BG108228A - Рекомбинантни антитела, свързани с ганглиозид и приложението им при диагностициране и лечение на тумори - Google Patents
Рекомбинантни антитела, свързани с ганглиозид и приложението им при диагностициране и лечение на тумори Download PDFInfo
- Publication number
- BG108228A BG108228A BG108228A BG10822803A BG108228A BG 108228 A BG108228 A BG 108228A BG 108228 A BG108228 A BG 108228A BG 10822803 A BG10822803 A BG 10822803A BG 108228 A BG108228 A BG 108228A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- item
- replaced
- antibodies
- human
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 title claims description 21
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title abstract description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 17
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 17
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 17
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 10
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 9
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims description 9
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 9
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 4
- 201000010893 malignant breast melanoma Diseases 0.000 claims description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 abstract description 23
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 43
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 12
- FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N N-glycolylneuraminic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O[C@](O)(C(O)=O)C[C@H](O)[C@H]1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-KVNVFURPSA-N 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 9
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 9
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 230000036541 health Effects 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100454807 Caenorhabditis elegans lgg-1 gene Proteins 0.000 description 4
- ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N L-Histidinol Natural products OCC(N)CC1=CN=CN1 ZQISRDCJNBUVMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N L-histidinol Chemical compound OC[C@@H](N)CC1=CNC=N1 ZQISRDCJNBUVMM-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 4
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 3
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N N-glycoloyl-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C(O)C(NC(=O)CO)C(O)CC(=O)C(O)=O SUHQNCLNRUAGOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N N-glycolyl-beta-neuraminic acid Natural products OCC(O)C(O)C1OC(O)(C(O)=O)CC(O)C1NC(=O)CO FDJKUWYYUZCUJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 101000777314 Homo sapiens Choline kinase alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000777313 Homo sapiens Choline/ethanolamine kinase Proteins 0.000 description 2
- 101001138544 Homo sapiens UMP-CMP kinase Proteins 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010027458 Metastases to lung Diseases 0.000 description 2
- 101100189058 Mus musculus Slc10a3 gene Proteins 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 description 2
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 2
- 208000009277 Neuroectodermal Tumors Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000008385 Urogenital Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940060155 neuac Drugs 0.000 description 2
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 208000037964 urogenital cancer Diseases 0.000 description 2
- OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N (e)-3-(1-benzyl-3-pyridin-3-ylpyrazol-4-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound N1=C(C=2C=NC=CC=2)C(/C=C/C(=O)O)=CN1CC1=CC=CC=C1 OXIKLRTYAYRAOE-CMDGGOBGSA-N 0.000 description 1
- 102100033400 4F2 cell-surface antigen heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101100217502 Caenorhabditis elegans lgg-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 208000037162 Ductal Breast Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- -1 GD3 ganglioside Chemical class 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 101000800023 Homo sapiens 4F2 cell-surface antigen heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001325209 Nama Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001130 anti-lysozyme effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000014581 breast ductal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 208000035250 cutaneous malignant susceptibility to 1 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008004 immune attack Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
- A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/739—Lipopolysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
- C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
- C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
- C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
- C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
- C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
- G01N33/686—Anti-idiotype
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/567—Framework region [FR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
- C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
- G01N2800/7028—Cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до получаване на модифицирани антитела чрез DNА рекомбинантна технология от моноклонално антитяло на мишка РЗ (МАb Р3), получено от хибридома клетъчна линия, депозирана съгласно Будапещенския договор с входящ номер ЕСАСС 94113026, и от негово антиидиотипно моноклонално антитяло на мишка 1Е10 (МАbаi 1Е10), получено от хибридома клетъчна линия с входящ номер ЕСАСС 97112901, с цел получаване на моноклонални антитела, които съхраняват биологичната функция на специфичното свързване към антиген на изходните антитела, като същевременно са по-малко имуногенни. Химерните антитела съгласно изобретението са хуманизирани, като включват различни домени на мишия имуноглобулин и на постоянните области на човешките имуноглобулини, при това се модифицират в областта на мишите рамки(FRs), по-специално в тези зони, които могат да се намират на антигенно място за Т-клетките, така че някои позиции от мишите рамки са също човешки. Изобретението се отнася и до приложение на посочените антитела за терапевтични и диагностични цели, по-специално за диагностика и лечение на различни видове тумори. а
Description
Област на техниката
Настоящото изобретение се отнася до биотехнологична област, в частност, до нови рекомбинантни антитела, получени посредством генно инженерство, по-специално, до химерни и хуманизирани антитела, получени от моноклонално антитяло на мишка РЗ (МАЬ РЗ) и негово антиидиотипно моноклонално антитяло на мишка 1Е10 (MAbai 1Е10).
По-специално, настоящото изобретение се отнася до антитела, които се свързват с ганглиозиди, съдържащи N-гликолирана сиалова киселина, но не се отнася до ацетилираните форми на ганглиозидите, нито до безполовите гликолипиди. Ганглиозидите, съдържащи N-гликолирана сиалова киселина,
Ί
представляват антигени, широко проявяващи се при рак на гърдата и меланоми. От друга страна, показан е, също така, антитуморният ефект на MAbai 1Е10 в експеримантални модели.
Настоящото изобретение се отнася и до фармацевтични състави, които съдържат преди описани рекомбинантни антитела, приложими при диагностициране и лечение на рак, по-специално, рак на гърдата и меланоми.
Предшестващо състояние на техниката
Ганглиозидите са гликосфинголипиди, които съдържат сиалова киселина, и, които присъстват в плазматичната мембрана в клетки на гръбначни животни (Stulls et al. (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179: 167-214). Някои от тези молекули са описани в литературата като антигени, отнасящи се до тумори или туморни маркери (Hakomory et al. (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3: 646-653), като по тази причина, приложението на анти-ганглиозидните антитела е описано като ефективно при диагностициране и лечение на рак (Hougton et al. (1985): Mouse monoclonal antibody lgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82: 1242-1246; Zhang et al. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides, I nt. J. Cancer, 73: 42-49).
Сиаловите киселини, по-често изразявани при животните, са Nацетилови (NeuAc) и N-гликолилови (NeuGc) (Gorfield et al. (1982): Occurrence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10: 5-50). N-гликолиловата (NeuGc) най-общо не се проявява в тъкани на нормален човек и на пиле, но е широко разпространена в други гръбначни (Leeden and Yu, (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A and Shengtrund CL (Eds). Plenum Press, New York, 1-48; Kawai et al. (1991):
Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectrometry, Cancer Research, 51: 1242-1246). Обаче, съществуват статии, които показват, че антителата анти-NeuGc, разпознават някои тумори и клетъчни линии при човека (Higashi et al. (1988): Detection of gangliosides as N-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952-956; Fukui et al. (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). Установени са повишени нива на GM3 (NeuGc) ганглиозидите при рак на гърдата при човек (Marquina et al. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 1996; 56: 51655171), като този резултат прави привлекателно приложението на тази молекула като мишена за лечение на рака.
Моноклоналното антитяло (МАЬ) РЗ, продуцирано от клетъчната линия с входящ номер ЕСАСС 94113026 (European Patent ЕР 0 657 471 В1), е моноклонално антитяло на мишка с IgM изотип, което се получава при стопяване на миши спленоцити от BALB/c мишка, имунизирана с липозоми, съдържащи GM3 (NeuGc) и тетаничен токсоид, с клетъчната линия P3-X63Ад8.653; която е миелома при мишка. Това моноклонално антитяло МАЬ РЗ силно взаимодейства с ганглиозиди, съдържащи N-гликолирана сиалова киселина, но не взаимодейства с ацетилираните форми на ганглиозидите, нито с безполовите гликолипиди. Показано е посредством имуноцитохимични и имунохистохимични изследвания, проведени с клетъчни линии и тъкани от доброкачествени и неопластични тумори, че моноклоналното антитяло МАЬ РЗ разпознава рак на гърдата (Vazquez et al. (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551-556) и меланома.
Моноклоналното антитяло Mab РЗ индуцира антиидиотипична имунна реакция (АЬ2) при мишки BALB/c (сингенетичен модел), даже без спомагателен и носещ протеин (Vazquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). Ролята на електронегативните групи, сиаловата киселина (за ганглиозидите) и SO3‘ (за сулфатидите) за разпознаващите свойства на това антитяло, е предствавена посредством имунохимичен анализ (Moreno et al. (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8:695-705).
Антиидиотипичното моноклонално антитяло на мишка Mab 1Е10 (Mabai 1Е10) от подтип lgG1, се получава от мишка BALB/c, имунизирана с моноклонално антитяло Mab РЗ, свързано с KLH (US Patent 6,063,379, cell line deposited under accession number ECACC 97112901). Моноклоналното антитяло Mabai 1E10 разпознава специфично МАЬ РЗ и не свързва други IgM антиганглиозидни антитела. Още повече, моноклоналното антитяло Mabai 1Е10 инхибира специфичното свързване на моноклоналното антитяло Mab РЗ с GM3 (NeuGc) и клетъчната линия MDA-MB-435, получена от дуктален карцином на гърдата (положителен за свързването на моноклоналното антитяло Mab РЗ). Моноклоналното антитяло MAbai 1Е10 индуцира силна имунна реакция на АЬЗ антителата, когато се имунизират мишки от сингенетичен или алогенен модел, като тези АЬЗ антитела не показват същата специфичност, както моноклоналното антитяло Mab РЗ, даже когато носят идиотопи, подобни на тези, носени от АЬ1 антитялото (Vazquez et al. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). Моноклоналното антитяло MAbai 1E10 индуцира силен антитуморен ефект, както в сингенетични така и в алогенни мишки. Растежът на клетъчната линия на карцином на гърдата F3II значително се подтиска от повтаряща се доза от моноклонално антитяло MAbai 1Е10, свързано с KLH в добавка на Freund, когато BALB/c мишките се ваксинират.
След ваксинацията се понижава, също така, и броят на спонтанните белодробни метастази. Интравенозното администриране на моноклонално антитяло MAbai 1Е10 върху C57BL/6 инокулирани мишки, от 10 до 14 дни след интравенозното инокулиране на меланомни клетки В16, причинява драматично понижаване на броя белодробни метастази, в сравнение с мишките, тритирани със страничен IgG. Тези резултати показват, че се предлага повече он един механизъм на антитуморно действие (Vazquez et al. (2000): Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756, 2000).
Даже, когато в продължение на 15 години е развивана хибридомната технология (Koehler у Milstein (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495-497) и, когато моноклоналните антитела вече много се използват при поставяне на диагнози, както и в научната област, те не показват терапевтична ефективност спрямо човек. Това се дължи главно на техния къс полуживот в кръвта и на това, че функциите на действие при мишките не се изпълняват в човешката имунна система, също и при човешката имунна реакция на антимишото антитяло (НАМА реакция).
Иначе, технологията на генното инженерство откри силата на използването на моноклоналното антитяло МаЬ, тъй като при манипулиране на имуноглобулиновите гени е възможно получаване на модифицирани антитела с понижена антигенност, както и подобряване на функциите на действие при лечение или диагностициране на някои патологии. Методите за понижаване на имуноглобулиновата имуногенност имат за основна задача да понижат разликата между мишото антитяло и човешкия имуноглобулин, без променяне на антигенната специфичност на разпознаване (Morrison у Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv. Immunol., 44: 65-92).
Напоследък се разработват редица методи за хуманизиране на антитела от мишки или плъхове и, по този начин, понижаване на ксеногенната имунна реакция спрямо чужди протеини, когато ги инжектират върху човека. Един от първите начини за понижаване на антигенността, бяха химерните антитела, в които, в постоянни домени на човешки молекули, са въведени различни домени на мишия протеин, които показват същата специфичност, но понижена имуногенност в сравнение с техните миши двойници, като човешките функции на действие се съхраняват посредством химерни антитела (Morrison et al. (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81: 6851-6855). Даже, когато химерните антитела имат същата специфичност, като мишия двойник, често се наблюдава имунна реакция спрямо променливите области на гризачите.
При опит за по-нататъшно понижаване на имуногенността на химерни антитела, само CDR от моноклонално антитяло на гризач може да се присади върху човешка основа и този променлив хибриден регион се проявява с човешките постоянни области (Jones et al. (1986): Replacing the complementarydetermining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature, 321: 522524; Verhoeyen et al. (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science, 239, 1534-1536). Обаче, този начин притежава някои слабости: често полученото антитяло понижава афинитета и редица остатъци от рамката трябва обратно да бъдат променяни в съответни миши остатъци за възстановяване на свързването (Rietchmann et al. (1988): Reshaping human antibodies lor therapy, Nature, 332: 323-327; Queen et al. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA 86: 10029-10033; Tempest et al. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272). Още повече, упорита имуногенност често се наблюдава в антитела с присадени CDR.
Mateo и сътрудници (US patent Number US 5 712 120) описват метод за понижаване на имуногенността на миши антитела. Съгласно метода, модифицирането се ограничава до променливите домени и, по-специално, до мишите рамки на химерните антитела. Още повече, замествания се осъществяват само в тези области на рамките, които притежават амфипатни
Ί
последователности и, оттук, са потенциални епитопи, разпознавани от Т клетките. Методът включва разумно заменяне на някои аминокиселинни остатъци, локализирани в потенциалните имуногенни епитопи посредством съответните остатъци на най-хомоложната човешка последователност, и аминокиселините, които основно отговарят за приетите структури и за остатъците в непосредствена близост до CDR или в зоната на Vernier, могат да бъдат задържани.
Полученото антитяло задържа своягта антигенна свързваща специфичност и е по-малко имуногенно от своя миши или химерен предшественик (Mateo et al. (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma, 19: 463-471) като тези свойства повишават терапевтичното им приложение. Използвайки този нов метод, трябва да бъдат извършени само някои мутации и, разбира се, по-малко генетични манипулации.
Техническа същност на изобретението
Настоящото изобретение се отнася до рекомбинантни антитела, получени чрез генно инженерство. По-специално, настоящото изобретение се отнася до химерно антитяло, получено от моноклонално антитяло на мишка РЗ, продуцирано от хибридомна клетъчна линия с входящ номер ЕСАСС 94113026. МАВ РЗ разпознава антиген, изразен в гръдни туморни клетки и меланоми. Моноклоналното антитяло на мишка МАЬ РЗ се характеризира със следните последователности на хиперпроменливите области (CDR) на тежките и леки вериги:
ТЕЖКА ВЕРИГА
CDR1: RYSVH
CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS
CDR3: SGVREGRAQAWFAY
CADENA LIGERA
CDR1: KASQDVSTAVA
CDR2: SASYRYT
CDR3: QQHYSTPWT
Предпочита се, рамковите (FR) последователности на тежката и леката вериги да бъдат следните:
ТЕЖКА ВЕРИГА
FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
FR2: WVRQPPGKGLEWLG
FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
FR4: WGQGTLV
ЛЕКА ВЕРИГА
FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
FR3: GVPDRRGSGSGTDRRISSVQAEDLAVYYC
FR4: FGGGTKL
В предпочитан аспект, химерното антитяло, съгласно настоящото изобретение, съдържа постоянна област в тежката верига на човешки lgG1 и постоянна област в леката верига на човешки Ск. В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до хуманизирано антитяло, получено от моноклоналното антитяло на мишка Mab РЗ, продуцирано от хибридомна клетъчна линия с входящ номер ЕСАСС 94113026, която се характеризира, че съдържа постоянна област в тежката верига на човешки lgG1 и постоянна област в леката верига на човешки Ск и рамковите (FR) области на леката верига съдържат някои от следните мутации:
ЛЕКА ВЕРИГА
Позиция 8: His заменен с Pro
Позиция 9: Lys заменен с Ser
Позиция 10: Phe заменен с Ser
Позиция 11: Met заменен с Leu
Позиция 13: Thr заменен с Ala
В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до химерно антитяло, получено от моноклонално антитяло на мишка 1Е10, продуцирано от хибридомна клетъчна линия с входящ номер ЕСАСС 97112901, и е антиидиотипно антитяло, което разпознава моноклоналното антитяло на мишка MAb РЗ. Антиидиотипното моноклонално антитяло на мишка MAbai 1Е10 се характеризира със следните последователности в хиперпроменливите области (CDR) на тежките и леки вериги:
© ТЕЖКА ВЕРИГА
CDR1:SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG
CDR3: EDYYDNSYYFDY
ЛЕКА ВЕРИГА
CDR1: RASQDISNYLN
CDR2: YTSRLHSG
CDR3: QQGNTLPWT
Предпочита се, рамковите (FR) последователности на тежката и леката & вериги да бъдат следните:
ТЕЖКА ВЕРИГА
FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT
FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR
FR4: WGQGTTLTV
ЛЕКА ВЕРИГА
FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC
FR2: WYQQKPDGTVKLLIY
FR3; VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC
FR4: FGGGTKLESK
В предпочитан аспект, химерното антитяло, съгласно настоящото изобретение, съдържа постоянна област в тежката верига на човешки lgG1 и постоянна област в леката верига на човешки Ск. В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до хуманизирано антитяло, получено от моноклоналното антитяло на мишка Mab 1Е10, продуцирано от хибридомна клетъчна линия с входящ номер ЕСАСС 97112901, която се характеризира, че съдържа постоянна област в тежката верига на човешки lgG1 и постоянна област в леката верига на човешки Ск и рамковите (FR) области на тежката и леката верига съдържат някои от следните мутации:
© ЛЕКА ВЕРИГА
Позиция 7: Thr заменен с Ser
Позиция 8: Thr заменен с Pro
Позиция 15: Leu заменен с Val
ТЕЖКА ВЕРИГА
Позиция 5: Gin заменен с Val
Позиция 40: Arg заменен с Ala
Позиция 42: Glu заменен с Gly
Позиция 87 (83, съгласно номерацията на Kabat): Thr заменен с Arg *·* В друг аспект, настоящото изобретение се отнася до клетъчните линии, които изразяват описаните химерни и хуманизирани антитела; настоящото изобретение се отнася и до фармацевтични състави, съдържащи описаните антитела.
За предпочитане, настоящото изобретение се отнася до фармацевтични състави за лечение на рак на гърдата, рак на белия дроб, рак на храносмилателната система, урогенитален рак, меланоми, саркоми и невроектодермални тумори, техни метастази и възвръщане, характеризиращи се с това, че включват описаните антитела и подходящ ексипиент.
В друг аспект на настоящото изобретение, фармацевтичните състави могат да бъдат използвани за локализиране и in wo диагностициране на рак на гърдата, рак на белия дроб, рак на храносмилателната система, урогенитален рак, меланоми, саркоми и невроектодермални тумори, техни метастази и възвръщане, характеризиращи се с това, че включват описаните антитела.
Синтез на cDNA и разширение на ген посредством рекция с верига на полимераза (PCR) на променлива област на моноклонално антитяло на мишка МАЬ РЗ на негово антиидиотипно моноклонално антитяло MAbai 1Е10
Цитоплазмена рибонуклеинова киселина се екстрахира от около 106 хибридомни клетки на РЗ (миши IgM Mab, който разпознава GM3 N-гликолиран ганглиозид) или на 1Е10 (антиидиотипно анти-РЗ антитяло). Рибонуклеиновата киселина се екстрахира с помощта на реактив TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY), съгласно инструкциите на производителя.
Реакцията на синтез на cDNA се провежда като се смесват 5 pg рибонуклеинова киселина, 25 pmol Vh (допълнение към постоянната област на мишия IgM за VHP3 и с постоянна област на миши lgG1 за VH 1Е10) или Vk (допълнение към постоянната миша капа област за двете антитела), 2.5 тМ от всеки dNTP, 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 75 тМ калиев хлорид, 10 тМ DTT, 8 тМ магнезиев двухлорид и 15 единици инхибитор на рибонуклеиновата киселина в 50 μΙ реакционна смес. Сместа се нагрява при 70°С в продължение на 10 минути и бавно се охлажда до 37°С. След това се прибавят 100 единици MLV обратима транскрипаза ензим и инкубирането при 42°С продължава 1 час.
Променливите области VK и VH на cDNA се разширяват при рекция с верига на полимераза (PCR). Накратко, 5 μΙ cADN на VH или VK се смесват с 25 pmol от специфични прекурсори, 2.5 тМ от всеки dNTP, 5 μΙ съставки на 10Х буфер Taq DNA полимераза и 1 единица от този ензим. Пробите се подлагат на температурни цикъла при 94°С, 30 секунди; 50°С, 30 секунди; 72°С, 1 минута; и последно инкубиране в продължение на 5 минути при 72°С.
Клониране и последователност на разширената cDNA
Продуктите на реакцията с верига на полимераза (PCR) VH и VK (съответно на РЗ и на 1Е10) се клонират в ТА вектор (ТА Cloning kit. Promega, USA). Ha получените клони се прикачат последователности чрез дидеокси метод, при използване на Т7 DNA полимераза (Т7 Sequencing kit. Pharmacia, Sweden).
φ w Конструкция на химеоните гени
VH и VK гените се взимат от ТА вектори посредством ензимно усвояване и се клонират в съответни вектори на изразяване (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104).
VH гените се взимат от ТА вектор посредством ензимно усвояване с EcoRV и Nhel и се клонират във вектор на изразяване (РАН 4604), който включва променлива област от човешки lgG1 и устойчив на хистидинол ген. © Получените конструкции са P3VH-PAH4604 и 1E10VH-PAH4604. VK гените се взимат от ТА вектор посредством ензимно усвояване с EcoRV и Sall и се клонират във вектор на изразяване (PAG 4622). Този вектор включва устойчив на микофенолна киселина ген и човешка капа постоянна област. Получените конструкции са P3VK-PAG4622 и 1E10VK-PAG4622.
Изразяване на химерни антитела, получени от моноклонално антитяло на мишка (МаЬ РЗ) и Mabid 1Е10
NS-0 клетки се електропорират с 10 pg P3VK-PAG4622 или 1E10VKPAG4622, като клоните, изразяващи човешки капа леки вериги се пренасят върху 10 pg P3VH-PAH4604 или 1E10VH-PAH4604.
Деоксирибонуклеиновите киселини се линеаризират чрез усвояване с Pvul ензим, утаяват се с етанол и се разтварят в 50 μΙ PBS. Приблизително 107 клетки се посяват при центрофугиране и отново се суспендират в 0.5 ml PBS заедно с усвоената DNA в кювета за електропориране. След 10 минути върху лед, на клетките се пуска импулс от 200 волта и 960 pF и се оставят в лед още 10 минути. Клетките се разпределят в плочка с 96 гнезда с D’MEM F12 плюс 10% ембрионален телешки серум. След два или четири дни се прибавя селективна среда (D’MEM F12 с микофенолна киселина 0.45 pg/ml или хистидинол тМ, съответно). Клоните стават видими с просто око след 14 дни.
Присъствието на човешко антитяло в средата на гнездата, съдържащи пренесени клони, се измерва посредством ELISA Гнездата на микротитърната плочка се покриват с кози античовешки капа леки вериги (за човешка капа верига, продуцираща клони) или античовешки IgG (специфична гама верига) (за пълно продуциране на клони от антитяло) антитела. След промиване с PBST (буфериран разтвор от салинфосфат, съдържащ 0.05% Tween 20), към всяко микротитърно гнездо в продължение на 1 час при 37°С се прибавя разредена културна среда от гнездата, съдържащи трансфектанти. Гнездата се промиват с PBS-Т и се прибавят пероксидаза от спрегната с хрян козя античовешка капа лека верига или свързан с алкална фосфатаза кози античовешки IgG (специфична гама верига), след което се инкубират в продължение на 1 час при 37°С. Гнездата се промиват с PBS-Т и се прибавя субстратен буфер, съдържащ, съответно, о-фенилендиамин или рнитрофенилфосфат. След половин час се измерва поглъщане, съответно, от 492 или 405 пт.
Конструкция на хуманизираните антитела P3hu и 1 E10hu при хуманизиране на епитопи на Т клетки. Предвиждане на Т клетъчни епитопи
Последователностите на променливите домени на РЗ и 1Е10 се анализират посредством алгоритъма AMPHI (Margalit et al. (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213-2229). Той търси спираловидни амфипатични сегменти със 7 или 11 аминокиселинни остатъка, които се свързват с Т имуногенността. Програмата SOHHA също предвижда спираловидни хидрофобни сегменти. (Elliot et al. (1987): An hypothesis on the binding of an amphipatic, alpha helical sequence in Ii to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952). И двата алгоритъма предвиждат кои сегменти от променливата област на антителата РЗ и 1Е10 могат да представят Ш-помощните клетки в контекста на МНС молекулите от клас II.
Хомоложен анализ с човешки имуноглобулини
Аминокиселинните последователности на мишите променливи области се сравняват с имуноглобулиновите последователности, включени в GeneBank и EMBL база данни (има ги в Интернет). Хомоложната последователност на човешката променлива област е определена за всяко антитяло. За търсене на хомоложната последователност е използван Software PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00 (Hitachi).
Анализ за понижаване на имуногенността
Целта на метода е понижаване на имуногенността, разрушаваща или хуманизираща потенциални имуногенни Т епитопи, с минимум промени. Методът включва разумно заменяне на някои аминокиселинни остатъци, локализирани в спираловидни амфипатични сегменти. Аминокиселините, които основно са отговорни за приетите структури, както и за остатъците в непосредствена близост до CDR или са в зоната Vernier, трябва да бъдат запазени.
Съгласно този метод, последователностите от мишата променлива област се сравняват с най-хомоложната човешка последователност като се идентифицират различни аминокиселинни остатъци на всяка позиция между мишото МаЬ и най-хомоложната човешка последователност, като само остатъците в рамките се взимат под внимание (Kabat (1991): Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), като дефинираните преди остатъци се заменят от онези остатъци, които присъстват в най-хомоложната човешка последователност. Промените се извършват по методи на директна мутагенеза.
Остатъците, включени в триизмерната структура на мястото за свързване, не се променят; те могат да въздействат върху разпознаване на антигена. Допълнителна информация за влиянието на заместванията в структурата може да бъде получена чрез молекулно моделиране на мястото на свързване на антигена.
Трябва да се има в предвид присъствието на пролинови остатъци в спираловидния амфипатичен сегмент и фактът, че някои миши остатъци не се появяват на същата позиция в най-хомоложната човешка последователност, но са чести в други човешки имуноглобулини. По тази причина няма единно мнение за заменянето на мишите аминокиселини в рамките. Възможно е да се получат различни версии на модифицирани антитела с различен брой замествания. Мутациите се провеждат при припокриване на PCR.
Клониране и изразяване на хуманизираните антитела P3hu и 1E10hu
Генетичните конструкции, съответстващи на P3hu и 1E10hu, се клонират във вектори на изразяване, по метода, описан по-горе за химерните антитела. Получените конструкции представляват P3VKhu-PAG4622 или 1E10VKhuPAG4622 и P3VHhu-PAH4604 или 1E10VHhu-PAH4604. Те се пренасят в NS-0 клетки, следвайки протокола, описан по-горе за химерните антитела.
Пречистване на рекомбинантните антитела
Рекомбинантните антитела се пречистват посредством афинитетна хроматография при използване на протеин A (Pharmacia, Upssala, Sweden).
Биологична активност
Специфичното свързване с антиген се измерва посредством ELISA, при който анализ се тества биологичната активност на рекомбинантните антитела.
За рекомбинантното антитяло МаЬ РЗ, микротитърните плочки се покриват с GM3(NeuGc) ганглиозид в метанол. След сушене в продължение на един час, неспецифичното свързване се блокира с волски sera албумин (BSA) 1% в Tris-HCI буфер и се инкубира в продължение на 1 час при 37°С. Гнездата се промиват с PBS и се инкубират в продължение на 1 час при 37°С с пречистен рекомбинантен МаЬ РЗ. Гнездата се промиват с Tris-HCI, прибавя се козе античовешко антитяло, свързано с алкална фосфатаза и се инкубира в продължение на 1 час при 37°С. Накрая, гнездата се промиват и се прибавя субстратен буфер, съдържащ р-нитрофенилфосфат. След половин час се измерва поглъщане, съответно, при 405 или 492 nm.
За рекомбинантното антитяло Mabai 1Е10, EUSA анализът е същият с тази разлика, че гнездата се покриват с МаЬ РЗ и промиването се извършва с PBS-0.05% Tween 20.
Примери за изпълнение на изобретението
В следващите примери, всички използвани ензими, както и реактиви и материали, са търговски продукти, ако не е споменато друго.
Пример 1. Получаване на химерен МАЬ РЗ
Синтезата на cDNA се провежда при взаимодействие с ензима обратима транскриптаза, като се излиза от рибонуклеинова киселина от хибридома, продуцираща МаЬ РЗ, както е описано по-горе. Последователностите на специфичните прекурсори, използвани в тази реакция, са следните:
За VH:
5AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG (AG)(AG)CCAGTGGATAGAC 3’
За VK:
5’GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3’ cDNA VHP3 и cDNA VKP3 се удължават с PCR при използване на Taq Polymerase и специфични прекурсори. Местата на ограничения, включени в прекурсорите, са ECORV/NHEI за VH и ECORV/SALI за VK. Използваните последователности на прекурсорите са следните:
За VH:
Прекурсор 1 (сигнален пептид):
5’GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3’ Прекурсор 2 (СН1):
5’GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT3’
За VK:
Прекурсор 1 (сигнален пептид):
5’GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3’ Прекурсор 2 (Ск):
5’AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3’
PCR продуктите се клонират в ТА вектор (ТА cloning kit, Invitrogen). Дванадесет независими клона се свързват в последователност посредством дидеокси метод при използване на Т7 DNA Pol (Pharmacia). Посредством анализ за хомоложно търсене се определя най-хомоложната група в последователността за VHP3 и VKP3. VHP3 и VKP3 последователностите (Фигури 1 и 2) имат висока хомология, съответно с групите IB и V, съгласно класификацията на Kabat.
След усвояване с ограничените ензими ECORV и NHEI за VHP3 и с ECORV и SALI за VKP3, те се клонират във вектори на изразяването, усвоени преди със същите ензими, РАН4604 и PAG4622, съответно за VH и VK. Тези вектори на изразяването са подарени от Sherie Morrison (UCLA, California, USA) като те са подходящи за изразяване на имуноглобулини в клетки на бозайници. Векторът РАН4604 включва човешка постоянна област lgG1 и PAG4622 (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Получените конструкции са P3VH-PAH4604 и P3VKPAG4622.
NS-0 клетки се заразяват с 10 цд P3VK-PAG4622, клон, изразяващ лека верига, се заразява с 10 цд P3VH-PAH4604, като и в двата случая деоксирибонуклеиновата киселина се линеаризира с Pvul, утаява се с етанол и се разтваря в 50 μΙ PBS преди трансфекцията.
Приблизително 107 клетки се посяват при центрофугиране и отново се суспендират в 0.5 ml PBS заедно с усвоената деоксирибонуклеинова киселина в кювета за електропориране. След 10 минути върху лед, на клетките се пуска импулс от 200 волта и 960 цР и се оставят в лед още 10 минути. Клетките се разпределят в плочка с 96 гнезда с D’MEM F12 плюс 10% ембрионален телешки серум. След два или четири дни се прибавя селективна среда (D’MEM F12 с микофенолна киселина 0.45 цд/т1 или хистидинол 10 тМ, съответно). Трансфектираните клони стават видими с просто око след 14 дни.
Присъствието на човешко антитяло в средата на гнездата, съдържащи пренесени клони, се измерва посредством ELISA Гнездата на микротитьрната плочка се покриват с кози античовешки капа леки вериги (за човешка капа верига, продуцираща клони) или античовешки IgG (специфична гама верига) (за пълно продуциране на клони от антитяло) антитела. След промиване с
PBST (буфериран разтвор от салинфосфат, съдържащ 0.05% Tween 20), към всяко микротитьрно гнездо в продължение на 1 час при 37°С се прибавя разредена културна среда от гнездата, съдържащи трансфекганти. Гнездата се промиват с PBS-Т и се прибавят пероксидаза от спрегната с хрян козя античовешка капа лека верига или свързан с алкална фосфатаза кози античовешки IgG (специфична гама верига), след което се инкубират в продължение на 1 час при 37°С. Гнездата се промиват с PBS-Т и се прибавя субстратен буфер, съдържащ, съответно, о-фенилендиамин или рнитрофенилфосфат. След половин час се измерва поглъщане, съответно, от 492 или 405 nm.
Пример 2, Получаване на различни версии на хуманизираното антитяло РЗ
Мишите VHP3 е VKP3 последователности (Фигури 1 и 2) се сравняват с човешки последователности.фигури 3 и 4 показват най-хомоложните човешки последователности. Спираловидни амфипатични области или потенциални епитопи на Т клетки се търсят върху мишите последователности с РЗ променлива област и, съгласно метода, се провежда разумно заменяне на аминокиселини за разрушаване или хуманизиране на потенциалните епитопи на Т клетки до миши последователности.
Анализът на VHP3 дава (фигура 3) два амфипатични сегмента, като първият сегмент обхваща CDR1, FR2 и някои остатъци на CDR2, а вторият сегмент обхваща края на FR3 и CDR3. Основните разлики в мишата последователност в сравнение с най-хомоложната човешка последователност са установени в CDR или остатъците, включени в тридименсионална структура на свързващото място. За тази цел беше решено да не се заменя никаква аминокиселина в миши VHP3.
Анализът на VKP3 дава (фигура 4) също два амфипатични сегмента, като първият сегмент обхваща FR1, а вторият сегмент обхваща CDR2 и някои остатъци на FR3. Беше решено да се заменят остатъци в позиции 8, 9, 10, 11 и с остатъци в същата позиция в най-хомоложната човешка последователност. Аминокиселините His, Lys, Phe, Met и Thr бяха заменени съответно с Pro, Ser, Ser, Leu и Ala. Замените бяха извършени посредством PCR припокриване (Kammann et al. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404)) при използване на прекурсори 1,2,3 и 4, чиито последователности са следните:
Прекурсор 1:
5’ ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC 3’
Прекурсор 2:
5’ AGCGTCGACTTACGTn(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3’
Прекурсор 3:
5’ GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGACTGGGTCAT 3’
Прекурсор 4:
5’ GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3’
Местата на мутациите са потвърдени при създаване на последователностите. Получената конструкция е P3Vkhu и тя се клонира в PAG 4622 вектор на изразяване. Получената конструкция е P3Vkhu-PAG4622. За проявяване на хуманизираното антитяло РЗ, NS-Оклетки се заразяват с P3VHРАН4604 и P3Vkhu-PAG4622.
Антитялото P3hu се заразява, следвайки същия метод, описан по-горе за химерните антитела.
Пример 3. Биологична активност на химерен МаЬ РЗ
Специфичното свързване към антиген се измерва посредством ELISA за определяне на биологичната активнот на химерен МаЬ РЗ.
За рекомбинантното антитяло МаЬ РЗ, микротитърните плочки се покриват с GM3(NeuGc) ганглиозид в метанол. След сушене в продължение на един час, неспецифичното свързване се блокира с волски sera албумин (BSA) 1% в Tris-HCI буфер и се инкубира в продължение на 1 час при 37°С. Гнездата се промиват с PBS и се инкубират в продължение на 1 час при 37°С с пречистен рекомбинантен Mab РЗ. Гнездата се промиват с Tris-HCI, прибавя се козе античовешко антитяло, свързано с алкална фосфатаза и се инкубира в продължение на 1 час при 37°С. Накрая, гнездата се промиват и се прибавя субстратен буфер, съдържащ р-нитрофенилфосфат. След половин час се измерва поглъщане при 405 nm.
Химерен Mab Т1 се използва за негативен контрол.
На Фигура 5 е показано специфичното свързване на химерен МаЬ РЗ към антигена.
Пример 4, Получаване на химернен МАЬ 1Е10
Синтезата на cDNA се провежда при взаимодействие с ензима обратима транскриптаза, като се излиза от рибонуклеинова киселина от хибридома, продуцираща Mab 1Е10, както е описано по-горе. Последователностите на специфичните прекурсори, използвани в тази реакция, са следните:
За VH:
5’GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3’
За VK:
5’GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3’ cDNA VH1E10 и cDNA VK1E10 се удължават с PCR при използване на Taq Polymerase и специфични прекурсори.
За VH:
Прекурсор 1 (сигнален пептид):
5’GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3’ Прекурсор 2 (СН1):
5’GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3’
За VK:
Прекурсор 1 (сигнален пептид):
5’GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3’ Прекурсор 2 (Ck):
5’AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3’
PCR продуктите се клонират в ТА вектор (ТА cloning kit, Invitrogen). Дванадесет независими клона се свързват в последователност (фигури 7 и 8) посредством дидеокси метод при използване на Т7 DNA Pol (Pharmacia). Посредством анализ за хомоложно търсене се определя най-хомоложната група в последователността за VH1E10 и VK1E10. VH1E10 и VK1E10 последователностите имат висока хомология, съответно със смесените групи и V, съгласно класификацията на Kabat.
След усвояване с ограничените ензими ECORV и NHEI за VH1E10 и с Hindi и SALI за VK1E10, те се клонират във вектори на изразяването, усвоени преди със същите ензими, РАН4604 и PAG4622, съответно за VH и VK. Тези вектори на изразяването са подарени от Sherie Morrison (UCLA California, USA) като те са подходящи за изразяване на имуноглобулини в клетки на бозайници. Векторът РАН4604 включва човешка постоянна област lgG1 и PAG4622 (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Получените конструкции са 1E10VH-PAH4604 и 1E10VK-PAG4622.
NS-0 клетки се заразяват с 10 pg 1E10VK-PAG4622, клон, изразяващ лека верига, се заразява с 10 pg 1E10VH-PAH4604, като и в двата случая деоксирибонуклеиновата киселина се линеаризира с Pvul, утаява се с етанол и се разтваря в 50 pl PBS преди трансфекцията.
Приблизително 107 клетки се посяват при центрофугиране и отново се суспендират в 0.5 ml PBS заедно с усвоената деоксирибонуклеинова киселина в кювета за електропориране. След 10 минути върху лед, на клетките се пуска импулс от 200 волта и 960 pF и се оставят в лед още 10 минути. Клетките се разпределят в плочка с 96 гнезда с D’MEM F12 плюс 10% ембрионален телешки серум. След два или четири дни се прибавя селективна среда (D’MEM F12 с микофенолна киселина 0.45 pg/ml или хистидинол 10 тМ, съответно). Трансфектираните клони стават видими с просто око след 14 дни.
Присъствието на човешко антитяло в средата на гнездата, съдържащи пренесени клони, се измерва посредством ELISA. Гнездата на микротитърната плочка се покриват с кози античовешки капа леки вериги (за човешка капа верига, продуцираща клони) или античовешки IgG (специфична гама верига) (за пълно продуциране на клони от антитяло) антитела. След промиване с PBST (буфериран разтвор от салинфосфат, съдържащ 0.05% Tween 20), към всяко микротитърно гнездо в продължение на 1 час при 37°С се прибавя разредена културна среда от гнездата, съдържащи трансфекганти. Гнездата се промиват с PBS-Т и се прибавят пероксидаза от спрегната с хрян козя античовешка капа лека верига или свързан с алкална фосфатаза кози античовешки IgG (специфична гама верига), след което се инкубират в продължение на 1 час при 37°С. Гнездата се промиват с PBS-Т и се прибавя субстратен буфер, съдържащ, съответно, о-фенилендиамин или рнитрофенилфосфат. След половин час се измерва поглъщане, съответно, от 492 или 405 nm.
Пример 5. Получаване на различни версии на хуманизираното антитяло РЗ
Мишите VH1E10 е VK1E10 последователности (Фигури 6 и 7) се сравняват с човешки последователности. Фигури 8 и 9 показват най-хомоложните човешки последователности. Спираловидни амфипатични области или потенциални епитопи на Т клетки се търсят върху мишите последователности с 1Е10 променлива област и, съгласно метода, се провежда разумно заменяне на аминокиселини за разрушаване или хуманизиране на потенциалните епитопи на Т клетки до миши последователности.
Анализът на VH1E10 дава (Фигура 8) три амфипатични сегмента, като първият сегмент обхваща FR1, вторият сегмент обхваща FR2, а третият сегмент обхваща FR3. Беше решено да се заменят остатъци в позиции 5, 40, 42 и 87 (83, съгласно номерирането на Kabat) с остатъци в същата позиция в найхомоложната човешка последователност. Аминокиселините Gin, Arg и Glu бяха заменени, съответно, с Val, Ala, Gly и Arg.
Замените бяха извършени посредством PCR припокриване (Kammann et al. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) при използване на различен набор от прекурсори.
Прекурсорите за мутация в позиция 5 на тежката верига са 1, 2, 3 и 4, чиито последователности са следните:
Прекурсор 1:
5’ CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3’
Прекурсор 2:
5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3’
Прекурсор 3:
5’ AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3’
Прекурсор 4:
5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3’
След проверка на последователностите в позиция 5, се въвеждат мутации на позиции 40 и 42.
Прекурсор за мутации на позиции 40 и 42 на тежката верига:
Прекурсор 1:
5’ TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG 3’
Прекурсор 2:
5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3’
Прекурсор 3:
5’ CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA 3’
Прекурсор 4:
5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3’
След проверка на последователностите в позиции 40 и 42, се въвежда мутация на позиция 87 (83, съгласно номерирането на Kabat).
Прекурсор за мутации в позиция 87 (83, съгласно номерирането на Kabat) на тежката верига:
Прекурсор 1:
5’ CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3’
Прекурсор 2:
5’ GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3’
Прекурсор 3:
5’ AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3’
Прекурсор 4:
5’ GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT3’
Други замени не са правени поради това, че остатъците са въведени в тридименсионалната структура на мястото за свързване.
Местата на мутациите са потвърдени при създаване на последователностите. Получената конструкция е 1E10VHhu и тя се клонира в РАН4604 вектор на изразяване. Получената конструкция е 1E10VH-PAH4604.
Анализът на VK1E10 дава (фигура 9) три амфипатични сегмента, като първият сегмент обхваща FR1, вторият сегмент обхваща CDR1, а третият сегмент обхваща FR3. Беше рошено да се заменят остатъци в позиции 7, 8 и 15 с остатъци в същата позиция в най-хомоложната човешка последователност. Аминокиселините Thr, Thr и Leu бяха заменени, съответно, с Ser, Pro и Val. Замените бяха извършени посредством PCR припокриване (Kammann et al. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) при използване на прекурсори 1, 2, 3 и 4, чиито последователности са следните:
Прекурсори за мутация в позиции 7, 8 и 15 на леката верига:
Прекурсор 1:
5’CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTC 3’
Прекурсор 2:
5’AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3’
Прекурсор 3:
5’GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGTCATCTG 3’ Прекурсор 4:
5’GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3’
Местата на мутациите са потвърдени при създаване на последователностите. Получената конструкция е 1E10Vkhu и тя се клонира в PAG4622 вектор на изразяване. Получената конструкция е 1E10VKhu-PAG4622.
За проявление на хуманизираното антитяло 1Е10, NS-0 клетки се заразявате 1E10VHhu-PAH4604 и 1E10VKhu-PAG4622.
Антитялото 1E10hu се заразява по описания по-горе метод на електропорация и детекция за химерните антитела.
Пример 6. Биологична активност на химерен МАЬ 1Е10
Специфичното свързване към антиген се измерва посредством ELISA за определяне на биологичната активнот на химерен Mab 1Е10.
За рекомбинантното антитяло Mab 1Е10, микротитърните плочки се покриват с Mab РЗ. След промиване с PBST (буфериран разтвор на салинфосфат, съдържащ 0.05% Tween 20), неспецифичното свързване се блокира с волски sera албумин (BSA) 1% в PBST и се инкубира в продължение на 1 час при 37°С. Гнездата се промиват с PBST и се инкубират в продължение на 1 час при 37°С с пречистен рекомбинантен Mab 1Е10. Гнездата се промиват с PBST, прибавя се козе античовешко антитяло, свързано с алкална фосфатаза и се инкубира в продължение на 1 час при 37°С. Накрая, гнездата се промиват с PBST и се прибавя субстратен буфер, съдържащ рнитрофенилфосфат. След половин час се измерва поглъщане при 405 nm.
Химерен Mab С5 се използва за негативен контрол.
На Фигура 10 е показано специфичното свързване на химерен Mab 1Е10 към Mab РЗ.
Описание на приложените фигури
Фигура 1: VHP3 DNA и намалени аминокиселинни последователности. Последователностите са подредени съгласно номерирането на Kabat (Kabat et al. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health). C пунктирани линии са маркирани CDR.
Фигура 2: VKP3 DNA и намалени аминокиселинни последователности. Последователностите са подредени съгласно номерирането на Kabat (Kabat et al. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health). C пунктирани линии са маркирани CDR.
Фигура 3: VHP3 е подреден с най-хомоложната човешка последователност. Амфипатичните сегменти са подчертани, a CDR са почернени.
Фигура 4: VKP3 е подреден с най-хомоложната човешка последователност. Амфипатичните сегменти са подчертани, a CDR са почернени.
Фигура 5: Специфично свързване към GM3(NeuGc) посредством Mab РЗ. Рзлични концентрации на Mab РЗ и MAb Т1 (негативен контрол) са изпитвани посредством ELISA Микротитърните плочки са покрити с GM3(NeuGc) и GM3(NeuAc) (негативен контрол) ганглиозид в метанол и е измерено специфичното свързване.
Фигура 6: VH1E10 DNA и намалени аминокиселинни последователности. Последователностите са подредени съгласно номерирането на Kabat (Kabat et al. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National institute of Health). C пунктирани линии са маркирани CDR.
Фигура 7: VK1E10 DNA и намалени аминокиселинни последователности. Последователностите са подредени съгласно номерирането на Kabat (Kabat et al. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health). C пунктирани линии са маркирани CDR.
| Фигура 8: | VH1E10 е подреден с най-хомоложната човешка |
| последователност. | Амфипатичните сегменти са подчертани, a CDR са |
почернени.
| Фигура 9: | VK1E10 е подреден с най-хомоложната човешка |
| последователност. | Амфипатичните сегменти са подчертани, a CDR са |
почернени.
Фигура 10: Специфично свързване на миши МаЬ РЗ посредством химирин Mab 1Е10. Рзлични концентрации на Mab 1Е10 и МАЬ С5 (негативен контрол) са изпитвани посредством ELISA Микротитърните плочки са покрити с МаЬ РЗ и МаЬ АЗ (негативен контрол) и е измерено специфичното свързване.
Claims (16)
1. Химерно моноклонално антитяло, получено от моноклонално антитяло на мишка МаЬ РЗ, което разпознава ганглиозиди, съдържащи N-гликолирана сиалова киселина, и, което се продуцира от хибридомна клетъчна линия с входящ номер ЕСАСС 94113026, характеризиращо се с това, че хиперпроменливите области (CDR) на неговите тежки и леки вериги включват следните последователности:
ТЕЖКА ВЕРИГА
CDR1.RYSVH
0 CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS
CDR3: SGVREGRAQAWFAY
ЛЕКА ВЕРИГА
CDR1: KASQDVSTAVA
CDR2: SASYRYT
CDR3: QQHYSTPWT
2. Химерно моноклонално антитяло, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че рамковите области (FR) на неговите тежки и леки вериги включват следните последователности:
О ТЕЖКА ВЕРИГА
FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
FR2: VWRQPPGKGLEWLG
FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
FR4: WGQGTLV
ЛЕКА ВЕРИГА
FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
FR4: FGGGTKL
3. Моноклонално антитяло, съгласно претенции 1 и 2, характеризиращо се с това, че за неговото хуманизиране и съхраняване на свързващите му свойства към антигена, то включва поне едно от следващите замествания: ЛЕКА ВЕРИГА
Позиция 8: His заменен с Pro
Позиция 9: Lys заменен с Ser
Позиция 10: Phe заменен с Ser
Позиция 11: Met заменен с Leu
Позиция 13: Thr заменен с Ala
4. Моноклонално антитяло, съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращо се с това, че постоянната област на тежката верига включва аминокиселинна последователност от гама-1 верига и постоянната област на леката верига включва аминокиселинна последователност от капа верига, и двете получени от човешки имуноглобулини.
5. Клетъчна линия, характеризираща се с това, че продуцира някое от моноклоналните антитела, съгласно претенции от 1 до 4.
6. Фармацевтичен състав за лечение на злокачествени тумори на гърда и меланоми, техни метастази и възобновяване, характеризиращ се с това, че включва някое от моноклоналните антитела, съгласно претенции от 1 до 4.
7. Фармацевтичен състав за in wo локализиране и идентифициране на злокачествени тумори на гърда и меланоми, техни метастази и възобновяване, характеризиращ се с това, че включва някое от моноклоналните антитела, съгласно претенции от 1 до 4.
8. Приложение на моноклоналното антитяло, съгласно коя да е от претенции от 1 до 4, за производство на медикамент, ефикасен за лечение на злокачествени тумори на гърда и меланоми, техни метастази и възобновяване.
9. Химерно моноклонално антитяло, получено от антиидиотипно моноклонално антитяло на мишка 1Е10, което разпознава моноклоналното антитяло на мишка МАЬ РЗ, продуцирано от хибридомна клетъчна линия с входящ номер ЕСАСС 97112901, характеризиращо се с това, че хиперпроменливите домени на неговите тежки и леки вериги включват следните последователности:
ТЕЖКА ВЕРИГА
CDR1:SYDIN
CDR2: W1FPGDGSTKYNEKFKG
CDR3: EDYYDNSYYFDY
ЛЕКА ВЕРИГА
CDR1: RASQDISNYLN
CDR2: YTSRLHSG © CDR3: QQGNTLPWT
10. Моноклонално антитяло, съгласно претенция 9, характеризиращо се с това, че рамковите области (FR) на неговите тежки и леки вериги включват следните последователности:
ТЕЖКА ВЕРИГА
FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT
FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR
FR4: WGQGTTLTV © ЛЕКА ВЕРИГА
FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC
FR2: WYQQKPDGTVKLUY
FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC
FR4: FGGGTKLESK
11. Моноклонално антитяло, съгласно претенции 9 и 10, характеризиращо се с това, че за неговото хуманизиране и съхраняване на свързващите му свойства към антигена, то включва поне едно от следващите замествания:
ЛЕКА ВЕРИГА
Позиция 7: Thr заменен с Ser
Позиция 8: Thr заменен с Pro
Позиция 15: Leu заменен с Val
ТЕЖКА ВЕРИГА
Позиция 5: Gin заменен с Val
Позиция 40: Arg заменен с Ala
Позиция 42: Glu заменен с Gly
Позиция 87 (83, съгласно номерацията на Kabat): Thr заменен с Arg
12. Моноклонално антитяло, съгласно претенции от 9 до 11, характеризиращо се с това, че постоянната област на тежката верига включва аминокиселинна последователност от гама-1 верига и постоянната област на леката верига включва аминокиселинна последователност от капа верига, и двете получени от човешки имуноглобулини.
13. Клетъчна линия, характеризираща се с това, че продуцира някое от моноклоналните антитела, съгласно претенции от 9 до 12.
14. фармацевтичен състав за лечение на злокачествени тумори на гърда и меланоми, техни метастази и възобновяване, характеризиращ се с това, че включва някое от моноклоналните антитела, съгласно претенции от 9 до 12.
15. фармацевтичен състав за in vivo локализиране и идентифициране на злокачествени тумори на гърда и меланоми, техни метастази и възобновяване, характеризиращ се с това, че включва някое от моноклоналните антитела, съгласно претенции от 9 до 12.
16. Приложение на моноклоналното антитяло, съгласно коя да е от претенции от 9 до 12, за производство на медикамент, ефикасен за лечение на злокачествени тумори на гърда и меланоми, техни метастази и възобновяване.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2001008420010084A CU23007A1 (es) | 2001-04-06 | 2001-04-06 | Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos |
| PCT/CU2002/000003 WO2002081496A2 (es) | 2001-04-06 | 2002-04-08 | Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG108228A true BG108228A (bg) | 2005-04-30 |
| BG66304B1 BG66304B1 (bg) | 2013-03-29 |
Family
ID=40291118
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG108227A BG66293B1 (en) | 2001-04-06 | 2003-10-03 | Immunotherapeutic combinations for the treatment of tumours that overexpress gangliosides |
| BG108228A BG66304B1 (bg) | 2001-04-06 | 2003-10-03 | Рекомбинантни антитела, свързващи ганглиозид и тяхното използване при диагностициране и лечение на тумори |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG108227A BG66293B1 (en) | 2001-04-06 | 2003-10-03 | Immunotherapeutic combinations for the treatment of tumours that overexpress gangliosides |
Country Status (37)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20050069535A1 (bg) |
| EP (3) | EP1384726B1 (bg) |
| JP (2) | JP4366080B2 (bg) |
| KR (3) | KR100863509B1 (bg) |
| CN (3) | CN101054417B (bg) |
| AR (2) | AR033123A1 (bg) |
| AT (3) | ATE477279T1 (bg) |
| AU (3) | AU2002308348B2 (bg) |
| BG (2) | BG66293B1 (bg) |
| BR (3) | BR0208676B1 (bg) |
| CA (2) | CA2443372C (bg) |
| CU (1) | CU23007A1 (bg) |
| CZ (2) | CZ296276B6 (bg) |
| DE (2) | DE60223547T2 (bg) |
| DK (2) | DK1384726T3 (bg) |
| EA (2) | EA006936B1 (bg) |
| EC (2) | ECSP034788A (bg) |
| ES (2) | ES2296986T3 (bg) |
| HK (3) | HK1066818A1 (bg) |
| HR (2) | HRP20030806B1 (bg) |
| HU (2) | HU228106B1 (bg) |
| IL (2) | IL158246A0 (bg) |
| IS (2) | IS6965A (bg) |
| MX (2) | MXPA03008739A (bg) |
| MY (3) | MY145703A (bg) |
| NO (2) | NO20034437L (bg) |
| NZ (2) | NZ528598A (bg) |
| PE (1) | PE20020972A1 (bg) |
| PL (2) | PL208109B1 (bg) |
| PT (2) | PT1384726E (bg) |
| SG (1) | SG161737A1 (bg) |
| SI (2) | SI1411064T1 (bg) |
| SK (2) | SK287783B6 (bg) |
| UA (3) | UA75393C2 (bg) |
| UY (2) | UY27242A1 (bg) |
| WO (2) | WO2002081496A2 (bg) |
| ZA (2) | ZA200307585B (bg) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7297336B2 (en) * | 2003-09-12 | 2007-11-20 | Baxter International Inc. | Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity |
| CN101111260B (zh) * | 2005-02-04 | 2013-03-20 | 萨瓦克公司 | 存活蛋白肽疫苗 |
| FI20055398A0 (fi) | 2005-07-08 | 2005-07-08 | Suomen Punainen Risti Veripalv | Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi |
| EP2594591B1 (en) * | 2005-08-11 | 2018-06-06 | Arpi Matossian-Rogers | Tcr-v-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease |
| JP5415071B2 (ja) * | 2005-08-19 | 2014-02-12 | ワイス・エルエルシー | Ｇｄｆ−８に対するアンタゴニスト抗体ならびにａｌｓおよびその他のｇｄｆ−８関連障害の処置における使用 |
| ITFI20060163A1 (it) * | 2006-06-29 | 2006-09-28 | Menarini Internat Operations Luxembourg Sa | Composizione farmaceutica contenente un anticorpo monoclonale anti idiotipico anti-ca-125 ed alluminio |
| TWI434855B (zh) | 2006-11-21 | 2014-04-21 | Hoffmann La Roche | 結合物及其在免疫分析中作為參考標準之用途 |
| WO2009104649A1 (ja) * | 2008-02-22 | 2009-08-27 | 片山化学工業株式会社 | 合成糖脂質含有リポソーム |
| EP2166085A1 (en) | 2008-07-16 | 2010-03-24 | Suomen Punainen Risti Veripalvelu | Divalent modified cells |
| TWI516501B (zh) | 2008-09-12 | 2016-01-11 | 禮納特神經系統科學公司 | Ｐｃｓｋ９拮抗劑類 |
| NZ594985A (en) * | 2009-03-10 | 2013-07-26 | Biogen Idec Inc | Anti-bcma (b-cell maturation antigen, cd269, tnfrsf17) antibodies |
| SG174992A1 (en) | 2009-04-01 | 2011-11-28 | Genentech Inc | Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use |
| CU23736A1 (es) * | 2009-05-04 | 2011-11-15 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpos que reconocen sulfatidos y proteoglicanos sulfatados y su uso |
| WO2011026242A1 (en) * | 2009-09-03 | 2011-03-10 | Vancouver Biotech Ltd. | Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor |
| WO2012096994A2 (en) * | 2011-01-10 | 2012-07-19 | Emory University | Antibodies directed against influenza |
| CU24070B1 (es) * | 2011-12-27 | 2015-01-29 | Ct De Inmunología Molecular | Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores que expresan regf y gangliósidos n-glicolilados gm3 (neugcgm3) |
| EP2641916A1 (en) * | 2012-03-23 | 2013-09-25 | Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) | Novel antibodies anti-sPLA2-IIA and uses thereof |
| MY177331A (en) | 2012-06-15 | 2020-09-12 | Pfizer | Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor |
| AR096687A1 (es) | 2013-06-24 | 2016-01-27 | Genentech Inc | Anticuerpos anti-fcrh5 |
| UA120753C2 (uk) | 2013-12-17 | 2020-02-10 | Дженентек, Інк. | Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20 |
| JP2017512759A (ja) * | 2014-04-10 | 2017-05-25 | オービーアイ ファーマ インコーポレイテッド | 抗体、前記抗体を産生するハイブリドーマ、前記抗体を含む薬学的組成物及びその用途 |
| TWI715587B (zh) | 2015-05-28 | 2021-01-11 | 美商安可美德藥物股份有限公司 | Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途 |
| CA2986928A1 (en) | 2015-06-16 | 2016-12-22 | Genentech, Inc. | Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use |
| WO2018017864A2 (en) * | 2016-07-20 | 2018-01-25 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Pvrig-binding agents and uses thereof |
| CA3044664C (en) | 2016-11-30 | 2022-11-22 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treatment of cancer comprising tigit-binding agents |
| CU20170173A7 (es) * | 2017-12-27 | 2019-11-04 | Ct Inmunologia Molecular | Nano-partículas que contienen el gangliósido gm3 como inmunomoduladoras |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2754206B2 (ja) * | 1987-11-17 | 1998-05-20 | メクト株式会社 | α２→３結合を認識するモノクローナル抗体 |
| US6051225A (en) * | 1988-10-19 | 2000-04-18 | The Dow Chemical Company | Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment |
| EP0586002B1 (en) * | 1992-08-18 | 2000-01-19 | CENTRO de IMMUNOLOGIA MOLECULAR | Monoclonal antibodies recognizing the epidermal growth factor receptor, cells and methods for their production and compositions containing them |
| JPH07101999A (ja) * | 1993-10-06 | 1995-04-18 | Hagiwara Yoshihide | 抗癌ヒトモノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列 |
| US6063379A (en) * | 1993-12-09 | 2000-05-16 | Centro De Inmunologia Molecular | Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies |
| CU22702A1 (es) * | 1997-10-21 | 2001-07-31 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpos monoclonales anti - idiotipo, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, hibridoma que los produce y composiciones que los contienen |
| EP0657471B1 (en) * | 1993-12-09 | 2001-10-24 | Centro de Inmunologia Molecular | Anti ganglioside monoclonal antibodies and their use in the specific active immunotherapy of malignant tumours |
| CU22420A1 (es) * | 1993-12-29 | 1996-01-31 | Centro Inmunologia Molecular | Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer |
| US6149921A (en) * | 1993-12-29 | 2000-11-21 | Centro De Inmunologia Molecular | Vaccine compositions for eliciting an immune response against N-acetylated gangliosides and their use for cancer treatment |
| CU22615A1 (es) * | 1994-06-30 | 2000-02-10 | Centro Inmunologia Molecular | Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos |
| CU22731A1 (es) * | 1998-02-05 | 2002-02-28 | Centro Inmunologia Molecular | Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen |
| US7442776B2 (en) * | 1999-10-08 | 2008-10-28 | Young David S F | Cancerous disease modifying antibodies |
-
2001
- 2001-04-06 CU CU2001008420010084A patent/CU23007A1/es unknown
-
2002
- 2002-04-05 MY MYPI20081190A patent/MY145703A/en unknown
- 2002-04-05 UY UY27242A patent/UY27242A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-05 MY MYPI20021239A patent/MY157372A/en unknown
- 2002-04-05 AR ARP020101264A patent/AR033123A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-05 AR ARP020101263A patent/AR033122A1/es unknown
- 2002-04-05 UY UY27243A patent/UY27243A1/es unknown
- 2002-04-05 MY MYPI20021228A patent/MY137078A/en unknown
- 2002-04-08 HU HU0401355A patent/HU228106B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 MX MXPA03008739A patent/MXPA03008739A/es active IP Right Grant
- 2002-04-08 JP JP2002580025A patent/JP4366080B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 BR BRPI0208676A patent/BR0208676B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 ES ES02759752T patent/ES2296986T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 SK SK1216-2003A patent/SK287783B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 AT AT06076643T patent/ATE477279T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 PL PL371937A patent/PL208109B1/pl unknown
- 2002-04-08 KR KR1020037012938A patent/KR100863509B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 PT PT02759751T patent/PT1384726E/pt unknown
- 2002-04-08 NZ NZ528598A patent/NZ528598A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 SG SG200506530-5A patent/SG161737A1/en unknown
- 2002-04-08 HU HU0401695A patent/HU228105B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 PL PL02371770A patent/PL371770A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2002-04-08 CA CA2443372A patent/CA2443372C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 SI SI200230660T patent/SI1411064T1/sl unknown
- 2002-04-08 CZ CZ20032641A patent/CZ296276B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 CZ CZ2003-2668A patent/CZ304424B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 EP EP02759751A patent/EP1384726B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 JP JP2002579482A patent/JP2004528033A/ja active Pending
- 2002-04-08 AU AU2002308348A patent/AU2002308348B2/en not_active Ceased
- 2002-04-08 DK DK02759751T patent/DK1384726T3/da active
- 2002-04-08 US US10/473,978 patent/US20050069535A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-08 DE DE60223547T patent/DE60223547T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 KR KR1020037012969A patent/KR100946168B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 EP EP06076643A patent/EP1798243B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 AT AT02759751T patent/ATE406386T1/de active
- 2002-04-08 WO PCT/CU2002/000003 patent/WO2002081496A2/es active Application Filing
- 2002-04-08 DK DK02759752T patent/DK1411064T3/da active
- 2002-04-08 CN CN2007101021039A patent/CN101054417B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 DE DE60228561T patent/DE60228561D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 IL IL15824602A patent/IL158246A0/xx unknown
- 2002-04-08 AT AT02759752T patent/ATE378356T1/de active
- 2002-04-08 WO PCT/CU2002/000002 patent/WO2002081661A2/es active IP Right Grant
- 2002-04-08 PE PE2002000283A patent/PE20020972A1/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-08 ES ES02759751T patent/ES2312610T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 EP EP02759752A patent/EP1411064B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-04-08 CA CA2441845A patent/CA2441845C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 PT PT02759752T patent/PT1411064E/pt unknown
- 2002-04-08 SI SI200230766T patent/SI1384726T1/sl unknown
- 2002-04-08 BR BR0208675-1A patent/BR0208675A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 US US10/473,977 patent/US20040253233A1/en not_active Abandoned
- 2002-04-08 NZ NZ528599A patent/NZ528599A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 CN CNB028086309A patent/CN100349920C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 CN CNB028084330A patent/CN1319991C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-04-08 EA EA200301097A patent/EA006936B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 MX MXPA03008738A patent/MXPA03008738A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-04-08 EA EA200301098A patent/EA006310B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 AU AU2002308347A patent/AU2002308347B2/en not_active Ceased
- 2002-04-08 SK SK1226-2003A patent/SK287914B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-04-08 BR BRPI0208675-1A patent/BRPI0208675B1/pt unknown
- 2002-08-04 UA UA2003108989A patent/UA75393C2/uk unknown
- 2002-08-04 UA UA2003108988A patent/UA76745C2/uk unknown
-
2003
- 2003-09-23 IS IS6965A patent/IS6965A/is unknown
- 2003-09-23 IS IS6964A patent/IS2701B/is unknown
- 2003-09-29 ZA ZA200307585A patent/ZA200307585B/en unknown
- 2003-09-30 EC EC2003004788A patent/ECSP034788A/es unknown
- 2003-09-30 EC EC2003004787A patent/ECSP034787A/es unknown
- 2003-10-01 ZA ZA2003/07679A patent/ZA200307679B/en unknown
- 2003-10-02 IL IL158246A patent/IL158246A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-10-03 NO NO20034437A patent/NO20034437L/no not_active Application Discontinuation
- 2003-10-03 BG BG108227A patent/BG66293B1/en unknown
- 2003-10-03 NO NO20034436A patent/NO331533B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-10-03 BG BG108228A patent/BG66304B1/bg unknown
- 2003-10-06 HR HR20030806A patent/HRP20030806B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2003-10-06 HR HR20030805A patent/HRP20030805B1/xx not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-14 HK HK04109894A patent/HK1066818A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-01 HK HK05102752A patent/HK1070080A1/xx not_active IP Right Cessation
- 2005-12-20 UA UAA200512270A patent/UA86768C2/ru unknown
-
2007
- 2007-10-26 AU AU2007231687A patent/AU2007231687B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-12-31 HK HK07114311.6A patent/HK1109160A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-08-07 KR KR1020087019420A patent/KR100919617B1/ko not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-03-19 US US12/407,046 patent/US8758753B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2007231687B2 (en) | Ganglioside-associated recombinant antibodies and the use thereof in the diagnosis and treatment of tumors | |
| US20230110249A1 (en) | Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis | |
| EP1623997B1 (en) | Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside n-glycolyl-gm3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumours | |
| Richman et al. | Monoclonal antibodies to human colorectal epithelium: markers for differentiation and tumour characterization | |
| US20060073144A1 (en) | Individualized anti-cancer antibodies | |
| JP3565351B2 (ja) | 免疫応答を惹起するための、多数エピトープ含有抗原の再構成法および組成物 | |
| JP2002518347A (ja) | 前立腺癌治療のための免疫療法組成物および方法 | |
| CN114341182A (zh) | Dll3靶向抗体及其用途 | |
| EP3693063A1 (en) | Methods and compositions for treating cancer |