CN101111260B - 存活蛋白肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及治疗性疫苗，其包含一种或多种存活蛋白多肽片段。该疫苗可用于诸如癌症性疾病的预防性、改善性和/或治愈性治疗。本发明进一步涉及组合治疗的方法。

Description

存活蛋白肽疫苗
本专利申请中引用的所有专利和非专利参考文献的全文都纳入本文参考。
发明领域
本发明涉及治疗性疫苗，其包含一种或多种存活蛋白多肽片段。疫苗可用于诸如癌症性疾病的预防性、改善性和/或治疗性治疗。本发明进一步涉及组合治疗的方法。
发明背景
哺乳动物免疫系统识别并与外来或异源材料反应。该系统的一个重要方面是T细胞应答。该应答需要T细胞识别并与细胞表面分子的复合物(被称为构成人主要组织相容性复合物(MHC)的人白细胞抗原(HLA))和肽相互作用。该肽源自较大的分子，其由细胞加工，所述细胞也提呈HLA/MHC分子。T细胞和HLA/肽复合物的相互作用是受限制的，其需要T细胞特异针对HLA分子和肽的特定组合。如果不存在特异性T细胞，则即使存在其配偶复合物也没有T细胞应答。相似地，如果特异性复合物不存在而T细胞存在，则也没有应答。
已经很成熟的有，源自人肿瘤相关抗原(TAA)的肽表位可通过MHC分子而被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别，而且大多数(如果不是全部的话)肿瘤表达该抗原。因此，在例如免疫接种和过继T细胞治疗的策略中，激动人心的临床努力将靶向于这些TAA，以在患者中产生有效的抗肿瘤CTL应答。
可是抗原丧失性变体的免疫选择对于大多数已知CTL表位在临床肿瘤学中的治疗潜力来说是严重的障碍，而且在靶向于不参与癌生长的抗原时，抗原缺陷性突变肿瘤的选择是治疗策略中公认的局限性。原因是大多数被表征的肽源自对于肿瘤细胞的存活并不必要的多肽，所述多肽。因此，如果通过治疗性手段(如免疫接种)诱导出针对这些肽抗原的强有力的CTL应答，则缺少靶抗原表达的肿瘤细胞非常可能逃避所产生的免疫应答。
需要癌症性疾病的更有效的治疗性疫苗和改良的治疗方法。
癌症中也已经暗示存在有通过T细胞识别细胞异常的机制。在WO92/20356中，公开了基因家族，所述基因家族能被加工成肽，所述肽随之在细胞表面上表达，并且使得肿瘤细胞通过特异性CTL裂解。这些基因被称为MAGE家族，而且其据说编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，而且源自其的肽被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。
可是，尽管通常认可大多数(如果不是全部的话)肿瘤具有抗原性，但是仅有一些真正有免疫原性，即免疫系统能容易地控制肿瘤进程。
为了克服这缺陷，开始了几个免疫治疗试验，其用TAA衍生的肽来免疫接种。对于黑素瘤(已经表征出具有最大数量的CTL所确定的TAA的肿瘤)，免疫接种诱导出了强有力的针对抗原的CTL应答，而且一些患者的疾病完全消退了。可是，用在这些免疫接种试验中的大多数肽表位具有黑素细胞特异性，并且这些肽不能应用于非黑素细胞来源的肿瘤。此外，这些TAA在不同患者的肿瘤中异源表达，甚至在同一个患者得到的肿瘤转移中能有所不同。可是，在近几年，已经鉴定出许多肿瘤特异性肽抗原，其在许多不同的癌中表达，即HER-2、Muc-1和端粒酶。
也有显示，通过适当处理，出现在肿瘤中的肿瘤抗原可暴露于免疫系统。研究表明，免疫应答的CD8+CTL分支，单独或与CD4+Th细胞联合构成了适应性免疫应答的初级抗肿瘤效应器分支。直到现在，关注点主要在于免疫应答的CTL分支上。可是，变得更清晰的是，CD4T细胞应答在肿瘤排斥中起必要作用，尤其在体内诱导期或CTL应答的扩展中。因此，将1类限制性肿瘤抗原组合进有效的肿瘤免疫接种规程中可能增加疫苗的有效性。
凋亡是细胞自杀的遗传程序，而凋亡抑制被暗示是涉及癌形成的重要机制，其通过延长细胞寿命、有利于转化突变的积累而进行。存活蛋白(survivin)是近来鉴定出的凋亡蛋白质抑制剂(IAP)家族的成员。在约4百万个转录子的综合性基因表达分析中，存活蛋白被鉴定为头等基因之一，其在许多种癌症中始终被上调，而在正常组织中没有被上调。过量表达存活蛋白的实体恶性肿瘤包括肺、结肠、乳腺、胰腺、和前列腺癌以及恶性造血组织肿瘤。另外有报道，一系列黑素瘤和非黑素瘤皮肤癌总是呈存活蛋白阳性的。在大多数人癌症中过量表达存活蛋白，暗示了肿瘤进程中凋亡抑制所起的一般性作用，这一观点得到下列观察结果的证实，即：对于结直肠和膀胱癌、以及成神经细胞瘤，存活蛋白的表达与不利的预后结果相关联。存活蛋白作为另一种凋亡抑制剂在肿瘤血管发生期间在内皮细胞中表达，而且在血管发生期间反义靶向存活蛋白造成了内皮细胞凋亡，该细胞凋亡在体外能促进毛细管样脉管迅速萎缩。相反地，在正常成人组织中不能检测到存活蛋白。由于存活蛋白在大多数人癌症中过量表达而且抑制其功能能导致增加凋亡，因此该蛋白质可能是治疗性CTL应答的靶位。存活蛋白蛋白及其潜在的诊断和治疗应用在US6,245,523中有披露，其纳入本文参考。存活蛋白是16.5kDa细胞质蛋白质，其包含替换RING指结构的单BIR和多电荷的羧基末端卷曲区域，当转移入B细胞前体时，其抑制生长因子(IL-3)撤退所诱导的凋亡。编码存活蛋白的基因几乎与效应器细胞蛋白酶受体-1(EPR-1)的序列一致，但指向相反的方向，因而这暗示了存在2个分离的基因以头对头的构型重复。因此，存活蛋白可被描述为反义EPR-1产物。由于2个基因的方向相反，因此蛋白质的编码氨基酸序列是不同的。
在功能上，通过上调其天然反义EPR-1转录子来抑制存活蛋白表达会造成大量凋亡并降低细胞生长。
US6,245,523公开了分离纯化的存活蛋白，而且它提供了编码存活蛋白蛋白的核酸分子、和结合存活蛋白的抗体和其他分子。US6,245,523还公开了存活蛋白蛋白的抗凋亡活性片段及其变体，其中有氨基酸残基插在所公开的存活蛋白序列的N-或C-末端、或其内部。明确公开的是，该肽应包含凋亡所需的关键功能性残基，即第67位的Trp、第73位的Pro和第84位的Cys。
以前已经公开了，如ELISPOT试验所测的，可利用负载有存活蛋白肽的树突细胞进行免疫接种来产生弱特异性T细胞应答(WO2004/067023和Otto，K.等，J.Vaccine(2004))。应答为每104个细胞小于30，接下去的临床结果评估显示疾病进展。所以该疫苗仅有非常有限的用途。因此有极大重要性的是，要开发出能诱导出非常强的特异性T细胞应答、尤其是能诱导出疾病进程被抑制的临床响应的疫苗。
发明简述
本发明基于以下发现，即源自存活蛋白蛋白的MHC I类限制性肽能结合MHC I类HLA分子，并由此离体和在原位都能在患有范围广的癌症的患者中引发CTL免疫应答。用于治疗前，必须与临床结果相组合分析免疫应答，以评估疫苗组合物治疗癌症的有效性。免疫后的特异性T细胞应答可以是针对用于疫苗中的潜在抗原的有用测试，优选疫苗组合物能引发出非常强的T细胞应答，如每104个PBMC有超过50个释放INF-γ的细胞，因为这可以增加用于治疗癌症的疫苗组合物的成功率。本发明公开了特别有效的疫苗组合物，其能诱导出部分或完全的肿瘤消退。显然这些发现打开了新的治疗手段的通路，由于存活蛋白显示出在肿瘤细胞中普遍表达，所述治疗手段通常可用于控制癌症性疾病。
本文所述的疫苗组合物或免疫原性组合物能作为药物组合物，因为该肽能产生能抗瘤形成的CTL应答。所以，所属疫苗组合物能作为治疗性疫苗或治疗或药物组合物。
在一个方面，本发明涉及用作药物的疫苗组合物，其包含一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体(其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ IDNO：23的连续氨基酸序列至少85％同一)和配制用于油包水乳剂的佐剂(其包含矿物油和表面活性剂，其中所述佐剂含至多14.5体积百分比的所述表面活性剂)。
本发明的一个方面涉及至多有50个氨基酸残基的存活蛋白肽变体，其能结合HLA-B7，其包含选自下组的肽：APPAWQPFL(SEQ ID NO：13)和RPPAWQPFL(SEQ ID NO：14)。
其他方面涉及疫苗组合物，其包含一种或多种存活蛋白肽或肽变体，其中所述肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，而且其中组合物包含：
i.HLA-B7结合肽和/或
HLA-A1和HLA-A2限制性肽和/或
HLA-A1和HLA-B35限制性肽
ii.和佐剂。
一个方面涉及疫苗组合物，其包含三种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，而且其中，
i.至少一种肽或肽变体选自HLA-A1结合肽的组，而且其中
ii.至少一种肽或肽变体选自HLA-A2结合肽的组，而且其中，
iii.至少一种肽或肽变体选自HLA-B35结合肽的组，
和佐剂。
本发明的另一方面涉及疫苗组合物，其包含七种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中所述肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，
i.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A1结合肽的组，
ii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A2结合肽的组，
iii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A3结合肽的组
iv.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A24结合肽的组
v.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A11结合肽的组
vi.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-B35结合肽的组
vii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-B7结合肽的组和佐剂。
实体肿瘤的发展依赖于血管形成。因此抑制血管发生可预防实体瘤的发展。肿瘤血管发生期间，在内皮细胞中表达存活蛋白、bcl-2和Mcl-1，这暗示了利用本文所述的肽进行免疫接种可具有抗血管形成的效应。
本发明的一个方面涉及用作药物的疫苗，其包含一种或多种存活蛋白肽或肽变体(其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一)和佐剂，其能在受试者肿瘤基质中诱导出抗原特异性T细胞的浸润。
在另一方面，本发明涉及疫苗组合物，其包含：
i.核酸，其编码：
a)存活蛋白多肽(SEQ ID NO：23)，
b)存活蛋白肽或
c)存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，和
ii.佐剂。
本发明的一个方面涉及包含一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体和佐剂的疫苗组合物在制备药物中的用途，所述疫苗组合物能在受试者中诱导出非常强的特异性细胞毒性T-细胞应答。这是有重大意义的，因为非常强的特异性T-细胞应答可与较高的良好临床响应率相关。在这点上，非常强的特异性T细胞应答等于当在施用疫苗组合物之前和之后通过ELISPOT试验测量时，每104个PBMC细胞有超过50个肽特异性点的应答，
本发明的一个方面涉及包含组件的试剂盒(kit in parts)，其包括；
i.疫苗组合物，其包含；
a)一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，
b)和佐剂，
和
ii.第二药物。
本发明的一个方面描述了在受试者中刺激抗存活蛋白的强特异性T细胞应答，所述方法包含：
a)提供根据本发明所述的疫苗组合物，
b)向受试者施用所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物可施用超过一次；和
c)由此在受试者中刺激强特异性T细胞应答，其中所述强特异性T细胞应答是在施用疫苗组合物之前和之后通过ELISPOT试验所测得的每104个PBMC细胞有超过50个肽特异性点，
d)在受试者中获得强特异性T细胞应答
本发明的另一方面涉及治疗或预防疾病的方法，其包括；
a)提供根据本发明所述的疫苗组合物，
b)向受试者施用所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物可施用超过一次。
在又一方面，本发明涉及治疗或预防疾病的方法，其包括；
a)提供根据本发明所述的疫苗组合物，
b)向受试者施用所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物可施用超过一次。
c)由此在受试者中刺激强特异性T细胞应答，其中所述强特异性T细胞应答是在施用疫苗组合物之前和之后通过ELISPOT试验所测得的每104个PBMC细胞有超过50个肽特异性点，
d)在受试者中获得临床响应。
在某些方面，本发明涉及在受试者肿瘤基质中诱导抗原特异性T-细胞浸润或在受试者中抑制血管发生的方法，其包括；
a)提供根据本发明所述的疫苗，
b)向受试者施用所述疫苗组合物，
c)在肿瘤基质中达到抗原特异性T-细胞浸润或抑制血管发生。
组合治疗方法，其包括同时、顺序或以任意次序分开施用：
a)根据本发明所述的疫苗组合物和，
b)第二药物。
定义：
AA：参见“氨基酸”。
佐剂：疫苗佐剂是增强针对抗原的特异性免疫应答的成分。
氨基酸：实体，其包含由中央部分分隔的氨基末端部分(NH2)和羧基末端部分(COOH)，所述中央部分包含碳原子、或碳原子链，所述碳原子链包含至少一条侧链或一个功能团。NH2指出现在氨基酸或肽的氨基末端的氨基，而COOH指出现在氨基酸或肽的羧基末端的羧基。通用术语氨基酸包括天然和非天然氨基酸。列于J.Biol.Chem.，243：3552-59(1969)中并为37C.F.R.第1.822(b)(2)节所采纳的标准命名的天然氨基酸属于本文下表1所列的氨基酸组中。非天然氨基酸是未列于表1中的那些。非天然氨基酸的例子是列于诸如37C.F.R.第1.822(b)(4)节中的那些，其全部纳入本文参考。本文所述的氨基酸残基可以是“D”或“L”异构型的。
Figure S06803736820070803D000071
Figure S06803736820070803D000081
表1.天然氨基酸和它们各自的代码。
氨基酸残基：术语“氨基酸残基”指的是涵盖了与至少另一种类起反应，如与2种、例如与3种、如与超过3种另外的种类起反应的氨基酸，无论是标准氨基酸、非标准氨基酸或假氨基酸。尤其，氨基酸残基可包括代替游离羧基的酰键，和/或代替游离胺基的胺键和/或酰胺键。而且，反应过的氨基酸残基可包括代替酰胺键的酯或硫酯键。
抗体：是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。例如，抗体是完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫活性的片段。
抗原：抗体所识别的分子。通常是肽、多肽或多聚多肽。抗原优选能引发出免疫应答。
A.P.I.重力：石油工业所用的术语，其表示根据API(美国石油研究所)所确定的值而得到的石油液体的相对密度。通过带有标尺的液体比重仪可测量API重力，所述标尺以API度数加以量度。
CTL：细胞毒性T淋巴细胞。表达CD8、并带有T细胞受体的T细胞亚群，所以其能应答由I类分子提呈的抗原。
乳剂：第一种液体的小球在第二种液体中形成的悬浮液，其中第二种液体与第一种液体不混合。
乳化剂：促进乳剂形成的表面活性剂。
HLA：人白细胞抗原，也称为MHC。人能合成三种不同的MHC I类分子——HLA-A、HLA-B和HLA-C。人MHC II类分子被称为HLA-D。
免疫球蛋白：血清抗体，其包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD
分离的：被用于描述本文公开的各种促分泌素、多肽和核苷酸中的任一种，其从其天然环境的成分中被鉴定和分离出来和/或回收。其天然环境中的污染成分是通常干扰多肽诊断或治疗应用的材料，而且其可包括酶、激素、和其它蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的具体实施方式中，多肽将是纯化的。
配体：分子(例如肽)，其能特异结合一种或多种相关受体。例如，抗原是其相关抗体的配体。
MHC：主要组织相容性复合物，也称为HLA。存在两个主要的MHC亚类，I类和II类。
矿物油：源自矿物来源的油(如石油)，其与源自植物和动物的油不同。可变组成的烃混合物。
Montanide ISA(Montanide Incomplete Seppic Adjuvant)：配制用于油包水乳剂的油性佐剂。Montanide ISA佐剂是基于油/表面活性剂的佐剂的组，其中不可代谢的和/或可代谢的油与表面活性剂组合在一起(可得自Seppic，比利时)。
PBMC：外周血单核细胞。
PBL：外周血白细胞。
肽：限定序列并由酰胺键相连的多个共价相连的氨基酸残基。该术语与寡肽和多肽类似使用。天然和/或非天然氨基酸可由肽键或非肽键连接。术语肽也包括化学或酶催化反应导入的翻译后修饰，这是现有已知的。表面张力：表面张力是增加表面积所需的能量。液体分子间的粘着力造成了表面张力，而且液体表面分子强烈地相互粘着。表面活性剂：表面活性试剂，其能减少其所溶解于其中的液体的表面张力。表面活性剂是含亲水的极性基团和疏水的非极性基团的化合物，并通常包含脂肪链。
TAA：肿瘤相关抗原
发明详述
本发明考察了疫苗组合物，其包含下文所述的存活蛋白肽和存活蛋白肽变体。
疫苗组合物
根据本发明所述的疫苗组合物能根据已知方法配制，如通过混合一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体和活性试剂进行，优选其适于向人施用。该赋形剂、载体和配制方法的例子可在诸如Remington′s PharmaceuticalSciences(Maack Publishing Co，Easton，PA)中找到。为了配制适于有效施用的药学上可接受的组合物，根据本发明，该组合物将包含有效量的本文所述的存活蛋白多肽、存活蛋白肽或存活蛋白肽变体。
根据本发明所述的疫苗组合物可以治疗有效量向个体施用。根据各种因素，如个体病况、体重、性别和年龄，有效量可发生变化。其它因素包括施用模式。
在下文中，疫苗组合物指涵盖了用于治疗用途的组合物，包括施用所述组合物能刺激患者免疫应答，如能刺激强特异性细胞毒性T细胞应答，尤其涵盖了能针对靶损伤而诱导出临床响应的疫苗组合物。进一步预期的是，本发明的疫苗组合物不诱导任何全身性或局部毒性反应或任何其它副作用。
为了获得疫苗或免疫原性组合物，可能需要将本文所述的相对小的存活蛋白肽和存活蛋白肽变体分子和各种材料(如佐剂、免疫刺激成分和/或载体)组合在一起。疫苗组合物中包括佐剂以增强特异免疫应答。因此，尤其重要的是鉴定出佐剂，其在与一种或多种抗原组合时得到能诱导出强特异性细胞毒性T细胞应答、而最重要的是针对靶损伤的临床响应的疫苗组合物。
佐剂
已有大量佐剂被描述并被用于在实验室动物(如小鼠、大鼠和兔)中产生抗体。在此背景下，对副作用的容许度可以更高些，因为其主要目的是获得强抗体应答。
为了用于药物和为了能批准用于药物，尤其是为了用于人，需要良好表征出疫苗组合物的成分，包括佐剂。进一步需要组合物具有任何不利反应，如肉芽肿、脓肿或发烧的最小风险。
在优选的具体实施方式中，疫苗组合物适于向人受试者施用，因此优选的佐剂适于向人受试者施用。
挑选佐剂可进一步根据其刺激所需的免疫应答、B细胞和/或T细胞活化的类型而选择，而且可配制成疫苗组合物以优化分配和向相关淋巴组织的提呈。
近来，包括为合适的抗原提呈细胞负载抗原肽在内的方法被认为是产生针对癌症性疾病的免疫应答的高效方式。该方法包括从患者中分离出APC(PBL)或APC前体细胞并使这些负载抗原肽，可选地可用树突细胞并在体外分化成APC并在注射入患者前负载抗原肽。该方法非常复杂并耗时。使用细胞培养物使其成为非常不灵活的疫苗组合物，其需要特别的制备和储存设备。本发明的目的在于鉴定出容易制备和/或储存的疫苗组合物。
用于治疗性疫苗中的佐剂可以是矿物盐(如氢氧化铝和磷酸铝或磷酸钙胶体)、基于油乳剂和表面活性剂的配方(如MF59(微流体化的去污剂稳定化的水包油乳剂)、QS21(纯化的皂角苷)、AS02(SBAS2、水包油乳剂+单磷酰脂A(MPL)+QS21)、Montanide ISA51和ISA-720(稳定化的油包水乳剂)、佐剂65(含花生油、二缩甘露醇单油酸酯和单硬脂酸铝)(RIBIImmunoChem Research Inc.，Hamilton，Utah))、特定佐剂(如病毒颗粒(掺入流感血凝素的单薄层脂质体载体)、AS04(带有MPL的铝盐)、ISCOMS(皂角苷和脂(如胆固醇)的结构化复合物、聚乙酸乙交酯(polyactideco-glycolide)(PLG))、(天然和合成的)微生物衍生物(如单磷酰脂A(MPL)、Detox(MPL+M.Phlei细胞壁骨架)、AGP(RC-529(合成的乙酰化单糖))、DC_chol(能自组装成脂质体的类脂免疫刺激剂)、OM-174(脂A衍生物)、CpG基序(合成的寡核苷酸，其含免疫刺激性CpG基序)、修饰的细菌毒素、LT和CT(其带有无毒性的佐剂效应)、内源性人免疫调节剂(例如，hGM-CSF或hIL-12或Immudaptin(C3d串联阵列))、惰性载体(如金颗粒)。
QS-21和Montanide ISA-51佐剂可以以无菌、一次性使用的瓶的形式提供。
在一个具体实施方式中，疫苗组合物包含下文所述的佐剂和存活蛋白肽或存活蛋白肽变体。在优选的具体实施方式中，佐剂可以是MontanideIncomplete Seppic Adjuvant(ISA)(Seppic，比利时)，其包括MontanideISA-51、Montanide ISA50、Montanide ISA70、Montanide ISA206、MontanideISA708、Montanide ISA-720、Montanide ISA763A、Montanide ISA207、Montanide ISA264、Montanide ISA27、Montanide ISA35、Montanide ISA740、Montanide ISA773、Montanide ISA266、Montanide ISA267、Montanide ISA28、Montanide ISA51F、Montanide ISA016D和Montanide IMS。最后提到的三种还没有被批准用在人，但是其潜在地可用于根据本发明所述的疫苗组合物。
Montanide ISA-51和Montanide ISA-720特别可用于人，因此它们是优选的，而且它们是基于油的佐剂，必须作为乳剂来施用(见下文)。
在一些具体实施方式中，疫苗组合物可进一步包含一种或多种额外的免疫刺激成分。这些包括而不限于，胞壁酰二肽(MDP)；例如N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(ala-MDP)、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，正MDP)和N-乙酰-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，MTP-PE)、二甲基甘氨酸、促吞噬肽、和海藻糖二霉菌酸酯、单磷酰脂A(MPL)、和含甲酰-甲硫氨酸的三肽(如N-甲酰-Met-Leu-Phe)。这些化合物可通过商业途径从诸如Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)和RIBI ImmunoChem Research，Inc.(Hamilton，MT)处获得。
载体可以不依赖于佐剂而出现。例如，载体功能可以是增加特定存活蛋白片段的分子量，从而增强它们的活性或免疫原性，带来稳定性，增加生物活性，或延长血清半衰期。载体可以是所属领域技术人员已知的任何合适的载体。载体蛋白可以是但不限于钥孔血蓝素、血清蛋白(如转铁蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、甲状腺球蛋白或卵白蛋白、免疫球蛋白)、或激素(如胰岛素或棕榈酸)。为了对人进行免疫，载体必须是生理上可接受的载体，是人可接受的并安全的。可是在本发明的一个具体实施方式中，破伤风类毒素和/或白喉类毒素也是合适的载体。可选地，载体可以是葡聚糖，例如琼脂糖凝胶。
基于油乳剂和表面活性剂的疫苗可分成油包水、水包油和水包油包水配方。
用于水包油配方的佐剂可以是矿物油或/和非矿物油和表面活性剂/乳化剂。佐剂与水溶性抗原组合物混合在一起，提供了疫苗制剂。
根据本发明，油可以是可代谢的或不可代谢的，或可代谢的油和不可代谢的油的混合物。非矿物油可迅速代谢掉，从注射位置处去除，因此它们很少有副作用，但随之的免疫应答也相应小，而矿物油仅有部分可被代谢掉，具有较高的诱导出不希望的效应的风险并有良好的免疫应答。
优选在加入疫苗水相之前，使油与乳化剂(如二缩甘露醇单油酸酯)预先混合，并用胶体磨或持续机械或流体超声乳化剂进行乳化。
更复杂的双重乳剂(水/油/水)可通过在含少量吐温80的水相中再一次乳化来制备。
近年来已经获得的显著进展有：导入可选择的‘现成可用的’油佐剂。例如，含十八碳烯酸和无水甘露醇的酯的油，可方便地形成双重或混合乳剂(水/油/水)，其稳定且低粘度，不需要精密的乳化设备。
在具体实施方式中，优选佐剂是用于油包水疫苗配方。
在具体实施方式中，优选的油成分可以是非矿物油。在优选的具体实施方式中，佐剂选自基于非矿物油的Montanide ISA(incomplete seppicadjuvant)的组，如Montanide ISA708、Montanide ISA-720、Montanide ISA763A、Montanide ISA207、Montanide ISA264、Montanide ISA27和MontanideISA35。
可选地，佐剂可包含非矿物油或/和矿物油。因此在优选的具体实施方式中，佐剂选自基于非矿物油或/和矿物油的Montanide ISA(incompleteseppic adjuvant)的组，如Montanide ISA740、Montanide ISA773、MontanideISA266、Montanide ISA267，Montanide ISA28、和Montanide IMS，其中最后一个还没有被批准用于人。
在最优选的具体实施方式中，油成分是矿物油。在优选的具体实施方式中，佐剂选自基于矿物油的Montanide ISA(incomplete seppic adjuvant(Seppic，比利时))的组，如Montanide ISA50、Montanide ISA-51、MontanideISA70、Montanide ISA206、和Montanide ISA51F和Montanide ISA016D，其中最后两个还没有被批准用于人。
矿物油的组成(例如碳链长度)影响了佐剂功效，短链诱导出强免疫应答但带来局部副作用，而用长链带来的应答较小但无显著的副作用，因此应该良好地表征矿物油，平衡长和短碳链的组成。优选矿物油有少于8％、或如少于7％、或如少于6％并最优选少于5％的其链长小于C14的烃。
优选矿物油不含不饱和或芳香族烃。
优选油成分具有的A.P.I.重力为32-40、或如35-37并尤其如36.2-36.8。
另外，优选矿物油在25℃具有的比重为0.82-0.84或如0.83-0.84。更优选矿物油在25℃具有的比重为0.834-0.838。
37.8℃(100F)粘度为55-65SSU的矿物油是优选的，更优选使用粘度为27-61的矿物油，而且尤其优选矿物油在37.8℃(100F)具有的粘度为59-61SSU。
优选矿物油在25℃具有的折射率为1.2-1.6、或如1.3-1.6或如1.4-1.5并最优选为1.458-.463，
进一步优选矿物油具有一种或多种以下特征；
a)酸测试优于最低值，
b)360nm处荧光呈阴性，
c)可见悬浮物呈阴性，
d)具有295F的最小ASTM闪点，
e)符合轻质矿物油和紫外线吸收的所有RN要求。
矿物油应是药用级别的。
Drakeol6VR(Penreco，Texas)是药用级别的矿物油。Drakeol6VR不含有不饱和或芳香族烃，其具有的A.PI.重力为36.2-36.8，25℃的比重为0.834-0.838，37.8℃(100F)的粘度为59-61SSU或10.0-10.6厘沲，25℃的折射率为1.458-.463，酸测试优于最低值，360nm处荧光呈阴性，可见悬浮物呈阴性，具有0-15F的ASTM倾注试验值，具有295F的最小ASTM闪点，并符合轻质矿物油和紫外线吸收的所有RN要求。少于5％的矿物油由带有短链的烃构成。
在最优选的具体实施方式中，矿物油是Drakeol6VR。
表面活性剂
佐剂的表面张力可通过表面活性剂来调节，由此其可影响佐剂和疫苗制剂的粘度。表面活性剂的毒性效应与脂肪酸残余水平相关，因此需要带有低水平脂肪酸的高质量表面活性剂。表面活性剂应该是药用级别的。
根据本发明所述的佐剂可包含表面活性剂。
在具体实施方式中，佐剂配制成油包水乳剂，其包含矿物油和表面活性剂，其中佐剂含至多14.5体积百分比的所述表面活性剂。
本发明的一个方面涉及用作药物的疫苗组合物，其包含：
i.一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中所述肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，和
ii.配制用于油包水乳剂的佐剂，其包含矿物油和表面活性剂，其中佐剂含至多14.5体积百分比的所述表面活性剂。
在另一个具体实施方式中，佐剂含2至14体积百分比的所述表面活性剂，如5至14体积百分比的所述表面活性剂，如6至13体积百分比的所述表面活性剂，如7至12体积百分比的所述表面活性剂或如8至12体积百分比的所述表面活性剂。
优选表面活性剂的主要脂肪酸种类是C18’，其构成了组合物的65至88％。
进一步优选表面活性剂是油，如带有最大酸值为1的脂质液体。
而且还优选表面活性剂具有的皂化值为150-190、或如160-170、或如162-175，而且最优选的皂化值为164-172。
而且还优选表面活性剂具有的羟值为70-120、或如80-110、或如80-110、85-105，而且最优选的羟值为89-100。
而且还优选表面活性剂具有的碘价为40-100或如50-90、或如60-80、或如65-78，而且最优选的碘价为67-75。
而且还优选表面活性剂具有的重金属值小于40ppm或如30ppm、或如25ppm、或如22ppm，而且最优选的重金属值小于20ppm。
而且还优选表面活性剂具有的最大含水量为50％、或如45％、或如40％、或如37％，而且最优选的最大含水量为0.35％。
而且还优选表面活性剂具有的25℃的粘度如200-400mPaS、或如225-375mPaS、或如250-350mPaS、或如275-325mPaS，而且最优选的25℃的粘度约为300mPaS。
在优选的具体实施方式中，表面活性剂是二缩甘露醇油酸酯，也被称为无水甘露醇十八烷脂。
Montanide80是以油酸为基础的(分布有各种脂肪酸)，其中主要的脂肪酸种类是C18’，构成了组合物中的65至88％。油是脂质液体，其最大酸值为1，皂化值为164-172，羟值为89-100，碘价为67-75，最大过氧化值为2，重金属值小于20ppm，最大含水量为0.35％，最大色值为9而且25℃的粘度约为300mPaS。
在最优选的具体实施方式中，佐剂包含表面活性剂二缩甘露醇油酸酯(Montanide80(Seppic，比利时))。
在另一优选的具体实施方式中，佐剂包含矿物油Drakeol 6VR和表面活性剂二缩甘露醇油酸酯(Montanide80)。
在优选的具体实施方式中，佐剂包含矿物油Drakeol6VR和表面活性剂二缩甘露醇油酸酯，其中佐剂含至多14.5％的表面活性剂无水甘露醇十八烷脂(Montanide80)。
在更优选的具体实施方式中，佐剂含2至14体积百分比的所述表面活性剂无水甘露醇十八烷脂，如5至14体积百分比的所述表面活性剂无水甘露醇十八烷脂，如6至13体积百分比的所述表面活性剂无水甘露醇十八烷脂，如7至12体积百分比的所述表面活性剂无水甘露醇十八烷脂或如8至12体积百分比的所述表面活性剂无水甘露醇十八烷脂。
在具体实施方式中，佐剂是20℃密度约为0.7-1.0或0.8-0.9或优选约为0.85的澄清黄色液体。
在具体实施方式中，佐剂具有的20℃的粘度小于500mPaS，如小于250mPaS或如25-150mPaS或优选约150mPaS。
在具体实施方式中，佐剂具有的最大酸值为0.5，
在具体实施方式中，佐剂具有的皂化值为10-40，如12-30，如14-25或优选为16-20。
在具体实施方式中，佐剂具有的羟值为5-20，或如6-18或如7-15或优选为9-13。
在具体实施方式中，佐剂具有的最大过氧化值为5或4或3或优选为2。
在具体实施方式中，佐剂具有的碘价为1-20，如2-15，如3-12或优选如5-9。
在具体实施方式中，佐剂具有的最大含水量为百分之2，如百分之1.5，如百分之1或优选如百分之0.5。
在具体实施方式中，佐剂具有的25℃的折射率在1.450和1.470之间或在1.455和1.465之间或优选在1.461-1.463之间。
在具体实施方式中，50：50混合的佐剂和盐水的传导率小于20μScm-1、15μScm-1、12μScm-1或优选小于10μScm-1。
Montanide ISA51含有在矿物油溶液(Drakeol 6 VR)中的二缩甘露醇油酸酯(Montanide80)。Montanide ISA 51含有约百分之8至12的无水甘露醇十八烷脂和约百分之88至92的矿物油。Montanide ISA 51是澄清的黄色液体，其在20℃的密度约为0.85，而20℃的粘度约为50mPaS。MontanideISA51的特征在于所具有的最大酸值为0.5，皂化值为16-20，羟值为9-13，最大过氧化值为2，碘价为5-9，最大含水量为百分之0.5，25℃的折射率在1.455和1.465之间或优选在1.461-1.463之间。50：50混合的MontanideISA51和盐水的传导率小于10μScm-1。
在更优选的具体实施方式中，佐剂是Montanide incomplete seppicadjuvant。
在最优选的具体实施方式中，疫苗组合物包含：
i.一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％的同一性，和
ii.配制用于油包水乳剂的佐剂，其包含矿物油和表面活性剂，其中所述佐剂包含至多14.5体积百分比的所述表面活性剂，其中所述佐剂是Montanide ISA51。
存活蛋白肽或肽变体
理想的免疫治疗靶位是正常组织中沉默的、癌细胞中过量表达的并直接涉及肿瘤细胞存活和发展的基因产物。存活蛋白潜在地达到了这些特点，因为它抑制凋亡并且涉及细胞分裂的调控。所以，存活蛋白能阻止细胞发生生理死亡，从而延长细胞存活。
存活蛋白是16.5kDa细胞质蛋白质，其包含替换RING指结构的单BIR和多电荷的羧基末端卷曲区域。编码序列有429个核苷酸长(SEQ ID NO：22)，其包括终止密码子，而编码的存活蛋白蛋白有142个氨基酸长(SEQ IDNO：23)。
本发明涉及疫苗组合物，其包含一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体。
在具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体包含由142个氨基酸残基组成的全长存活蛋白多肽(SEQ ID NO：23)。
优选地，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体包含至少5个氨基酸残基，而且更优选它包含至少7个氨基酸残基、至少8个氨基酸残基、至少9个氨基酸残基、至少10个氨基酸残基、至少11个氨基酸残基、至少12个氨基酸残基、至少14个氨基酸残基、至少16个氨基酸残基、至少18个氨基酸残基或至少20个氨基酸残基。
在具体实施方式中，进一步优选一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体由至多142个氨基酸残基或如至多120个氨基酸残基、或如至多100个氨基酸残基、并优选至多80个氨基酸残基或如至多50个氨基酸残基组成，并更优选它由至多20个氨基酸残基、如至多18个、如至多16个、如至多14个、如至多12个、如至多11个、如至多10个氨基酸残基组成。
在具体实施方式中，疫苗组合物包含一种或多种肽或肽变体，其由SEQID NO：23的至少5个氨基酸残基和至多20个连续的氨基酸残基组成。
在具体实施方式中，进一步优选一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其由SEQ ID NO23的至多142个连续的氨基酸残基或如至多120个连续的氨基酸残基、或如至多100个连续的氨基酸残基、并优选至多80个连续的氨基酸残基或如至多50个连续的氨基酸残基组成，并更优选它由SEQ ID NO23的至多20个连续的氨基酸残基、如至多18个连续的氨基酸、如至多16个连续的氨基酸、如至多14个连续的氨基酸、如至多12个连续的氨基酸、如至多11个连续的氨基酸、如至多10个连续的氨基酸残基组成。
在特定具体实施方式中，肽由七肽、八肽、九肽、十肽或十一肽组成，其分别由SEQ ID NO：23的7，8、9、10、11个连续的氨基酸残基组成。
本发明还涵盖了本文公开的存活蛋白肽变体和功能等价物。本文中所用的“功能等价物”通过参考正在讨论的序列预先确定的片段的相应功能而确定的。例如，通过ELISPOT试验证明的与HLAI类分子的相似的结合亲和力、或相似的效力，可确定功能等价性。
本文所述的存活蛋白衍生的肽的功能等价物或变体将被理解为在插入、缺失和替换(包括保守替换)的数目和范围上展示与优选的、预选确定的序列逐渐不同的氨基酸序列。该不同可通过在优选的、预先确定的序列和存活蛋白衍生的变体或存活蛋白衍生的功能等价物之间的同一性的减少来度量。
氨基酸序列间的同一性可用现有公知的算法来计算。与包含或由连续的存活蛋白衍生的氨基酸残基组成的片段同源的片段将被认为落入本发明的范围内，这时它们在整个长度上与预先确定的存活蛋白衍生的肽优选如至少75％同一、如至少80％同一、如至少85％同一、如至少88％同一、至少90％同一、如至少94％同一，包括95％、96％、97％、98％或99％同一。
根据本发明所述的疫苗组合物包含一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一。
根据本发明所述的肽变体的例子有肽LLLGEFLKL(存活蛋白96-104L2)(SEQ ID NO：4)，其中肽变体与存活蛋白序列“LTLGEFLKL”8/9*100％(89％)同一。
以上用于描述肽变体的名称用于本申请全文中：数字前的字母(例如L2)表示变体氨基酸(L)，其在给定肽的第2位上替换了其他本来存在的氨基酸。给定肽或者用一个数字表示，该数字表示肽的第一个氨基酸相对于全长存活蛋白序列的位数(存活蛋白96或Sur96起始于存活蛋白的第96位残基)，或用两个数字表示，其中第二个数字给出了相应于存活蛋白的肽的末端残基。
肽变体可源自已知的存活蛋白序列，如公开于US6.245.523中的序列(本文的SEQ ID NO：23)。选择潜在具有结合特定HLA分子能力的肽，这可通过利用结合给定的特定HLA分子的已知序列的配对排列、以显示在肽的特定位置上的一些相关氨基酸的支配作用来进行。该支配性氨基酸残基在本文中也被称为“锚定残基”或“锚定残基基序”。通过这种基于可在可访问的数据库中找到的已知序列数据的相对简单的过程，肽可从存活蛋白蛋白质分子上衍生得到，其可能结合特定HLA分子。这种对一些HLA分子的分析的有代表性的例子在下表2中给出了：
表2.所用的主要锚定残基基序。
 
HLA等位基因 第1位 第2位 第3位 第5位 第6位 第7位 C-末端
HLA-A1HLA-A2HLA-A3HLA-A11HLA-A23HLA-A24HLA-A25HLA-A26HLA-A28HLA-A29HLA-A30HLA-A31HLA-A32HLA-A33HLA-A34HLA-A66HLA-A68HLA-A69HLA-A74HLA-B5HLA-B7HLA-B8HLA-B14HLA-B15(B62)HLA-B17HLA-B27HLA-B35HLA-B37HLA-B38HLA-B39HLA-B40 E，DE，DE，DE，D T，SL，ML，V，MV，I，F，YI，YYM，A，TV，T，I，L，FV，A，LEY，L，F，VI，LY，I，L，VV，LT，VT，VV，T，ATA，PPR，KQ，L，K，P，H，V，I，M，S，TRPD，EHR，HE D，EF，YM，L，F，Y，IL，M，F，YF，YKD，EF，I，V I，VK，R VFI，L，V L YL，VK，Y，FK，RW，II，L，FWY，FA，RY，LYRWRRR，KR，KV，LV，LI，LL，FLL，VF，Y，WL，VY，K，F，LI，L，M，YI，L，MF，LL，FL，V，
 
(B60，61)HLA-B42HLA-B44HLA-B46HLA-B48HLA-B51HLA-B52HLA-B53HLA-B54HLA-B55HLA-B56HLA-B57HLA-B58HLA-B67HLA-B73HLA-Cw1HLA-Cw2HLA-Cw3HLA-Cw4HLA-Cw6HLA-Cw6HLA-Cw8HLA-Cw16 L，PEM，I，L，VQ，KA，P，GQPPPPA，T，SA，T，SPRA，LA，LA，LY，P，FYYA，L F，Y A，W，M，T，RY，LF，Y，WY，FLF，Y，I，VI，VW，F，LA，VA，VF，W，YF，W，YLPLF，YL，ML，M，F，YL，I，V，YL，Y，FL，I，L，V
因此，作为一个例子来说，潜在具有结合HLA-A1能力的九肽具有以下序列之一：Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y，Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y，Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y或Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y(Xaa表示任意氨基酸残基)。以相似的方式，可设计出潜在具有结合其他任何HLA分子能力的序列。
将能理解，所属领域普通技术人员能鉴定出其它针对给定HLA分子的“锚定残基基序”。
因此，根据本发明所述的肽变体包括肽，其包含包括表2所列的针对每一个特定HLA的任意氨基酸残基的序列。
可选地，通过直接比较肽中与存活蛋白的连续氨基酸序列相比的替换的数量可度量出该差异。因此在具体实施方式中，所述疫苗包含由7-20个连续的氨基酸组成的存活蛋白肽变体，所述7-20个连续的氨基酸与SEQ IDNO：23的连续氨基酸序列包含一个或两个氨基酸替换。在更优选的具体实施方式中，所述疫苗组合物包含由7-12个连续的氨基酸组成的存活蛋白肽变体，所述7-12个连续的氨基酸与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列相比包含一个氨基酸替换。
MHC1类分子的结合沟极好地适合9或10个氨基酸的肽。在更优选的具体实施方式中，所述疫苗组合物包含由9或10个氨基酸残基组成的一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体。
基于所选的存活蛋白蛋白的序列，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体可通过形成上述合适大小的肽的存活蛋白起始材料的任何合适的化学或酶学处理手段来衍生获得，或可通过所属领域普通技术人员熟悉的常规肽合成过程来合成它。
本发明的肽具有所衍生的存活蛋白蛋白的天然序列的序列。可是，对任何给定的HLA分子具有更高亲和力的肽可通过替换、缺失或添加至少一个氨基酸残基而从该天然序列中衍生出来，如基于上述鉴定出针对给定HLA分子的锚定残基基序的过程(参见表2)。
因此，在具体实施方式中，疫苗组合物包含一种或多种存活蛋白肽或肽变体，其中一个或多个存活蛋白肽变体的序列可通过替换、缺失或添加至少一个氨基酸残基而从天然序列中衍生出，由此获得具有针对给定HLA分子的锚定残基基序的肽。
因此，为了增强存活蛋白衍生的肽的免疫原性，可在锚定位置上导入氨基酸替换，而不在TCR接触残基上导入，以此增强肽与HLAI类分子的结合。这能产生更具有免疫原性的表位，例如，这增强了诱导癌反应性CTL的能力，而且已经证明它更适于诱导出具有临床意义的CTL应答。可重要的是，靶癌细胞不仅在细胞表面上表达和提呈天然存活蛋白衍生的肽。由此，非常重要的是，诱导特异针对修饰的存活蛋白衍生的肽的治疗性CTL与天然类似物有交叉反应。
在具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于选自以下组的MHC I类分子中的至少一种：HLA-A1，HLA-A2，HLA-A3，HLA-A11，HLA-A23，HLA-A24，HLA-A25，HLA-A26，HLA-A28，HLA-A29，HLA-A30，HLA-A31，HLA-A32，HLA-A33，HLA-A34，HLA-A66，HLA-A68，HLA-A69，HLA-A74，HLA-B5，HLA-B7，HLA-B8，HLA-B14，HLA-B15B62)，HLA-B17，HLA-B27，HLA-B35，HLA-B37，HLA-B38，HLA-B39，HLA-B40(B60，61)，HLA-B42，HLA-B44，HLA-B46，HLA-B48，HLA-B51，HLA-B52，HLA-B53，HLA-B54，HLA-B55，HLA-B56，HLA-B57，HLA-B58，HLA-B67，HLA-B73，HLA-Cw1，HLA-Cw2，HLA-Cw3，HLA-Cw4，HLA-Cw6，HLA-Cw6。
因此，在另外的具体实施方式中，一种或多种肽受限于选自以下组的MHC I类分子中的至少一种：HLA-A1，HLA-A2，HLA-A3，HLA-A11，HLA-A24，HLA-B7，HLA-B35，HLA-B44，HLA-B8，HLA-B15，HLA-B27和HLA-B51，HLA-Cw1，HLA-Cw2，HLA-Cw3，HLA-Cw4，HLA-Cw5，HLA-Cw6，HLA-Cw7和HLA-Cw16。
在特别优选的具体实施方式中，一种或多种肽受限于选自以下组的MHC I类分子中的至少一种：HLA-A1，HLA-A2，HLA-B7和HLA-B35。
根据本发明所述的疫苗可包含具有相同组织特异性的两种或更多种肽，因为各个肽的功效可随个体不同而变化。因此在具体实施方式中，两种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于选自以下组的MHC I类HLA分子：HLA-A1，HLA-A2，HLA-A3，HLA-A11，HLA-A23，HLA-A24，HLA-A25，HLA-A26，HLA-A28，HLA-A29，HLA-A30，HLA-A31，HLA-A32，HLA-A33，HLA-A34，HLA-A66，HLA-A68，HLA-A69，HLA-A74，HLA-B5，HLA-B7，HLA-B8，HLA-B14，HLA-B15B62)，HLA-B17，HLA-B27，HLA-B35，HLA-B37，HLA-B38，HLA-B39，HLA-B40(B60，61)，HLA-B42，HLA-B44，HLA-B46，HLA-B48，HLA-B51，HLA-B52，HLA-B53，HLA-B54，HLA-B55，HLA-B56，HLA-B57，HLA-B58，HLA-B67，HLA-B73，HLA-Cw1HLA-Cw2，HLA-Cw3，HLA-Cw4，HLA-Cw6，HLA-Cw6。
在另一个具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于选自以下组的MHC I类HLA-A分子中的至少一种：HLA-A1，HLA-A2，HLA-A3，HLA-A9，HLA-A10，HLA-A11，HLR-Aw19，HLA-A23(9)，HLA-A24(9)，HLA-A25(10)，HLA-A26(10)，HLA-A28，HLA-A29(w19)，HLA-A30(w19)，HLA-A31(w19)，HLA-A32(w19)，HLA-Aw33(w19)，HLA-Aw34(10)，HLA-Aw36，HLA-Aw43，HLA-Aw66(10)，HLA-Aw68(28)，HLA-A69(28)。文献中也使用更简单的名称，其中仅用主要数字名称，如分别用HLA-A19或HLA-A24代替HLA-Aw19和HLA-A24(9)。在特定具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于选自由以下所组成的组的MHC I类HLA种类；HLA-A1，HLA-A2，HLA-A3，HLA-A11和HLA-A24。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-A1。
在特定具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下组的序列的HLA-A1限制性肽；MAEAGFIHY(SEQ ID NO：17)(存活蛋白38-46Y9，第9位上用“Y”替换“C”的存活蛋白38-46)，PTENEPDLAY(SEQ ID NO：18)(存活蛋白47-56Y10，第10位上用“Y”替换“Q”的存活蛋白47-56)，QFEELTLGEF(SEQ ID NO：15)(存活蛋白92-101)和FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)(存活蛋白93-101T2，第2位上用“T”替换“E”的存活蛋白93-101)。括号中的名称显示了US6,245,523所公开的存活蛋白蛋白中的残基位置和肽中的氨基酸变化。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-A2。
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下序列的HLA-A2限制性存活蛋白衍生的肽：FLKLDRERA(存活蛋白101-109)(SEQ ID NO：1)，TLPPAWQPFL(存活蛋白5-14)(SEQ ID NO：2)，ELTLGEFLKL(存活蛋白95-104)(SEQ ID NO：3)，LLLGEFLKL(存活蛋白96-104L2，第2位上用“L”替换“T”的存活蛋白96-104)(SEQ ID NO：4)和LMLGEFLKL存活蛋白96-104M2(第2位上用“M”替换“T”的存活蛋白96-104(SEQ ID NO：5)。
一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体也可以是HLA-A3限制性肽(如第10位上用“K”替换“F”的RISTFKNWPK(Sur18K10)存活蛋白18-27(SEQ ID NO：20))和/或HLA-A11限制性肽(如DLAQCFFCFK(存活蛋白53-62)(SEQ ID NO：19)、DVAQCFFCFK(Sur53/V2)(SEQ ID NO：45)、DFAQCFFCFK(Sur53/F2)(SEQ ID NO：46)、DIAQCFFCFK(Sur53/I2)(SEQID NO：47))和/或HLA-A2限制性肽(如RISTFKNWPFL(存活蛋白18-28)(SEQ ID NO：21))和/或HLA-A24限制性肽(如STFKNWPFL(Sur20-28)(SEQID NO：41)、或第2位上用“Y”替换“T”的SYFKNWPFL(Sur20-28/Y2)(SEQID NO：48))。
在另外的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于包括以下任一项的MHC I类HLA-B分子：HLA-B5，HLA-B7，HLA-B8，HLA-B12，HLA-B13，HLA-B14，HLA-B15，HLA-B16，HLA-B17，HLA-B118，HLA-B21，HLA-Bw22，HLA-B27，HLA-B35，HLA-B37，HLA-B38，HLA-B39，HLA-B40，HLA-Bw41，HLA-Bw42，HLA-B44，HLA-B45，HLA-Bw46和HLA-Bw47。在特定具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体能结合的MHC I类HLA-B种类选自以下组：HLA-B7，HLA-B8，HLA-B15，HLA-B27，HLA-B35，HLA-B44，HLA-B51和HLA-B58。
在更优选的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B7或HLA-B35。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B7。
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下序列的结合HLA-B7的存活蛋白衍生的肽：LPPAWQPFL(存活蛋白6-14)(SEQ ID NO：10)，QPFLKDHRI(存活蛋白11-19)(SEQ ID NO：11)，CPTENEPDL(存活蛋白51-59)(SEQ ID NO：6)，TPERMAEAGF(存活蛋白34-43)(SEQ ID NO：12)，APPAWQPFL(存活蛋白6-14A1)(SEQ ID NO：13)，RPPAWQPFL(存活蛋白6-14R1)(SEQ ID NO：14)，RAIEQLAAM(Sur133-141)(SEQ ID NO：44)，TAKKVRRAI(Sur127-135)(SEQ ID NO：49)，RPIEQLAAM(Sur133P2)(SEQ ID NO：50)或TPKKVRRAI(Sur127P2)(SEQ ID NO：51)。APPAWQPFL(SEQ ID NO：13)是通过在肽第1位上用“A”替换“L”而从存活蛋白6-14中衍生出的序列，而RPPAWQPFL(SEQ ID NO：14)是通过在肽第1位上用“R”替换“L”而从存活蛋白6-14中衍生出的。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B35.
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下序列的HLA-B35限制性存活蛋白衍生的肽：CPTENEPDL(存活蛋白46-54)(SEQ ID NO：6)，EPDLAQCFF(存活蛋白51-59)(SEQ ID NO：7)，CPTENEPDY(存活蛋白46-54Y9)(SEQ ID NO：8)和EPDLAQCFY(存活蛋白51-59Y9)(SEQ ID NO：9)。括号中的名称表示US6，245,523公开的存活蛋白蛋白的残基位置。CPTENEPDY(SEQ ID NO：8)是通过在肽C末端上用“Y”替换“L”而从存活蛋白46-54中衍生出的序列，而EPDLAQCFY(SEQ ID NO：9)是通过在C末端上用“Y”替换“F”残基而从存活蛋白51-59中衍生出的。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B51。存活蛋白肽特别是具有以下序列的HLA-B51限制性存活蛋白衍生的肽：RAIEQLAAM(Sur133-141)(SEQ ID NO：44)。该肽也是HLA-B7限制性的。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B27。
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下序列的HLA-B27限制性存活蛋白衍生的肽：ERMAEAGFI(Sur36-44)(SEQ ID NO：43)，ERAKNKIAK(Sur107-115)(SEQ ID NO：52)，DRERAKNKI(Sur105-113)(SEQ ID NO：53)，KEFEETAKK(Sur122-130)(SEQ ID NO：54)，ERMAEAGFL(Sur36/L9)(SEQID NO：55)，ERMAEAGFF(Sur36/F9)(SEQ ID NO：56)，ERMAEAGFR(Sur36/R9)(SEQ ID NO：57)，ERMAEAGFK(Sur36/K9)(SEQ ID NO：58)或KRFEETAKK(Sur122/R2)(SEQ ID NO：59)。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B44。
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下序列的HLA-B44限制性存活蛋白衍生的肽：KETNNKKKEY(Sur115Y10)(SEQ ID NO：42)，KETNNKKKEF(Sur115-124)(SEQ ID NO：60)，EELTLGEFL(Sur94-102)(SEQ ID NO：61)或EELTLGEFY(Sur94Y9)(SEQ ID NO：62)。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B8。
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下的序列的HLA-B8限制性存活蛋白衍生的肽：ISTFKNWPFL(Sur19-28)(SEQ ID NO：63)，ISKFKNWPFL(Sur19/K3)(SEQID NO：64)，LSVKKQFEEL(Sur87-96)(SEQ ID NO：65)，LSKKKQFEEL(Sur87/K3)(SEQ ID NO：66)，RAKNKIAKET(Sur108-117)(SEQ ID NO：67)，RAKNKIAKEL(Sur108/L10)(SEQ ID NO：68)，NNKKKEFEET(Sur118)(SEQ ID NO：69)，NNKKKEFEEL(Sur118/L10)(SEQ ID NO：70)，QPKLKDHRI(Sur11/K3)(SEQ ID NO：71)，FLKDHRIST(Sur13)(SEQ IDNO：72)，FLKDKRIST(Sur13/K5)(SEQ ID NO：73)，FLKDHRISL(Sur13/L9)(SEQ ID NO：74)，AFLSVKKQF(Sur85)(SEQ ID NO：75)，AFLSVKKQF(Sur85/K3)(SEQ ID NO：76)，AFLSKKKQF(Sur85/K5)(SEQID NO：77)，AFLSVKKQL(Sur85/L9)(SEQ ID NO：78)，FLSVKKQFE(Sur86)(SEQ ID NO：79)，FLSVKKQFL(Sur86/L9)(SEQ ID NO：80)，FLKVKKQFE(Sur86/K3)(SEQ ID NO：81)，SVKKQFEEL(Sur88)(SEQ IDNO：82)，SVKKKFEEL(Sur88/K5)(SEQ ID NO：83)，FLKLKRERA(Sur101/K5)(SEQ ID NO：84)，FLKLDRERL(Sur101/L9)(SEQ ID NO：85)，TAKKKRRAI(Sur127/K5)(SEQ ID NO：86)或TAKKVRRAL(Sur127/L9)(SEQ ID NO：87)，或TAKKVRRAI(Sur127)(SEQ ID NO：49)，FLKLDRERA(Sur101)(SEQ ID NO：1)或QPFLKDHRI(Sur11)(SEQ IDNO：11)。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B15。
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下的序列的HLA-B15限制性存活蛋白衍生的肽：TLPPAWQPF(Sur5)(SEQ ID NO：88)，TLPPAWQPY(Sur5/Y9)(SEQ IDNO：89)，WQPFLKDHRI(Sur10)(SEQ ID NO：90)，WQPFLKDHRY(Sur10/Y9)(SEQ ID NO：91)，FLKDHRISTF(Sur13)(SEQ ID NO：92)，FLKDHRISTY(Sur13/Y9)(SEQ ID NO：93)，RISTFKNWPF(Sur18)(SEQ IDNO：94)，RLSTFKNWPF(Sur18/L2)(SEQ ID NO：95)，DLAQCFFCF(Sur53)(SEQ ID NO：96)，DLAQCFFCY(Sur53/Y9)(SEQ ID NO：97)，ISTFKNWPF(Sur19)(SEQ ID NO：98)，IQTFKNWPF(Sur19/Q2)(SEQ IDNO：99)，ILTFKNWPF(Sur19/L2)(SEQ ID NO：100)，RMAEAGFIY(Sur37/Y9)(SEQ ID NO：101)，RMAEAGFIF(Sur37/F9)(SEQ ID NO：102)，RLAEAGFIY(Sur37/L2Y9)(SEQ ID NO：103)，KKHSSGCAF(Sur78)(SEQID NO：104)，KQHSSGCAF(Sur78/Q2)(SEQ ID NO：105)，KLHSSGCAF(Sur78/L2)(SEQ ID NO：106)，RAIEQLAAY(Sur133/Y9)(SEQ ID NO：107)或RLIEQLAAM(Sur133/L2)(SEQ ID NO：108)或RAIEQLAAM(Sur133)(SEQ ID NO：44)。
在特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体受限于HLA-B58。
在其它特定的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是具有选自以下的序列的HLA-B58限制性存活蛋白衍生的肽：PTLPPAWQPF Sur5(SEQ ID NO：109)，CTPERMAEAGF(Sur33)(SEQ IDNO：110)，ETNNKKKEF(Sur116)(SEQ ID NO：111)，ISTFKNWPF(Sur19)(SEQ ID NO：98)，GAPTLPPAW(Sur2)(SEQ ID NO：112)或CAFLSVKKQF(Sur84)(SEQ ID NO：113)。
在其他有用的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是肽，其受限于选自以下组的MHC I类HLA-C分子：HLA-Cw1，HLA-Cw2，HLA-Cw3，HLA-Cw4，HLA-Cw5，HLA-Cw6，HLA-Cw7和HLA-Cw16。
此外，对本发明肽进行翻译后修饰是有益的。
因此在具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体是包含一种或多种翻译后修饰的肽。
肽可包含任意种类的修饰。因此目前已经鉴定出了近200种结构各异的共价修饰，修饰的大小和复杂程度有很多，从酰胺转化为羧酸，到结合多个复杂寡糖。这些修饰包括磷酸化、乙酰化、泛素化、脂化(乙酰化、异戊烯化、法呢基化、香叶基化、棕榈酰化、肉豆蔻酰化)、甲基化、羧化、磺化和O-或N-糖基化。
已经显示，将乳癌MCF-7或宫颈癌HeLa细胞暴露于抗癌剂(包括阿霉素、紫杉醇、或UVB)会造成存活蛋白表达增长4-5倍。抗癌治疗后存活蛋白水平的变化并不涉及调节存活蛋白mRNA的表达，也不依赖于基因的重新转录。相反，通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂flavopiridol抑制存活蛋白在Thr34上磷酸化会造成存活蛋白的表达缺失，而不能磷酸化的存活蛋白Thr34至Ala的突变体与野生型存活蛋白相比显示出清除率加快。持续消除存活蛋白在Thr34上的磷酸化会不依赖于p53而增强抗癌剂诱导的细胞凋亡，并在体内乳腺癌异种移植模型中抑制肿瘤生长而不带来毒性。这些数据提示了，Thr34磷酸化在肿瘤细胞中关键性调控存活蛋白水平，而且持续消除p34激酶活性可去除存活蛋白生存能力检查点，并增强肿瘤细胞中的凋亡。
因此预计，本发明的存活蛋白和存活蛋白衍生的肽涵盖了磷酸化的肽。天然存活蛋白磷酸肽抗原可通过扫描磷酸化位点Thr34周围的MHC肽结合基序的存在来鉴定。因此，可能的存活蛋白衍生的磷酸肽序列包括TPERMAEAGF(SEQ ID NO：114)——推定的HLA-B35-和/或HLA-B7-和/或HLA-B51限制性肽抗原。本文包括的其他天然磷酸肽包括：HLA-A2：CACTPERMA(SEQ ID NO：115)，和CTPERMAEA(SEQ ID NO：116)；HLA-A3：FLEGCACTP(SEQ ID NO：117)，；HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51：WPFLEGCACT(SEQ ID NO：118)(用粗体标出磷酸化的Thr残基)。
公知的是，不同HLA分子在主要人群中有不同的分布。因此，需要鉴定出受几种HLA I类分子限制的肽表位，以扩展能用根据本发明的方法进行治疗的患者群。表征有不同HLA限制元件的多重存活蛋白表位，以如下两种重要方式拓宽了该靶抗原的临床潜力：(i)它增加了符合基于存活蛋白衍生的肽的免疫治疗条件的患者数量。约有50％的白种人和亚洲人人群表达HLA-A2抗原，约有25％的白种人和5％的亚洲人表达HLA-A1和HLA-A3抗原，而约有15％的白种人和30％的亚洲人表达HLA-A11抗原。尽管这些数字由于共表达而不能累加，但是将受限于这些中多个的肽加以组合的确将涵盖大多数癌症患者，(ii)在每个患者中对几个限制性元件进行集体靶向可能降低通过HLA等位基因缺失造成的免疫逃逸的风险。缺失单个HLA等位基因是癌细胞所进行的MHC改变的显著组成部分，而全部缺失I类表达则是相当少见的事件。因此现在，鉴定出受不同HLA等位基因限制的存活蛋白表位，可能在等位基因重叠的患者中同时靶向超过一个HLA分子。
尽管可预测出许多用于疫苗组合物中的潜在的肽，但是实际鉴定出能获得有用应答的肽和疫苗组合物仍需要测试多项参数。本发明描述了尤其有效的疫苗组合物。根据本发明所述的疫苗组合物包括存活蛋白肽和存活蛋白肽变体。
目前优选的多表位疫苗的例子包括依赖于给定患者的组织类型对存活蛋白衍生的肽的表位的“定制”组合，例如，带有HLA-1、HLA-A2、HLA-A3、和HLA-B35表型的受试者可用包含以下肽的疫苗免疫：ELTLGEFLKL(存活蛋白95-104)(SEQ ID NO：3)，LMLGEFLKL存活蛋白96-104M2((SEQ ID NO：5)，CPTENEPDY(存活蛋白46-54Y9)(SEQ ID NO：8)和EPDLAQCFY(存活蛋白51-59Y9)(SEQ ID NO：9)和/或RISTFKNWPK(Sur18K10)(SEQ ID NO：20)
可选地，表位可根据给定种群中各种HLA表型的普遍程度来选择。作为一个示例来说，HLA-A2是白种人人群中分布最广的表型，所以结合HLA-A2的肽将在该人群的大部分中有活性。
可是，根据本发明所述的疫苗组合物也可包含两种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体的组合，其中每一种特异与不同HLA分子相互作用，从而覆盖靶人群中的更大比例。因此，作为示例来说，疫苗组合物可包含受HLA-A分子限制的肽和受HLA-B分子限制的肽的组合，如包括那些对应于HLA表型在靶人群中的普遍程度的HLA-A和HLA-B分子，例如HLA-A2和HLA-B35。另外，疫苗组合可包含受HLA-C分子限制的肽。根据本发明所述的其他组合包括受HLA-A1和HLA-A2限制的肽、或受HLA-A1和HLA-B35限制的肽。另外可用带有不同特异性的3种肽，如受HLA-A1、HLA-A2和HLA-B35限制的肽的组合。
疫苗组合中包括一种HLA-B7限制性肽或两种肽，如HLA-A1和HLAA2结合肽或如HLA-A1和HLA-B35结合肽，是有益的。
本发明的一个方面涉及HLA-B7限制性肽，如LPPAWQPFL(存活蛋白6-14)(SEQ ID NO：10)，QPFLKDHRI(存活蛋白11-19)(SEQ ID NO：11)，CPTENEPDL(存活蛋白51-59)(SEQ ID NO：6)，TPERMAEAGF(存活蛋白34-43)(SEQ ID NO：12)，APPAWQPFL(存活蛋白6-14A1)(SEQ ID NO：13)或RPPAWQPFL(存活蛋白6-14R1)(SEQ ID NO：14)。
在一个具体实施方式中，HLA-B7限制性肽是APPAWQPFL(存活蛋白6-14A1)(SEQ ID NO：13)或RPPAWQPFL(存活蛋白6-14R1)(SEQ ID NO：14)。在特定的具体实施方式中，HLA-B7限制性肽是APPAWQPFL(存活蛋白6-14A1)(SEQ ID NO：13)，在不同的特定具体实施方式中，HLA-B7限制性肽是RPPAWQPFL(存活蛋白6-14R1)(SEQ ID NO：14)。
本发明的一个方面涉及疫苗组合物，其包含一种或多种存活蛋白肽或肽变体，其中肽变体的序列在整个长度与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，而且其中组合物包含
i.HLA-B7结合肽和/或
HLA-A1和HLA-A2限制性肽和/或
HLA-A1和HLA-B35限制性肽
ii.和任意上述佐剂，如Montanide ISA51。
在特别优选的具体实施方式中，疫苗组合物包含：
i.肽，其包含APPAWQPFL(SEQ ID NO：13)并由至多15个、优选10个氨基酸组成，
和/或
肽，其包含RPPAWQPFL(SEQ ID NO：14并由至多15个、优选10个氨基酸组成，
和/或
肽，其包含FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)并由至多15个、优选10个氨基酸组成，以及肽，其包含LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)并由至多15个、优选10个氨基酸组成，
和/或，
肽，其包含FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)并由至多15个、优选10个氨基酸组成，以及肽，其包含EPDLAQCFY(SEQ IDNO：9)并由至多15个、优选10个氨基酸组成，
和/或
肽，其包含LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)并由至多15个、优选10个氨基酸组成，以及肽，其包含EPDLAQCFY(SEQ IDNO：9)并由至多15个、优选10个氨基酸组成，
ii.任意上述佐剂，如Montanide ISA51。
包括三种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，而且尤其如果肽受限于不同HLA分子，则可进一步改善疫苗组合物的功效。
在具体实施方式中，疫苗组合物包含，
a)三种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，
i.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A1结合肽的组，
ii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A2结合肽的组，
iii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-B35结合肽的组
b)和任意上述佐剂，如Montanide ISA51。
在具体实施方式中，HLA-A1结合肽、HLA-A2结合肽和/或HLA-B35结合肽优选由至多15个、如至多14、13、12、11个、并最优选至多10个氨基酸组成。
在特定的具体实施方式中，疫苗组合物包含HLA-A1限制性肽FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)。在第二个特定的具体实施方式中，疫苗组合物包含HLA-A2结合肽LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)，而在第三个特定的具体实施方式中，疫苗组合物包含HLA-B35结合肽EPDLAQCFY(SEQ IDNO：9)。
在最特别的具体实施方式中，疫苗组合物包含HLA-A1限制性肽FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)、HLA-A2结合肽LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)和HLA-B35结合肽EPDLAQCFY(SEQ ID NO：9)。
在具体实施方式中，上文所述的HLA-A1结合肽、HLA-A2结合肽和/或HLA-B35结合肽优选由至多15个、如至多14、13、12、11个、并最优选至多10个氨基酸组成。
包括七种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，而且尤其如果肽受限于不同HLA分子，则可进一步改善疫苗组合物的功效。
在具体实施方式中，疫苗组合物包含，
a)七种或更多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一性，
i.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A1结合肽的组，
ii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A2结合肽的组，
iii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A3结合肽的组
iv.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A24结合肽的组
v.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-A11结合肽的组
vi.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-B35结合肽的组
vii.而且其中至少一种肽或肽变体选自HLA-B7结合肽的组
b)和任意上述佐剂，如Montanide ISA51。
在具体实施方式中，上文所述的HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A11、HLA-B35和/或HLA-B7结合肽优选由至多15个、如至多14、13、12、11个、并最优选至多10个氨基酸组成。
在优选的具体实施方式中，疫苗组合物包含HLA-A1结合肽FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)、HLA-A2结合肽LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、HLA-A3结合肽RISTFKNWPK(SEQ ID NO：20)、HLA-A24结合肽STFKNWPFL(SEQ ID NO：41)、HLA-A11结合肽DLAQCFFCFK(SEQ IDNO：19)、HLA-B35结合肽EPDLAQCFY(SEQ ID NO：9)和HLA-B7结合肽LPPAWQPFL(SEQ ID NO：10)和佐剂，如Montanide ISA51。
在另一优选的具体实施方式中，疫苗组合物还包含
i.至少一种选自HLA-B44结合肽的组的肽或肽变体和/或，
ii.至少一种选自HLA-B27结合肽的组的肽或肽变体和/或，
iii.至少一种选自HLA-B51结合肽的组的肽或肽变体。
在尤其优选的具体实施方式中，疫苗组合物包含HLA-A1结合肽FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)、HLA-A2结合肽LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)、HLA-A3结合肽RISTFKNWPK(SEQ ID NO：20)、HLA-A24结合肽STFKNWPFL(SEQ ID NO：41)、HLA-A11结合肽DLAQCFFCFK(SEQ IDNO：19)、HLA-B35结合肽EPDLAQCFY(SEQ ID NO：9)和HLA-B7结合肽LPPAWQPFL(SEQ ID NO：10)，而且任何一种或多种HLA-B44结合肽是KETNNKKKEY(SEQ ID NO：42)，HLA-B27结合肽是ERMAEAGFI(SEQ ID NO：43)，而且HLA-B51结合肽是RAIEQLAAM(SEQ ID NO：44)，以及佐剂，如Montanide ISA51。
在任意以上具体实施方式中，HLA-A11结合肽可选自以下组：DLAQCFFCFK(SEQ ID NO：19)，DVAQCFFCFK(SEQ ID NO：45)，DFAQCFFCFK(SEQ ID NO：46)或DIAQCFFCFK(SEQ ID NO：47)。
在任意以上具体实施方式中，优选肽的数量乘以最多13，如12、如11或优选为10或9之后，是组成疫苗的氨基酸的最大数量。例如，如果疫苗包含5个肽，则因此优选疫苗由至多65、如60、如55、如50或45个氨基酸组成。
为了选出存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，以用于根据本发明所述的疫苗组合物中，可评估存活蛋白肽和肽变体结合HLA I类分子的能力。另外，可评估存活蛋白肽或存活蛋白肽变体引发出癌患者PBL群中产INF-γ细胞的能力。
这些测量可给出存活蛋白肽或存活蛋白肽变体用于疫苗组合物中的有用性的指标，但是优选包含存活蛋白肽或存活蛋白肽变体的疫苗组合物在施用后能在癌患者中诱导出强特异性T细胞应答。而且还优选施用疫苗组合物来诱导出临床响应，其特征如与评估靶损伤相关的小节中所述的那样。临床响应的特征可以是至少病情稳定(靶损伤的最长直径总和至多增加20％)，更优选靶损伤的最长直径总和减小了，如部分响应或最优选完全消退了。
疫苗组合物包含一种或多种存活蛋白肽或肽变体，其中一种或多种存活蛋白肽或一种或多种肽变体受限于HLA I类分子，其中限制性肽或肽变体的特征在于具有以下特征之至少一个；
(i)能结合I类HLA分子，如通过能收获到的最高半数I类HLA分子的肽的数量(C50值)所测得的，其亲和力，如WO2004/067023中所述的集成结合试验所确定的，至多是50μM。
(ii)能在癌患者PBL群中引发出产INF-γ细胞，如通过(如WO2004/067023所述的)ELISPOT试验所确定的，其频率至少为每104个PBL有1。
集成结合试验提供了筛选能以以上亲和力结合给定HLA等位基因分子的候选肽的简单方法。在优选的具体实施方式中，一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体具有至多30μM的C50值，如至多20μM，包括如至多10μM、至多5μM和至多2μM或至多1μM。选出的肽的C50值示于WO2004/067023的表4中。
一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体用于根据本发明所述的疫苗组合物中的特征是能识别或引发出产INF-γ应答器T细胞，即特异识别癌患者的PBL群或肿瘤细胞(靶细胞)中特定肽的细胞毒性T细胞(CTL)。该活性可通过将来自患者的PBL或肿瘤细胞进行如WO2004/067023和本文中参考文献所述的ELISPOT试验而轻松确定。试验前，通过使细胞与要测试的肽接触来刺激要测试的PBL群或肿瘤细胞，这是有益的。优选肽能以每104个PBL至少有1的频率引发或识别产INF-γT细胞，该频率可通过本文所用的ELISPOT试验确定。更优选频率为每104个PBL至少有5个，最优选为每104个PBL至少有10个，如每104个PBL至少有50个或100个。在特别优选的具体实施方式中，频率为每104个PBL至少有200个或如每104个PBL至少有250个。
应答黑素瘤特异性抗原(如MART-1和gp100肽)而产生IFN-γ，这被用所示肽免疫接种癌患者而证实了。但没有观察到与临床响应显著相关(Hersey，P.等，Cancer Immunol.Immunother.2004，Sep.21)。
因此，鉴定出推测的免疫原后，优选评估体内功能。非常优选疫苗组合物包含一种或多种存活蛋白肽或一种或多种肽变体，其能引发非常强的免疫应答，如免疫接种之前和之后，如针对INF-γ的ELISPOT试验所测的，诱导出非常强的特异性细胞毒性T-细胞应答。该试验包括通过分析施用免疫组合物之前和之后得到的PBMC对疫苗组合物中所用的免疫原的反应性来测试患者中的细胞毒性T-细胞应答，例如通过实施例1所述的ELISPOT试验。
与基于油的佐剂相比，树突细胞在疫苗组合物中的应用已在现有技术中产生了更高的功效(Schreurs MW等，Cancer Res.2000Dec15；60(24)：6995-7001)。所以树突细胞目前是优选的佐剂。
实施例1所述的令人意想不到的临床试验结果显示了，施用根据本发明所述的疫苗组合物能诱导出惊人地大的数量的特异性释放INF-γ的细胞。
优选施用根据本发明所述的疫苗组合物能在受试者中诱导出通过释放INF-γ的细胞的数量而测得的强特异性T-细胞应答，其是每104个PBMC细胞超过了50、或如每104个PBMC细胞超过了100、或如每104个PBMC细胞超过了150、或如每104个PBMC细胞超过了200。最优选的是，通过释放INF-γ的细胞的数量而测得的特异性T-细胞应答是每104个PBMC超过了250。
ELISPOT测得的特异性T-细胞应答可依赖于所用的施用方案，例如免疫接种的数量和施用疫苗组合物的时间(参见与治疗相关的说明)。在具体实施方式中，强特异性细胞毒性T细胞应答可在12个月后、或如在10个月后(如8个月后)被检测到。在优选的具体实施方式中，特异性细胞毒性T细胞应答可在6个月后被检测到。在另外最优选的具体实施方式中，特异性细胞毒性T细胞应答可在4或3个月后被检测到。
可进一步相应评估肽的抗血管发生效果，这是因为抑制血管发生对实体瘤的发展有着深远的作用。
潜在抗血管发生效果的指示标志是抗原特异性T细胞对肿瘤基质的浸润。利用实施例2所述的组织染色法可测试肿瘤基质中是否出现抗原特异性T细胞，由此可用多聚肽/HLA复合物原位检测癌患者肿瘤损伤上的抗原特异性T细胞。抗原特异性T细胞可识别根据本发明所述的存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，优选识别与HLA1类分子形成的复合物。
优选施用根据本发明所述的疫苗组合物能在肿瘤基质中诱导出抗原特异性T-细胞的浸润，如肿瘤基质中的存活蛋白特异性T-细胞。
疫苗组合物的评估进一步包括检查施用疫苗组合物引发临床响应的能力。对于治疗癌症，利用以下与评估靶损伤相关的小节所述的实体瘤响应评估标准(RECIST)来测定临床响应。
在具体实施方式中，根据本发明所述的疫苗组合物能引发临床响应，其被称为病情稳定、部分响应或完全消退，其特征在于靶损伤的最长直径总和至多增加20％。
因此，鉴定肽变体在根据本发明所述的疫苗组合物中的潜在应用的简单方法包括以下步骤：选择特定HLA分子，如在给定人群中以高比率出现的分子，进行上述比对分析以鉴定出存活蛋白蛋白中的“锚定残基基序”，分离或构建合适大小的肽，其包含一种或多种鉴定出的锚定残基，并(i)利用本文所述的集成试验测试所产生的肽结合特定HLA分子的能力、和/或(ii)测试所产生的肽在癌患者PBL群中以WO2004/067023所述的ELISPOT试验所确定的每104个PBL至少有1的频率引发产INF-γ的细胞的能力。
为了鉴定出肽或肽变体是否可用于根据本发明所述的疫苗组合物中，包含肽的疫苗组合物引发免疫应答的能力，如诱导出强特异性细胞毒性T-细胞应答的能力，可以在免疫接种之前和之后通过针对INF-γ的ELISPOT试验来测定(如本文实施例1所述)。
WO2004/067023显示了，通过HLA/肽复合物分离的存活蛋白反应性细胞拥有裂解靶细胞的功能性能力。另外，进一步证实了利用存活蛋白肽和存活蛋白肽变体的树突细胞疫苗能在癌细胞系中和在癌患者的PBL群中引发微弱的免疫应答，但是癌患者中的临床响应不大，因为有报道疾病还在发展。
相对于群体中PBMC的总数或CD8+细胞的数量，可评估出特异性免疫应答。后一个评估的参照在WO2004/067023中有使用，而本文所述的结果使用了PBM细胞总数作参照。如果WO2004/067023的图17所述的结果使用了相同的参照，反应性细胞的数量将为每104个PBMC细胞有8-30。
由于免疫应答的强度是评估潜在免疫原的关键参数，因此该分析是评估疫苗组合物的强有力的工具。根据本发明，向癌患者施用后刺激强特异性T细胞应答的能力是重要的特征。用疫苗组合物免疫之前和之后，通过在PBMC群中产INF-γ的细胞的数量可测量应答。在本发明的具体实施方式中，疫苗组合物能在癌患者中刺激强特异性T细胞应答，其中施用后通过ELISPOT试验测得的强T细胞应答为每104个PBL细胞大于50、如大于100、如大于150、如大于200、如大于225或如大于250个肽特异性点。
抗血管发生效果的评估结果可用于选择出有用的肽，因为据信(不限于理论)能引发抗血管发生效果的疫苗组合物将证明在抑制肿瘤生长中是非常有效的。如果与能引发抗存活蛋白的强特异性T细胞应答的一种或多种肽相组合，则预计包含该一种或多种肽的疫苗组合物将有非常高的可能性诱导出优良的临床响应。
本发明的一个方面涉及疫苗组合物，其包含一种或多种存活蛋白肽或肽一种或多种变体(其中肽变体的序列在整个长度上与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一)和佐剂，其能在受试者肿瘤基质中诱导出抗原特异性T细胞的浸润。
在优选的具体实施方式中，疫苗组合物能在受试者中抑制血管发生。
还必要的是评估对靶损伤的作用，因此如以下与评估靶损伤相关的小节所述，必须评估施用疫苗组合物后的临床响应。优选疫苗组合物能引发临床响应，其被称为病情稳定、部分响应或完全消退，其特征在于如实施例1所见到的，靶损伤的最长直径总和至多增加20％。更优选降低了靶损伤的最长直径总和(部分响应)，而最优选的响应是完全消退。
预计存活蛋白肽或存活蛋白肽变体除了能结合HLA分子之外，还能在细胞表面上形成HLA和肽的复合物，该复合物随之用作细胞溶解性T细胞的表位或靶位。有可能存活蛋白肽或存活蛋白肽变体会引发出其他类型的免疫应答，如能产生抗复合物的抗体和/或延迟型超敏(DTH)反应的B细胞应答。
后一类型的免疫应答会在注射本发明疫苗组合物的位点上出现充血和明显硬化的特征。
免疫的可能的副作用可能是全身性的或局部性的毒性。血管的变化(如脉管炎)或伤口愈合受损是可能的副作用。血色素、白细胞和血小板以及乳酸脱氢酶、肌酸酐和胆碱酯酶的改变是其他不希望的效应。
在本发明的具体实施方式中，施用疫苗组合物不产生血管变化。在第二个具体实施方式中，施用疫苗组合物不诱导出伤口愈合受损。
因此在本发明最优选的具体实施方式中，施用疫苗组合物基本无副作用。尤其是，应当与疾病严重程度相关联评估副作用的相关性。
另外如上所述，对引发出肿瘤特异性T辅助细胞免疫，即用II类-MHC限制性表位免疫，已给予越来越多的关注，而不管肿瘤通常不表达II类MHC的事实。这是基于近来的发现，即在许多情况下，疫苗诱导的抗肿瘤响应的诱导和功效需要肿瘤特异性CD4阳性的Th细胞的配合。
因此，驱动开发带有更复杂组合物的疫苗的重要因素是希望靶向于多个肿瘤抗原，这可如通过设计包含或编码一组仔细挑选出的CTL和Th细胞表位的疫苗来实现。
多表位疫苗
显然，多表位疫苗构成了有效的途径来产生抗源自几种不同抗原的表位的免疫，而不需要导入潜在有害蛋白质，如原癌蛋白，(编码这些蛋白的基因)。该疫苗也允许选择性地诱导出抗亚优势的和隐蔽的T细胞表位的免疫，其对于肿瘤相关性自身抗原的情况尤其重要，对此可存在在正常组织中显著出现的表位的耐受性。
与表位疫苗相关的一些难题包括抗原提呈细胞不能提呈某些表位。尤其是，由于抗原提呈细胞的免疫蛋白酶体和出现在大多数肿瘤细胞中的‘构成型’蛋白酶体之间的功能差异，因而可有差异地提呈在肿瘤细胞上表达的抗原。
因此鉴定适于疫苗组合物的肽包括根据实验研究测试并选择以评估包括在疫苗组合物中的不同化合物(包括疫苗组合物的抗原和佐剂成分)的功效。
因此，在另一个方面，本发明提供了疫苗组合物，其仅仅包含一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，或还适宜地包含了其他蛋白质或肽片段。在特定具体实施方式中，这些其他蛋白质或肽片段包括但不限于参与调节细胞凋亡的蛋白质或其肽片段。这些蛋白质的合适例子可选自Bcl-2蛋白家族，例如Bcl-2蛋白、Bcl-XL蛋白、Bcl-w蛋白质、Mcl-1蛋白、TRAG-3蛋白以及源自任意蛋白质的肽片段。其他已知凋亡抑制剂包括凋亡蛋白抑制剂(IAP)家族的成员，如X-IAP、C-IAP1和C-IAP2。这些蛋白质都相对普遍表达，而凋亡多肽抑制剂ML-IAP则相当选择性地表达，并主要在黑素瘤中被检测到。因此，能引发特异性T细胞应答(即细胞毒性T细胞应答或辅助T细胞应答)的ML-IAP片段可任选包括在本发明的疫苗组合物中。
ML-IAP的有用的肽片段包括ML-IAP245(RLQEERTCKV)(SEQ ID NO：24)，ML-IAP280(QLCPICRAPV)(SEQ ID NO：25)，ML-IAP90(RLASFYDWPL)(SEQ ID NO：26)，ML-IAP154(LLRSKGRDFV)(SEQ ID NO：27)，ML-IAP230(VLEPPGARDV)(SEQ ID NO：28)，ML-IAP98(PLTAEVPPEL)(SEQ ID NO：29)，ML-IAP34(SLGSPVLGL)(SEQ ID NO：30)，ML-IAP54(QILGQLRPL)(SEQ ID NO：31)，ML-IAP99(LTAEVPPEL)(SEQ ID NO：32)，ML-IAP83(GMGSEELRL)(SEQ ID NO：33)和ML-IAP200(ELPTPRREV)(SEQ ID NO：34)。
另外有益地，本发明的药物组合物可包含至少另一种免疫原性蛋白质或其肽片段，其选自不属于或源自存活蛋白蛋白质的蛋白质或肽片段。在特定具体实施方式中，免疫原性蛋白质或其肽片段源自上文和PCT/DK2004/000799所述的Bcl-2蛋白家族。另一个Bcl-2衍生的免疫原性肽是具有选自以下序列的HLA-A2限制性肽：Bcl172(NIALWMTEYL)(SEQID NO：35)，Bcl180(YLNRHLHTWI)(SEQ ID NO：36)，Bcl208(PLFDFSWLSL)(SEQ ID NO：37)和Bcl214(WLSLKTLLSL)(SEQ ID NO：38)，Bcl218(KTLLSLALV)(SEQ ID NO：39)和Bcl80(AAAGPALSPV)(SEQ ID NO：40)。
本发明的具体实施方式涉及根据本发明所述的疫苗组合物，其进一步包含一种或多种选自以下组的肽或肽变体：ML-IAP，BCL-2，BCL-X，MCL-1或TRAG-3肽(如PCT/DK2004/000798所述的)或其能结合HLA1类分子的肽变体。
另外，根据本发明所述的组合物可以上文所定义的包含I类限制性表位和/或II类限制性表位的多表位疫苗的形式提供。
剂量
预计本发明有用的疫苗组合物包含免疫有效量的存活蛋白肽或存活蛋白肽变体。
疫苗组合物中存活蛋白肽或存活蛋白肽变体的量可根据特定应用而变化。可是无论何处，免疫原的单剂量都优选是约10μg至约5000μg，更优选是约25μg至约2500μg，或如约50μg至约1000μg，或如约50μg至约500μg，或如约50μg至约250μg，或如约50μg至约200μg，或如约75μg至约150μg。在优选的具体实施方式中，免疫原的剂量是约75μg至约150μg。在最优选的具体实施方式中，剂量是约100μg。
施用
施用模式包括皮内、皮下和静脉内施用、以控制释放时间的剂型植入等。现有已知的任意和所有施用形式都包括在本文中。优选皮下施用，尤其是深度皮下施用。进一步优选根据本发明所述的疫苗组合物被施用于排流淋巴结附近的交替手或足中。
还包括现有已知适于配制成可注射用的免疫原性肽组合物的任何和所有常规的剂型，如冻干剂型和溶液、悬浮液或乳剂剂型，如果需要，其包括常规的药学上可接受的载体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲液成分等。
本发明组合物的免疫效果能够用所属领域技术人员已知的和如WO2004067023实施例所述的几种方法来确定。如何确定疫苗组合物引起的CTL应答的例子在WO97/28816中有提供。通过免疫后发生的延迟型超敏(DTH)反应和/或检测特异识别疫苗组合物的一种或多种肽的抗体也可确定成功的免疫应答。
在优选的具体实施方式中，本发明的药物组合物是能引发针对癌症性疾病的免疫应答的免疫原性组合物或疫苗。
如本文所用的表述“免疫原性组合物或疫苗”指组合物，其引发至少一种类型的针对癌细胞的免疫应答。因此，该免疫应答可以是上述任意类型的：CTL应答，其中产生能识别出现在细胞表面上的HLA/肽复合物并导致细胞裂解的CTL，即疫苗在免疫接种的受试者中引发产生具有抗癌细胞的细胞毒性效应的效应器T细胞；产生抗癌抗体的B细胞应答；和/或DTH型免疫应答。
核酸疫苗
根据本发明所述的疫苗组合物可包含核酸，其编码存活蛋白多肽(SEQID NO：23)、其肽片段或其存活蛋白肽变体。因此所述核酸可编码任意上述蛋白质和肽片段。例如，核酸可以是DNA、RNA、LNA、HNA、PNA，优选核酸是DNA或RNA。
在具体实施方式中本发明涉及疫苗组合物，其包含：
i.核酸，其编码：
    a)存活蛋白多肽(SEQ ID NO：23)，
    b)存活蛋白肽或
    c)存活蛋白肽变体。
    和
ii.任意上述佐剂。
本发明的核酸可包含于任何合适的载体(如表达载体)中。可用的有大量载体，而且技术人员将能选择出用于特定目的的载体。例如，载体可以是质粒、粘粒、病毒颗粒或人工染色体形式的。可通过各种过程将合适的核酸序列插入到载体中，例如，利用现有公知的技术可将DNA插入到合适的限制性内切酶位点中。除了根据本发明所述的核酸序列，载体可进一步包含一种或多种信号序列、复制起始点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。载体也可包含额外的序列。使用对所属领域技术人员来说是已知的标准连接技术构建包含一种或多种这些成分的合适载体。载体优选是表达载体，其包含与调节核酸序列可操作相连的核酸，所述调节核酸序列使其在合适的细胞中指导表达。在本发明的范围内，所述调节核酸序列通常应能在哺乳动物细胞中、优选人细胞中、更优选抗原提呈细胞中指导表达。
在一个优选的具体实施方式中，载体是病毒载体。所述病毒载体除了编码存活蛋白或其肽片段的核酸之外，还包含编码T细胞刺激多肽的第二核酸序列。T细胞刺激多肽优选选自由B7.1、ICAM-1和LFA-3组成的组。
载体也可以是细菌载体，如减毒细菌载体。为了在感染和存留部位诱导出持续性的粘膜免疫应答，可以使用减毒细菌载体。不同的重组细菌可用作载体，例如细菌载体可选自由沙门氏菌、乳球菌、和李斯特氏杆菌组成的组。通常，可以显示诱导针对异源抗原HPV16L1或E7的免疫，在小鼠中显示出强CTL应答诱导和肿瘤消退。
药用药物
本发明的一个方面涉及用于制备药物的根据本发明所述的疫苗组合物。在特定的具体实施方式中，药物用于治疗癌症。
在具体实施方式中，根据本发明所述的药物用于皮下施用，因此药物可配制成溶液或悬浮液，或配制成可在施用前配成悬浮液的冻干产品。
本发明进一步涉及用于治疗癌的包含疫苗组合物的药物，所述疫苗组合物包含一种或多种作为活性成分的存活蛋白肽或存活蛋白肽变体和佐剂。
治疗
在大量癌症性疾病人群中发现存活蛋白分子被下调了。包含存活蛋白肽或存活蛋白肽变体的疫苗组合物可用于治疗临床病况，如癌症性疾病。根据本发明所述的治疗包括减轻疾病症状和抑制疾病发展，由此产生下文所述的临床响应。
根据本发明所述的疫苗组合物可施用多于一次，如两次、三次、四次、五次，或如大于五次、如大于7次、如大于10次、如大于15次。用本发明疫苗组合物治疗的疾病可以是复发的或慢性的，因此为了使症状最小化并抑制疾病发展或复发，可以定期间隔来长期持续治疗。例如，要治疗的疾病可以是癌症性疾病，而且治疗可持续到或直至达到临床响应为完全消退或病情稳定、或在患者终身始终持续。
例如，在至少1个月、如至少2个月、如至少3个月、如至少5个月、如至少8个月、如至少12个月、如至少20个月中，疫苗组合物可以每14天施用一次。疫苗组合物可在受试者终身以定期间隔来施用。当检测到疾病复发或疾病发展时，可施用疫苗组合物。
在具体实施方式中，本发明涉及在受试者中刺激抗存活蛋白的强特异性T细胞应答的方法，所述方法包括：
a)提供根据本发明所述的疫苗组合物，
b)向受试者施用所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物可施用多于一次；和
c)由此刺激受试者中的强特异性T细胞应答，其中在施用疫苗组合物之前和之后通过ELISPOT试验所测得的特异性T细胞应答，是每104个PBMC细胞有超过50个肽特异性点。
在特定的具体实施方式中，在施用疫苗组合物之前和之后通过ELISPOT试验所测得的强特异性T细胞应答，是每104个PBMC细胞有超过200个肽特异性点。
在另外特定的具体实施方式中，根据本发明所述的方法可包括每个月施用所述疫苗组合物一次。
在不同的优选的具体实施方式中，疫苗组合物每2个月施用一次。
在具体实施方式中，本发明涉及治疗或预防疾病的方法，其包括；
a)提供疫苗组合物，其包含任意上述的肽并任选任意上述的佐剂，
b)向受试者施用所述疫苗组合物，其中所述疫苗组合物可施用多于一次；和
c)由此刺激受试者中的强特异性T细胞应答，其中在施用疫苗组合物之前和之后通过ELISPOT试验所测得的强特异性T细胞应答，是每104个PBMC细胞有超过50个肽特异性点。
d)在受试者中获得临床响应。
如下文涉及评估靶损伤的小节所述，来评估临床响应。
在优选的具体实施方式中，疫苗组合物用于治疗临床病况。
在本发明优选的具体实施方式中，临床病况是癌症。本文所用的术语“癌症”指涵盖了任何癌、瘤和肿瘤前疾病。例如，所述癌可选自由以下所组成的组：结肠癌、乳癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索癌、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、Wilms氏肿瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、成胶质细胞瘤、神经瘤、颅咽管瘤、神经鞘瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病和淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病和真性急性髓细胞红细胞增多症、多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、和重链病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、直肠癌、泌尿器官癌、子宫癌、口腔癌、皮肤癌、胃癌、脑瘤、肝癌、喉癌、食管癌、乳房肿瘤、儿童期不存在的急性淋巴系白血病(ALL)、胸腺ALL、B细胞ALL、急性髓细胞样白血病、骨髓单细胞样(myelomonocytoid)白血病、急性巨核细胞样(megakaryocytoid)白血病、Burkitt氏淋巴瘤、急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、和T细胞白血病、小和大的非小细胞肺癌、急性粒细胞白血病、生殖细胞肿瘤、子宫内膜癌、胃癌、头颈部的癌、慢性淋巴样白血病、毛细胞性白血病和甲状腺癌。
在具体实施方式中，根据本发明所述的疫苗组合物用于治疗选自以下组的癌；恶性黑素瘤、胰腺癌、宫颈癌或结肠癌。
在优选的具体实施方式中，根据本发明所述的疫苗组合物用于治疗恶性黑素瘤和胰腺癌。
本发明的一个方面涉及抑制血管发生的方法，其包括；
a)提供根据本发明所述的疫苗组合物
b)向受试者施用所述疫苗组合物。
需要治疗的个体是任何个体，优选地人类。肽通常将对不同的HLA分子具有不同的亲和力。因此，在本发明其中疫苗组合物或药物组合物包含存活蛋白肽的具体实施方式中，优选向给定个体施用的疫苗组合物或药物组合物将包含至少一种能与该特定个体HLA分子相关连的肽。
组合治疗
本发明还涉及用于组合治疗的药物组合物和包含组件的试剂盒。
本文所用的组合治疗表示用多于一种不同药物来治疗需要其的受试者。因此在一个方面，组合治疗可包括施用包含上文所述的疫苗组合物和第二药物的药物组合物或包含组件的试剂盒。第二药物可以是下文所述的任何药物，例如化学治疗剂或血管发生抑制剂。
组合治疗尤其可包括向个体施用化学治疗剂和/或免疫治疗剂，以及组合以一种或多种i)根据本发明所述的存活蛋白肽或存活蛋白肽变体、ii)根据本发明所述的疫苗组合物。可是，组合治疗还可包括放射治疗、基因治疗和/或外科手术。
本发明的一个方面涉及组合治疗方法，其包括同时、顺序或以任意次序分开施用：
i)根据本发明所述的疫苗组合物
ii)和第二药物。
在优选的具体实施方式中，第二药物是化学治疗剂。
例如，化学治疗剂可以是氨甲喋呤、长春新碱、亚德里亚霉素、顺铂、无糖氯乙亚硝基脲、5-氟尿嘧啶、丝裂霉素C、博莱霉素、阿霉素、氮烯咪胺、紫杉酚、fragyline、甲葡胺GLA、戊柔比星、卡氯芥和poliferposan、MM1270、BAY12-9566、RAS法尼基转移酶抑制剂、法尼基转移酶抑制剂、MMP、MTA/LY231514、LY264618/Lometexol、Glamolec、CI-994、TNP-470、Hycamtin/托泊替康、PKC412、伐司朴达/PSC833、诺消灵/Mitroxantrone、Metaret/苏拉明、巴马司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incel/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN698、TA2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP845、D2163、PD18380、DX8951f、Lemonal DP2202、FK317、Picibanil/OK-432、AD32/戊柔比星、氯化锶/锶衍生物、Temodal/替莫唑胺、Evacet/脂质体阿霉素、Yewtaxan/紫杉醇、紫杉酚/紫杉醇、希罗达/卡培他滨、氟铁龙/去氧氟尿苷、Cyclopax/口服紫杉醇、口服紫杉烷、SPU-077/顺铂、HMR1275/Flavopiridol、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS原癌基因抑制剂、BMS-182751/口服铂、UFT(替加氟/尿嘧啶)、盐酸左旋米唑/左旋米唑、恩尿嘧啶/776C85/5FU增效剂、依立替康/左旋米唑、Camptosar/依立替康、Tumodex/Ralitrexed、克拉立平/克拉屈滨、Paxex/紫杉醇、Doxil/脂质体阿霉素、Caelyx/脂质体阿霉素、Fludara/氟达拉滨、Pharmarubicin/表柔比星、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis-Naphtalimide、LU103793/多拉司他汀、Caetyx/脂质体阿霉素、健择/2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、ZD0473/Anormed、YM116、iodine seeds、CDK4和CDK2抑制剂、PARP抑制剂、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/异磷酰胺、卫萌/替尼泊甙、帕拉铂/碳铂、Plantinol/顺铂、Vepeside/鬼臼乙叉苷、ZD9331、泰索帝/多西他奇、鸟嘌呤阿拉伯糖苷的前药、紫杉烷类似物、亚硝基脲、烷化剂(如melphelan和环磷酰胺)、氨基苯乙哌啶酮、天冬酰胺酶、白消安、碳铂、Chlorombucil、盐酸阿糖胞苷、放线菌素D、盐酸道诺霉素、雌氮芥磷酸钠、鬼臼乙叉苷(VP16-213)、5-氟脱氧尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他胺、羟基脲(羟基尿素)、异磷酰胺、干扰素α-2a、α-2b、乙酸亮丙瑞林(LHRH释放因子类似物)、洛莫司汀(CCNU)、盐酸二氯甲基二乙胺(氮芥)、巯基嘌呤、巯乙磺酸钠、米托担(o.p′-DDD)、盐酸米托蒽醌、善得定、普卡霉素、盐酸甲基苄肼、链脲霉素、柠檬酸三苯氧胺、硫鸟嘌呤、硫替派、硫酸长春碱、安吖啶(m-AMSA)、阿扎胞苷、Erthropoietin、六甲蜜胺(HMM)、白细胞介素2、丙脒腙(甲基-GAG；甲基乙二醛双丙脒腙；MGBG)、喷司他汀(2′脱氧柯福霉素)、赛氮芥(甲基-CCNU)、替尼泊甙(VM-26)和硫酸长春地辛。另外，化学治疗剂可以是US6,482,843第13至18栏的表3中所述的化学治疗剂。
本发明的治疗组合物或疫苗组合物也可与其他抗癌策略联合使用，这些组合疗法能有效抑制和/或消除肿瘤生长和转移。本发明的方法可有益地与其他治疗形式一起使用，包括但不限于放射、外科手术、基因疗法和化学疗法。
血管发生时存活蛋白在内皮细胞中高表达，暗示其涉及血管内皮生长因子(VEGF)的细胞保护性作用，因此靶向表达存活蛋白的细胞可直接靶向癌细胞并进一步通过抑制血管发生而防止肿瘤生长。
通过组合用根据本发明所述的疫苗进行治疗和用血管发生抑制剂进行治疗可增强抗血管形成效果。抗血管形成疗法靶向于肿瘤脉管系统并防止肿瘤生长超过一定大小，因此在第二个优选的具体实施方式中，第二药物是血管发生抑制剂。
例如，血管发生抑制剂可以是但不限于，BMS-275291、Dalteparin(
Figure S06803736820070803D000461
)、苏拉明、2-甲氧雌甾二醇(2-ME)、撒利多胺、CC-5013(撒利多胺类似物)、考布他汀A4磷酸、LY317615(蛋白激酶Cβ抑制剂)、大豆异黄酮(染料木黄酮；大豆蛋白质分离物)、AE-941(NeovastatTM；GW786034)、抗VEGF抗体(贝伐单抗；AvastinTM)、干扰素-α、PTK787/ZK222584、VEGF-Trap、ZD6474、EMD121974、Carboxyamidotriazole(CAI)、塞来考昔(
Figure S06803736820070803D000462
)、氢溴酸卤夫酮(TempostatinTM)、AdPEDF、Macugen、色氨酰基-tRNA合成酶(TrpRS)、rhufab V2(aka lucentis)、角鲨胺、Retaane15mg(含己酸羟孕酮乙酸阿奈可他悬浮液)和白细胞介素-12。
“组合治疗”可包括将异源核酸导入到合适的细胞中，这一般被称为基因疗法。例如基因疗法可包括将肿瘤抑制剂基因或凋亡促进基因导入到肿瘤细胞中。可选地，抑制原癌基因或凋亡抑制基因表达的核酸序列可被导入到肿瘤细胞中。另外，可导入基因，其编码能给肿瘤细胞带来对化学治疗剂敏感性的酶。因此，本发明在一个具体实施方式中提供了方法，其包括通过导入基因载体来治疗癌的步骤，所述基因载体编码能将前药(即非毒性化合物)通过酶催化转化成毒性化合物的蛋白质。在本发明的方法中，治疗性核酸序列是编码产物的核酸，其中产物通过其本身或在其他药物存在的情况下导致细胞死亡。该治疗性核酸的代表性例子是编码单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶的核酸。其他例子有水痘带状疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶，其可将5-氟胞嘧啶转化成高毒性化合物5-氟尿嘧啶。
评估靶损伤
利用原WHO手册所述的报告癌治疗结果的RECIST(实体瘤中的响应评估标准)标准(世界卫生组织印刷出版物第48期；1979)，其考察测定靶损伤的最长直径(Therasse P等J.Natl.Cancer Inst.2000年2月2日；92(3)：205-16)，由此来测定治疗响应。响应被分成；完全响应、部分响应、疾病发展和病情稳定。完全响应是所有靶损伤都消失了，而部分响应指靶损伤的最长直径总和至少减少了30％。疾病发展表示靶损伤的最长直径总和至少增加了20％。病情稳定指没有以上情况出现的情况。完全响应或部分响应的持续时间，应该从刚达到测定标准的时候开始，直到疾病复发或发展被记录的第一天来加以测量。优选至少在一个患者中观察到该效果。
部分响应指响应，其中观察到了靶损伤的最长直径总和至少减少了30％。所述响应可进一步细分，其中观察到40％的部分响应、或50％的部分响应、或60％的部分响应、或70％的部分响应、或80％的部分响应、或90％的部分响应，它们分别涉及靶损伤的最长直径总和减少了至少40％、50％、60％、70％、80％或90％的治疗。
在具体实施方式中，根据本发明所述的疫苗组合物用于治疗癌症，由此达到至少30％的部分响应。
在具体实施方式中，包括施用根据本发明所述的疫苗组合物的方法用于治疗癌，并由此达到至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％或如至少90％的部分响应。
病情稳定指其中靶损伤的最长直径总和减少了30％或更少的响应，还包括其中靶损伤的最长直径总和增加了20％或更少的响应。该类响应可细分成靶损伤的最长直径总和减少30％或更少、如25％或更少、如20％或更少、如15％或更少、如10％或如5％或更少的响应，和可细分成靶损伤的最长直径总和增加20％或或更少、如15％或或更少、如10％或如5％或或更少的小组。还包括有靶损伤的最长直径总和减少或增加至多1％、如3％或如至多5％的小组。
疾病发展表示靶损伤的最长直径总和增加了至少20％。该类响应可细分成靶损伤的最长直径总和增加至多25％、如至多30％、如至多35％、如至多40％、如至多45％、或如至多50％的响应。根据本发明，如果诊断预测将增加50％，则将会造成其中靶损伤的最长直径总和增加了至多30％的疾病发展性响应的治疗视为阳性结果。因此，特定的具体实施方式包括其中响应的特征在于疾病发展性响应、而且其中靶损伤的最长直径总和增加了至多25％、如至多30％、如至多35％、如至多40％、如至多45％或如至多50％的治疗。
本发明的具体实施方式涉及治疗或预防疾病的方法，其包括；
a)提供根据本发明所述的疫苗组合物，
b)向受试者施用所述疫苗组合物
c)用于治疗癌症，和
d)其中施用所述疫苗组合物造成病情稳定、部分响应或完全消退，特征在于靶损伤的最长直径总和增加了至多20％。
实施例1中所述的数据证明了，即使在患有很晚期疾病的已经重度治疗过的患者中，在所有检查的患者中的循环淋巴细胞群中都得到了极强的存活蛋白特异性T细胞应答。如实施例1表3所见的，两个受试者(JUSC和OTSC)经历了完全消退，而在一些病例中观察到了病情稳定并在一个受试者中见到了部分响应。
包含组件的试剂盒
组合治疗包括分开、顺序或同时施用配制在一种或多种药物中的两种或更多种活性成分。为了方便使用，所述药物可包括在单一组合成的产品中或包含组件的试剂盒中。
本发明的一个方面涉及包含组件的试剂盒，其包含：
a)疫苗组合物，其包含
i.一种或多种存活蛋白肽或存活蛋白肽变体，其中肽变体的序列在整个长度与SEQ ID NO：23的连续氨基酸序列至少85％同一，
ii.和本文所述的佐剂，
b)和第二药物。
对于治疗癌症，根据本发明所述的包含组件的试剂盒中的药物可以是化学治疗剂。对于治疗免疫疾病，药物可以是免疫治疗剂。
在具体实施方式中，根据本发明所述的试剂盒中的药物包含化学治疗剂或免疫治疗剂。在优选的具体实施方式中，药物包含化学治疗剂。根据本发明，包含组件的试剂盒包含的疫苗组合物和药物用于分开、顺序或同时施用。试剂盒可进一步包含并标注有所包含的药物和疫苗组合物的合适用法/施用方法/剂量信息。
附图说明
图1.通过IFN-γELISPOT评估的胰腺癌患者PBL对存活蛋白肽Sur1M2的免疫性的动力学分析。在第一次免疫接种sur1M2/Montanide前、及其后一、三和六个月，获得患者OTSC的PBMC。用肽刺激T-淋巴细胞一次，然后将105个细胞铺板于每个孔中，含有或不含肽的都重复三个孔。利用
Figure S06803736820070803D000491
系列2.0分析仪(CTL分析仪，LLC，Cleveland，美国)为每个患者计算肽特异性点的平均数(扣除没有外加的肽的点之后)。
图2.通过IFN-γELISPOT评估的黑素瘤患者PBL对存活蛋白肽Sur1M2的免疫性的动力学分析。在第一次免疫接种sur1M2/Montanide前、及其后一、三和六个月，获得患者JUSC的PBMC。用肽刺激T-淋巴细胞一次，然后将105个细胞铺板于每个孔中，含有或不含肽的都重复三个孔。利用系列2.0分析仪(CTL分析仪，LLC，Cleveland，美国)为每个患者计算肽特异性点的平均数(扣除没有外加的肽的点之后)。
图3.通过IFN-γELISPOT评估的黑素瘤患者PBL对存活蛋白肽Sur1M2的免疫性的动力学分析。在第一次免疫接种sur1M2/Montanide前、及其后一和四个月，获得患者SIST的PBMC。用肽刺激T-淋巴细胞一次，然后将105个细胞铺板于每个孔中，含有或不含肽的都重复三个孔。利用
Figure S06803736820070803D000501
系列2.0分析仪(CTL分析仪，LLC，Cleveland，美国)为每个患者计算肽特异性点的平均数(扣除没有外加的肽的点之后)。
实施例
实施例1
使用包含存活蛋白衍生表位和作为佐剂的montanide ISA 51的疫苗组合物的临床结果。对一系列下文所述的晚期癌症患者进行治疗。
所有临床试验都遵照赫尔辛基宣言进行，治疗前所有患者都知情同意。临床研究被德国的Würzburg大学(研究号7/03)和德国Langen的Paul-Ehrlich研究所(草案号0899/01)的伦理评价委员会批准。
患者
参与本研究的合格患者必须满足以下标准：
·可测到的转移性黑素瘤、胰腺、结肠或宫颈癌
·已证实的疾病缓慢发展
·至少一次标准治疗失败了
·期望寿命至少还有3个月
·在过去4周内未进行治疗
·没有明显的器官衰竭
·I类组织类型HLA-A1、-A2或-B35
肽
包括在本研究中的肽都是存活蛋白肽变体，其由替换一个氨基酸而从存活蛋白肽修饰而得。从而获得给定肽对MHC分子的更好的锚定残基和改善的结合亲和力。所用的肽包括：
·HLA-A1限制性表位FTELTLGEF(SEQ ID NO：16)(存活蛋白93-1012T，其中第2位上的天然谷氨酰胺被苏氨酸替代)。
·HLA-A2限制性表位LMLGEFLKL(SEQ ID NO：5)(存活蛋白96-1042M，其中第2位上的天然苏氨酸被甲硫氨酸替代)。
·HLA-B35限制性表位EPDLAQCFY(SEQ ID NO：9)(存活蛋白51-599Y，其中第9位上的亮氨酸被酪氨酸替代)。
根据制造商(Seppic，Brussels，比利时)的说明，将100μg HLA-A1、HLA-A2或HLA-B35限制性存活蛋白肽与1ml Montanide ISA51混合。混合物通过在排流淋巴结邻近处施用，深度皮下轮流注射入手或足中。患者以7天间隔进行前两次免疫接种，然后以28天的间隔进行其他免疫接种。
评估毒性、临床功效和免疫应答。
毒性通过体检/病史、血液学测试和血清化学来评估。每次免疫接种前进行这些检查。
临床功效在治疗开始前及其后每隔3个月通过体检和合适的成像研究(如CT扫描、NMR扫描、胸腔X射线、超声或骨闪烁扫描)来评估。
免疫学应答通过ELISPOT试验监测，其利用PBMC检测存活蛋白96-104特异性IFN-γ释放。为了增加ELISPOT试验的灵敏度，在有10μM肽存在下、以24孔板(Nunc，丹麦)上每ml X-vivo培养基(Bio Whittaker，Walkersville，Maryland)有1×106个细胞的浓度体外刺激PBMC一次，所述培养基添加有5％热失活的人血清和2mM L-谷氨酰胺。2天后，加入40IU/ml重组白细胞介素-2(IL-2)(Chiron，Ratingen，德国)。10天后，测试细胞反应性。简而言之，硝化纤维底的96孔板(MultiScreen MAIP N45，Millipore，Hedehusene，丹麦)用抗IFN-γ抗体(1-D1K，Mabtech，Nacka，瑞典)包被。洗孔，用X-vivo培养基封闭，然后加入104个刺激性T2细胞(含有或不含10μM肽)和不同浓度的效应器细胞。孵育板过夜。第二天弃去培养基并洗板，然后加入生物素化的第二抗体(7-B6-1-生物素，Mabtech)。孵育板2小时，洗涤并向每个孔加入抗生物素蛋白-酶缀合物(AP-抗生物素蛋白，Calbiochem，Life Technologies)。在室温孵育板1小时并向每个孔加入酶底物NBT/BCIP(Gibco，LifeTechnologies)，在室温孵育5-10分钟。一旦出现深紫色点，用自来水洗涤以终止反应。用
Figure S06803736820070803D000511
系列2.0分析仪(CTL分析仪，LLC，Cleveland，美国)计数点的个数，肽特异性CTL频率可通过形成点的细胞数来计算。针对每个肽抗原的所有试验进行三次。
结果
使用存活蛋白肽得到的临床结果的概述包括；患者简称、免疫接种次数和临床响应，其在表3中有概括。
 
患者 出生日期 诊断结果 HLA类型 免疫接种次数 正在进行研究 终止日 退出 临床应答
AGSC 28.05.26 MM A2 2 X
ALKA 19.04.36 MM A2 5 22.10.03 X
BRHI 27.08.34 MM A2 5 X SD
CHPF 18.12.34 MM A2 12 X PR
CHPF 18.12.34 MM B35 1 X
EREI 04.05.55 MM A2 5 08.10.03 X
HAKO 27.02.63 MM A1 2 X
JUSC 03.01.57 MM A2 16 X CR
MAKR 20.08.40 MM B35 3 X
OSRO 11.07.35 MM A2 4 05.08.04
OTSC 10.05.29 PC A2 15 X CR
REPA 27.09.45 MM A2 4 19.04.04
SIST 08.02.34 MM A2 7 30.03.04 SD
WESE 23.07.42 MM A2 5 X SD
表3.正在进行的临床试验结果。
转移性黑素瘤(MM)、胰腺癌(PC)。完全响应(complete response)(CR)、部分响应(partial response)(PR)、病情稳定(stable disease)(SD)和疾病发展(progressive disease)(PD)。
毒性：没有观察到治疗诱导出的副作用。在注射部位上没有观察到全身性或局部毒性症候。特别关注血管变化的症候，例如脉管炎或伤口愈合受损。血色素、白细胞和血小板以及乳酸脱氢酶、肌酸酐和胆碱酯酶并不被免疫接种所影响(数据未显示)。因此，没有检测到血管变化的临床或组织学症候。另外，没有伤口愈合受损、出血症、心脏失调、脉管炎或炎性肠病的症候出现。因此，免疫接种存活蛋白对保持正常的造血作用的癌症患者来说是能耐受的并是安全的。
临床功效：在该组预后相当不利的患者中出现客观的临床响应。响应包括在一些患者中肿瘤内脏转移的完全消退，但大多数为病情稳定。显著的是，尽管患者对之前的化疗(分别用
Figure S06803736820070803D000521
或
Figure S06803736820070803D000522
)响应失败，但在这两个诊断出患有皮肤黑素瘤(JuSc)和胰腺腺癌(OtSc)的患者中分别产生了完全的肿瘤消退(表3)。因此，临床结果证实了其是非常成功的完整治疗，其有异乎寻常高的响应率和临床功效。
存活蛋白特异性CD8+T细胞应答。
追踪患者中的细胞毒性T细胞应答的动力学情况。通过针对IFN-γ的ELISPOT，测试免疫接种之前和之后获得的PBMC对修饰的存活蛋白96-104表位的反应性。在所有测试的患者中，明显诱导出了存活蛋白反应性的T细胞。对于两个完全应答的患者OtSc(患有胰腺癌)和JuSc(患有黑素瘤)，在免疫接种前和免疫接种开始后一、三和六个月分析PBL。在患者OtSc中，免疫接种试验开始后一个月就已经出现了强应答。该应答在三和六个月后更强了。因此，可以检测到每104个中有大于600个存活蛋白特异性细胞(图1)。在患者JuSc中，直到六个月后才观察到应答(图2)，可在此时，它与患者OtSc中的一样强。另外，我们在免疫接种前和免疫接种试验开始后一和四个月，分析了黑素瘤患者SiSt的PBL。在患者SiSt中，在免疫接种四个月后，观察到了强应答(图3)。最终，分析两名非常晚期的黑素瘤患者(AlKa和ErEi)的PBL，这两名患者在他们因疾病死亡前仅能接受四次免疫接种。在这两个患者中，也诱导出了抗存活蛋白肽的应答(数据未显示)。数据证实了，即使在这些患有非常晚期疾病的重度治疗过的患者中，也在所有检查的患者中的循环淋巴细胞群内获得了极强的存活蛋白特异性T细胞应答。因此，在对从免疫的患者中得到的PBL进行一次体外刺激之后，观测到了每104个细胞有大于250个释放INF-γ的细胞，而在特定实施例中有大于600个释放INF-γ的细胞。
实施例2
免疫组织化学染色
将生物素化的肽/HLA复合物与链霉抗生物素蛋白-FITC-缀合葡聚糖分子(DAKO，Glostrup，丹麦)多聚化以产生多价HLA-葡聚糖化合物，进行免疫组织化学分析。组织切片干燥过夜，并接着在冷的丙酮中固定5分钟。于室温在暗处进行所有孵育步骤：(a)初级抗体(1：100稀释度)进行45分钟(b)Cy3-缀合的羊抗小鼠抗体(1：500稀释度；编号115-165-100；Jackson ImmunoResearch，得自Dianova，Hamburg，德国)进行45分钟；并最终(c)用多聚物进行75分钟。在每一步之间，用PBS/0.1％BSA洗载玻片2次，每次10分钟。切片用盖玻片盖好，并保存在冰箱中直至用共聚焦显微镜(Leica)检查。
序列表
<110>萨瓦克公司(Survac ApS)
<120>存活蛋白肽疫苗
<130>P984PC00
<160>118
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白101-109
<400>1
Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala
1              5
<210>2
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>存活蛋白5-14
<400>2
Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu
1               5                   10
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>存活蛋白95-104
<400>3
Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
1               5                   10
<210>4
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白96-104L2
<400>4
Leu Leu Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
1               5
<210>5
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白96-104M2
<400>5
Leu Met Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu
1               5
<210>6
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白46-54
<400>6
Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu
1               5
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白51-59
<400>7
Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe
1               5
<210>8
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白46-54Y9
<400>8
Cys Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Tyr
1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白51-59Y9
<400>9
Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Tyr
1               5
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白6-14
<400>10
Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu
1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白11-19
<400>11
Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile
1               5
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>存活蛋白34-43
<400>12
Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe
1               5                   10
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白6-14A1
<400>13
Ala Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu
1               5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白6-14R1
<400>14
Arg Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu
1               5
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>存活蛋白92-101
<400>15
Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe
1               5                   10
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白93-101T2
<400>16
Phe Thr Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe
1               5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(9)
<223>存活蛋白38-46Y9
<400>17
Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Tyr
1               5
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>存活蛋白47-56Y10
<400>18
Pro Thr Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Tyr
1               5                   10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>存活蛋白53-62
<400>19
Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys
1               5                   10
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(10)
<223>存活蛋白18-27K10
<400>20
Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Lys
1               5                   10
<210>21
<211>11
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(11)
<223>存活蛋白18-28
<400>21
Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu
1               5                   10
<210>22
<211>429
<212>DNA
<213>人(homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(426)
<400>22
atg ggt gcc ccg acg ttg ccc cct gcc tgg cag ccc ttt ctc aag gac    48
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1               5                   10                  15
cac cgc atc tct aca ttc aag aac tgg ccc ttc ttg gag ggc tgc gcc    96
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
            20                  25                  30
tgc acc ccg gag cgg atg gcc gag gct ggc ttc atc cac tgc ccc act    144
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
        35                  40                  45
gag aac gag cca gac ttg gcc cag tgt ttc ttc tgc ttc aag gag ctg    192
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
    50                  55                  60
gaa ggc tgg gag cca gat gac gac ccc ata gag gaa cat aaa aag cat    240
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65                  70                  75                  80
tcg tcc ggt tgc gct ttc ctt tct gtc aag aag cag ttt gaa gaa tta    288
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
                85                  90                  95
acc ctt ggt gaa ttt ttg aaa ctg gac aga gaa aga gcc aag aac aaa    336
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
            100                 105                 110
att gca aag gaa acc aac aat aag aag aaa gaa ttt gag gaa act gcg    384
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
        115                 120                 125
aag aaa gtg cgc cgt gcc atc gag cag ctg gct gcc atg gat tga        429
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
    130                 135                 140
<210>23
<211>142
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>23
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1               5                   10                  15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
            20                  25                  30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
        35                  40                  45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
    50                  55                  60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65                  70                  75                  80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
                85                  90                  95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
            100                 105                 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
        115                 120                 125
Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
    130                 135                 140
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>24
Arg Leu Gln Glu Glu Arg Thr Cys Lys Val
1               5                   10
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>25
Gln Leu Cys Pro Ile Cys Arg Ala Pro Val
1               5                   10
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>26
Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp Trp Pro Leu
1               5                   10
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>27
Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe Val
1               5                   10
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>28
Val Leu Glu Pro Pro Gly Ala Arg Asp Val
1               5                   10
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>29
Pro Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu
1               5                   10
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>30
Ser Leu Gly Ser Pro Val Leu Gly Leu
1               5
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>31
Gln Ile Leu Gly Gln Leu Arg Pro Leu
1               5
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>32
Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu
1               5
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>33
Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu
1               5
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>人(homo sapiens)
<400>34
Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Val
1               5
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>合成的序列
<400>35
Asn Ile Ala Leu Trp Met Thr Glu Tyr Leu
1               5                   10
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>合成的序列
<400>36
Tyr Leu Asn Arg His Leu His Thr Trp Ile
1               5                   10
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>合成的序列
<400>37
Pro Leu Phe Asp Phe Ser Trp Leu Ser Leu
1               5                   10
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>合成的序列
<400>38
Trp Leu Ser Leu Lys Thr Leu Leu Ser Leu
1               5                   10
<210>39
<211>9
<212>PRT
<213>合成的序列
<400>39
Lys Thr Leu Leu Ser Leu Ala Leu Val
1               5
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>合成的序列
<400>40
Ala Ala Ala Gly Pro Ala Leu Ser Pro Val
1               5                   10
<210>41
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>Sur 20-28
<400>41
Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu
1               5
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>Sur115Y10
<400>42
Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Tyr
1               5                   10
<210>43
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>Sur36-44
<400>43
Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile
1               5
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>Sur133-141
<400>44
Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met
1               5
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>45
Asp Val Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys
1               5                   10
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>46
Asp Phe Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys
1               5                   10
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>47
Asp Ile Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys
1               5                   10
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>48
Ser Tyr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu
1               5
<210>49
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>49
Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile
1               5
<210>50
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>50
Arg Pro Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met
1               5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>51
Thr Pro Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile
1               5
<210>52
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>52
Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys
1               5
<210>53
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>53
Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile
1               5
<210>54
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>54
Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys
1               5
<210>55
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>55
Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Leu
1               5
<210>56
<211>8
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>56
Glu Arg Ala Glu Ala Gly Phe Phe
1               5
<210>57
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>57
Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Arg
1               5
<210>58
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>58
Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Lys
1               5
<210>59
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>59
Lys Arg Phe Glu Glu Thr Ala Lys Lys
1               5
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>60
Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe
1               5                   10
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>61
Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu
1               5
<210>62
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>62
Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Tyr
1               5
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>63
Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu
1               5                   10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>64
Ile Ser Lys Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu
1               5                   10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>65
Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
1               5                   10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>66
Leu Ser Lys Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
1               5                   10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>67
Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Thr
1               5                   10
<210>68
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>68
Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Lys Glu Leu
1               5                   10
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>69
Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr
1               5                   10
<210>70
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>70
Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Leu
1               5                   10
<210>71
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>71
Gln Pro Lys Leu Lys Asp His Arg Ile
1               5
<210>72
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>72
Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr
1               5
<210>73
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>73
Phe Leu Lys Asp Lys Arg Ile Ser Thr
1               5
<210>74
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>74
Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Leu
1               5
<210>75
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>75
Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe
1               5
<210>76
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>76
Ala Phe Lys Ser Val Lys Lys Gln Phe
1               5
<210>77
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>77
Al a Phe Leu Ser Lys Lys Lys Gln Phe
1                5
<210>78
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>78
Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Leu
1               5
<210>79
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>79
Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu
1               5
<210>80
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>80
Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Leu
1               5
<210>81
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>81
Phe Leu Lys Val Lys Lys Gln Phe Glu
1               5
<210>82
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>82
Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
1               5
<210>83
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>83
Ser Val Lys Lys Lys Phe Glu Glu Leu
1               5
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>84
Phe Leu Lys Leu Lys Arg Glu Arg Ala
1               5
<210>85
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>85
Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Leu
1               5
<210>86
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>86
Thr Ala Lys Lys Lys Arg Arg Ala Ile
1               5
<210>87
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>87
Thr Ala Lys Lys Val Arg Arg Ala Leu
1               5
<210>88
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>88
Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe
1               5
<210>89
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>89
Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Tyr
1               5
<210>90
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>90
Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile
1               5                   10
<210>91
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>91
Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Tyr
1               5                   10
<210>92
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>92
Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe
1               5                   10
<210>93
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>93
Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Tyr
1               5                   10
<210>94
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>94
Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe
1               5                   10
<210>95
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>95
Arg Leu Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe
1               5                   10
<210>96
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>96
Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe
1               5
<210>97
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>97
Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Tyr
1               5
<210>98
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>98
Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe
1               5
<210>99
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>99
Ile Gln Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe
1               5
<210>100
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>100
Ile Leu Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe
1               5
<210>101
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>101
Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile Tyr
1               5
<210>102
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>102
Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile Phe
1               5
<210>103
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>103
Arg Leu Ala Glu Ala Gly Phe Ile Tyr
1               5
<210>104
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>104
Lys Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe
1               5
<210>105
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>105
Lys Gln His Ser Ser Gly Cys Ala Phe
1               5
<210>106
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>106
Lys Leu His Ser Ser Gly Cys Ala Phe
1               5
<210>107
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>107
Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Tyr
1               5
<210>108
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>108
Arg Leu Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met
1               5
<210>109
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>109
Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe
1               5                   10
<210>110
<211>11
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>110
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe
1               5                   10
<210>111
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>111
Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe
1               5
<210>112
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>112
Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp
1               5
<210>113
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>113
Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe
1               5                   10
<210>114
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>114
Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe
1               5                   10
<210>115
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>115
Cys Ala Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala
1               5
<210>116
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>116
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala
1               5
<210>117
<211>9
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>117
Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys Thr Pro
1               5
<210>118
<211>10
<212>PRT
<213>合成的肽
<400>118
Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala Cys Thr
1               5                   10

Claims (4)

1.用作药物的疫苗组合物，其包括：
i.一种存活蛋白肽，其由SEQ ID NO：5组成，和
ii.Montanide ISA 51佐剂。
2.权利要求1的疫苗组合物，其包含：
i.核酸，其编码SEQ ID NO：5，
和
ii.Montanide ISA 51佐剂。
3.权利要求1-2任一项所表征的疫苗组合物用于制备治疗转移性黑素瘤的药物的用途。
4.权利要求1-2任一项所表征的疫苗组合物用于制备治疗胰腺癌的药物的用途。
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