ΟϋΗ3: ΟΟΟΝΤίΡννΤ
- 3 006310
Предпочтительно, последовательности ΕΚ тяжелой и легкой цепи являются следующими:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ:
РК1: ανθίαα30ΑΕΐνΚΡΟΑδνΚΙ.50ΚΑ36ΥΤΕΓ
ΡΗ2: ΥννηΟΗΡΕΟβίεννίΟ
РНЗ: КАТкТТОК833ТАУМО1.3га-Т5Е03АУУЕСАЯ ри4: ννααβτη,τν
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
ЕЮ: О1ОМТаТТ331.3А31вОНУТ13С
РН2: ΙΛΎΟΟΚΡΟβίνΚΙΛΙΥ
ЕНЗ: νΡδΚΡ363Ο5ΟΤ0Υ8ίΠ8ΝίΕΟΕ0ΙΑΤΥΕΟ
ЕК4: ЕОСаТКЬЕЗК
В предпочтительном варианте химерное антитело данного изобретения содержит константную область тяжелой цепи 1дС 1 человека и константную область легкой цепи Ск человека. В другом аспекте данное изобретение относится к гуманизированному антителу, произведенному из МАЬ 1Е10, продуцируемого гибридомной клеточной линией с депозитным номером ЕСАСС 97112901, характеризующемуся тем, что оно содержит константную область тяжелой цепи 1дС1 человека и константную область легкой цепи Ск человека, и ΕΚ тяжелой и легкой цепи человека содержат любую из следующих точковых мутаций:
Легкая цепь:
Положение 7: ТЬг заменен Зег
Положение 8: ТЬг заменен Рго
Положение 15: Ьеи заменен Уа1
Тяжелая цепь:
Положение 5: С1п заменен Уа1
Положение 40: Агд заменен А1а
Положение 42: С1и заменен С1у
Положение 87 (83 согласно нумерации КаЬа!): ТЬг заменен Агд.
В другом аспекте данное изобретение относится к клеточным линиям, которые экспрессируют описанные химерные и гуманизированные антитела; дополнительно данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим описанные антитела.
Предпочтительно, оно относится к фармацевтическим композициям для лечения опухолей молочной железы, легкого, пищеварительной системы, мочеполовой системы, меланом, сарком и нейроэктодермальных опухолей, их метастазов и рецидивов, причем эти фармацевтические композиции содержат описанные антитела и подходящий наполнитель.
В другой репрезентации данного изобретения эти фармацевтические композиции могут быть использованы для определения местоположения и диагностики ίη νίνο опухолей молочной железы, легкого, пищеварительной системы, мочеполовой системы, меланом, сарком и нейроэктодермальных опухолей, их метастазов и рецидивов, причем эти фармацевтические композиции содержат описанные антитела.
Синтез кДНК и амплификация генов при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции) вариабельного района МАЬ Р3 и МАЬа1 1Е10.
Цитоплазматическую РНК экстрагировали приблизительно из 106 гибридомных клеток, продуцирующих Р3 (мышиное 1дМ-МАЬ, которое узнает СМ3 Ν-гликолилированный ганглиозид) или 1Е10 (антиидиотипическое анти-Р3-антитело). РНК экстрагировали с использованием реагента ТКЕОЬ (С1ВСО ВРЕ, Сгапб Ыапб, ΝΥ), в соответствии с инструкциями изготовителя.
Реакцию синтеза кДНК проводили, смешивая 5 мкг РНК, 25 пмоль УЬ (комплементарной константной области мышиного 1дМ для УНР3 и константной области мышиного 1дС1 для УН 1Е10) или Ук (комплементарной константному мышиному району каппа для обоих антител), 2,5 мМ каждого из άΝΙΚ, 50 мМ Трис-НС1 рН 7,5, 75 мМ КС1, 10 мМ ДТТ, 8 мМ МдС12 и 15 единиц ингибитора РНКаз в реакционной смеси 50 мкл. Смесь прогревали при 70°С в течение 10 мин и медленно охлаждали до 37°С. Затем добавляли 100 единиц фермента обратной транскриптазы МЬУ, и инкубирование при 42°С продолжали в течение одного часа.
кДНК вариабельных областей УК и УН амплифицировали при помощи ПЦР. Вкратце, кДНК УН или УК смешивали с 25 пмоль специфических праймеров, 2,5 мМ каждого из άΝΊΚ, 5 мкл компонентов 10Х буфера для ДНК-полимеразы Тад и 1 единицей этого фермента. Эти пробы подвергали 25 термическим циклам при 94°С, 30 с; 50°С, 30 с; 72°С, 1 мин и последей инкубации в течение 5 мин при 72°С.
Клонирование и секвенирование амплифицированной кДНК
ПЦР-продукты УН и УК (Р3 и 1Е10, соответственно) клонировали в вектор ТА (набор для клонирования ТА, Рготеда, ИЗА). Полученные клоны секвенировали с использованием дидезокси-способа с применением ДНК-полимеразы Т7 (набор для секвенирования с Т7, РЬагтааа, З\\сбеп).
- 4 006310
Конструирование химерных генов
Гены УН и УК вырезали из ТА-векторов путем ферментативного расщепления и их клонировали в соответствующие экспрессирующие векторы (Со1ота е! а1. (1992): Νονοί усеЮгк Гог (Не ехртеккюи οί аибЬобу то1ееи1ек имид уапаЫе тедюик деиета!еб Ьу ро1утетаке сНаб1 теаебои, 1. 1ттипо1. Ме1б., 152: 89104).
Гены УН вырезали из ТА-вектора путем ферментативного расщепления ЕсоВУ и Ν1κ1 и клонировали в экспрессирующий вектор (РАН 4604), который включал в себя ген вариабельного района 1дС1 человека и ген устойчивости к гистидинолу. Были получены конструкции Р3УН-РАН4604 и 1Е10УНРАН4604. Гены УК вырезали из ТА-вектора ферментативным расщеплением ЕсоКУ и 8аИ и клонировали в экспрессирующий вектор (РАС4622). Этот вектор включал в себя ген устойчивости к микофеноловой кислоте и ген константного района каппа человека. Были получены конструкции Р3УК-РАО4622 и 1Е10УК-РАО4622.
Экспрессия химерных антител, полученных из МАЬ Р3 и МАЫй 1Е10
Клетки N8-0 электропорировали с использованием 10 мкг Р3УК-РАО4622 или 1Е10УК-РА64622, клоны, экспрессирующие легкие цепи каппа человека, трансфицировали с использованием 10 мкг Р3УНРАН4604 и 1Е10УН-РАН4604.
Эти ДНК линеаризовали расщеплением ферментом Руи1, осаждали этанолом и растворяли в 50 мкл ЗФР. Приблизительно 107 клеток собирали путем центрифугирования и ресуспендировали в 0,5 мл ЗФР вместе с расщепленной ДНК в кювете для электропорации. После 10 мин на льду этим клеткам давали импульс 200 В и 960 мкФ и оставляли на льду в течение дополнительных 10 мин. Клетки распределяли в 96-луночные планшеты с ЭМЕМ Е12 плюс 10% фетальная телячья сыворотка. Спустя два или четыре дня добавляли селективную среду (ЭМЕМ Е12 с микофеноловой кислотой, 0,45 мкг/мл, или гистидинолом, 10 мМ, соответственно). Трансфицированные клоны были видны невооруженным глазом спустя 14 дней.
Присутствие антитела человека в среде лунок, содержащих трансфицированные клоны, измеряли с использованием ЕЫ8А. Лунки микротитрационного планшета покрывали козьими антителами против легкой цепи каппа человека (для клонов, продуцирующих каппа-цепь человека) или против 1дС человека (специфическими для гамма-цепи) (для продуцирующих полное антитело клонов). После промывания ЗФРТ (забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 0,05% Твин 20) разведенную культуральную среду лунок, содержащих трансфектанты, добавляли в каждую микротитрационную лунку и выдерживали в течение одного часа при 37°С. Лунки промывали ЗФР-Т, добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела против легкой цепи каппа человека или конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антитела против 1дС человека (специфические для гамма-цепи) и инкубировали при 37°С один час. Лунки промывали ЗФР-Т и добавляли субстратный буфер, содержащий офенилендиамин или пара-нитрофенилфосфат, соответственно. Спустя полчаса измеряли оптическую плотность при 492 или 405 нм, соответственно.
Конструирование гуманизированных антител Р3Ьи и 1Е10Ьи путем гуманизации Т-клеточных эпитопов
Предсказание Т-клеточных эпитопов.
Последовательности вариабельных доменов Р3 и 1Е10 анализировали с использованием алгоритма АМРН1 (Матдаб! е! а1. (1987): Ртебюбои оГ пптипобопбпаЩ Не1рег Т се11 аибдешс 8Йе8 Ггот (Не рбтагу 5ес.|иепсе. 1. 1ттипо1., 138: 2213-2229). С его помощью осуществляли поиск на спиральные амфипатические сегменты с 7 или 11 аминокислотными остатками, которые были ассоциированы с Тиммуногенностью. С помощью программы 8ОННА также были предсказаны спиральные гидрофобные остатки (ЕШо! е! а1. (1987). Аи Нуро1Неб5 ои (Не Ьтбшд оГ аи атрЫрабс, а1рНа бебса1 кециеисе 1и б(еи) (о (Не беюЮре оГ с1а§8 II аибдеи, I. 1ттиио1., 138: 2949-2952). Оба алгоритма помогли предсказать, какие сегменты из последовательностей вариабельной области антител Р3 и 1Е10 могли бы присутствовать в Тхелперных клетках в контексте молекул МНС класса II.
Анализ гомологии с иммуноглобулинами человека
Аминокислотные последовательности мышиных вариабельных областей сравнивали с последовательностями иммуноглобулинов, содержащихся в базах данных ОепВапк и ЕМВЬ (доступных в Интернете). Для каждого антитела определяли наиболее гомологичную последовательность из вариабельной области иммуноглобулинов человека. Для поиска гомологии последовательностей использовали программное обеспечение РС-ТАО ШВЮ РКО8[8 06-00 (НбасЫ).
Анализ на уменьшение иммуногенности
Целью этого способа является уменьшение иммуногенности путем разрушения или гуманизации потенциально иммуногенных Т-эпитопов с минимальными изменениями. Этот способ предусматривает разумную замену небольшого числа аминокислотных остатков, расположенных в спиральных амфипатических сегментах. Должны быть сохранены аминокислоты, которые являются в основном ответственными за канонические структуры, а также остатки в непосредственной близости к СЭВ или в зоне Уетшет.
Согласно этому способу последовательности мышиной вариабельной области сравнивали с наиболее гомологичной последовательностью человека, и идентифицировали различные аминокислотные ос
- 5 006310 татки в каждом положении между мышиным МЛЬ и наиболее гомологичной последовательностью человека (КаЬа! (1991), 8ес.|иепсе5 о£ ргсИснъ о£ нптипо1ощса1 йИегеЧ. Ийй Εάίΐίοη, Ναΐίοηαΐ ΙηκΙίΙυΙο о£ НеаИй), ранее определяемые остатки заменяли остатками, присутствующими в наиболее гомологичной последовательности человека. Замены производили с использованием способов направленного мутагенеза.
Остатки, участвующие в трехмерной структуре сайта связывания, не мутировали; это могло бы повлиять на узнавание антигена. Дополнительная информация о влиянии замен в третичной структуре может быть получена путем молекулярного моделирования антигенсвязывающего сайта.
Следует иметь в виду присутствие остатков пролина в спиральном амфипатическом сегменте и тот факт, что некоторые мышиные остатки не находятся в том же самом положении в наиболее гомологичной последовательности человека, но являются часто встречающимися в других иммуноглобулинах человека. По этой причине нет уникального ансамбля мышиных аминокислот, которые должны быть заменены в рамках считывания. Можно получать различные версии модифицированного антитела с различными числами замен. Мутации проводили посредством перекрывающихся ПЦР.
Клонирование и экспрессия гуманизированных антител Р3Ьи и 1Е10Ьи
Генетические конструкции, соответствующие Р31ш и 1Е101ш. клонировали в экспрессирующих векторах в соответствии со способом, описанным для химерных антител. Полученными конструкциями были Р3УКЙЦ-РАО4622 или 1Е10Укйц-РАО4622 и Р3УН1и-РАН4604 и 1Е10УН1и-РАН4604. Их трансфицировали в клетки N8-0 согласно протоколу, описанному выше для химерных антител.
Очистка рекомбинантных антител
Рекомбинантные антитела очищали методом аффинной хроматографии с использованием протеина А (Рйагтааа, ИрззаЦ 8\\сбеп).
Биологическая активность
Специфическое связывание с антигеном, измеряемое при помощи ЕЫ8А, было тестом на биологическую активность рекомбинантных антител.
Для рекомбинантного МАЬ Р3 микротитрационные планшеты покрывали ганглиозидом ОМ3 (№иОс) в метаноле. После сушки в течение одного часа неспецифическое связывание блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в Трис-НС1-буфере с инкубированием в течение одного часа при 37°С. Лунки промывали ЗФР и инкубировали в течение 1 ч при 37°С с очищенным рекомбинантным МАЬ Р3. Лунки промывали Трис-НС1, добавляли козьи антитела против 1д человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой, и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Наконец, эти лунки промывали и добавляли субстратный буфер, содержащий пара-нитрофенилфосфат. Через полчаса измеряли оптическую плотность при 405 или 492 нм, соответственно.
Для рекомбинантного МАЬа1 1Е10 анализ ЕЫ8А был сходным, за исключением того, что лунки покрывали МАЬ Р3, и промывание выполняли с использованием ЗФР-0,005% Твин 20.
Примеры
В следующих примерах все используемые ферменты, а также реагенты и материалы, получали из коммерческих источников, если нет других указаний.
Пример 1. Получение химерного МАЬ Р3.
Синтез кДНК выполняли реакцией с ферментом обратной транскриптазой с использованием РНК из гибридомы, продуцирующей МАЬ Р3, в качестве исходного материала, как описано ранее. Последовательности специфических праймеров, используемых в этой реакции, показаны ниже.
Для УН:
δ ’ АО6ТСТАСАА(СТ)СТССАСАСАСАСв(АС)(АСК:САБТеОАТАОАС 3'
Для УК:
5' ССЕТСТАСААСТОбАТбСТевСЗААвАТОО 3’ кДНК УНР3 и кДНК УКР3 амплифицировали при помощи ПЦР с использованием ДНКполимеразы Тад и специфических праймеров. Включенными в праймеры сайтами рестрикции были сайты ЕсоРУ/М1е1 для УН и ЕсоК.У/8а11 для УК. Последовательности используемых праймеров были следующими:
Для νΗ:
Праймер 1 (сигнальный пептид):
5(ЗССвАТАТССАССАТвС(А6)АТ6(С6)А6СТ6(Т<ЗКЗТ(СА)АТ(ССКГГСТТЗ·
Праймер 2 (СН1):
5’ ОвСССТАССТОСАОАОАСАОТСАССАСЗАОТ 3'
Для УК:
Праймер 1 (сигнальный пептид):
5' ООО<ЗАТАТССАССАТ6вА6(ТА)САСА(6Т)(ТА)СТСАСОТСТТТ(6А)Т 3'
Праймер 2 (Ск)
5' АвС6ТСОАСТТАС<ЗТТТ(ТО)АТТТССА(ВА)СТТ(ЗТ)СТССС 3'
- 6 006310
Продукты ПЦР клонировали в вектор ТА (набор для клонирования ТА, 1пу|!годеп). Двенадцать независимых клонов секвенировали по дидезокси-способу с использованием ДНК-полимеразы Т7 (РЬагтаС1а). С использованием анализа поиска гомологии определили группу наиболее гомологичных последовательностей для УНР3 и УКРЗ. Последовательности УНР3 и УКРЗ (фиг. 1 и 2) имеют высокую гомологию с группами ΙΒ и V, соответственно, в соответствии с классификацией Кабата.
После расщепления рестриктазами ЕсоРУ и ΝΙιοΙ для УНРЗ и ЕсоРУ и 8а11 для УКРЗ их клонировали в экспрессирующие векторы, предварительно расщепленные теми же самыми ферментами, РАН4604 и РАС4622 для УН и УК, соответственно. Эти экспрессирующие векторы были предоставлены 811епе Могг18оп (иСЬА, Са1йогша, И8А), они пригодны для экспрессии иммуноглобулинов в клетках млекопитающих. Вектор РАН4604 включал в себя константную область 1дС1 человека и РАС4622 человека (Со1ота е! а1. (1992): Νονοί усс!огк Еог !Ье ехргеккюп о£ апйЬобу то1еси1ек икшд гапаЫс гедюпк депега!еб Ьу ро1утегаке сйаш геасйоп, 1. 1ттипо1. Ме!11., 152: 89-104). Были получены конструкции РЗУНРАН4604 и РЗУК-РАО4622.
Клетки N8-0 трансфицировали 10 мкг РЗУ1<-РАС4622, клон, экспрессирующий легкую цепь, трансфицировали 10 мкг РЗУН-РАН4604, в обоих случаях ДНК линеаризовали с использованием Руи1, осаждали этанолом и растворяли в 50 мкл ЗФР перед трансфекцией.
Приблизительно 107 клеток собирали путем центрифугирования в 0,5 мл ЗФР вместе с расщепленной ДНК в кювете для электропорации. После 10 мин на льду клеткам давали импульс 200 Вт и 960 мкФ и оставляли на льду в течение дополнительных 10 мин. Клетки распределяли в 96-луночные планшеты с ЛМБМ Р12 плюс 10% фетальная телячья сыворотка. Спустя два или четыре дня добавляли селективную среду (ΌΜΕΜ Р12 с микофеноловой кислотой, 0,45 мкг/мл, или гистидинолом, 10 мМ, соответственно). Трансфицированные клоны были видны невооруженным глазом спустя 14 дней.
Присутствие антитела человека в среде лунок, содержащих трансфицированные клоны, измеряли с использованием ЕЫ8А. Лунки микротитрационного планшета покрывали козьими антителами против легкой цепи каппа человека (для продуцирующих каппа-цепь человека клонов) или против 1дС человека (специфическими для гамма-цепи) (для продуцирующих полное антитело клонов). После промывания ЗФРТ (забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 0,05% Твин 20) разведенную культуральную среду лунок, содержащих трансфектанты, добавляли в каждую микротитрационную лунку и выдерживали в течение одного часа при З7°С. Лунки промывали ЗФР-Т, добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела против легкой цепи каппа человека или конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антитела против 1дС человека (специфические для гамма-цепи) и инкубировали при З7°С один час. Лунки промывали ЗФР-Т и добавляли субстратный буфер, содержащий офенилендиамин или паранитрофенилфосфат, соответственно. Спустя полчаса измеряли оптическую плотность при 492 или 405 нм, соответственно.
Пример 2. Получение отличающихся версий гуманизированного антитела РЗ.
Мышиные последовательности УНРЗ и УКРЗ (фиг. 1 и 2) сравнивали с последовательностями человека. Фиг. З и 4 показывают наиболее гомологичные последовательности человека. Спиральные амфипатические районы потенциальных Т-клеточных эпитопов подвергали поиску на предмет последовательности мышиного вариабельного района РЗ и в соответствии с этим способом проводили разумную стратегию для замены аминокислот для разрушения или гуманизации потенциальных Т-клеточных эпитопов в этих мышиных последовательностях.
Анализ УНРЗ дал 2 амфипатических сегмента, первый из которых включает в себя СЭРЕ РР2 и несколько остатков СЛР2, а второй включает в себя конец РРЗ и СЛРЗ. Основные отличия мышиной последовательности в сравнении с наиболее гомологичной последовательностью человека были обнаружены в СЭР или остатках, участвующих в трехмерной структуре сайта связывания. По этой причине было решено не заменять никаких аминокислот в мышином УНРЗ.
Анализ УКРЗ дал 2 амфипатических сегмента (фиг. 4), первый из которых включает в себя РР1, а второй включает в себя СЛР2 и несколько остатков РРЗ. Было решено заменить остатки в положениях 8, 9, 10, 11 и 1З остатками, находящимися в тех же самых положениях в наиболее гомологичной последовательности человека. Аминокислоты Н1к, Ьук, РЬе, Ме! и ТЬг были заменены Рго, 8ег, 8ег, Ьеи и А1а, соответственно. Эти замены выполняли с использованием перекрывающейся ПЦР (Каттапп е! а1. (1989) Кар1б 1пкег!1опа1 ти!адепек1к о£ ^NА Ьу ро1утегаке сйаш геас!юп (РСК), ШЭею АсЛк Рек., 17: 5404) с использованием праймеров 1 и 2 и З и 4, последовательности которых являются следующими:
Праймер 1:
У АТЗАСССАЗТСТССТТСТТСТСТГГССеСОТСАСТАеСАСАС У
Праймер 2:
5' АСССТССАСТТАС6ТТТ(Т<3)АТТТССА<еА)СТГ(ОТ)(ЗТССС 3'
Праймер 3:
У ОТСТССТАСТбАСОСООАААЗАОААОААОЗАОАСТеаЗТСАТЗ'
Праймер 4:
5'<ЗабОАТАТССАССАТСОАС(ТА)САСА(СРаА)СТСА<ЗОТСТТТ(вА)ТЗ'
- 7 006310
Точковые мутации проверяли секвенированием. Полученной конструкцией была Р3УК1ш. и ее клонировали в экспрессирующий вектор РАС 4622. Полученной конструкцией была Р3УК1ш-РЛС4622. Для экспрессии гуманизированного антитела Р3 клетки N8-0 трансфицировали Р3УН-РАН4604 и Р3УКНиРАС4622.
Антитело Р31ш трансфицировали согласно той же самой процедуре электропорации и детектирования, которая описана ранее для химерных антител.
Пример 3. Биологическая активность химерного МАЬ Р3.
Специфическое связывание с антигеном, измеряемое при помощи ЕЫ8А, было тестом на биологическую активность химерногоМАЬ Р3.
Для рекомбинантного МАЬ Р3 микротитрационные планшеты покрывали ганглиозидом СМ3(ЦеиСе) в метаноле. После сушки в течение одного часа при 37°С неспецифическое связывание блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в Трис-НС1-буфере с инкубированием в течение одного часа при 37°С. Лунки промывали ЗФР и инкубировали в течение 1 ч при 37°С с очищенным рекомбинантным МАЬ Р3. Лунки промывали Трис-НС1, добавляли козьи антитела против 1д человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой, и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Наконец, эти лунки промывали и добавляли субстратный буфер, содержащий пара-нитрофенилфосфат. После получаса измеряли оптическую плотность при 405 соответственно.
Химерное МАЬ Т1 использовали в качестве негативного контроля.
На фигуре 5 показано специфическое связывание химерного МАЬ Р3 с антигеном.
Пример 4. Получение химерного МАЬ 1Е10.
Синтез кДНК выполняли реакцией с ферментом обратной транскриптазы с использованием РНК из гибридомы, продуцирующей МАЬ 1Е10, в качестве исходного материала, как описано ранее. Последовательности специфических праймеров, используемых в этой реакции, показаны ниже.
Для УН:
5СЕ66СТАССТОАОСАОАСТОТОАОАСТССТ 3'
Для УК
ОСеТСТАСААСТОбАТОСТЗССААСАТОеА 3' кДНК νΗΙΕΙΟ и кДНК УК1Е10 амплифицировали при помощи ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Таф и специфических праймеров.
Для УН:
Праймер 1 (сигнальный пептид):
5ОС<ЗОАТАТССАССАТОО(Аа)АТ6{Св)А6СТ<3(ТО)аТ(СА)АТ(СЗ)СТСТТЗ·
Праймер 2 (СН1):
5' 66(ЗОСТАОСТСАЕОА<ЭАСТСТОАОАСТеОТ 3'
Для УК:
Праймер 1 (сигнальный пептид):
55СООТТААССАССАТЗАОС(СТ)СССС{АРОСТСАС(СТ)Т(СТ)СГ(ТС)СС(ОА)3·
Праймер 2 (Ск)
5'А0С0ТС0АСТТАС6ТТТ(Т6)АТТТССА((ЗА)СТТ(СТ)ОТСССЗ·
Продукты ПЦР клонировали в вектор ТА (набор для клонирования ТА, 1пуйгодеп). Двенадцать независимых клонов секвенировали (фиг. 7 и 8) по дидезокси-способу с использованием ДНК-полимеразы Т7 (Рйагтас1а). С использованием анализа поиска гомологии определили группу наиболее гомологичных последовательностей для УН1Е10 и УК1Е10. Последовательности УН1Е10 и УК1Е10 имеют высокую гомологию с группами смешанных районов и V, соответственно, в соответствии с классификацией Кабата.
После расщепления рестриктазами ЕсоКТО и Ν1κΙ для νΗΡΗ) и Нтс11 и 8а11 для νΚΙΗΗ) их клонировали в экспрессирующие векторы, предварительно расщепленные теми же самыми ферментами, РАН4604 и РАС4622 для νΉ и νκ, соответственно. Эти экспрессирующие векторы были предоставлены 8Непе Могпкоп (иСЬА, Са1йогша, И8А), они пригодны для экспрессии иммуноглобулинов в клетках млекопитающих. Вектор РАН4604 включал в себя константную область 1дС1 человека и РАС4622 человека (Со1ота е! а1. (1992): №се1 уес1ог8 £ог Не ехргеккюп о£ апйЬобу то1еси1ек шшд уапаЫе гедюпк депега!еб Ьу ро1утегаке скат геасйоп, 1. 1ттипо1. Ме1к., 152: 89-104). Были получены конструкции 1Е10^РАН4604 и 1Е10\’К-РАС4622.
Клетки N8-0 трансфицировали с использованием 10 мкг 1Е10^-РАС4622, клон, экспрессирующий легкую цепь, трансфицировали с использованием 10 мкг 1Е10VН-РАН4604, в обоих случаях ДНК линеаризовали с использованием Руц1, осаждали этанолом и растворяли в 50 мкл ЗФР перед трансфекцией.
Приблизительно 107 клеток собирали путем центрифугирования в 0,5 мл ЗФР вместе с расщепленной ДНК в кювете для электропорации. После 10 мин на льду клеткам давали импульс 200 В и 960 мкФ и
- 8 006310 оставляли на льду в течение дополнительных 10 мин. Клетки распределяли в 96-луночные планшеты с ΌΜΕΜ Р12 плюс 10% фетальная телячья сыворотка. Спустя два или четыре дня добавляли селективную среду (ΌΜΕΜ Р12 с микофеноловой кислотой, 0,45 мкг/мл, или гистидинолом, 10 мМ, соответственно). Трансфицированные клоны были видны невооруженным глазом спустя 14 дней.
Присутствие антитела человека в среде лунок, содержащих трансфицированные клоны, измеряли с использованием ЕЫЗА. Лунки микротитрационного планшета покрывали козьими антителами против легкой цепи каппа человека (для продуцирующих каппа-цепь человека клонов) или против 1дС человека (специфическими для гамма-цепи) (для продуцирующих полное антитело клонов). После промывания ЗФРТ (забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 0,05% Твин 20), разведенную культуральную среду лунок, содержащих трансфектанты, добавляли в каждую микротитрационную лунку и выдерживали в течение одного часа при 37°С. Лунки промывали ЗФР-Т, добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена козьи антитела против легкой цепи каппа человека или конъюгированные со щелочной фосфатазой козьи антитела против 1дС человека (специфические для гамма-цепи) и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Лунки промывали ЗФР-Т и добавляли субстратный буфер, содержащий о-фенилендиамин или пара-нитрофенилфосфат, соответственно. Спустя полчаса измеряли оптическую плотность при 492 или 405 нм, соответственно.
Пример 5. Получение отличающихся версий гуманизированного антитела 1Е10.
Мышиные последовательности УН1Е10 и УК1Е10 (фиг. 6 и 7) сравнивали с последовательностями человека. Фиг. 8 и 9 показывают наиболее гомологичные последовательности человека. Спиральные амфипатические районы потенциальных Т-клеточных эпитопов подвергали поиску на последовательности мышиного вариабельного района 1Е10, и в соответствии с этим способом проводили разумную стратегию для замены аминокислот для разрушения или гуманизации потенциальных Т-клеточных эпитопов в этих мышиных последовательностях.
Анализ УН1Е10 дал (фиг. 8) 3 амфипатических сегмента, первый из которых включает в себя РК1, второй включает в себя РК2, третий включает в себя РК3. Было решено заменить остатки в положениях 5, 40, 42 и 87 (83 согласно нумерации Кабата) остатками, находящимися в тех же самых положениях в наиболее гомологичной последовательности человека. Аминокислоты С1и, Агд, С1и и ТЬг были заменены Уа1, А1а, С1у и Агд, соответственно.
Эти замены выполняли с использованием перекрывающейся ПЦР (Каттапп с1 а1. (1989) КарИ ίηзегЦопа1 ти1адепез!3 οί ΩΝΛ Ьу ро1утегазе сйаш геасйоп (РСК), Ыис1е1с АсИз Кез., 17: 5404) с использованием другого набора праймеров.
Праймеры для мутации в положении 5 были праймерами 1 и 2 и 3 и 4, последовательности которых являются следующими:
Праймер 1:
СА6ОТТСА6СТ0вТ6СА6ТСТС0А0СТГ
Праймер 2:
5’ СЗСЗСТАЗСТСАЗЗАЗАСТОТЗАвАВТвЗТ 3'
Праймер 3:
5’ АЗСТССАСАСТЗСАССАЗСТЗААССТЗ 3'
Праймер 4:
5'6СЗСАТАТССАССАТЗЗ(АЗ)АТ6(СЗ)А6СТЗ(Тв)ЗТ(СА)АТ(СЗ)СТСТТЗ
После проверки секвенированием точковой мутации в положении 5 вводили мутации в положениях 40 и 42.
Праймеры для мутаций в положениях 40 и 42 тяжелой цепи:
Праймер 1:
5’ Тб<ЗеТСА6<ЗСАО6С6ССТ666САеО6АСТТЗА6 3'
Праймер 2:
5' СЗСОСТА6СТЗАСОАСАСТЗТЗАОАЗТЗЗТ 3'
Праймер 3:
5’ СТСААСТСССТОСССАООСОССТбССТСАСССАЗ·
Праймер 4:
5’06в0АТАТССАССАТеб(А0)АТа(Се)А0СТ0(Т0)0Т(СА)АТ(С6)СТСТТЗ·
После проверки секвенированием точковой мутации в положениях 40 и 42 вводили мутацию в положение 87 (83 согласно нумерации Кабата).
Праймеры для мутаций в положении 87 (83 согласно нумерации Кабата) тяжелой цепи.
- 9 006310
Праймер 1:
5’ СТСАОСАООСТССС6ТСТОАООАСТСТЗ'
Праймер 2:
5' СССССТАССТбАССАОАСТОТОАОАбТОСТ 3'
Праймер 3:
5* АОАСТССТСАОАССОСАСССТССТОАС 3*
Праймер 4:
5'аО(ЗОАТАТССАССАТаО(АС)АТО(СС)АССТа(ТОКЭТ(СА)АТ(СС)СТСТТЗ'
Другие замены не производили, так как остатки участвовали в трехмерной структуре сайта связывания.
Точковые мутации подтверждали секвенированием. Полученной конструкцией была 1Е10УНЬи, и ее клонировали в экспрессирующий вектор РАН4604. Полученной конструкцией была 1Е10УНРАН4604.
Анализ УН1Е10 дал также 3 амфипатических сегмента (фиг. 9), первый из которых включает в себя РК1, второй включает в себя СБК1 и третий включает в себя РК3. Было решено заменить остатки в положениях 7, 8 и 15 остатками, находящимися в тех же самых положениях в наиболее гомологичной последовательности человека. Аминокислоты ТЬг, ТЬг и Беи были заменены 8ег, Рго и Уа1, соответственно. Эти замены выполняли с использованием перекрывающейся ПЦР (Каттапп е1 а1. (1989) ΙΚιρίΟ тзегйопа1 ти1а§епез1з о£ ΌΝΑ Ъу ро1утегазе сйаш геасйоп (РСК), Пие1е1с Ас1бз Кез., 17: 5404) с использованием праймеров 1 и 2 и 3 и 4, последовательности которых являются следующими.
Праймеры для мутации в положениях 7, 8 и 15 легкой цепи:
Праймер 1:
УСАОАТОАСАСАОТСТССТТССТСССТОТСТОССТСТСТОССАОАСАОАСТС 3’
Праймер 2:
5АСССТСОАСТТАССТТТ(Т<3)АТТТССА(СА)СТТ(ОЛОТССС 3'
Праймер 3:
б’вАСТСТСТСТСССАСАСАСССАСАСАСССАОвААООАОАСТСТеТСАТСТОЗ·
Праймер 4:
5-ССС6ТТААССАССАТОА(Зв(аТ)СССХ:(АТ)ОСТСАС(СТ)Т(СТХ:Т(ТС)СС(СА)3'
Точковые мутации подтверждали секвенированием. Полученной конструкцией была 1Е10УкЬи, и ее клонировали в экспрессирующий вектор РАО 4622. Полученной конструкцией была 1Е10УКЬиРАО4622.
Для экспрессии гуманизированного антитела 1Е10 клетки N8-0 трансфицировали 1Е10УНЬиРАН4604 и 1Е10УКЬи-РАО4622.
Антитело 11:1011ц трансфицировали согласно той же самой процедуре электропорации и детектирования, которая описана ранее для химерных антител.
Пример 6. Биологическая активность химерного антитела МаЪ1Е10.
Специфическое связывание с антигеном, измеряемое при помощи ЕБ18А, было тестом на биологическую активность химерного МАЪ 1 Е10.
Для рекомбинантного МАЪ 1Е10 микротитрационные планшеты покрывали антителом МАЪ Р3. После промывания ЗФРТ (забуференным фосфатом солевым раствором, содержащим 0,05% Твин-20), неспецифическое связывание блокировали 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в ЗФРТ с инкубированием в течение одного часа при 37°С. Лунки промывали и инкубировали в течение 1 ч при 37°С с очищенным рекомбинантным МАЪ 1Е10. Лунки промывали ЗФРТ и добавляли козьи антитела против 1д человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой, и инкубировали при 37°С в течение одного часа. Наконец, эти лунки промывали ЗФРТ и добавляли субстратный буфер, содержащий паранитрофенилфосфат. После получаса измеряли оптическую плотность при 405 нм, соответственно.
Химерное МАЪ С5 использовали в качестве негативного контроля.
На фиг. 10 показано специфическое связывание химерного МАЪ 1Е10 с МАЪ Р3.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - ДНК УНР3 и расшифрованные аминокислотные последовательности. Последовательности выстроены для сопоставления в соответствии с нумерацией Кабата (КаЪа! е1 а1. (1991), 8ециепсез о£ рго1ешз о£ 1ттипо1од1са1 т1егез1, 1;ίί'11ι ебШоп, №11опа1 1пз111и1е о£ 11еа1111), СОК отмечены пунктирными линиями.
Фиг. 2 - ДНК УКР3 и расшифрованные аминокислотные последовательности. Последовательности выстроены для сопоставления в соответствии с нумерацией Кабата (КаЪа! е1 а1. (1991), 8ециепсез о£ рго
- 10 006310
1е1пз ок 1ттипо1о§1са1 т1еге8к 1'ΊΤΐΙι ебйюп, Ыа1юпа1 1п8111и1е ок НеаИЪ), СЭК отмечены пунктирными линиями.
Фиг. 3 - УНРЗ сопоставляли с наиболее гомологичной последовательностью человека. Амфипатические сегменты подчеркнуты, а СЭК напечатаны жирным шрифтом.
Фиг. 4 - УКРЗ сопоставляли с наиболее гомологичной последовательностью человека. Амфипатические сегменты подчеркнуты, а СЭК напечатаны жирным шрифтом.
Фиг. 5 - специфическое связывание ОМЗ (ЫеиОс) химерным МЛЬРЗ. Различные концентрации МЛЬ РЗ и МАЬ Т1 (отрицательный контроль) испытывали с использованием ЕБ18А. Микротитрационные планшеты покрывали ганглиозидами ОМЗ(ЫеиОс) и ОМЗ(ЫеиАс) (отрицательный контроль) в метаноле и измеряли специфическое связывание.
Фиг. 6 - ДНК УН1Б10 и расшифрованные аминокислотные последовательности. Последовательности выстроены для сопоставления в соответствии с нумерацией Кабата (КаЬа! е! а1. (1991), Зециепсез ок рго1е1пз ок 1ттипо1о§1са1 т1егезк Б1кФ ебйюп. Ыа1юпа1 1п81Ни1е ок Неа1Ф), СБК отмечены пунктирными линиями.
Фиг. 7 - ДНК УК1Е10 и расшифрованные аминокислотные последовательности. Последовательности выстроены для сопоставления в соответствии с нумерацией Кабата (КаЬа! е! а1. (1991), Зециепсез ок рго1е1пз ок 1ттипо1о§1са1 т1егезк Б1кФ ебйюп. Ыа1юпа1 1п8111и1е ок Неа1Ф), СБК отмечены пунктирными линиями.
Фиг. 8 - УН1Е10 сопоставляли с наиболее гомологичной последовательностью человека. Амфипатические сегменты подчеркнуты, а СБК напечатаны жирным шрифтом.
Фиг. 9 - УК1Е10 сопоставляли с наиболее гомологичной последовательностью человека. Амфипатические сегменты подчеркнуты, а СБК напечатаны жирным шрифтом.
Фиг. 10 - специфическое связывание мышиного МАЬ РЗ химерным МАЬ 1Е10. Различные концентрации МАЬ 1Е10 и МАЬ С5 (отрицательный контроль) испытывали с использованием ЕБ18А. Микротитрационные планшеты покрывали МАЬ РЗ и МАЬ АЗ (отрицательный контроль) и измеряли специфическое связывание.
Claims (16)
1. Химерное моноклональное антитело, полученное из мышиного моноклонального антитела МАЬ РЗ, которое узнает ганглиозиды, содержащие Ν-гликолилированную сиаловую кислоту, и которое продуцируется гибридомной клеточной линией с депозитным номером ЕСАСС 9411З026, где гипервариабельные домены его тяжелой и легкой цепей содержат следующие последовательности:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
СОЯ1: КУЗУН
СОА2: Μΐννθ€££Τ0ΥΝ5Α1.Κ8
СОНЗ: δΘνΗΕΟΚΑΟΑννΡΑΥ
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
СОР1: КАЗСЮУЗТАУА
С0Н2: δΑδΥΚΥΤ СОАЗ: ΟΟΗΥ8ΤΡΜ/Τ
2. Химерное моноклональное антитело по п.1, где области рамки считывания (БК) его тяжелой и легкой цепей содержат следующие последовательности:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
РН1: 0ναΐΚΕ50Ρ0ίνΑΡ80613Π·0Τν8©Ρ5ί5 гга: ул/коррекбЬЕЖб
РАЗ: ΚΓδΙδΚβΝδΚδΟνΡΙΚΜΝδίαΤϋΟΤΑΜΥΥΟΑΡ
РЯД: ννοασπ,ν
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
РЯ1:0ΐνΜΤΟ5ΗΚΡΜ3Τ8ν00ΗνδΙΤ0
РЙ2: νΥΥααΚΡΘαδΡΚΙ±ΙΥ
РАЗ: ΘνΡΟΠΡΤΟδΟδΘΤΟΕΤΓΠδβνΟΑΕΟΙΑΥΥΥΟ
РЯ4: ροοσπα
3. Моноклональное антитело по пп.1 и 2, где для его гуманизации и сохранения связывающих свойств в отношении антигена оно включает в себя по меньшей мере одну из следующих замен:
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ:
Положение 8: ΗΪ5 заменен Рго
Положение 9: Ьуэ заменен Зег
Положение 10: РЬе заменен Зег
Положение 11: Мей заменен Ьеи
Положение 13: ТЬг заменен А1а.
- 11 006310
4. Моноклональное антитело по пп.1-3, где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность гамма-1-цепи, а константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность каппа-цепи, обе из которых получены из иммуноглобулинов человека.
5. Клеточная линия, продуцирующая любое из моноклональных антител по пп.1-4.
6. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей молочной железы и меланом, их метастазов и рецидивов, содержащая любое из моноклональных антител по пп.1-4.
7. Фармацевтическая композиция для локализации и идентификации ίη νίνο злокачественных опухолей молочной железы и меланом, их метастазов и рецидивов, содержащая любое из моноклональных антител по пп.1-4.
8. Применение моноклонального антитела по любому из пп.1-4 для приготовления лекарственного средства, применимого для лечения злокачественных опухолей молочной железы и меланом, их метаста зов и рецидивов.
9. Химерное моноклональное антитело, полученное из мышиного антиидиотипического моноклонального антитела 1Е10, которое узнает мышиное антитело МЛЬ Р3 и продуцируется гибридомной клеточной линией с депозитным номером ЕСАСС 97112901, где гипервариабельные домены его тяжелой и легкой цепей содержат следующие последовательности:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
00Η1:6Υ0ΙΝ
СОК2: ννΐΡΡ6065ΤΚΥΝΕΚΡΚΟ
СЦВЗ: Ε0ΥΥ0Ν8ΥΥΡ0Υ
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
СОЮ: ΚΑ3ΟΟΙ5ΝΥίΝ
СОР2: ГТЗКЦНЗО сонз: αοοΝτίΡΫΥΤ
10. Моноклональное антитело по п.9, где области рамки считывания (РЯ) его тяжелой и легкой цепей содержат следующие последовательности:
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ
РК1: даОШОЗОАЕЦУКРбАЗУЮЗСКАЗвУТЕГ
РК2: №УН0№Е061ВМв
РАЗ: КАПТТОКЗЗЗТАУМаСЗга-ТЗЕОЗАУУРСАК рю: νν<3ασττι.τν
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ
РН1: ОЮМТатТЗЗЦЗАЗЦаОНУПЗС
ЕП2: νΛΌΟΚΡΟατνΚΙΧΙΥ
РАЗ: νΡ8ΡΡ3<3303ΘΤΟΥ3ίΤΙ8ΝίΕΟΕΟΙΑΤΥΕΟ
РА4: ЕССОТКЦЕЗК
11. Моноклональное антитело по пп.9 и 10, где для его гуманизации и сохранения связывающих свойств в отношении антигена оно включает в себя по меньшей мере одну из следующих замен:
ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ:
Положение 7: ТЬг заменен 5ег
Положение 8: ТЬг заменен Рго
Положение 15: Ьеи заменен Уа!
ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ:
Агд.
12. Моноклональное антитело по пп.9-11, где константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность гамма-1-цепи, а константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность каппа-цепи, обе из которых получены из иммуноглобулинов человека.
13. Клеточная линия, продуцирующая любое из моноклональных антител по пп.9-12.
14. Фармацевтическая композиция для лечения злокачественных опухолей молочной железы и меланом, их метастазов и рецидивов, содержащая любое из моноклональных антител по пп.9-12.
15. Фармацевтическая композиция для локализации и идентификации ίη νίνο злокачественных опухолей молочной железы и меланом, их метастазов и рецидивов, содержащая любое из моноклональных антител по пп.9-12.
16. Применение моноклонального антитела по любому из пп.9-12 для приготовления лекарственного средства, применимого для лечения злокачественных опухолей молочной железы и меланом, их мета стазов и рецидивов.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2001008420010084A CU23007A1 (es) | 2001-04-06 | 2001-04-06 | Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos |
| PCT/CU2002/000003 WO2002081496A2 (es) | 2001-04-06 | 2002-04-08 | Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200301098A1 EA200301098A1 (ru) | 2004-04-29 |
| EA006310B1 true EA006310B1 (ru) | 2005-10-27 |
Family
ID=40291118
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200301097A EA006936B1 (ru) | 2001-04-06 | 2002-04-08 | Иммунотерапевтические комбинации для лечения опухолей, которые сверхэкспрессируют ганглиозиды |
| EA200301098A EA006310B1 (ru) | 2001-04-06 | 2002-04-08 | Ассоциированные с ганглиозидами рекомбинантные антитела и их применение в диагностике и лечении опухолей |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200301097A EA006936B1 (ru) | 2001-04-06 | 2002-04-08 | Иммунотерапевтические комбинации для лечения опухолей, которые сверхэкспрессируют ганглиозиды |
Country Status (37)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20040253233A1 (ru) |
| EP (3) | EP1798243B1 (ru) |
| JP (2) | JP4366080B2 (ru) |
| KR (3) | KR100863509B1 (ru) |
| CN (3) | CN101054417B (ru) |
| AR (2) | AR033123A1 (ru) |
| AT (3) | ATE378356T1 (ru) |
| AU (3) | AU2002308348B2 (ru) |
| BG (2) | BG66293B1 (ru) |
| BR (3) | BR0208676B1 (ru) |
| CA (2) | CA2441845C (ru) |
| CU (1) | CU23007A1 (ru) |
| CZ (2) | CZ296276B6 (ru) |
| DE (2) | DE60228561D1 (ru) |
| DK (2) | DK1411064T3 (ru) |
| EA (2) | EA006936B1 (ru) |
| EC (2) | ECSP034788A (ru) |
| ES (2) | ES2296986T3 (ru) |
| HK (3) | HK1066818A1 (ru) |
| HR (2) | HRP20030806B1 (ru) |
| HU (2) | HU228106B1 (ru) |
| IL (2) | IL158246A0 (ru) |
| IS (2) | IS2701B (ru) |
| MX (2) | MXPA03008738A (ru) |
| MY (3) | MY137078A (ru) |
| NO (2) | NO331533B1 (ru) |
| NZ (2) | NZ528599A (ru) |
| PE (1) | PE20020972A1 (ru) |
| PL (2) | PL208109B1 (ru) |
| PT (2) | PT1411064E (ru) |
| SG (1) | SG161737A1 (ru) |
| SI (2) | SI1411064T1 (ru) |
| SK (2) | SK287783B6 (ru) |
| UA (3) | UA75393C2 (ru) |
| UY (2) | UY27243A1 (ru) |
| WO (2) | WO2002081661A2 (ru) |
| ZA (2) | ZA200307585B (ru) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7297336B2 (en) * | 2003-09-12 | 2007-11-20 | Baxter International Inc. | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity |
| AU2006209951B2 (en) * | 2005-02-04 | 2011-04-14 | Survac Aps | Survivin peptide vaccine |
| FI20055398A0 (fi) * | 2005-07-08 | 2005-07-08 | Suomen Punainen Risti Veripalv | Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi |
| BRPI0614366A2 (pt) * | 2005-08-11 | 2009-10-06 | Arpi Matossian Rogers | peptìdeo, anticorpo ou fragmento de anticorpo, anticorpo ou ligante funcionalmente equivalente, molécula de ácido nucleico, vetor, célula hospedeira, métodos para expressar um peptìdeo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um anticorpo ou ligante equivalente e para tratar uma doença em um paciente, composição farmacêutica, composição de vacina, métodos de vacinação de um indivìduo contra uma doença ou um distúrbio e de diagnose de um indivìduo para a presença de anticorpos autoimunes, e, arranjo de peptìdeos |
| PT2407486T (pt) | 2005-08-19 | 2018-02-21 | Univ Pennsylvania | Anticorpos antagonistas contra gdf-8 e utilizações no tratamento de ela e outros distúrbios associados a gdf-8 |
| ITFI20060163A1 (it) * | 2006-06-29 | 2006-09-28 | Menarini Internat Operations Luxembourg Sa | Composizione farmaceutica contenente un anticorpo monoclonale anti idiotipico anti-ca-125 ed alluminio |
| TWI434855B (zh) | 2006-11-21 | 2014-04-21 | Hoffmann La Roche | 結合物及其在免疫分析中作為參考標準之用途 |
| JP5465542B2 (ja) * | 2008-02-22 | 2014-04-09 | 片山化学工業株式会社 | 合成糖脂質含有リポソーム |
| EP2166085A1 (en) | 2008-07-16 | 2010-03-24 | Suomen Punainen Risti Veripalvelu | Divalent modified cells |
| TWI516501B (zh) | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Ｐｃｓｋ９拮抗劑類 |
| MX341884B (es) | 2009-03-10 | 2016-09-07 | Biogen Ma Inc | Anticuerpos anti-antigeno de maduracion de celulas b (bcma). |
| WO2010120561A1 (en) | 2009-04-01 | 2010-10-21 | Genentech, Inc. | Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use |
| CU23736A1 (es) * | 2009-05-04 | 2011-11-15 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpos que reconocen sulfatidos y proteoglicanos sulfatados y su uso |
| EP2473530B1 (en) * | 2009-09-03 | 2015-04-22 | Vancouver Biotech Ltd. | Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor |
| US9469685B2 (en) * | 2011-01-10 | 2016-10-18 | Emory University | Antibodies directed against influenza |
| CU24070B1 (es) * | 2011-12-27 | 2015-01-29 | Ct De Inmunología Molecular | Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores que expresan regf y gangliósidos n-glicolilados gm3 (neugcgm3) |
| EP2641916A1 (en) * | 2012-03-23 | 2013-09-25 | Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) | Novel antibodies anti-sPLA2-IIA and uses thereof |
| SA113340642B1 (ar) | 2012-06-15 | 2015-09-15 | فايزر إنك | أجسام مضادة معارضة محسنة ضد gdf-8 واستخداماتها |
| AR096687A1 (es) | 2013-06-24 | 2016-01-27 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-fcrh5 |
| CN110156893B (zh) | 2013-12-17 | 2023-03-03 | 基因泰克公司 | 抗cd3抗体及使用方法 |
| BR112016020009A2 (pt) * | 2014-04-10 | 2017-10-17 | Obi Pharma Inc | anticorpo, composição farmacêutica, método para inibir a proliferação de células cancerígenas, hibridoma |
| TWI715587B (zh) | 2015-05-28 | 2021-01-11 | 美商安可美德藥物股份有限公司 | Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途 |
| AR105026A1 (es) | 2015-06-16 | 2017-08-30 | Genentech Inc | ANTICUERPOS MADURADOS POR AFINIDAD Y HUMANIZADOS PARA FcRH5 Y MÉTODOS PARA SU USO |
| WO2018017864A2 (en) * | 2016-07-20 | 2018-01-25 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Pvrig-binding agents and uses thereof |
| CN110662552A (zh) | 2016-11-30 | 2020-01-07 | 昂科梅德制药有限公司 | 包含tigit结合剂的癌症治疗方法 |
| CU20170173A7 (es) * | 2017-12-27 | 2019-11-04 | Ct Inmunologia Molecular | Nano-partículas que contienen el gangliósido gm3 como inmunomoduladoras |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2754206B2 (ja) * | 1987-11-17 | 1998-05-20 | メクト株式会社 | α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 |
| US6051225A (en) * | 1988-10-19 | 2000-04-18 | The Dow Chemical Company | Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment |
| ES2144440T3 (es) * | 1992-08-18 | 2000-06-16 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor del factor de crecimiento epidermico, celulas y metodos para su produccion y compuestos que los contienen. |
| JPH07101999A (ja) * | 1993-10-06 | 1995-04-18 | Hagiwara Yoshihide | 抗癌ヒトモノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
| CU22702A1 (es) * | 1997-10-21 | 2001-07-31 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpos monoclonales anti - idiotipo, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, hibridoma que los produce y composiciones que los contienen |
| US6063379A (en) * | 1993-12-09 | 2000-05-16 | Centro De Inmunologia Molecular | Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies |
| CA2137638C (en) * | 1993-12-09 | 1999-07-20 | Ana M. V. Lopez | Anti gangliosides monoclonal antibodies and their use in the specific active immunotherapy of malignant tumors |
| CU22420A1 (es) * | 1993-12-29 | 1996-01-31 | Centro Inmunologia Molecular | Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer |
| US6149921A (en) * | 1993-12-29 | 2000-11-21 | Centro De Inmunologia Molecular | Vaccine compositions for eliciting an immune response against N-acetylated gangliosides and their use for cancer treatment |
| CU22615A1 (es) * | 1994-06-30 | 2000-02-10 | Centro Inmunologia Molecular | Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos |
| CU22731A1 (es) * | 1998-02-05 | 2002-02-28 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen |
| US7442776B2 (en) * | 1999-10-08 | 2008-10-28 | Young David S F | Cancerous disease modifying antibodies |
-
2001
- 2001-04-06 CU CU2001008420010084A patent/CU23007A1/es unknown
-
2002
- 2002-04-05 AR ARP020101264A patent/AR033123A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-05 MY MYPI20021228A patent/MY137078A/en unknown
- 2002-04-05 AR ARP020101263A patent/AR033122A1/es unknown
- 2002-04-05 UY UY27243A patent/UY27243A1/es unknown
- 2002-04-05 MY MYPI20081190A patent/MY145703A/en unknown
- 2002-04-05 MY MYPI20021239A patent/MY157372A/en unknown
- 2002-04-05 UY UY27242A patent/UY27242A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-08 AT AT02759752T patent/ATE378356T1/de active
- 2002-04-08 CA CA2441845A patent/CA2441845C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 SK SK1216-2003A patent/SK287783B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 EA EA200301097A patent/EA006936B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 DE DE60228561T patent/DE60228561D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 MX MXPA03008738A patent/MXPA03008738A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-08 CN CN2007101021039A patent/CN101054417B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 SG SG200506530-5A patent/SG161737A1/en unknown
- 2002-04-08 PT PT02759752T patent/PT1411064E/pt unknown
- 2002-04-08 US US10/473,977 patent/US20040253233A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-08 EP EP06076643A patent/EP1798243B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 CN CNB028084330A patent/CN1319991C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 NZ NZ528599A patent/NZ528599A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 BR BRPI0208676A patent/BR0208676B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 EA EA200301098A patent/EA006310B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 CZ CZ20032641A patent/CZ296276B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 CA CA2443372A patent/CA2443372C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 SI SI200230660T patent/SI1411064T1/sl unknown
- 2002-04-08 HU HU0401355A patent/HU228106B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 IL IL15824602A patent/IL158246A0/xx unknown
- 2002-04-08 JP JP2002580025A patent/JP4366080B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 US US10/473,978 patent/US20050069535A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-08 AT AT02759751T patent/ATE406386T1/de active
- 2002-04-08 EP EP02759752A patent/EP1411064B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 CZ CZ2003-2668A patent/CZ304424B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 AT AT06076643T patent/ATE477279T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 SI SI200230766T patent/SI1384726T1/sl unknown
- 2002-04-08 DK DK02759752T patent/DK1411064T3/da active
- 2002-04-08 AU AU2002308348A patent/AU2002308348B2/en not_active Ceased
- 2002-04-08 MX MXPA03008739A patent/MXPA03008739A/es active IP Right Grant
- 2002-04-08 DE DE60223547T patent/DE60223547T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 CN CNB028086309A patent/CN100349920C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 PT PT02759751T patent/PT1384726E/pt unknown
- 2002-04-08 WO PCT/CU2002/000002 patent/WO2002081661A2/es active IP Right Grant
- 2002-04-08 JP JP2002579482A patent/JP2004528033A/ja active Pending
- 2002-04-08 KR KR1020037012938A patent/KR100863509B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 PL PL371937A patent/PL208109B1/pl unknown
- 2002-04-08 PE PE2002000283A patent/PE20020972A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-08 AU AU2002308347A patent/AU2002308347B2/en not_active Ceased
- 2002-04-08 DK DK02759751T patent/DK1384726T3/da active
- 2002-04-08 HU HU0401695A patent/HU228105B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 SK SK1226-2003A patent/SK287914B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 ES ES02759752T patent/ES2296986T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 ES ES02759751T patent/ES2312610T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 EP EP02759751A patent/EP1384726B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 KR KR1020037012969A patent/KR100946168B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 NZ NZ528598A patent/NZ528598A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 BR BRPI0208675-1A patent/BRPI0208675B1/pt unknown
- 2002-04-08 WO PCT/CU2002/000003 patent/WO2002081496A2/es active Application Filing
- 2002-04-08 PL PL02371770A patent/PL371770A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-04-08 BR BR0208675-1A patent/BR0208675A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-08-04 UA UA2003108989A patent/UA75393C2/uk unknown
- 2002-08-04 UA UA2003108988A patent/UA76745C2/ru unknown
-
2003
- 2003-09-23 IS IS6964A patent/IS2701B/is unknown
- 2003-09-23 IS IS6965A patent/IS6965A/is unknown
- 2003-09-29 ZA ZA200307585A patent/ZA200307585B/en unknown
- 2003-09-30 EC EC2003004788A patent/ECSP034788A/es unknown
- 2003-09-30 EC EC2003004787A patent/ECSP034787A/es unknown
- 2003-10-01 ZA ZA2003/07679A patent/ZA200307679B/en unknown
- 2003-10-02 IL IL158246A patent/IL158246A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-10-03 NO NO20034436A patent/NO331533B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-10-03 BG BG108227A patent/BG66293B1/en unknown
- 2003-10-03 BG BG108228A patent/BG66304B1/bg unknown
- 2003-10-03 NO NO20034437A patent/NO20034437L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-10-06 HR HR20030806A patent/HRP20030806B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-10-06 HR HR20030805A patent/HRP20030805B1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-14 HK HK04109894A patent/HK1066818A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-01 HK HK05102752A patent/HK1070080A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2005-12-20 UA UAA200512270A patent/UA86768C2/ru unknown
-
2007
- 2007-10-26 AU AU2007231687A patent/AU2007231687B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-12-31 HK HK07114311.6A patent/HK1109160A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-08-07 KR KR1020087019420A patent/KR100919617B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-03-19 US US12/407,046 patent/US8758753B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA006310B1 (ru) | Ассоциированные с ганглиозидами рекомбинантные антитела и их применение в диагностике и лечении опухолей | |
| EP1623997B1 (en) | Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside n-glycolyl-gm3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumours | |
| CN112703013B (zh) | Cd3抗原结合片段及其应用 | |
| JP2001523956A (ja) | ヒトｃｄ６に対するモノクローナル抗体 | |
| EA023679B1 (ru) | АНТИ-EpCAM АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | |
| EP2168599B1 (en) | Cancer remedy containing antibody against peptide encoded by exon-17 of periostin | |
| CN1675244A (zh) | Mcam抑制剂 | |
| WO1998022510A9 (en) | Methods for the production of chicken monoclonal antibodies | |
| CN113015751A (zh) | 一种融合蛋白及其用途 | |
| JPH08501925A (ja) | 糖蛋白ｐに対するモノクローナル抗体 | |
| JPH10501411A (ja) | 細胞周期非依存性グリオーマ細胞表面抗原特異的ヒト・モノクロナール抗体 | |
| WO1998012227A1 (en) | Recombinant single chain antibodies directed against the gp54 cancer marker, composition comprising same and use thereof | |
| JP4651495B2 (ja) | Ｉｓｇ１５タンパク質と特異的に反応するモノクローナル抗体及びそれを産生するハイブリドーマ並びに癌およびウイルス感染の検出方法 | |
| WO2010058396A1 (en) | A cd44vra antibody and diagnostic and therapeutic methods using same | |
| WO2006004207A1 (ja) | 抗シノビオリン抗体 | |
| MXPA06014972A (es) | Metodos y composiciones para el tratamiento de enfermedades poliquisticas. | |
| JP2015196665A (ja) | 中和活性を有する抗ｌｒ１１モノクローナル抗体、及びそれを含有してなる医薬 | |
| JPH05506241A (ja) | ３５ｋｄ腫瘍関連タンパク質抗原および免疫複合体 | |
| US20240034790A1 (en) | Antibody specific for cd47 and uses thereof | |
| EP4365197A1 (en) | Humanized antibody specific to cd47 and pharmaceutical composition comprising same for preventing or treating cd47-related disease | |
| JP4557886B2 (ja) | 食道癌の抗原およびその利用 | |
| JPH03504323A (ja) | 抗体 | |
| JPH02174691A (ja) | モノクローナル抗体 | |
| JPS61238800A (ja) | モノクロ−ナル抗体ａｍｆ及びその製造法 | |
| JP2004141161A (ja) | ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼ・ｐａｃｅ４に対するモノクローナル抗体及びその利用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |