KR20190057345A - 암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체 - Google Patents

암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체 Download PDF

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마디하 데로우아지
엘로디 벨노위
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아말 테라퓨틱스 에스에이
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Abstract

본 발명은 a) 세포 투과 펩타이드, b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 및 c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 암 예방 및/또는 치료에 사용되기 위한 복합체를 제공하며, 여기서 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합되어 있다. 특히, 약학 조성물 및 백신과 같은 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 조성물이 제공된다.

Description

암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체
본 발명은 백신 분야, 특히 결장직장암(CRC)의 예방 및/또는 치료를 위한 백신에 관한 것이다.
결장직장암(CRC)은 전 세계적으로 흔하고 치명적인 질병으로서, 세 번째로 흔히 진단되는 암이고, 남성의 경우 3번째, 여성의 경우 2번째로 발생하며, 2012 년에 136만 건의 새로운 사례와 약 694,000건의 사망이 발생하였다. CRC 발생 위험은 인간, 환경 및 유전적 요인에 의해 영향을 받는다(Cancer, I.A.f.R.o. GLOBACAN 2012. 2012 [2015년 7월 5일 인용됨]; 다음으로부터 이용가능: http://globocan.iarc.fr/Pages/burden_sel.aspx). CRC 발병률은 여성보다 남성에서 더 두드러지지만, 연령 및 라이프 스타일에 의해 더 현저한 영향을 받는다. 실제로 CRC로 진단된 환자의 90% 이상이 50세 이상으로서(Prevention, C.f.D.C.a. What Are the Risk Factors for Colorectal Cancer? 2015 [2015년 7월 5일 인용됨]), 케이스의 2/3가 선진국에서 발생했다. 보통 비만으로 이어지는 일반적인 육류 소비, 보다 구체적으로 붉은 육류 또는 알코올성 음료의 섭취가 CRC의 위험을 현저하게 증가시킨다는 증거가 있다(Stewart, B. and C. Wild, World Cancer Report 2014, B. Stewart and C. Wild, Editors. 2014, International Agency for Research on Cancer: Geneva). 결장직장암 발병의 위험성에 영향을 미치는 다른 두 가지 요인은 유전성 및 염증성 장 질환이다. 가족성 대장 용종증(FAP)은 예를 들어 50세 미만의 사람들에 대하여 CRC의 위험을 현저하게 증가시킨다(Burt, R.W., J.A. DiSario, and L. Cannon-Albright, Genetics of colon cancer: impact of inheritance on colon cancer risk. Annu Rev Med, 1995. 46: p. 371-9). MAP (MUTYH-관련 폴립증)과 같은 FAP(Sieber, O.M., et al., Multiple colorectal adenomas, classic adenomatous polyposis , and germ-line mutations in MYH . N Engl J Med, 2003. 348(9): p. 791-9) 또는 린치 증후군(Lynch, H.T., et al., Genetics, natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cancer: an updated review. Gastroenterology, 1993. 104(5): p. 1535-49)은 병인성(predispose) 환자가 다발성 결장 선종의 유전을 일으키는 유전자 변이와 관련이 있다(Dennis J Ahnen, D.M., FA. Colorectal cancer: Epidemiology, risk factors, and protective factors. 2015 [2015년 7월 9일에 인용됨]; 다음으로부터 이용가능: http://www.uptodate.com/contents/colorectal-cancer-epidemiology-risk-factors-and-protective-factors). CRC를 발병할 때 궤양성 대장염이나 크론병과 같은 질병의 영향이 잘 문서화되어 있다. 궤양성 대장염의 영향은 예를 들어 위험도가 3 내지 15배까지 증가하는 것과 관련이 있다(Ekbom, A., et al., Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study. N Engl J Med, 1990. 323(18): p. 1228-33). 크론병에 대한 데이터가 적게 존재하지만, 유사한 위험이 이 질환과 관련되어 있다. CRC, 선종성 용종증 또는 염증성 장질환과 관련하여 가족력이 있는 환자의 경우, 조기 선별 검사가 강력히 권장된다(Jemal, A., et al., Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011. 61(2): p. 69-90).
많은 암에서와 마찬가지로, CRC 환자의 생존 시간은 질병 발달 단계에 의존한다. 초기 단계(0, I 및 II기)의 환자는 좋은 예후를 보인다(75% 이상). III기는 말초 조직 상의 종양 침범에 따라 더 많은 이종 생존율(90%로부터 50%까지)을 가진다. 마지막으로 오직 IV기만이 환자 생존 시간에 빠르고 현저한 영향을 나타낸다: 오직 환자의 약 10%만이 진단 후 60개월 이상 생존할 것이다.
기존의 치료법은 일반적으로 잘 확립된 화학요법, 방사선 요법 및/또는 표적 치료가 뒤따르거나 또는 그렇지 아니한 수술에 기반한다(Moertel, C.G., Chemotherapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 1994. 330(16): p. 1136-42; Meyerhardt, J.A. and R.J. Mayer, Systemic therapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 2005. 352(5): p. 476-87). 질병 진행 단계에 따라, 기존 치료법은 진단 후 2년 동안 30% 내지 95%의 생존율을 허용한다. 초기 단계의 모든 CRC 치료 전략은 추가 요법과 조합되거나 또는 그렇지 않은 수술로 시작된다. 추가 치료 요법에 대한 결정은 예비 스크리닝 결과 동안에 확인된 질병 진행 단계에 의존한다. 진행된 CRC의 경우, 일반적으로 1차 치료법으로서 화학요법 또는 표적 치료법의 사용이 추천된다. 가장 일반적으로 사용되는 요법은 FOLFOX, CapeOX 또는 FOLFIRI이다. 이러한 치료법은 VEGF(제넨테크 베바시주맙/아바스틴® 또는 레제네론-사노피 애플리버셉트/잘트랩®) 또는 EGFR(머크-세로노 세툭시맙/어비툭스®)를 표적으로 하는 상기와 같은 권장 생물 약제 중 하나와 함께 조합으로 사용될 수 있다. 다른 표적 치료법은 독립형 1차 치료제로 제안될 수 있다. 암젠(Amgen)의 EGFR 단일 클론 항체(파니투무맙/벡티빅스®)와 더 최근에는 바이엘의 소분자 키나아제 억제제 레고라페닙(스티바가®)이 전체 CRC 환자의 생존 기간을 증가시킬 수 있는 능력을 보여주었다. 질병이 이미 다른 기관으로 중요하게 퍼진 경우, 엘라이 릴리(Eli Lilly)의 VEGF 단일 클론 항체 라무시루맙(시람자®)을 사용할 수도 있다. 4기의 경우, 통증과 같은 증상을 완화하기 위해 방사선을 사용할 수도 있다.
비록 CRC 화학요법이 잘 확립되었지만(Moertel, C.G., Chemotherapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 1994. 330(16): p. 1136-42), 보다 효과적이고 2차적인 영향을 덜 받는 전략을 향한 추진력은, 다시 말해 4기 CRC에 대하여, 지난 수십년 간 중요하게 진전되었다(Gallagher, D.J. and N. Kemeny, Metastatic colorectal cancer: from improved survival to potential cure. Oncology, 2010. 78(3-4): p. 237-48). 첫 번째 시도는 보완적인 어쥬번트 요법을 향해 진행되었다. 그러나 수년 후에, 수술 후 5-FU 기반 요법의 가치는, 특히 II기 CRC 환자에서, 논쟁으로 남아있다(Meyerhardt, J.A. and R.J. Mayer, Systemic therapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 2005. 352(5): p. 476-87).
그 맥락에서, 면역 요법은 신중하게 평가되었다. 면역 시스템은 종양 세포를 인지하고 어느 정도 제거할 수 있으나, 하지만, 이 항-종양 반응은 강도가 약하고 비효율적이다. 이 약한 항-종양 반응을 치료 백신과 함께 강화하는 것은 암 요법의 긴 숙원이다. 면역 반응을 강화하는 면역 시스템 변화는 표준 치료법과 조합될 수 있기 때문에 따라서 종양학에서의 유망한 치료 접근법이 되었다.
최근 FDA의 시풀류셀(Sipuleucel)-T 백신 및 항-CTLA-4 항체에 대한 승인을 포함하는, 유망한 전임상 데이터 및 임상 시험 발달은 능동 면역은 일정한 암 유형에 대한 안전하고 실현 가능한 치료 양식이라는 것을 보여주었다. 면역 반응 매개하는 종양-특이적 세포독성 T 림프구(CTLs)의 유도는 변형된 종양 세포 백신, 펩타이드 백신, 재조합 바이러스성 벡터, DNA, 단백질, 또는 수상돌기 세포 백신을 포함하는 다른 접근법을 사용하는 것으로 보고되었다. 하지만, CTLs에 의하여 매개되는 항-종양 면역성은 오직 가끔씩만 종양 감소와 연관되고 몇 안 되는 연구만이 3상 임상 단계에 도달하였다.
전체적으로, 암 백신은 지금까지 매우 제한된 임상 효능을 보였다. 정말로, 2011년 말에, 300개의 진행 중인 암 백신 임상 시험 중 오직 19개 3상 임상 시험이 보고되었다(globaldata, 2012). 이들 중, 누박스(NeuVax), 유방암에 대한 펩타이드 백신, 스티뮤박스(Stimuvax), 유방암 및 비소세포 폐암(Non-Small Cell Lung Carcinoma, NSCLC)에 대한 리포좀 기반의 백신, TG4010, 비소세포 폐암 및 GSK1572932A, 비소세포 폐암을 위한 보고 리포좀이 있다. 이들 네 개의 암 백신은 상이한 기술에 기초하고 한 개의 단독 항원을 표적하는 점에서 공통된다.
암 치료 백신은 두 가지의 주요 카테고리로 나누어질 수 있다: 개별화(personalized, 자가(autologous)) 및 표준화(standardized) 백신, 그리고 기술 플랫폼에 따라 더욱 분류된다. 현재 개별화 백신은 종양 용해 백신은 물론 수상돌기 세포에 기반 백신(이하 세포 기반)을 포함한다. 후자에서, 항원 탑재(loading)는 종양 용해물을 사용해 펄스하거나, 종양으로부터 추출된 RNA를 전달 감염하는 동안 발생한다. 이 경우, 항원은 종양 특이적 또는 연관되어 있으나, 정확하게 규정되지는 않았다. 수상돌기세포는 또한 규정된 항원으로 펩타이드 펄스하거나 또는 프로벤지(Provenge)® 백신을 조작하는데 사용되는 프로스타틱 애시드 포스페이트(Prostatic Acid Phosphatase, PAP)와 같은 단백질을 사용하여 탑재될 수 있다. 하지만, 이들 세포-기반 치료의 제조 과정은 시간이 소요되고 노동 집약적인 것에 비하여 품질 기준에 도달하고 유지하기는 어렵다. 면역관측(Immunomonitoring)은 부가 합병증을 만들어 낸다. 게다가, 상기 자가 암 백신의 대다수는 관리되기 위하여 사용되는 항원에 대한 정체 및 수량을 가능하게 하지 않고, 이는 규정되고 표준화된 백신과 다르다.
세포-기반 요법(cell-based therapy)(APCs, T 세포, CARs, 용해물(lysates))과 달리, 서브 유닛 백신(subunit vaccine, 단백질 또는 펩타이드들)들은 보다 쉬운 생산 및 넓은 범위의 환자에 투여할 수 있도록 유의적으로 향상된 배치간 재현성을 갖는 표준화된 백신을 허용한다. 뿐만 아니라, 항원은 충분히 규정되어 보다 우수한 면역-관측을 허용하고 백신 성분의 원치 않는 영향에 대한 위험을 줄인다.
전임상 및 임상 개발에서 평가된 상이한 접근법은 짧은 펩타이드 백신(Slingluff CL, Jr. The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination? Cancer journal 2011;17(5):343-50), 긴-펩타이드 백신(Melief CJ, van der Burg SH. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nature reviews Cancer 2008;8(5):351-60) 및 단백질을 포함한다. 긴 펩타이드 및 단백질 백신과 달리, 짧은 펩타이드 백신은 매우 짧은 반감기를 가지고 면역 반응에 부정적인 결과를 가질 수 있다.
단백질-기반 백신을 위해, MAGE-A3를 재조합 융합 단백질-기반 백신으로 표적한 결과가 전이성 흑색종(Kruit WH, Suciu S, Dreno B, Mortier L, Robert C, Chiarion-Sileni V, et al. Selection of immunostimulant AS15 for active immunization with MAGE-A3 protein: results of a randomized phase II study of the European Organisation for Research and Treatment of Cancer Melanoma Group in Metastatic Melanoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2013;31(19):2413-20) 및 비소세포 폐암(NSCLC)(Vansteenkiste J, Zielinski M, Linder A, Dahabreh J, Gonzalez EE, Malinowski W, et al. Adjuvant MAGE-A3 immunotherapy in resected non-small-cell lung cancer: phase II randomized study results. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 2013;31(19):2396-403)에서의 유망한 2상 데이터 이래로 의욕적으로 기다려졌다. 하지만, 흑색종에서의 2013년 임상 3상 DERMA 연구(NCT00796445)는 그의 최초 주요 유효성 평가 변수(Co primary endpoint)에 도달하지 못했고, 이후 2014년에는 임상 3상 MAGRIT 연구(NCT00480025)이 종료되었다. 매우 부정적인 이들 임상 결과들에도 불구하고, 단백질 기반 백신은 많은 장점들이 부정할 수 없도록 존재한다.
또한 결장직장암의 맥락에서, 종양 면역학에서의 과학적 진보는 세포 및 체액 경로를 통한 항-종양 면역 반응의 더 나은 이해를 이끌어냈고(Smith, C.L., et al., Immunotherapy of colorectal cancer. Br Med Bull, 2002. 64: p. 181-200; Koido, S., et al., Immunotherapy for colorectal cancer. World J Gastroenterol, 2013. 19(46): p. 8531-42), 종양 항원을 더 잘 규명하는데 도움을 주었다. 이러한 진보는 CRC에서 면역 요법에 대한 새로운 시각을 열었다. 항체와 같은 수동 면역 요법이 CRC 치료의 첫 번째 표적 치료제로서 입증되었다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 통한 종양 성장 경로와 상호 작용하거나 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 억제할 수 있는 그들의 능력 덕택에, 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab) 및 베바시주맙(bevacizumab)과 같은 항체는 각각 2004년, 2006년 및 2009년에 CRC 치료를 위한 FDA 승인을 받았다.
CRC를 위한 입양 세포 전이(Adoptive cell transfer; ACT) 임상 시험은 불행히도 지금까지 나쁜 결과를 돌려줬다. 실제로 비-조작 및 조작된 T 세포 치료 둘 모두에 대한 제한된 환자 군집이 주요 장애물인 것으로 보인다. 유사하게, 키메라 항원 수용체(CAR)와 융합된 T 세포로 치료된 환자에서 관찰된 2차 효과는, ACT를 안전하고 효과적인 치료로서 입증하는데 실패하였다(Koido, S., et al., Immunotherapy for colorectal cancer. World J Gastroenterol, 2013. 19(46): p. 8531-42; Xiang, B., et al., Colorectal cancer immunotherapy . Discov Med, 2013. 15(84): p. 301-8). 따라서 실현 가능성과 비용 및 면역 반응 메모리 측면에서의 일반적인 ACT 단점에 추가되어, 당분간 ACT 옵션이 차단되는 것으로 보인다.
보다 최근에 애플리버셉트(aflibercept)에 대한 환자 생존에 대한 긍정적인 3상 임상 시험의 결과로, 이 항-VEGF 융합 단백질이 전이성 결장직장암(mCRC)에 대해 FDA의 승인을 받았다(Clarke, J.M. and H.I. Hurwitz, Ziv - aflibercept : binding to more than VEGF -A--does more matter? Nat Rev Clin Oncol, 2013. 10(1): p. 10-1). 이 표적 치료 승인은 비-항체 면역 요법을 위한 길을 열어준다. 지금까지 CRC에 대해 승인된 활성 면역 요법이나 면역 조절제가 없었다. 구조적으로 CRC를 위하여 시험되는 분자들의 대다수는 소분자인데, 일반적로 키나아제 저해제 또는 항체(각각 52%와 28%)이다.
일반적으로, 치료 암 백신은 그들의 면역 시스템이 종양 세포를 인지하고 죽일 수 있는 능력을 강화하도록 암 환자들에게 투여된다. 치료 암 백신의 주요 목적은 종양 세포에 특이적인 살해 T 세포(killer T cells, 세포독성 T 림프, 또한 cytotoxic T lymphocyte라고 함)를 발생시키는 것이다. 이것을 위하고 강력한 면역 반응을 달성하기 위하여, 백신은 암 면역성이 개시될 수 있도록 종양에 존재하고 또한 항원 제시 세포(Antigen Presenting Cells, APCs), 특별히 수지상 세포(dendritic cells, DCs)에 전달되어야 하는, 항원을 포함하여야 한다. 상기 수지상 세포는 이들 종양 항원을 세포 표면 발현된 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II 위에서 T 세포에게 제시되는 작은 펩타이드로 가공한다. T세포에 의하여 인지되고 그렇게 함으로써 그들의 자극을 유도하는 펩타이드는 에피토프라고 불리운다. MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자에 의한 제시는 두 가지 클래스의 T 세포, CD8 + 세포독성 T 림프구(CTLs) 및 CD4 + 도움 T(helper, Th) 세포, 개별적으로, 활성화를 허용한다. 부가로, 완전히 활성화되기 위하여, 항원 인이 이외에도 T 세포는 항원 비특이적이고 항원 제시 세포 및 T 세포의 표면에 발현되는 보조-자극(co-stimulatory) 분자들간의 상호 작용에 의하여 제공되는 이차 신호, 보조-자극(co-stimulatory) 신호를 요구한다. 그리하여 효과적인 치료 암 백신을 위한 주요 두 가지 요구 사항은 종양 항원의 특이성 및 그들을 효과적으로 수지상 세포로 전달할 수 있는 능력이다.
종합하면, 종양 특이적 면역 반응의 유도는 따라서 세 가지 주요 단계를 요구한다: (i) 항원은 수지상 세포에 전달되어야만 하고, 이는 에피토프로 가공될 것이고, (ii) 수지상 세포는 적절한 활성 신호를 받아야 하고, 그리고 (iii) 활성화된 종양 항원-탑재 수지상 세포는 림프 기관에서 T-세포 매개된 면역 반응을 발생시켜야만 한다.
종양 세포는 개별 항원의 발현을 하향 조절하는 것에 의하여 면역 시스템을 회피할 수 있기 때문에(수동적 면역 회피), 다중-에피토프 항원 전달은 장점을 제공한다. 정말로, 단백질 기반 백신은 단일 MHC 대립 유전자(allele)에 대한 제한의 제약 없는 수지상 세포와 같이 항원 제시 세포(APCs)로의 다중-에피토프 항원 전달을 허용한다. 또 다른 장점은 단백질이 탑재된 수지상 세포에서 최근에 기술된 장기-지속 에피토프 제시이다(van Montfoort N, Camps MG, Khan S, Filippov DV, Weterings JJ, Griffith JM, et al. Antigen storage compartments in mature dendritic cells facilitate prolonged cytotoxic T lymphocyte cross-priming capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009;106(16):6730-5). 뿐만 아니라, 그들의 구성 에피토프(constituent epitopes)의 MHC 제한적 제시를 달성하기 위하여 단백질은 수지상 세포에 의한 섭취 및 가공을 요구한다. 이는 이러한 엄격한 가공 요건을 가지고 있지 않은 짧은 펩타이드의 백신 접종 이후 나타나는 말초 면역관용(peripheral tolerance) 유도의 위험을 감소시킨다(Toes RE, Offringa R, Blom RJ, Melief CJ, Kast WM. Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specific T-cell tolerance induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996;93(15):7855-60).
하지만, 대다수의 수용성 단백질은 일반적으로 엔도리소좀(endolysosome) 내에서 분해되고 MHC 클래스 I 분자에서 저조하게 교차-제시(cross-present)되고 그리하여 CD8 + T 세포 반응에 대하여 저조하게 면역적이다 (Rosalia RA, Quakkelaar ED, Redeker A, Khan S, Camps M, Drijfhout JW, et al. Dendritic cells process synthetic long peptides better than whole protein, improving antigen presentation and T-cell activation. European journal of immunology 2013;43(10):2554-65). 게다가, 성숙 수지상 세포(DCs)는 미성숙 수지상 세포(DCs)에 비하여 T-세포 반응의 감작 및 면역 반응에 있어서 더 강력하지만(Apetoh L, Locher C, Ghiringhelli F, Kroemer G, Zitvogel L. Harnessing dendritic cells in cancer. Semin Immunol. 2011; 23:42-49), 그들은 외인성 항원, 특히 MHC 클래스 II 제한적 항원을 효과적으로 섭취하는 능력을 상실한다(Banchereau J, Steinman RM. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 1998; 392:245-252). 결론적으로, 백신으로서 펩타이드-펄스된(pulsed) 수지상 세포(DCs)는 몇몇의 제약점을 가진다. 예를 들면, 펩타이드 분해, 급속한 MHC 클래스 I 전환(turnover), 및 수지상 세포(DC)/펩타이드의 준비 및 주사 동안 MHC 클래스 I 분자의 펩타이드로부터 분리는 수지상 세포(DC) 표면에서 MHC 클래스 I/펩타이드 복합체의 짧은 반감기를 초래하여 약한 T-세포 반응을 이끌 수 있다.
단백질-기반 백신 전달의 효능을 향상시키기 위하여, 암 펩타이드의 수지상 세포(DCs) 안으로의 세포 전달을 위한 세포 투과 펩타이드(cell penetration peptides)의 사용이 제안되었다(Wang RF, Wang HY. Enhancement of antitumor immunity by prolonging antigen presentation on dendritic cells. Nat Biotechnol. 2002; 20:149-156). 세포 투과 펩타이드(cell penetration peptides, CPPs)는 세포막을 통과하고 대부분의 세포 유형안으로 들어갈 수 있는 능력을 갖는 8 내지 40 잔기의 펩타이드이다(Copolovici DM, Langel K, Eriste E, Langel U. Cell-penetrating peptides: design, synthesis, and applications. ACS nano 2014;8(3):1972-94, Milletti F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 2012). 대안적으로, 그들은 또한 자연 단백질 내에서 발생하는 그들의 기원을 반영하는 단백질 형질 도입 영역(protein transduction domain, PTDs)으로 불리운다. 몇 몇의 강력한 세포 투과 펩타이드들(CPPs)이 단백질로부터 확인되었고, 이는 인간 면역결핍 바이러스의 Tat 단백질, 단순 헤르페스 바이러스(simple herpes virus)의 VP22 단백질, 및 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor)를 포함한다 (Berry CC. Intracellular delivery of nanoparticles via the HIV-1 tat peptide. Nanomedicine. 2008; 3:357-365; Deshayes S, Morris MC, Divita G, Heitz F. Cell-penetrating peptides: Tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci. 2005; 62:1839-1849; Edenhofer F. Protein transduction revisited: Novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 2008; 14:3628-3636; Gupta B, Levchenko TS, Torchilin VP. Intracellular delivery of large molecules and small particles by cell-penetrating proteins and peptides. Adv Drug Deliv Rev. 2005; 57:637-651; Torchilin VP. Recent approaches to intracellular delivery of drugs and DNA and organelle targeting. Annu Rev Biomed Eng. 2006; 8:343-375). DC/TAT-TRP2에 의해 유발된 T-세포 활성은 DC/TRP2에 의하여 유도된 것보다 3- 내지 10-배 더 높았다(Wang HY, Fu T, Wang G, Gang Z, Donna MPL, Yang JC, Restifo NP, Hwu P, Wang RF. Induction of CD4+ T cell-dependent antitumor immunity by TAT-mediated tumor antigen delivery into dendritic cells. J Clin Invest. 2002a; 109:1463-1470).
게다가, 서브유닛(subunit) 백신(펩타이드 또는 단백질)은 저조하게 면역성이다. 그리하여 치료 암 백신의 면에서, 수지상 세포에서의 보조-자극 분자의 수준을 증가시키고 그리하여 대상 항원에 대한 면역 시스템의 반응을 증가시키기 위하여 강력한 보조제(adjuvents)가 백신에 추가되는 것이 필수적이다. 보조제는 면역 시스템에 의하여 자연적으로 인지되는 보존된 미생물의 성분을 모방함으로써 이 과업을 달성한다. 그들은 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS), 박테리아 세포 벽의 성분, 및 이중-가닥 RNA(double-stranded RNA, dsRNA), 단일-가닥 DNA(single-strand RNA, ssDNA), 및 비메틸화된 CpG 디뉴클레오티드-포함 DNA와 같은 핵산을 포함한다. 그들과 백신과의 공존은 항원에 대한 선천적인 면역 반응을 상당히 증가시킨다. 뿐만 아니라, 이 보조제는 항체 생산을 초래하는 체액 면역 보다는 CTLs 및 Th1 유형으로의 편향(polarized)과 함께 적응 면역 반응(adaptive immune response)을 촉진한다. 상이한 보조제들이 평가되었고, 제한적인 개수만이 인간 사용을 위한 규제 승인을 받았다. 이들은 미국에서는 알럼(Alum), MPL(모노포스포릴 지질 A, monophosphoryl lipid A) 및 ASO4(알럼 및 MPL)가 있고, 유럽에서는 MF59(수중유(oil-in-water) 에멀전), ASO4, 리포좀(liposome)이 있다(Lim, Y.T., Vaccine adjuvant materials for cancer immunotherapy and control of infectious disease. Clin Exp Vaccine Res, 2015. 4(1): p. 54-8).
최근에, 톨 유사 수용체(Toll Like Receptor, TLR) 리간드가 보조제의 유망한 클래스로 떠오르고 있다(Baxevanis, C.N., I.F. Voutsas, and O.E. Tsitsilonis, Toll-like receptor agonists: current status and future perspective on their utility as adjuvants in improving anticancer vaccination strategies. Immunotherapy, 2013. 5(5): p. 497-511). 암 백신 연구의 유의적인 개발은 따라서 TLR-3 (poly I:C), TLR-4 (모노포르포릴 리피드(monophosphoryl lipid) A; MPL), TLR-5 (플라젤린(flagellin)), TLR-7 (이미퀴모드(imiquimod)), 및 TLR-9 (CpG) (Duthie MS, Windish HP, Fox CB, Reed SG. Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol Rev. 2011; 239:178-196)을 포함하는, 백신 제형에 대한 다양한 TLR 작용제(agonist)들을 포함하도록 하였다. TLR 자극 이후 면역 세포에 의하여 생산되는 시그널링 및 사이토킨의 유형은 Th1, Th2, Th17 및 Treg 세포로의 CD4+ T-세포 분화를 관리한다. 대개 TLR-기반 보조제에 의한 수지상 세포 및 T 세포와 같은 면역 세포의 자극은 염증전 사이토킨을 생산하고 Th1 및 CD8+ T 반응을 촉진한다(Manicassamy S, Pulendran B. Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors. Semin Immunol. 2009; 21:185-193).
백신의 TLR 리간드에의 접합은 비-접합 백신(non-conjugated vaccines)과 대비하여, (i) TLR 발현 면역 세포에 의한 우선적인 흡수(uptake), (ii) 보다 높은 면역 반응, (iii) 말초 면역관용(peripheral tolerance) 유도의 위험성 감소를 포함하는 몇 몇의 장점을 제공하는 매력적인 방법이다. 정말로, 항원과 함께 장착된 모든 항원 제시 세포는 동시에 활성화된다. 상이한 그룹에서 주로 화학적으로 펩타이드 또는 단백질 백신에 연결된 다양한 TLR 리간드를 가지고 이 접근법을 탐구하였다(Zom GG, Khan S, Filippov DV, Ossendorp F. TLR ligand-peptide conjugate vaccines: toward clinical application. Adv Immunol. 2012;114:177-201). 펩타이드에 대한 연결이 쉽게 수행됨에 따라, 가장 많이 조사된 접합체 백신(conjugate vaccine)을 위한 TLR 리간드는 TLR2 작용제 Pam2Cys 및 Pam3Cys이다(Fujita, Y. and H. Taguchi, Overview and outlook of Toll-like receptor ligand-antigen conjugate vaccines. Ther Deliv, 2012. 3(6): p. 749-60).
하지만, 지금까지 암 백신 시험의 다수는 제한된 효능을 보여왔다. 하나의 설명은 (i) 다가-에피토프 세포독성 T-세포 매개 면역을 자극하고, (ii) Th 세포 유도하고 (iii) 면역 기억력 촉진을 동시에 할 수 있는 요법의 부재이다. 이들 세 가지 파라미터는 강력하고, 장기 지속 항-종양 면역성을 발생시키는 데 필수적이다. 정말로, 상이한 에피토프에 특이적인 CTLs들은 이질적인 종양 덩어리 내에서 더 많은 암 세포의 파괴를 허용하고 항원-상실 변이체(antigen-loss variants)의 증식을 피할 수 있다(종양 면역 탈출). Th 세포는 장기-지속 세포성 면역의 유지에 관여되어 있고 Th 세포에 의한 종양 침투는 또한 CD8+ CTLs의 동원(recruitment) 및 기능에 필수적인 단계이다.
상기 견지에서, 본 발명의 목적은 상기 요약된 현행 암 백신의 단점을 극복하고, 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위하여 개선된 항암 활성을 가지면서, 보다 효능있는 백신을 제시하는 결장직장암 면역 요법 적용을 위한 신규한 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 하기에 정리된 대상(subject-matter) 및 첨부된 청구 범위에 의해 발명자에 의해 해결된다.
본 발명은 하기에 의하여 상세히 기술되지만, 본 발명은 여기에 기술된 특정한 방법, 프로토콜 및 반응액에 국한되지 않으며 달라질 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 오직 첨부된 청구항에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 의도로 사용되지 않는 것 또한 이해되어야 한다. 반대로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 기술자에게 보통 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
하기에, 본 발명의 구성요소들이 기술될 것이다. 이들 구성요소들은 특정의 구현예들로 기술되나, 하지만, 이는 임의의 방법 및 임의의 숫자로 조합되어 추가적인 구현예들을 만들어 낼 수 있음이 이해되어야 한다. 다양하게 제시된 실시예들 및 바람직한 구현예들은 본 발명을 오직 그 명시적으로 제시된 구현예로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 기술은 명시적으로 기술된 구현예들을 임의 개수의 개시된 및/또는 바람직한 구성요소들과 조합하는 구현예를 지지하고 아우르는 것으로 이해되어야 한다. 뿐만 아니라, 달리 표시하지 않는 한 본 특허 명세서의 기술은 본 명세서 내 기술된 모든 구성요소와의 임의의 치환 및 조합이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
본 상세한 설명 및 후술할 청구항 전체에 걸쳐, 달리 명시하지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)", 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형예,들은 명시된 멤버, 정수(integer) 또는 단계를 포함하나 임의의 다른 비-명시된 멤버, 정수 또는 단계를 제외하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "이루어지다(consist of)"는 용어 "포함되다(comprise)"의 특별한 구현예로서, 임의의 비-명시된 멤버, 정수 또는 단계는 제외된다. 본 발명의 면에서, 용어 "포함하다(comprise)"는 용어 "이루어지다(consist of)"를 아우른다. 상기 용어 "포함하는(comprising)"은 따라서 용어 "이루어지는(consisting)"은 물론 용어 "함유하는(including)"도 아우른다, 일례로, X를 "포함하는" 조성물은 명시적으로 X만으로 이루어지거나 또는 부가적인 것을 함유할 수 있다, 일례로, X + Y.
본 발명(특별히 청구항 면에서)을 기술하는 면에서 사용된 용어 "임의의" 및 "하나의"(a 또는 an) 및 "상기(the)" 및 유사 참조는 달리 표시되거나 또는 분명하게 내용상 상반되는 경우를 제외하고는 단일 또는 복수 모두를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서 수치 영역에 대한 인용구는 단순히 해당 영역 내에 포함되는 각 별개 수치를 개별적으로 언급하는 것을 간소하는 방법으로서만 제공되는 것으로 의도된다. 본 명세서 내 달리 표시되지 않는 한, 각 개별 수치값들을 마치 여기에 개별적으로 인용되는 것처럼 본 명세서 내로 포함된다. 본 명세서 내 임의의 청구되지 않은 구성요소가 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 표시하는 것으로 해석되어서는 안된다.
용어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않는다 일례로, 실질적으로 Y를 포함하지 않는 조성물은 Y를 완전히 포함하지 않을 수 있다. 필요한 경우, 용어 "실질적으로"는 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치값 X와 관련된 용어 "약"은 X ± 10%를 의미한다.
본 발명에 따른 복합체
첫 번째 측면에서 본 발명은 다음을 포함하는 복합체를 제공한다:
a) 세포 투과 펩타이드(cell penetrating peptide);
b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제(peptide agonist),
여기서 성분 a) 내지 c), 즉, 세포 투과 펩타이드, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제, 들은 공유적으로 결합되어 있고, 이는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 이러한 복합체는 동시적으로 (i) 다중-에피토픽 세포독성 T세포-매개된 면역성의 자극, (ii) Th 세포의 유도 및 (iii) 면역 기억력의 증진을 제공한다. 그렇게 함으로써, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 강력한, 특히 향상된 항-종양 활성을 갖는, 백신을 제공한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질, 특히 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질, 바람직하게는 재조합 융합 단백질 또는 재조합 융합 폴리펩타이드이다. 용어 "재조합"은 본 명세서에 사용된 것처럼 자연적으로 발생하지 않는 것(여기서: 폴리펩타이드 또는 단백질)을 의미한다. 그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체, 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질은 전형적으로 성분 a) 내지 c)를 포함하고, 상기 성분 a) 내지 c)는 상이한 기원의 것이다, 즉, 본 조합에서는 자연적으로 발생하지는 않는 것이다.
본 발명의 면에서, 즉, 본 명세서 전체에 걸쳐, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질" 및 이들 용어의 변형체들은, 각각, 바람직하게 통상의 펩타이드 결합, 또는, 대안적으로, 예를 들면 이소스테릭(isosteric) 펩타이드의 경우와 같은, 변형된 펩타이드 결합에 의하여 서로 결합된 최소 두 개의 아미노산을 포함하는 펩타이드, 올리고펩타이드, 올리고머 또는 융합 단백질을 포함하는 단백질을 나타낸다. 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 L-아미노산 및/또는 D-아미노산으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 (전부) L-아미노산 또는 (전부) D-아미노산으로 구성될 수 있고, 그렇게 함으로써 "레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드 서열"을 생성한다. 용어 "레트로-인버소 (펩타이드) 서열"은 서열의 방향이 역전되고 각 아미노산 잔기의 키랄리티(chirality)가 도치된 선형 펩타이드 서열의 이성질체를 나타낸다(일례로, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994) 참조). 특히, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질은 또한 비-펩타이드성 구조 구성요소를 포함하는 펩타이드 유사체로 정의되는 "펩티도미메틱스(peptidomimetics)"를 포함하고, 이 펩타이드는 자연 모체 펩타이드의 생물학적 기능과 유사하게 작용하거나 반대로 작용할 수 있다. 펩티도미메틱스는 효소적으로 잘라질 수 있는 펩타이드 결합과 같은 고전적 펩타이드 특성을 결여한다. 특히, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 아미노산에 부가하여 유전자 코드로 정의된 20개 아미노산 이외의 다른 아미노산을 구성될 수 있고, 또는 이는 상기 유전자 코드에 의한 정의된 20개 아미노산 이외의 아미노산으로 구성될 수 있다. 특히, 본 발명의 면에서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은, 번역 후 성숙 또는 화학적 과정과 같은 자연적 과정에 의하여 변형된 아미노산으로 동일하게 이루어질 수 있고, 이는 당해 분야 기술자에게 잘 알려져 있다. 이러한 변형들은 본 문헌에 상세히 설명되어 있다. 이들 변형들은 폴리펩타이드 어디에서든지 나타날 수 있다: 펩타이드 골격(peptide skeleton)에서, 아미노산 사슬에서 또는 심지어 카르복시- 또는 아미노- 말단(terminal end)에서. 특히, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 하기 유비퀴틴화(ubiquitination)에 의해 분지화되거나 또는 분지화와 함께 또는 없이 고리화할 수 있다. 이 종류의 변형은 자연적 또는 인공적 번역-후 과정은 당해 분야 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 명세서 면에서 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질"은 특히 변형된 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질 또한 포함한다. 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 변형은 아세틸화(acetylation), 아실화(acylation), ADP-리보실화(ribosylation), 아미드화(amidation), 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유적 고정(covalent fixation), 지질(lipid) 또는 지질 유도체(lipidic derivative)의 공유적 고정, 포스파티딜이노시톨(phosphatidylinositol)의 공유적 고정, 공유 또는 비-공유 교차-결합(cross-linking), 원형화(cyclization), 이황화 결합(disulfide bond) 생성, 탈메틸화(demethylation), PEG화(pegylation)를 포함하는 글리코실화(glycosylation), 수산화(hydroxylation), 요도드화(iodization), 메틸화(methylation), 미리스토일화(myristoylation), 산화(oxidation), 단백질 분해(proteolytic) 과정, 인산화(phosphorylation), 프레닐화(prenylation), 라세미화(racemization), 세네로일화(seneloylation), 황산화(sulfatation), 아르기닌화(arginylation) 또는 유비퀴틴화(ubiquitination)와 같은 아미노산 추가를 포함할 수 있다. 이러한 변형들은 본 문헌에 상세히 설명되어 있다 (Proteins Structure and Molecular Properties (1993) 2nd Ed., T. E. Creighton, New York ; Post-translational Covalent Modifications of Proteins (1983) B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York ; Seifter et al. (1990) Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182: 626-646 and Rattan et al., (1992) Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663: 48-62). 그에 따라서, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", "단백질"은 바람직하게는 예를 들면 지질펩타이드(lipopeptides), 지질단백질(lipoproteins), 당펩타이드(glycopeptides), 당단백질(glycoproteins) 및 그 유사체들을 포함한다.
하지만, 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 "고전적"(classical) 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이고, 그에 따라 "고전적" 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 전형적으로 보통 펩타이드 결합에 의하여 연결된, 유전자 코드에 의하여 정의되는 20개의 아미노산으로부터 선택된 아미노산으로 구성된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체가 폴리펩타이드 또는 단백질이라면, 최소한 5 개, 최소한 60 개, 최소한 70 개, 바람직하게는 최소한 80 개, 최소한 90 개, 더 바람직하게는 최소한 100 개, 최소한 110 개, 보다 더 바람직하게는 최소한 120 개, 최소한 130 개, 특히 바람직하게는 최소한 140 개, 또는 가장 바람직하게는 150 개 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
성분 a) - 세포 투과 펩타이드
CPP(세포 투과 펩타이드)는, 특히 최소한 임의의 항원 또는 항원성 에피토프의, 항원 제시 세포(antigen presenting cells, APCs), 특히 수지상 세포(dendritic cells, DCs) 및 그에 따라 수지상 세포의 항원 가공 절차로의, 효율적인 전달, 즉, 운송 및 탑재(loading)를 허용한다.
용어 "세포 투과 펩타이드"(cell penetrating peptides, CPPs)는 일반적으로 상이한 형태의 카르고 분자(cargo molecules)를 원형질 막을 투과하여 운송할 수 있는 짧은 펩타이드를 지정하는 것으로 사용되고, 그리고, 따라서, 다양한 분자 카르고(나노 사이즈 입자부터 작은 화학 분자 및 DNA의 거대 절편까지)의 세포 흡수(cellular uptake)를 용이하게 한다. 상기 세포 투과 펩타이드와 연관된 카르고 분자의 "세포 내재화"(Cellular internalization)는 일반적으로 카르고 분자의 원형질막 투과 운송 및 그에 따라 세포로의 상기 카르고 분자의 유입을 의미한다. 특정예에 따라서는, 상기 카르고 분자는, 이후, 세포질 내 방출되거나, 세포내 소기관을 향하거나, 또는 세포 표면에 더욱 제시될 수 있다. 본 발명에 따른, 세포 투과 펩타이드 또는 상기 세포 투과 펩타이드로 이루어지는 복합체의 세포 제시 능력, 또는 내재화는, 유동 세포 계측법 또는 살아있고 고정된 세포, 상기 펩타이드 또는 복합체로 형질 도입된 세포의 면역세포화학(immunocytochemistry), 및 웨스턴 블럿을 포함하는 당해 분야에서 통상의 기술자에게 알려진 통상적인 방법에 의하여 검사될 수 있다.
세포 투과 펩타이드는 전형적으로 라이신(lysine) 또는 아르기닌(argine)과 같은 양성 전하 아미노산의 높은 상대적 존재를 포함하는 아미노산 조성을 가지거나 또는 극성/대전된 아미노산 및 비극성, 수소성 아미노산이 번갈아 나오는 경향(alternating pattern)을 포함하는 서열을 가진다. 이들 구조의 두 유형은, 각각, 다중양이온성(polycationic) 또는 양친매성(amphipathic)로 불리운다. 세포-투과 펩타이드들은 상이한 크기, 아미노산 서열, 및 전하를 가지나, 그러나 모든 CPPs는 원형질 막을 이동시키고 세포질 또는 세포 소기관으로의 전달을 용이하게 하는 공통적인 특성을 가진다. 현재, CPP 전위(translocation)의 이론은 세 개의 주요 진입 메커니즘을 구분한다: 세포막 내에서의 직접 투과, 엔도사이토시스(endocytosis)-매개 진입, 및 이행 구조(transitory structure) 형성을 통한 전위. CPP 형질 도입은 계속 진행 중인 연구 영역이다. 세포-투과 펩타이드는 암을 포함하는 상이한 질병의 치료에서의 약물 전달 인자 및 바이러스 억제제는 물론, 세포 표지 및 영상화를 위한 조영제(contrast agent)로서 의약 분야에서 수많은 적용을 찾았다.
전형적으로, 세포 투과 펩타이드(CPPs)는 세포막을 투과하고 또한 대부분의 세포 유형에 들어갈 수 있는 능력을 갖는 8 내지 50 개 잔기의 펩타이드이다. 대안적으로, 그들은 또한 자연 단백질에서 발생하는 그들의 기원을 반영하는 단백질 형질 도입 도메인(protein transduction domain, PTDs)으로 불리운다. 그린 및 로웬스테인(Green and Lowenstein)과 동시에 프랑켈 및 파보(Frankel and Pabo)는 인간 면역 결핍 바이러스 1(human immunodeficiency virus 1)로부터 전사-촉진 전사 활성 인자(trans-activating transcriptional activator)(HIV-TAT)의 세포 내로의 투과 능력을 기술하였다(Frankel, A.D. and C.O. Pabo, Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 1988. 55(6): p. 1189-93). 1991년에, 노랑초파리(Drosophila melanogaster)로부터 안테나페디아 호메오도메인(Antennapedia homeodomain, DNA-결합 도메인)의 신경 세포로의 형질 도입이 기술되었다(Joliot, A., et al., Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991. 88(5): p. 1864-8). 1994년에는, 아미노산 서열 RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1)을 갖는, 페네트라틴(Penetratin)으로 불리우는 첫 16-mer 펩타이드 CPP가 안테나페디아(Antennapedia)의 호메오도메인의 세번째 헬릭스로부터 특징 지워졌고(Derossi, D., et al., The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem, 1994. 269(14): p. 10444-50), 이후 1998년에는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2)을 갖는, 단백질 형질 도입에 요구되는 TAT의 최소 도메인(minimal domain)의 확인이 뒤따랐다(Vives, E., P. Brodin, and B. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 1997. 272(25): p. 16010-7). 지난 20년간, 수십의 펩타이드가 바이러스성 단백질, 예를 들어 VP22(Elliott, G. and P. O'Hare, Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell, 1997. 88(2): p. 223-33) 및 ZEBRA(Rothe, R., et al., Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. J Biol Chem, 2010. 285(26): p. 20224-33)를 포함하는 상이한 기원으로부터 또는 독(venoms), 예를 들어 멜리틴(melittin)(Dempsey, C.E., The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta, 1990. 1031(2): p. 143-61), 마스토파란 (mastoporan)(Konno, K., et al., Structure and biological activities of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), a new mast cell degranulating peptide in the venom of the solitary wasp (Anterhynchium flavomarginatum micado). Toxicon, 2000. 38(11): p. 1505-15), 마우로칼신(maurocalcin)(Esteve, E., et al., Transduction of the scorpion toxin maurocalcine into cells. Evidence that the toxin crosses the plasma membrane. J Biol Chem, 2005. 280(13): p. 12833-9), 크로타민(crotamine)(Nascimento, F.D., et al., Crotamine mediates gene delivery into cells through the 결합ing to heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 2007. 282(29): p. 21349-60), 또는 부포린(buforin)(Kobayashi, S., et al., Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 2004. 43(49): p. 15610-6), 으로부터 기술되었다. 폴리-아르기닌(R8, R9, R10 및 R12) (Futaki, S., et al., Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem, 2001. 276(8): p. 5836-40) 또는 트랜스포르탄(transportan)(Pooga, M., et al., Cell penetration by transportan. FASEB J, 1998. 12(1): p. 67-77)을 포함하는 합성 CPPs 또한 디자인되었다. 상기 기술된 임의의 CPPs는 세포 투과 펩타이드, 일례로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 성분 a), 로 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 성분 a), 일례로 CPP는 아미노산 서열 YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2)를 갖는, TAT의 최소 도메인을 포함할 수 있다. 특히 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 성분 a), 일례로 CPP는 아미노산 서열 RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1)를 갖는 페네트라틴(Penetratin)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 세포 투과 펩타이드, 즉, 성분 a),로 사용될 수 있는, 다양한 CPPs가 또한 다음 리뷰 문헌에 개시되어 있다: Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012. 다른 말로, Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60 에 개시된 CPPs는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 세포 투과 펩타이드, 즉, 성분 a),로 사용될 수 있다. 이는 특히 양이온성 CPPs, 양친매성 CPPs, 및 소수성 CPPs는 물론 헤파란(heparan)-, RNA- 및 DNA-결합 단백질에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 1), 신호 펩타이드에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 2), 항균성 펩타이드에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 3), 바이러스성 단백질에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 4), 다양한 자연 단백질에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 5), 및 디자인된 CPPs(Designed CPPs) 및 펩타이드 라이브러리에서 유래된 CPPs(cf. Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16): 850-60, 2012 의 표 6)을 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의하여 이루어지는, 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 SEQ ID NO: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 가진다.
그렇게 함으로써, 바람직하게 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의하여 이루어지는, 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 SEQ ID NO: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 가진다.
이러한 바람직한 CPPs는 WO 2014/041505에 개시되어 있다.
용어 "ZEBRA"(또한 Zta, Z, EB1, 또는 BZLF1로 알려진)는 일반적으로 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV)의 베이직-류신 지퍼(basic-leucine zipper, bZIP) 전사 활성 인자를 의미한다. ZEBRA의 최소 도메인은, 세포 투과 성질을 나타내고, ZEBRA의 잔기 170 부터 잔기 220 까지의 스패닝(spanning)으로 확인되었다. ZEBRA의 아미노산 서열은 NCBI accession number YP_401673로 개시되고 서열번호 NO: 3에 제시된 245개 아미노산으로 이루어진다:
MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF
(SEQ ID NO: 3 - ZEBRA 아미노산 서열(Epstein - Barr virus (EBV)로부터의 자연 서열) (YP_401673))
최근에, 바이러스성 단백질 ZEBRA로부터 유래된 CPP는 (i) 직접 전위(direct translocation) 및 (ii) 지질 래프트-매개 엔토시토시스(lipid raft-mediated endocytosis) 양자에 의하여 생체막을 투과하여 단백질 카르고를 형질 도입하는 것으로 기술되었다(Rothe R, Liguori L, Villegas-Mendez A, Marques B, Grunwald D, Drouet E, et al. Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. The Journal of biological chemistry 2010;285(26):20224-33). 본 발명자들은 상기 두 진입 경로는, MHC 클래스 I 및 II 양자에 의하여 제한된 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 각각에 대한 카르고 항원의 제시를 촉진하여야 하는 것으로 추정하였다. 그에 따라서, 이러한 CPP는 다중-항원성 펩타이드를 수지상 세포(DCs)에 전달할 수 있고, 결과적으로 CTL 및 Th 세포 활성화 및 항-종양 기능을 촉진할 수 있다. 이러한 CPP는 따라서 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체를 항원 제시 세포(antigen presenting cells, APCs)에 효과적으로 전달하고 다중-항원성 MHC 클래스 I 및 II 제한 제시를 유도한다.
본 발명의 면에서, 용어 "MHC 클래스 I"은 주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex molecules, MHC)의 두 주요 클래스 중 하나를 지정한다. MHC 클래스 I (또한 "MHC I"로 알려짐) 분자는 신체의 모든 유핵 세포에서 발견된다. MHC 클래스 I의 기능은 에피토프를 세포독성 세포 (cytotoxic cells, CTLs)에 내보이는 것이다. 인간에서, MHC 클래스 I 분자는 두 개의 폴리펩타이드 체인, α- 및 β2-마이크로글로불린 (b2m) 으로 이루어진다. 오직 상기 α 체인 만이 다형성(polymorphic)이고 HLA 유전자에 의하여 암호화되고, 반면에 상기 b2m 서브유닛은 다형성이 아니고 Beta-2 마이크로글로불린 유전자에 의하여 암호화된다. 본 발명의 면에서, 용어 "MHC 클래스 II"는 주조직 적합성 복합체의 다른 하나의 주요 클래스를 지정한다. MHC 클래스 II (또한 "MHC II"로 알려짐) 분자는 오직 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포를 포함하는 몇몇 특화된 세포 유형에서만 발견되고, 이들 모두는 항원-제시 세포 전용이다.
바람직하게는, 상기 기술된 것처럼 ZEBRA의 최소 도메인(minimal domain)의 절편의 상기 서열 변이체는 세포 투과 펩타이드의 세포 투과 능력을 방해하지 않고 상기 기술된 것처럼 ZEBRA의 최소 도메인의 절편과, 특히 총 길이에 걸쳐, 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 아미노산 서열 일치성(sequence identity)을 공유한다. 특히, 상기 정의된 ZEBRA의 최소 도메인의 "절편"은 바람직하게 이의 절단형의(truncated) 서열로 이해되어야 한다, 즉, 그 자연 서열의 아미노산 서열과 대비하여 N-말단, C-말단 및/또는 서열 내부적으로 절단된 아미노산 서열. 게다가, ZEBRA의 최소 도메인의 이러한 "절편"은 바람직하게는 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 20 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 길이를 가진다.
그에 따라서, 본 발명의 면에서, 즉, 본 명세서 전체에 걸쳐, 사용된 용어 "서열 변이체"(sequence variant)는 기준 서열(reference sequence) 내 임의의 변이(alterantion)를 나타낸다. 용어 "서열 변이체"는 핵산 서열 변이체 및 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 바람직하게는, 기준 서열은 "서열 및 서열 번호 표" (서열 목록)에 열거된 임의의 서열이다, 즉, SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 94. 바람직하게는, 서열 변이체는 기준 서열과, 특히 서열의 총 길이에 걸쳐, 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 아미노산 서열 일치성(sequence identity)을 공유하고, 그에 따라 하기 기술된 것처럼 서열 일치성이 계산되었다. 특히, 서열 변이체는 기준 서열의 특정 기능을 유지한다. 특히, 아미노산 서열 변이체는 기준 서열 내 한 개 또는 그 이상의 아미노산이 삭제되거나 치환되거나, 또는 한 개 또는 그 이상의 아미노산이 기준 아미노산 서열의 서열 내로 삽입되는 변이된 서열을 가진다. 상기 변이의 결과로, 아미노산 서열 변이체는 기준 서열에 최소한 70%, 최소한 75%, 바람직하게는 최소한 80%, 더 바람직하게는 최소한 85%, 보다 더 바람직하게는 최소한 90%, 특히 바람직하게는 최소한 95%, 가장 바람직하게는 최소한 99% 일치한다. 예를 들면, 최소한 90% 일치하는 변이체 서열은 적어도 변이, 즉, 임의의 삭제, 삽입 또는 치환,이 기준 서열의 100개 아미노산 당 10개를 넘지 않는다.
본 발명의 면에서, 최소한의 "서열 일치성을 공유"하는 아미노산 서열, 예를 들어, 본 발명에 따른 조회(query) 아미노산 서열에 95%는 대상 아미노산 서열이 조회 아미노산 서열의 각 100개 아미노산 당 5개까지의 변이를 포함할 수 있는 경우를 제외하고는 대상 아미노산 서열이 조회 서열과 일치하는 것을 의미하는 것을 의도한다. 다른 말로, 조회 아미노산 서열에 최소한 95% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 얻기 위하여, 대상 서열 내 아미노산 잔기의 5% (100개 중에서 5개)까지, 바람직하게는 상기 변이체 또는 절편의 정의 내에서, 다른 아미노산으로 삽입되거나 치환될 수 있다. 동일한 사항이, 당연히, 핵산 서열에 또한 유사하게 적용된다.
정확한 대응이 없는 (아미노산 또는 핵산) 서열에 대해서는, 첫 번째 서열의 "% 일치성"은 두 번째 서열에 대하여 측정될 수 있다. 일반적으로, 대비되는 이들 두 서열은 서열들간 최대 상관성을 주기 위하여 정렬된다. 이는 정렬 정도를 증가시키기 위하여, 어느 하나 또는 양쪽 서열 내 "갭"(gap) 삽입을 포함할 수 있다. % 일치성은 이후 대비될 서열 각각의 전체 길이에 걸쳐 결정되거나(소위 글로벌 정렬이라 함), 이는 특히 동일하거나 유사한 길이의 서열에 적절하고, 또는 더 짧고, 규정된 길이(소위 로컬 정렬이라 함)에 걸쳐 결정될 수 있고, 이는 상이한 길이의 서열에 더 적절하다.
두 개 또는 그 이상의 서열의 일치성(identity) 및 상동성(homology)을 대비하는 방법은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 두 서열의 일치하는 백분율은 일례로 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게, 단 이에 제한되지 않는, 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 예는 Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 BLAST 프로그램 패밀리에 통합되어 있다,(Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 or Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402) 또한 참조, NCBI 홈페이지 싸이트 ncbi.nlm.nih.gov를 통하여 접근 가능) 또한 FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448. 참조). 일정한 정도에서 다른 서열과 일치하는 서열은 이들 프로그램들에 의하여 확인될 수 있다. 뿐만 아니라, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395) 내 입수 가능한 프로그램, 예를 들면 BESTFIT 및 GAP 프로그램,이 두 개의 폴리뉴클레오티드 사이의 % 일치성 및 두 개의 폴리펩타이드 서열 사이의 % 상동성 또는 일치성을 결정하는데 사용될 수 있다. BESTFIT은 "로컬 상동성(local homology)" 알고리즘을 사용하고(Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.) 두 개 서열 사이에서 최고의 유사성을 갖는 영역을 찾는다.
더 바람직하게는, 상기 기술된 본 발명 또는 이의 변이체에 따른 세포 투과 펩타이드의 절편들은 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자의 면에서, 항원-제시 세포와 같은, 세포의 표면에서 항원 또는 항원성 에피토프와 같은 카르고 분자를 제시하는 상술한 펩타이드의 능력을 더욱 보유한다. 세포 투과 펩타이드 또는 상술한 세포 투과 펩타이트를 포함하는 복합체의 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 분자의 면에서 세포의 표면에서 항원 또는 항원성 에피토프와 같은 카르고 분자를 제시하는 능력은, 이들 에피토프에 대한 특이성을 갖는 MHC-제한 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 기능을 촉진하는 능력을 포함하여, 당해 분야 통상의 기술자에게 알려진 표준 방법으로 검사될 수 있다.
바람직한 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 SEQ ID NO: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 가지고
바람직하게는 기준 서열과 대비하여 최소한 보존적으로 치환된 아미노산을 가지는 아미노산 서열을 포함하고, 이는 주어진 아미노산 잔기가 유사한 생리화학적 특성을 가지는 잔기로 대체되는 것을 의미한다.
일반적으로, 기준 서열 내에 존재하는 한 개 또는 그 이상의 아미노산의 치환은 보존적으로 만들어져야만 한다. 보존적 치환의 예는 하나 지방족 아미노산의 다른 것으로의 치환, 예를 들면 이소류신(Ile), 발린(Val), 류신(Leu) 또는 알라닌(Ala)이 또 다른 것으로, 또는 한 개 극성 아미노산의 다른 것으로의 치환, 예를 들면 라이신(Lys) 및 아르기닌(Arg); 글루탐산(Glu) 및 아스파탐(Asp); 글루타민(Gln) 및 아스파라긴(Asn) 사이를 포함한다. 다른 이러한 치환, 예를 들면, 유사한 소수성 성질을 가지는 전체 영역의 치환이 잘 알려져 있다(Kyte and Doolittle, 1982, J. Mol. Biol. 157(1):105- 132). 한 개 또는 그 이상의 L-아미노산과 한 개 또는 그 이상의 D-아미노산의 치환은 본 발명의 면에서 보존적 치환으로 여겨진다. 표 1에 대표적인 아미노산 치환이 제시되어 있다.
원래 잔기 치환의 예
알라닌 (A) 발린, 류신, 이소류신, 글라이신
아르기닌 (R) 히스티딘, 라이신
아스파라긴 (N) 글루타민
아스파탐 (D) 글루탐산
시스테인 (C) 세린
글루타민 (Q) 아스파라긴
글루탐산 (E) 아스파탐
글라이신 (G) 프롤린, 알라닌
히스티틴 (H) 라이신, 아르기닌
이소류신 (I) 류신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌
류신 (L) 이소류신, 발린, 메티오닌, 알라닌, 페닐알라닌
라이신 (K) 아르기닌, 히스티딘
메티오닌 (M) 류신, 이소류신, 페닐알라닌
페닐알라닌 (F) 류신, 발린, 이소류신, 타이로신, 트립토판, 메티오닌
프롤린 (P) 알라닌, 글라이신
세린 (S) 트레오닌
트레오닌 (T) 세린
트립토판 (W) 타이로신, 페닐알라닌
타이로신 (Y) 트립토판, 페닐알라닌
원래 잔기 치환의 예
발린 (V) 이소류신, 메티오닌, 류신, 페닐알라닌, 알라닌
특히 바람직하게, 바람직한 세포 투과 펩타이드는,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 SEQ ID NO: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 가지고,
서열번호 NO: 3의 ZEBRA 아미노산 서열에 대해 포지션 189에 상응하는 위치에서, 시스테인(Cys, C)이 세린(Ser, S)으로 치환되어 포함한다.
그렇게 함으로써, 이러한 바람직한 세포 투과 펩타이드는 후술하는 일반식 (I)에 따른 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하다:
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
여기서 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있고,
X1은 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X1은 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X2는 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X2는 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X3은 타이로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F) 이며, 바람직하게는 X3은 타이로신(Y), 트립토판(W), 또는 페닐알라닌(F) 이며;
X4는 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X4는 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X5는 아스파라긴(N) 또는 글루타민(Q) 이며;
X6은 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X6은 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X7은 발린(V), 이소류신(I), 메티오닌(M), 류신(L), 페닐알라닌(F), 또는 알라닌(A) 이며, 바람직하게는 X7은 발린(V), 이소류신(I), 메티오닌(M) 또는 류신(L) 이며;
X8은 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 또는 글라이신(G) 이며, 바람직하게는 X8은 알라닌(A) 또는 글라이신(G) 이며;
X9는 세린(S) 또는 트레오닌(T) 이며;
X10은 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X10은 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X11은 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X11은 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X13은 아르기닌(R), 라이신(K), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X13은 아르기닌(R) 또는 라이신(K) 이며;
X14는 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 이소류신(I), 또는 글라이신(G) 이며, 바람직하게는 X14는 알라닌(A) 또는 글라이신(G) 이며;
X15는 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X15는 라이신(K) 또는 아르기닌(R) 이며;
X16은 페닐알라닌(F), 류신(L), 발린(V), 이소류신(I), 타이로신(Y), 트립토판(W), 또는 메티오닌(M) 이며, 바람직하게는 X16은 페닐알라닌(F), 타이로신(Y) 또는 트립토판(W) 이며; 및
X17은 라이신(K), 아르기닌(R), 또는 히스티딘(H) 이며, 바람직하게는 X17은 라이신(K) 또는 아르기닌(R)이다.
바람직하게는, 이러한 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질은 (전부) L-아미노산 또는 (전부) D-아미노산으로 구성되고, 그렇게 함으로써 "레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드 서열"을 생성한다. 용어 "레트로-인버소 (펩타이드) 서열"은 서열의 방향이 역전되고 각 아미노산 잔기의 키랄리티(chirality)가 도치된 선형 펩타이드 서열의 이성질체를 나타낸다(일례로, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368,692-693 (1994) 참조).
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X1은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X2은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X3은 타이로신(Y)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X4은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X5은 아스파라긴(N)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X6은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X7은 발린(V)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X8은 알라닌(A)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X9은 세린(S)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X10은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X11은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X13은 아르기닌(R)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 정의되고, 여기서 X14은 알라닌(A)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X15은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X16은 페닐알라닌(F)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 X17은 라이신(K)이다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 일반식(I)에 의하여 유전적으로 상기처럼 정의되고, 여기서 일반식(I)에서의 포지션 12에 상응하는 포지션의 상기 아미노산은 세린(S)이다.
상기 바람직한 세포 투과 펩타이드는, 또한 특히 바람직하게,
i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이를 가지고; 및/또는
ii) ZEBRA의 최소 도메인의 절편, 상기 최소 도메인은 SEQ ID NO: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 선택적으로, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 치환, 삭제, 및/또는 추가될 수 있음, 또는 이러한 절편의 서열 변이체를 포함하는 아미노산 서열을 가지고,
SEQ ID NO: 4 - 13에 따른 아미노산 서열로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산 서열, 또는 상기 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 그의 서열 변이체, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변이체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
CPP1 (Z11):
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC
(SEQ ID NO: 4)
CPP2 (Z12):
KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
(SEQ ID NO: 5)
CPP3 (Z13):
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK
(SEQ ID NO: 6)
CPP4 (Z14):
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK
(SEQ ID NO: 7)
CPP5 (Z15):
KRYKNRVASRKSRAKFK
(SEQ ID NO: 8)
CPP6 (Z16):
QHYREVAAAKSSEND
(SEQ ID NO: 9)
CPP7 (Z17):
QLLQHYREVAAAK
(SEQ ID NO: 10)
CPP8 (Z18):
REVAAAKSS END RLRLLLK
(SEQ ID NO: 11)
CPP9 (Z19):
KRYKNRVA
(SEQ ID NO: 12)
CPP10 (Z20):
VASRKSRAKFK
(SEQ ID NO: 13)
그렇게 함으로써, SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13), SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15), 또는 SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18), 또는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 이의 서열 변이체, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변이체, 에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 세포 투과 펩타이드가 특히 바람직하다. 게다가, SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13) 또는 SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14) 또는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 이의 서열 변이체, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 세포 투과 펩타이드가 더 바람직하다.
게다가, SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13) 또는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없는 이의 서열 변이체, 바람직하게는 상술한 펩타이드의 세포 투과 능력의 방해 없이 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 치환, 삭제, 및/또는 추가된 서열 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 갖는 세포 투과 펩타이드가 가장 바람직하다. 따라서, 세포 침투 펩타이드는 SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13)에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 75%의 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 80%의 서열 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%의 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%의 서열 동일성, 특히 바람직하게는 적어도 95%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것이 가장 바람직하다. 이와 관련하여, "기능적 서열 변이체"는 상기 펩타이드의 세포 침투 능력이 유지되는 서열 변이체이다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
하나의 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18)을 포함하거나 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가진다.
당해 분야의 기술자들은 본 발명의 상기 세포 투과 펩타이드의 주요 아미노산 서열은 본 발명으로부터 멀어짐 없이, 예를 들어 번역 후 변형, 글리코실화 또는 인산화에 의한 것과 같이, 더욱 번역 후 변형이 될 수 있음이 이해될 것이다.
부가 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 선택적으로, 상기 기술된 그의 아미노산 서열에 부가하여, 하기 중 임의의 하나, 또는 임의의 조합을 더욱 포함한다:
(i) 핵 위치화 신호(nuclear localization signal, NLS). 이러한 신호는 당해 분야 기술자에게 잘 알려져 있고 Nair et al(2003, Nucleic Acids Res. 31(1): 397-399)에 기술되어 있다.
(ii) 표적화 펩타이드(targeting peptide), 이는 Kapoor et al. (2012, PLoS ONE 7(4): e35187)에 기술되고 http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/general.php?에 리스트된 것과 같은 종양 귀소 펩타이드(tumor homing peptides)을 포함.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 세포 투과 펩타이드는 항원 또는 항원성 에피토프와 연결되고 상기 항원 또는 항원성 에피토프의 세포 내재화를 용이하게 한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 한 개의 단일 세포 투과 펩타이드 또는 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 다섯 개 이하 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 네 개 이하 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 세 개 이하 포함하고, 특히 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 두 개 이하 포함하고 가장 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드 한 개 포함한다.
성분 b) 항원 / 항원성 에피토프
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 성분 b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것처럼, "항원"(antigen)은 적응 변역 반응의 수용체의 타겟, 특히 항원, T 세포 수용체, 및/또는 B 세포 수용체의 타겟을 제공하는 임의의 구조적 물질(structural substance)이다. "에피토프(epitope)", 또한 "항원성 결정인자"(antigenic determinant)로 알려진 것은 면역 시스템, 특히 항체, T 세포 수용체 및/또는 B 세포 수용체에 의하여 인지되는 항원의 부분(part)(또는 절편(fragment))이다. 따라서, 한 개 항원은 적어도 하나의 에피토프를 가지고, 즉, 단일 항원은 한 개 또는 그 이상의 에피토프를 가진다. 본 발명의 면에서, 용어 "에피토프"는 주로 T 세포 에피토프를 지정하고, 이는 항원-제시 세포의 표면에 발현되고, 여기에 이들은 주조직 적합성 복합체(Major Histocompatibility Complex molecules, MHC)에 묶인다. MHC 클래스 I 분자에 의하여 제시된 T 세포 에피토프는 전형적으로, 그러나 전적이지는 않게, 길이 6 내지 8개 사이의 아미노산의 펩타이드이고, 반면에 MHC 클래스 II 분자는, 일반적으로, 그러나 전적이지는 않게, 길이 12 내지 25개 사이의 아미노산의 더 긴 펩타이드를 제시한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 다음으로 이루어지는 그룹에서 선택된다: (i) 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질, (ii) 폴라사카라이드, (iii) 지질(lipid), (iv) 지질단백질(lipoprotein) 또는 지질펩타이드(lipopeptide), (v) 당지질(glycolipid), (vi) 핵산, 및 (vii) 소분자 약물 또는 독소(toxin). 따라서, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 특히 만약 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프가 상기 발명 복합체에 포함되면 펩타이드, 단백질, 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질 및 당지질을 포함하는 이의 조합, 핵산(일례로, DNA, siRNA, shRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 데코이 DNA, 플라스미드), 또는 소분자 약물(일례로, 사이클로스포린(cyclosporine) A, 파크리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-아미노레불리닉산(aminolevulinic acid)), 또는 이의 임의의 조합이 될 수 있다.
상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 예를 들면 최소한 모두 연관된 한 개, 즉, 한 개 또는 이상, 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 및/또는 적어도 하나의, 즉, 한 개 또는 이상, 핵산, 일례로, 개별 한 개가 한 개 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 것을 포함할 수 있다는 것이 이해된다. 또한 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 단백질, 지질, 및/또는 지질단백질 및 당지질을 포함하는 폴리사카라이드의 조합이 될 수 있다. 따라서, 특히 만약 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체가 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다면, 이는 한 개 초과의 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질, 한 개 초과의 폴리사카라이드, 한 개 초과의 지질, 한 개 초과의 지질단백질, 한 개 초과의 펩타이드, 한 개 초과의 당지질의 핵산, 한 개 초과의 소분자 약물 또는 독소, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 암/종양-연관 항원, 암/종양-특이적 항원, 및/또는 바이러스성, 박테리아성, 곰팡이성, 원생동물성(protozoal) 및 다세포 기생충성 항원성 단백질을 포함하는 병원균(pathogen)으로부터의 한 개 또는 그 이상의 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다.
더 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 (i) 적어도 하나의 병원균 에피토프 및/또는 (ii) 적어도 하나의 암/종양 에피토프, ,특히 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다. 가장 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 적어도 하나의 암/종양 에피토프, 특히 한 개 종양 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 오직 이러한 항원(들) 또는 항원성 에피토프(들), 암/종양-연관 항원(들), 암/종양 특이적 항원(들) 및/또는 암/종양 에피토프(들)인; 특히, 종양-연관 항원(들), 종양-특이적 항원(들), 및/또는 종양 에피토프(들)을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본 명세서에 사용된 것처럼, "암 에피토프"는 암-연관 항원으로부터 또는 암-특이적 항원으로부터의 에피토프를 의미한다. 그에 따라서, "종양 에피토프"는 종양-연관 항원으로부터 또는 종양-특이적 항원으로부터의 에피토프를 의미한다. 이러한 에피토프들은 전형적으로 일정한 종류의 암/종양에 특이적이(또는 연관된)다. 특히, 암/종양-연관(또한 암/종양-관련) 항원들은, 암/종양 세포 및 정상 세포, 양자에 의하여 발현되는 항원이다. 그에 따라서, 그들 항원들은 생성 이후 (또는 심지어 이전에) 정상적으로 존재한다. 그에 따라서, 상기 면역 시스템이 그들 항원들에 대하여 자가-면역관용(self-tolerance)을 발달시켰을 수 있는 기회가 있다. 암/종양-특이적 항원은, 그에 반해서, 암/종양 세포에 의하여 특이적으로 발현되는, 그러나 정상 세포에 의해서는 아닌, 항원이다. 암/종양-특이적 항원은 특히 신생항원(neoantigen)을 포함한다. 일반적으로 신생항원은, 이전에 존재하지 않았고 존재하는, 따라서, 면역 시스템에 "새로운", 항원이다. 신생항원은 전형적으로 체세포 돌연변이(somatic mutations)에 기인한다. 암/종양 면에서, 암/종양-특이적 신생항원은 전형적으로 상기 암/종양이 발달하기 전에는 존재하지 않고 암/종양-특이적 신생항원은 통상적으로 암성(cancerous) 세포/종양 세포 내 체세포 돌연변이에 의하여 암호화된다. 신생항원은 면역 시스템에 신규한 것이므로, 그들 항원의 자가-면역관용의 위험성은 암/종양-연관 항원과 대비하여 상당히 낮다. 어쨌든 종양-특이적 돌연변이의 모든 암 세트는 독특한 것으로 나타난다. 하지만, 모든 암의 종양-특이적 돌연변이의 세트는 독특한 것으로 나타난다. 그에 따라서, 본 발명의 면에서 이러한 암/종양-특이적 항원 암/종양-특이적 항원, 특히 신생항원이 당해 기술자에게 알려진 방법, 일례로, 암 게놈 시퀀싱(cancer genome sequencing)에 의하여 결장직장암으로 진단된 대상에서 확인되는 것이 바람직하다. 확인 이후, 상기 각각 암/종양-특이적 신생항원 및/또는 암/종양-특이적 신생항원성 에피토프는 본 발명에 따른 복합체에 사용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 항원 (그러나 바람직하게는 암/종양-특이적 에피토프 아님)을 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 항원 (그러나 바람직하게는 암/종양-연관 에피토프 아님)을 포함하는 것이 또한 바람직하다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체 또한 바람직하게는, (i) 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-연관 항원 및 (ii) 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 에피토프 및/또는 한 개 또는 그 이상의 암/종양-특이적 항원 양자 모두를 포함할 수 있다.
특히, 항원 또는 항원성 에피토프가 결합되거나 또는 항원 또는 항원성 항원 에피토프가 특이적인 암/종양은 본 명세서에 기술된 바와 같이 결장직장암이다. 따라서, 항원은 바람직하게는 CRC-관련된 또는 CRC-특이적 항원이고, 에피토프는 바람직하게는 CRC-관련된 또는 CRC-특이적 항원 에피토프이다.
적절한 암/종양 에피토프는 예를 들면 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)로부터 검색될 수 있다. 암/종양 에피토프의 예들은 일례로 TRP2-유래 에피토프, 당단백질(glycoprotein) 100 (gp100) 멜라노마 항원-유래 에피토프, 당단백질 70 (gp70) 항원-유래 에피토프, 서비빈(survivin) 에피토프, IEa 에피토들, IL13rα2, Epha2 (에프린 유형-A 수용체 2, ephrin type-A receptor 2), 그들의 면역성 절편, 및 이러한 항원 및/또는 절편들의 융합체를 포함한다. 뿐만 아니라, 암/종양 에피토프의 예는 신생항원, 일례로, 예를 들면, Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 기술된 MC-38 종양 세포주로부터의 신생항원의 에피토프를 포함한다. 상기 기술된 것처럼, 신생항원은 항원이고, 정상 인간 게놈에서는 전부 존재하지 않는다. 비변형된 자가-항원과 비교하여, 이들 항원으로 입수 가능한 상기 T 세포 풀의 질이 중앙 T 세포 저항성에 의하여 영향받지 않기 때문에, 신생항원은 종양 관리(tumor control)에 관련성을 가진다. 특히, 신생항원은 개별 종양 게놈에 기초할 수 있다. 잠재적인 신생항원은 당해 분야 기술자에게 알려진, 암 게놈 시퀀싱 또는 (암) 게놈의 단백질-코딩 부분 내에서 돌연변이를 확인하는 딥-시퀀싱(deep-sequencing) 테크놀로지와 같은 방법에 의하여 예측될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체 내에서 유용한 암/종양-연관, 특히 종양-관련, 또는 조직-특이적 항원의 구체적인 예는 후술하는, 그러나 이에 제한되지 않는 항원을 포함한다: Her-2neu, SPAS-1; TRP-2, 타이로시네이즈, Melan A/Mart-1, gplOO, BAGE, GAGE, GM2 강글리오시드(ganglioside), 키네신 2(kinesin 2), TATA 구성요소 조절 인자 1(TATA element modulatory factor 1), 종양 단백질(tumor protein) D52, MAGE D, ING2, HIP-55, TGF-1 항-세포사멸 인자(anti-apoptotic factor), HOM-Mel-40/SSX2, 상피 항원(epithelial antigen) (LEA 135), DF31MUC1 항원 (Apostolopoulos et al., 1996 Immunol. Cell. Biol. 74: 457-464; Pandey et al., 1995, Cancer Res. 55: 4000-4003), MAGE-1, HOM-Mel-40/SSX2, NY-ESO-1, EGFR, CEA, Epha2, Epha4, PCDGF, HAAH, 메소텔린(Methothelin); EPCAM; NY-ESO-1, 당단백질(glycoprotein) MUC1 및 NIUC10 뮤신즈(mucins) p5 (특별히 돌연변이된 버전), EGFR, 암-연관 혈청 항원(cancer-associated serum antigen, CASA) 및 암 항원 125 (cancer antigen 125, CA 125) (Kierkegaard et al., 1995, Gynecol. Oncol. 59: 251-254), 상피 당단백질 40(epithelial glycoprotein 40, EGP40) (Kievit et al., 1997, Int. J. Cancer 71: 237-245), 편평 세포 암종 항원(squamous cell carcinoma antigen, SCC) (Lozza et al., 1997 Anticancer Res. 17: 525-529), 카텝신 E(cathepsin E) (Mota et al., 1997, Am. J Pathol. 150: 1223-1229), 멜라노마 내 타이로시네이즈(Fishman et al., 1997 Cancer 79: 1461-1464), 대뇌 해면종(cerebral cavernomas)의 세포 핵 항원(cell nuclear antigen, PCNA)(Notelet et al., 1997 Surg. Neurol. 47: 364-370), 유두갑상선암종 내 35 kD 종양-연관 자가항원(autoantigen)(Lucas et al., 1996 Anticancer Res. 16: 2493-2496), CDC27 (상기 단백질의 변형체도 포함), 항원 트리오세포스페이트 아이소머레이즈(antigens triosephosphate isomerase), 707-AP, A60 마이코박테리알 항원(mycobacterial antigen) (Macs et al., 1996, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122: 296-300), 아넥신 II(Annexin II), AFP, ART-4, BAGE, β-카테닌(catenin)/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl p190, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CA 19-9 (Tolliver and O'Brien, 1997, South Med. J. 90: 89-90; Tsuruta at al., 1997 Urol. Int. 58: 20-24), CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CEA (Huang et al., Exper Rev. Vaccines (2002)1:49-63), CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-B1), EphA2 (Zantek et al., Cell Growth Differ. (1999) 10:629-38; Carles-Kinch et al., Cancer Res. (2002) 62:2840-7), EphA4 (Cheng at al., 2002, Cytokine Growth Factor Rev. 13:75-85), 종양 연관 톰센-프리에덴레이크 항원(tumor associated Thomsen-Friedenreich antigen)(Dahlenborg et al., 1997, Int. J Cancer 70: 63-71), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT-V, gp100 (Zajac et al., 1997, Int. J Cancer 71: 491-496), HAGE, HER2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, 세포괴멸(apoptosis)의 억제제(일례로, 서비빈(survivin)), KH-1 선암(adenocarcinoma) 항원 (Deshpande and Danishefsky, 1997, Nature 387: 164-166), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE D, MART-1, MART-1/Melan-A (Kawakami and Rosenberg, 1997, Int. Rev. Immunol. 14: 173-192), MC1R, MDM-2, Myosin/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, neo-polyA polymerase, NA88-A, NY-ESO-1, NY-ESO-1a (CAG-3), PAGE-4, PAP, 프로테이네이즈 3(Proteinase 3) (Molldrem et al., Blood (1996) 88:2450-7; Molldrem et al., Blood (1997) 90:2529-34), P15, p190, Pm1/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, TEL/AML1, TPI/m, 타이로시네이즈(Tyrosinase), TARP, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1, 및 NY-ESO-1 및 LAGE-1 유전자로부터 유래된, 선택적으로 번역된(대안적으로 translated) NY-ESO-ORF2 및 CAMEL 단백질. 또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체에서 유용한 암/종양-관련된, 특히 종양-관련된 또는 조직 특이적 항원의 또 다른 예는 항원 ASCL2(Achaete-scute homolog 2)이다. 수많은 다른 암 항원들이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다.
바람직하게는, 상기 암/종양 항원 또는 상기 암/종양 에피토프는 재조합 암/종양 항원 또는 재조합 암/종양 에피토프이다. 이러한 재조합 암/종양 항원 또는 재조합 암/종양 에피토프는 상기 비투여(naive) 암/종양 항원 또는 상기 비투여 암/종양 에피토프의 전반적인 아미노산 서열 내에서 특정 아미노산을 변경(추가, 삭제 또는 치환)하는 돌연변이를 도입함으로써 구성될 수 있다. 상기 돌연변이의 도입은 상기 암/종양 항원 또는 상기 암/종양을 포유류 대상, 및 바람직하게는 인간 또는 개 대상에 걸쳐 광범위하게 적용될 수 있을 정도로 변이시키지는 않지만, 그러나 상기 초래되는 아미노산 서열이 면역관용을 중단시키거나 또는 면역 반응을 발생시키기 위한 외부 항원(foreign antigen)으로 고려되기에 충분하게 변경한다. 또 다른 방식은 그의 상응하는 비투여 암/종양 항원 또는 비투여 암/종양 에피토프; 바람직하게는 최소한 90% 에서 98% 까지 서열 일치성; 더 바람직하게는 최소한 93% 에서 98% 까지 서열 일치성; 또는 보다 더 바람직하게는 최소한 95% 에서 98% 까지 서열 일치성을 갖는 것에 대하여 최소한 85%에서 99%까지 아미노산 서열 일치성을 갖는 공통(consensus) 재조합 암/종양 항원 또는 암/종양 에피토프를 만들어 낼 수 있다. 일부 사례에서는 상기 재조합 암/종양 항원 또는 상기 재조합 암/종양 에피토프는 이의 상응하는 비처리 암/종양 항원 또는 암/종양 에피토프에 대하여 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 서열 일치성을 갖는다. 상기 비투여 암/종양 항원은 상기 특정 암 또는 암 종양과 정상적으로 연관된 항원이다. 상기 암/종양 항원에 따라서, 상기 암/종양 항원의 상기 공통 서열은포유류 종 또는 종의 서브타입 내에서 또는 바이러스 균주 또는 형철형(serotypes)에 걸쳐 존재할 수 있다. 일부 암/종양 항원은 상기 암/종양 항원의 야생형 아미노살 서열로부터 크게 차이나지 않는다. 상기 앞서 언급된 접근법은 조합되어 상기 최종 재조합 암/종양 항원 또는 암/종양 에피토프는 상기에서 논의된 비투여 암 항원 아미노산 서열에 대하여 유사율(percent similarity)을 갖는다. 바람직하게는, 하지만, 본 명세서에 기술된 암/종양 항원 에피토프의 상기 아미노산 서열은 돌연변이되지 않고, 따라서 상기 기준 에피토프 서열(reference epitope sequence)과 일치한다.
본 명세서에 사용된 "병원균 에피토프"(pathogen epitope)는 바이러스, 박테리아, 곰팡이, 원생동물 및 다세포 기생충을 포함하는 병원균으로부터의 항원성 단백질, 항원성 폴리사카라이드, 항원성 지질, 항원성 지질단백질 또는 항원성 당지질로부터의 에피토프를 의미한다. 병원균으로부터의 항원성 단백질, 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질 또는 당지질은, 예를 들어, 아메바증(Amoebiasis), 탄저병(Anthrax), 부룰리 궤양(Buruli Ulcer, 미코박테리움 울서란즈(Mycobacterium ulcerans)), 칼리시바이러스(Caliciviruses) 연관 설사, 캠필로터(Campylobacter) 설사, 자궁경부암(Cervical Cancer, 인간 파필로마바이러스(Human papillomavirus)), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 연관 생식기 질병, 콜레라, 크리미아-콩고 출혈열(Crimean-Congo haemorrhagic fever), 뎅기열(Dengue Fever), 디프테리아(Diptheria), 에볼라 출혈열(Ebola haemorrhagic fever), 장독소생성대장균 (Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) 설사, 위암(Gastric Cancer, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 임질(Gonorrhea), 그룹 A 스트렙토코커스(Group A Streptococcus) 연관 질병, 그룹 A 스트렙토코커스(Group B Streptococcus) 연관 질병, 헤모필러스 인플루엔자 B형 폐렴 및 침습 질병(invasive disease), A형 감염(Hepatitis A), B형 간염(Hepatitis B), C형 간염(Hepatitis C), E형 간염(Hepatitis E) 설사, 단순 헤르페스 유형 2 생식기 궤양(Herpes simplex type 2 genital ulcers), HIV/AIDS, 구충병(Hookworm Disease), 인플루엔자(Influenza), 일본 뇌염(Japanese encephalitis), 라사열(Lassa Fever), 리슈만편모충증(Leishmaniasis), 렙토스피라증(Leptospirosi), 간암(헤파티티스 B(Hepatitis B)), 간암(헤파티티스 C(Hepatitis C)), 라임병(Lyme Disease), 말라리아(Malaria), 마르부르그 출혈열(Marburg haemorrhagic fever), 홍역(Measles), 유행귀밑샘염(볼거리, Mumps), 비인두암(Nasopharyngeal cancer, 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus)), 수막염균 수막염(Neisseria meningitidis Meningitis), 파라인플루엔자 연관 폐렴(Parainfluenza associated pneumonia), 백일해(Pertussis), 흑사병(Plague), 회색질척수염(Poliomyelitis), 광견병(Rabies), 호흡기합포체 바이러스 폐렴(Respiratory syncytial virus (RSV) pneumonia), 리프트 계곡열(Rift Valley fever), 로타바이러스 설사(Rotavirus diarrhoea), 풍진(Rubella), 주혈흡충증(Schistosomiasis), 중증급성호흡증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS), 이질(시겔라증, Shigellosis), 마마(천연두, Smallpox), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 연관 질병, 위암(Stomach Cancer (헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae) 및 침습 질병, 파상풍(Tetanus), 진드기매개뇌염Streptococcus (Tick-borne encephalitis), 트라코마(Trachoma), 결핵(Tuberculosis), 야생토끼병(Tularaemia), 장티푸스(Typhoid fever), 서부 나일강 바이러스(West-Nile virus) 연관 질병, 황열(Yellow fever)을 포함하는 질병의 원인으로 예방접종의 표적이 될 수 있는 병원균으로부터의 단백질, 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질 또는 당지질을 함께, 포함한다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경(context) 내에서 및/또는 CD1 환경 내에서 상기 세포 표면에서 제시될 것이고, 여기서 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경 내에서의 제시가 바람직하다. 상기 구절 "MHC 클래스 I 환경 내에서 에피토프 제시"는 특히 세포의 상기 표면에서 MHC 클래스 I 분자의 홈(groove)에 놓여있는 CD8+ 에피토프를 나타낸다. 상기 구절 "MHC 클래스 II 환경 내에서 에피토프 제시"는 특히 세포의 상기 표면에서 MHC 클래스 II 분자의 홈에 놓여있는 CD4+ 에피토프를 나타낸다. 상기 구절 "CD1 환경 내에서 에피토프 제시"는 특히 세포의 상기 표면에서 분화 1 분자(differentiation 1 molecule)의 클러스터의 홈에 놓여있는 지질성 에피토프(lipidic epitope)를 나타낸다.
유익하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 세포 투과성 펩타이드 및 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 그리고 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 환경 내에서 항원 제시 세포의 상기 세포 표면에서 상술한 에피토프의 전달 및 제시를 허용하고, 그리고 따라서, 예방접종 및 면역요법에 유용하다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 이는 적어도 하나의 CD4+ 에피토프 및/또는 적어도 하나의 CD8+ 에피토프이다.
용어 "CD4+ 에피토프" 또는 "CD4+-제한 에피토프"는, 본 명세서에 사용된 것처럼, CD4+ T 세포에 의하여 인지되는 에피토프, 특히 MHC 클래스 II 분자의 홈 내에 놓여있는 항원 절편으로 이루어지는 상술한 에피토프를 지정한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체 내에 포함되는 단독 CD4+ 에피토프는 바람직하게는 약 12-25개 아미노산으로 이루어진다. 이는 또한, 예를 들면, 약 8-25개 아미노산 또는 약 6-100개 아미노산으로 이루어질 수 있다.
용어 "CD8+ 에피토프" 또는 "CD8+-제한 에피토프"는, 본 명세서에 사용된 것처럼, CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 에피토프, 특히 MHC 클래스 I 분자의 홈 내에 놓여있는 항원 절편으로 이루어지는 상술한 에피토프를 지정한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체 내에 포함되는 단독 CD8+ 에피토프는 바람직하게는 약 8-11개 아미노산으로 이루어진다. 이는 또한, 예를 들면, 약 8-15개 아미노산 또는 약 6-100개 아미노산으로 이루어질 수 있다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원은 또는 상기 적어도 하나의 항원성 에피토프는 암/종양-연관 항원, 암/종양-특이적 항원, 또는 병원균으로부터의 항원성 단백질의 항원결정인자(antigenic determinant)(들)에 상응하는 CD4+ 에피토프 및/또는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 더 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원은 또는 상기 적어도 하나의 항원성 에피토프는 암/종양-연관 항원 또는 암/종양-특이적 항원의 항원결정인자(들)에 상응하는 CD4+ 에피토프 및/또는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원은 또는 상기 적어도 하나의 항원성 에피토프는 종양-연관 항원, 종양-특이적 항원의 항원결정인자(들)에 상응하는 CD4+ 에피토프 및/또는 CD8+ 에피토프로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 것이 또한 바람직하고, 여기서 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD4+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어지고 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다. Th 세포 (CD4+)가 항-종양 면역 반응에서 DC 허용 및 상기 종양 부위에서 CTLs (CD8+)의 동원(recruitment) 및 유지(maintenance) 양자 모두에서 중심적인 역할을 수행하는 것이 현재 정립되었다. 그리하여, 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는, 여기서 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD4+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어지고 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어지고, CTLs 및 Th 세포의 동시 초회항원자극(priming)을 허용하는 통합 면역 반응을 제공하고 따라서 단지 한 개 CD8+ 에피토프 또는 단지 한 개 CD4+ 에피토프에 대한 면역에 바람직하다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 바람직하게는 Ealpha-CD4+ 에피토프 및 gp100-CD8+ 에피토프를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 여기서 상기 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프는 최소한 두 개, 일례로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 이상의 CD4+ 에피토프 및/또는 최소한 두 개, 일례로 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개, 또는 이상의 CD8+ 에피토프를 포함하거나 이로 이루어진다. 그렇게 함으로써, 상기 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프는 바람직하게는 상이한 항원 또는 항원성 에피토프, 더 바람직하게는 상기 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프는 서로간에 상이하지만 그러나 동일한 종류의 종양에 관련된다. 다중-항원성 항원(multi-antigenic vaccine)은 (i) 항원-상실 변이체의 증식을 피하고, (ii) 이질적인 종양 덩어리 내에서 상이한 종양 세포를 표적하고 (iii) 환자-대-환자 종양 변이성(variability)을 면할 것이다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 특히 바람직하게, 특히 최소한 두 개 CD8+ 에피토프 및 두 개 CD4+ 에피토프를 갖는 최소한 네 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 이러한 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 종양 세포에 대응하여 상승적으로 기능하고 효과적인 항-종양 면역을 촉진하는 다중-에피토픽(multi-epitopic) CD8 CTLs 및 CD4 Th 세포를 유도한다. Th 세포는 예방접종 이후 관측되는 지속성 세포면역(long-lasting cellular immunity)에 또한 관여된다. 이러한 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 다클론성(polyclonal), 다중-에피토프성(multi-epitopic) 면역 반응 및 다중-기능성 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 그에 따라 유효한 항-종양 활성을 유도한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 최소한 두 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 최소한 세 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 최소한 네 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 특히 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 최소한 다섯 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고 가장 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 최소한 여섯 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있고, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 서로간에 상이하다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 적어도 하나의 CD4+ 에피토프 및 적어도 하나의 CD8+ 에피토프를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 한 개 초과의 CD4+ 에피토프를 포함하고, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD4+ 에피토프 두 개 또는 이상, 그리고 바람직하게는 CD8+ 에피토프 없다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 한 개 초과의 CD8+ 에피토프를 포함하는 것이 또한 바람직하고, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD8+ 에피토프 두 개 또는 이상, 그리고 바람직하게는 CD4+ 에피토프 없다. 가장 바람직하게는, 하지만, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 (i) 적어도 하나의 CD4+ 에피토프, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD4+ 에피토프 두 개 또는 이상, 그리고 (ii) 적어도 하나의 CD8+ 에피토프, 일례로 동일한 항원으로부터 또는 상이한 항원으로부터의 CD8+ 에피토프 두 개 또는 이상을 포함한다.
예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 바람직하게는 gp100-CD8+ 에피토프, Ealpha-CD4+ 에피토프, 그리고 부가의 CD4+ 에피토프 및 부가의 CD8+ 에피토프를 포함할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 gp100-CD8+ 에피토프 및 Ealpha-CD4+ 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 SEQ ID NO: 14 또는 이의 서열 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
ESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS
SEQ ID NO: 14 (OVA-CD4+, gp100-CD8+, Ealpha-CD4+, 및 OVA-CD8+ 에피토프를 포함하는 MAD5-cargo)
예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 또한 gp70-CD8+ 에피토프 및/또는 gp70-CD4+ 에피토프를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 gp70-CD8+ 에피토프 및/또는 gp70-CD4+ 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 SEQ ID NO: 43 또는 이의 서열 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
VTYHSPSYAYHQFERRAILNRLVQFIKDRI
SEQ ID NO: 43 (gp70-CD8+ 및 gp70-CD4+ 에피토프를 포함하는 Mad8-cargo)
예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 바람직하게는 적어도 하나의 서비빈 에피토프, 예를 들어 서비빈(survivin) CD8+ 에피토프 및/또는 서비빈 CD4+ 에피토프 같은 것을 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 서비빈 CD8+ 에피토프 및/또는 서비빈 CD4+ 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 한 개 초과의 서비빈 CD8+ 에피토프 및/또는 한 개 초과의 서비빈 CD4+ 에피토프, 예를 들어 두 개 상이한 서비빈 CD8+ 에피토프 같은 것은 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 SEQ ID NO: 44 또는 이의 서열 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
NYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQR
SEQ ID NO: 44 (CD8+ 에피토프 1 및 CD8+ 에피토프 2를 포함하는 Mad11-cargo)
예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 바람직하게는 신생항원으로부터의 에피토프를 포함할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 신생항원(neoantigen)으로부터의 에피토프, 예를 들어 Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 MC-38 종양 세포주 확인된 신생항원 같은 것을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 SEQ ID NO: 42 또는 이의 서열 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
HLELASMTNMELMSSIV
SEQ ID NO: 42 (Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 기술된 신생항원으로부터의 에피토프를 포함하는 Mad9-cargo).
예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 바람직하게는 신생항원으로부터 한 개 초과, 예를 들면 두 개 또는 세 개, 에피토프를 포함할 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 신생항원으로부터의 한 개 초과의 에피토프, 예를 들어 Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 확인된 MC-38 종양 세포주 같은 것을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 이러한 폴리펩타이드 또는 단백질은 상기 정의된 것처럼 SEQ ID NO: 63 또는 이의 서열 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다:
LFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEG
SEQ ID NO: 63 (Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 기술된 신생항원으로부터의 에피토프를 포함하는 Mad12-cargo).
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질이다. 본 발명에 유용한 펩타이드성(peptidic), 폴리펩타이드성(polypeptidic), 또는 단백질성(proteic) 성질의 항원 또는 항원성 에피토프의 예시는, 암/종양 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 알레르기 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 자가-면역 자가-항원 또는 그의 항원성 에피토프, 병원성 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 및 바이러스로부터의 항원 또는 그의 항원성 에피토프, 바람직하게는 거대세포바이러스(cytomegalovirus, CMV), 오소폭스 천연두 바이러스(orthopox variola virus), 오소폭스 알라스트림 바이러스(orthopox alastrim virus), 파라폭스 오비스 바이러스(parafox ovis virus), 전염물렁증 바이러스(molluscum contagiosum virus), 단순 헤르페스 1형 바이러스(herpes simplex virus 1), 단순 헤르페스 2형 바이러스(herpes simplex virus 2), B형 간염 바이러스(herpes B virus), 수두대상포진바이러스(varicella zoster virus), 슈도레이비스 바이러스(pseudorabies virus), 인간 거대세포 바이러스(human cytomegaly virus), 인간 헤르페스 바이러스 6형(human herpes virus 6), 인간 헤르페스 바이러스 7형(human herpes virus 7), 엡스테인-바르 바이러스(Epstein-Barr virus), 인간 헤르페스 바이러스 8형(human herpes virus 8), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus), 오뇽뇽 바이러스(O'nyong'nyong virus), 루비 바이러스(rubivirus), C형 간염 바이러스(hepatitis C virus), G형 간염 바이러스(GB virus C), 서부 나일강 바이러스(West Nile virus), 뎅기 바이러스(dengue virus), 황열 바이러스(yellow fever virus), 도약병 바이러스(louping ill virus), 세인트루이스 뇌염 바이러스(St. Louis encephalitis virus), 일본B형 뇌염바이러스(Japan B encephalitis virus), 포와산바이러스(Powassan virus), 초여름 수막 뇌염 바이러스(초여름 수막 뇌염 바이러스, FSME virus), 중증급성호흡증후군(SARS), 사스-코로나 바이러스(SARS-associated corona virus), 인간 코로나 바이러스 229E(human corona virus 229E), 인간 코로나 바이러스 Oc43(human corona virus Oc43), 토로바이러스(Torovirus), 제1형 사람 T 림프친화성 백혈병 바이러스(human T cell lymphotropic virus type I), 제2형 사람 T 림프친화성 백혈병 바이러스(human T cell lymphotropic virus type II), HIV(AIDS), 즉, 제1형 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus type 1) 또는 제2형 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus type 2), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 라사열 바이러스(Lassa virus), 림프구성 맥락수막염 바이러스(lymphocytic choriomeningitis virus), 타카라이브 바이러스(Tacaribe virus), 쥬닌 바이러스(Junin virus), 마추포 바이러스(Machupo virus), 보르나명 바이러스(Borna disease virus), 분얌웨라 바이러스(Bunyamwera virus), 캘리포니아 뇌염 바이러스(California encephalitis virus), 리프트 계곡열바이러스(Rift Valley fever virus), 등애매개열 바이러스(sand fly fever virus), 토스카나 바이러스(Toscana virus), 크리미아-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus), 하자라 바이러스(Hazara virus), 크하산 바이러스(Khasan virus), 한탄 바이러스(Hantaan virus), 서울 바이러스(Seoul virus), 프로스펙트 힐 바이러스(Prospect Hill virus), 푸말라 바이러스(Puumala virus), 도라바-벨그라데 바이러스(Dobrava Belgrade virus), 툴라 바이러스(Tula virus), 신 놈브레 바이러스(sin nombre virus), 빅토리아 호수 마르부르그 바이러스(Lake Victoria Marburg virus), 자이레 에볼라 바이러스(Zaire Ebola virus), 수단 에볼라 바이러스(Sudan Ebola virus), 아이보리 코스트 에볼라 바이러스(Ivory Coast Ebola virus), A형 인플루엔자 바이러스(influenza virus A), B형 인플루엔자 바이러스(influenza virus B), C형 인플루엔자 바이러스(influenza virus C), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 말라리아 기생충(malaria parasite)(열대열원충(Plasmodium falciparum), 삼일열원충(Plasmodium vivax), 난형열원충(Plasmodium ovale), 사일열원충(Plasmodium malariae), 원숭이열원충(Plasmodium knowlesi)), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(measles virus), 유행성이하선염 바이러스(mumps virus), 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus), 사람 메타뮤노바이러스(human metapneumovirus), 소포성 구내념 인디안 바이러스(vesicular stomatitis Indiana virus), 광견병 바이러스(rabies virus), 모콜라 바이러스(Mokola virus), 두벤하게 바이러스(Duvenhage virus), 유럽 박쥐 라사바이러스 1 + 2(European bat lyssavirus 1 + 2), 오스트레일리아 박쥐 라사바이러스(Australian bat lyssavirus), 아데노바이러스 A-F(adenoviruses A-F), 인간 파필로마바이러스(human papillomavirus), 콘딜로마 바이러스 6(condyloma virus 6), 콘딜로마 바이러스 11(condyloma virus 11), 폴리오마 바이러스(polyoma viruses), 아데노-관련 바이러스 2(adeno-associated virus 2), 로타바이러스(rotaviruses), 오르비바이러스(orbiviruses), 수두대상포진(varizella zoster)을 포함하는 수두(varicella) 등등으로부터의, 또는 리슈만편모충(leishmania), 티파노좀(typanosomes), 아메바(amibes), 박테리아(bacteria), 등등으로부터의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 또는 에피토프로부터 또는 상기 항원 또는 항원성 에피토프의 변이체로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 상기에서 정의된 에피토프는 물론 항원의 변이체도 상기에서 보이거나 기술한 한 개의 상기 항원 또는 항원 서열과 약 10 %, 특히 최소한 10 %, 약 20 %, 특히 약 20 %, 약 30 %, 특히 최소한 30 %, 약 40 %, 특히 최소한 40 %, 약 50 %, 특히 최소한 50 %, 약 60 %, 특히 최소한 60 %, 약 70 %, 특히 최소한 70 %, 약 80 %, 특히 최소한 80 %, 약 90 % 특히 최소한 90 %, 최소한 95 % 또는 최소한 98 %의 서열 상동성 또는 일치성을 나타낸다. 이와 관련해서, 상기 에피토프 및 변이체의 정의는 정의된 것과 유사하게 적용된다.
펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질 카테고리 내 항원 또는 항원성 에피토프의 예들은 Novellino et al. (2005, Cancer Immunol Immunother , 54(3):187-207), Vigneron et al. (2013, Cancer Immun .13: 15)에 의해 기술된 것들과 같은 다발신경아교종(multiple glioma) 에피토프의 조합을 포함한다. 하지만, 본 발명에 따라 사용하기 위한 단일 복합체는 또한 단지 서브셋(subset), 일례로 한 개 또는 이상의 상술한 신경아교종 에피토프를 포함할 수 있다. 이러한 예에서, 바람직하게는 본 발명에 따른 상이한 복합체는 한 개 또는 이상의 상술한 신경아교종 에피토프의 상이한 서브셋을 포함하고, 따라서 예를 들면 본 발명에 따른 이러한 상이한 복합체를 포함하는 본 발명에 따른 백신은 모든 상술한 신경아교종 에피토프를 포함하나 그러나 상기 상이한 복합체에 분포된다.
게다가, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 또한 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함할 수 있고, 여기서 상기 항원 또는 항원성 에피토프 항원 또는 항원성 에피토프는 폴리사카라이드, 지질, 지질단백질, 및/또는 당지질이고, 특히 폴리사카라이드성, 지질성, 지질단백질성, 및/또는 당지질성 에피토프이고, 예를 들면, 상기 정의된 병원균 에피토프가 될 수 있다.
특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함할 수 있고, 여기서 상기 항원 또는 항원성 에피토프 항원 또는 항원성 에피토프는 바이러스성, 박테리아성, 곰팡이성, 원생동물성 및 다세포 기생충성 항원 또는 에피토프를 포함하는 폴리사카라이드성, 지질성, 지질단백질성, 및/또는 당지질성이다.
바람직하게는, 상술한 에피토프는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경에서 상기 세포 표면에 제시될 것이다.
바람직하게는, 상술한 지질성 에피토프는 CD1(cluster of differentiation 1) 내 상기 세포 표면에 제시될 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 또한 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함할 것이고, 여기서 상술한 항원 또는 항원성 에피토프는 소분자 약물 또는 독소이다.
본 발명에 유용한 상기 소분자 약물 또는 독소의 카테고리 내 카르고 분자의 예는 사이클로스포린 A(cyclosporine A), 파크리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 5-아미노레불리닉산(aminolevulinic acid), 디프테리아 독소(diphtheria toxin), 수니티닙(sunitinib) 및 De wit Amer (2010, Neuro Oncol , 12(3):304-16) 내에서 검토된 것들을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 이상의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 (최소한) 두 개 또는 세 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 (최소한) 네 개 또는 다섯 개 항원 또는 항원성 에피토프를 포함한다.
만일 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프가 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되는 상술한 항원 또는 항원성 에피토프는 특히 또한 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 공유적으로 결합, 일례로 또 다른 항원 또는 항원성 에피토프과 및/또는 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드에 대해, 및/또는 성분 c), 즉 TLR 펩타이드 작용제에 대해,하는 것이 이해된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되는 상기 다양한 항원 또는 항원성 에피토프는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되는 상기 다양한 항원 또는 항원성 에피토프는 서로 간에 상이하고, 따라서 다중-항원성(multi-antigenic) 및/또는 다중-에피토프성(multi-epitopic) 복합체를 제공한다.
게다가, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 항원 또는 항원성 에피토프는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 연속적으로 위치하는 것이 바람직하다. 이는 특히 상기 복합체에 의해 포함되는 모든 항원 및/또는 항원성 에피토프가 나열하여 위치하는 것을 의미하고, 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드에 의해서도 성분 c), 즉 TLR 펩타이드 작용제에 의해서도 방해받지 않는다. 오히려, 성분 a) 및 성분 c)는 상기 복합체 내에서 예를 들면 모든 항원 및/또는 항원성 에피토프의 나열(stretch) 이전 또는 이후에 위치한다. 하지만, 이러한 방식으로 연속적으로 위치한 상기 항원 및/또는 항원성 에피토프는 예를 들면 하기 기술되는 스페이서(spacer) 또는 링커(linker)에 의해 서로 간에 연결될 수 있고, 이것은 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드도 아니고, 성분 c), 즉 TLR 펩타이드 작용제도 아니다.
게다가, 본 발명에 따른 사용을 위한 복합체는 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 따라서, 복합체는 바람직하게는 하나 이상의 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 예를 들어, 복합체는 제1항원의 하나 이상의 항원 에피토프 및 제2항원의 하나 이상의 항원 에피토프를 포함할 수 있으며; 또는 복합체는 제1항원의 하나 이상의 항원 에피토프, 제2항원의 하나 이상의 항원 에피토프 및 제3항원의 하나 이상의 항원 에피토프를 포함할 수 있다; 또는 복합체는 제1항원의 하나 이상의 항원 에피토프, 제2항원의 하나 이상의 항원 에피토프, 제3항원의 하나 이상의 항원 에피토프 및 제4항원의 하나 이상의 항원 에피토프를 포함할 수 있다; 등등. 바람직한 구현예에서, 복합체는 하나 이상의 항원의 하나 이상의 에피토프를 포함하고; 보다 바람직하게는 동일한 항원의 항원성 에피토프가 본 발명에 따른 사용을 위해 복합체 내에서 연속적으로 (또는 중첩되어) 위치한다. 이것은 특히 복합체에 포함된 동일한 항원의 모든 항원성 에피토프가 성분 a), 즉 세포 침투성 펩타이드에 의해서도, 성분 c), 즉 TLR 펩타이드 작용제에 의해서도, 또한 그 어떠한 다른 항원성 에피토프(즉, 다른 항원으로부터의 에피토프)에 의해서도 방해받지 않는 스트레치에 위치한다는 것을 의미한다.
대안적으로, 하지만, 상기 다양한 항원 및/또는 항원성 에피토프는 또한 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 임의의 다른 방식으로, 예를 들면 두 개 또는 그 이상의 항원 및/또는 항원성 에피토프 사이에 위치한 성분 a) 및/또는 성분 c), 즉 성분 a) 및 성분 c)(또는 그와 정반대) 사이에 위치한 한 개 또는 그 이상의 항원 및/또는 항원성 에피토프와 함께, 및, 선택적으로, 성분 a) 및/또는 성분 c) 각각의 다른 말단에 위치한 한 개 또는 그 이상의 항원 및/또는 항원성 에피토프와 함께 위치할 수 있다.
결장직장암에 관련되는 수많은 상이한 항원 또는 항원성 에피토프는 본 발명에 따라 사용되기 위한 단일 복합체에 의해 유익하게 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 대안적으로, 결장직장암에 관련되는 수많은 상이한 항원 또는 항원성 에피토프는 상이한 항원 또는 항원성 에피토프의 서브셋, 특히 본 발명에 따른 상이한 복합체들에 의해 포함되는 결장직장암의 맥락에서 서로 간에 보완하는 서브셋에 분포할 수 있고, 그에 따라 상이한 서브셋을 포함하는 이러한 상이한 복합체들은 필요한 대상체에게 유익하게 동시에, 일례로 단일 백신으로, 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 및 IL13알파2로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프인 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 ASCL2, EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프인 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함한다. 이러한 항원은 결장직장암과 관련하여 특히 유용하다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 항원, 또는 이들의 단편, 또는 종양 항원의 서열 변이체 또는 그의 단편의 서열 변이체를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 ASCL2, EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 종양 항원, 또는 이의 단편, 또는 종양 항원의 서열 변이체 또는 그의 단편의 서열 변이체를 포함하는 것이 또한 바람직하다. 본 명세서에 사용된, 항원의 "절편"(fragment)은 상기 항원의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 상기 항원의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 상기 항원의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 상기 항원의 적어도 25개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 상기 항원의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다. "서열 변이체"는 상기 정의된 대로 이고, 다시 말해 서열 변이체는 상기 기준 서열에 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 일치하는 (아미노산) 서열을 갖는다. "기능적"(functional) 서열 변이체는 항원/항원 단편/에피토프의 측면에서, 에피토프(들), 예컨대 항원(단편)에 의해 포함되는 에피토프(들)의 기능이 손상되거나 또는 철폐되지 않음을 의미한다. 하지만 바람직하게는 에피토프(들), 예컨대 본 명세서 기술된 바와 같이 암/종양 항원(단편)에 의해 포함되는 에피토프(들)의 아미노산 서열은 돌연변이되지 않고, 따라서, 기준 에피토프 서열에 일치한다.
상기 기술된 것처럼, 이들 항원의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
EpCAM
Ep-Cam은 세포 부착(cellular adhesion)을 매개하는 당단백질이다. 상기 EpCAM 의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA
[SEQ ID NO: 47]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 SEQ ID NO: 47 또는 절편 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
EpCAM의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 EpCAM 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 EpCAM 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 EpCAM 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낼 수 있다):
GLKAGVIAV
[SEQ ID NO: 48]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 48에 따른 아미노산 서열 또는 본 명세서에 기술된 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
HER-2/ neu
Her-2는 표피성장인자 수용체(EGFR, epidermal growth factor receptor) 패밀리에 속한다. 많은 HLA-A 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 상기 HER2의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV
[SEQ ID NO: 70]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 SEQ ID NO: 70 또는 절편 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 상기 기술된 것처럼, HER-2의 적합한 암/종양 에피토프는 문헌으로부터 알려지거나 또는 암/종양 에피토프 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. 펩타이드 데이터베이스: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 여기서 CD4+ 또는 CD8+ T 세포에 의하여 인지되는 인간 종양 항원들을 그들의 발현 경향에 따라 네 개 주요 그룹으로 나눔, 또는 데이터베이스 "탄티젠"(Tantigen)(TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/) 사용에 의해 확인될 수 있다.
Mucin -1 ( MUC -1)
MUC-1는, 세포 부착에 작용하는 인간 표피 뮤신(human epithelial mucin)이다. MUC-1의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL
[SEQ ID NO: 49]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 SEQ ID NO: 49 또는 절편 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
MUC-1의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 MUC-1 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 MUC-1 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 MUC-1 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열 각각은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낼 수 있다):
GSTAPPVHN
[SEQ ID NO: 50]
TAPPAHGVTS
[SEQ ID NO: 51]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 50 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
TOMM34
TOMM34는 전구체 단백질(precursor proteins)의 미트콘드리아 안으로의 내수송(import)에 관여된다. 이의 많은 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다.
RNF 43
RNF43은 RING-타입 E3 유비퀴틴 리가아제(ubiquitin ligase)이고 막통과 도메인(transmembrane domain), 프로테아제-연관 도메인(protease-associated domain), 엑토도메인(ectodomain), 및 세포질 RING 도메인(cytoplasmic RING domain)을 포함하는 것으로 예상된다. RNF43은 Wnt 시그널링을 음조절(negatively regulate)하는 것으로 생각되어지고, RNF43의 발현은 프리즐드 수용체(frizzed receptor)의 유비퀴틴화(ubiquitination) 증가, 이의 세포하 분포(subcellular distribution)의 변이, 그에 따른 이들 수용체의 감소된 표면 수준을 초래하는 결과를 초래한다.
KOC1
KOC1은, 또한 인슐린-유사 성장 인자 2 mRNA-바인딩 단백질(insulin-like growth factor 2 mRNA-결합ing protein 3, IGF2BP3)로 알려진, mRNA 바인딩 단백질이다. 하지만 발현 데이터가 입수 가능하지 않다.
혈관 내피 성장 인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF )/ 혈관 내피 성장 인자 수용체(Vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)
혈관 내피 성장 인자는, 원래 혈관 투과 인자(vascular permeability factor, VPF)라고 알려진, 혈관 형성(vasculogenesis) 및 혈관 신생(angiogenesis)을 촉진하는 세포에 의해서 생산되는 신호 단백질(signal protein)이다. 이는 혈액 순환이 불충분한 경우 조직으로 산소 공급을 저장하는 시스템의 일부이다. VEGF의 일반적인 기능은 배발생(embryonic development) 동안 새로운 혈관, 상처 이후 새로운 혈관, 운동 후 근육, 및 막힌 혈관을 우회하는 새로운 혈관(곁순환, collateral circulation)을 만들어 내는 것이다. VEGF (VEGFR)를 위한 수용체에는 세 가지 주요 서브타입, 다시 말해 VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3이 존재한다.
사람융모생식샘자극호르몬 (human chorionic gonadotropin , βhCG )의 베타 서브유닛(Beta subunit)
사람융모생식샘자극호르몬(Human chorionic gonadotropin, hCG)은 착상(implantation)에 따른 배아에서 생산되는 호르몬이다. 몇 몇 암성 종양(cancerous tumors)은 이 호르몬을 생산한다; 그리하여, 환자가 임신이 아닌 경우에 측정된 상승된 수준은 암 진단으로 이어진다. hCG는 황체형성호르몬(luteinizing hormone, LH), 난포자극 호르몬(follicle-stimulating hormone, FSH), 갑상선-자극 호르몬(thyroid-stimulating hormone, TSH)의 그것과 일치하는 알파 서브유닛(α(alpha) subunit) 및 hCG에 독특한 베타 서브유닛(β(beta) subunit)의 이형이량체(heterodimeric)이다. 상기 The β-subunit of hCG 고나도트로핀(gonadotropin)의 베타-서브유닛(beta-hCG)은 145 개 아미노산을 포함하고 여섯 개 고도로 상동하는(homologous) 유전자에 의하여 암호화된다.
서비빈(Survivin)
서비빈(Survivin)은, 또한 아폽토시스 반복-포함 5의 바큐로바이러스 억제제(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5) 또는 BIRC5로 불리우고, 아폽토시스 억제제(inhibitor of apoptosis, IAP) 패밀리의 구성원이다. 상기 서비빈 단백질은 카스파아제(caspase) 활성을 억제하는 기능을 하고, 그렇게 함으로써 아폽토시스 또는 프로그램된 세포 죽음의 음조절(negative regulation)을 이끈다. 상기 서비빈의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD
[SEQ ID NO: 52]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 SEQ ID NO: 52 또는 절편 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
서비빈의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 서비빈 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 서비빈 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 서비빈 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
RISTFKNWPF
[SEQ ID NO: 53]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 53에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 복합체는 서비빈의 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산(바람직하게는 적어도 15개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 20개 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 25개 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 30개 아미노산)의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 53에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
암- 배아항원 ( Carcino -embryonic antigen, CEA )
CEA는 세포내 부착(intracellular adhesion) 당단백질이다. CEA는 태아 발달(fetal development)동안 위장관 조직에서 정상적으로 생산되고, 그러나 상기 생산은 출생 이전에 중단된다. 그리하여, CEA는 통상적으로 건강한 성인의 혈액 내에 단지 매우 낮은 수준으로 존재한다. 상기 CEA의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVAL
[SEQ ID NO: 54]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 SEQ ID NO: 54 또는 절편 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
CEA의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 CEA 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 CEA 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 CEA 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
YLSGANLNLS
[SEQ ID NO: 55]
SWRINGIPQQ
[SEQ ID NO: 56]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 55 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 복합체는 CEA의 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산(바람직하게는 적어도 15개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 20개 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 25개 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 30개 아미노산)의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 55에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다 .
전환 성장 인자 베타 수용체 2형(Transforming growth factor beta receptor 2, TGFβR2)
TGFβ 수용체는 단일 통과(single pass) 세린/트레오닌 키나아제(serine/threonine kinase) 수용체이다. 그들은 몇 몇 상이한 아형(isoform)으로 존재한다. TGFβR2은 단백질 키나아제 도메인을 가지고, 또 다른 수용체 단백질을 갖는 이형이량체 복합체를 형성하고, 그리고 TGF-beta에 결합하는 막통과 단백질이다. 이 수용체/리간드 복합체는 단백질을 인산화하고, 이후 핵으로 들어가고 세포 분열과 관련된 유전자의 세브셋의 전사를 조절한다.
P53
P53은 게놈 돌연변이를 방지하는 역할을 하는 종양 억제 단백질(tumor suppressor protein)이다. P53은 항암 기능의 많은 기전을 가지고 아폽토시스, 유전자 안정성, 및 혈관 신생(angiogenesis)의 억제 역할을 한다. 그의 항암 역할에서, p53은 몇 몇 기전을 통하여 작동한다: DNA가 지속된 손상을 입는 경우 DNA 수리 단백질을 활성화하고; DNA 손상 인지시 세포 주기를 G1/S 조절 지점(G1/S regulation point)에서 잡아서 성장을 정지시킬 수 있고; 그리고 아폽토시스를 개시할 수 있다.
키르스텐 라스 ( 케이라스 , Kirsten Ras , KRas )
V-Ki-ras2 키르스텐 랫 바이랄 온코진 호모로그(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 및 KRas로 알려진 GTPase KRas는, 정상 조직 시그널링(normal tissue signaliing)에서 필수적인 기능을 수행하고, 그리고 KRAS 유전자의 돌연변이는 많은 암의 발달에 필수적인 단계이다. 상기 ras 서브패밀리의 다른 구성원과 같이, 상기 KRAS 단백질은 GTPase이고 많은 신호 전달 경로에서 조기 작용자(early player)이다. KRAS는 그의 C-말단(C-terminus)의 아이소프렌 기(isoprene group)의 존재 때문에 통상적으로 세포막에 묶여 있다. 상기 KRas의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM
[SEQ ID NO: 57]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 SEQ ID NO: 57 또는 절편 또는 이의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
Kirsten Ras의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 Kirsten Ras 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 Kirsten Ras 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 Kirsten Ras 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
VVVGAGGVG
[SEQ ID NO: 58]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 58에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
O-연결 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제 (O-Linked N- Acetylglucosamine (GlcNAc) Transferase, OGT)
OGT (O-연결 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 트랜스퍼라아제(O-Linked N-Acetylglucosamine (GlcNAc) Transferase), O-GlcNAc 트랜스퍼라아제(O-GlcNAc transferase), OGTase, O-연결 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(O-linked N-acetylglucosaminyltransferase), 유리딘 디포스포-N-아세틸글루코사민:폴리펩타이드 베타-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(uridine diphospho-N-acetylglucosamine:polypeptide beta-N-acetylglucosaminyltransferase), 단백질 O-연결 베타-N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라아제(protein O-linked beta-N-acetylglucosamine transferase))는 시스템 이름 UDP-N-아세틸-D-글루코사민:단백질-O-베타-N-아세틸-D-글루코사미닐 트랜스퍼라아제(UDP-N-acetyl-D-glucosamine:protein-O-beta-N-acetyl-D-glucosaminyl transferase)의 효소이다 시스템 이름 "UDP-N-아세틸-D-글루코사민:단백질-O-베타-N-아세틸-D-글루코사미닐 트랜스퍼라아"(UDP-N-acetyl-D-glucosamine:protein-O-beta-N-acetyl-D-glucosaminyl transferase)의 효소이다. OGT는 O-글리코시딕 결합(O-glycosidic linkage)내 단일 N-글루코사민(N-glucosamine)을 세포 내 단백질의 세린 또는 트레오닌 잔기로의 추가를 촉진한다. OGT는 인간 신체 내 생물학적 기능의 호스트의 부분이다. OGT는 AKT1의 상기 트레오닌 308 인산화를 억제하고, IRS1 인산화(세린 307 및 세린 632/635 위치)의 속도를 증가시키고, 인슐린 시그널을 감소시키고, 그리고 인슐린 시그널의 성분을 글리코실화(glycosylation)하는 것에 의해 근육 세포 및 지방 세포(adipocytes) 내 인슐린의 저항성에 관여된다. 추가적으로, OGT는 N-아세틸글루코사민의 추가와 함께 세린 및 트레오닌 잔기의 세포 내 글리코실화를 촉진한다. 연구들은 OGT 대립형질(alleles)은 배아형성(embryogenesis)에 치명적이고, 그리고 OGT는 세포 내 글리코실화 및 배아 줄기 세포(embryonic stem cell) 활력에 필요하다. OGT는 또한 전사 인자 및 RNA 폴리머라아제 II(RNA polymerase II)를 변형시키는 상기 번역 후 변형을 촉진하나, 하지만 이 변형의 특이적인 기능은 대부분 안 알려져 있다.
카스파아제 5(Caspase 5, CASP5)
카스파아제 5는 다른 단백질을 아스파르트 아미노산 잔기에서 단백질 가수분해하는 효소이고, 그리고 카스파아제라고 불리우는 시스테인 프로테아제(cystein protease) 패밀리에 속한다. 이는 카스파아제 1(caspase 1), 카스파아제 4(caspase 4) 및 뮤린 카스파아제 4 호모로그 카스파아제 11(murine caspase 4 homolog caspase 11)고 함께, 염증성 카스파아제이고 면역 시스템 내에서 역할을 가진다.
결장직장 종양-연관 항원-1(Colorectal tumor- assiciated antigen-1, COA -1)
COA-1는 2003년 Maccalli et al. (Maccalli, C., et al., Identification of a colorectal tumor- assiciated antigen ( COA -1) recognized by CD4(+) T lymphocytes. Cancer Res, 2003. 63(20): p. 6735-43) 에 의하여 결장직장 및 흑색종 세포에 의해 강하게 발현되는 것으로 확인되었다(입수 가능 자료 없음). 그의 돌연변이는 종양 및 정상 세포의 차이나는 인지에 개입할 것이다.
흑색종 연관-항원(Melanoma-associate antigen, MAGE)
MAGE (Melanoma-associated antigen, 흑색종 연관-항원) 유전자 패밀리의 포유류 구성원은, 남성 생식 세포(male germ cell) 및, 그들 중 일부는, 태반은 예외로 하고 원래 정상 성인 조직에서는 침묵(silent)하는 것으로 기술되었다. 그에 반해서, 이들 유전자는 다양한 종류의 종양에서 발현되었다. 그리하여, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 바람직하게는 상기 MAGE-패밀리(family)의 항원 ("MAGE" 항원) 또는 그의 에피토프를 포함한다. 상기 MAGE 패밀리 중에서, 특히 MAGE-A3 및 MAGE-D4가 바람직하고, 그리고 MAGE-A3가 특히 바람직하다. MAGE-A3의 건강한 세포에서의 정상 기능은 안 알려져 있다. MAGE-A3는 종양-특이적 단백질이고, 그리고 많은 종양에서 확인되었다. 상기 MAGE-A3의 아미노산 서열은 하기에서 보여진다:
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKAFSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHIS YPPLHEWVLREGEE
[SEQ ID NO: 59]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 59에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
MAGE-A3의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 MAGE-A3 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 MAGE-A3 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 MAGE-A3 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
KVAELVHFL
[SEQ ID NO: 60]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 60에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
T-세포에 인지되는 편평 세포 암종 항원( Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells, SART)
상기 SART 패밀리 내에서, SART-3가 가장 바람직하다. 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 바람직하게는 상기 SART-패밀리의 항원 ("SART" 항원) 또는 이의 에피토프를 포함하고; 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 더 바람직하게는 SART-3 또는 이의 에피토프를 포함한다. T-세포 3(T-cell 3)에 인지된 편평 세포 암종 항원은 암 환자에서 HLA-A24-제한되고 종양 에피토프 및 종양-특이적 세포 독성 T 림프구를 유도할 수 있는 종양 에피토프를 보유한다. SART-3는 mRNA 스플라이싱(splicing)의 조절에 관여되는 것으로 생각된다.
IL13R알파2
IL13R알파2는 인터루킨 13(interleukin 13, IL-13)을 매우 높은 친화성으로 결합하고(그리고 그리하여 이를 분리(sequester)할 수 있고) 그러나 IL-4 결합을 허용하지 않는다. 이는 IL-13 및 IL-4 양자 모두의 음조절제(negative regulator)로 작용하나, 하지만 이의 상기 기전은 아직 불명이다.
MAFVCLAIGCLYTFLISTTFGCTSSSDTEIKVNPPQDFEIVDPGYLGYLYLQWQPPLSLDHFKECTVEYELKYRNIGSETWKTIITKNLHYKDGFDLNKGIEAKIHTLLPWQCTNGSEVQSSWAETTYWISPQGIPETKVQDMDCVYYNWQYLLCSWKPGIGVLLDTNYNLFYWYEGLDHALQCVDYIKADGQNIGCRFPYLEASDYKDFYICVNGSSENKPIRSSYFTFQLQNIVKPLPPVYLTFTRESSCEIKLKWSIPLGPIPARCFDYEIEIREDDTTLVTATVENETYTLKTTNETRQLCFVVRSKVNIYCSDDGIWSEWSDKQCWEGEDLSKKTLLRFWLPFGFILILVIFVTG LLLRKPNTYPKMIPEFFCDT
[SEQ ID NO: 61]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 본 명세서에 기술된 것처럼 SEQ ID NO: 61 또는 절편 또는 그의 변이체에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
IL13R알파2의 몇몇 에피토프가 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 바람직한 IL13R알파2 에피토프는, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 의해 포함되고, 후술하는 에피토프를 포함한다(하기에서 보여지는 상기 에피토프 서열은 상술한 IL13R알파2 서열의 절편이고, 따라서, 상술한 IL13R알파2 서열 내에서 밑줄로 보여졌다; 상기 후술하는 에피토프 서열은 한 개 에피토프 또는 한 개 초과의 (겹쳐지는) 에피토프를 나타낸다):
LPFGFIL
[SEQ ID NO: 62]
그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 SEQ ID NO: 62에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
ASCL2 ( Achaete - scute homolog 2)
ASCL2는 태반 발달 중에 영양포(trophoblast) 증식의 유지를 위해 필수적인 기본적인 헬릭스-루프-헬릭스 전사 인자이다. ASCL2는 장 신생물(neoplasia)에서 과발현되는 증식의 추정 조절자임이 밝혀졌다. ASCL2의 아미노산 서열은 다음과 같다:
MDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
[SEQ ID NO: 92]
따라서, 본 발명에 따른 사용을 위한 바람직한 복합체는 서열 번호 92에 따른 아미노산 서열 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 이의 단편 또는 변이체를 포함한다.
ASCL2의 몇몇 에피토프는 당업자에게 공지되어있다. 본 발명에 사용하기 위한 복합체에 바람직하게 포함되는 바람직한 ASCL2 에피토프는 하기 에피토프를 포함한다(하기에 나타낸 에피토프 서열은 상기 ASCL2 서열의 단편이며, 따라서 상기 ASCL2 서열 중에 밑줄이 그어져 보여진다; 하기 에피토프 서열 각각은 하나의 에피토프 또는 하나 이상의(오버랩하는) 에피토프를 지칭할 수 있다:
SAVEYIRALQ
[SEQ ID NO: 93]
ERELLDFSSW
[SEQ ID NO: 94]
따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 바람직한 복합체는 서열 번호 93에 따른 아미노산 서열 및/또는 서열 번호 94에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 ASCL2의 에피토프를 포함하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 복합체는 서열 번호 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10개의 아미노산(바람직하게는 적어도 15개의 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 25개의 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 30개의 아미노산)의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%의 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 93에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 복합체는 서열 번호 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99%)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 서열 번호 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60 및 62 중 어느 하나에 따른 에피토프와 같은, EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas, MAGE-A3 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프인, 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함한다; 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 서열 번호 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 62, 93 및 94 중 어느 하나에 따른 에피토프와 같은, EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas, MAGE-A3, IL13R알파2 및 ASCL2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프인, 적어도 하나의 종양 에피토프를 포함한다; 더 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 서열 번호 48, 50 51, 53, 55, 56, 58 및 60중 어느 하나에 따른 에피토프와 같은, EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas 및 MAGE-A3로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프이다; 더 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 서열 번호 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 93 및 94 중의 어느 하나에 따른 에피토프와 같은, EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas, MAGE-A3 및 ASCL2로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프이다; 더욱 더 바람직하게는, 적어도 하나의 종양 에피토프는 서열 번호 48, 50, 51, 53, 55 및 56 중 어느 하나에 따른 에피토프와 같은, EpCAM, MUC-1, 서비빈 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프이다; 심지어 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 서열 번호 48, 50, 51, 53, 55, 56, 93 및 94 중 어느 하나에 따른 에피토프와 같은, EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA 및 ASCL2로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프이다; 가장 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 서열 번호 48, 53, 55, 56, 93 및 94 중의 어느 하나에 따른 에피토프와 같은, EpCAM, 서비빈, CEA 및 ASCL2로 이루어진 군으로부터 선택된 항원의 에피토프이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 다음을 포함하는 것이 또한 바람직하다:
i) EpCAM의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
ii) MUC-1의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
iii) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
iv) CEA의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
v) KRas의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 58에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
vi) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 60에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 변이체는 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
vii) EpCAM의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
viii) MUC-1의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
ix) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
x) CEA의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xi) KRas의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 58에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xii) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 60에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
xiii) ASCL2의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
상기 기술된 것처럼, 이들 항원의 부가적인 에피토프(상기 예시된 에피토프에 추가하여)는 암/종양 에피토브 데이터베이스, 일례로 van der Bruggen P, Stroobant V, Vigneron N, Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, 또는 데이터베이스 "Tantigen" (TANTIGEN version 1.0, Dec 1, 2009; Cancer Vaccine Center의 Bioinformatics Core, Dana-Farber Cancer Institute 개발; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)로부터 쉽게 검색될 수 있다.
"서열 변이체"는 상기 정의된 대로이고, 다시 말해 서열 변이체는 기준 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 일치하는 (아미노산) 서열을 가진다. "기능적" 서열 변이체는 에피토프의 면에서, 에피토프로서의 상기 기능이 손상되거나 파괴되지 않는다. 바람직하게는, 하지만, 본 명세서에 기술된 암/항원의 에피토프의 상기 아미노산 서열은 돌연변이 하지 않고, 따라서, 기준 에피토프(reference epitope) 서열에 일치한다.
또한, 본 발명에 따라 사용되기 위한 복합체는 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 EpCAM의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 MUC-1의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 서비빈의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 CEA의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 KRas의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 MAGE-A3의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체.
또한, 본 발명에 따라 사용되기 위한 복합체는 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 EpCAM의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 MUC-1의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 서비빈의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 CEA의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 KRas의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 MAGE-A3의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
- 1 이상의 에피토프를 포함하는 ASCL2의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체.
본 명세서에 사용된, 항원의 "단편"은 상기 항원의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 상기 항원의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 상기 항원의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 상기 항원의 적어도 25개 연속적인 아미노산 또한 가장 바람직하게는 상기 항원의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다. 따라서, EpCAM의 단편은 EpCAM (SEQ ID NO: 47)의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 EpCAM (SEQ ID NO: 47)의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 EpCAM (SEQ ID NO: 47)의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 EpCAM (SEQ ID NO: 47)의 적어도 25개 연속적인 아미노산 및 가장 바람직하게는 EpCAM (SEQ ID NO: 47)의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다; MUC-1의 단편은 MUC-1 (SEQ ID NO: 49)의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 MUC-1 (SEQ ID NO: 49)의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 MUC-1 (SEQ ID NO: 49)의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 MUC-1 (SEQ ID NO: 49)의 적어도 25개 연속적인 아미노산 및 가장 바람직하게는 MUC-1 (SEQ ID NO: 49)의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다; 서비빈의 단편은 서비빈 (SEQ ID NO: 52)의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 서비빈 (SEQ ID NO: 52)의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 서비빈 (SEQ ID NO: 52)의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 서비빈 (SEQ ID NO: 52)의 적어도 25개 연속적인 아미노산 및 가장 바람직하게는 서비빈 (SEQ ID NO: 52)의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다; CEA의 단편은 CEA (SEQ ID NO: 54)의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 CEA (SEQ ID NO: 54)의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 CEA (SEQ ID NO: 54)의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 CEA (SEQ ID NO: 54)의 적어도 25개 연속적인 아미노산 및 가장 바람직하게는 CEA (SEQ ID NO: 54)의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다; KRas의 단편은 KRas (SEQ ID NO: 57)의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 KRas (SEQ ID NO: 57)의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 KRas (SEQ ID NO: 57)의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 KRas (SEQ ID NO: 57)의 적어도 25개 연속적인 아미노산 및 가장 바람직하게는 KRas (SEQ ID NO: 57)의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다; 그리고 MAGE-A3의 단편은 MAGE-A3 (SEQ ID NO: 59)의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 MAGE-A3 (SEQ ID NO: 59)의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 MAGE-A3 (SEQ ID NO: 59)의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 MAGE-A3 (SEQ ID NO: 59)의 적어도 25개 연속적인 아미노산 및 가장 바람직하게는 MAGE-A3 (SEQ ID NO: 59)의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다. 게다가 ASCL2 의 단편은 ASCL2 (SEQ ID NO: 92)의 적어도 10개 연속적인 아미노산, 바람직하게는 ASCL2 (SEQ ID NO: 92)의 적어도 15개 연속적인 아미노산, 더 바람직하게는 ASCL2 (SEQ ID NO: 92)의 적어도 20개 연속적인 아미노산, 보다 더 바람직하게는 ASCL2 (SEQ ID NO: 92)의 적어도 25개 연속적인 아미노산 및 가장 바람직하게는 ASCL2 (SEQ ID NO: 92)의 적어도 30개 연속적인 아미노산을 포함한다.
상기 단편의 기능적 서열 변이체는, 상기 기준 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 85%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 일치하는 (아미노산) 서열을 가지고, 그리고 단편에 포함되는 적어도 하나, 바람직하게는 모든 에피토프(들)의 에피토프 기능은 유지된다.
바람직하게는, 이러한 복합체는 다음을 포함한다:
xiv) EpCAM의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변이체;
xv) CEA의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변이체; 및
xvi) MAGE-A3의 한 개 또는 그 이상의 에피토프(예를 들어 SEQ ID NO: 60에 따른 에피토프) 또는 그의 기능적 서열 변이체.
이러한 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한, 이러한 복합체는 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
xvii) EpCAM의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xviii) MUC-1의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xix) CEA의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
xx) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 60에 따른 에피토프와 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2 중의 어떠한 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2 중의 어떠한 에피토프도 포함하지 않는다.
또한, 이와 같은 복합체는 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
xxi) EpCAM의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxii) MUC-1의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxiii) CEA의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxiv) KRas의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 58에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한, 이와 같은 복합체는 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
xxv) EpCAM의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxvi) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxvii) CEA의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxviii) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 60에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한, 이와 같은 복합체는 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
xxix) MUC-1의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxx) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
xxxi) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 60에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 EpCAM, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, EpCAM, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
더 바람직하게, 이와 같은 복합체는 다음을 포함한다:
xxxii) EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxxiii) MUC-1 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxxiv) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
xxxv) CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 다음을 포함한다:
xxxvi) EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxxvii) MUC-1 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxxviii) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xxxix) ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
xl) CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 다음을 포함한다:
xli) EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xlii) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xliii) ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
xliv) CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
특히 바람직하게는 복합체는 다음을 포함한다:
xlv) EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xlvi) MUC-1 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
xlvii) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
xlviii) CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한, 이와 같은 복합체는 다음을 포함하는 것이 특히 바람직하다:
xlix) CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
l) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
li) EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
lii) ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한, 이와 같은 복합체는 다음을 포함하는 것이 특히 바람직하다:
liii) EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
liv) MUC-1 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 50에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 51에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
lv) CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56)에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한, 이와 같은 복합체는 다음을 포함하는 것이 특히 바람직하다:
lvi) CEA의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
lvii) 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
lviii) ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, EpCAM, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
보다 더 바람직하게, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함한다:
- CEA의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체;
- 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
- ASCL2의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, EpCAM, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
보다 더 바람직하게, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함한다:
i) SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10개 아미노산(바람직하게는 적어도 15개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 20개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 25개 아미노산 및 가장 바람직하게는 적어도 30개 아미노산)의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10개 아미노산(바람직하게는 적어도 15개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 20개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 25개 아미노산 및 가장 바람직하게는 적어도 30개 아미노산)의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
iii) SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10개 아미노산(바람직하게는 적어도 15개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 20개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 적어도 25개 아미노산 및 가장 바람직하게는 적어도 30개 아미노산)의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 CEA, 서비빈 및 ASCL2가 아닌 그 어떠한 추가의 항원 또는 추가의 항원 에피토프를 포함하지 않으며, 더 바람직하게는 이와 같은 복합체는 그 어떠한 다른 (종양) 에피토프를 포함하지 않는다.
바람직하게는 이와 같은 복합체 중에서 (i) SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 C-말단은 (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접적으로 연결된다; 그리고 (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 C-말단은 (iii) SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접적으로 연결된다.
더욱 더 바람직하게는, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함한다:
i) SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
ii) SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
iii) SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 CEA, 서비빈 및 ASCL2가 아닌 그 어떠한 추가의 항원 또는 추가의 항원 에피토프를 포함하지 않으며, 더 바람직하게는 이와 같은 복합체는 그 어떠한 다른 (종양) 에피토프를 포함하지 않는다.
바람직하게는 이와 같은 복합체 중에서 (i) SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체의 C-말단은 (ii) SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체의 N-말단에 직접적으로 연결된다; 그리고 (ii) SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체의 C-말단은 (iii) SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 변이체의 N-말단에 직접적으로 연결된다.
가장 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 98에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다. 이와 같은 복합체는 CEA, 서비빈 및 ASCL2가 아닌 그 어떠한 추가의 항원 또는 추가의 항원 에피토프를 포함하지 않으며, 더 바람직하게는 이와 같은 복합체는 그 어떠한 다른 (종양) 에피토프를 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
- CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
- ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, CEA, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
- CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, EpCAM, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
- ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, EpCAM, CEA, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- 서비빈의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 53에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
- CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 ASCL2, HER-2, EpCAM, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- EpCAM 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 48에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- CEA 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 55에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGF
Figure pct00001
βR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다. 더 바람직하게는, 이와 같은 복합체는 ASCL2, EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
또한 특히, 이와 같은 복합체가 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
- ASCL2 의 1 이상의 에피토프(SEQ ID NO: 93에 따른 에피토프 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 에피토프 같은 것) 또는 이의 기능적 서열 변이체.
이와 같은 복합체는 바람직하게는 EpCAM, HER-2, MUC-1, CEA, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 또는 IL13R알파2의 어느 에피토프도 포함하지 않는다.
성분 c) - TLR 펩타이드 작용제(peptide agonist )
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에서, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 자가-애주번트성(self-adjuvancity)과 함께 수지상 세포에 대한 백신의 증가된 표적화(targeting)를 허용한다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내 TLR 펩타이드 작용제의 본 발명에 따른 상기 CPP 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프에 대한 물리적 연결(Physical linkage)은 항원(들)을 내재화하고, 대사하고 제시하는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포의 동시적인 촉진에 의해 향상된 면역 반응을 제공한다.
본 발명의 면에서 사용된 것처럼, "TLR 펩타이드 작용제"는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLR)의 작용제로, 즉 이는 TLR에 결합하고 상기 TLR을 활성화하고, 특히 생물학적 반응을 생산한다. 게다가, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 상기 정의된 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 10 부터 150개 아미노산, 더 바람직하게는 15 부터 130개 아미노산, 보다 더 바람직하게는 20 부터 120개 아미노산, 특히 바람직하게는 25 부터 110개 아미노산, 가장 바람직하게는 30 부터 100개 아미노산을 포함한다.
톨 유사 수용체(TLRs)는 세포외(extracellular), 막통과, 및 세포질(cytosolic) 도메인으로 특징되는 막통과 단백질이다. 편자-유사 모양(horseshoe-like shapes)의 류신-풍부 반복(leucine-rich repeats, LRRs)를 포함하는 상기 세포외 도메인은 갖가지 미생물로부터의 공통 분자 경향의 인지에 관여된다. 톨 유사 수용체는 TLRs1 - 10을 포함한다. TLR 수용체 및 변형체 및 이의 유도체(derivatives)를 활성화할 수 있는 화합물은 선행 기술에 잘 문서화되어 있다. TLR1은 박테리아성 지질단백질 및 이의 아세틸화된 형태에 의해 활성화될 수 있고, TLR2는 추가로 그램 양성 박테리아성 당지질(Gram positive bacterial glycolipids), LPS, LP A, LTA, 섬모(fimbriae), 외부막 단백질(outer membrane proteins), 박테리아로부터 또는 숙주로부터의 열충격 단백질(heat shock proteins), 및 마이코박테리아성 리포아라비노만난(Mycobacterial lipoarabinomannans)에 의해 활성화될 수 있다. TLR3는 dsRNA, 특히 바이러스에서 유래한, 또는 화학적 화합물 폴리(LC)에 의해 활성화될 수 있다. TLR4 는 그램 음성LPS, LTA, 박테리아로부터 또는 숙주로부터의 열충격 단백질, 바이러스 껍질(viral coat) 또는 외피 단백질(envelope proteins), 탁솔(taxol) 또는 이의 유도체, 올리고사카라이드를 포함하는 히알루로난(hyaluronan) 및 피브로텍인(fibronectins)에 의해 활성화될 수 있다. TLR는 박테리아 플라겔래 또는 플라겔린과 활성화될 수 있다. TLR6는 마이코박테리아성 지질단백질(mycobacterial lipoproteins) 및 그룹 B 연쇄구균 열 의존성 가용성 인자 (group B streptococcus heat labile soluble factor, GBS- F) 또는 포도상 구균 모듈린(staphylococcus modulins)에 의해 활성화될 수 있다. TLR7은 이미다조퀴놀린(imidazoquinolines) 에 의해 활성화될 수 있. TLR9 may be activated by 비메틸화(unmethylated) CpG DNA 또는 크로마틴-IgG 복합체(chromatin - IgG complexes)에 의해 활성화될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 TLR 펩타이드 작용제는 TLR1, 2, 4, 5, 6, 및/또는 10의 작용제이다. TLRs는 상기 세포 표면에서(TLR1, 2, 4, 5, 6, 및 10) 또는 세포내 소기관, 예를 들어 엔도솜(endosomes) 같은 것의 막에서(TLR3, 4, 7, 8, 및 9) 발현된다. 상기 엔도솜 수용체를 위한 자연 리간드는 핵산-기반 분자(nucleic acid-based molecules)으로 밝혀 졌다(TLR4는 예외). 상기 세포-발현 TLR1, 2, 4, 5, 6, 및 10은 세포외 미생물의 분자 경향을 인지한다(Monie, T. P., Bryant, C. E., et al. 2009: Activating immunity: Lessons from the TLRs and NLRs. Trends Biochem. Sci. 34(11), 553-561). TLRs는 몇몇 세포 유형에서 발현되지만 사실상 모든 TLRs이 DCs에서 발현되어 이들 특화된 세포가 모든 가능한 병원균 및 위험 신호를 감지할 수 있게 한다.
하지만, TLR2, 4, 및 5는 본질적으로 DCs의 표면에서 발현된다. 그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 TLR 펩타이드 작용제는 더 바람직하게는 TLR2, TLR4 및/또는 TLR5의 펩타이드 작용제를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 TLR2 펩타이드 작용제 및/또는 TLR4 펩타이드 작용제이다. 특히 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 TLR4 펩타이드 작용제이다. 가장 바람직하게는, 상기 TLR 펩타이드 작용제는 한 개 TLR 펩타이드 작용제이고, 이는 두 개, TLR2 및 TLR4 작용제, 모두 이다. TLR2는 박테리아, 바이러스, 기생충, 및 곰팡이로부처 유래된 대단히 다양한 리간드를 감지할 수 있다. 상기 리간드 특이성은 TLR2와 다른 TLRs, 예를 들어 TLR1, 6, 또는 10과 같은, 또는 비-TLR 분자, 예를 들어 디텍신-1(dectin-1), CD14 또는 CD36와 같은,와의 상호 작용에 의해 자주 결정된다. TLR1와의 이형이량체(heterodimer) 생성은 TLR2가 (마이코)박테리아 기원의 지질단백질(triacyl lipoproteins) 또는 지질펩타이드, 예를 들어 Pam3CSK4 및 펩티도글리칸 같은 것을 확인할 수 있게 한다(PGA; Gay, N. J., and Gangloff, M. (2007): Structure and function of Toll receptors and their ligands. Annu. Rev. Biochem. 76, 141-165; Spohn, R., Buwitt-Beckmann, U., et al. (2004): Synthetic lipopeptide adjuvants and Toll-like receptor 2―Structure-activity relationships. Vaccine 22(19), 2494-2499). TLR2 및 6 의 이형이량체화는 다이아실 지질펩타이드 및 지모산(zymosan)의 감지를 가능하게 한다. 지질폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS) 및 그의 유도체는 TLR4 및 TLR5를 위한 플라겔린을 위한 리간드이다(Bryant, C. E., Spring, D. R., et al. (2010). The molecular basis of the host response to lipopolysaccharide. Nat. Rev. Microbiol. 8(1), 8-14).
TLR2는 넓고 구조적으로 갖가지 영역의 리간드와 상호작용하고, 미생물 및 곰팡이에 의해 발현되는 분자도 포함한다. 다중 TLR2 작용제(multiple TLR2)는 확인되어 왔고, 자연 및 합성 지질펩타이드 (일례로 마이코플라즈마 퍼멘타스 대식세포-활성화 지질펩타이드(Mycoplasma fermentas macrophage-activating lipopeptide, MALP-2)), 펩티도글리칸 (PG 예를 들어 S. aureus로부터 유래한 것들과 같은), 다양한 바이러스 주로부터의 지질폴리사카라이드(LPS), 폴리사카라이드 (일례로 지모산), 그램 양성 박테리아로부터의 글리코포스파티딜-이노시톨-앵커드(glycosylphosphatidyl-inositol-anchored) 구조(일례로 마이코박테리아로부터의 리포테이코산(lipoteichoic acid, LTA) 및 리포-아라비만난(lipo-arabinomannan) 및 결핵균(M. tuberculosis)으로부터의 리포만난(lipomannas))를 포함한다. 일정한 바이러스 결정인자(viral determinants)는 TLR2를 통해 또한 유도할 수 있다 (Barbalat R, Lau L, Locksley RM, Barton GM. Toll-like receptor 2 on inflammatory monocytes induces type I interferon in response to viral but not bacterial ligands. Nat Immunol. 2009: 10(11):1200-7). 박테리아 지질펩타이드는 세포 벽의 구조적 성분이다. 그들은 펩타이드가 시스테인 잔기를 통해 접합될 수 있는 아세틸화 s-글리세릴시스테인 모이어티(acylated s-glycerylcysteine moiety)로 이루어진다. 박테리아 지질펩타이드인, TLR2 작용제의 예는 MALP-2 및 이의 합성 유도체(synthetic analogue) 디-팔미토일-S-글리세릴 시스테인(di-palmitoyl-S-glyceryl cysteine, Pam2Cys) 또는 트리-팔미토일-S-글리세릴 시스테인(tri-palmitoyl-S-glyceryl cysteine, Pam3Cys)를 포함한다.
다양한 리간드가 TLR4와 상호작용하고, 살모넬라 미네소타 R595(Salmonella minnesota R595)으로부터의 모노포스포릴 지질 A(Monophosphoryl Lipid A, MPLA), 지질폴리사카라이드(lipopolysaccharides, LPS), 만난(mannans, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 글리코이노시톨포스포리피드(glycoinositolphospholipids, 트리파노소마(Trypanosoma)), 바이러스 외피 단백질(viral envelope proteins, RSV 및 MMTV) 및 피브리노겐 및 열-충격 단백질을 포함하는 내재성(endogenous) 항원을 포함한다. TLR4의 이러한 작용제는 예를 들면 Akira S, Uematsu S, Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. Feb 24; 2006: 124(4):783-801 또는 Kumar H, Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun. Oct 30; 2009 388(4):621-5에 기술되어 있다. LPS는, 그램 음성 박테리아의 외피 막에서 발견되고, 상기 TLR4 리간드로 가장 넓게 연구되었다. 적합한 LPS-유래 TLR4 작용제 펩타이드는 예를 들면 국제특허 WO 2013/120073 (A1)에 기술되어 있다.
TLR5는 거의 모든 운동성 박테리아 의해 발현되는 상기 플라겔린 분자 영역에 의해 촉발된다. 따라서, 플라겔린, 또는 플라게린으로부터의 펩타이드 또는 단백질 및/또는 플라겔린의 변이체 또는 절편은 또한 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 TLR 펩타이드 작용제로 적합하다.
TLR 펩타이드 작용제의 예는 따라서 상기 TLR2 지질펩타이드 작용제 MALP-2, Pam2Cys 및 Pam3Cys 또는 이의 변형체, TLR4 작용제 LPS의 다른 형태, 일례로 수막염균(N. meningitides) 야생형(wild-type) L3-LPS 및 돌연변이 펜타-아실화된(penta-acylated) LpxL1-LPS, 및 상기 TLR5 작용제 플라겔린을 포함한다.
하지만, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 TLR 펩타이드 작용제는 지질펩타이드도 아니고 지질단백질도 아니고, 당펩타이드도 아니고 당단백질도 아니고, 더 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 TLR 펩타이드 작용제는 본 명세서에 정의된 고전적인 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질이다.
바람직한 TLR2 펩타이드 작용제는 아넥신 II(annexin II) 또는 그의 면역조절(immunomodulatory) 절편이고, 이는 국제특허 WO 2012/048190 A1 및 미국특허출원 US 13/0331546에 상세히 기술되어 있고, 특히 국제특허 WO 2012/048190 A1의 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 7 에 따른 아미노산 염기 서열 또는 이의 절편 또는 변이체를 포함하는 TLR2 펩타이드 작용제가 바람직하다.
그렇게 함으로써, 상기 기술된 SEQ ID NO: 15에 따른 아미노산 서열 또는 이의 서열 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 TLR2 펩타이드 작용제는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 성분 c), 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제로서 특히 바람직하다.
STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 15 (TLR2 펩타이드 작용제 아낙사(Anaxa))
SEQ ID NO: 15에 따른 TLR 펩타이드 작용제의 특히 바람직한 기능적 서열 변이체는 SEQ ID NO: 71에 따른 TLR 펩타이드 작용제이다:
STVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 71
이에 따라, SEQ ID NO: 71에 따른 아미노산 서열 또는 상기 기술된 바와 같은 이의 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어진 TLR2 펩타이드 작용제가 특히 복합체에 포함되는 성분 c)로서, 즉 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제로서 바람직하다. 다시 말해, 복합체 중의 TLR 펩타이드 작용제는 가장 바람직하게는 SEQ ID NO: 71에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
TLR4와 관련하여, TLR 펩타이드 작용제는, 특히 TLR4에 결합하는 모티브에 대응하는 것으로, 특히 바람직하고, 특히 (i) 상기 자연 LPS 리간드 미믹킹 펩타이드 (RS01: Gln-Glu-Ile-Asn-Ser-Ser- Tyr 및 RS09: Ala-Pro-Pro-His-Ala-Leu-Ser) 및 (ii) 피브로넥틴(Fibronectin) 유래 펩타이드이다. 상기 세포성 당단백질 피브로넥틴(Fibronectin, FN)은 세 개 엑손의 교차적인 스플라이싱에 의해 단일 유전자에에 발생된 다중의 아형을 가진다. 이들 아형 중 한 개는 상기 엑스트라 도메인 A(extra domain A, EDA)이고, 이는 TLR4와 상호작용한다.
더욱 적합한 TLR 펩타이드 작용제는 피브로넥인 EDA 도메인 또는 그의 절편 또는 변이체를 포함한다. 이러한 적합한 피브로넥틴 EDA 도메인 또는 이의 절편 또는 변이체는 유럽특허 EP 1 913 954 B1, EP 2 476 440 A1, 미국특허 US 2009/0220532 A1, 및 국제특허 WO 2011/101332 A1에 개시되어 있다. 그렇게 함으로써, 상기 기술된 SEQ ID NO: 45에 따른 아미노산 서열 또는 이의 서열 변이체를 포함하거나 이로 이루어지는 TLR4 펩타이드 작용제는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 성분 c), 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,로서 특히 바람직하다.
NIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQST
SEQ ID NO: 45 (TLR4 펩타이드 작용제 EDA)
추가로, 고-이동도 그룹 박스 1 단백질(high-mobility group box 1 protein, HMGB1) 및 그의 펩타이드 절편은 TLR4 작용제인 것으로 예상된다. 이러한 HMGB1-유래 펩타이드는 예를 들면 미국특허 US 2011/0236406 A1에 개시되어 있다.
게다가 또한 SEQ ID NO: 15에 따른 TLR 작용제 및 SEQ ID NO: 71에 따른 TLR 작용제는 TLR4 작용제로서 작용할 수 있다. 이에 따라, SEQ ID NO: 15 또는 71에 따르는 아미노산 서열 또는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 TLR4 펩타이드 작용제가 특히 복합체에 포함되는 성분 c), 즉 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제로서 바람직하다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 (최소한) 두 개 또는 세 개 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 보다 더 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 (최소한) 네 개 또는 다섯 개 TLR 펩타이드 작용제를 포함한다. 만일 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제가 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 경우 상술한 TLR 펩타이드 작용제는 특히 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 또한 공유적으로 결합된다는 것이, 일례로 다른 TLR 펩타이드 작용제에 및/또는 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드에 및/또는 성분 b), 즉 항원 또는 항원성 에피토프에, 이해된다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 한 개 단일 TLR 펩타이드 작용제를 포함한다. 특히, 이 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 한 개 단일 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고 기술된 상기 한 개 단일 TLR 펩타이드 작용제를 제외하고는 TLR 작용제 특성을 갖는 성분을 포함하지 않는다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 다양한 TLR 펩타이드 작용제는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 다양한 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 상이하다.
게다가, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 항원 또는 항원성 에피토프, 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 TLR 작용제는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 연속적으로 위치하는 것이 바람직하다. 이는 특히 상기 복합체에 포함되는 모든 TLR 펩타이드 작용제가 직선배열로 위치하는 것을 의미하고, 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드에 의해서도 또는 성분 b), 즉 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프에 의해서도 방해받지 않는다. 오히려, 상기 복합체 내 성분 a) 및 성분 b)는 예를 들면 모든 TLR 펩타이드 작용제의 이러한 직선배열 이전 또는 이후에 위치한다. 하지만, 이러한 방식으로 연속적으로 위치된 상기 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 연결될 수 있고, 예를 들면 후술되는 스페이서 또는 링커에 의해, 이는 성분 a), 즉 세포 투과 펩타이드,도 성분 b), 즉 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프도 아니다.
대안적으로, 하지만, 상기 다양한 TLR 펩타이드 작용제는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 임의의 다른 방식으로 위치될 수 있고, 예를 들면 성분 a) 및/또는 성분 b가 두 개 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제 사이에 위치하고, 즉 한 개 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제가 성분 a) 및 성분 b) 사이(또는 그 반대)에 위치하고, 선택적으로, 한 개 또는 이상의 TLR 펩타이드 작용제는 성분 a) 및/또는 성분 b)의 상기 각각 다른 말단에 위치한다.
동일 또는 상이한 TLR 수용체를 활성화하는 수많은 상이한 TLR 펩타이드 작용제가 본 발명에 따라 사용하기 위한 단일 복합체에 의해 유익하게 포함될 수 있다는 것이 이해된다. 대안적으로, 동일 또는 상이한 TLR 수용체를 활성화하는 수많은 상이한 TLR 펩타이드 작용제는 동일 또는 상이한 TLR 수용체를 활성화하는 수많은 상이한 TLR 펩타이드 작용제의 서브셋에 분포될 수 있고, 그에 따라 상이한 세브셋을 포함하는 이러한 상이한 복합체는 동시에, 일례로 단일 백신, 필요한 대상에게 유익하게 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내 성분 a), b), 및 c)의 연결
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서, 성분 a), b) 및 c)는 공유적으로 결합되고, 즉 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체의 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중에서 두 개 사이의 상기 결합은 공유 결합이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체의 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개는 서로 간에 공유적으로 결합된다(즉 상기 "첫 번째" 및 상기 "두 번째" 성분), 및 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 상기 세 번째 성분은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 상기 첫 번째 성분에 또는 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 번째 성분에 공유적으로 결합된다. 그렇게 함으로써, 바람직하게는 선형 분자가 생성된다. 하지만, 상기 성분 a), b), 및 c) 각각이 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 상기 나머지 두 성분에 공유적으로 결합되는 것도 생각할 수 있다.
"공유 결합"(covalent linkage, 또한 공유 결합(covalent bond))은, 본 발명의 면에서 사용된 것처럼, 원자들간 전자쌍 공유에 관여하는 화학결합을 나타낸다. "공유 결합"(covalent linkage, 또한 공유 결합(covalent bond))은 그들이 전자를 공유하는 때 원자간의 인력과 척력의 안정적인 균형에 특히 관여한다. 많은 분자들에서, 상기 전자의 공유는 각각 원자가 전체 외각의 동등성을 획득할 수 있게 하고, 안정적인 전자 배치에 상응한다. 공유 결합은 많은 종류의 상호작용, 예를 들면 시그마-결합(σ-bonding), 파이-결합(π-bonding), 금속-대-금속 결합, 아고스틱 상호작용(agostic interactions), 및 삼중이전자 결합(three-center two-electron bonds)을 포함한다. 그에 따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 또한 "화합물"(compound)를 나타낼 수 있고, 특히 이는 "분자"(molecule)를 나타낼 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서, 성분 a), b), 및 c)는 당해 기술 분야에서 알려진 임의의 적합한 방식의 화학적 커플링, 예를 들어 교차-결합 방법(cross-linking method)들에 의해 공유적으로 결합된다. 하지만, 많은 알려진 화학적 교차-결합 방법들은 비-특이적이라는 사실에 주목해야 하고, 즉, 그들은 상기 성분 a), b), 및 c)의 임의의 특정한 지점을 향하지 않는다. 따라서, 상기 비-특이적 교차-결합제(non-specific cross-linking agent)의 사용은 기능적 부위를 공격하거나 활성 부위를 막을 수 있고, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체의 상기 융합된 성분의 생물학적 비활성을 야기한다. 이는 당해 분야의 기술자들에게 적절한 보호 그룹을 사용하여 잠재적으로 반응 그룹을 막는 것을 나타낸다. 대안적으로, 상기 성분 a), b), 및 c)의 교차-결합을 위해 적용될 수 있는, 강력하고 다재다능한 옥심 및 하이드라존 결찰술(oxime and hydrazone ligation techniques)이 적용될 수 있다. 이 연결 기술은 일례로 Rose et al. (1994), JACS 116, 30에 의해 기술된다.
커플링 특이성(Coupling specificity)은 성분 a), b), 및/또는 c) 내에서 오직 한 번 또는 적은 횟수로 발견되는 기능기(functional group)에 대한 직접 화학적 커플링에 의해 증가될 수 있고, 이 기능기는 상기 성분 a), b), 및 c)의 상기 또 다른 것에 교차-결합 된다. 예로서, 만약 단지 한 개 시스테인 잔기가 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체의 일정한 성분 a), b), 또는 c) 내에 존재하는 경우, 상기 시스테인 티올 그룹(cystein thiol group)이 사용될 수 있다. 또한, 예를 들면, 만약 일정한 성분 a), b), 또는 c)이 라이신 잔기를 포함하지 않는다면, 일차 아민(primary amines)에 특이적인 교차-결합 시약(cross-linking reagent)은 상기 각각 성분의 상기 아미노 말단에 선별적이 될 것이다. 대안적으로, 교차-결합은 또한 상기 펩타이드의 상기 N-말단에 위치된 상기 글루탐산 잔기를 통해 실행될 수 있고 이에 아민 결합이 그의 곁사슬(side-chain)을 통하여 발생될 수 있다. 그리하여, 글루탐산 잔기를 일정한 성분 a), b), 또는 c)의 N-말단에 연결하는 것이 유익할 수 있다. 하지만, 만약 시스테인 잔기가 일정한 성분 a), b), 또는 c) 내로 도입되는 경우에는, 그의 N- 또는 C-말단상에 또는 근처에의 도입이 바람직하다. 한 개 또는 이상의 추가적인 아미노산, 일례로 그 중에서도 시스테인 잔기를 상기 전위(translocation) 서열에 추가하는 것에 의해 또는 상기 각각 성분 내에 포함되는 상기 전위서열(들)의 적어도 하나의 잔기를 치환하는 것에 의한 일정한 성분 a), b), 또는 c)의 변형에 기초하는 이러한 아미노산 서열 변이에 대해 전통적인 방법이 입수 가능하다. 시스테인 곁사슬이 커플링 목적으로 사용되는 경우에는, 일정한 성분 a), b), 또는 c)는 바람직하게는 한 개 시스테인 잔기를 가진다. 임의의 두 번째 시스테인 잔기는 바람직하게는 피해야 하고, 선택적으로, 그들이 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 각각 성분에 존재하는 경우 교체될 수 있다. 시스테인 잔기가 어느 성분 a), b), 또는 c)의 상기 원래 서열 내에서 치환되는 경우, 상기 각각 성분의 상기 펩타이드 접힘(folding) 내에 초래되는 결과를 최소화하는 것이 전형적으로 바람직하다. 접힘 내 변화를 상기 치환이 화학적 및 입체적으로 시스테인에 유사한 경우 최소화된다. 그리하여, 세린이 시스테인의 치환체로서 바람직하다.
상기 세 개 성분 a), b), 및 c)에서 두 개의 커플링은 예를 들어 HOBt, HBTU, DICI, TBTU와 같은 표준 펩타이드 합성 커플링제(standard peptide synthesis coupling reagents)를 포함하는 커플링제 또는 접합제를 통해 달성될 수 있다. 사용될 수 있는 몇 몇 분자내 교차-결합제가 있고, 예를 들면, Means and Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, pp. 39-43 참조한다. 이들 시약들은 예를 들면, N-숙시미미딜 3-(2-피리딜이티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP) 또는 N,N'-(1,3-페닐렌)비스말레이미드(N,N'-(1,3-phenylene)bismaleimide); N,N'-에틸렌-비스-(아이오도아세트아마이드)(N,N'-ethylene-bis-(iodoacetamide)) 또는 6 내지 11 탄소 메틸렌 브릿지(carbon methylene bridges)를 갖는 다른 이러한 시약; 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)이다. 이 목적에 유용한 다른 교차-결합제는 다음을 포함한다: p,p'-디플루오로-m,m'-디니트로디페닐설폰(p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodiphenylsulfone); 디메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate); 페놀-1,4-디설포닐클로라이드(phenol-1,4-disulfonylchloride); 헥사메틸렌디이소시아네이트(hexamethylenediisocyanate) 또는 디이소시아네이(diisothiocyanate), 또는 아조페닐-p-디이소시아네이트(azophenyl-p-diisocyanate); 글루타랄데하이드(glutaraldehyde) 및 디스디아조벤지딘(disdiazobenzidine). 교차-결합제는 동종이기능성(homobifunctional), 즉, 상기 동일한 반응을 겪는 두 개 기능기를 갖는,일 수 있다. 바람직한 동종이기능성 교차-결합제는 비스말레이미도헥산(bismaleimidohexane, BMH)이다. BMH는 두 개 말레이미도(maleimide) 기능기를 포함하고, 이는 온화한 조건(pH 6.5-7.7)에서 설프하이드릴(sulfhydryl)-포함 화합물과 특이적으로 반응한다. 상기 두 개 말레이미도기는 탄화수소 사슬(hydrocarbon chain)에 의해 연결된다. 그리하여, BMH는 시스테인 잔기를 포함하는 단백질(또는 폴리펩타이드)의 비가역적 교차-결합에 유용하다. 교차-결합제는 또한 이종이기능성(heterobifunctional)일 수 있다. 이종이기능성 교차-결합제는 자유 아민 및 티올, 각각을 갖는 두 단백질을 교차-결합할 두 개 상이한 기능기, 예를 들면 아민(amine)-반응기(reactive group) 및 티올(thiol)-반응기를 가진다. 이종이기능성의 교차-결합제의 예들은 석시니미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate, SMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석시니미드 에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester, MBS), 및 석시니미드 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(succinimide 4-(p-maleimidophenyl)butyrate, SMPB), MBS의 연장된 사슬 유사체, 이다. 이들 크로스-링커의 상기 석시이미딜기(succinimidyl group)는 일차 아민과 반응하고, 그리고 상기 티올-반응 말레이미도는 시스테인 잔기의 상기 티올과 함께 공유 결합을 형성한다. 교차-결합제는 종종 수중에서 낮은 용해도를 갖기 때문에, 친수성 모이어티(hydrophilic moiety), 예를 들어 설포네이트기(sulfonate group)가 이의 수용해도(water solubility)을 향상시키기 위해 상기 교차-결합제에 추가될 수 있다. 설포-MBD(Sulfo-MBS) 및 설포-SMCC(sulfo-SMCC)는 수용성을 위해 변형된 교차-결합제의 예이다. 많은 교차-결합제가 세포 조건에서는 필수적으로 비분할성(non-cleavable) 접합체(conjugate)를 생성한다. 그리하여, 몇몇 교차-결합제는 공유 결합, 예를 들어 디설파이드(disulfide) 같은 것을 포함하고, 이는 세포 조건에서 분할성이다. 예를 들면, 트라우트 시약(Traut's reagent), 디티오비스 (석시니미딜프로피오네이트)(dithiobis (succinimidylpropionate), DSP), 및 N-석시니미딜 3-(2-피리딜이티오)프로피오네이트(N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate, SPDP)은 잘 알려진 분할성(cleavable) 크로스-링커이다. 상기 분할성 교차-결합제의 사용은 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 상기 대상 세포로의 전달 이후 서로 간에 분리되는 것을 허용한다. 이 목적을 위해, 직접 디설파이드 결합(disulfide linkage)이 또한 유용할 수 있다. 화학적 교차-결합(Chemical cross-linking)은 또한 스페이서 암(spacer arm)의 사용을 포함할 수 있다. 스페이서 암은 분자내 유연성(intramolecular flexibility)을 제공하거나 또는 분자내 거리를 조정하고 그렇게 함으로써 생물학적 활성 보존을 돕는다. 스페이서 암은 스페이서 아미노산, 일례로 프롤린을 포함하는 단백질(또는 폴리펩타이드) 모이어티의 형태일 수 있다. 대안적으로, 스페이서 암은 상기 교차-결합제, 예를 들어 "장사슬 SPDP"(long-chain SPDP) (Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., cat. No. 21651 H) 내의 일부일 수 있다. 수많은 교차-결합제는, 상기 논의된 것들 포함하여, 상업적으로 사용 가능한다. 이들 사용을 위한 상세한 지시들도 상기 상업적 공급자들로부터 손쉽게 입수가능하. 단백질 교차-결합 및 접합체 준비에 대한 더 상세한 정보, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 성분 a), b), 및 c)의 결합 면에서 유용한 것은 다음에서 검색될 수 있다: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991).
펩타이드 또는 단백질 교차결합을 위한 교차-결합제는 예를 들면 (i) 아민-대-아민(amine-to-amine) 크로스링커(교차연계자, crosslinker), 일례로 일차 아민의 선택적 접합을 위한 NHS-에스테르 및 이미도에스테르(imidoester) 반응기에 기초한 동종이기능성 아민-특이적 단백질 교차결합 시약; 짧은, 긴, 쪼갤 수 있는, 비가역적인, 세포막 투과할 수 있는, 및 세포 표면 종류들; (ii) 설프하이드릴-대-카보하이드레이트(sulfhydryl-to-carbohydrate) 크로스링커, 일례로 공유적 교차결합의 접합 및 생성을 위한 말레이미드 및 하이드라진 반응기에 기초한 교차결합 시약; (iii) 설프하이드릴-대-설프하이드릴(sulfhydryl-to-sulfhydryl) 크로스링커, 일례로 안정한 티오에테르(thioether) 결합을 형성하는 단백질 및 펩타이드 티올(peptide thiols)(감소된 시스테인)의 선택적 공유 접합을 위한 말레이미드 또는 피리딜디티올(pyridyldithiol) 반응기에 기초한 동종이기능성 설프하이드릴-특이적 교차결합 시약; (iv) 광반응성(photoreactive) 크로스링커, 일례로 아릴 아지드(aryl azide), 디아지린(diazirine), 및 두 단계 활성화를 통해 수용체-리간드 상호작용 복합체에 관여되는 단백질, 핵산 및 다른 분자 구조를 접합하는 다른 광-반응성(빛-활성화, light-activated) 화학적 이종이기능성 교차결합 시약; (v) 아민-대-설프하이드릴(amine-to-sulfhydryl) 크로스링커, 일례로 일차 아민(라이신) 및 단백질 및 다른 분자의 설프하이드릴(시스테인)기 사이의 접합을 위한 이종이기능성 단백질 교차결합 시약; 상이한 길이 및 유형의 스페이서 암과 함께 입수가능; 및 (vi) 아민-대-아민(amine-to-amine) 크로스링커, 일례로 카르복실-대-아민(carboxyl-to-amine) 크로스링커, 일례로 카르보디이미드(Carbodiimide) 교차결합 시약, DCC 및 EDC (EDAC), 카르복실기(글루타메이트(glutamate), 아스파르테이트(aspartate), C-터미니(C-termini))의 일차 아민에의 접합 및 또한 아민-접합을 위한 카르복실레이트의 안정한 활성화를 위한 N-하이드록시석시니미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 포함한다.
크로스링커의 예를 일반적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에 사용될 수 있는, N -(α-말레이미도아세톡시)-석시니미드 에스테르(N -(α-Maleimidoacetoxy)-succinimide ester), N -5-아지도-2-니트로벤질옥시-석시니미드(N -5-Azido-2-nitrobenzyloxy-succinimide), 1,4-Bis-말레이미도부탄(1,4-Bis-Maleimidobutane), 1,4-Bis-말레임미딜-2,3-dihydroxy-butane(1,4-Bis-Maleimmidyl-2,3-dihydroxy-butane), Bis-말레이미도헥산(Bis-Maleimidohexane), Bis-말레이미도에탄(Bis-Maleimidoethane), N -(β-말레이미도프로피오닉산)하이드라지드*TFA(N -(β-Maleimidopropionic acid)hydrazide*TFA), N -(β-말레이미도프로필옥시)석시니미드 에스테르(N -(β-Maleimidopropyloxy)succinimide ester), 1,8-Bis-말레이미도디에틸렌-글리콜(1,8-Bis-Maleimidodiethylene-glycol), 1,11-Bis-말레이미도트리에틸렌글리콜(1,11-Bis-Maleimidotriethyleneglycol), 비스 (설포석시니미딜)수베레이트(Bis (sulfosuccinimidyl)suberate), 비스 (설포석시니미딜)글루타레이트-d0(Bis (sulfosuccinimidyl)glutarate-d0), 비스 (설포석시니미딜)2,2,4,4-글루타레이트-d4(Bis (sulfosuccinimidyl)2,2,4,4-glutarate-d4), 비스 (설포석시니미딜)수베레이트-d0(Bis (sulfosuccinimidyl)suberate-d0), Bis (설포석시니미딜)2,2,7,7-수베레이트-d4(Bis (sulfosuccinimidyl)2,2,7,7-suberate-d4), Bis (NHS)PEG5, Bis (NHS)PEG9, Bis (2-[석시니미독시카르보닐옥시]에틸)설폰(Bis (2-[succinimidoxycarbonyloxy]ethyl)sulfone), N,N-디시클로헥실카르보디이미드(N,N-Dicyclohexylcarbodiimide), 1-5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1-5-Difluoro-2,4-dinitrobenzene), 디메틸 아디피미데이트*2염산(Dimethyl adipimidate*2HCI), 디메틸 피멜이미데이트*2염산(Dimethyl pimelimidate*2HCI), 디메틸 수베리미데이트*2염산(Dimethyl suberimidate*2HCl), 디석시니미딜 글루타레이트(Disuccinimidyl glutarate), 디티오비스(석시니미딜프로피오네이트) (Dithiobis(succimidylpropionate))(롱만트 시약(Lomant's Reagent)), 디석시니디밀 수베르레이트(Disuccinimidyl suberate), 디석시니디밀 타르타레이트(Disuccinimidyl tartarate), 디메틸 3,3'-디티오비스프로피오니미데이트*2염산(Dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate*2HCI), 디티오비스-말레이미도에탄(Dithiobis-maleimidoethane), 3,3'-디티오비스 (설포석시니미딜프로피오네이트)(3,3'-Dithiobis (sulfosuccinimidylpropionate)), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride), 에틸렌 글리콜 비스 (석시니미딜선니네이트)(Ethylene glycol bis (succinimidylsuccinate)), N-ε-말레이미도카프로익산(N-ε-Maleimidocaproic acid), N-(ε-말레이미도카프로익산)하이드라자이드(N-(ε-Maleimidocaproic acid)hydrazide), N-(ε-말레이미도카프로일옥시)석시니미드 에스테르(N-(ε-Maleimidocaproyloxy)succinimide ester), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)석시니미드 에스테르(N-(γ-Maleimidobutyryloxy)succinimide ester), N-(κ-말레이미도운데카노익산)하이드라자이드(N-(κ-Maleimidoundecanoic acid)hydrazide), NHS-LC-디아지린(NHS-LC-Diazirine), 석시니미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복시-(6-아미도카프로에이트(Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxy-(6-amidocaproate), 석시니미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오] 프로피온아미도)헥사노에이트(Succinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio] propionamido)hexanoate), L-포토-류신(L-Photo-Leucine), L-포토-메티오닌(L-Photo-Methionine), m-말레이미도벤질-N-하이드록시석시니미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 4-(4-N-말레이미도페닐)-부티릭산 하이드라자이드*염산(4-(4-N-Maleimidophenyl)-butyric acid hydrazide*HCI), 2-[N2-(4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로벤조일)-N6-(6-비오틴아미도카프로일)-L-라이신일]에틸메탄에티오설페이트(2-[N2-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl]ethylmethanethiosulfate), 2-{N2-[N6-(4-아지도-2,3,5,6-테트라플루오로벤조일)-N6-(6-비오틴아미도카프로일)-L-라이신일]} 에틸메탄에티오설페이트(2-{N2-[N6-(4-Azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoyl)-N6-(6-biotinamidocaproyl)-L-lysinyl]}ethylmethanethiosulfate), N-하이드록시석시니미드(N-Hydroxysuccinimide), N-하이드록시석시니미드 에스테르 에탄 아지드(N-hydroxysuccinimide ester ethane azide), N-하이드록시석시니미드 에스테르 테트라펜타데칸 아지드(N-hydroxysuccinimide ester tetraoxapentadecane azide), N-하이드록시석시니미드 에스테르 도데카옥사노나트리아콘탄 아지드(N-hydroxysuccinimide ester dodecaoxanonatriacontane azide), NHS-포스핀(NHS-Phosphine), 3-(2-피리딜디티오)프로리오닐하이드라지드(3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazide), 2-피리딜디티올-테트라옥사테트라데칸-N-하이드록시석시니미드(2-pyridyldithiol-tetraoxatetradecane-N-hydroxysuccinimide), 2-피리딜디티올-테트라옥사옥타트리아콘탄-N-하이드록시석시니미드(2-pyridyldithiol-tetraoxaoctatriacontane-N-hydroxysuccinimide), N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate), 석시니미딜 3-(브로모아세타미도)프로피오네이트(Succinimdyl 3-(bromoacetamido)propionate), NHS-디아지린(NHS-Diazirine), NHS-SS-디아지린(NHS-SS-Diazirine), N-석시니미딜 이소시아네이트(N-succinimidyl iodoacetate), N-석시니미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트(N-Succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate), 석시니미딜 4-(N-말레이미도-메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Succinimidyl 4-(N-maleimido-methyl)cyclohexane-1-carboxylate), NHS-PEG2-말레이미도(NHS-PEG2-Maliemide), NHS-PEG4-말레이미도(NHS-PEG4-Maliemide), NHS-PEG6-말레이미도(NHS-PEG6-Maleimide), NHS-PEG8-말레이미도(NHS-PEG8-Maliemide), NHS-PEG12-말레이미도(NHS-PEG12-Maliemide), NHS-PEG24-말레이미도(NHS-PEG24-Maleimide), 석시니미딜 4-(p-말레이미도-페닐)부티레이트(Succinimidyl 4-(p-maleimido-phenyl)butyrate), 석시니미딜-6-(β-말레이미도프로피오나미도)헥사노에이트(Succinimidyl-6-(β-maleimidopropionamido)hexanoate), 4-석시니미딜옥시카르보닐-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(4-Succinimidyloxycarbonyl-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluene), 석시니미딜-(4-프소랄렌-8-일옥시)부티레이트(Succinimidyl-(4-psoralen-8-yloxy)butyrate), N-석시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate), 에틸렌 글리콜 비스 (설포-석시니미딜 석시네이트)(Ethylene glycol bis (sulfo-succinimidyl succinate)), N-(ε-말레이미도카프로일옥시)설포석시니미드 에스테르(N-(ε-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide ester), N-(γ-말레이미도카프로일옥시)설포석시니미드 에스테르(N-(γ-Maleimidobutryloxy)sulfosuccinimide ester), N-(κ-말레이미도카프로일옥시)설포석시니미드 에스테르(N-(κ-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide ester), 설포-NHS-LC-디아지린(Sulfo-NHS-LC-Diazirine), 설포석시니미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]프로피오나미도)헥사노에이트 (Sulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]propionamido)hexanoate), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석시니미드 에스테르(m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester), N-하이드록시설포석시니미드(N-Hydroxysuccinimide), 설포-NHS-포스핀(Sulfo-NHS-Phosphine), 설포석시니미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoate), 설포-NHS-(2-6-[비오티나미도]-2-(p-아지도벤자미도)(Sulfo-NHS-(2-6-[Biotinamido]-2-(p-azidobezamido)), 설포-NHS-디아지린(Sulfo-NHS-Diazirine), 설포-NHS-SS-디아지린(Sulfo-NHS-SS-Diazirine), 설포석시니미딜(4-아이오도-아세틸)아미도벤조에이트(Sulfosuccinimidyl(4-iodo-acetyl)aminobenzoate), 설포석시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(Sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate), 설포석시니미딜 4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate), Tris-(2-말레이미도에틸)아민(Tris-(2-Maleimidoethyl)amine) (Trifunctional), 및 Tris-(석시니미딜 아미노트리세테이트) (Tris-(succimimidyl aminotricetate))(Trifunctional)을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체의 세 개 성분 a), b), 및 c)로부터 두 개 사이의 결합은 직접적으로 또는 간접적일 수 있고, 즉, 두 개 성분이 직접적으로 붙거나 또는 그들은 상기 복합체의 추가적인 성분, 일례로 스페이서 또는 링커에 의해 결합될 수 있다.
만약 상기 결합되는 성분이 반응성 아민 또는 카르복실기를 가지는 경우, 직접 결합은 바람직하게는 아민 브릿지(amide bridge)에 의해 인식될 수 있다. 더 특별하게, 만약 상기 결합되는 성분이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 펩타이드 결합(peptide bond)이 바람직하다. 이러한 펩타이드 결합은 결합되는 양자 성분(한 개 성분의 N-말단(N-teriminal end) 및 상기 다른 성분의 C-말단(C-teriminal end))에 관여하는 화학적 합성을 사용하여 형성될 수 있고, 또는 상기 두 성분의 전체 펩타이드 서열의 단백질 합성을 통해 직접 형성될 수 있고, 여기서 양자(단백질 또는 펩타이드) 성분은 바람직하게는 한 개 과정으로 합성된다. 이러한 단백질 합성 방법은 일례로, 그것에 제한됨 없이, 액체상 펩타이드 합성 방법(liquid phase peptide synthesis methods) 또는 고체상 펩타이드 합성 방법(solid peptide synthesis methods), 일례로 Merrifield, t-Boc 고체-상 펩타이드 합성, Fmoc 고체-상 펩타이드 합성, BOP (벤조스라이졸-1-옥시-트리스-(디메틸아미노)펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질-포스포니움(Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate)) 기초한 고체상 펩타이드 합성, 등등에 따른 고체상 펩타이드 합성 방법을 포함한다. 대안적으로, 에스테르 또는 에테르 결합이 바람직하다.
게다가, 특히 만약 결합되는 상기 성분이 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 결합은 상기 곁사슬, 일례로 디설파이드 브릿지(disulfide bridge)를 통해 발생할 수 있다. 다른 화학적 성질의 부가 성분, 일례로 만약 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프가 펩타이드 성질이 아닌 경우, 마찬가지로 펩타이트 성질의 상기 성분, 일례로 펩타이드 성질인 경우의 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제, 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프에 부착될 수 있다. 곁사슬을 통한 결합은 바람직하게는 곁사슬 아미노, 티올 또는 하이드록시, 일례로 아미드 또는 에스테르 결합에 기초할 수 있다. 펩타이드성 주사슬(main chain)의 또 다른 성분의 펩타이드성 곁사슬과의 결합은 또한 이소펩타이드 결합(isopeptide bond)을 통할 수 있다. 이소펩타이드 결합은 단백질의 주사슬에는 존재하지 않는 아미드 결합이다. 상기 결합은 한 개 펩타이드 또는 단백질의 상기 카르복시 말단(carboxyl terminus)과 또 다른(표적) 펩타이드 또는 단백질의 라이신 잔기의 상기 아미노기 사이에 형성된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 선택적으로 스페이서 또는 링커를 포함할 수 있고, 이는 비-면역성 모이어티이고, 이는 바람직하게는 분할될 수 있고, 또한 이는 성분 a) 및 b) 및/또는 성분 a) 및 c), 및/또는 성분 b) 및 c)를 결합, 및/또는 연속적 항원 또는 항원성 에피토프를 결합, 및/또는 연속적 TLR 펩타이드 작용제를 결합, 및/또는 연속적 세포 투과 펩타이드를 결합, 및/또는 이는 성분 b) 및/또는 c)의 C-말단 부분에 위치될 수 있다. 링커 또는 스페이서는 바람직하게는 상기 성분의 결합, 바람직하게는 분할될 수 있는, 더 바람직하게는 표적 세포 내부에서 자연적으로 분할, 일례로 효소적 분할(enzymatic cleavage)에 의해,될 수 있는 것에 추가로 부가 기능성을 제공한다. 하지만, 이러한 부가 기능성은 특히 임의의 면역적 기능성을 포함하지 않는다. 부가 기능성의 예는, 특히 융합 단백질 내에서 링커를 고려하면, Chen X. et al., 2013: Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357 - 1369에서 찾을 수 있고, 거기에는 예를 들면 또는 생체 내 분할될 수 있는 링커도 개시되어 있다. 게다가, Chen X. et al., 2013: Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10): 1357 - 1369는 또한 다양한 링커, 일례로 연성 링커(flexible linkers) 및 경성 링커(rigid linkers), 및 링커 디자인 툴 및 데이터베이스를 개시하였고 이는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 또는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내 사용될 링커를 디자인하는데 유용할 수 있다.
상술한 스페이서는 펩타이드성 또는 비-펩타이드성일 수 있고, 바람직하게는 상기 스페이서는 펩타이드성이고, 바람직하게는, 펩타이드성 스페이서는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산, 더 바람직하게는 약 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산으로 이루어진다. 상기 펩타이드성 스페이서의 아미노산 서열은 상기 임의의 성분 a), b), 또는 c)의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역(flanking region)의 그것과 일치할 수 있다. 대안적으로 펩타이드성 스페이서는 예를 들어 상기 자연적 인접 영역의 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitutions)의 결과로 초래된 아미노산 서열과 같은 비-자연적 아미노산 서열 또는 프로테아제의 알려진 분할 위치(cleavage site)의 서열, 예를 들어 엔테로키나아제(enterokinase) 표적 위치(target site)(아미노산 서열: DDDK, SEQ ID NO: 16), 인자 Xa(factor Xa) 표적 위치(아미노산 서열: IEDGR, SEQ ID NO: 17), 크롬빈(thrombin) 표적 위치(아미노산 서열: LVPRGS, SEQ ID NO: 18), 프로테아제(protease) TEV 표적 위치(아미노산 서열: ENLYFQG, SEQ ID NO: 19), 프레시션(PreScission) 프로테아제 표적 위치(아미노산 서열 LEVLFQGP, SEQ ID NO: 20), 다가양이온성 아미노산, 일례로 폴리 K, 푸린(furin) 표적 위치(아미노산 서열 RX(R/K)R, SEQ ID NO: 21),로 이루어질 수 있다. 구체적인 구현예에서, 상기 펩타이드성 스페이서는 임의의 시스테인(Cys, C) 잔기를 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서 상기 링커 서열은 최소한 20%, 더 바람직하게는 최소한 40% 및 보다 더 바람직하게는 최소한 50%의 글라이신(Gly) 또는 β-알라닌(alanine) 잔기, 일례로 GlyGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 22), GlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 23), GlyGlyGly, CysGlyGly 또는 GlyGlyCys, 등등을 포함한다. 적당한 링커 서열은 당해 분야 기술자에 의해 쉽게 선택되고 준비될 수 있다. 그들은 D 및/또는 L 아미노산으로 구성될 수 있다. 펩타이드성 스페이서의 부가예는 상기 아미노산 서열 EQLE (SEQ ID NO: 24) 또는 TEWT (SEQ ID NO: 25) 또는 이의 임의의 보존적 치환체를 포함한다.
비-펩타이드성 스페이서는 에스테르, 티오에스테르, 및 디-설파이드를 포함하거나 이들일 수 있다.
특히, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 성분 a) 및 b) 사이 및/또는 성분 a) 및 c) 사이, 및/또는 성분 b) 및 c) 사이에 위치한 스페이서 또는 링커, 특히 펩타이드성 스페이서를 포함할 수 있다. 이 펩타이드성 스페이서는 당해 분야 기술자에 의해 선택될 수 있고 따라서 상기 세포 투과 펩타이드 및 상기 카르고 분자를 포함하는 상기 복합체가 일단 내재화되면 세포 조직(cell machinery)에 의해 잘라질 수 있다.
상기 복합체가 몇 몇 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 경우 또는 상기 복합체가 몇몇 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체 내 포함되는 상기 각각 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 상기 각각 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 직접 결합되거나 또는 스페이서 또는 링커, 일례로, 적은 아미노산으로 이루어지는 펩타이드성 스페이서를 통해 결합될 수 있다는 것은 당해 분야 기술자에게 분명하다. 대안적으로, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체가 몇 몇 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 경우 또는 상기 복합체가 몇 몇 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 경우, 본 발명의 복합체에 포함되는 약간의 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 약간의 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 직접 결합되고 다른 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 다른 TLR 펩타이드 작용제는 예를 들어 적은 아미노산으로 이루어지는 펩타이드성 스페이서 같은 스페이서 또는 링커를 통해 결합되는 것이 또한 가능하다.
예를 들면, 본 발명의 상기 복합체에 포함되는 두 개 연속적인 항원 또는 항원성 에피토프 또는 두 개 연속적인 TLR 펩타이드 작용제는 서로 간에 스페이서에 의해 결합되어 상술한 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 자연 인접 영역 또는 상술한 TLR 펩타이드 작용제, 각각을 구성한다. 예를 들면, 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제를 두 번째 항원/항원성 에피토프 또는 두 번째 TLR 펩타이드 작용제에 결합하는 데 사용된 상기 스페이서는, 각각, 약 8 개 아미노산으로 구성될 수 있고 이는 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역의 4개 아미노산에, 두 번째 항원/항원성 에피토프 또는 두 번째 TLR 펩타이드 작용제의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역의 4개 아미노산이 뒤따르는 것에 대응한다. 본 발명의 실례(illustration)에서, 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제("항원/항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1")를 두 번째 에피토프("항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2")에 결합하는 데 사용된 상기 스페이서는 다음 범위의 임의 가능한 조합에 대응하는 약 8 개 아미노산으로 이루어진다: 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 0개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 8개, 부터 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 8개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 0개 까지, 즉항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 1개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 7개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 2개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 6개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 3개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 5개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 4개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 4개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 5개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 3개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 6개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 2개, 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 7개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 1개, 8 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1의 인접 아미노산 8개 및 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 인접 아미노산 0개 이다. 두 개 연속적인 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제를 결합하는 스페이서를 구성하는 총 8개 아미노산은 절대값이 아니고 상기 스페이서는 또한 전체 수, 사례를 들면, 3개 아미노산, 4개 아미노산, 5개 아미노산, 6개 아미노산, 개 아미노산, 9개 아미노산 또는 10개 아미노산을 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 유사하게, 상기 언급된 것과 동등한 조합은 또한 스페이서가 8개 보다 적게 또는 않은 아미노산을 가지는 상황에서 본 발명의 실례이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실례에서, 첫 번째 항원/항원성 에피토프 또는 첫 번째 TLR 펩타이드 작용제("항원/항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1")를 두 번째 항원/항원성 에피토프 또는 두 번째 TLR 펩타이드 작용제, 각각,("항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2")에 결합하는 데 사용된 상기 스페이서는 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산으로 이루어진다. 보다 특히, 상술한 스페이서의 아미노산 서열은 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 1 또는 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제 2의 상기 N-말단 또는 C-말단 인접 영역의 상기 4개 아미노산에 대응할 수 있다. 스페이서는 상기 기술된 것처럼 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 마지막 항원/에피토프/TLR 펩타이드 작용제의 C-말단에 위치할 수 있다.
상기 세 개 성분 a), b), 및 c)의 두 개를 결합하는 기술은 상기 문헌에 잘 기재되어 있고 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 성질에 따라 달라질 수 있다. 사례를 들면, 상기 세 개 성분 a), b), 및 c)의 두 개 사이 결합은 토탈 스텝와이즈 고체상 합성(total stepwise solid-phase synthesis) 또는 액상 합성(solution-phase) 또는 고체상 절편 커플링(solid-phase fragment coupling), 안정한 아미드(stable amide), 티오졸리딘(thiazolidine), 옥심(oxim) 및 하이드라진 결합(hydrazine linkage), 디설파이드 결합(disulphide linkage), 안정한 티오알레이미드 결합(stable thiomaleimide linkage), 펩타이드 결합(융합 단백질의 아미노산 사이 펩타이드 결합 포함), 또는 정전기성(electrostatic) 또는 소수성(hydrophobic) 상호작용을 통한 분할성 디설파이드 결합(cleavable disulphide linkages)을 통해 달성할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 임의의 선택적인 스페이서 또는 링커와 마찬가지로 펩타이드성 성질이다. 더 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체의 모든 성분, 일례로 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 이는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 및 임의의 선택적인 펩타이드 링커 또는 스페이서는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 펩타이드 의해 결합된다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 따라서 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질, 예를 들어 융합 단백질, 일례로 재조합 융합 단백질이다.
이와 관련해서, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 87에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체; SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 87의 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 바람직하다. 게다가 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 또는 SEQ ID NO: 91에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 또는 SEQ ID NO: 91의 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 바람직하다. 게다가, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, 또는 SEQ ID NO: 69에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체; 또는 SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, 또는 SEQ ID NO: 69의 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 바람직하다. SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69의 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 더 바람직하다. SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69의 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 더 바람직하다. SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69의 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 더 바람직하다. 게다가, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 87에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, 또는 SEQ ID NO: 87의 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 더 바람직하다. 게다가, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 또는 SEQ ID NO: 91에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 또는 SEQ ID NO: 91와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 더 바람직하다. SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 보다 더 바람직하다. SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 보다 더 바람직하다. SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69에 따르는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 구성되는 복합체 또는 SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 또는 SEQ ID NO: 69와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 복합체가 특히 바람직하다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 72에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 72와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 73에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 73과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 74에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 74와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 75에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 75와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 76에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 76과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 77에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 77과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 78에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 78과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 79에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 79와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 80에 따른 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 80과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 81에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 81과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 82에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 82와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 83에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 83과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 84에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 84와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 85에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 85와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 86에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 86과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 87에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 87과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 88에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 88과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 89에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 89과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 90에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 90과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 가장 바람직하게, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 91에 따르는 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO: 91과 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
특히 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 SEQ ID NO: 89에 따르는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 적어도 50% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
SEQ ID NO: 26:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
SEQ ID NO: 27:
MHHHHHHSTV HEILCKLSLE GDHSTPPSAY GSVKPYTNFD AEKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS
SEQ ID NO: 28:
MHHHHHHKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGSS TVHEILCKLS LEGDHSTPPS AYGSVKPYTN FDAE
SEQ ID NO: 33:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE
SEQ ID NO: 34:
MHHHHHHREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG SSTVHEILCK LSLEGDHSTP PSAYGSVKPY TNFDAE
SEQ ID NO: 37:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GS
SEQ ID NO: 38:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG S
SEQ ID NO: 39:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKVTYHSPSYAYHQFERRAILNRLVQFIKDRISVVQALVLTSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTN FDAE
SEQ ID NO: 40:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 41:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKHLELASMTNMELMSSIVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 46:
RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAHAEINEAGRRVKRKVPRNQDWLRVKRASFEAQGALANIAVDKARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 69:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 72:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 73:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 74:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 75:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 76:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 77:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSEYKLVVVGAVGVGKSALTAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 78:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 79:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 80:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 81:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 82:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 83:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALIAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 84:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 85:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 86:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 87:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 88:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 89:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 90:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
SEQ ID NO: 91:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
가장 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체는 다음 성분들을 포함한다(또는 이로 이루어진다):
(i) SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13)에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 96에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 95에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70% 서열 동일성 (바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
(iv) SEQ ID NO: 97에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
(v) SEQ ID NO: 71에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드; 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체. 바람직하게는 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 성분 (i) - (v) (상기 기술된 것과 같음)을 포함한다. 그러나, 복합체는 또한, 하기에 기술될 바와 같이, 상이하게 배열될 수도 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 또한 다음을 포함하는 복합체를 제공한다:
세포 투과 펩타이드;
적어도 3개의 항원성 에피토프; 및
적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
여기서 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합되고, 그리고
여기서 적어도 3개의 항원성 에피토프는 (i) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 (a) 이의 기능적 서열 변이체(들), (ii) CEA 1 이상의 에피토프 또는 (a) 이의 기능적 서열 변이체(들), 및 (iii) ASCL2 1 이상의 에피토프 또는 (a) 이의 기능적 서열 변이체(들)을 포함한다.
본 발명에 따른 이러한 복합체의 바람직한 구현예는 전술한 바와 같은 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체의 바람직한 구현예에 상응한다.
예를 들어 본 발명에 따른 복합체는 바람직하게는, SEQ ID NO: 52에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 10개 아미노산의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다. 더 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 53에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 95에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
예를 들어 본 발명에 따른 복합체는 바람직하게는, SEQ ID NO: 54에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 10개 아미노산의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다. 더 바람직하게, 복합체는 SEQ ID NO: 55에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 96에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
예를 들어, 본 발명에 따른 복합체는 바람직하게는, SEQ ID NO: 92에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 10개 아미노산의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다. 더 바람직하게, 복합체는 SEQ ID NO: 93에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 97에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
또한, 복합체가 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함하는 것이 바람직하다:
CEA의 1 이상의 에피토프 또는 상기 기술된 바와 같은 이의 기능적 서열 변이체;
서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 상기 기술된 바와 같은 이의 기능적 서열 변이체; 및
ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 상기 기술된 바와 같은 이의 기능적 서열 변이체.
더 바람직하게는, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함한다:
- SEQ ID NO: 54에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 10개 아미노산의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
- SEQ ID NO: 52에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 10개 아미노산의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
- SEQ ID NO: 92에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 10개 아미노산의 길이를 갖는 이의 단편, 또는 상기 기술된 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체.
보다 더 바람직하게, (i) SEQ ID NO: 54에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같은 이의 단편 또는 변이체의 C-말단은 (ii) SEQ ID NO: 52에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같은 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접적으로 연결되고; 그리고 (ii) SEQ ID NO: 52에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같은 이의 단편 또는 변이체의 C-말단은 (iii) SEQ ID NO: 92에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같은 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접적으로 연결된다.
또한 바람직하게, 복합체는 SEQ ID NO: 96에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; SEQ ID NO: 95에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및 SEQ ID NO: 97에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
가장 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 98에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 상기 기술한 바와 같이 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 상기 기술한 바와 같이 복합체는 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질이다.
게다가 본 발명에 따른 복합체의 세포 투과 펩타이드는 바람직하게는 상기 기술한 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체의 세포 투과 펩타이드에 상응한다. 이는 특히 세포 투과 펩타이드의 바람직한 구현예에 적용된다.
또한, 본 발명에 따른 복합체의 TLR 펩타이드 작용제는 바람직하게는 상기 기술한 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체의 TLR 펩타이드 작용제에 상응한다. 이는 특히 TLR 펩타이드 작용제의 바람직한 구현예에 적용된다.
예를 들어, 본 발명에 따른 복합체는 바람직하게는 상기 기술한 바와 같이 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음의 성분들을 포함한다:
(i) SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13)에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
(ii) SEQ ID NO: 96에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
(iii) SEQ ID NO: 95에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
(iv) SEQ ID NO: 97에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
(v) SEQ ID NO: 71에 따르는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드; 또는 적어도 70% 서열 동일성(바람직하게는 적어도 75%, 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체,
여기서 성분 (i) - (v)는 선택적으로 링커 또는 스페이스에 의해 연결된다.
가장 바람직하게는, 복합체는 SEQ ID NO: 89에 따르는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 적어도 50% 서열(바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 복합체는 본 명세서에 기재된 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내 성분 a), b), 및 c) 의 배열
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내 상기 성분 a), b), 및 c)는 임의의 방식으로 배열될 수 있다.
특히 만약 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드 및/또는 한 개 초과의 한 개 항원 또는 항원성 에피토프 및/또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제가 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체에 포함되는 경우, 상기 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드는 비-연속적 방식으로 위치될 수 있고, 즉 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 (성분 b)) 및/또는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제 (성분 c))는 연속적으로 위치된 세포 투과 펩타이드의 나열을 방해할 수 있고 및/또는 상기 세포 투과 펩타이드는 성분 b)와 함께 및/또는 성분 c)와 함께 교차적 방식(alternating manner)으로 위치될 수 있다. 유사하게, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프는 비-연속적 방식으로 위치될 수 있고, 즉 적어도 하나의 세포 투과 펩타이드 (성분 a)) 및/또는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제 (성분 c))는 연속적으로 위치된 항원 또는 항원성 에피토프의 나열을 방해할 수 있고 및/또는 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 성분 a)와 함께 및/또는 성분 c)와 함께 교차적 방식으로 위치될 수 있다. 유사하게, 상기 TLR 펩타이드는 비-연속적 방식으로 위치될 수 있고, 즉 적어도 하나의 세포 투과 펩타이드 (성분 a)) 및/또는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 (성분 b))는 연속적으로 위치된 항원 또는 항원성 에피토프의 나열을 방해할 수 있고 및/또는 상기 TLR 펩타이드는 성분 a)와 함께 및/또는 성분 b)와 함께 교차적 방식으로 위치될 수 있다.
하지만, 상기 한 개 초과의 세포 투과 펩타이드는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 연속적 방식으로 위치되고 및/또는 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 연속적 방식으로 위치되고 및/또는 상기 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제는 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 연속적 방식으로 위치되는 것이 바람직하다. 이는 특히 상기 복합체에 포함되는 일정한 성분의 모든 단일 유닛, 즉 모든 세포 투과 펩타이드, 모든 항원 또는 항원성 에피토프 또는 모든 TLR 펩타이드 작용제는 나열적으로 위치되어, 상기 다른 두 개 성분 중 임의에 의해 방해받지 않는다는 것을 의미한다. 오히려, 상기 다른 두 개 성분은 상기 복합체 내에서 예를 들어 상술한 일정한 성분의 모든 단일 유닛의 이러한 나열의 이전 또는 이후에 위치된다. 하지만, 연속적으로 위치된 상술한 일정한 성분의 상기 단일 유닛은 이러한 방식으로 예를 들면 스페이서 또는 링커에 의해 본 명세서에 기술된 것처럼 서로 간에 결합될 수 있고, 이는 상기 다른 성분은 아니다.
각각의 상기 성분 a), b), 및 c)은 연속적 방식으로 위치되는 것이 특히 바람직하다.
구조적으로 각 성분 a), b), 및 c)는 전형적으로 단일 주사슬(main chain) 및 적어도 하나의 곁사슬(side chain)를 포함한다. 용어 "주사슬" (또한 "골격 사슬"(backbone chain)), 본 발명의 면에서 사용된 것은 분자 내 공유 결합 원소의 상기 주요 연속적인 가지(사슬)를 타나낸다. 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질에서, 상기 주사슬(골격)는 상기 펩타이드 결합에 의해 결합된 연속적 알파-카본 원소 및 질소 원소를 전형적으로 포함한다. 상기 골격은 상기 곁사슬을 포함하지 않는다. 본 발명의 면에서 사용된 용어 "곁사슬"(또는 "부수 사슬"(pendant chain))은 "주사슬" 또는 골격으로 불리우는 분자의 중심 부분에 부착되어 있는 화학기를 나타낸다. 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질에서, 상기 결사슬은 상기 연속적 아미노산의 상기 (중심) 부분의 전형적으로 대표하고, 이는 상기 골격의 상기 알파-카본 원소에 부착된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내, 상기 성분 a), b), 및 c)는 본 명세서에 기술된 것처럼 링커 또는 스페이서를 통해 공유적으로 결합될 수 있고 또는 그들은 직접 공유적으로 결합할 수 있다. 스페이서 또는 링커가 공유 결합을 위해 사용되는지 아닌지 여부과 무관하게, 상기 세 개 성분 중 두 개가 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 서로 간에 결합하는 방법으로 주요 네 개 옵션이 있다, 다시 말해:
(i) 주사슬/주사슬 결합(main-chain/main-chain linkage)을 통해,
(ii) 주사슬/곁사슬 결합(main-chain/side-chain linkage)을 통해,
(iii) 곁사슬/주사슬 결합(side-chain/main-chain linkage)을 통해 또는
(iv) 곁사슬/곁사슬 결합(side-chain/side chain linkage)을 통해서이다.
바람직하게는, 모든 세 개 성분 a), b), 및 c)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합되고, 따라서 결과적으로 특히 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서, 이는 한 개 또는 그 이상의 세포 투과 펩타이드(들)의 상기 주사슬, 한 개 또는 그 이상의 항원(들) 또는 항원성 에피토프(들)의 상기 주사슬, 및 한 개 또는 그 이상의 TLR 펩타이드 작용제(들)의 주사슬을 포함한다. 다른 말로, 상기 한 개 또는 그 이상의 세포 투과 펩타이드(들)의 상기 주사슬, 한 개 또는 그 이상의 항원(들) 또는 항원성 에피토프(들)의 상기 주사슬, 및 한 개 또는 그 이상의 TLR 펩타이드 작용제(들)의 주사슬은 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체의 상기 주사슬을 구성하고, 선택적으로 부가 성분, 예를 들면 링커(들), 스페이서(들), 등등과 함께 구성한다. 그에 따라서, 후술하는 상기 성분 a), b), 및 c)의 배열이 바람직하고, 특히 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 상술한 바람직한 배열은 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단 -> C-말단 방향으로 하기에 보여지고 모든 세 개 성분 a), b), 및 c)이 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합되고 선택적으로 링커, 스페이서 또는 또 다른 추가적 성분에 의해 결합될 수 있다:
(α) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제);
(β) 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(γ) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(δ) 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드);
(ε) 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제); 또는
(ζ) 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 성분 c) (적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드).
특히 모든 세 개 성분 a), b), 및 c)가 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합되는 경우, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단적으로 위치하는 것이 바람직하고, 여기서 상기 세포 투과 펩타이드 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서에 의해, 또는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의해 결합된다. 그에 따라서, 이는 상기에서 보인 배열에서 배열 (α), (β), 및 (γ)에 대응하고, 즉 상기 배열에서 배열 (α), (β), 및 (γ)이 더 바람직하다.
보다 더 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 상기 세포 투과 펩타이드의 C-말단적으로 위치하는 것이 바람직하고, 여기서 상기 세포 투과 펩타이드 및 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서에 의해 결합되나, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의해서는 아니다. 그에 따라서, 이는 상기에서 보인 배열에서 배열 (α) 및 (β)에 대응하고, 즉 상기 배열에서 배열 (α) 및 (β)가 보다 더 바람직하다. 특히 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 제조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질이고 상기 성분 a) 내지 c)는 상술한 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 다음과 같은 순서로 위치된다:
(α) 성분 a) - 성분 b) - 성분 c); 또는
(β) 성분 c) - 성분 a) - 성분 b),
여기서 상기 성분은 부가 성분에 의해, 특히 링커 또는 스페이서에 의해 결합될 수 있다.
특히 바람직한 것은 배열 (α)이고, 여기서 상기 최소한 한 대 TLR 작용제는 적어도 하나의 TLR2 작용제를 포함하거나 이로 이루어진다, 예를 들면:
(α1) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들);
(α2) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들), 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들);
(α3) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들); 또는
(α4) 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들).
대안적으로, TLR2 펩타이드 작용제을 포함하는 이러한 배열내, 추가 TLR 펩타이드 작용제가 상기 복합체 내에서 다른 위치에서 또한 배열될 수 있다, 예를 들면:
(α5) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들);
(α6) 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들); 또는
(α7) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들).
특히 바람직한 것은 배열 (β)이고, 여기서 상기 적어도 하나의 TLR 작용제는 적어도 하나의 TLR4 작용제를 포함하거나 이로 이루어진다, 예를 들면:
(β1) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(β2) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들), 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프);
(β3) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프); 또는
(β4) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프).
대안적으로, TLR4 펩타이드 작용제을 포함하는 이러한 배열내, 추가 TLR 펩타이드 작용제가 상기 복합체 내에서 다른 위치에서 또한 배열될 수 있다, 예를 들면:
(β5) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들);
(β6) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들); 또는
(β7) 한 개 또는 그 이상의 TLR4 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR4 펩타이드 작용제(들) - 성분 a) (세포 투과 펩타이드) - 성분 b) (적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프) - 한 개 또는 그 이상의 TLR2 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR2 펩타이드 작용제(들) 및 한 개 또는 그 이상의 TLR5 펩타이드 작용제, 일례로 1, 2, 3, 4, 또는 5 개 TLR5 펩타이드 작용제(들).
대안적으로, 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 단지 두 개가 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내에서 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합된다.
예를 들면 성분 a) 및 b)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합하고, 따라서 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 보여지는 후술 배열 결과를 가져오고, 여기서 상기 성분 a) 및 b)는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서 등등에 의해 결합될 수 있다:
(1) 세포 투과 펩타이드 (a) - 항원/항원성 에피토프 (b); 또는
(2) 항원/항원성 에피토프 (b) - 세포 투과 펩타이드 (a).
이러한 경우, 성분 c), 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 이후 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 곁사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 상기 세포 투과 펩타이드 (a)에 또는 상기 항원/항원성 에피토프 (b)에 또는, 만약 있다면, 예를 들면, 세포 투과 펩타이드 (a) 및 항원/항원성 에피토프 (b) 사이에 위치하는, 스페이서 또는 링커 같은 추가 성분에 배열될 수 있다. 이는 후술 배열을 포함한다.
(i) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 결사슬에;
(ii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬;
(iii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 세포 투과 펩타이드의 곁사슬에;
(iv) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(v) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/주사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 주사슬에;
(vi) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(vii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에;
(viii) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 주사슬에; 또는
(ix) 성분 c)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 b) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에.
예를 들면 성분 b) 및 c)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합하고, 따라서 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 보여지는 후술 배열 결과를 가져오고, 여기서 상기 성분 b) 및 c)는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서 등등에 의해 결합될 수 있다:
(3) 항원/항원성 에피토프 (b) - TLR 펩타이드 작용제 (c); 또는
(4) TLR 펩타이드 작용제 (c) -항원/항원성 에피토프(b).
이러한 경우, 성분 a), 즉 상기 세포 투과 펩타이드는 이후 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 곁사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 상기 항원/항원성 에피토프 (b)에 또는 상기 TLR 펩타이드 작용제 (c)에 또는, 만약 있다면, 예를 들면, 항원/항원성 에피토프 (b) 및 TLR 펩타이드 작용제 (c) 사이에 위치하는, 스페이서 또는 링커 같은 추가 성분에 배열될 수 있다. 이는 후술 배열을 포함한다.
(x) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xi) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 주사슬에;
(xii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xiii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xiv) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/주사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬에;
(xv) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xvi) 성분 a)는 결합될 수 있다- 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에;
(xvii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 주사슬에; 또는
(xviii) 성분 a)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 세포 투과 펩타이드의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 b) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에.
예를 들면 성분 a) 및 c)는 주사슬/주사슬 결합을 통해 결합하고, 따라서 상기 복합체의 상기 주사슬의 N-말단C-말단 방향으로 보여지는 후술 배열 결과를 가져오고, 여기서 상기 성분 a) 및 b)는 선택적으로 부가 성분, 일례로 링커, 스페이서 등등에 의해 결합될 수 있다:
(5) 세포 투과 펩타이드 (a) - TLR 펩타이드 작용제 (c); 또는
(6) TLR 펩타이드 작용제 (c) - 세포 투과 펩타이드 (a).
이러한 경우, 성분 b), 즉 상기 항원/항원성 에피토프는 이후 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 곁사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 상기 세포 투과 펩타이드 (a)에 또는 상기 TLR 펩타이드 작용제 (c)에 또는, 만약 있다면, 예를 들면, 세포 투과 펩타이드 (a) 및 TLR 펩타이드 작용제 (c) 사이에 위치하는, 스페이서 또는 링커 같은 추가 성분에 배열될 수 있다. 이는 후술 배열을 포함한다.
(xix) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xx) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 주사슬에;
(xxi) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 곁사슬에;
(xxii) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xxiii) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/주사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 주사슬에;
(xxiv) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 c)에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제의 상기 곁사슬에;
(xxv) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 주사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 주사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에;
(xxvi) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/주사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 주사슬에; 또는
(xxvii) 성분 b)는 결합될 수 있다 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 결사슬/곁사슬 결합을 통해 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 항원/항원성 에피토프 스페이서에, 즉 상기 적어도 하나의 항원/항원성 에피토프의 상기 곁사슬은 공유적으로 결합 - 선택적으로 스페이서 또는 링커를 통해 - 성분 a) 및 성분 c) 사이에 위치하는 링커 또는 스페이서의 상기 곁사슬에.
대안적으로, 또한 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체의 모든 세 개 상기 성분 a), b), 및 c)는 주사슬/곁사슬 결합을 통해, 결사슬/주사슬 결합을 통해 또는 곁사슬/곁사슬 결합을 통해 배열되고, 선택적으로 부가 성분, 일례로 스페이서 또는 링커에 의해 결합되는 것이 생각될 수 있다.
결장직장암
본 발명은 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 복합체를 제공한다.
결장직장암(CRC, "장암"이라고도 함)은 결장암 및 직장암(CC)을 포함하는 암이다. 두 개의 각각의 암은 많은 공통점을 가지만 암 시작점은 아니다. 문헌(Siegel, R., C. Desantis, and A. Jemal, Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin, 2014. 64(2): p. 104-17)에 따르면, 2006년과 2010년 사이에 미국에서, 종양 부위에 의한 발병률은 근위 결장(결장의 첫 번째 부분과 중간 부분)에서 약간 더 중요하다. 10만명에 대해 약 19건의 사례가 있으며, 이는 사례의 42%를 나타낸다. 그 다음에 케이스의 28%로서 직장암이 오고, 원위부 결장(결장 하단)이 10만명에 대해 10건 발생했다.
해부학적으로, "결장직장암"이라는 용어는 (i) 맹장(cecum) (회맹판을 포함한 암), 충수(appendix), 상행 결장(ascending colon), 간굽이(hepatic flexure), 횡행 결장(transverse colon), 지라굽이(splenic flexure), 하행 결장(descending colon), S상 결장(sigmoid colon) (S상 (굽이)의 암을 포함))의 암들뿐만 아니라 결장의 중복 부위의 암들; (ii) 결장 및 직장의 암과 직장구불결장(rectosigmoid)의 암과 같은, 직장구불결장 이행부(rectosigmoid junction)의 암들; 및 (iii) 직장팽대(rectal ampulla)의 암과 같은 직장암들을 포함한다.
바람직하게는, 결징직장암은 맹장(cecum)암 (회맹판을 포함한 암), 충수(appendix)암, 상행 결장(ascending colon)암, 간굽이(hepatic flexure)암, 횡행 결장(transverse colon)암, 지라굽이(splenic flexure)암, 하행 결장(descending colon)암, S상 결장(sigmoid colon)암 (S상 (굽이)의 암을 포함)) 또는 이들의 조합과 같은, 결장암이다.
또한, 결장직장암은 (i) 결장 및 직장의 암 또는 (ii) 직장구불결장(rectosigmoid)의 암과 같은, 직장구불결장 이행부(rectosigmoid junction)의 암인 것이 바람직하다.
게다가, 결장직장암은 직장팽대(rectal ampulla)의 암과 같은 직장암인 것이 또한 바람직하다.
세포 유형에 관해서는, 결장직장암은 다음을 포함한다: 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma), 결장직장 간질 종양(colorectal stromal tumors), 일차 결장직장 림프종(primary colorectal lymphoma), 결장직장 평할근육종(colorectal leiomyosarcoma), 결장직장 흑색종(colorectal melanoma), 결장직장 편평상피암(colorectal squamous cell carcinoma) 및 결장직장 유암종(colorectal carcinoid tumors), 예를 들어, 맹장(cecum), 충수(appendix), 상행 결장(ascending colon), 횡행 결장(transverse colon), 하행 결장(descending colon), S상 결장(sigmoid colon) 및/또는 직장(rectum)의 유암종(carcinoid tumors)과 같은 것들. 따라서, 결장직장암의 바람직한 유형은 다음을 포함한다: 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma), 결장직장 간질 종양(colorectal stromal tumors), 일차 결장직장 림프종(primary colorectal lymphoma), 결장직장 평할근육종(colorectal leiomyosarcoma), 결장직장 흑색종(colorectal melanoma), 결장직장 편평상피암(colorectal squamous cell carcinoma) 및 결장직장 유암종(colorectal carcinoid tumors), 예를 들어, 맹장(cecum), 충수(appendix), 상행 결장(ascending colon), 횡행 결장(transverse colon), 하행 결장(descending colon), S상 결장(sigmoid colon) 및/또는 직장(rectum)의 유암종(carcinoid tumors)과 같은 것들. 더 바람직하게는, 결장직장암은 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma) 또는 결장직장 유암종 상피성암(colorectal carcinoid carcinoma). 보다 더 바람직하게는, 결장직장암은 결장직장 선암종(colorectal adenocarcinoma)이다.
CRCs의 95% 이상이 선암(adenocarcinomas)이다. 결장직장 선암종은 보통 점액이 결장이나 직장을 윤활하게 만드는 선세포에서 시작한다. CRC는 일반적으로 가장 안쪽 층에서 시작하여 일부 또는 모든 다른 층을 통해 성장할 수 있다. 드문 경우로 CRC는 폴립(polyp) 중에서 형성될 수 있는데, 이는 시작 영역의 벽 속으로의 성장을 촉진한다. 진행된 단계(III기 및 IV기)에서는 암이 혈관을 통해 인근 림프절 또는 신체의 먼 부분으로 이동한다.
예를 들어 결장직장암에서 TNM 단계 시스템은 일차 종양("T" 단계)에 대해 다음 단계를 포함한다: TX - 일차 종양을 평가할 수 없음, T0 - 일차 종양의 증거 없음, Ta - 비침습성 유두암(papillary carcinoma), Tis - 제자리 암종(Carcinoma in situ): 상피내(intraepithelial) 또는 고유층(lamina propria) 침윤, T1 - 종양이 점막하층(submucosa)을 침범함, T2 - 종양이 근육 조직(muscularis propria)을 침범함, T3 - 종양이 근골격 조직(muscularis propria)을 통해 결장직장주변(pericolorectal) 속으로 침범함, T4a - 종양이 장측 복막(visceral peritoneum) 표면으로 침투함, 그리고 T4b - 종양은 다른 기관이나 구조물에 직접 침투하거나 부착한다: 다음 단계들은 림프절에 관한 것이다("N" 단계): NX - 국소 림프절을 평가할 수 없음, N0 - 국소 림프절 전이 없음, N1 - 1-3개 국소 림프절 내 전이로서, N1a - 1개 국소 림프절 내 전이, N1b - 2-3개 국소 림프절 내 전이, 그리고 N1c - 국소 결절 전이 없이 장막하층(subserosa), 장간막(mesentery), 또는 복막화되지 않은(nonperitonealized) 결장주위의(pericolic) 또는 직장 주위의(perirectal) 조직 중에 종양 침전(들)을 가짐, N2 - 4개 이상의 림프 절 내 전이로서, N2a - 4-6개 국소 림프절 내 전이 및 7개 이상의 국소 림프절 내 전이를 가짐; 그리고 원격 전이의 경우 다음의 단계들이 있음("M" 단계들): M0 - 원격 전이 없음, 그리고 M1 - 원격 전이로서, M1a - 1개 기관 또는 장소(eg, 간, 폐, 난소, 비국소 결절)에 국한된 전이 및 M1b - 1개 초과의 기관/장소 또는 복막(peritoneum) 내 전이를 가짐. 이 단계는 다음과 같은 결장직장암의 수치화한 단계로 통합될 수 있다: 0기: Tis, N0, M0; I기: T1, N0, M0 또는 T2, N0, M0; IIA기: T3, N0, M0; IIB기: T4a, N0, M0; IIC기: T4b, N0, M0; IIIA기: T1-T2, N1/N1c, M0 또는 T1, N2a, M0; IIIB기: T3-T4a, N1/N1c, M0 또는 T2-T3, N2a, M0 또는 T1-T2, N2b, M0; IIIC기: T4a, N2a, M0 또는 T3-T4a, N2b, M0 또는 T4b, N1-N2, M0; IVA기: 임의의 T, 임의의 N, M1a 및 IVB기: 임의의 T, 임의의 N, M1b. 간단하게 말하면, 0기에서, 암은 결장 또는 직장의 내막 너머로 자라나지 않았다; I기에서, 암은 점막으로부터 근육막으로 퍼졌다; II기에서, 암은 근육막을 통과하여 기관 근처의 장막(serosa)으로 퍼졌다; III기에서, 암은 림프절 근처까지 퍼지거나 또는 암 세포가 림프절 근처의 조직까지 퍼졌다; IV기에서, 암은 혈액 및 림프절을 통하여 신체의 다른 부분까지 퍼졌다.
용어 "암"에도 불구하고, 결장직장암은 상기 기술한 모든 수치화한 단계를 포함하며, 그리하여 결장직장암의 바람직한 단계는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다: 0기 (Tis, N0, M0), I기 (T1, N0, M0 또는 T2, N0, M0), IIA기 (T3, N0, M0), IIB기 (T4a, N0, M0), IIC기 (T4b, N0, M0), IIIA기 (T1-T2, N1/N1c, M0 또는 T1, N2a, M0), IIIB기 (T3-T4a, N1/N1c, M0 또는 T2-T3, N2a, M0 또는 T1-T2, N2b, M0), IIIC기 (T4a, N2a, M0 또는 T3-T4a, N2b, M0 또는 T4b, N1-N2, M0), IVA기 (임의의 T, 임의의 N, M1a) 및 IVB기 (임의의 T, 임의의 N, M1b). 보다 바람직하게는, 결장직장암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: I기 (T1, N0, M0 또는 T2, N0, M0), IIA기 (T3, N0, M0), IIB기 (T4a, N0, M0), IIC기 (T4b, N0, M0), IIIA기 (T1-T2, N1/N1c, M0 또는 T1, N2a, M0), IIIB기 (T3-T4a, N1/N1c, M0 또는 T2-T3, N2a, M0 또는 T1-T2, N2b, M0), IIIC기 (T4a, N2a, M0 또는 T3-T4a, N2b, M0 또는 T4b, N1-N2, M0), IVA기 (임의의 T, 임의의 N, M1a) 및 IVB기 (임의의 T, 임의의 N, M1b). 보다 더 바람직하게, 결장직장암은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: IIA기 (T3, N0, M0), IIB기 (T4a, N0, M0), IIC기 (T4b, N0, M0), IIIA기 (T1-T2, N1/N1c, M0 또는 T1, N2a, M0), IIIB기 (T3-T4a, N1/N1c, M0 또는 T2-T3, N2a, M0 또는 T1-T2, N2b, M0), IIIC기 (T4a, N2a, M0 또는 T3-T4a, N2b, M0 또는 T4b, N1-N2, M0), IVA기 (임의의 T, 임의의 N, M1a) 및 IVB기 (임의의 T, 임의의 N, M1b). 가장 바람직하게, 결장직장암은 (i) IIIA기 (T1-T2, N1/N1c, M0 또는 T1, N2a, M0), IIIB기 (T3-T4a, N1/N1c, M0 또는 T2-T3, N2a, M0 또는 T1-T2, N2b, M0), 또는 IIIC기 (T4a, N2a, M0 또는 T3-T4a, N2b, M0 또는 T4b, N1-N2, M0)와 같은 III기 결장직장암, 또는 (ii) IVA기 (임의의 T, 임의의 N, M1a) 및 IVB기 (임의의 T, 임의의 N, M1b)와 같은 IV기 결장직장암이다.
펩타이드 및 단백질 복합체를 암호화하는 핵산
또 관점에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체를 인코딩하는 핵산, 특히 핵산 분자를 제공하며, 여기서 상기 복합체는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 특히, 본 발명은 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 정의된 바와 같은 복합체를 암호화한다. 환언하면, 본 발명은 핵산, 특히 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 복합체를 암호화하고, 여기서 복합체는 결장직장암의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 폴리펩타이드 또는 단백질이다.
본 발명은 또한 핵산, 특히 상기 기술된 바와 같은 본 발명에 따른 복합체를 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데, 여기서 상기 복합체가 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 특히, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 환언하면, 본 발명은 핵산, 특히 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 복합체를 암호화하고, 여기서 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 이러한 핵산은 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
핵산은 바람직하게는 단일 가닥, 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥인 핵산을 포함하고, 바람직하게는 게놈 DNA, cDNA, RNA, siRNA, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 발현 요소, 미니-유전자(mini-gene), 유전자 단편, 조절 요소, 프로모터가 있거나 없는 상보(complimentary) RNA/DNA 서열 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 핵산(분자) 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 더 바람직한 예시들은, 예컨대 재조합 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 올리고뉴클레오타이드, rRNA, mRNA, miRNA, siRNA, 또는 tRNA와 같은 RNA 분자, 또는 상기 기술한 바와 같은 DNA 분자를 포함한다. 따라서 핵산(분자)는 DNA 분자 또는 RNA 분자인 것이 바람직하다; 바람직하게는 게놈 DNA; cDNA; siRNA; rRNA; mRNA; 안티센스 DNA; 안티센스 RNA; 리보자임; 상보 RNA 및/또는 DNA 서열; 발현 요소, 조절 요소 및/또는 프로모터가 있거나 없는 RNA 및/또는 DNA 서열; 벡터; 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명은 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산에 관련되고, 상기 핵산은 특히 폴리펩타이드 또는 단백질인 복합체를 암호화하는데, 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 및 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하고, 여기서 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프, 및 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는, 선택적으로 본 명세서에 기술된 펩타이드성 스페이서(들) 또는 링커(들)과 함께, 공유적으로 결합된다. 만일 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 폴리펩타이드 또는 단백질인,가 상술한 복합체에 포함되는 경우, 상기 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프는 또한, 선택적으로 본 명세서에 기술된 펩타이드성 스페이서(들) 또는 링커(들)과 함께, 공유적으로 결합된다. 유사하게, 만일 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제가 상술한 복합체에 포함되는 경우, 상기 한 개 초과의 펩타이드 작용제는 또한, 선택적으로 본 명세서에 기술된 펩타이드성 스페이서(들) 또는 링커(들)과 함께, 공유적으로 결합된다.
특히 바람직하게 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 핵산은 (a) 상기 기술된 세포 투과 펩타이드, (b) 상기 기술된 적어도 하나의, 바람직하게는 최소한 두 개, 더 바람직하게는 최소한 세 개, 보다 더 바람직하게는 최소한 네 개, 특히 바람직하게는 최소한 다섯 개, 가장 바람직하게는 최소한 여섯 개 항원 또는 항원성 에피토프, 바람직하게는 상기 기술된 것처럼 연속적 방식으로 배열되고 및 (c) 상기 기술된 적어도 하나의 TLR 작용제를 포함하는 (재조합) 융합 단백질인 복합체를 암호화한다.
가장 바람직하게, 핵산 (분자)는 본 명세서에 기술된 바와 같은 예시된 복합체 또는 이의 기능적 서열 변이체를 암호화한다. 따라서, 핵산 (분자)는 가장 바람직하게는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 87 중 어느 하나에 따르는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 87 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성 을 공유하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특히, 핵산 (분자)는 가장 바람직하게, SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 91 중 어느 하나에 따르는 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 91 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
특히 바람직하게 본 발명에 따르는 핵산 (분자)는 SEQ ID NO: 89에 따르는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 적어도 50% 서열 동일성 (바람직하게는 적어도 60%, 더 바람직하게는 적어도 70%, 더 바람직하게는 적어도 75%, 보다 더 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 특히 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함한다.
복합체의 생산 및 정제
부가 측면에 따라 본 발명은 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료예 사용하기 위한 벡터, 특히 상기 기술된 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 문맥에서 사용된, 용어 "벡터"(vector)는 핵산 분자, 바람직하게는 합성 핵산 분자, 즉 자연에서 발생하지 않는 핵산을 나타낸다. 본 발명 면에서 벡터는 원하는 핵산 서열을 통합(incorporating)하거나 또는 결집(harboring)하는데 적합하다. 이러한 벡터들은 저장 벡터(storage vectors), 발현 벡터(expression vectors), 클로닝 벡터(cloning vectors), 트랜스퍼 벡터(transfer vectors) 등등이 될 것이다. 저장 벡터는 핵산 분자의 편리한 저장을 허용하는 벡터이다. 따라서, 상기 벡터는, 일례로, 본 발명에 따른 원하는 복합체에 대응하는 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 예를 들어 RNA, 일례로 mRNA, 또는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질와 같은 발현 산물의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 상기 벡터의 서열 나열의 전사에 필요한 서열, 예를 들어 프로모터 서열과 같은 것을 포함할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 클로닝 위치를 포함하는 벡터이고, 이는 핵산을 상기 벡터로의 통합하는 데 사용될 수 있다. 클로닝 벡터는, 일례로, 플라스미드 벡터(plasmid vector) 또는 박테리오파지 벡터(bacteriophage vector)일 수 있다. 트랜스퍼 벡터는 핵산 분자를 세포 또는 소기관 내로 이동시키는 유용한 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터(viral vectors), 일 수 있다. 본 발명 면에서 벡터는, 일례로, RNA 벡터 또는 DNA 벡터,일 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 DNA 분자이다. 예를 들면, 본 발명의 적용 면에서 벡터는 클로닝 위치, 선택 마커(selection marker), 예를 들어 항생제 내성 인자(antibiotic resistance factor), 및 벡터의 증식(multiplication)에 적합한 서열, 예를 들어 복제 기점(origin of replication)을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 적용면에서 벡터는 플라스미즈 벡터이다. 바람직하게는, 본 발명 적용의 면에서 벡터는 발현 벡터이다.
상기 기술된 바와 같이, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 형질전환된 세포도 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 세포의 예들은, 비록 이에 제한되지 않지만, 박테리아 세포(bacterial cells), 일례로 대장균(E. coli), 및 진핵세포(eukaryotic cells), 일례로, 효모 세포(yeast cells), 동물 세포 또는 식물 세포을 포함한다. 한 구현예에서 상기 세포는 포유류, 일례로, 인간, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종(myeloma) 또는 하이브리도마(hybridoma) 세포 이다. 그에 따라서, 본 발명은, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체를 발현하는 세포; 또는 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 벡터를 포함하는 세포와 관련된다.
특히, 세포는 상기 기술된 바와 같은 벡터로, 바람직하게는 발현벡터로 감염(transfect)될 수 있다. 용어 "감염"(transfection)은 핵산 분자, 예를 들어, DNA 또는 RNA (일례로 mRNA) 분자의 세포 내로의, 바람직하게는 진핵 세포 내로의, 도입을 나타낸다. 본 발명 면에서, 용어 "감염"은 핵산 분자를 세포, 바람직하게는 진핵 세포 내로, 예를 들어 포유류 세포 내로, 도입하기 위한 것으로 당해 분야 기술자에 알려진 임의의 방법을 아우른다. 이러한 방법들은, 예를 들면, 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 일례로 양이온성 지질(cationic lipids) 및/또는 리포솜(liposomes)에 기초한, 인산칼슘 침전법(calcium phosphate precipitation), 나노입자(nanoparticle) 기초한 핵산전달감염, 바이러스 기초한 핵산전달감염(virus based transfection), 또는 양이온성 폴리머에 기초한 핵산전달감염, 예를 들어 DEAE-덱스트란(dextran) 또는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine etc) 등등을 아우른다. 바람직하게는, 상기 도입은 비-바이러스성이다.
수많은 발현 시스템이 사용 가능하고, 제한없이 크로모솜(chromosomes), 에피솜(episomes), 및 변이된 바이러스(derived viruses)를 포함한다. 보다 특히, 상기 기술된 바와 같은 벡터, 특히 사용된 상기 재조합 벡터는 박테리아성 플라스미드(bacterial plasmids), 트랜스포손(transposons), 효모 에피솜(yeast episomes), 삽입 요소(insertion elements), 효모 크로모솜 요소(yeast chromosome elements), 바쿨로바이러스(baculovirus), 예를 들어 SV40 같은 유두종 바이러스(papilloma viruses), 백시니아 바이러스(vaccinia viruses), 아데노바이러스(adenoviruses), 폭스 팍스 바이러스(fox pox viruses), 거짓미친개병(pseudorabies) 바이러스, 레트로바이러스(retroviruses)과 같은 바이러스로부터 유래할 수 있다.
예를 들면, 이러한 벡터, 특히 제조합 벡터는 쉽게 코스미드(cosmid) 또는 파지미드(phagemid) 유도체가 될 수 있다. 상기 핵산 서열, 특히 본 발명에 따른 핵산은 당해 분야 기술자에게 잘 알려진 방법, 예를 들면, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4th Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001에 기술된 것 같은 것에 의해 상기 재조합 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다.
벡터, 특히 재조합 벡터는, 특히 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산의 발현 조절을 콘트롤하는 뉴클레오타이드 서열뿐만 아니라, 특히 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산의 발현, 전사 및 번역을 허용하는 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함할 수 있다. 전형적으로, 이들 서열들은 사용되는 숙주 세포에 따라 선택된다.
따라서, 예를 들면, 적당한 분비 신호(secretion signal)는 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 벡터 내에서, 특히 재조합 벡터 내에서, 통합될 수 있고, 그에 따라서 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 핵산에 의해 암호화되는 상기 폴리펩타이드 및 단백질은, 예를 들면 상기 세포질그물(endoplasmic reticulum)의 루멘(lumen)을 향해, 상기 원형질막 주위공간(periplasmic space)를 향해, 세포막 상에 또는 상기 세포외 환경을 향해 안내될 수 있다. 적당한 분비 신호의 선택은 후속적인 단백질 정제를 용이하게 할 수 있다.
또 다른 관점에서 본 발명은, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 숙주 세포를 제공하는데, 숙주세포는 벡터, 특히 본 명세서에서 기술된 바와 같은 재조합 벡터를 포함한다.
벡터, 특히 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 도입은 당해 분야 기술자에게 잘 알려진 방법, 예를 들어 문헌(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 2nd ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, 및 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 전술)에 기재된 것들, 예를 들면, 일례로 인산칼슘에 의한, DEAE 덱스트란(dextran)에 의한, 또는 양이온성 지질에 의한 상기 기술된 핵산전달감염을 포함하는; 미세주입법(microinjection), 전기천공법, 형질도입법 또는 감염에 따라 실행될 수 있다.
숙주 세포는, 예를 들면, 예를 들어 대장균(E. coli) 같은 박테리아 세포, 예를 들어 효소 세포 같은 곰팡이 세포 및 아스퍼질러스(Aspergillus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 곤충 세포 및/또는 임의의 세포주, 일례로 중국 햄스터 난소 세포(Chinese Hamster Ovary cells, CHO), C127 마우스 세포주(mouse cell line), 시리안 햄스터(Syrian hamster) 세포의 BHK 세포주, 인간 배아 신장 293(Human Embryonic Kidney 293, HEK 293) 세포일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 숙주 세포는 포유류이고, 일례로, 인간, CHO, HEK293T, PER.C6, NS0, 골수종 또는 하이브리도마 세포이다. 수지상 세포 및 수지상 세포주가 숙주 세포로서 특히 바람직하다. 전형적으로, 배양 배지의 선택은 특히 상기 세포 유형 및/또는 상기 세포주의 선택에 달려있고, 당해 기술자는 적합한 배양 배지, 어떠한 것이 선택된 세포 유형 및/또는 세포주에 적합한지 이해한다.
숙주 세포는, 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 단백질, 특히 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체를 발현하기 위하여, 본 명세서에 기술된 바와 같은 벡터 및/또는 상기 핵산에 기초하여 사용될 수 있다. 표준 방법에 의한 정제 이후, 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질, 특히 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체는 하기 기술된 방법에 의해 사용될 수 있다.
그에 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 상기 복합체를 제조하는 방법을 제공하고, 특히 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 상술한 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(i) 상기 기술된 숙주 세포를 배양 배지 내에서 배양(cultivating); 및
(ii) 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 배양 배지로부터 분리, 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 숙주 세포 용해(lysis) 이후 상기 숙주로부터 분리.
따라서, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 이러한 방법에 의해 수득한 상기 복합체는 바람직하게는 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 복합체이다.
단백질 추출(extraction)을 위해 상업적으로 입수 가능한 키트 및/또는 시약, 예를 들면 Novagen사의 BugBusterTM,이 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 제조하는 방법은 부가적으로 후술 단계를 포함한다:
(iii) 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체의 가용화(solubilization), 일례로 우레아 또는 구아니딘 염산(guanidine hydrochloride, GuHCl)을 포함하는 용액에 재현탁,
여기서 단계 (iii)은 상기 기술된 단계 (ii)를 뒤따른다.
게다가, 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 제조하는 방법은 부가적으로 후술 단계를 포함한다:
(iv) 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체의 정제, 바람직하게는 원-스텝 친화력 크로마토그래피,
여기서 단계 (iv)는 상기 기술된 단계 (ii), 또는, 만약 존재한다면, 단계 (iii)을 뒤따른다.
추가적으로, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체는 또한 합성 화학 방법(synthetic chemistry methods), 예를 들면 고체상 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다.
이들 펩타이드 또는 단백질의 정제는 단백질/펩타이드 정제를 위해 당해 분야에 알려진 임의의 기술의 방법에 의해 실행될 수 있다. 예시적인 기술은 이온-교환 크로마토그래피(ion-exchange chromatography), 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography), 및 면역친화성 방법(immunoaffinity methods)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 또한 다음 단계를 포함하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 제조하는 방법을 제공한다:
(i) 상술한 복합체의 화학적으로 합성; 및
(ii) 상술한 복합체를 정제.
바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 제조하는 방법에서, 단계 (i)에서 화학적으로 합성되고 단계 (ii) 에서 정제된 상기 복합체는 세포 투과 펩타이드로 본 명세서에 기술된 아미노산 서열, TLR 펩타이드 작용제로 본 명세서에 기술된 아미노산 서열, 및, 선택적으로, 만약 상기 적어도 하나의 항원 및/또는 항원성 에피토프가 펩타이드 또는 단백질인 경우 항원 또는 항원성 에피토프로 본 명세서에 기술된 아미노산 서열을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서
(i) 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 절편 및/또는 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 따로따로 합성되고;
(ii) 선택적으로, 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 절편 및/또는 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 정제되고; 및
(iii) 상기 세포 투과 펩타이드, 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 절편 및/또는 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 상기 기술된 것처럼 공유적으로 결합되고, 선택적으로 상기 기술된 것처럼 스페이서 또는 링커에 의해 또는 교차-결합제에 의해 의한다.
본 발명에 따른 복합체가 탑재된 세포
또 다른 관점에서 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 복합체가 탑재된 세포와 관련된다. 예를 들면, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체가 탑재된 세포는 치료될 대상으로부터 얻은 세포, 특히 치료될 대상에서 분리된 세포, 즉 치료될 대상으로부터 분리된 세포이다.
본 발명의 문맥에서 사용된 것처럼, 용어 "대상"(subject)은 특히 포유류를 나타낸다. 예를 들면, 본 발명에 의해 고려되는 표유류는 인간, 영장류, 예를 들어 소, 양, 돼지, 말과 같은 가축, 실험실 설치류 및 기타 같은 종류의 것을 포함한다. 더 바람직하게는, 용어 "대상"은 사람 대상을 나타낸다.
본 발명의 문맥에서 사용된 것처럼, "치료" 및 "치료하는" 및 이와 같은 것들은 일반적으로 원하는 약물학적 및 생리학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 상기 효과는 질병(disease), 증후(symptom) 또는 이들의 상태(condition)를 예방하거나 부분적으로 예방하는 형태로 예방적 효과 및/또는 질병, 상태, 증후 및 상기 질병으로 인한 부작용(adverse effect)의 부분적 또는 완전한 치료 형태의 치료적 효과일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "치료"는 포유류, 특히 인간의 질병의 임의의 치료를 포함하며, 다음을 포함한다: (a) 예를 들면 예방적 초기 무증상 개입(preventive early asymptomatic intervention)과 같은 질병에 취약하나 아직 상기 질병의 발발이 발생하지 않았거나 및/또는 상기 질병으로 아직 진단되지 않은 대상에서 발생하는 질병의 예방; (b) 질병의 저해, 즉, 그의 발달을 정지 또는 둔화; 또는 (c) 질병의 완화, 즉, 예를 들면 손상의 향상(improvement) 또는 개선(remediation) 같은 질병 및/또는 최소한 그의 증후 또는 상태의 최소한 부분적 완화를 일으키는 것. 특히, 본 발명에 따른 상기 방법, 용도, 제형 및 조성물은 암 또는 감염병(infectious diseases)의 치료 및/또는 초기 단계 암을 갖는 환자에서 진행 또는 전이 단계로의 암의 진화의 방지에 유용하고, 그렇게 함으로써 암의 병기를 개선한다. 암에 적용될 때, 질병 또는 질환의 예방은 상기 암이 발달할 위험에 있는 것으로 확인된, 사례를 들면 상기 개인의 친척 집단에서 상기 암의 과거 발현으로 인한, 개인의 암의 출현 또는 발달의 방지 및 종양 자극 병원체로의 감염의 방지를 포함하고, 이러한 병원체는 예를 들어, 엡스테인-바르 바이러스 (EBV), 사람유두종바이러스 (HPV), 간염 B 바이러스 (HBV), 간염 C 바이러스 (HCV), 인간 헤르페스 바이러스 8 (인간 Herpes virus, HHV8), 인간 T-세포 백혈병 바이러스 타입 1 (leukemia virus type 1, HTLV-1), 메르켈 세포 폴리오마 바이러스(Merkel cell polyomavirus, MCV) 및 헬리코박터 파일로리가 있다. 또한, 용어 암의 "예방/치료"에 의해 포함되는 것은 개인의 이미 진단된 암의 안정화 또는 지연이다. "안정화"에 의해, 이는 초기 단계 암을 갖는 환자에서 암의 진행 또는 전이 단계로의 암의 진화의 방지를 의미한다.
바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체가 탑재된 상기 세포는 항원-제시 세포(antigen-presenting cell, APC)이다. 바람직하게는, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포, 대식세포(macrophage) 및 B-세포로 이루어진 그룹에서 선택된다. 수지상 세포, 특히 치료될 환자로부터 분리된 수지상 세포(전통식(재래식) 및/또는 플라스마시토이드(plasmacytoid)),가 바람직하다.
항원 제시 세포, 특히 수지상 세포를 대상으로부터 분리하는 방법들은 당해 분야 기술자에게 알려져 있다. 이들은 골수의 단핵구(monocytes) 또는 조혈간세포(hematopoietic stem cell), 제대혈, 또는 말초 혈액을 수확하는 단계를 포함한다. 이들은 또한 배아 줄기(embryonic stem, ES) 세포 및 유도 만능 줄기 세포 (induced pluripotent stem, iPS)의 사용을 포함한다. 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포 또는 이의 전구체들은 정화(elutriation) 및 마그네틱 비드 기초 분리를 포함하는 방법에 의해 농축될 수 있고, 이는 CD14+ 전구체 세포에 대한 농축과 관련될 수 있다.
본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 상기 세포, 바람직하게는 상기 언급된 항원-제시 세포, 더 바람직하게는 수지상 세포, 내로 탑재하고 나아가 대상에게 투여 전에 이러한 세포를 준비하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다. 예를 들면 수지상 세포의 제조는 예를 들어 GM-CSF 및 IL-4를 포함할 수 있는 사이토킨을 사용한 그들의 배양 또는 분화를 포함할 수 있다. 수지상 세포주가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 복합체를 상기 세포 내로, 바람직하게는 수지상 세포 내로, 더 바람직하게는 수지상 세포 내로, 탑재하는 것은 배양시 상기 세포와 본 발명의 복합체의 공동 배양을 관여시키며, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체에 의해 포함되는 세포 관통 펩타이드의 본래 성질 (즉, 그의 내재화 능력)을 이용한다. 따라서 효율적인 성숙을 유도하기 위해 탑재된 상기 세포, 즉, 수지상 세포의 부가적 배양은 IL-1β, IL-6, TNFα, PGE2, IFNα를 포함하는 사이토킨, 및 폴리-IC, 폴리-ICLC (즉 카르복시메틸셀룰로오즈(carboxymethylcellulose), 폴리이노시닉-폴리시티딜 산(polyinosinic-polycytidylic acid) 및 폴리-L-라이신 이중-가닥 RNA의 합성 복합체)를 포함하는 아주반트, 및 부가적인 TLR 작용제 및 NLR(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors) 작용제의 첨가를 포함할 수 있다.
세포, 특히 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체가 탑재된 항원 제시 세포를 제조하기 위한 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다:
(i) 본 발명의 복합체로 상술한 세포를 형질도입 또는 형질전환;
(ii) 배양 배지 내에서 상술한 세포를 배양; 및
(iii) 상기 배양 배지로부터 상술한 세포를 분리.
바람직하게는, 상기 세포는 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체가 탑재되어 있고, 여기서 상기 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이고, 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체(들)가 탑재되고 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용되는 상기 세포는 MHC 클래스 I 환경 및/또는 MHC 클래스 II 환경 내 상기 세포 표면에서 상술한 복합체에 포함되는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프를 제시한다.
본 발명에 따른 조성물 및 키트
또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 바람직하게 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 포함한다:
(i) 상기 기술된 복합체,
(ii) 상기 기술된 핵산,
(iii) 상기 기술된 벡터,
(iv) 상기 기술된 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 복합체가 탑재된 세포.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체를 포함한다.
본 발명에 따라 (사용하기 위한) 조성물은 또한 상기 상술한 성분 (i) 내지 (v) 중 한 개 초과를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 조성물은 (i)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 복합체, (ii)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 핵산, (iii) 에 속하는 최소한 두 개의 상이한 벡터, (iv)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 숙주 세포, 및/또는 (v)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 세포를 포함할 수 있고; 일례로, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 조성물은 최소한 두 개의 상이한 복합체 (i) 및/또는 최소한 두 개의 상이한 핵산 (ii)를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)는 성분 a)에서, 즉 세포 투과 펩타이드에서, 성분 b)에서, 즉 항원 또는 항원성 에피토프에서 또는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 서브셋에서, 또는 성분 c)에서, 즉 상기 TLR 펩타이드 작용제에서 또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제의 세브셋에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 세 개 모두에서 상이할 수 있다. 그에 따라서, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 핵산 (ii)는 그들이 이러한 상이한 복합체를 암호화하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 벡터 (iii)은 그들이 이러한 상이한 핵산을 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 숙주 세포 (iv)는 그들이 이러한 상이한 벡터를 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 복합체가 탑재된 상기 상이한 세포 (v)는 그들이 이러한 상이한 복합체가 탑재되는 것에서 상이할 수 있다.
본 발명은 또한 백신, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것을 제공하고, 상기 백신은 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 성분을 포함한다:
(i) 상기 기술된 복합체,
(ii) 상기 기술된 핵산,
(iii) 상기 기술된 벡터,
(iv) 상기 기술된 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 복합체가 탑재된 세포.
바람직하게는, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 백신은 본 명세서에 기술된 바와 같은 상기 복합체를 포함한다.
그렇게 함으로써, 상기 성분 (i) 내지 (v) 중 한 개 초과하는 것에 대하여 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 조성물에 대해 기술된 상기 상세한 사항은, 또한 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 백신에 적용된다.
본 발명의 면에서 사용된 것처럼, 용어 "백신"은 전형적으로 구체적인 질병, 바람직하게는 암에 대한 선천(innate) 및/또는 후천(적응, adaptive) 면역을 제공하는 생물학적 제재를 나타낸다. 따라서, 백신은 특히 치료될 대상의 면역 시스템의 선천 및/또는 후천 면역 반응을 지원한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체의 상기 항원 또는 항원성 에피토프는 전형적으로 치료될 환자의 후천 면역 반응을 유도하거나 지원하고, 그리고 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체의 상기 TLR 펩타이드 작용제는 선천 면역 반응을 유도하거나 지원할 수 있다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신은 또한 본 발명 약학 조성물에 대해 후술 정의된 약학적으로 허용가능한 운반체(carrier), 보조제 및/또는 매개체(vehicle)를 포함할 수 있다. 본 발명 조성물의 특정한 내용에서, 특히 본 발명 백신에서, 약학적으로 허용가능한 운반체의 상기 선택은 본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,이 투여되는 방식에 의해 원칙적으로 정해진다. 본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신은 예를 들면, 전신적으로(systemically) 또는 국소적으로(locally), 투여될 수 있다. 전신 투여(systemic administration)를 위한 경로는 일반적으로, 예를 들면, 경피(transdermal), 경구(oral), 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 동맥내(intraarterial), 진피내(intradermal) 및 복강내(intraperitoneal) 주사를 포함하는 비경구(parenteral) 경로 및/또는 비강내(intranasal) 주입 경로를 포함한다. 국소 투여(local administration)를 위한 경로는 일반적으로, 예를 들면, 국소 투여(topical administration)경로를 포함하나 그러나 또한 진피내, 경피, 피하, 또는 근육내 주사 또는 병변내(intralesional), 두개내(intracranial), 폐내(intrapulmonal), 심장내(intracardial), 결절내(intranodal) 및 설하(sublingual) 주사를 포함한다. 더 바람직하게는, 발명 조성물, 특히 상기 백신은 진피내, 피하, 결절내 또는 근육내 경로로 투여될 수 있다. 보다 더 바람직하게는, 본 발명 조성물, 특히 상기 백신은 피하, 결절내 또는 근육내 경로로 투여될 수 있다. 특히 바람직하게는, 본 발명 조성물, 특히 상기 백신은 피하 또는 결절내 경로로 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명 조성물, 특히 상기 백신은 피하 경로로 투여될 수 있다. 발명 조성물, 특히 본 발명 백신은 그리하여 바람직하게는 액상(또는 때로는 고체상) 형태로 제조된다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신의 상기 적합한 투여량은 동물 모델을 사용한 상용 실험(routine experiments)에 의해 결정될 수 있다. 이러한 모델은, 어떠한 제한도 내포함이 없이, 토끼, 양, 마우스, 쥐(rat), 개 및 인간외 영장류 모델을 포함한다. 주사에 바람직한 단위 용량 제형(unit dose form)은 멸균수, 생리식염수 또는 그들의 혼합물을 포함한다. 이러한 용액의 pH는 약 7.4로 조정되어야 한다. 주사에 적합한 운반체는 하이드로겔, 조절된 또는 지연된 방출을 위한 기구(device), 폴리젖산(polylactic acid) 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 적용에 적합한 약학적으로 허용 가능한 운반체는 로션, 크림, 젤 및 그와 유사한 것들에의 사용에 적합한 것들을 포함한다. 만일 본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신,이 경구투여되는 경우, 정제(tablet), 캡슐(capsule) 및 그와 유사한 것들이 바람직한 단위 용량 제형이다. 경구 투여에 사용될 수 있는 단위 용량 제형의 제조를 위한 상기 약학적으로 허용 가능한 운반체는 상기 선행 기술에 의하여 잘 알려져 있다. 이의 선택은 예를 들면 맛, 비용 및 저장성과 같은 부수적 고려사항(secondary considerations)에 의존할 것이고, 이는 본 발명의 상기 목적에 결정적이지 않고, 그리고 당해 분야의 기술자에 의해 어려움 없이 만들어질 수 있다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신은 그의 면역원성을 더 증가시키기 위하여 한 개 또는 이상의 보조 물질(auxiliary substance)을 더욱 포함할 수 있다. 선택적으로 상기 기술된 본 발명 백신에 포함될 수 있는, 상기 기술된 본 발명 복합체 및 보조 물질의 상승 작용(synergistic action)은 바람직하게는 그렇게 함으로써 달성된다. 보조 물질의 다양한 유형에 따라서, 다양한 기전들이 이 점에 있어서 고려 대상이 된다. 예를 들면, 수지상 세포(DCs)의 상기 성숙을 허용하는 화합물, 예를 들면 지질폴리사카라이드, TNF-알파 또는 CD40 리간드는 적합한 보조 물질의 첫 번째 클래스를 형성한다. 일반적으로, "위험 신호"(danger signal)(LPS, GP96, 등등) 또는 사이토킨, 예를 들어 GM-CSF 같은 것의 방식으로 면역 시스템에 영향을 미치는 임의의 제제를 보조 물질로 사용하는 것이 가능하고, 이는 본 발명에 따른 상기 면역-자극 보조제에 의해 생성되는 면역 반응이 목적하는 방식으로 향상되거나 및/또는 영향받는 것을 허용한다. 특히 바람직한 보조 물질은 사이토킨, 예를 들어 모노킨(monokines), 림포킨(lymphokines), 인터루킨(interleukins) 또는 케모킨(chemokines)이고, 이는 예를 들어 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타 또는 TNF-알파, 예를 들어 hGH 같은 성장 인자(growth factor)이고 선천 면역 반응을 더욱 촉진한다.
본 발명 백신에 함유될 수 있는 부가 첨가제(additives)는 유화제(emulsifiers), 예를 들면, 트윈(Tween®) 같은; 습윤제(wetting agents), 예를 들면, 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate) 같은; 색소(colouring agents); 맛-부여제(taste-imparting agents), 약학적 운반체; 정제-형성제(tablet-forming agents); 안정화제(stabilizers); 항산화제(antioxidants); 보존제(preservatives)이다.
본 발명 조성물, 특히 본 발명 백신은 또한 추가적으로 임의의 부가 화합물을 포함할 수 있고, 이는 그의 인간 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10에 대한 (리간드로서) 그의 결합 친화성으로 인하거나, 또는 쥣과(murine) 톨-유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13에 대한 (리간드로서) 그의 결합 친화성으로 인하여 면역-촉진성인 것으로 알려져 있다.
발명 조성물, 특히 발명 백신에 추가될 수 있는 성분의 또 다른 클래스는 CpG 핵산, 특히 CpG-RNA 또는 CpG-DNA일 수 있다. CpG-RNA 또는 CpG-DNA는 단일-가닥 CpG-DNA (ss CpG-DNA), 이중-가닥 CpG-DNA (dsDNA), 단일-가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA) 또는 이중-가닥 CpG-RNA (ds CpG-RNA)일 수 있다. 상기 CpG 핵산은 바람직하게는 CpG-RNA의 형태, 더 바람직하게는 단일-가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA)의 형태일 수 있다. 상기 CpG 핵산은 바람직하게는 적어도 하나의 또는 이상의 (유사분열촉진(mitogenic)) 시토신/구아닌 디뉴클레오타이드 (cytosine/guanine dinucleotide) 서열(들) (CpG 모티브(들))을 포함한다. 첫 번째 바람직한 변형예에 따르면, 이들 서열에 포함된 적어도 하나의 CpG 모티브, 특히 상기 CpG 모티브의 상기 C (시토신) 및 상기 G (구아닌)는 비메틸화되어 있다. 이들 서열에 포함된 모든 부가적인 시토신 또는 구아닌은 선택적으로 메틸화되거나 또는 비메틸화될 수 있다. 부가적인 바람직한 변형예에 따르면, 하지만, 상기 CpG 모티브의 상기 C (시토신) 및 상기 G (구아닌)은 또한 메틸화된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물, 특히 상기 기술된 백신 조성물, 및 결장직장암을 앓고 있는 대상체, 바람직하게는 포유류 대상체, 및 가장 바람직하게는 인간 대상체를 치료하기 위한 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 복합체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체가 탑재된 적어도 하나의 세포, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 비히클, 또는 임의의 부형제(excipient), 완충제, 안정화제 또는 당해 분야 통상의 기술자에게 잘 알려진 다른 물질을 포함하는, 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 (사용하기 위한) 약학 조성물, 특히 본 명세서에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 복합체 또는 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체가 탑재된 적어도 하나의 세포 및 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
부가 성분으로서, 본 발명 약학 조성물은 특히 약학적으로 허용가능한 운반체 및/또는 매개체를 포함할 수 있다. 본 발명의 면에서, 약학적으로 허용가능한 운반체는 전형적으로 본 발명 약학 조성물의 상기 액상 또는 비-액상 기초(basis)를 포함한다. 만일 본 발명 약학 조성물이 액상 형태로 제공되는 경우, 상기 운반체는 전형적으로 발열원-비포함(pyrogen-free) 물; 등장성(isotonic) 식염수 또는 완충(수성) (buffered(aqueous)) 용액, 즉 인산, 시트레이트 등, 완충 용액을 포함한다. 특히 본 발명 발명 약학 조성물의 주사를 위해, 물 또는 바람직하게는 완충액, 더 바람직하게는 수성 완충액이 사용될 수 있고, 나트륨염, 바람직하게는 최소한 30 mM 나트륨염, 칼슘염, 바람직하게는 최소한 0.05 mM 칼슘염, 및 선택적으로 칼륨염, 바람직하게는 최소한 1 mM 칼륨염을 포함한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 나트륨염, 칼슘염 및, 선택적으로, 칼륨염은 그의 할로겐화물(halogenides), 일례로 염화물(chlorides), 요오드화물(iodides), 또는 브롬화물(bromides)의 형태로, 그의 수산화물(hydroxides), 탄산염(carbonates), 탄산수소염(hydrogen carbonates), 또는 황산염(sulfates), 등의 형태로 존재한다. 그것에 제한됨 없이, 나트륨염의 예는 일례로 염화나트륨(NaCl), 요오드화나트륨(NaI), 브로민화나트륨(NaBr), 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 황산나트륨(Na2SO4)를 포함하고, 상기 선택적인 칼륨염의 예는 일례로 염화칼륨(KCl), 요오드화칼륨(KI), 브로민화칼륨(KBr), 탄산칼륨(K2CO3), 탄산수소칼륨(KHCO3), 황산칼륨(K2SO4)를 포함하고, 그리고 칼슘염의 예는 일례로 염화칼슘(CaCl2), 요오드화칼슘(CaI2), 브로민화칼슘(CaBr2), 탄산칼슘(CaCO3), 황산칼슘(CaSO4), 수산화칼슘(Ca(OH)2 )을 포함한다. 뿐만 아니라, 상기 앞서 언급된 양이온의 유기 음이온(organic anion)은 상기 완충액에 포함될 수 있다. 더 바람직한 구현예에 따르면, 상기 정의된 주사 목적에 적합한 상기 완충액은, 염화나트륨(NaCl), 염화칼슘(CaCl2) 및 선택적으로 염화칼륨(KCl)로부터 선택된 염을 포함할 수 있고, 여기서 부가적 음이온이 상기 염화물에 추가적으로 존재할 수 있다. 염화칼슘은 또한 염화칼륨과 같은 다른 염에 의해 교체될 수 있다. 전형적으로, 상기 주사 완충액 내 상기 염은 최소한 30 mM 염화나트륨, 최소한 1 mM 염화칼륨 및 최소한 0,05 mM 염화칼슘의 농도로 존재할 수 있다. 상기 주사 완충액은 상기 특정한 기준 배지(reference medium)에 대해 고장성(hypertonic), 등장성 또는 저장성(hypotonic)일 수 있고, 즉 상기 완충액은 상기 특정한 기준 배지에 대해 더 높은, 같은 또는 더 낮은 염 함량을 가질 수 있고, 여기서 바람직하게는 상기 언급된 염의 이러한 농도는, 삼투압 또는 다른 농도 효과로 인한 손상으로 유도하지 않는다. 기준 배지는 일례로 "생체내" 방법으로 발생하는 액체, 예를 들어 혈액, 림프, 세포액(cytosolic liquids), 또는 다른 체액(body liquids), 또는 일례로, "생체외" 방법에서 기준 배지로 사용될 수 있는 액체, 예를 들어 일반 완충액 또는 액체이다. 이러한 일반 완충액 또는 액체는 기술자에게 알려져 있다. 식염수 (0.9% NaCl) 및 링게르-젖산 용액(Ringer-Lactate solution)은 액체 기초로서 특히 바람직하다.
바람직하게는 (약학) 조성물은, 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체를 포함하고, L-아르기닌과 같은 아르기닌을 추가로 포함한다.
하지만, 한 개 또는 이상의 호환 가능한 고체상 또는 액체상 충전제(fillers) 또는 희석제(diluents) 또는 피막형성 성분(encapsulating compounds)은 본 발명 약학 조성물에 잘 사용될 수 있고, 이는 치료될 대상자에의 투여에 적합하다. 본 명세서에 사용된 용어 "호환 가능한"(compatible)은 본 발명 약학 조성물의 이들 성분이 전형적인 사용 조건에서 본 발명 약학 조성물의 상기 약학적 효과를 실질적으로 감소시킬 수 있는 작용이 없는 이러한 방식으로 상기 정의된 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체와 혼합될 수 있는 능력이 있다는 것을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 운반체, 충전체 및 희석제는, 당연히, 치료될 대상에게 투여하기 적합하게 만들기 위해 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야만 한다. 약학적으로 허용 가능한 운반체, 충전체 또는 이의 성분으로 사용될 수 있는 화합물의 몇몇 예는 당(sugar), 예를 들면, 유당(lactose), 포도당(glucose) 및 자당(sucrose) 같은; 전분, 예를 들면, 옥수수 전분 또는 감자 전분 같은; 셀룰로오즈 및 그의 유도체, 예를 들면, 소듐 카르복시메틸셀룰로오즈(sodium carboxymethylcellulose), 에틸셀룰로오즈(ethylcellulose), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate) 같은; 트라가캔스 분말(powdered tragacanth); 맥아(malt); 젤라틴(gelatin); 우지(tallow); 고체 활택제(solid glidants), 예를 들면, 스테아르산(stearic acid), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate) 같은; 황산칼슘(calcium sulfate); 식물성 기름, 예를 들면, 땅콩기름(groundnut oil), 면화씨유(cottonseed oil), 참기름(sesame oil), 올리브유(olive oil), 옥수수유(corn oil) 및 카카오에서 얻은 기름(oil from Theobroma)과 같은; 폴리올, 예를 들면, 폴리프로필렌 글리콜(polypropylene glycol), 글리세롤(glycerol), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol) 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol); 알긴산(alginic acid)이다.
본 발명 약학 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 스프레이에 의해, 국소적으로, 직장으로, 코로, 입으로(buccally), 질로(vaginally) 또는 이식된 저장소(reservoir)를 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 비경구(parenteral)는 피하, 정맥내, 근육내, 관절-내(intra-articular), 윤활막-내(intra-synovial), 흉골내(intrasternal), 척추강내(intrathecal), 간내(intrahepatic), 병변내, 두개내, 경피, 진피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 결절내 및 설하 주사 또는 융합 기술을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명 약학 조성물은 진피내로, 근육내로, 결절내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 더 바람직하게는 본 발명 약학 조성물은 근육내로, 결절내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 보다 더 바람직하게는 본 발명 약학 조성물은 결절내로 또는 피하로 투여될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명 약학 조성물은 피하로 투여될 수 있다. 또한, 특히 바람직하게는, 진보적인 약학적 조성물은 피하로 또는 피부 내(intradermally)로 투여될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명 약학 조성물은 비경구 주사, 더 바람직하게는 피하, 정맥내, 근육내, 관절-내, 윤활막-내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내, 두개내, 경피, 진피내, 폐내, 복강내, 심장내, 동맥내, 결절내 및 설하 주사 또는 융합 기술에 의해 투여될 수 있다. 본 발명 약학 조성물의 멸균 주사 제형은 수성 또는 유성(oleaginous) 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 당해 분야에 알려진 기술에 따라서 적합한 분산 또는 습윤제를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 멸균 주사 제제는 또한 비-독성 비경구적-허용 가능한 희석제 또는 용매 내 멸균 주사 용액 또는 현탁액, 예를 들면 1,3-부타네디올(1.3-butanediol) 내 용액과 같은 것 일 수 있다. 상기 허용 가능한 매개체 및 용매 중에 채용될 수 있는 것은 물, 링레스즈 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 추가적으로, 멸균, 고정유(fixed oils)가 전통적으로 용매 또는 현탁 배지로 채용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함하는 임의의 혼합 고정유(blended fixed oil)가 채용될 수 있다. 지방산, 예를 들어 올레익산 및 그의 글리세라이드 유도체는 천연 약학적으로-허용 가능한 오일, 예를 들어 올리브유 또는 피마자유, 특별히 그들의 폴리에틸화된 버전과 마찬가지로, 주사에 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장-사슬 알코올(long-chain alcohol) 희석제 또는 분산제(dispersant), 예를 들어 에멀전 또는 현탁액을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 투여 제형(dosage form)의 제조에 보통 사용되는 카르복시메틸 셀룰로오즈 또는 유사한 분산제를 포함한다. 다른 보통 사용되는 계면활성제, 예를 들어 트윈(Tweens), 스판(Spans) 및 약학적으로 허용 가능한 고체, 액체, 또는 다른 투여 제형의 제조에 보통 사용되는 다른 유화제 또는 생체이용률 향상제(bioavailability enhancers) 또한 본 발명 약학 조성물의 제조의 목적에 사용될 수 있다.
정맥, 피부 또는 피하 주사, 또는 병 환부에 주사를 위해, 활성 성분은 바람직하게는 발열원-비포함하고 적합한 pH를 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수성 용액의 제형일 것이다. 당해 분야 관련 기술자는, 예를 들면, 소듐 클로라이즈 인젝션(Sodium Chloride Injection), 링게르즈 인젝션(Ringer's Injection), 락테이티드 링게르즈 인젝션(Lactated Ringer's Injection) 같은 등장성 매개체를 사용하여 적합한 용액을 잘 준비할 수 있다. 보존제, 안정화제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가, 필요한 대로, 함유될 수 있다. 개인에게 공급되는 것이 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 핵산 분자, 다른 약학적으로 유용한 화합물임에 관계없이, 투여는 바람직하게는 "예방적으로 유효량" 또는 "치료적으로 유효량"이고 (상황에 따라), 이는 상기 개인에게 도움되기 충분하게 된다. 투여되는 상기 실제 용량, 및 투여 속도 및 시간-경로는, 치료되어야 하는 것의 상기 속성 및 심각성에 따라 달라진다.
상기 정의된 본 발명 약학 조성물은 또한, 이에 제한되지는 않지만, 캡슐, 정제, 수상 현탁액 또는 용액을 포함하는 임의의 경구적으로 허용 가능한 투여 제형으로 경구 투여될 수 있다. 경구 사용을 위한 정제의 경우에는, 보통 사용되는 운반체는 유당 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제(lubricating agents), 예를 들어 스테아린산 마그네슘,도 또한 전형적으로 추가된다. 캡슐 제형 내 경구 투여를 위하여, 유용한 희석제는 유당 및 건조 옥수수전분을 포함한다. 수상 현탁액이 경구 사용에 요구되는 경우, 상기 활성 성분, 즉 상기 정의된 본 발명 전달체 카르고 접합체(transporter cargo conjugate) 분자는 유화제 또는 현탁화제와 조합된다. 원하는 경우, 일정한 감미제, 향료 또는 색소가 또한 추가될 수 있다.
본 발명 약학 조성물은 또한, 특히 상기 치료의 표적이 국소 적용에 의해 손쉽게 도달할 수 있는 영역 또는 기관을 포함하는 경우, 일례로 상기 피부 또는 임의의 다른 도달 가능한 상피 조직의 질병을 포함하는, 국소적으로 투여될 수 있다. 적합한 국소 제형은 이들 영역 또는 기관 각각을 위해 손쉽게 준비된다. 국소 적용을 위해, 본 발명 약학 조성물은 적합한 연고, 본 발명 면역촉진 조성물, 특히 상기 정의된 그의 성분을 포함하고, 한 개 또는 이상의 운반체에 현탁되거나 용해된,로 제조될 수 있다. 국소 투여를 위한 운반체는, 이에 제한되지 않지만, 미네랄 오일(mineral oil), 액상 바세린(liquid petrolatum), 백색 바세린(white petrolatum), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 폴리옥시프로필렌(polyoxypropylene) 화합물, 에멀시파일 왁스(emulsifying wax) 및 물을 포함한다. 대안적으로, 본 발명 약학 조성물은 적합한 로션 또는 크림으로 제조될 수 있다. 본 발명의 면에서, 적합한 운반체는, 이에 제한되지 않지만, 미네랄 오일, 솔비탄 모노스테아레이트(sorbitan monostearate), 폴리솔베이트 60(polysorbate 60), 세틸 에스테르 왁스(cetyl esters wax), 세틸 알코올(cetearyl alcohol), 2-옥틸도데카놀(2-octyldodecanol), 벤질 알코올(benzyl alcohol) 및 물을 포함한다.
이와 관련해서, 상술한 약학 조성물을 사용하는 경우 치료의 처방, 일례로 투여량 결정 등은 전형적으로 일반의(general practitioners) 및 다른 의사의 책임하에 있고, 그리고 전형적으로 치료될 질환, 개별 환자의 상태, 전달의 위치, 투여의 방법 및 진료의에게 알려진 다른 인자들을 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜의 예는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다.
그에 따라서, 본 발명 약학 조성물은 전형적으로 본 발명 조성물의 상기 성분의, 특히 상기 정의된 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체 및/또는 상술한 복합체가 탑재된 세포의, "안전한 유효량"을 포함한다. 본 명세서에 사용된, "안전한 유효량"(safe and effective amount)은 질병 또는 질환의 긍정적인 변화를 유의적으로 유도하기에 충분한 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체의 양, 즉, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체 또는 상술한 복합체가 탑재된 세포의 양으로, 찾고자 하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간 내에서 상기 생물학적 또는 약용 반응을 유발한다. 유효량은 치료되는 상기 질병 또는 상태의 증상의 경감을 위한 "치료적 유효량"(therapeutically effective amount) 및/또는 예방되는 상기 질병 또는 상태의 증상의 예방을 위한 "예방적 유효량"(prophylactically effective amount)이 될 수 있다. 상기 용어는 또한 상기 질병의 진행을 감소시키기에, 뚜렷이 상기 종양 성장 또는 감염을 감소 또는 저해하고 그렇게 함으로써 찾고자 하는 상기 반응을 유발하기에, 충분한 활성 복합체의 양을 포함하고, 특히 이러한 반응은 상기 복합체에 포함되는 상기 항원 또는 항원성 에피토프에 대한 면역반응일 수 있다(즉 "저해적 유효량"(inhibition effective amount)). 이와 동시에, 하지만, "안전한 유효량"은 심각한 부작용을 피하기에 충분히 적고, 다시 말해서 이점과 위험 사이에서 합리적인 관계를 허용한다. 이들 제한에 대한 결정은 전형적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 있다. 본 발명 약학 조성물의 상기 성분, 특히 상기 정의된 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체의, "안전한 유효량"은 뿐만 아니라 치료되는 구체적인 상태와 또한 치료되는 환자의 나이 및 신체 상태, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식단, 투여의 시간, 배출의 속도, 약물 조합, 상기 정의된 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체의 상기 특정 성분 a), b), 및 c)의 활성, 상태의 심각성, 투여의 기간, 수행하는 요법의 속성, 사용된 상기 구체적인 약학적으로 허용 가능한 운반체, 및 유사 인자들과 관련하여, 상기 수행하는 의사의 지식 및 경험 내에서, 다르다. 본 발명 약학 조성물은 의료는 물론 수의학 목적, 바람직하는 의료 목적,으로 일반적으로 약학 조성물로 또는 백신으로 사용될 수 있다.
약학 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 본 발명에 따른 제형은 본 명세서에 기술된 임의의 제형 내에 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체를 포함할 수 있는 약학 제형처럼 투여될 수 있다.
본 발명의 면에서 사용된 용어 "약학 제형"(pharmaceutical formulation) 및 "약학 조성물"(pharmaceutical composition)은 특히 상기 활성 성분(들)의 생물학적 활성을 명백히 유효하게 허용하는 이러한 제형이고 상기 상술한 제형이 투여되는 대상에게 유독할 수 있는 추가 성분을 포함하지 않는 제제를 나타낸다.
본 발명의 면에서, 치료의 "효능"(efficacy)은 본 발명에 따른 용도 또는 방법에 대응한 질병 동안의 변화에 기초하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 암의 치료의 효능은 종양 부피의 감소, 및/또는 무진행 생존 시간(progression free survival time) 의 증가, 및/또는 원발암(primary cancer) 절제후 재발의 감소된 위험으로 측정될 수 있다. 더 특별히 면역요법으로 치료되는 암을 위하여, 효능의 평가는 신규한 면역-관련 반응 기준(immune-related response criteria, irRC)를 통해 면역요법제에 대한 항암 반응의 임상 경향의 스펙트럼에 의할 수 있고, 이는 고형암 내 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST) 및 세계보건기구(World Health Organization, WHO) 기준으로부터 차용되었다(J. Natl . Cancer Inst . 2010, 102(18): 1388 -1397). 감염병의 예방의 효능은 궁극적으로 인구 집단 내 역학 연구들에 의해 평가되고, 이는 흔히 혈청 내 중화항체의 적정량, 및 다기능성 병원체 특이적 T 세포 반응의 유도와 상호관련된다. 전임상 평가는 감염성 병원체 접종 후 감염에 대한 저항성을 포함할 수 있다. 감염병의 치료는 상기 병원체의 성장의 억제 또는 상기 병원체의 제거(및, 따라서, 상기 병원체의 감지 결여), 병원체 특이적 항체 및/또는 T 세포 면역 반응과 상호 관련되는 것에 의해 측정될 수 있다.
약학 조성물, 특히 백신 조성물, 또는 본 발명에 따른 제형은 또한 본 명세서에 기술된 임의의 제형 내에 본 발명에 따른 복합체가 탑재된 항원 제시 세포를 포함할 수 있는 약학 제형처럼 투여될 수 있다.
상기 백신 및/또는 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 조성물은 또한 약학 조성물 및 그의 단위 용량(unit dosage)으로, 특히 전통적으로 채용되는 보조제, 면역조절 물질, 운반체, 상기 또는 하기 기술된 희석제 또는 부형제와 함께, 제조될 수 있고, 그리고 이러한 제형 내에서 고체, 예를 들어 정제 또는 충진된 캡슐, 또는 예를 들어 용액, 현탁액, 유화액, 엘릭시르(elixirs) 같은 액체, 또는 동일한 것으로 충전된 캡슐, 모든 경구용제, 또는 주사 또는 지속 주입법(continuous infusion)에 의한 비경구용(피하 및 진피내 포함)을 위한 멸균 주사 용액의 형태로 채용될 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 특히 본 발명에 따른 약학 조성물 및 백신의 면에서, 주사가능 조성물은 전형적으로 주사가능 멸균 식염수 또는 인산-완충 식염수 또는 당해 분야에서 알려진 다른 주사가능 운반체에 기초한다. 이러한 약학 조성물 및 그 단위 용량 제형은 전통적인 비율로, 추가적인 활성 성분 또는 이론과 함께 또는 없이, 그리고 이러한 단위 용량 제형은 상기 채용되는 의도된 일일 용량 범위에 상응하는 활성 성분의 임의의 적합한 유효량을 포함할 수 있다.
본 발명의 문맥에서 적합한 보조제 및/또는 면역조절 물질의 예는 MPL® (Corixa), 알루미늄 화합물을 함유하는 알루미늄-기반 무기질(일반적으로 알럼(Allum)이라 불림), ASO1-4, MF59, 칼슘포스페이트(CalciumPhosphate), 리포솜(Liposomes), 이소콤(Iscom), 폴리이노시닉:폴리시티딜릭 산(polyinosinic:polycytidylic acid., polyIC), 그의 안정화형 poly-ICLC (힐토놀(Hiltonol))을 포함하는, CpG 올리고디옥시뉴클레오타이드, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF), 지질폴리사카라이드 (LPS), 몬타나이드(Montanide), 폴리락티드 co-글리콜라이드(polylactide co-glycolide, PLG), 플라겔린(Flagellin), 킬라하(Soap Bark) 나무 사포닌(QS21), 아미노 알킬 글루코사마이드(amino alkyl glucosamide compounds) (일례로 RC529), 합성 올리고디옥시뉴클레오타이드를 갖는 두 개 성분 항박테리아 펩타이드(일례로 IC31), 이미퀴모드(Imiquimod), 레시퀴모드(Resiquimod), 면역자극 서열(Immunostimulatory sequences, ISS), 모노포스포릴 지질 A (monophosphoryl lipid A, MPLA), 섬유아세포-자극 지질펩타이드 (Fibroblast-stimulating lipopeptide, FSL1), 및 항-CD40 항체를 포함한다.
본 발명에 따라 (사용하기 위한) 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신은, 이제 제한되지 않지만, 수성 또는 유성 현탁액, 용액, 유화액, 시럽, 및 엘릭시르를 포함하는 액체 제형일 수 있다. 상기 조성물은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 매개체로 복원하기 위한 건조 제품으로 제조될 수 있다. 이러한 액상 제제는, 이에 제한되지 않지만, 현탁화제, 유화제, 비-수성 매개체 또는 보존제를 포함하는 첨가제를 포함할 수 있다. 현탁화제는, 이에 제한되지 않지만, 솔비톨 시럽(sorbitol syrup), 메틸 셀룰로오즈(methyl cellulose), 포도당/당 시럽(glucose/sugar syrup), 젤라틴(gelatin), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxymethyl cellulose), 알루미늄 스테아레이트 젤(aluminum stearate gel), 및 수소화된 식용 지방(hydrogenated edible fats)을 포함한다. 유화제는, 이에 제한되지 않지만, 레시틴(lecithin), 솔비탄 모노올레이트(sorbitan monooleate), 및 아카시아(acacia)를 포함한다. 보존제는, 이에 제한되지 않지만, 메틸(methyl) 또는 프로필(propyl) 파라-하리드록시벤조에이트(p-hydroxybenzoate) 및 솔빅산(sorbic acid)을 포함한다. 분산제 또는 습윤제는 이에 제한되지 않지만 폴리(에틸렌 글리콜(poly(ethylene glycol)), 글리세롤, 우태아혈청(bovine serum albumin), 트윈(Tween®), 스판(Span®)을 포함한다.
본 발명에 따라 (사용하기 위한) 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신은 또한 저장 제제로 제조될 수 있고, 이는 이식에 의해 또는 근육내 주사를 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 (사용하기 위한) 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신은 또한 고형 조성물일 수 있고, 이는 전통적인 방식으로 제조된 정제 또는 함당정제(lozenge)의 제형일 수 있다. 예를 들면, 경구 투여를 위한 정제 또는 캡슐은, 이에 제한되지 않지만, 결합제(binding agent), 충전제, 윤활제(lubricants), 붕괴제(disintegrants) 및 습윤제를 포함하는 전통적인 부형제를 포함할 수 있다. 결합제는, 이에 제한되지 않지만, 시럽, 아카시아(acacia), 젤라틴, 솔비톨, 트라가캔스, 전분의 점액(mucilage) 및 폴리비닐피롤리딘(polyvinylpyrrolidone)을 포함한다. 충전제는, 이에 제한되지 않지만, 유당, 당, 미정질(microcrystalline) 셀룰로오즈, 옥수수전분(maizestarch), 인산칼슘(calcium phosphate), 및 솔비톨을 포함한다. 윤활제는, 이에 제한되지 않지만, 스테아린산 마그네슘, 스테아르산, 탈크(talc), 폴리에틸렌 글리콜, 및 실리카를 포함한다. 붕괴제는, 이에 제한되지 않지만, 감자 전분 및 소듐 스타치 글리콜레이트(sodium starch glycollate)를 포함한다. 습윤제는, 이에 제한되지 않지만, 소듐 라우릴 설페이트를 포함한다. 정제는 당해 분야에서 잘 알려진 방법에 따라 코팅될 수 있다.
본 발명에 따라 (사용하기 위한) 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신은 또한 지효성(sustained release) 제형으로 또는 지효성 약물 전달 시스템으로부터 투여될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신은 반복 투여에 의한 전달을 위해 적용될 수 있다.
본 발명에 따라 (사용하기 위한), 조성물, 특히 약학 조성물 및 백신의 측맥에서, 또는 이의 제제(preparation)의 측면에서 유용한, 추가의 물질 뿐만 아니라 제형 가공 기술 및 그 유사한 것은 "Part 5 of Remington's "The Science and Practice of Pharmacy", 22nd Edition, 2012, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins"에 정리되어 있다.
부가적 관점에서, 본 발명은 또한 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 키트 오브 파트(kit-of-parts)와 관련되는데, 상기 키트 오브 파트는 다음 중 적어도 하나를 포함한다:
(i) 상기 기술된 복합체,
(ii) 상기 기술된 핵산,
(iii) 상기 기술된 벡터,
(iv) 상기 기술된 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 복합체가 탑재된 세포.
특히, 본 발명에 따른 상기 키트 오브 파트는 또한 상기 상술한 성분 (i) 내지 (v) 중 한 개 초과를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 상기 키트 오브 파트는 (i)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 복합체, (ii)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 핵산, (iii)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 벡터, (iv)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 숙주 세포, 및/또는 (v)에 속하는 최소한 두 개의 상이한 세포를 포함할 수 있고; 일례로, 본 발명의 상기 키트 오브 파트는 최소한 두 개의 상이한 복합체 (i) 및/또는 최소한 두 개의 상이한 핵산 (ii)를 포함할 수 있다.
예를 들면, 상기 기술된 상기 키트 오브 파트에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)는 성분 a)에서, 즉 세포 투과 펩타이드에서, 성분 b)에서, 즉 항원 또는 항원성 에피토프에서 또는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프의 서브셋에서, 또는 성분 c)에서, 즉 상기 TLR 펩타이드 작용제에서 또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제의 세브셋에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 키트 오브 파트에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 키트 오브 파트에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 세 개 모두에서 상이할 수 있다. 그에 따라서, 상기 기술된 상기 키트 오브 파트에 포함되는 상기 상이한 핵산 (ii)는 그들이 이러한 상이한 복합체를 암호화하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 키트 오브 파트에 포함되는 상기 상이한 벡터 (iii)은 그들이 이러한 상이한 핵산을 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 키트 오브 파트에 포함되는 상기 상이한 숙주 세포 (iv)는 그들이 이러한 상이한 벡터를 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 키트 오브 파트에 포함되는 복합체가 탑재된 상기 상이한 세포 (v)는 그들이 이러한 상이한 복합체가 탑재되는 것에서 상이할 수 있다.
상기 키트 오브 파트의 상기 다양한 성분은 한 개 또는 이상의 용기에 포장될 수 있다. 상술한 성분은 동결건조되거나 또는 건조 제형 또는 적합한 완충액에 용해되어 제공될 수 있다. 상기 키트는 또한 추가적인 시약, 사례를 들면, 보존제, 배양 배지, 및/또는 상기 언급된 성분의 복원 및/또는 저장을 위한 완충액, 세척액, 및 그와 유사한 것을 포함한다. 추가적으로, 본 발명에 따른 상기 키트 오브 파트는 선택적으로 사용 설명서를 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명은 또한 결장직장암을 치료, 예방 및/또는 안정화하기 위한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 약학 조성물 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 백신 및 상술한 약학 조성물 또는 상술한 백신의 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 지시서(instructions)를 포함하는 백신접종 키트를 제공한다.
따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 복합체, 본 명세서에 기술된 세포, 본 명세서에 기술된 조성물, 본 명세서에 기술된 백신, 및/또는 본 명세서에 기술된 약학 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
바람직하게는, 이러한 키트는 본 명세서에 기술된 복합체, 본 명세서에 기술된 세포, 본 명세서에 기술된 조성물, 본 명세서에 기술된 백신, 및/또는 본 명세서에 기술된 약학 조성물의 사용에 의해 결장직장암을 치료하는 지시사항이 담긴 팩키지 인서트(package inert) 또는 설명서 리플릿(leaflet)을 부가적으로 포함한다.
또한 바람직하게는, 상기 기술된 성분들 (i) - (v) 중 어느 하나에 추가하여, 상기 키트는 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제를, 본 명세서에 기술된 바와 같은 사용을 위한 조합의 문맥에 있어서, 본 명세서에 기술된 바와 같이, 포함한다.
본 발명에 따른 용도 및 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체, 및/또는 (ii) 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체가 탑재된, 항원-제시 세포와 같은 세포 중 어느 하나의 결장직장암의 예방, 치료 또는 안정화를 위한 (약제의 제조를 위한) 용도를 제공한다. 이에 따라, 본 발명은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체, 및/또는 (ii) 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체가 탑재된, 항원-제시 세포와 같은 세포 중 어느 하나의 결장직장암의 예방, 치료 또는 안정화를 위한 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체를 제공하고, 이는 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 환경(context) 내에서 상기 항원 제시 세포의 세포 표면에서 이동 및 제시를 허용하여, 백신접종 및/또는 면역요법 용도를 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 결장직장암의 예방, 치료 및 억제 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 임의의 하나를 상술한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
게다가, 본 발명은, 대상에서, CD4+ 도움 T 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포에 의존하는 단일 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체, 및/또는 (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 임의의 하나를 상술한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
CD4+ 및/또는 CD8+ 반응에 의존하는 면역 반응은 염증 반응, 전-염증 사이토카인 반응을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있고, 이는 본 발명의 화합물 투여 이전 수준에 대비 한 개 또는 이상의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 mRNA 또는 단백질의 발현 증가를 포함한다. 이는 또한 본 발명의 화합물 투여 이후 항원-특이적 T 세포의 빈도 또는 절대 수의 증가에 의해 측정될 수 있으며, HLA-펩타이드 멀티머 염색(staining), ELISPOT 분석, 및 지연성 과민반응 시험(delayed type hypersensitivity tests)에 의해 측정될 수 있다. 이는 또한 항원-특이적 T 도움 세포에 의존적인 항원-특이적 혈청 항체의 증가에 의해 간접적으로 측정될 수 있다.
본 발명은 또한, 대상에서, 다중 MHC 클래스 I 분자 및/또는 다중 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 단일 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체, 및/또는 (ii) 본 발명의 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 어느 하나를 상술한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
대상체 중에서, 다중 MHC 클래스 I 분자 및/또는 다중 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법은, 사이토카인 반응을 평가하는 것에 의해 결정될 수 있고, 이는 항원 제시 세포에서 별개의 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 개별 펩타이드로 T 세포의 생체외 자극 이후 본 발명의 화합물 투여 이전 수준 대비 한 개 또는 이상의 IFN-γ, TNF-α 및 IL-2 mRNA 또는 단백질의 발현 증가를 포함한다. 상이한 MHC 분자에 대한 제한은 또한 상이한 MHC 분자를 발현하는 항원 제시 세포를 사용하거나, 또는 MHC 차단 항체(blocking antibodies)를 사용하여 인증될 수 있다. 이는 또한 본 발명의 조성물 투여 이후 항원-특이적 T세포의 빈도 또는 절대 수에 의해 측정될 수 있고, HLA-펩타이드 중합체 염색(multimer staining)에 의해 측정되고, 이는 별개의 MHC 분자와 함께 형성된 중합체를 사용한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 단일 또는 다중 항원 또는 항원성 에피토프에 대한 면역 반응을 유발 또는 향상하는 방법에서, 상기 면역 반응은 종양-연관 항원 또는 종양-특이적 항원의 단일 또는 다중 에피토프, 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같은 에피토프들의 조합에 대한 것이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 상기 면역 반응은 병원체로부터의 항원 단백질의 다중 에피토프를 향한다.
본 명세서 기술된 본 발명에 따른 상기 방법은, 대상에서, MHC 클래스 I 분자 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 단일 또는 다중 에피토프에 대한 면역 반응을 유발하거나 또는 향상하기 위한 것일 수 있다.
특히, 본 발명은 따라서 필요한 대상체 중에서 결장직장암을 예방 및/또는 치료하거나 항-종양-반응을 개시, 증가 또는 지속하기 위한 방법을 제공하고 이는 다음을 포함하는 복합체를 상기 대상에게 투여하는 단계를 포함한다:
세포 투과 펩타이드;
적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
여기서 상기 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합된다.
이러한 방법에서 본 명세서에 기술된 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체, 본 명세서에 기술된 핵산, 본 명세서에 기술된 세포, 본 명세서에 기술된 조성물, 본 명세서에 기술된 백신, 및/또는 본 명세서에 기술된 약학 조성물이 상기 대상체에게 투여되는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 상기 대상체는 결장직장암을 가지거나 및/또는 결장직장암으로 진단되었다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체, 및/또는 (ii) 본 명세서에 기술된 바와 같은 복합체가 탑재된, 항원-제시 세포와 같은 세포 중 임의의 하나의, 결장직장암의 (진단의) 측면에서 영상화 기술을 위한 영상화 조성물의 제조를 위한 용도, 또는 결장직장암의 진단을 위한 진단 조성물("diagnostic compositions")의 제조를 위한 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 결장직장암의 진단을 위한 진단 조성물은 다음으로부터 선택되는 1 이상의 성분을 포함한다:
(i) 상기 기술된 복합체,
(ii) 상기 기술된 핵산,
(iii) 상기 기술된 벡터,
(iv) 상기 기술된 숙주 세포, 및
(v) 상기 기술된 복합체가 탑재된 세포.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 진단 조성물은 상기 기술된 바와 같은 복합체를 포함한다.
특히, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체, 상기 기술된 바와 같은 핵산, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포, 본 발명 조성물, 본 발명의 약학 조성물 또는 본 발명 백신 또는, 가장 바람직하게는, 본 발명 진단 조성물은 진단 도구로서 진단에, 일례로 (생체내(in vivo) 또는 시험관내(in vitro)) 분석에, 일례로 면역분석에, 결장직장암을 감지, 예지, 진단, 또는 관측하기 위하여 사용될 수 있다.
예로서, (시험관내) 분석은 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체, 상기 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포, 본 발명 조성물, 본 발명에 약학 조성물 또는 본 발명 백신 또는, 가장 바람직하게는, 본 발명 진단 조성물을 일례로 배양된 동물 세포, 인간 세포 또는 미생물에서 선택된 표적 세포에 전달하고, 기술자에게 전형적으로 알려진 생물리학 방법에 의해 상기 세포 반응을 관측하여 수행될 수 있다. 여기에 전형적으로 사용되는 상기 표적 세포는 배양된 세포(시험관내), 인간 또는 동물 몸에서 분리된 세포, 예를 들어 인간 또는 동물 몸에서 분리된 혈액 세포, 또는 생체내 세포, 즉, 살아있는 인간 또는 동물의 기관 또는 조직을 구성하는 세포, 또는 살아 있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물이다. 이와 관련해서 특히 바람직한 것은 소위 마커 또는 레이블로 불리우고, 이는 본 발명에 항원-제시 세포 복합체 내에 및, 특히, 본 발명에 따른 진단 조성물 내에 포함될 수 있다.
부가적 측면에 따르면, 본 발명은 대상체에서 결장직장암을 진단하는 방법을 제공하고, 여기서 상술한 방법은 (i) 본 발명의 복합체, (ii) 본 발명의 상기 복합체가 탑재된 세포, 예를 들어 항원-제시 세포, 또는 (iii) (i) 내지 (ii)의 약학 조성물, 중 임의의 하나를 상술한 대상에게 또는 상술한 대상의 샘플에 체외(ex vivo)투여하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 용도 및 방법은 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체의 투여를 포함한다.
게다가, 본 발명에 따른 용도 및 방법은 한 개 초과의 본 발명에 따른 복합체, 세포 또는 약학 조성물의 투여를 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 따른 용도 및 방법에서, 최소한 두 개의 상이한 복합체가 사용되거나 투여되고, 여기서 각 복합체는 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 상술한 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하거나 또는 (만약 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프가 상술한 복합체에 포함된다면) 항원 또는 항원성 에피토프의 상술한 서브셋은 상기 두 복합체 사이에서 상이하다.
예를 들면, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)는 성분 a)에서, 즉 세포 투과 펩타이드에서, 성분 b)에서, 즉 항원 또는 항원성 에피토프에서 또는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프의 상기 서브셋에서, 또는 성분 c)에서, 즉 상기 TLR 펩타이드 작용제에서 또는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제의 세브셋에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 두 개에서 상이할 수 있다; 또는 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 복합체 (i)은 상기 세 개 성분 a), b), 및 c) 중 세 개 모두에서 상이할 수 있다. 그에 따라서, 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 핵산 (ii)는 그들이 이러한 상이한 복합체를 암호화하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 벡터 (iii)은 그들이 이러한 상이한 핵산을 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 상기 상이한 숙주 세포 (iv)는 그들이 이러한 상이한 벡터를 포함하는 것에서 상이할 수 있다; 상기 기술된 상기 조성물에 포함되는 복합체가 탑재된 상기 상이한 세포 (v)는 그들이 이러한 상이한 복합체가 탑재되는 것에서 상이할 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 용도 및 방법에서, 본 발명에 따른 상기 세포는 항원 제시 세포, 특히 수지상 세포, 더 바람직하게는 치료되는 대상으로부터의 수지상 세포일 수 있다.
투여의 방식
본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 상기 기술된 임의의 방식으로 투여될 수 있고, 이는 경구(orally) 또는 직장(rectally)과 같은 장관 내(enterally)로, 정맥내와 같은 비경구적으로, 또는 그들의 조합을 포함한다. 비경구 투여는, 이에 제한되지 않지만, 정맥내, 동맥-내, 복강-내, 피하, 진피내 및 근육내를 포함한다. 바람직하게는 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체; 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물; 및/또는 본 발명 백신은, 경구(oral), 설하(sublingual) 및 직장(rectal)과 같은 장관 투여 경로를 통하여 투여 될 수 있다. 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 또한 바람직하게는 국소적, 종양내(intratumoral), 진피내, 피하내, 근육내, 비강내, 또는 결절내 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 또한 이식의 형태로 투여될 수 있고, 이는 상기 조성물의 지연 방출은 물론 지연 조절 정맥 주입(slow controlled i.v. infusion)을 허용한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 피하적(subcutaneously) 또는 으로 피부내(intradermally)로 투여될 수 있다.
본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여는 다중 연속 주입/투여를 요구할 수 있다. 따라서, 상기 투여는 최소한 두 번, 예를 들면 처음에는 일차 면역접종 주입/투여로 그리고, 이후, 추가 주입/투여로, 반복될 수 있다.
특히, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 반복적 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 최소한 1, 2, 3, 또는 4 주; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 또는 12 개월; 또는 2, 3, 4, 또는 5 년의 기간 동안 반복적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체는 일당 2회, 일당 1화, 2일 마다, 3일 마다, 주당 1회, 2주 마다, 3주 마다, 개월당 1회 또는 2개월 마다 투여될 수 있다. 바람직하게는 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체는 반복적으로, 예를 들어 주당 1회 또는 매 2주당 (1회) 투여될 수 있다.
게다가, 상기 세포 투과 펩타이드, 성분 a), b), 및 c), 즉 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프 및 상기 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 복합체를 구성하고, 필요한 대상에게 투여 직전에 혼합되거나 동시 투여될 수 있는 분리된 조성물에 포함될 수 있다.
한 방식에 따르면, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 상기 기술된 상기 투여 경로, 특히 약학 조성물을 위한 것을 사용하여 환자에게 직접적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 환자에게 체외(ex vivo) 방식을 사용하여 투여될 수 있고, 일례로 상기 정의된 상기 약학 조성물, 상기 백신 또는 본 발명 전달체 카르고 접합체 분자를 세포내로 안내하고, 바람직하게는 자가 세포, 즉 치료되는 상기 환자로부터 유래한 세포, 그리고 이들 세포를 치료되어야 할 상기 환자의 상기 지점내로 이식하고, 선택적으로 치료 전 이들 세포의 후속 저장 및/또는 배양한다.
개인에게, 단일 또는 다중 용량으로, 투여되는 용량은 인자의 다양성에 따라 달라지고, 이는 약물동력학 성질, 대상 상태 및 특성(성별, 나이, 체중, 건강, 크기), 증후군의 정도, 동시 치료, 치료의 빈도 및 희망하는 효과를 포함한다.
전형적으로, 암 치료를 위해, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체의 치료적 유효 용량(therapeutically effective dose)은 주사당 약 0.01 mg 내지 5 mg, 특히 주사당 약 0.1mg 내지 2 mg, 또는 주사당 약 0.01 nmol 내지 1 mmol, 특히 주사당 약 1 nmol 내지 1 mmol, 바람직하게는 주사당 1 μmol 내지 1 mmol 이다.
전형적으로, 암 치료를 위해, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원 제시 세포의 치료적 유효 용량(therapeutically effective dose)은 주사당 약 0.2 백만 세포 내지 2 백만 세포이다.
조합 요법
본 발명에 따른 방법 및 용도에 있어서, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여는, 단독으로 또는 결장직장암의 치료 및/또는 안정화에 유용한 협력제(co-agent)와 조합하여 수행될 수 있다.
사례를 들면, 결장직장암의 치료, 예방 또는 안정화의 경우에, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 상기 약제학적 조성물의 투여는 고형 결장직장 종양에 대한 종래의 화학요법 및 전이 제어를 위해 사용되는 물질 또는 프로그램된 세포 죽음을 초래하는 것에 의해 작용하는 다른 분자, 예를 들어 이에 한정되지는 않지만, Fas Ligand 및 종양 괴사 인자(Tumor Necrosis factor, TNF)-관련 아폽토시스 유도 (TRAIL) 리간드를 포함하는 종양 괴사류 구성원들(Tumor Necrosis Family Members)로부터 선택된 협력제와 조합하여 수행될 수 있다. 부가적 구현예에 따르면, 본 발명에 따른 방법 및 용도에 있어서, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여는 방사선 치료와 병행하여 수행될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 방법 및 용도에 있어서, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 핵산; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체가 탑재된 항원-제시 세포와 같은 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신의 투여를 아우르고, 여기서 치료적으로 효과적인 함량으로, 결장직장암의 치료 및/또는 안정화 및/또는 결장직장암 재발 방지에 유용한 다른 치료적 식이요법 또는 협력제 (예를 들어 다중 약물 식이요법)와 동시에 또는 연속해서 대상에게 투여된다. 상기 협력제와 동시에 투여되는 상술한 복합체, 세포 또는 조성물, 백신 또는 약학 조성물은 동일 또는 상이한 조성물(들)로 그리고 동일 또는 상이한 투여 경로(들)에 의해 투여될 수 있다.
상술한 다른 치료적 식이요법 또는 협력제는 방사선 요법, 화학요법, 수술, 표적요법(소분자, 펩타이드 및 모노클론 항체를 포함) 및 항-혈관신생 요법(anti-angiogenic therapy)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수도 있다. 항-혈관신생요법은 본 명세서에서 종양-연관 맥관구조(vasculature)를 직접적 또는 간접적으로 표적으로 하는 시약의 투여로 정의된다.
이에 따라, 본 발명은 또한, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 다음의 조합을 제공한다:
(i) 본 명세서에서 정의된 바와 같은 복합체; 및
(ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제.
전통적인 화학 요법제는 세포독성(cytotoxic)인데, 즉 그들은 대부분의 암세포의 주요 특성 중 하나인 급속하게 분열하는 세포를 죽임으로써 작용한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체와의 조합을 위하여 바람직한 화학 요법제는 결장직장암의 치료에 관하여 숙련된 기술자에게 알려진 화학 요법제와 같은 것이다. 조합을 위한 바람직한 화학 요법제는 5-플루러유러실(5-FU), 카페시타빈(젤로다®), 이리노테칸(캠프토사르®) 및 옥사리프라틴(엘록사틴®)을 포함한다. 또한 바람직하게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체는 조합된 화학요법과 조합되는데, 이는 바람직하게는 다음으로부터 선택된다: (i) 폴폭스(5-FU, 루코보린 및 옥사리프라틴); (ii) 카페옥스(CapeOx)(카페시타빈 및 옥사리프라틴); (iii) 5-FU 및 루코보린; (iv) 폴폭시리(FOLFOXIRI)(루코보린, 5-FU, 옥사리프라틴, 및 이리노테칸); 및 (v) 폴피리(FOLFIRI)(5-FU, 루코보린, 및 이리노테칸). 번지지 않은(non-spread) 암에서, (i) FOLFOX (5-FU, 루코보린, 및 옥사리프라틴); (ii) CapeOx (카페시타빈 및 옥사리프라틴); 또는 (iii) 5-FU 및 루코보린의 조합이 바람직하다. 번진 암에 대해서, (iv) FOLFOXIRI (루코보린, 5-FU, 옥사리프라틴, 및 이리노테칸); (i) FOLFOX (5-FU, 루코보린, 및 옥사리프라틴); 또는 (v) FOLFIRI (5-FU, 루코보린, 및 이리노테칸)의 조합이 바람직하다.
결장직장암의 치료를 위하여 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체와 조합을 위한 표적 약물은 VEGF-표적 약물 및 EGFR-표적 약물을 포함한다. VEGF-표적 약물의 바람직한 예시는 베바시주맙(아바스틴®), 라무시루맙(사이람자®) 또는 집-아플리버셉트(잘트랩®)을 포함한다. EGFR-표적 약물의 바람직한 예시는 세툭시맙(에르비툭스®), 파니투무맙(벡티빅스®) 또는 레고라페닙(스티바가®)을 포함한다.
결장직장암의 치료를 위하여 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체와 조합을 위한 면역 치료제는 백신, 키메라 항원 수용체(CARs), 체크포인트 조절제 및 종양세포붕괴성(oncolytic) 바이러스 요법을 포함한다.
결장직장암의 치료를 위하여 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체와의 조합을 위한 바람직한 백신은 트로박스(TroVax), 온코박스(OncoVax), IMA910, ETBX-011, 믹오릭스(MicOryx), EP-2101, MKC1106-PP, CDX-1307, V934/V935, MelCancerVac, 임프림(Imprime) PGG, 팡(FANG), 테세모타이드(Tecemotide), 알로스팀(AlloStim), DCVax, GI-6301, AVX701, OCV-C02를 포함한다.
인공 T 세포 수용체(또한 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체, 키메라 항원 수용체(CARs)로도 알려짐)는 면역 수용체 세포 상에 임의의 특이성을 부여하는 조작된 수용체이다. 인공 T 세포 수용체(artificial T cell receptors, CARs)는 입양 세포 전이와 관련하여 선호된다. 이를 위해, T 세포를 환자로부터 제거하고 결장직장암 특이적 수용체를 발현하도록 수정한다. 그 다음 암세포를 인식하고 죽일 수있는 T 세포가 환자에게 재도입된다.
본 명세서에서 사용되는 바에 따라, 용어 "면역 체크포인트 조절제" ("체크포인트 조절제"로서도 언급됨)는 하나 이상의 체크 포인트 분자의 기능을 조절 (예컨대: 전체 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해, 활성화, 자극, 증가, 보강 또는지지)하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 따라서 면역 체크포인트 조절제는 "면역 체크포인트 억제제" ("체크포인트 억제제" 또는 "엑제제"로서도 언급됨) 또는 "면역 체크포인트 활성화제" ("체크포인트 활성화제" 또는 "활성화제"로서도 언급됨)일 수도 있다. "면역 체크포인트 억제제" ("체크포인트 억제제" 또는 "엑제제"로서도 언급됨)는 하나 이상의 체크 포인트 분자의 기능을 전부 또는 부분적으로 감소, 억제, 방해 또는 음성적으로 조절한다. "면역 체크포인트 활성화제" ("체크포인트 활성화제" 또는 "활성화제"로서도 언급됨)는 하나 이상의 체크 포인트 분자의 기능을 전부 또는 부분적으로 활성화, 자극, 증가, 강화,지지 또는 양성적으로 조절한다. 면역 체크포인트 조절제는 전형적으로 (i) 자체 내성 및/또는 (ii) 면역 반응의 진폭 및/또는 지속 기간을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 사용되는 면역 체크포인트 조절제는 하나 이상의 인간 체크 포인트 분자의 기능을 조절하며, 따라서 "인간 체크포인트 억제제"이다.
체크포인트 분자는 단백질과 같은 분자로, 전형적으로 면역 경로에 관여하며, 예를 들어 T-세포 활성화, T-세포 증식 및/또는 T-세포 기능을 조절한다. 따라서 체크포인트 조절제에 의해 조절(예컨대, 전적으로 또는 부분적으로 감소, 억제, 간섭, 활성화, 자극, 증가, 강화 또는 지지)되는 체크포인트 분자의 기능은, 일반적으로 T-세포 활성화 (조절), T-세포 증식 및/또는 T 세포 기능이다. 따라서 면역 체크 포인트 분자는 자체 내성과 생리학적 면역 반응의 기간 및 진폭을 조절하고 유지한다. 면역 체크포인트 분자의 다수가 B7:CD28 패밀리 또는 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 수퍼 패밀리에 속하며, 특정 리간드의 결합에 의해 세포질 도메인에 모집되는 신호 분자를 활성화시킨다(참고문헌: Susumu Suzuki et al., 2016: Current status of immunotherapy. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2016: doi: 10.1093/jjco/hyv201 [Epub ahead of print]; 특히 표 1).
바람직하게는 결장직장암의 치료를 위하여 본 명세서에 정의된 바와 같은 복합체와의 조합을 위한 면역 체크포인트 조절제는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR, ICOS, A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR 및/또는 FasR/DcR3으로부터 선택되는 1 이상의 면역 체크포인트 분자의 활성화제 또는 억제제; 또는 이들의 1 이상의 리간드의 활성화제 또는 억제제이다.
보다 바람직하게, 면역 체크포인트 조절제는 (공-)자극 체크 포인트 분자의 활성제 또는 억제 체크 포인트 분자의 억제제 또는 이들의 조합이다. 이에 따라, 면역 체크포인트 분자는 더 바람직하게는 (i) CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및/또는 ICOS의 활성화제 또는 (ii) A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR 및/또는 FasR/DcR3의 억제제이다.
보다 더 바람직하게, 면역 체크포인트 조절제는 억제 체크 포인트 분자의 억제제(그러나 바람직하게는 자극 체크 포인트 분자의 억제제가 아님)이다. 이에 따라, 면역 체크포인트 분자는 보다 더 바람직하게는 A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR 및/또는 DcR3의 억제제 또는 이의 리간드이다..
또한, 면역 체크포인트 조절제가 자극성 또는 보조자극 체크포인트 분자의 활성화제(그러나 바람직하게는 억제성 체크 포인트 분자의 활성화제가 아님)인 것이 바람직하다. 이에 따라, 면역 체크포인트 분자는 더 바람직하게는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및/또는 ICOS의 활성화제 또는 이의 리간드이다.
면역 체크포인트 조절제가 CD40 경로, IDO 경로, CTLA-4 경로 및/또는 PD-1 경로의 조절제인 것이 보다 더 바람직하다. 특히, 면역 체크포인트 조절제는 바람직하게 CD40, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 및/또는 IDO의 조절제이고, 더 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 및/또는 IDO의 억제제 또는 CD40의 활성화제이고, 보다 더 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1, PD-1 및/또는 IDO의 억제제이고, 그리고 가장 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4 및/또는 PD-1의 억제제이다.
면역 체크포인트 조절제가 CD40 경로, IDO 경로, LAG3 경로, CTLA-4 경로 및/또는 PD-1 경로의 조절제인 것이 더욱 바람직하다. 특히, 면역 체크포인트 조절제는 바람직하게는 CD40, LAG3, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 및/또는 IDO의 조절제이고, 더 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, LAG3, 및/또는 IDO의 억제제 또는 CD40의 활성화제이고, 보다 더 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4, PD-L1, PD-1, LAG3 및/또는 IDO의 억제제이고, 보다 더 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 LAG3, CTLA-4 및/또는 PD-1의 억제제이고, 그리고 가장 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 CTLA-4 및/또는 PD-1의 억제제이다.
따라서, 결장직장암의 치료를 위한 본 명세서에서 정의된 복합체와 조합하기 위한 체크 포인트 조절제는 CD40 경로, CTLA-4 경로 또는 PD-1 경로의 공지된 조절제로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 결장직장암의 치료를 위해 본 명세서에서 정의된 복합체와 조합하기 위한 체크 포인트 조절제는 CD40 경로, LAG3 경로, CTLA-4 경로 또는 PD-1 경로의 공지된 조절제로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직하게는 면역 체크포인트 조절제는 PD-1 엑제제이다. Preferred inhibitors of the CTLA-4 경로 및 PD-1 경로의 바람직한 억제제는 다음을 포함한다: 단일클론 항체들예르보이(Yervoy)®(이필리무맙; 브리스톨 마이어스 스큅) 및 트레멜리무맙(Tremelimumab, 화이자/메드이뮨)뿐만 아니라 옵디보(Opdivo)®(니볼루맙; 브리스톨 마이어스 스큅), 키트루다(Keytruda)®(펨브롤리주맙; 머크), 더발루맙(Durvalumab, 메드이뮨/아스트라제네카), MEDI4736(아스트라제네카; 참고문헌 WO 2011/066389 A1), MPDL3280A(로슈/제넨테크; 참고문헌 US 8,217,149 B2), 피딜리주맙(Pidilizumab, CT-011; 큐어테크(CureTech)), MEDI0680(AMP-514; 아스트라제네카), MSB-0010718C(머크), MIH1(아피매트릭스) 및 람브롤리주맙(Lambrolizumab)(예컨대, WO2008/156712 중에 hPD109A 및 그의 인간화한 유도체 h409All, h409A16 및 h409A17로서 개시됨; Hamid et al., 2013; N. Engl. J. Med. 369: 134-144). 더 바람직한 체크포인트 억제제는 CTLA-4 억제제 예르보이®(이필리무맙; 브리스톨 마이어스 스큅) 및 트레멜리무맙(Tremelimumab, 화이자/메드이뮨)뿐만 아니라 PD-1 억제제 옵디보(Opdivo)®(니볼루맙; 브리스톨 마이어스 스큅), 키트루다(Keytruda)®(펨브롤리주맙; 머크), 피딜리주맙(Pidilizumab, CT-011; 큐어테크(CureTech)), MEDI0680(AMP-514; 아스트라제네카), AMP-224 및 람브롤리주맙(Lambrolizumab)(예컨대, WO2008/156712 중에 hPD109A 및 그의 인간화한 유도체 h409All, h409A16 및 h409A17로서 개시됨; Hamid et al., 2013; N. Engl. J. Med. 369: 134-144)를 포함한다. 상기 기술된 바와 같이 LAG3 억제제의 바람직한 예시는 항-LAG3 단일클론 항체 BMS-986016(브리스톨 마이어스 스큅)이다. LAG3 억제제의 다른 바람직한 예시들은 LAG525(노바티스), IMP321(Immutep) 및 WO 2009/044273 A2 및 문헌(Brignon et al., 2009, Clin. Cancer Res. 15: 6225-6231) 중에 개시된 바와 같은 LAG3-Ig뿐만 아니라 마우스 또는 인간화된 항체 차단 인간 LAG3(예컨대, WO 2008/132601 A1 중에 기술된 IMP701), 또는 완전 인간 항체 차단 인간 LAG3(EP 2320940 A2 중에 개시된 것과 같은 것)을 포함한다.
면역 체크포인트 조절제는 CD40의 조절제가 아닌 것이 바람직하다. 특히, 면역 체크포인트 조절제는 CD40 리간드가 아닌 것이 바람직하다. 면역 체크포인트 조절제가 항-CD40 항체가 아닌 것이 또한 바람직하다.
또한 결장직장암의 치료를 위한 본 명세서에서 정의된 복합체와 조합하기 위한 체크 포인트 조절제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 니볼루맙(Nivolumab), MPDL3280A, MEDI4736, 트레멜리무맙(Tremelimumab), 아벨루맙(Avelumab), PDR001, LAG525, INCB24360, 발리루맙(Varlilumab), 우렐루맙(Urelumab), AMP-224 및 CM-24로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
종양 용해 바이러스는 종양에서 복제함으로써 세포 용해를 유발하도록 설계되어 항종양 면역 반응을 활성화시킨다. 결장직장암의 치료를 위한 본 명세서에서 정의된 복합체와 조합하기 위한 종양 용해 바이러스는 바람직하게는 JX594(티미 딘 키나아제 비활성화 백시니아 바이러스), ColoAd1(아데노바이러스), NV1020(HSV-유래된 것), ADXS11-001(약독화 리스테리아 백신), Reolysin®(인간 레오바이러스의 특수 배합), PANVAC(재조합 백시니아-바이러스 CEA-MUC-1-TRICOM), Ad5-hGCC-PADRE (재조합 아데노바이러스 백신) 및 vvDD-CDSR(백시니아 바이러스)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 대략 동시에 투여된다.
본 명세서에서 사용되는 "대략 동시에"란 특히 동시 투여 또는 (i) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제의 투여 직 후를 의미하고, (ii) 복합체는 투여되거나 또는 (i) 복합체 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제를 투여한 직 후에 투여된다. 숙련된 기술자는 "직후"란 제2투여를 준비하는 데 필요한 시간, 특히 제2투여를 위한 위치를 노출시키고 소독하는 것뿐만 아니라 "투여 장치"(예 : 주사기, 펌프 등)의 적절한 준비를 위하여 필요한 시간을 포함함을 이해한다. 동시 투여는 또한 (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제의 투여 기간이 중첩되는 경우, 또는 예를 들어 하나의 성분이 30분, 1시간, 2시간 또는 그 이상과 같은 더 긴 시간 동안, 예컨대 주입에 의해 투여되고, 다른 구성 요소는 그와 같은 장기간 동안의 임의의 시간에 투여되는 경우를 포함한다. (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제를 거의 동시에 투여하는 것은, 상이한 투여 경로 및/또는 상이한 관리 사이트가 사용되는 경우에 특히 바람직하다.
또한, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 연속하여 투여되는 것이 바람직하다. 이는 (i) 복합체가 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제의 전 또는 후에 투여되는 것을 의미한다. 연속 투여에서, 제1성분의 투여와 제2성분의 투여 사이의 시간은 바람직하게는 1주일 이하, 보다 바람직하게는 3일 이하, 더욱 더 바람직하게는 2일 이하 및 가장 바람직하게는 24시간 이하이다. (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는, 제1성분(복합체의 체크포인트 조절제)의 투여 및 제2성분(체크 포인트 조절제의 다른 하나 및 복합체)의 투여 사이의 시간이 바람직하게는 6시간 이하, 더 바람직하게는 3시간 이하, 더욱 더 바람직하게는 2시간 이하, 그리고 가장 바람직하게는 1시간 이하를 가지고 동일한 날에 투여되는 것이 특히 바람직하다.
바람직하게는, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 동일한 투여 경로를 통하여 투여된다. 또한, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 별개의 투여 경로를 통하여 투여되는 것이 바람직하다.
게다가, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 바람직하게는 별개의 조성물 중에 제공된다. 대안적으로는, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 바람직하게 동일한 조성물 중에 제공된다.
그에 따라서, 본 발명은 암의 치료 및/또는 안정화 및/또는 결장직장암 재발 방지에 유용한 적어도 하나의 협력제와 조합되는, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 복합체 또는 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 세포, 특히 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 항원-제시 세포, 및 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 약학 제제(formulation)을 제공한다.
게다가, 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 복합체; 본 발명에 따라 (사용하기 위한) 상기 복합체가 탑재된 상기 세포, 예를 들어 항원-제시 세포; 본 발명 조성물; 본 발명 약학 조성물 또는 본 발명 백신은 수술 후 고형 종양이 제거된 곳에 재발 및/또는 전이의 예방으로서 투여될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 방법 및 용도에서 영상화 또는 진단 조성물의 투여는 단독 또는 결장직장암을 영상화 및/또는 진단하는데 유용한 협력제와 조합하여 수행될 수 있다.
대상체
본 발명은 결장직장암을 앓고 있는 또는 결장직장암을 발전시킬 위험이 있는 임의의 대상체에게 적용될 수 있고, 이는 특히 본 발명에 따른 상기 복합체에 포함되는 상기 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프의 특이성에 따라 달라진다. 특히, 상술한 복합체의 상기 치료적 효과는 상술한 항원 또는 항원성 에피토프에 대응하는 면역 반응, 특히 CD4+ 도움 T 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포에 의존적이거나 및/또는 MHC 클래스 I 분자 및/또는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제한되는 반응을 유발할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 대상체는 또한 종양의 수술적 제거를 한 대상이 바람직하다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 상기 특정한 구현예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 정말로, 본 명세서에 기술된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형들은 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당해 분야 통상의 기술자들에게 명백할 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 본 명세서에 참조로서 통합된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명에 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 보통으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 비록 본 명세서에 기술된 것들에 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 실험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 후술된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 명세서, 특허, 및 다른 문헌들은 전체로 참조로서 통합된다. 상반되는 경우에는, 정의를 포함하는, 본 명세서에 의한다. 추가적으로, 물질, 방법, 및 실시예는 오직 설명적이고 제한하기 위해 사용되지 않는다.
하기에서 본 첨부된 그림들의 간단한 설명이 주어질 것이다. 상기 그림들은 본 발명을 더 상세히 설명하려는 것으로 의도된다. 하지만, 그들은 본 발명의 주제를 어떠한 방식으로든 제한하려고 의도하지는 않는다.
도 1: 실시예 1의 단일 연층(buffy)의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포(human blood monocyte-derived dendritic cells, DCs)에 의한 활성 마커 CD40의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형(isotype) 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 1에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 2: 실시예 1의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 활성 마커 CD86의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 2에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 3: 실시예 1의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 활성 마커 HLADR의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 3에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 4: 실시예 1의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 단일 활성 마커 CD83의 발현을 보여준다. 상기 수지상 세포는 300nM의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 또는 25ng/ml의 LPS로 48시간 동안 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 수행되었다 (아형은 도 4에 도시하지 않음) (한 개 실험).
도 5: 실시예 2의 TCR 트랜스제닉 마우스로부터의 골수 유래 수지상 세포(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) 및 비장세포를 사용하여 포유류내 시험관내 기능적 MHC 클래스 I-제한된 교차-제시를 보여준다. 이것을 위해, BMDC는 밤새 300nM의 EDAMad5, EDAZ13Mad5 및 Mad5 와 함께 밤새 로드되었다. OVACD8 에피토프 및 gp100 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 I-제한 제시는 CFSE-표지된 OT1 세포 및 P-Mel 세포 각각과 함께 4일 후에 관측되었다. OVACD4 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 II-제한 제시는 CFSE-표지된 OT2 세포와 함께 4일 후에 관측되었다. 대조군으로, BMDC가 1시간 동안 5uM 펩타이드로 펄스되었다(2개 개별 실험의 대표로서 한 개 실험).
도 6: 실시예 3의 2 nmol 그룹에 대한 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol의 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 마우스를 출혈시키고 펜타머 염색(pentamer staining)이 수행되었다(그룹당 3-4마리 마우스, 한 개 실험).
도 7: 실시예 3의 10 nmol 그룹에 대한 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 10 nmol의 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 마우스를 출혈시키고 펜타머 염색이 수행되었다(그룹당 3-4마리 마우스, 한 개 실험).
도 8: 실시예 3의 모든 실험된 그룹에 대한 펜타머 양성 CD8+ T 세포의 백분율을 보여준다. C57BL/6 마우스는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol 또는 10 nmol의 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 마우스를 출혈시키고 펜타머 염색이 수행되었다(그룹당 3-4마리 마우스).
도 9: 실시예 4의 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차); *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 그룹 (2-way Anova test). C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5 일(d5) 및 13 일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 또는 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 10: 실시예 4의 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹당 7마리 개별 마우스). C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 또는 Mad5 및 MPLA (EDA와 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 11: 실시예 4의 (A) 그룹당 7마리 마우스의 생존곡선; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 그룹 (Log-rank test) 그리고 (B) 그룹당 7마리 마우스의 무종양 진행 곡선를 보여준다; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 그룹 (Log-rank test).
도 12: 실시예 5의 모든 실험 그룹에 대한 전이의 수를 나타낸다. C57BL/6 마우스는 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일(d0) 및 9일(d9)) 피하 주사에 의해 2nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5 또는 Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 마우스는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소(metastasis foci)의 수가 계산되었다. **, p<0.01; ****, p<0.0001 (Unpaired T test).
도 13: 실시예 6의 모든 실험 그룹에 대한 전이의 수를 나타낸다. C57BL/6 마우스는 두 번 (d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5 또는 Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 0일차(day 0)에, 마우스들은 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었다. 마우스들은 14일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소(metastasis foci)의 수가 계산되었다. *, p<0.05; ***, p<0.001 (Unpaired T test).
도 14: 실시예 8의 결과를 보여준다. HEK-hTLR2 세포주는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 0.3 μM, 1 μM 또는 3 μM의 AnaxaZ13Mad5 또는 Z13Mad5Anaxa로 자극되었고 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 양성 대조군은 500ng/ml의 Pam3CSK4, TLR2 작용제로 수행되었다. (A) 현탁액 20 마이크로리터가 콴티블루®(QuantiBlue®) 검출 배지에 추가되고 37℃ 에서 1시간 동안 흡광도 판독(620nm) 전에 배양되었다. (B) 현탁액 내 IL-8 분비의 (ELIZA에 의한) 수량화.
도 15: 실시예 9의 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol의 AnaxaZ13Mad5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 마우스를 출혈시키고 펜타머 염색이 수행되었다 (한 개 실험).
도 16: 실시예 9의 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 2 nmol의 AnaxaZ13Mad5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에 마우스를 출혈시키고 펜타머 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). *, p<0.05.
도 17: 실시예 10의 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차). C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4(Anaxa 등분자)의 공동주사로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. *, p<0.05; ***, p<0.001, ****, p<0.0001.
도 18: 실시예 10의 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹당 7마리 개별 마우스). C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4(Anaxa 등분자)의 공동주사로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 19: 실시예 10의 그룹당 7마리 마우스의 생존 곡선을 보여준다. C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 10nmol의 AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4(Anaxa 등분자)의 공동주사로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. *, p<0.05, **, p<0.01, ****, p<0.0001 (Log-rank test).
도 20: 실시예 11의 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차). C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 2nmoles의 Hp91Z13Mad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA 또는 Z13Mad5 및 MPLA(EDA 등분자)로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001 (2-way Anova test at day 23).
도 21: 실시예 11의 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹당 7마리 개별 마우스). C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 2nmoles의 Hp91Z13Mad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, Z13Mad5EDA 또는 Z13Mad5 및 MPLA(EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 22: 실시예 11의 그룹당 7마리 마우스의 생존 곡선을 보여준다. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). *, p<0.05; **, p<0.01 (Log-rank test).
도 23: 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 표준편차); ****, p<0.0001 (Log-rank test). C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol, 2 nmol 또는 10 nmol의 Z13Mad5Anaxa 로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 24: 실시예 13의 0.5 nmol (A) 또는 2nmol (B)의 Z13Mad5Anaxa로 세 번 (0주(Wk0)차에 한번, 2주(Wk2) 차에 한번 및 4주(Wk4)차에 한번) 피하(s.c.), 진피내(i.d.), 또는 근육내(i.m.)로 백신접종된 C57BL/6 마우스의 혈액 내에서 각 백신접종 후 검출된 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 2차(Vac 2) 및 3차(Vac 3) 백신접종 7일 후 마우스를 출혈시키고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). *, p<0.05.
도 25: 실시예 13의 KLRG1 발현 (A) 및 PD-1 발현 (B)을 보여주고, 이는 다량체-양성 CD8 T 세포에서 분석되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). 간략히, C57BL/6 마우스는 세 번 (0주(Wk0)차에 한번, 2주(Wk2) 차에 한번및 4주(Wk4)차에 한번) 피하, 진피내, 또는 근육내로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 2차(Vac 2) 및 3차(Vac 3) 백신접종 7 일후 마우스로부터 혈액을 얻었고 FACS 염색이 수행되었다.
도 26: 실시예 14의 두 번 (0주(Wk0)차에 한번 및 2주(Wk2)차에 한번) 결절내로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 C57BL/6 마우스에서의 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 2차 백신접종 7일 이후 마우스로부터 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 마우스 3마리).
도 27: 실시예 15의 CD8 T 세포 중 펜타머-양성 세포의 백분율 (A 및 B; *, p<0.05) 및 펜타머-양성 CD8 T 세포의 KLRG1 기하평균(C 및 D)을 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 세 번 (A 및 C: 0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4); B 및 D: 0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마우스 were bled 7 days after 마지막 백신접종 7일 후 마우스를 출혈시켰고 펜타머 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험).
도 28: 실시예 15의 CD8 T 세포 중 다량체-양성 세포의 백분율 (A 및 D); 다량체-양성 CD8 T 세포의 KLRG1 기하평균 (B 및 E) 및 PD1 geomean of 다량체-양성 CD8 T 세포의 PD1 기하평균 (C 및 F)을 보여준다. A-C, C57BL/6 마우스는 세 번 0일(Day0), 3일(Day3) 및 7일(Day7)차에 백신접종되었고 7일 및 14일차에 출혈시켰다. D-F, C57BL/6 마우스는 세 번 0일(Day0), 3일(Day3) 및 14일(Day4)차에 백신접종되었고 7일 및 21일차에 출혈시켰다. 백신접종은 피하로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 수행되었다. 다량체 염색은 혈액 샘플에서 수행되었다(그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험).
도 29: 실시예 16의 도면에 나타난 다양한 구성물과 BMDCs의 배양 후 APC 활성화를 나타내는 IL-6 분비를 보여준다. 간략히, BMDCs는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. IL-6 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 2 내지 3개 개별 실험의 평균 ± 표준편차.
도 30: 실시예 16의 도면에 나타난 다양한 구성물과 Raw 264.7 세포의 배양 후 APC 활성화를 나타내는 TNF-α 분비를 보여준다. 간략히, Raw 264.7 세포는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. TNF-α 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 2 내지 3개 개별 실험의 평균 ± 표준편차.
도 31: 실시예 17의 도면에 나타난 다양한 구성물과 HEK-hTLR4 세포의 배양 후 TLR4 결합을 나타내는 IL-8 분비를 보여준다. 간략히, HEK-hTLR4는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. IL-8 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 2개 개별 실험의 평균 ± 표준편차.
도 32: 실시예 18의 준치료적 환경의 폐 전이 모델에서 전이 수를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일(d0) 및 9일(d9)) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 마우스는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소의 수가 계산되었다. **, p<0.01 (One-way Anova with Tukey's multiple comparisons test).
도 33: 실시예 19의 준치료적 환경의 폐 전이 모델에서 전이 수를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일(d0) 및 9일(d9)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4 (Anaxa 등분자)으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 마우스는 21일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소의 수가 계산되었다. *, p<0.05; **, p<0.01 (Unpaired t-test).
도 34: 실시예 20의 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 수량화를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 5-8마리 마우스).
도 35: 실시예 20의 사이토킨 분비를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다. 사이토킨 분비하는 CD8 T 세포의 % (그룹당 5-8 마리 마우스).
도 36: 실시예 21의 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 Z13Mad5Anaxa의 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 세 번 (7일(d7), 21일(d21) 및 35일(d35)) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마우스는 매일 중량 측정되었고 중량 감소가 15% 그 이상의 도달하였을 때 희생되었다.
도 37: 실시예 22의 예방적 환경의 피하 EG7-OVA 종양 모델에서 Z13Mad5Anaxa의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 두 번 (d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었고 이후 0일(day0)차에 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. (A) 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장 (평균 ± 표준편차; ****, p<0.0001 (30일차에 2-way Anova test). (B) 그룹당 7마리 마우스의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). ***, p<0.001 (Log-rank test).
도 38: 실시예 23의 치료적 환경의 피하 B16-OVA 종양 모델의 확립된 종양에서 Z13Mad5Anaxa의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 피하로 1x105 B16-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (14일(d14) 및 31일(d21)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. (A) 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); *, p<0.05 (32일차에 2-way Anova test). (B) 그룹당 7마리 마우스의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.).
도 39: 실시예 24의 피하 EG7-OVA 종양 모델에서 Z13Mad5Anaxa 내 CPP의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 0일차에 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 그후 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. (A) 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); ****, p<0.0001. (B) 그룹당 7마리 마우스의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). **, p<0.01; ***, p<0.001.
도 40: 실시예 25의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 면역 반응에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2nmol (A) 또는 0.5 nmol (B)의 Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 2차, 3차, 4차 및 5차 백신접종 후 7일에 마우스를 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). *, p<0.05 각 시간 지점에서 백신접종군 대 비투여 마우스사이, 단 Z18Mad5Anaxa-백신접종된 마우스의 Vac2(2차 접종)을 제외.
도 41: 실시예 26의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 CD8 T 세포에 대한 효과를, 비장 (A), 배출 림프절(draining lymph nodes) (B) 및 골수 (C)에서, 보여준다. C57BL/6 마우스는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 5차 백신접종 9일 후 마우스는 희생되었고, 기관들은 회수되었고, 다량체 염색이 수행되었다.
도 42: 실시예 26의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 비장 내 T 세포에 대한 효과를 보여준다 (CD8 T 세포 반응 (A) 및 CD4 T 세포 반응 (B)). C57BL/6 마우스는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종되었다. (A) 5차 백신접종 9일 후, SIINFEKL OVACD8 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다. (B) 5차 백신접종 9일 후, SIINFEKL OVACD4 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다
도 43: 실시예 26의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 CD8 T 세포 효과기 기능에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 다섯 번(0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4), 6주(Wk6) 및 8주(Wk8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 5차 백신접종 9일 후, SIINFEKL OVACD8 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 세포속 염색이 수행되었다
도 44: 실시예 27의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 종양 성장 (A) 및 생존율 (B)에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. (A) 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); *, p<0.05; ****, p<0.0001 (2-way Anova test at day 28). (B) 그룹당 7마리 마우스의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.). *, p<0.05; **, p<0.01; ***,p<0.001 (Log-rank test).
도 45: 실시예 28의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 면역 반응에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 세 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4)) 피하로 2 nmol (A) 또는 0.5 nmol (B)의EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5로 백신접종되었다. 마우스는 2차 및 3차 백신접종 7일 후 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). *, p<0.05
도 46: 실시예 29의 EDAZ14Mad5의 종양 성장 (A) 및 생존율 (B)에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (5일(d5) 및 13일(d13)) 피하주사에 의해 2nmoles의 EDAZ14Mad5로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 왼쪽 패널: 그룹당 7마리 마우스의 종양 성장 (평균 ± 표준편차); **, p<0.01 (27일차의 2-way Anova test). 오른쪽 패널: 그룹당 7마리 마우스의 생존 곡선. 중앙 생존값(Median survival)이 그래프에 나타나있다 (m.s.).
도 47: 실시예 30의 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 수량화를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 7 - 16마리 마우스).
도 48: 실시예 30의 사이토킨 분비를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일(d7) 및 21일) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다. 사이토틴 분비하는 CD8 T 세포의 % (그룹당 7-16마리 마우스).
도 49: 실시예 31의 Z13Mad8Anax의 비장내 T 세포에 대한 효과를 보여준다 (CD8 T 세포 반응 (A) 및 CD4 T 세포 반응 (B)). C57BL/6 마우스는 네 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4) 및 6주(Wk6)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad8Anaxa로 백신접종되었다. (A) 4차 백신접종 1주일 후, gp70CD8 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다. (B) 4차 백신접종 1주일 후, gp70CD4 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다.
도 50: 실시예 32의 B16 폐 전이 모델에서 Z13Mad11Anaxa의 전이 수 (A) 및 비장 내 T 세포 반응 (B)에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 두 번 (0일,10일) 피하로 1 nmol의 Z13Mad11Anaxa로 백신접종되었다.
도 51: 실시예 33의 Z13Mad9Anaxa의 비장 내 T 세포에 대한 효과를 보여준다 (CD8 T 세포 반응. C57BL/6 마우스는 네 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2), 4주(Wk4) 및 6주(Wk6)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad9Anaxa로 백신접종되었다. 4차 백신접종 1주일 후, adpgk 펩타이드로 자극된 비장 세포에서 엘리스팟 분석이 수행되었다.
도 52: 실시예 34의 상이한 CPPs를 갖는 복합체의 면역 반응에 대한 효과를 보여준다. C57BL/6 마우스는 두 번 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 TatFMad5Anaxa로 백신접종되었다. 마우스는 2차 백신접종 7일 후 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 8마리 마우스로 한 개 실험).).
도 53: 실시예 35의 비투여 마우스에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 수량화를 보여준다. 간략히, C57BL/6 마우스는 한 번 (0일(day0)) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 "Z13Mad5Anaxa") 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa (그룹 "Z13Mad5+Anaxa")로 백신접종되었다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액 내에서 7일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 4-8마리 마우스).
도 54: 실시예 36의 Z13Mad12Anaxa의 혈액 내 T 세포에 대한 효과를 보여준다(CD8 T 세포 반응). C57BL/6 마우스는 두 번 (0주(Wk0) 및 2wd(Wk2)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad12Anaxa로 백신접종되었다. 2차 백신접종 1주일 후, 신생항원 reps1를 위한 다량체 염색이 혈액 세포에서 수행되었다.
도 55: 실시예 37의 단일 연층의 인간 혈액 단핵구-유래 수지상 세포에 의한 활성 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86 (왼쪽에서 오른쪽으로) 의 발현을 보여준다. DCs는 48시간 동안 300nM의 Z13Mad5Anaxa (아래 패널) 또는 Z13Mad5 (위 패널)로 자극되었다. 각 상태에 대한 아형 염색도 또한 기술된대로 수행되었다.
도 56: 실시예 38에서 멀티머-양성 세포(CD8 T 세포의 %)의 반복된 백신 접종 동안 백분율을 나타낸다. 간단히 말해, C57BL/6 마우스를 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 6 회(0, 2, 4, 8, 12, 16주) 백신 접종하였다. 각 백신 접종 후 또는 백신 접종 전에 마우스를 출혈시키고 펜타머 염색을 수행하였다(그룹 당 4마리의 마우스를 가지고 2회 실험). 시간 축 아래의 화살표는 백신 접종 시점을 나타낸다.
도 57: 실시 예 39에서 MC-38 종양 모델에서 Z13Mad11Anaxa로 백신 접종된 마우스 및 대조군 마우스의 종양 부피(A) 및 생존율(B)을 나타낸다. 간략하게, C57BL/6 마우스의 좌측 옆구리에 2x105 MC38 종양 세포를 s.c. 이식하고, 오른쪽 옆구리에 2 nmol의 Z13Mad11Anaxa를 s.c. 주입하는 것에 의하여 2회 백신 접종하였다(종양 이식 전에 -d21 & -d7). (A) 종양 성장 및 (B) 그룹 당 7마리의 생존 곡선. 중앙 생존은 그래프 상에 표시된다(m.s.). *, p<0.05; **, p<0.01 (로그 순위 테스트; Log-rank test).
도 58: 실시예 40에서 본 발명에 따른 복합체 투여 후 선택된 사이토카인의 방출을 나타낸다. 간략하게, C57BL/6 마우스에 10 nmol의 Z13Mad5Anaxa를 i.v. 주입하였다. 투여 후 0.5, 1 및 3시간 후에, 혈청 중의 IL-6, TNFα, IFNγ, IL1-β 및 IL12를 모니터하기 위해 Luminex의 멀티플렉스를 사용하여 혈액 샘플을 채취하였다(n = 4).
도 59: 실시예 41에서 대조군(컬럼 (A)) 및 Z13Mad12Anaxa-백신 접종된 마우스(컬럼 (B))에 대한 종양 부위(종양-침윤 세포, TILs)에서의 신생항원 adpgk-특이적 면역 반응을 나타낸다. TIL의 FACS 도트 플롯이 표시된다. 각 도트 플롯에 대해 멀티머-양성 세포의 백분율(CD8 T 세포의 % 중)이 표시된다.
도 60: 실시예 41에서 대조군(컬럼 (A)) 및 Z13Mad12Anaxa-백신 접종된 마우스(컬럼 (B))에 대한 종양 부위(종양-침윤 세포, TILs)에서 신생항원 reps1-특이적 면역 반응을 나타낸다. 혈액 세포의 FACS 도트 플롯이 표시된다. 각 도트 플롯에 대해 멀티머-양성 세포의 백분율(CD8 T 세포의 % 중)이 표시된다.
도 61: 실시예 41에서 대조군 및 Z13Mad12Anaxa-백신 접종 마우스에 대한 종양 부위(종양-침윤 세포, TILs)에서의 신생항원-특이적 면역 반응을 나타낸다. 각 에피토프(adpgk (A) 및 reps1 (B))에 대해 멀티머-양성 세포의 백분율(CD8 T 세포의 % 중)이 도시되어 있다.
도 62: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP110으로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 63: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP112로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소 타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 64: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP115로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소 타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 65: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP117로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 66: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP118로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 67: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP119로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 68: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP120으로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 69: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP122로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 70: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 300nM의 ATP123으로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 71: 실시예 42에서 하나의 단일 버피로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)에 의한 활성화 마커 HLA-DR, CD83, CD80 및 CD86의 발현을 나타낸다. DC는 밤 동안 600nM의 ATP125로 자극되었다. 각각의 상태에 대한 이소타입 염색은 또한 도시된 바와 같이 수행하였다.
도 72: 실시예 43에 대해 그룹당 13 내지 14마리의 마우스의 종양 성장(A) 및 생존율(B)(평균±SEM)을 나타낸다. C57BL/6 마우스의 등에 2x105 MC-38 종양 세포를 s.c. 이식하였다. "Z13Mad12Anaxa" 및 "Z13Mad12Anaxa + 항-PD1" 그룹의 마우스에게 2nmol의 Z13Mad12Anaxa를 꼬리베이스에 3회 (d3, d10 및 d17) 피하 주입하는 것에 의하여 백신 접종하였다. 200 ㎍의 항-PD1 항체를 "anti-PD1" 및 "Z13Mad12Anaxa + 항-PD1" 그룹의 마우스에 각각 6일, 10일, 13일, 17일, 20일, 24일 및 27일에 i.p. 투여하였다. 종양의 크기는 캘리퍼로 측정하였다. 각 그룹의 종양이 없는 마우스의 수는 각각의 종양 성장 곡선에 대해 나타내었다. *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; ****, p<0.0001.
도 73: 실시예 43에 대해 그룹당 13 내지 14 마리의 마우스의 개별 종양 성장 곡선을 나타낸다. C57BL/6 마우스의 등에 2x105 MC-38 종양 세포를 s.c. 이식하였다. "Z13Mad12Anaxa" 및 "Z13Mad12Anaxa + 항-PD1" 그룹의 마우스에게 2nmol의 Z13Mad12Anaxa를 꼬리베이스에 3회(d3, d10 및 d17) 피하 주입하는 것에 의하여 백신 접종하였다. 200 ㎍의 항-PD1 항체를 "항-PD1"및 "Z13Mad12Anaxa + 항-PD1" 그룹의 마우스에 각각 6일, 10일, 13일, 17일, 20일, 24일 및 27일에 i.p. 투여하였다. 종양의 크기는 캘리퍼로 측정 하였다.
도 74: 실시예 44에 대한 결과를 나타낸다. C57BL/6 마우스에게 ATP128 4 nmol을 1회 백신 접종하였다. 마우스를 7일 후 출혈시키고 엘리스팟(Elispot) 분석을 ATP128을 탑재한 수지상 세포로 자극한 혈액 세포 상에서 수행하였다(하나의 실험).
도 75: 실시예 45에 대해 10개의 다른 버피(buffys)로부터의 인간 혈액 단핵구-유도된 수지상 세포(DC)의 활성화 지수를 나타낸다. DC를 300nM의 ATP128으로 밤새 자극하였다. 음성 및 양성 대조군은 세포를 완충액 및 MPLA와 각각 배양하여 수행하였다.
도 76: 실시예 46에 대해 ATP128로 하룻밤 동안 로딩한 후, 두 개의 상이한 도너, 도너 9(실선) 및 도너 10(점선)으로부터의 인간 수지상 세포의 표면에서 MHC 클래스 I(A) 및 클래스 II(B) 상에 존재하는 것으로 발견된 ATP128 함유 펩타이드의 영역, 및 MHC 클래스 I 및 클래스 II(C) 상에 제시된 각각의 펩타이드 수를 나타낸다. 밑줄 친 숫자는 면역원성 펩타이드로서 문헌에 이미 기재된 펩타이드에 상응한다.
실시예
하기에서, 본 발명의 다양한 구현예 및 측면을 설명하는 구체적인 실시예들이 제시된다. 하지만, 본 발명은 본 명세서 기술된 상기 특정한 구현예에 의하여 전혀 제한되지 않아야 한다. 후술하는 준비예 및 실시예는 당해 분야 통상의 기술자가 본 발명을 더 명확하게 이해하고 실행할 수 있게 하기 위하여 주어진다. 본 발명은, 하지만, 예시되는 구현예에 의해 범위가 제한되지 않고, 이는 오직 본 발명의 단일 측면의 실례를 의도하고, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위에 속한다. 정말로, 본 명세서에 기술된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형들은 전술한 설명, 첨부된 도면 및 후술 실시예로부터 당해 분야 통상의 기술자들에게 손쉽게 명백하게 될 것이다. 이러한 모든 변형들은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
실시예 1: 시험관내 인간 수지상 세포 성숙
본 연구의 목적은 본 발명에 따라 사용하기 위한 위한 복합체의 수지상 세포의 성숙 유도 능력을 조사하는 것이었다. 본 연구에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 융합 단백질이고, 세포-투과 펩타이드 "Z13", 단백질 "MAD"를 포함하고, 이는 상이한 CD8+ 및 CD4+ 를 구성하고, 및 상기 TLR4 펩타이드 작용제 "EDA"를 포함한다. 그에 따라서, N-말단 위치의 EDA 펩타이드와 융합 단백질 및 Z13 또는 EDA 또는 양자 없이 상이한 조절 접합된 단백질이 디자인되었다.
다시 말해, 하기 구성물이 디자인되었고, 여기 아미노산 서열에서 상기 세포-투과 펩타이드 "Z13"은 밑줄로 표시되어 있고 상기 TLR 펩타이드 작용제 "EDA"는 이탤릭체로 표시되어 있다:
EDAZ13Mad5
서열:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQST KRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[SEQ ID NO: 26]
분자량: 25'057 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- EDA TLR 작용제 포함 (Lasarte, J.J., et al., The extra domain A from fibronectin targets antigens to TLR4 -expressing cells and induces cytotoxic T cell responses in vivo . J Immunol, 2007. 178(2): p. 748-56)
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산(Tris-HCl), , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 1 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: < 0.01EU/ug
Z13Mad5
서열:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKSSE NDRLRLLLKE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[SEQ ID NO: 29]
분자량: 15'196 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 1 M L-아르기닌, pH 9
- 내독성 수준:
ｏ Batch 1: 0.32EU/mg
ｏ Batch 2: 0.44EU/mg
Mad5
서열:
MHHHHHHE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[SEQ ID NO: 30]
분자량: 10'154.6 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: 0.069EU/mg
상기 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 및 Mad5 단백질의 인간 수지상 세포(DC) 성숙 유도 능력이 조사되었다. 300nM 단백질로 48시간 동안 배양한 후, 활성 마커 발현 (CD86, CD40, CD83 및 HLA-DR)이 인간에서 FACS에 의해 인 평가되었다 (도 1 - 4). 각 단백질의 특정 완충액은 음성 대조군으로 사용되었다.
결과는 CD40에 대해서는 도 1, CD86에 대해서는 도 2, HLADR에 대해서는 도 3, 및 CD83에 대해서는 도 4에 나타나 있다. EDAZ13Mad5는 인간 DCs 성숙을 유도하고, 이는 CD86, HLADR 및 CD83의 증가로 나타난 반면, Z13Mad5 및 Mad5 단백질은 인간 DCs를 활성화할 수 없었다. 이들 결과는 상기 단백질의 EDA 부분이 인간 DCs에서 활성 마커의 조절을 담당하는 것을 나타낸다.
실시예 2: 시험관내 에피토프 제시 (MHC I)
본 연구의 목적은 상이한 TCR 트랜스제닉 마우스로부터의 골수 유래 수지상 세포(bone marrow derived dendritic cells, BMDCs) 및 비장세포를 사용하여 포유류내 기능적 MHC 클래스 I-제한된 교차-제시를 시험관내 시스템에서 평가하는 것이다. 이것을 위해, 구성물 EDAZ13Mad5 및 Mad5 (실시예 1에 기술)의 구성물 EDAMad5이 사용되었다:
EDAMad5
서열
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGEDDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTE SLKISQAVHA AHAEINEAGR EVVGVGALKV PRNQDWLGVP RFAKFASFEA QGALANIAVD KANLDVEQLE SIINFEKLTE WTGS
[SEQ ID NO: 31]
분자량: 20'017 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- EDA TLR 작용제 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: 1.8EU/mg
BMDC는 밤새 300nM의 EDAMad5, EDAZ13Mad5 및 Mad5 단백질, OVACD8, OVACD4 및 gp100 에피토프를 포함하는,과 함께 밤새 로드되었다. 이들 MHC I-제한 OVACD8 및 gp100 에피토프의 가공 및 제시는 OT-1 T 세포 수용체 (TCR) 트랜스제닉 마우스로부터의 비투여(naive) OVA257 -264-특이적 CD8+ T 세포 및 P-mel T 세포 TCR 트랜스제닉 마우스로부터의 gp100-특이적 CD8+ T 세포 각각의 시험관내 증식을 측정함으로써 관측되었다. 그에 따라서, OVACD8 에피토프 및 gp100 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 I-제한 제시는 CFSE-표지된 OT1 세포 및 P-Mel 세포 각각과 함께 4일 후에 관측되었다. MHC II-제한 OVACD4 에피토프의 가공 및 제시는 OT-2 T 세포 수용체 (TCR) 트랜스제닉 마우스로부터의 비투여(naive) OVA323 -339-특이적 CD4+ T 세포의 시험관내 증식을 측정함으로써 관측되었다. 그에 따라서, OVACD4 에피토프의 효과적인 MHC 클래스 II-제한 제시는 CFSE-표지된 OT2 세포와 함께 4일 후에 관측되었다. 대조군으로, BMDC가 1시간 동안 5uM 펩타이드로 펄스되었다(2개 개별 실험의 대표로서 한 개 실험).
결과는 도 5에 나타내었다. 모든 평가된 Mad5-기반 단백질에서 유사한 교차-제시 및 가공 능력이 관찰되었다.
실시예 3: CD8 T 세포 면역 반응
EDA-접합 단백질의 다클론 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 효능을 조사하기 위해, C57BL/6 마우스는 두 번 (0주 및 2주), 피하 주사에 의해 2 nmol 또는 10 nmol의 구성물 EDAZ13Mad5 또는 EDAMad5 (실시예 1 및 2에 기술)로 백신접종되었다. 양성 대조군은 Mad5 및 TLR4 작용제 MPLA (EDA 등분자)로 백신접종되었다. 2 nmol의 구성물(도 6) 및 10 nmol의 구성물(도 7)로 두 개 용량이 평가되었다. 각 그룹마다 3 - 4 마리 마우스가 사용되었다.
마지막 백신접종 7일 후에, 마우스를 출혈시키고 혈액 내 OVA-특이적 면역 반응을 관측하기 위해 펜타머 염색(pentamer staining)이 수행되었다. 도 8에, 펜타머 양성 CD8+ T 세포의 백분율을 실험된 모든 그룹 및 두 용량에서 나타내었다.
이들 자료는 흥미롭게도 면역 반응이 2nmol에 대비하여 10nmol에서 낮다는 것을 나타냈다. 두 용량에서, 2nmol 및 10nmol, 백신 매개 면역 반응이 EDAMad5 그룹에 대비하여 EDAZ13Mad5 그룹에서 더 지속적으로 관찰되었다. 게다가, TLR4 작용제가 백신과 접합되는 경우 증가된 면역 반응이 있었다.
실시예 4: 벤치마크 EG.7-OVA 종양 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능
종양 성장 조절에 대한 EDA 구성물 단백질(construct proteins)의 효과를 평가하기 위해, EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 모델(s.c. 모델)이 선택되었다. C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 이식 후, 마우스들은 5 일 및 13 일차에 10 nmol의 다음 구성물로 (cf. 구성물 상세는 실시예 1 및 2): EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5, 또는 Mad5 및 MPLA (EDA 등분자)로 왼쪽 옆구리에 피하로 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
도 9는 그룹당 7 마리 마우스의 종양 성장을 보여준다 (평균 ± 평균의 표준오차(표준편차, SEM)); *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 (2-way Anova test). 도 10은 개별 종양 성장 곡선을 보여준다 (그룹단 7 마리 개별 마우스). 도 11 A는 그룹당 7 마리 마우스의 생존 곡선을 보여준다; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 (Log-rank test). 도 11 B는 그룹당 7 마리 마우스의 무종양 진행 곡선(tumor-free progression curve)을 보여준다; *, p<0.05 EDAZ13Mad5 대 대조군 (Log-rank test).
결과는 치료적 환경에서, EDAZ13Mad5는 대조군과 대비하여 더 좋은 무종양 진행 곡선 및 생존 곡선으로 종양 성장을 유의적으로 조절하는 유일한 단백질 백신임을 보여준다.
결과는 그리하여 구성물 단백질 EDAZ13Mad5은 치료적 환경에서 종양 성장을 조절하기 위한 고효능 백신임을 제안한다.
실시예 5: 흑색종 전이 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능
준-치료적 환경에서 B16-OVA 종양 세포를 사용한 폐 전이 모델에서 효능을 평가하기 위해, 상이한 구성물 단백질이 사용되었다: EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (cf. 구성물의 디자인에 대해서는 실시예 1 및 2), 및 MPLA 단독. C57BL/6 마우스는 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 동시에(d0) 2 nmol의 백신 (EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA, MPLA 단독)이 피하 주사에 의해 오른쪽 옆구리에 투여되었다. 9일 후, 마우스들은 동일한 용량으로 2차 백신접종되었다. 부가로 대조군은 2 nmol의 Z13Mad5 및 TLR4 작용제 MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 백신접종되었다. 마우스는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소(metastasis foci)의 수가 계산되었다. 결과는 도 12에 나타냈다.
결과는 접합체 EDAZ13Mad5는 Z13Mad5 + MPLA만큼 폐에서 종양 전이를 억제하는 효능이 있는 것을 보여준다. 뿐만 아니라, EDA-Mad5는 EDAZ13Mad5 보다 덜 강력한 효능이 있으며, 이는 백신 효능에서 Z13의 결정적인 역할을 나타낸다.
실시예 6: 흑색종 전이 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능 - 예방적 환경
게다가, 상이한 구성물 단백질 EDAMad5, EDAZ13Mad5, 및 Z13Mad5 + MPLA (cf. 구성물의 디자인에 대해서는 실시예 1 및 2)의 효능이 폐 전이 모델에서 예방적 환경에서 평가되었다. C57BL/6 마우스는 종양 세포 이식 12일 및 7일 이전에(d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAMad5 또는 Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자)로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 0일차(day 0)에, 마우스들은 정맥으로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었다. 마우스들은 14일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 결과는 도 13에 나타냈다.
실시예 7: TLR2 펩타이드 작용제를 포함하는 부가 구성물의 디자인
여기서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체는 또한 융합 단백질이고, 세포-투과 펩타이드 "Z13", 단백질 "MAD5"이는 다양한 항원으로부터의 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프를 구성하고, 및 TLR2 펩타이드 작용제 "Anaxa"(아낙사)를 포함한다. 그에 따라서, C-말단 또는 N-말단 위치에 Anaxa 펩타이드가 있는 융합 단백질이 디자인되었다.
다시 말해, 하기 구성물이 디자인되었고, 여기 아미노산 서열에서 세포-투과 펩타이드 "Z13"은 밑줄로 나타내고 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa "는 이탤릭체로 나타냈다:
AnaxaZ13Mad5
서열:
MHHHHHHSTV HEILCKLSLE GDHSTPPSAY GSVKPYTNFD AE KRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGS
[SEQ ID NO: 27]
분자량: 18973 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프 포함
- 아넥신의 35-mer 펩타이드 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: 5.17 EU/mg
Z13Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHKRYKNRVA SRKSRAKFKQ LLQHYREVAA AKSSENDRLR LLLKESLKIS QAVHAAHAEI NEAGREVVGV GALKVPRNQD WLGVPRFAKF ASFEAQGALA NIAVDKANLD VEQLESIINF EKLTEWTGSS TVHEILCKLS LEGDHSTPPS AYGSVKPYTN FDAE
[SEQ ID NO: 28]
분자량: 18973 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- 아넥신(Annexin) 35-mer 펩타이드 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, , 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
내독성 수준: 3.1 EU/mg
실시예 8: TLR2 결합 (HEK-hTLR2 세포주)
본 연구의 목적은 Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5 구성물 단백질(cf. 이들 구성물 단백질의 디자인에 대해서는 실시예 7)이 작용제로서 TLR2에 결합할 수 있는지 여부를 평가하는 것이다. HEK-BlueTM hTLR2는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 0.3 μM, 1 μM 또는 3 μM의 AnaxaZ13Mad5 또는 Z13Mad5Anaxa로 자극되었고 37℃에서 24시간 동안 배양되었다. 양성 대조군은 500ng/ml의 Pam3CSK4, TLR2 작용제로 수행되었다.
NF-κB/AP1의 활성화를 관측하기 위해, 현탁액 20 마이크로리터가 콴티블루®(QuantiBlue®) 검출 배지에 추가되고 37℃ 에서 1시간 동안 흡광도 판독(620nm) 전에 배양되었다. 결과는 도 14 A에 나타냈다.
현탁액 내 IL-8의 분비는 ELIZA에 의해 수량화되었다. 결과는 도 14 B에 나타냈다.
결과 (도 14 A, B)는 Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5가 유사하게 용량 의존적 방식으로 TLR2에 결합할 수 있다는 것을 보여주었다.
실시예 9: 특이적 CD8 + T 세포의 생체내 유도
실시예 7의 Anaxa-접합 단백질의 CD8+ T 세포 반응의 유도 효능을 조사하기 위하여, C57BL/6 마우스는 두 번 (0주 및 2주), 피하 주사에 의해 2 nmol의 AnaxaZ13Mad5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마지막 백신접종 7 일 후에, 마우스를 출혈시키고 혈액 내 OVA-특이적 면역 반응을 관측하기 위해 펜타머 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). 결과는 도 15 및 16에 나타냈다.
이들 자료는, Z13Mad5Anaxa 백신 및 AnaxaZ13Mad5 구성물, 두 개 모두 강한 면역 반응을 유발하는 것을 나타낸다.
실시예 10: 종양 성장에 대한 치료적 효과
실시예 7에서 디자인된 Anaxa-접합 구성물 단백질의 종양 성장 조절 효과를 평가하기 위하여, 벤치마크 종양 모델, 다시 말해 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 이식이 사용되었다.
C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 이식 후, 7 마리 마우스의 세 그룹이 오른쪽 옆구리에 5일차 및 13일차에 피하 주사에 의해 10 nmol의 AnaxZ13Mad5 (그룹 1), Z13Mad5Anaxa (그룹 2) 또는 Z13Mad5 및 Pam3CSK4 (Anaxa 등분자; 그룹 3)로 백신접종되었다. 외부 보조제와 혼합된 단백질에 효과를 대비하기 위하여, 대조군은 Z13Mad5 및 Pam3CSK4 (Anax 등분자)로 백신접종되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다. 결과는 도 17 - 19에 나타냈다.
치료 일정에서, Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5은 대조군과 대비하여 종양 성장을 조절하는데 더 좋은 단백질 백신이다, 즉 유의적으로 더 좋은 생존 곡선을 보이는 Z13Mad5 및 Pam3CSK의 공동 주사(co-injection). 특히, Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5는 Z13Mad5가 Pam3CSK4와 분리되어 투여되는 것보다 유의적으로 더 높은 효능을 입증하였다. 결과는 그리하여 구성물 단백질 Z13Mad5Anaxa 및 AnaxaZ13Mad5이 치료적 환경에서 종양 성장을 조절하기 위한 유망한 접합체-백신이라는 것을 제안한다.
실시예 11: 종양 성장에 대한 치료 효과 - 구성물과 상이한 TLR 작용제와의 대비
본 연구의 목적은 상이한 TLR 작용제에 접합된 상이한 구성물 단백질 백신, 다시 말해 실시예 1 및 7의 EDAZ13Mad5 및 Z13Mad5Anaxa의 종양 성장 조절에 대한 효능을 대비하는 것이다. 이것을 위해, 실시예 10에서 전술된 것처럼 C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 마우스 (그룹당 7 개별 마우스)는 피하로 오른쪽 옆구리에 5 일 및 13 일차에 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5+MPLA의 공동주사 (EDA 등분자)로 백신접종되었다.
결과는 도 20, 21 및 22에 나타냈다. 이 실험 환경에서, Z13Mad5Anaxa, EDAZ13Mad5, 및 Z13Mad5+MPLA는 유사하게 종양 성장 조절을 유의적으로 할 수 있었다. 게다가, 이들 자료는 본 실험 환경에서 Z13Mad5Anaxa는 유의적으로 종양 성장을 조절하는 가장 좋은 구성물이고 EDAZ13Mad5는 Z13Mad5+MPLA 보다 살짝 더 좋다는 것을 나타낸다.
실시예 12: 종양 성잘 조절에서 Z13Mad5Anaxa의 용량 효과
접합체 백신의 최적 용량(optimal dose)을 확인하기 위하여, Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 세 개의 상이한 용량(0.5 nmol, 2 nmol 및 10 nmol)의 종양 성장 조절 능력이 평가되었다. Z13Mad5Anaxa 구성물의 용량 효과는 실시예 10에 전술된 것처럼 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 모델에서 평가되었다. 종양 이식 후, 마우스는 두 번(종양 이식 후 5 일차 및 13 일차)에 치료적 환경에서 0.5, 2 또는 10 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다.
C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 0.5 nmol, 2 nmol 또는 10 nmol의 Z13Mad5Anaxa으로 오른쪽 옆구리에 두 번 백신접종되었다(5일(d5) 및 13일(d13)). 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
그룹당 7 마리 마우스의 종양 성장은 도 23에 묘사되어 있다. 이들 자료는 종양 성장 조절을 위해 0.5 및 2 nmol의 용량이 최소한 10 nmol 만큼 유효하다는 것을 보여준다.
실시예 13: Z13Mad5Anaxa의 상이한 투여 경로의 효과
본 연구는 Z13Mad5Anaxa 접합체 백신의 효능을 입증하는 전술한 실시예(cf. 실시예 7)에 기반하고, 이는 상기에서 보여준 피하 종양 모델 EG7에서 종양 성장을 조절하는데 유효하다.
피하, 근육내 및 진피내 투여 경로의 효과를 조사하기 위하여, 피하, 근육내 및 진피내 주사에 의해 유발되는 면역 반응이 대비되었다. 진피내 주사는 판텍 바이오솔루션즈(Pantec Biosolutions)로부터의 플리이즈®(PLEASE®) 기구를 사용해 수행되었다.
마우스는 0.5 또는 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)로 2주 간격으로 세 번 백신접종되었다(0주, 2주 및 4주). 몇몇 림프절을 표적하기 위하여, 1차 및 3차 백신접종은 오른쪽 옆구리에 수행되었고 이에 반해 2차는 왼쪽 옆구리에 행해졌다. SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 및 3차 백신접종 1 주일 후에 혈액 내에서 분석되었다. 도 24는 0.5 nmol (도 24 A) 또는 2nmol (도 24 B)의 Z13Mad5Anaxa로 세 번 (0주(Wk0), 2주(Wk2) 및 4주(Wk4)) 피하, 진피내, 또는 근육내로 백신접종된 C57BL/6 마우스의 혈액 내에서 각 백신접종 후 검출된 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 2차 및 3차 백신접종 7일 후 마우스를 출혈시키고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험).
결과는 평가된 두 용량(0.5 및 2nmol)에서, (i) 실험된 모든 투여 경로는 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하였고 (ii) 피하 백신접종이 가장 강한 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하였음을 나타낸다. 피하 투여에서, 최대 면역 반응은 3차 백신접종 이후 도달되었고 3차 백신접종 이후 여전히 유지되었다. 진피내 및 근육내 백신접종에 의해 유발된 2차 백신 접종 이후 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응은 피하 백신접종에 대비하여 낮았고 3차 백신접종 이후 증가되지 않았다.
다음으로, SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 효과기(effector) 기능 및 탈진(exhaustion) 상태가 KLRG 1 (살해세포 렉틴-유사 수용체 서브패밀리 G 멤버, Killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1) 및 PD-1를 각각 분석함으로써 평가되었다.
이것을 위해, C57BL/6 마우스는 세 번(0주, 2주 및 4주) 피하, 진피내 또는 근육내로 2nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다(cf. 실시예 7). 2차 및 3차 백신접종 7 일후 마우스로부터 혈액을 얻었고 FACS 염색이 수행되었다. KLRG1 및 PD-1 발현은 다량체-양성(multimer-positive) CD8 T 세포에서 분석되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). 결과는 도 25에 나타냈다.
이들 자료는 피하 백신접종 이후 KLRG 1의 발현이 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포를 강하게 증가시키는 것을 나타낸다. 진피내 또는 근육내 백신접종 이후, 관찰된 효과는 더 낮았다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 중 KLRG 1-양성 세포의 백분율은 또한 피하 백신접종 이후 증가되었다(결과 나타내지 않음).
KLRG 1와 상반되게, PD-1 발현은 시간 및 백신접종, 피하 및 근육내 백신접종 경로에 대해,과 함께 감소한다. 이는 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 가 탈진하지 않는 것을 제안한다. SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 중 PD-1양성 세포의 백분율은 또한 피하 및 근육내 백신접종 이후 감소한다 (자료 나타내지 않음). 마우스가 피하로 백신접종되는 경우 PD-1 발현은 2차 백신접종 이후 더 높다는 것에 주목하는 것이 중요하고, 이는 특이적 T 세포의 조기 활성 상태를 반영한다 (Keir, M.E., et al., PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol, 2008. 26: p. 677-704).
후기 탈진(late exhaustion) 마커 Tim-3의 발현 또한 분석되었다. 모드 그룹에서 매우 낮은 발현이 관찰되었다.
종합하면, 결과들은 피하 백신접종은 근육내 또는 진피내 주사에 대비하여 가장 좋은 특이적 CD8 면역 반응을 유발하는 것을 나타낸다.
실시예 14: 결절내 투여 경로
이전 실험(실시예 13)에 기초하여, 결절내 투여 경로가 추가적으로 조사되었다. 이것을 위해, Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 결절내 주사에 의해 유발된 면역 반응이 조사되었다.
이 목적을 위해, 마우스들은, 예를 들어 Jewell, C.M., S.C. Lopez, and D.J. Irvine, In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection of adjuvant-releasing polymer particles. Proc Natl Acad Sci US A, 2011. 108(38): p. 15745-50에 기술된 것 처럼, 손쉽게 림프절을 영상화하고 침습적인 수술없이 결절로 주사할 수 있도록 먼저 에반 블루(Evans Blue)가 피하로 주사되었다.
C57BL/6 마우스는 두 번 매 2주 마다 (0주(Wk0) 및 2주(Wk2)) 결절내로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)로 백신접종되었다. 1차 백신접종은 오른쪽 서혜부(inguinal) 림프절에 수행되었고, 반면에 2차 백신접종은 왼쪽 서혜부 림프절에 행해졌다. 2차 백신접종 7일 이후 마우스로부터 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 마우스 3마리). 다른 말로, SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 백신접종 1주일 이후 혈액에서 분석되었다. 도 26은 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 반응을 보여준다. 이들 자료는 결절내 주사도 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포를 유발할 수 있었다는 것을 나타낸다
실시예 15: 백신접종 일정
백신접종 일정 평가는 상기 기술된 것과 동일한 Z13Mad5Anaxa 구성물(cf. 실시예 7)을 사용한 3차 백신접종의 효과를 확인하기 위한 목적으로 시작되었다. 이전 결과를 고려하여 피하 경로가 선택되었다.
실험에서 처음 두 백신접종은 0주(wk0) 및 2주(wk2)에 3차 백신접종은 4주(wk4) (도 27A) 또는 8주 (도 27B)에 수행되었다. 따라서, C57BL/6 마우스는 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 세 번 백신접종되었다(도 27A 내지 C: Wk0, Wk2 및 Wk4 및 도 27 B 내지 D: Wk0, Wk2 및 Wk8). 마지막 백신접종 7일 이후 마우스로부터 혈액을 얻었고 펜타머 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험). 그에 따라서, SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 및 3차 백신접종 1 주일 후에 분석되었다(도 27A 및 B). 추가적으로, SIINFEKL-특이적 T 세포의 효과기 기능(effector function)은 특이적 CD8 T 세포에서의 KLRG 1의 발현을 분석하는 것에 의해 평가되었다 (도 27C 및 D).
자료는 대조군과 대비하여 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율이 실험된 모든 시간 지점(Vac2 및 Vac3)은 물론 두 백신접종 일정 모두에서(도 27A 및 B) 유의적으로 증가하였다는 것을 나타낸다.
흥미롭게도, 4주차 3차 백신접종은 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율의 가장 두드러지게 증가를 허용하였다 (도 27A). 동일한 세포는 또한 더 높은 KLRG 1 발현을 통한 향산된 효과기 기능을 입증한다 (도 27C). 이와 반대로, 8주차에 3차 백신접종이 수행되어도 SIINFEKL-특이적 면역 반응 및 KLRG 1 발현에서 2차에서부터 3차 백신접종까지의 향상이 관찰되지 않았다.
종합하면, 이들 결과는 CD8 면역 반응이 2차 및 3차 백신접종 사이 지연의 단축에 의해 증가될 수 있다는 것을 나타낸다.
조기 3차 백신접종이 면역 반응을 증가시킬 수 있다는 것을 고려하여, 다음 연구에서 두 개의 백신접종 단기 일정이 조사되었다:
i) 0일, 3일 및 7일차의 세 번 백신접종 및
ii) 0일, 7일 및 14일차의 세 번 백신접종.
또 다시, C57BL/6 마우스가 사용되었고 백신접종은 피하로 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)로 수행되었다. 다량체 염색이 2차 및 3차 백신접종 1주일 후에 얻은 혈액 샘플에서 수행되었다(그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험).
따라서, SIINFEKL-특이적 CD8+ T 세포 반응은 2차 및 3차 백신접종 1주일 후에 분석되었다(도 28A 및 D). 추가적으로, SIINFEKL-특이적 T 세포의 효과기 기능은 특이적 CD8 T 세포에서의 KLRG 1의 발현의 분석에 의해 (도 28B 및 28E) 및 특이적 T 세포의 PD-1 발현 분석에 의한 탈진 상태에 의해 평가되었다 (도 28C 및 28F).
자료는 - 상기 기술된 백신접종 일정에 관한 첫 연구와 유사하게 - 대조군과 대비하여 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율이 실험된 모든 시간 지점(Vac2 및 Vac3)은 물론 두 백신접종 일정 모두에서(도 28 A 및 B) 유의적으로 증가하였다는 것을 나타낸다.
하지만, 0주-2주-4주(wk0-wk2-wk4) 일정과 대비하여, 0일(Day0), 3일(Day3) 및 7일(Day7)차 백신접종 일정은 이러한 높은 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발하지 않았다. 0일(Day0), 7일(Day7) 및 14일(Day14)차 백신접종 일정과 관련하여, 유발된 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포 면역 반응은 이전 일정(d0-d3-d7)과 대비하여 더 높으나 3차 백신접종 이후 유지되지 않는다.
종합하면, 백신접종 일정 자료 셋트는 0주-2주-4주 백신접종 일정이 높은 효과기 기능과 함께 효능있는 OVA-특이적 CD8 면역 반응을 유도하기 위한 가장 좋은 백신접종 일정이라는 것을 나타낸다.
실시예 16: TLR 작용제- CPP 접합체 구성물의 포유류 항원-제시 세포(APC) 활성화 능력
본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체 중의 두 성분, CPP 성분 및 TLR 작용제 성분의 효과를 조사하기 위해, 상기 기술된 것처럼(cf. 실시예 1, 2 및 7) 또다시 융합 단백질이 사용되었다.
추가적으로, 부가적 "대조 펩타이드"(control peptide)가 디자인 되었고, 이는 또한 융합 단백질이고 단백질 "MAD5"를 포함하고, 이는 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프, 및 TLR2 펩타이드 작용제 "Anaxa"로 (즉 세포 투과 펩타이드 없이) 이루어진다. 그에 따라서, 하기 대조군 구성물이 추가적으로 디자디인되었다:
Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE
[SEQ ID NO: 32]
분자량: 13933 Da
특성:
- Mad5 카르고는 OVACD4, gp100CD8, EalphaCD4 및 OVACD8 에피토프를 포함
- C-말단 위치내 아넥신(Annexin) 35-mer 펩타이드 포함
- 저장 완충액: 50 mM 트리스-염산, 150 mM 염화나트륨, 10% 글리세롤, 2 mM DTT, 0.5 M L-아르기닌, pH 8
- 내독성 수준: Batch 1 - 12.15 EU/mg
본 연구의 목적은 본 발명에 따른 두 개의 예시적인 복합체의 능력을 평가하는 것으로, 다시 말해 EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1) 및 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의, 세포 투과 펩타이드 성분 Z13 (Mad5Anaxa, cf. 상기; EDAMad5, cf. 실시예 2) 또는 TLR 작용제 (Z13Mad5, cf. 실시예 1)를 결여하는 기준 복합체(reference complex)와 대비하여 항원-제시 세포 활성을 촉진하는 것이다.
이것을 위해, 상기 언급된 구성물의 항원-제시 세포(APC) 활성화를 촉진하는 능력은 골수-유래 수지상 세포(bone marrow-derived dendritic cells, BMDCs)에서 평가되었고, 이는 TLR7을 제외하고 모든 TLR을 발현한다.
BMDCs가 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7), Mad5Anaxa (cf. above), Z13Mad5 (cf. 실시예 1), EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1) 또는 EDAMad5 (cf. 실시예 2)로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다.
APC 활성화는 BMDCs의 배양 현탁액 내 IL-6의 분비를 관측하는 것에 의해 조사되었다. IL-6 분비는 ELISA에 의해 현탁액 내에서 수량화되었다.
결과는 도 29에 나타냈다. 이들 자료는 Z13Mad5Anaxa는 BMDC를 활성화할 수 있었고, 반면에 Z13Mad5 또는 Mad5Anaxa의 존재하에 세포가 배양되는 경우 이러한 활성화가 관찰되지 않았음을 분명하게 보여준다. 이는 단지 TLR 작용제 (Anaxa 또는 EDA)가 대식세포 및 수지상 세포의 활성화에 중대할 뿐만 아니라, CPP도 또한 필요하다는 것을 제안한다. 또한 TLR 작용제 없는 CPP의 존재로는 충분하지 않고, 정말로, CPP 및 TLR 작용제 모두 대식세포 및 수지상 세포의 활성화에 중대하다.
이들 결과는 또 다른 세포주, 다시 말해 Raw 264.7 마우스 대식세포 세포주를 사용하여 확인되었고, 이는 TLR5를 제외한 모든 TLRs을 발현한다(Applequist, S.E., R.P. Wallin, and H.G. Ljunggren, Variable expression of Toll-like receptor in murine innate and adaptive immune cell lines. Int Immunol, 2002. 14(9): p. 1065-74).
Raw 264.7 세포는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7), Mad5Anaxa (cf. above) 또는 Z13Mad5 (cf. 실시예 1) 로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다.
Raw 264.7 세포에서 APC 활성화는 Raw 264.7의 배양 현탁액 내 TNF-α의 분비를 관측하는 것에 의해 조사되었다. TNF-α 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다. 결과는 도 30에 나타냈다.
CPP는 분자의 세포 내로의 유입을 용이하게 할 수 있고, 세포속 TLR의 더 좋은 표적화를 허용하는 것으로 생각된다.
종합하면, 자료는 CPP 및 TLR 작용제, 모두의 접합체 구성물 내 APC를 활성화하는 중대한 역할을 드러낸다. 이 효과는 구성물의 세포 내로의 유입을 돕는 것에 의한 것일 수 있고, 그리하여 세포속 TLR의 최적 표적화를 초래한다.
실시예 17: 접합체 구성물의 인간 TLR에 결합하는 능력
최근 Anaxa 펩타이드는 TLR2를 통한 시그널링에 의한 보조 활성을 보유하고 (WO 2012/048190 A1), 반면에 EDA 펩타이드는 TLR4에 대한 천연 리간드인 것으로 나타났다 (Okamura, Y., et al., The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4. J Biol Chem, 2001. 276(13): p. 10229-33).
게다가, 상기 실시예 8 및 도 14에 나타난 것처럼, Anaxa를 TLR 작용제로 포함하는 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체, 예를 들면 Z13Mad5Anaxa는 인간 TLR2에 결합하고 HEK-hTLR2 세포에 의한 IL-8의 분비를 촉진할 수 있다 (cf. 실시예 8, 도 14).
본 연구에서, Anaxa 펩타이드를 TLR 작용제로 또는 EDA 펩타이드를 TLR 작용제로 포함하는 본 발명에 따른 복합체의 인간 TLR4에 결합하는 능력이 평가되었다. 이것을 위해, 인간 TLR4 (HEK-hTLR4)로 핵산전달감염된 HEK 세포는 편평 96-웰 플레이트내 배양 배지내에 접종되었고, 1 μM의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7), Mad5Anaxa (cf. above), Z13Mad5 (cf. 실시예 1), EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1) 또는 EDAMad5 (cf. 실시예 2)로 촉진되었고 24시간 동안 37℃에서 배양되었다. IL-8 분비는 ELIZA에 의해 현탁액내에서 수량화되었다.
결과는 도 31에 나타냈다. 예상대로, HEK-hTLR4의 EDAZ13Mad5와 함께 배양은 놀랄만한 IL-8 분비를 초래하였고, EDAZ13Mad5의 TLR4에 대한 결합을 나타낸다. 실시예 16에서 얻은 결과와 긴밀하게, EDAMad5의 (CPP 없는) IL-8 분비는 EDAZ13Mad5에 대비하여 놀랄만하게 낮았고, CPP 존재의 효과를 보여준다. Z13Mad5 구성물은, TLR 작용제를 포함하지 않았고, IL-8 분비를 보여주지 않았고, - 예상대로- TLR4에 대한 결합의 결여를 나타낸다.
흥미롭게도, HEK-hTLR4의 구성물 Z13Mad5Anaxa와의 배양은 가장 확연한 IL-8 분비를 초래하였고, Z13Mad5Anaxa의 TLR4에 대한 결합을 나타낸다. 이는 Anaxa가 이전에는 TLR2 작용제인 것으로 가정되었기 때문에 매우 놀라운 것이다. 또 다시, 동일한 구성물은 단 CPP (Mad5Anaxa) 없이 IL-8 분비를 놀랄만하게 낮추는 결과를 초래하였고, 실시예 16에서 얻은 결과를 확인하였다.
종합하면, 이들 자료는 (i) 실시예 16에서 얻은 자료를 확인하고, (ii) EDA는 정말로 TLR4 작용제라는 것을 확인하고, 및 (iii) 놀랍게도 Anaxa 펩타이드 또한 TLR4 작용제라는 것을 보여준다 (TLR2 작용제인 것에 추가로, cf. 실시예 8 및 도 14).
실시예 18: 폐 전이 모델에서 종양 성장에 대한 백신 효능 - 준-치료적 환경: TLR 작용제 EDA
본 연구는 실시예 6에 기초하고, 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체의 효능을 보여주는, 다시 말해 EDAZ13Mad5, 예방 환경 내 흑색종 폐 전이 모델이다(cf. 도 13).
본 연구에서 동일한 폐 전이 모델은 물론 구성물 단백질 EDAZ13Mad5 및 Z13Mad5 + MPLA가 사용되었다(cf. 구성물의 디자인은 실시예 1 및 2). 하지만, 준-치료적 환경에서, C57BL/6 마우스는 종양 세포가 이식되는 것과 동시에 (d0), 그리고 2차를 위해, 이식 후 9일(d9)에 백신접종되었다. 백신접종은 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA로 피하로 오른쪽 옆구리에 수행되었다. 0일(day 0)차에, 마우스는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (d0 및 d9) 피하 주사에 의해 2 nmol의 EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (EDA 등분자) 또는 MPLA 단독으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 마우스는 13일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 결과는 도 32에 나타냈다.
결과는 EDAZ13Mad5이 Z13Mad5 + MPLA보다 흑색종 전이의 성장 억제에 살짝 더 효능있다는 것을 보여준다. 추가적으로, MPLA 단독 투여된 마우스에서 보조 효과는 관찰되지 않았다.
EDAZ13Mad5 및 Z13Mad5 + MPLA, 모두 예방적 및 준치료적 환경에서 폐 내 종양 전이의 성장을 유의적으로 억제하였다.
실시예 19: 폐 전이 모델에서 백신 효능 - 준-치료적 환경: TLR 작용제 Anaxa
본 연구는 동일한 모델 (준치료적 환경) 및 실험 일정과 함께 실시예 18에 기초한다. 하지만, "Anaxa" 펩타이드를 TLR 작용제로 포함하는 본 발명에 따른 복합체의 효과가 평가되었다 - 실시예 18에서의 EDA TLR 작용제 대신.
이것을 위해, C57BL/6 마우스는 정맥내로 1x105 B16-OVA 흑색종 종양 세포가 이식되었고 두 번 (0일 및 9일) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa 또는 Z13Mad5 + Pam3CSK4 (Anaxa 등분자)으로 피하로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 마우스는 21일차에 희생되었고 폐가 회수되었다. 각 폐에서 전이 병소의 수가 계산되었다. 결과는 도 33에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa는 Z13Mad5 + Pam3CSK4 보다 흑색종 전이 성장을 억제하는 데 지각할 수 있게 더 효능이 있다는 것을 보여둔다. 반대로, Mad5Anaxa는 폐 내 전이 성장을 조절할 수 없었고, 다시 CPP의 중요성을 강조한다.
전체로서, B16-OVA 폐 전이 실험은 Z13Mad5Anaxa가 폐 내 흑색종 전이의 성장을 억제하는 데 매우 유효했다는 것을 보여주었다.
실시예 20: 교모세포종 모델에서 백신 효능
본 연구에서, 또 다른 암 모델, 다시 말해 교모세포종 모델이 사용되었다. 신경아교종은 성인에서 원발성 뇌암의 가장 빈번한 형태이고, 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)과 함께 가장 치명적이다. 이 종양은 그의 침습적이고 공격적인 행동으로 악명이 높다. 현재, GBM에 대한 최고의 치료법은 수술, 화학요법 및 방사선요법의 조합을 관여하는 요법으로, 이는 오직 14.6 개월의 평균생존기간(median survival period) 을 갖는다. 신경아교종 환자의 예후를 향상시키는 새로운 치료 기법에 대한 긴급하고, 충족되지 않은 의료적 필요가 존재한다. T-세포 매개된 면역요법, 특히 고칩습적 GBM은 신경아교종에 대한 현존하는 기법과 함께 조합하여 사용하기에 개념적으로 매력적인 치료 옵션이다.
Gl261 신경아교종은 발암원-유도 마우스 신경아교종 모델이다. 이 모델은 면역능력이 있는 동물에서 개발된 몇 안되는 뇌 종양 모델의 하나를 대표하고, human GBM과 유사한 성장 특성을 가진다(Newcomb, E. and D. Zagzag, The murine GL261 glioma experimental model to assess novel brain tumor treatments, in CNS Cancer Models, Markers, Prognostic, Factors, Targets, and Therapeutic Approaches, Van Meir, Editor. 2009, Humana Press: Atlanta. p. 227-241; Jacobs, V.L., et al., Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro, 2011. 3(3): p. e00063). C57BL/6 마우스에서 두개내로 이식된 Gl261 세포의 낮은 수가 두개내 종양을 형성하였다 (Zhu, X., et al., Poly -/ CLC promotes the infiltration of effector T cells into intracranial gliomas via induction of CXCL10 in IFN -alpha and IFN -gamma dependent manners. Cancer Immunol lmmunother, 2010. 59(9): p. 1401-9; Zhu, X., et al., Toll like receptor-3 ligand poly -/ CLC promotes the efficacy of peripheral vaccinations with tumor antigen-derived peptide epitopes in murine CNS tumor models. J Transl Med, 2007. 5: p. 10). 상기 세포는 중간 정도로 면역성이다: 그들은 종양 위치에서 종양-특이적 면역 반응을 유발할 수 있다. 하지만, 상기 종양-특이적 면역 세포는 종양 제거를 완전하게 할 수는 없다.
최근에, M. Ollin은 새로운 Gl261 모델(Ohlfest, J.R., et al., Vaccine injection site matters: qualitative and quantitative defects in CDB T cells primed as a function of proximity to the tumor in a murine glioma model. J Immunol, 2013. 190(2): p. 613-20)을 이는 Gl261 세포주를 "쿼드 카셋트"(Quad Cassette)로 핵산전달감염하는 것에 의해 발생시켰고 H-2b 클래스 I 또는 II 분자에 의해 제시되는 네 개 펩타이드를 발현한다: 인간 gp10025 -33, 닭 OVA257 -264, 닭 OVA323-339, 및 마우스 I-Eα52 -68. 상기 Quad-Gl261 세포주는 또한 안정적으로 루시퍼라아제를 발현하고, 이는 생물발광에 의한 종양 성장의 추적을 허용한다.
본 연구의 목적은 Quad-Gl261 교모세포종 모델에서 본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체의 효능을 평가하는 것이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 복합체, 다시 말해 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 효과가 상기 기술된 교모세포종 모델에서 평가되었다. 종양 위치에서의 T 세포 귀소(homing)는 그리하여 Z13Mad5Anaxa 백신으로 두번 (1주(Wk1) 및 3주(Wk3)) 백신접종된 Gl261-Quad 종양-내포 마우스에서 분석되었다. Z13Mad5 및 Anaxa (Z13Mad5Anaxa 등분자)으로 별도로 투여되어 백신접종된 그룹이 대조군으로 사용되었다. 간략히, C57BL/6 마우스는 두개내로(intracranially) 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (이식 후 7일(d7) 및 21일(d21) 후에) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었다. 4주(Wk4) 차에, 혈액 및 두뇌 침윤 백혈구(brain infiltrating leukocytes, BILs)가 분석되었고, 여기서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 5-8마리 마우스). 결과는 도 34에 나타냈다.
일반적으로, SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 낮은 빈도가 혈액 내에서 수량화되었다. 하지만, SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 높은 백분율이 Z13Mad5Anaxa-백신접종된 마우스의 혈액 내에서 관찰되었다. 모든 그룹에서, BILs 내 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 지각할 수 있게 더 강한 축적이 있었다.
Z13Mad5Anaxa로 두 번 백신접종한 후, BILs 내 SIINFEKL-특이적 세포 CD8+ T 세포의 빈도(24%)는 Z13Mad5 + Anaxa (12%)보다 2배 더 높다.
다음으로, 사이토킨 분비가 평가되었다. 이것을 위해, C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol 의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다. 결과는 도 35에 나타냈다.
이질성에도 불구하고, Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스의 두뇌-침윤 CD8 T 세포에서 사이토킨 분비의 높은 수준이 관찰되었다. 이들 결과는 Z13Mad5Anaxa 백신이 종양-내포 마우스의 두뇌에서 효능있는 효과기 기능과 함께 더 강한 SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있었다는 것을 입증한다.
상기 얻어진 결과는 Z13Mad5Anaxa는 높은 두뇌 침윤 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하는 데 유효하다는 것을 나타낸다. Z13Mad5Anaxa는 두뇌 내 항원-특이적 CD8 T 세포에 의한 사이토킨의 분비를 촉진할 수 있다.
실시예 21: Gl261-Quad 교모세포종 모델에서 생존에서의 백신 효능
독립적인 실험에서, 대조군 및 Z13Mad5Anaxa-vaccinated 마우스의 생존이 관측되었다. 치료적 환경은 세 번 연속 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 두개내로 종양 이식 후 7일, 21일 및 35일차에 백신접종이다.
C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 세 번 (7일(d7), 21일(d21) 및 35일(d35)) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 백신접종되었다. 마우스는 매일 중량 측정되었고 중량 감소가 15% 이상 도달하였을 때 희생되었다. 결과는 도 36에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa 치료적 백신접종이 대조군 보다 평균 생존이 10일 연장되어 더 유효하다는 것을 보여준다.
실시예 22: 피하 종양 모델에서 백신 효능 - 예방적 환경
본 연구는 도 17 - 19에 보여진 실시예 10에서 얻어진 결과에 기초한다.
실시예 7 종양 성장 조절에서 디자인된 Anaxa-접합 구성물 단백질의 효과를 평가하기 위하여, 벤치마크 종양 모델, 다시 말해 EG.7-OVA 가슴샘종(thymoma) 세포의 피하 이식이 사용되었다. 백신접종이 5일 및 13일차에 수행된, 실시예 10과 반대로, 본 연구에서는 예방적 환경이 평가되었고, 여기서 마우스는 종양 이식 21일 및 7일 전에 백신접종되었다.
C57BL/6 마우스는 두 번 (d-21 및 d-7) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었고 이후 0일(day0)차에 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었다.
상기 결과는 도 37에 종양 부피 (도 37A) 및 생존율 (도 37B)과 함께 보여졌다. 이 자료는 Z13Mad5Anaxa로의 예방적 백신접종은 종양 성장 조절 및 생존율에 매우 유효하다는 것을 보여준다. 종양 부피는 Z13Mad5Anaxa로 처치된 마우스에서 대조군 마우스에 대비하여 매우 유의적으로 감소하였다. 생존율은 Z13Mad5Anaxa로 처치된 마우스에서 대조군 마우스에 대비하여 매우 유의적으로 증가하였다.
실시예 23: 피하 종양 모델에서 백신 효능 - 확립된 종양의 치료적 환경
본 연구는 도 17 - 19에 보여진 실시예 10에서 얻은 결과 및 도 37에 보여진 실시예 22에서 얻은 결과에 기초한다. 종양에서 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7)의 효과를 평가하는 것이 본 연구의 목표(goal)이다.
이 목적을 위해, B16-OVA 흑색종 세포의 피하 모델이 사용되었다. 본 모델에서 종양 세포는 천천히 펼쳐지고, 그리하여 더 큰 백신접종 시간창(time window)을 허용한다.
저용량의 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로의 1차 백신접종은 종양이 확립되고 가시적으로 되면 즉 종양 이식 후 14일차에 수행되었다. 2차 백신접종은 21일차에 행해졌다.
따라서, C57BL/6 마우스는 피하로 1x105 B16-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 번 (14일(d14) 및 21일(d21)) 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다. 종양 성장 및 생존곡선이 관측되었다. 결과는 도 38에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa는 확립되고 가시적인 종양의 성장을 효과적으로 조절한다는 것을 나타낸다. 게다가, 확립되고 가시적인 종양에도 불구하고 Z13Mad5Anaxa로 처리된 마우스에서 대조군에 대비하여 생존율이 증가하였다.
실시예 24: 피하 종양 모델에서 백신 효능 - 치료적 환경: CPP의 효과
본 연구의 프로토콜은 실시예 10에 기술된 연구에 상응하고, 추가 그룹 "Mad5Anaxa" (cf. 실시예 16) 이 평가되었다는 것이 차이난다.
간략히, 벤치마크 종양 모델이 사용되었고, 다시 말해 EG.7-OVA 가슴샘종 세포의 피하 이식이다. C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었다. 종양 이식 후, 7마리 마우스 그룹은 각각 피하로 오른쪽 옆구리에 5일 및 13일차에 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 Mad5Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었고 대조군 그룹에 대비되었다. 종양 크기는 캘리퍼로 측정되었. 결과는 도 39에 나타냈다.
상기 결과는 Z13Mad5Anaxa로 처리된 마우스가, 대조군 마우스 및 Mad5Anaxa, 즉 CPP 없는 구성물,로 처리된 마우스, 양자 모두에 대비하여 유의적으로 감소된 종양 부피 및 유의적으로 증가된 생존율을 보였다는 보여준다. 이들 결과는 CPP의 존재는 종양 부피의 유의적으로 감소된 종양 부피 및 유의적으로 증가된 생존율, 즉 백신접종의 증가된 효능을 초래한다는 것을 나타낸다. 그리하여, 상기 결과는 - 실시예 10에서 얻은 결과와 함께 - CPP 및 TLR 작용제의 존재는 종양 성장 및 생존율에 상승적 효과를 행사한다는 것을 나타낸다.
실시예 25: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체의 면역반응 역학(kinetic) 대비
본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내 상이한 CPP의 효과를 조사하기 위해 상기 기술된 융합단백질 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7) 이 사용되었다.
추가로, 부가적 융합 단백질이 디자인되었고, 이는 Z13 외에 CPPs를 포함한다 - 다시 말해 Z14 (SEQ ID NO: 7) 또는 Z18 (SEQ ID NO: 11). 이들 융합 단백질은 또한 단백질 "MAD5"을 포함하고, 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프, 및 TLR2 펩타이드 작용제 "Anaxa"로 이루어진다. 그에 따라서, 하기 구성물이 추가적으로 디자인되었다:
Z14Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GSSTVHEILC KLSLEGDHST PPSAYGSVKP YTNFDAE
(SEQ ID NO: 33)
Z18Mad5Anaxa
서열:
MHHHHHHREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG SSTVHEILCK LSLEGDHSTP PSAYGSVKPY TNFDAE
(SEQ ID NO: 34)
C57BL/6 마우스는 여덟 개 상이한 그룹에 할당되었다 (그룹당 4마리 마우스): 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa를 받는 세 개 그룹 및 그 대조군 및 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa을 받는 세 개 그룹 및 그 대조군. 마우스는 다섯 번 (0주(Week0), 2주(Week2), 4주(Week4), 6주(Week6) 및 8주(Week8)) 피하로 백신접종되었다. 2차, 3차, 4차 및 5차 백신접종 후 7일에 마우스를 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험).
결과는 도 40에 나타내었다. Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa 또는 Z18Mad5Anaxa로 백신접종된 모든 그룹이 대조군 그룹에 대비하여 다량체-양성 세포의 증가된 백분율을 보여주었다 (Z18Mad5Anaxa의 2차 백신접종 제외). 이들 결과는 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 본 발명에 따른 복합체가 상이한 용량에서 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 26: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체와의 T 세포 면역 반응 대비
CD8 T 세포 면역 반응을 더 상세히 조사하기 위하여, C57BL/6 마우스는 세 개의 상이한 그룹에 할당되었다 (그룹당 3 - 4마리 마우스): 비투여(naive), Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa.
Z13Mad5Anaxa 그룹 및 Z14Mad5Anax 그룹의 C57BL/6 마우스는 다섯 번(0주(Week0), 2주(Week2), 4주(Week4), 6주(Week6) 및 8주(Week8)) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7) 또는 Z14Mad5Anaxa (cf. 실시예 25)로 백신접종되었다. 5차 백신접종 9일 후, 마우스는 희생되었고, 기관들은 회수되었고, 비장, 골수 및 배출 림프절(draining lymph nodes) (서혜부 및 겨드랑) 내 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 백분율을 확인하기 위해 다량체 염색이 수행되었다.
결과는 도 41에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스는 다량체-양성 세포의 유사한 증가, 특히 비장, 골수 내는 물론 배출 림프절 내 살짝 증가를 보여주었다.
상이한 CPPs와 복합체로 백신접종 이후 CD8 T 세포 효과기 기능을 부가 조사하기 위해, 상기 기술된 동일한 마우스의 그룹 내에서 SIINFEKL OVACD8 펩타이드(SEQ ID NO: 35)로 자극되고 5차 백신접종 9일 후 비장세포에서 IFN-γ 생산 세포를 수량화하기 위해 엘리스팟(Elispot) 분석이 수행되었다.
그 결과는 도 42A에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스는 비투여 마우스에 대비하여 IFN-γ 생산 세포의 유의적인 증가를 보여주었다. Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스는 또한 비투여 마우스에 대비하여 IFN-γ 생산 세포의 증가를 보여주었으나, 하지만, 상기 증가는 유의적이지 않았고, 이는 마우스의 적은 수 때문일 것이다 (Z14Mad5Anaxa 그룹 내 마우스 3마리).
상이한 CPPs와 복합체로 백신접종 이후 CD4 T 세포 반응을 조사하기 위해, 상기 기술된 동일한 마우스의 그룹 내에서 OVACD4 펩타이드 (SEQ ID NO: 36) 로 자극되고 5차 백신접종 9일 후 비장세포에서 IFN-γ 생산 세포 수량화하기 위해 엘리스팟 분석이 수행되었다.
그 결과는 도 42B에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스는 비투여 마우스에 대비하여 IFN-γ 생산 세포의 매우 유의적인 증가를 보여주었다. Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스는 또한 비투여 마우스에 대비하여 IFN-γ 생산 세포의 증가를 보여주었으나, 하지만, 상기 증가는 유의적이지 않았고, 이는 마우스의 적은 수 때문일 것이다 (Z14Mad5Anaxa 그룹 내 마우스 3마리)
추가로, 상기 기술된 그룹의 마우스에서, SIINFEKL OVACD8 펩타이드 (SEQ ID NO: 35)로 자극된 비장세포에서 CD107a+IFN-γ+ TNF -α+ 세포를 확인하는 세포속 염색이 수행되었다. 결과는 도 43에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa로 또는 Z14Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스는 CD107a+IFN-γ+TNF-α+ 세포의 유사한 증가를 보였다.
실시예 27: EG.7-OVA 피하 모델에서 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체의 종양 성장 및 생존에 대한 효과 대비
상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체의 종양 성장 및 생존에 대한 효과를 조사하기 위하여 EG.7-OVA 피하 모델이 사용되었다. 0일에 C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 세 개 상이한 그룹에 할당되었다 (비투여, Z13Mad5Anaxa 및 Z14Mad5Anaxa). 마우스는 두 번 종양 이식 5일 및 13일 후에 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다.
결과는 도 44에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa 또는 Z14Mad5Anaxa로의 백신접종은 대조군 마우스에 대비하여 유의적으로 감소된 종양 부피는 물론 (도 44 A) 대조군 마우스에 대비하여 유의적으로 증가된 생존율을 초래하였다 (도 44 B). 이들 결과는 두 복합체, Z13Mad5Anaxa 및 Z14Mad5Anaxa,가 종양 성장을 유의적으로 감소시키고 생존을 유의적으로 연장시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 28: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체로 백신접종 후 면역 반응의 대비
본 실험에서 본 발명에 따라 사용하기 위한 상기 복합체 내 상이한 CPPs의 효과가 TLR 작용제 "EDA"를 갖는 복합체를 사용하여 조사되었다. 그리하여, 상기 기술된 융합 단백질 EDAZ13Mad5 (cf. 실시예 1)이 사용되었다.
추가로, 부가적 융합 단백질이 디자인되었고, 이는 Z13 외에 CPPs를 포함한다 - 다시 말해 Z14 (SEQ ID NO: 7) 또는 Z18 (SEQ ID NO: 11). 이들 융합 단백질은 또한 단백질 "MAD5"을 포함하고, 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프, 및 TLR4 펩타이드 작용제 "EDA"로 이루어진다. 그에 따라서, 하기 구성물이 추가적으로 디자인되었다:
EDAZ14Mad5
서열:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTKRY KNRVASRKSR AKFKQLLQHY REVAAAKESL KISQAVHAAH AEINEAGREV VGVGALKVPR NQDWLGVPRF AKFASFEAQG ALANIAVDKA NLDVEQLESI INFEKLTEWT GS
(SEQ ID NO: 37)
EDAZ18Mad5
서열:
MHHHHHHNID RPKGLAFTDV DVDSIKIAWE SPQGQVSRYR VTYSSPEDGI RELFPAPDGE DDTAELQGLR PGSEYTVSVV ALHDDMESQP LIGIQSTREV AAAKSSENDR LRLLLKESLK ISQAVHAAHA EINEAGREVV GVGALKVPRN QDWLGVPRFA KFASFEAQGA LANIAVDKAN LDVEQLESII NFEKLTEWTG S
(SEQ ID NO: 38)
C57BL/6 마우스는 여덞 개 상이한 그룹에 할당되었다 (그룹당 4 마리 마우스): 2 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5를 받는 세 그룹 및 그 대조군 및 0.5 nmol의 EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5를 받는 세 그룹 및 그 대조군 그룹. 마우스는 세 번 (0주(Week0,) 2주(Week2) 및 4주(Week4)) 피하로 백신접종되었다. 마우스는 2차 및 3차 백신접종 7일 후 출혈시켰고 다량체 염색이 수행되었다 (그룹당 4마리 마우스로 한 개 실험).
결과는 도 45에 나타냈다. EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 또는 EDAZ18Mad5로 백신접종된 모든 그룹이 대조군 그룹에 대비하여 다량체-양성 세포의 증가된 백분율을 보였다. 이들 결과는 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 본 발명에 따른 복합체가 상이한 용량에서 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 29: EG.7-OVA 피하 모델에서 EDAZ14Mad5의 종양 성장 및 생존에 대한 효과
EDAZ14Mad5의 종양 성장 및 성장에 대한 효과를 조사하기 위해 EG.7-OVA 피하 모델이 사용되었다 (cf. 동일한 모델에서 EDAZ13Mad5의 효과에 대해서는 실시예 4 및 도 9 - 11).
0일(d0)에 C57BL/6 마우스는 피하로 3x105 EG7-OVA 종양 세포가 왼쪽 옆구리에 이식되었고 두 개의 상이한 그룹에 할당되었다 (비투여 및 EDAZ14Mad5). 마우스는 두 번 종양 이식 5일 및 13일 후에 피하 주사에 의해 0.5 nmol의 EDAZ14Mad5로 오른쪽 옆구리에 백신접종되었다.
결과는 도 46에 나타냈다. EDAZ13Mad5와 유사하게 (cf. 실시예 4, 도 9 - 11) EDAZ14Mad5로 백신접종은 대조군 마우스에 대비하여 유의적으로 감소된 종양 부피는 물론 (도 46 A) 대조군 마우스에 대비하여 유의적으로 증가된 생존율을 초래하였다 (도 46 B). 이들 결과는 EDAZ14Mad5는 종양 성장을 유의적으로 감소시키고 생존을 유의적으로 연장시킬 수 있다는 것을 나타낸다 - EDAZ13Mad5와 유사 (cf. 실시예 4, 도 9 - 11).
실시예 30: 교모세포종 모델에서 Z13Mad5Anaxa 융합 구성물의 to Z13Mad5 및 Anaxa 대비 우월한 효능
본 발명에 따른 복합체의 효능을 조사하기 위해 교모세포종 모델이 선택되었다 (cf. 실시예 20). 다시 말해, Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7; SEQ ID NO: 28)이 마우스 한 그룹에 투여되었고, 반면에 Z13Mad5 (SEQ ID NO: 29) 및 Anaxa (SEQ ID NO: 15)은 또 다른 마우스 그룹에 투여(양자 함께)되었다.
종양 위치에서의 T 세포 귀소는 두 번 백신접종된 Gl261-Quad 종양-내포 마우스 (그룹당 7 - 16마리 마우스) 에서 분석되었고, 다시 말해 종양 이식 (day 0) 후 7일 및 21일, 2 nmol Z13Mad5Anaxa 백신이다. Z13Mad5 및 Anaxa (Z13Mad5Anaxa 등분자), 모두로 백신접종된 그룹이 대조군으로 사용되었다. 간력히, C57BL/6 마우스는 두개내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (이식 후 7일 및 21일) 피하 주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol of Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었다. 28일차에, 혈액 및 두뇌 침윤 백혈구(BILs)가 분석되었고, 여기서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포는 혈액내 및 BILs 내에서 28일차에 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 7 - 16마리 마우스).
결과는 도 47에 나타냈다. Z13Mad5 및 Anaxa, 모두를 백신접종된 마우스에 대비하여 Z13Mad5Anaxa-백신접종된 마우스의 혈액 내에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 유의적으로 더 높은 백분율이 관찰되었다 (도 47A). 유사하게, Z13Mad5 및 Anaxa 개별적으로 백신접종된 마우스에 대비하여 Z13Mad5Anaxa-백신접종된 마우스의 BILs 내에서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 더 강한 축적이 관찰되었다 (도 47B, p = 0.0539).
다음으로, 사이토킨 분비가 평가되었다. 이것을 위해, C57BL/6 마우스는 두강내로 5x105 Gl261-Quad 종양 세포가 이식되었고 두 번 (7일 및 21일) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa로 백신접종되었다. BILs은 분리되었고 성숙된 BMDCs의 탑재와 함께 또는 SllNFEKL 펩타이드(SEQ ID NO: 35) 없이 BrefeldinA의 존재하에 사이토킨을 위한 세포속 염색 전에 6시간 동안 배양되었다.
결과는 도 48에 나타냈다. 일반적으로, Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스의 두뇌-침윤 CD8 T 세포에서 사이토킨 분비의 높은 수준이 관찰되었다. 특히, Z13Mad5Anaxa로 백신접종된 마우스의 두뇌-침윤 CD8 T 세포에서 Z13Mad5 및 Anaxa 개별적으로 백신접종된 마우스에 대비하여 총 IFN-γ 및 of IFN-γ 및 TNF-α 모두 유의적으로 더 높은 분비가 관찰되었다.
종합하면, 이들 결과는 Z13Mad5Anaxa 백신이 (Z13Mad5 및 Anaxa 개별적으로 투여에 대비하여) 종양-내포 마우스의 두뇌에서 효능있는 효과기 기능과 함께 더 강한 SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있었다는 것을 입증한다.
상기 얻어진 결과는 Z13Mad5Anaxa는 높은 두뇌 침윤 SIINFEKL-특이적 CD8 면역 반응을 유발하는 데 유효하다는 것을 나타낸다. Z13Mad5Anaxa는 두뇌 내 항원-특이적 CD8 T 세포에 의한 사이토킨의 분비를 촉진할 수 있다.
실시예 31: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
상이한 항원성 카르고 ("Mad8") 의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체 가 디자인되었다 ("Z13Mad8Anaxa"). Z13Mad8Anaxa는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad8Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", 당단백질 70의 CD8 및 CD4 에피토프를 포함하는 항원성 카르고 "MAD8", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함하는 융합 단백질이다. 하기에서, Z13Mad8Anaxa의 아미노산 서열이 밀줄로 표시된 세포-투과 펩타이드 "Z13" 및 이탤릭으로 표시된 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"와 함께 보여졌다:
KRYKNRVASR KSRAKFKQLL QHYREVAAAK SSENDRLRLLLK VTYHSPSYAY HQFERRAILN RLVQFIKDRI SVVQALVLTS TVHEILCKLS LEGDHSTPPS AYGSVKPYTN FDAE
(SEQ ID NO: 39)
비투여 Balb/c 마우스 (그룹당 4마리 마우스)는 네 번 피하로 (0주, 2주, 4주 및 6주 2 nmol의 Z13Mad8Anaxa로 백신접종되었다.
백신접종 후 CD4 T 세포 반응을 조사하기 위하여, 4차 백신접종 1주일 후, 마우스는 희생되었고; 기관은 회수되었고 gp70CD4 펩타이드 (SEQ ID NO: 64) 또는 gp70CD8 펩타이드 (SEQ ID NO: 65)로 자극된 비장세포에서 IFN-γ-생산 에피토프-특이적 CD8 및 CD4 T 세포를 수량화하기 위해 생체외(ex vivo ) 엘리스팟 분석이 수행되었다.
결과는 도 49에 나타냈다. Z13Mad8Anaxa로 백신접종된 마우스는 비투여 마우스에 대비하여 IFN-γ 생산 세포의 유의적인 증가를 보여주었다. 이들 자료는 Z13Mad8Anaxa 백신이 강력한 에피토프-특이적 CD8 및 CD4 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있고 그에 따라서 본 발명에 따른 상기 복합체가 자가-항원 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 32: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
또 다른 상이한 항원성 카르고 ("Mad11")의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체가 디자인되었다 ("Z13Mad11Anaxa"). Z13Mad11Anaxa는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad11Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", 문헌(Derouazi M, Wang Y, Marlu R, et al. Optimal epitope composition after antigen screening using a live bacterial delivery vector: Application to TRP-2. Bioengineered Bugs. 2010;1(1):51-60. doi:10.4161/bbug.1.1.9482)에 기술된 서비빈의 두 CD8 에피토프를 포함하는 항원성 카르고 "MAD11", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함하는 융합 단백질이다. 하기에, Z13Mad11Anaxa의 아미노산 서열을 나타내었다:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(SEQ ID NO: 40)
비투여 C57BL/6 마우스 (그룹당 5 마우스)는 정맥내로 1x105 B16 흑색종 종양 세포 이식되었고 두 번 (0일 및 10일) 피하 주사에 의해 1 nmol의 Z13Mad11Anaxa로 백신접종되었다.
18일차에 마우스는 희생되었고; 기관은 회수되었고 서비빈 펩타이드 서비빈20-28 (SEQ ID NO: 67) 및 서비빈97-104: (SEQ ID NO: 68)로 자극된 비장세포에서 IFN-γ-생산 서비빈-특이적 T 세포를 수량화하기 위해 생체외 엘리스팟 분석이 수행되었다.
그 결과는 도 50에 나타냈다. Z13Mad11Anaxa로 백신접종된 마우스는 비투여 마우스에 대비하여 적은 전이를 보여주었다 (도 50A). 게다가, Z13Mad11Anaxa로 백신접종된 마우스의 비장에서 유의적으로 더 높은 수의 IFN-γ 생산 서비빈-특이적 T 세포가 관찰되었다 (도 49B).
얻은 결과는 Z13Mad11Anaxa이 전이의 수를 감소시키는 데 유효하고 Z13Mad11Anaxa이 비장에서 항원-특이적 CD8 T 세포에 의해 사이토킨 분비를 촉진할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 33: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
또 다른 상이한 항원성 카르고 ("Mad9")의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체가 디자인되었다 ("Z13Mad9Anaxa"). Z13Mad9Anaxa는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad9Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 MC-38 종양 세포주로부터 확인된 신생항원을 포함하는 "Mad9", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함하는 융합 단백질이다. 하기에서, Z13Mad9Anaxa의 아미노산 서열이 밀줄로 표시된 세포-투과 펩타이드 "Z13" 및 이탤릭으로 표시된 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"와 함께 보여졌다:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKHLELASMTNMELMSSIVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(SEQ ID NO: 41)
비투여 C57BL/6 마우스 (그룹당 4마리 마우스)는 네 번 피하로 (0주, 2주, 4주 및 6주에 2 nmol의 Z13Mad9Anaxa로 백신접종되었다. 백신접종 후 CD8 T 세포 반응을 조사하기 위하여, 4차 백신접종 1주일 후, 마우스는 희생되었고, 기관은 회수되었고 adpgk 펩타이드 (SEQ ID NO: 66)로 시험관내 재자극되고 7일 후 비장세포에서 IFN-γ-생산 에피토프-특이적 CD8 T 세포를 수량화하기 위해 생체외 엘리스팟 분석이 수행되었다.
결과는 도 51에 나타냈다. Z13Mad9Anaxa로 백신접종된 마우스는 비투여 마우스에 대비하여 효과기 신생항원-특이적 CD8 T 세포의 유의적인 증가를 보여주었다.
실시예 34: 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 복합체로 백신접종 후 면역반응의 대비
본 실험에서 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 상이한 CPP의 효과가 TLR 작용제 "Anaxa"를 갖는 복합체를 사용하여 조사되었다. 그리하여, 상기 기술된 융합 단백질 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7, SEQ ID NO: 28) 이 사용되었다.
추가로, 부가적 융합 단백질이 디자인되었고, 이는 Lu et al., Multiepitope trojan antigen peptide vaccines for the induction of antitumor CTL and Th immune responses J. Immunol., 172 (2004), pp. 4575-4582에 기술된 퓨린 링커에 조합된 TAT CPP를 포함한다. 그 융합 단백질은 또한 단백질 "MAD5", 이는 다양한 항원에서 유래한 상이한 CD8+ 및 CD4+ 에피토프로 이루어지고, 및 TLR4 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함한다. 그에 따라서, 하기 구성물이 추가적으로 디자인되었다:
TatFMad5Anaxa
서열:
RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAHAEINEAGRRVKRKVPRNQDWLRVKRASFEAQGALANIAVDKARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(SEQ ID NO: 46)
C57BL/6 마우스가 세 개의 상이한 그룹에 할당되었고 (그룹당 8마리 마우스): 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa를 받는 한 그룹, 2 nmol의 TatFMad5Anaxa를 받는 한 그룹 및 그 대조군. 마우스는 두 번 (0주 및 2주) 피하로 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa 또는 2 nmol의 TatFMad5Anaxa로 백신접종되었다. 마우스는 2차 백신접종 7일 후 혈액을 얻었고 다량체 염색이 수행되었다(그룹당 8마리 마우스).
결과는 도 52에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa 또는 TatFMad5Anaxa로 백신접종된 그룹이 대조군 그룹에 대비하여 다량체-양성 세포의 증가된 백분율을 보여주었다. 이들 결과는 상이한 세포 투과 펩타이드를 갖는 본 발명에 따른 복합체가 상이한 용량에서 면역 반응을 유발할 수 있다는 것을 나타낸다. 하지만, ZEBRA (Z13) 에서 유래한 CPP가 TAT CPP 보다 더 우수하다.
실시예 35: 비투여 마우스에서 Z13Mad5Anaxa 융합 구성물의 Z13Mad5 및 Anaxa 대비 우월한 효능
다음으로, 본 발명에 따른 복합체의 효능이 비투여 마우스에서 조사되었다. 다시 말해 Z13Mad5Anaxa (cf. 실시예 7; SEQ ID NO: 28)가 한 그룹의 마우스에 투여되었고, 반면에 Z13Mad5 (SEQ ID NO: 29) 및 Anaxa (SEQ ID NO: 15) 은 또 다른 마우스 그룹에 투여(양자 함께)되었다.
Z13Mad5Anaxa 그룹 및 Z13Mad5 + Anaxa 그룹의 C57BL/6 마우스는 한 번 (Week0) 피하주사에 의해 2 nmol의 Z13Mad5Anaxa (그룹 1) 또는 2 nmol of Z13Mad5 및 2 nmol의 Anaxa (그룹 2)로 백신접종되었다. 14일차에, 혈액이 분석되었고, 여기서 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포가 혈액 내에서 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 4 - 8마리 마우스).
결과는 도 53에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa-백신접종된 마우스의 혈액에서 Z13Mad5 및 Anaxa로 개별적으로 백신접종된 마우스에 대비하여 SIINFEKL-특이적 CD8 T 세포의 유의적으로 높은 백분율이 관찰되었다 (도 53).
종합하면, 이들 결과는 Z13Mad5Anaxa 백신이 (Z13Mad5 및 Anaxa 개별적 투여에 대비하여) 말초에서 더 강한 SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있었다는 것을 입증한다.
실시예 36: 본 발명에 따른 상기 복합체 내 또 다른 항원성 카르고의 효과
부가적으로 상이한 항원성 카르고 ("Mad12")의 효과를 조사하기 위하여, 세포 투과 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 또 다른 복합체가 디자인되었다 ("Z13Mad12Anaxa"). Z13Mad12Anaxa 는 Z13Mad5Anaxa (실시예 7에 기술)와 항원성 카르고가 상이하다. 특히, "Z13Mad12Anaxa"는 세포-투과 펩타이드 "Z13", Yadav et al. Nature. 2014 Nov 27;515(7528):572-6에 의해 MC-38 종양 세포주에서 확인된 신생항원을 포함하는 항원성 카르고 "MAD12", 및 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"를 포함한다. 하기에서, Z13Mad12Anaxa의 아미노산 서열을 보여졌다:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(SEQ ID NO: 69)
비투여 C57BL/6 마우스 (그룹당 4 마우스) 는 두 번 피하로 (0주, 2주) 2 nmol의 Z13Mad12Anaxa로 백신접종되었다. 백신접종 후 CD8 T 세포 반응을 조사하기 위하여, 2차 백신접종 1주일 후, 혈액이 분석되었고, 여기서 신생항원 reps1-특이적 CD8 T 세포가 혈액 내에서 다량체 염색에 의해 수량화되었다 (그룹당 4마리 마우스).
결과는 도 54에 나타냈다. Z13Mad12Anaxa로 백신접종된 마우스는 비투여 마우스에 대비하여 효과기 신생항원-특이적 CD8 T 세포의 유의적인 증가를 보여주었다.
실시예 37: 시험관내 인간 수지상 세포 성숙
본 연구의 목적은 본 발명에 따른 용도를 위한 복합체("Z13Mad5Anaxa", SEQ ID NO: 28, cf. 실시예 7) 의 수지상 세포의 성숙 유도하는 능력을 TLR 펩타이드 작용제를 결여하는 복합체("Z13Mad5", SEQ ID NO: 29, cf. 실시예 1) 에 대비하여 조사하기 위한 것이었다.
Z13Mad5Anaxa 폴리펩타이드 및 Z13Mad5 폴리펩타이드의 인간 수지상 세포(DC) 성숙을 유도하는 능력이 조사되었다. 300nM 단백질과 밤새 배양한 후, 인간 수지상 세포에서의 활성 마커 발현 (CD86, CD80, CD83 및 HLA-DR)이 FACS에 의해 평가되었다 (도 55). 각 단백질의 동일한 완충액 용량이 음성 대조군으로 사용되었다.
결과는 도 55에 나타냈다. Z13Mad5Anaxa는, CD96, HLADR 및 CD83의 상향-조절에서 보여진 것처럼, 인간 수지상 세포 성숙을 유도한 반면에, Z13Mad5는 인간 수지상 세포를 활성화할 수 없었다. 이들 결과는 단백질의 Anaxa 부분이 인간 수지상 세포의 활성화 마커의 상향-조절에 책임이 있다는 것을 나타낸다.
실시예 38: 반복된 백신 접종(vaccination)의 과정에 걸친 CD8 T cell 면역 반응
이펙터 T 세포의 풀이 수개월에 걸쳐 유지될 수 있는지를 조사하기 위해, 반복적인 백신 접종이 수행되었다. 즉, C57BL/6 마우스를 2 nmol의 컨스트럭트 Z13Mad5Anaxa(SEQ ID NO: 28)로 6회(0, 2, 4, 8, 12, 16주) 피하로 백신 접종하였다. 각 백신 접종 후(그리고 일부 백신 접종 전) 마우스를 출혈시키고 펜타머 염색법을 수행하여 혈액 중 OVA-특이적 면역 반응을 모니터링 하였다(그룹 당 4마리의 마우스를 갖는 2가지 실험). 도 56에서, 펜타머 양성 CD8+ T 세포의 백분율을 Z13Mad5Anaxa 백신 접종된 마우스 및 대조 마우스에 대해 나타내었다.
이 데이터는 6회 백신 접종으로 4개월(17주)에 걸쳐, 효과기 T 세포 풀을 유지할 수 있음을 보여준다.
실시예 39: 뮤린 MC38 결장직장암 모델에서의 본 발명에 따른 복합체의 평 가
뮤린 결장직장암 모델에서 본 발명에 따른 복합체의 효과를 평가하기 위해, 뮤린 MC38 결장직장암 모델을 선택하였다. MC38은 결장암 세포주이다.
나이브 C57BL/6 마우스의 좌측 플랭크에 2x105 MC38 종양 세포를 s.c. 이식하고, 우측 플랭크에 2 nmol의 컨스트럭트 Z13Mad11Anaxa(실시예 32, SEQ ID NO: 40 참조)를 피하 주입에 의하여 2회(종양 이식 전 -21일 및 -7일) 백신 접종하였다. "Mad11" 항원 화물은 뮤린 MC38 결장직장 모델에 의해 발현된 2개의 서바이빈 에피토프를 함유한다.
그 결과를 도 57에 나타내었다. Z13Mad11Anaxa로 백신 접종한 마우스는 나이드 마우스와 비교하여 현저히 적은 종양 체적을 나타냈다(도 57A). 더욱이, Z13Mad11Anaxa로 백신 접종된 마우스는 유의하게 높은 생존율을 보였다(도 57B).
얻어진 결과는 Z13Mad11Anaxa가 대조군에 비해 현저히 종양 성장을 감소시키고 지연시킬 수 있었음을 보여준다. 또한 Z13Mad11Anaxa로 백신 접종한 마우스의 생존율이 증가하였다.
실시예 40: 마우스에서의 예비 독성 연구
마우스에서 본 발명에 따른 복합체의 독성을 평가하기 위해, Z13Mad5Anaxa (SEQ ID NO: 28)를 2 nmol로 마우스 중에 s.c. 및 i.v. 주입하였다. 혈액 샘플링은 투여 후 0.5, 1.5 및 3시간에 수행되었다. 상업적인 멀티 플렉스 키트(Luminex)를 혈액 내의 사이토카인의 검출 및 정량화에 사용하였고, 4마리의 마우스를 각 시점에서 샘플링하였다. 그러나, 어떠한 프로-염증성 사이토카인의 발현도 검출될 수 없었다. 멀티 플렉스 키트는 고전적인 ELISA와 비교하여 유사한 결과를 나타내었다(데이터는 표시되지 않음).
다음으로, Z13Mad5Anaxa(SEQ ID NO: 28)의 투여량을 10 nmol까지 증가시켰다. 그러나, s.c. 투여 후에 사이토카인이 검출되지 않았다. s.c. 투여와 대조적으로, i.v. 투여로부터 1.5시간 후에 IL-6 및 TNFα의 일시적인 증가가 관찰되었다. 그러나, 이러한 약간의 증가는 3시간 후에 사라졌다(도 58). 마우스에서 Z13Mad5Anaxa 10 nmol의 피하 주입은 치료 후 6시간까지 어떠한 사이토카인 방출도 유도하지 않았다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 41: MC-38 종양 부위를 향한 T 세포의 귀환(homing)에 대하여, 세포 침투성 펩타이드 , 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 복합체의 효과
세포 침투성 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 복합체가, T 세포를 종양 부위로 귀환시키는 효과를 평가하기 위해, MC-38 종양 모델중의 마우스에 세포 침투성 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 백신 접종하였다 . 27일째, 마우스를 안락사시키고, TILs(종양 침윤 림프구) 중에서 신생항원-특이적 면역 반응을 모니터링 하기 위하여 FACS 염색을 수행하였다.
C57BL/6 마우스(그룹당 4 마리, 암컷, 7주령)의 좌측 플랭크에 2x105 MC-38 종양 세포를 s.c. 이식하였다(0일). 종양 이식 후, "Z13Mad12Anaxa" 그룹 마우스의 꼬리 베이스에 2 nmol의 Z13Mad12Anaxa(실시예 36; SEQ ID NO: 69 참조)를 3, 10 및 17일에 피하 백신 접종하였다.
도 59, 60 및 61에 도시된 바와 같이, 신생 항원-특이적 T 세포는 백신 접종 된 마우스의 종양 부위에 축적된다. 멀티머-양성 세포의 백분율은 Z13Mad12Anaxa로 백신 접종된 마우스에서 현저하게 증가했다. 멀티머-양성 세포 중 가장 낮은 백분율이 대조군 마우스에서 발견되었다.
실시예 42: 인간 컨 스트럭트에 의한 인간 수지상 세포 활성화
본 연구의 목적은 인간 수지상 세포의 성숙을 유도하기 위해 상이한 인간 항원 화물을 포함하는 본 발명에 따른 상이한 복합체의 능력을 조사하는 것이었다. 이를 위하여 컨스트럭트 ATP110 (SEQ ID NO: 72), ATP112 (SEQ ID NO: 74), ATP115 (SEQ ID NO: 77), ATP117 (SEQ ID NO: 79), ATP118 (SEQ ID NO: 80), ATP119 (SEQ ID NO: 81), ATP120 (SEQ ID NO: 82), ATP122 (SEQ ID NO: 84), ATP123 (SEQ ID NO: 85), 및 ATP125 (SEQ ID NO: 87)의 각각을 시험하였다. DC 활성화의 평가에 사용된 생물학적 지시자는 4가지 멤브레인 항원, 즉 HLA-DR, CD80, CD83 및 CD86의 발현 강도에 기초한 활성화 백분율을 나타내는 활성화 지수였다.
상기 언급된 컨스트럭트(ATP110 (SEQ ID NO: 72), ATP112 (SEQ ID NO: 74), ATP115 (SEQ ID NO: 77), ATP117 (SEQ ID NO: 79), ATP118 (SEQ ID NO: 80), ATP119 (SEQ ID NO: 81), ATP120 (SEQ ID NO: 82), ATP122 (SEQ ID NO: 84), ATP123 (SEQ ID NO: 85), 및 ATP125 (SEQ ID NO: 87)) 각각의 300nM 또는 600nM와 함께 밤새 배양한 후에, 활성화 마커 발현(CD86, CD80, CD83 및 HLA-DR)을 FACS에 의해 인간 수지상 세포에서 평가하였다(도 62 - 71). 네거티브 대조군으로서 각 컨스트럭트와 동일한 완충액 부피를 사용하였다.
결과는 CD86, HLADR 및 CD83의 상향 조절에 의해 보여지는 수지상 세포 성숙을 나타내는 시험된 모든 컨스트럭트를 갖는 도 62 - 71에 도시된다.
실시예 43: 결장직장암 모델에서 세포 침투 펩타이드 , 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제와 PD1 억제제의 조합이, 종양 성장 및 생존율에 미치는 영향
세포 침투 펩타이드, 상이한 항원 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 복합체와 PD1 억제제와의 조합이 결장직장암 치료에 미치는 효과를 평가하기 위해, MC-38 종양 모델을 사용하였다. MC-38은 결장암 세포주이다.
이를 위해, C57BL/6 마우스(그룹당 13 내지 14마리, 암컷, 7주령)의 좌측 플랭크에 2x105 MC-38 종양 세포를 s.c. 이식하였다(0일). 종양 이식 후, "Z13Mad12Anaxa"및 "Z13Mad12Anaxa + 항-PD1" 그룹의 마우스의 꼬리 베이스에, 3일, 10일 및 17일에 2 nmol의 Z13Mad12Anaxa(실시예 36; SEQ ID NO: 69 참조)를 피하로 백신 접종하였다. "항-PD1" 및 "Z13Mad12Anaxa + 항-PD1" 그룹의 마우스에게 6일, 10일, 13일, 17일, 20일, 24일 및 27일 각각에, 200 ㎍의 항-PD1 항체 RMP1-14(BioXcell, West Lebanon, NH, USA)를 i.p. 투여하였다. 10일 및 17일에, Z13Mad12Anaxa 및 항체 모두가 투여될 때, Z13Mad12Anaxa의 s.c. 투여 직후에 항체를 i.p. 투여하였다. 종양의 크기는 캘리퍼로 측정하였다.
도 72 및 도 73에 나타낸 바와 같이, PD1 억제제 단독 또는 Z13Mad12Anaxa 단독으로 처리한 결과, 대조군과 비교하여 현저히 감소된 종양 체적(도 72A) 및 증가된 생존율(도 72B)이 나타났다. 그러나, PD1 억제제와 Z13Mad12Anaxa의 조합은 가장 현저한 개선, 즉 강하게 감소된 종양 체적 및 강하게 증가된 생존율을 나타냈다. 참고로, "Z13Mad12Anaxa + aPD1" 그룹에서는 3 마리의 마우스에서만 종양이 생긴 반면에(반면 10마리는 종양이 없는 상태), "aPD1" 그룹과 "Z13Mad12Anaxa" 그룹에서는 각각 8마리와 10마리의 마우스에서 종양이 발생했다. 대조군에서는 모든 마우스에서 종양이 발생했다. 이 데이터는 항-PD1 치료와 Z13Mad12Anaxa 백신 접종의 조합이 항-PDD 단독 요법이나 Z13Mad12Anaxa 백신 접종 단독보다 더 효율적이라는 것을 보여준다.
도 73에 도시된 바와 같이, "Z13Mad12Anaxa + aPD1" 그룹의 종양이 없는 마우스의 수(13마리 마우스 중 10마리 마우스)는 "aPD1" 그룹(14마리의 마우스 중 6마리 마우스) 및 "Z13Mad12Anaxa" 그룹(13마리의 마우스 중 3마리)의 종양이 없는 마우스의 수의 합계보다도 더 크다. 따라서 이러한 결과는 항-PDD 치료와 Z13Mad12Anaxa 백신 접종의 상승적(synergistic) 효과를 나타낸다.
실시예 44: ATP128 백신 접종 후 마우스 중에 유도된 면역 반응
세포 투과 펩타이드, 3개 항원(서비빈, CEA 및 ASCL2)의 에피토프 및 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 다른 인간 컨스트럭트 ATP128 (SEQ ID NO: 89)를 디자인하였다. 특히, "ATP128"(SEQ ID NO: 89)은 세포-투과 펩타이드 "Z13"(SEQ ID NO: 6), 3개 항원인 서비빈, CEA 및 ASCL2의 에피토프들, 그리고 TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa"(즉, SEQ ID NO: 71에 따른 TLR 펩타이드 작용제)의 서열 변이체를 포함하는 융합 단백질이다. 다음에 ATP128의 아미노산 서열을 나타내었다:
KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
(SEQ ID NO: 89)
나이브 C57BL/6 마우스(그룹당 5마리, 암컷, 7주령)에게 ATP128(SEQ ID NO : 89)의 4 nmol을 피하 주입하여 백신 접종시켰다. 대조군 마우스는 비히클(백신 완충액)을 투여받았다. 처리 7일 후 마우스에서 출혈을 시키고 IFN-γ 생산 백신-특이적 T 세포를 정량화하기 위해 ATP128이 로딩된 마우스 수지상 세포로 자극시킨 혈액 세포 상에서 생체 외(ex vivo) Elispot 분석을 수행하였다.
그 결과를 도 74에 나타내었다. ATP128로 백신 접종한 마우스는 나이브 마우스에 비해 더 높은 ATP128-특이적 면역 반응을 나타내었다.
수득된 결과는 ATP128이 마우스에서 면역 반응을 유도하는데 효과적이라는 것을 보여준다.
실시예 45: ATP128 컨스트럭트에 의한 인간 수지상 세포 활성화
이 연구의 목적은 인간의 수지상 세포(인간 DC)의 성숙을 유도하기 위해 인간 항원 화물을 포함하는 ATP128(SEQ ID NO: 89)의 용량을 조사하는 것이었다. 이를 위해, ATP128(SEQ ID NO: 89)을 시험 하였다. DC 활성화의 평가를 위하여 사용된 생물학적 지표는, 4가지 멤브레인 항원, 즉 HLA-DR, CD80, CD83 및 CD86의 발현 강도에 기초한 활성화 백분율을 나타내는 활성화 지수(도 75)이었다.
300nM의 ATP128(SEQ ID NO: 89)을 밤새 배양한 후, 활성화 표지자 발현 (CD86, CD80, CD83 및 HLA-DR)을 FACS에 의해 인간 수지상 세포 상에서 평가하였다 (도 75). 같은 완충액을 음성 대조군으로 사용한 반면에, MPLA는 양성 대조군으로 사용하였다.
결과를 도 75에 나타내었다. 결과는 ATP128이 인간 DC를 유력하게 활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 46: ATP128 컨스트럭트에 의한 인간 수지상 세포 활성화
인간 세포가 ATP128(SEQ ID NO: 89) 중에 포함된 에피토프 펩타이드를 처리하고 제시할 수 있는지를 확인하기 위해, 2명의 상이한 기증자(기증자 "9" 및 "10"으로 명명됨)로부터 유래한 인간 수지상 세포(인간 DCs)에 ATP128을 밤새 로딩시키고, HLA 클래스 I 및 클래스 II/제시된 펩타이드 정제, 펩타이드 용출 및 질량 분광 분석에 의한 특성화를 위하여 처리하였다. 간단히 말해서, 충격-냉동된 인간 DC 샘플로부터 유래한 펩타이드 풀은, HLA-특이적 항체, 산 처리 및 한외 여과를 이용한 면역 침전에 의해 수득되었다. HLA 펩타이드 풀을 역상 크로마토그래피에 의해 소수성에 따라 분리하였고, 용출 펩타이드를 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에서 분석하였다. 그 후 데이터는 수집되어 펩타이드 서열 정보를 함유하는 단편 스펙트럼뿐만 아니라, 비단편화된 펩타이드의 질량 신호를 분석함으로써 자동으로 처리되었다. 거짓 발견율(FDR)은 셔플된 타겟 데이터베이스로 구성된 미끼 데이터베이스에 대한 처리를 기반으로 한 퍼콜레이터(Percolator) 알고리즘에 의해 결정되었다(Kall L, Canterbury JD, Weston J, Noble WS, MacCoss MJ (2007) Semi-supervised learning for peptide identification from shotgun proteomics datasets. Nat Methods 4(11):923-925)). HLA 클래스 I의 경우, 펩타이드 길이는 길이가 8-12 aa 길이로 제한되었다. HLA 클래스 II의 경우, 펩타이드의 길이는 12-25 aa 길이로 제한되었다. HLA 주석(annotation)은 SYFPEITHI(www.syfpeithi.de)를 사용하여 수행되었다.
데이터는 ATP128로 로딩된 인간 DC가 다중 항원 도메인으로부터 유도된 클래스 I 및 클래스 II 에피토프 펩타이드를 처리하고 제시할 능력이 있음을 보여 주었다(도 76). 모든 항원으로부터 유도된 펩타이드는 클래스 I 풀 중에서 동정되었다. 더 많은 수의 클래스 Ⅱ 결합 펩타이드가 백신의 모든 항원 부분으로부터 동정되었다.
서열 및 서열 ID 번호(서열 목록)의 표:
SEQ ID NO 서열 언급
SEQ ID NO: 1 RQIKIYFQNRRMKWKK CPP: 페네트라틴
SEQ ID NO: 2 YGRKKRRQRRR CPP: TAT 최소 도메인
domain
SEQ ID NO: 3 MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAAAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF ZEBRA 아미노산 서열 (Epstein - Barr virus (EBV)) (YP_401673)로부터 유래한 천연 서열
SEQ ID NO: 4 KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC CPP1 (Z11)
SEQ ID NO: 5 KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK CPP2 (Z12)
SEQ ID NO: 6 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK CPP3 (Z13)
SEQ ID NO: 7 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAK CPP4 (Z14)
SEQ ID NO: 8 KRYKNRVASRKSRAKFK CPP5 (Z15)
SEQ ID NO: 9 QHYREVAAAKSSEND CPP6 (Z16)
SEQ ID NO: 10 QLLQHYREVAAAK CPP7 (Z17)
SEQ ID NO: 11 REVAAAKSSENDRLRLLLK CPP8 (Z18)
SEQ ID NO: 12 KRYKNRVA CPP9 (Z19)
SEQ ID NO: 13 VASRKSRAKFK CPP10 (Z20)
SEQ ID NO: 14 ESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS MAD5 화물
SEQ ID NO: 15 STVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE TLR2 펩타이드 작용제 agonist Anaxa
SEQ ID NO: 16 DDDK 엔테로키나아제 타겟 부위
SEQ ID NO: 17 IEDGR 요소 Xa 타겟 부위
SEQ ID NO: 18 LVPRGS 트롬빈 타겟 부위
SEQ ID NO: 19 ENLYFQG 프로테아제 TEV 타겟 부위
SEQ ID NO: 20 LEVLFQGP 선절단(PreScission) 프로테아제 타겟부위
SEQ ID NO: 21 RX(R/K)R 푸린 타겟 부위
SEQ ID NO: 22 GGGGG 펩타이드성 링커
SEQ ID NO: 23 GGGG 펩타이드성 링커
SEQ ID NO: 24 EQLE 펩타이드성 링커
SEQ ID NO: 25 TEWT 펩타이드성 링커
SEQ ID NO: 26 MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQSTKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS EDAZ13Mad5
SEQ ID NO: 27 MHHHHHHSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAEKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS AnaxaZ13Mad5
SEQ ID NO: 28 MHHHHHHKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE Z13Mad5Anaxa
SEQ ID NO: 29 MHHHHHHKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS Z13Mad5
SEQ ID NO: 30 MHHHHHHESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS Mad5
SEQ ID NO: 31 MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQSTESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS EdaMad5
SEQ ID NO: 32 MHHHHHHESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE Mad5Anaxa
SEQ ID NO: 33 MHHHHHHKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE Z14 Mad5Anaxa
SEQ ID NO: 34 MHHHHHHREVAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE Z18 Mad5Anaxa
SEQ ID NO: 35 SIINFEKL SIINFEKL OVACD8 펩타이드
SEQ ID NO: 36 ISQAVHAAHAEINEAGR OVACD4 펩타이드
SEQ ID NO: 37 MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQSTKRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS EDAZ14Mad5
SEQ ID NO: 38 MHHHHHHNIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQSTREVAAAKSSENDRLRLLLKESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGVGALKVPRNQDWLGVPRFAKFASFEAQGALANIAVDKANLDVEQLESIINFEKLTEWTGS EDAZ18Mad5
SEQ ID NO: 39 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKVTYHSPSYAYHQFERRAILNRLVQFIKDRISVVQALVLTSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTN FDAE Z13Mad8Anaxa
SEQ ID NO: 40 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE Z13Mad11Anaxa
SEQ ID NO: 41 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKHLELASMTNMELMSSIVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE Z13Mad9Anaxa
SEQ ID NO: 42 HLELASMTNMELMSSIV Mad9
SEQ ID NO: 43 VTYHSPSYAYHQFERRAILN RLVQFIKDRISVVQALVLT Mad8
SEQ ID NO: 44 NYRIATFKNWPFLEDCAMEELTVSEFLKLDRQR Mad11
SEQ ID NO: 45 NIDRPKGLAFTDVDVDSIKIAWESPQGQVSRYRVTYSSPEDGIRELFPAPDGEDDTAELQGLRPGSEYTVSVVALHDDMESQPLIGIQST
 EDA
SEQ ID NO: 46 RKKRRQRRRRVKRISQAVHAAHAEINEAGRRVKRKVPRNQDWLRVKRASFEAQGALANIAVDKARVKRSIINFEKLRVKRSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 TatFMad5Anaxa
SEQ ID NO: 47 MAPPQVLAFGLLLAAATATFAAAQEECVCENYKLAVNCFVNNNRQCQCTSVGAQNTVICSKLAAKCLVMKAEMNGSKLGRRAKPEGALQNNDGLYDPDCDESGLFKAKQCNGTSMCWCVNTAGVRRTDKDTEITCSERVRTYWIIIELKHKAREKPYDSKSLRTALQKEITTRYQLDPKFITSILYENNVITIDLVQNSSQKTQNDVDIADVAYYFEKDVKGESLFHSKKMDLTVNGEQLDLDPGQTLIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVVVIAVVAGIVVLVISRKKRMAKYEKAEIKEMGEMHRELNA EpCAM
SEQ ID NO: 48 GLKAGVIAV EpCAM 에피토프
SEQ ID NO: 49 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGSGHASSTPGGEKETSATQRSSVPSSTEKNAVSMTSSVLSSHSPGSGSSTTQGQDVTLAPATEPASGSAATWGQDVTSVPVTRPALGSTTPPAHDVTSAPDNKPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL MUC-1
SEQ ID NO: 50 GSTAPPVHN
 MUC-1 에피토프
SEQ ID NO: 51 TAPPAHGVTS
MUC-1 에피토프
SEQ ID NO: 52 MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAKKVRRAIEQLAAMD
 서비빈
SEQ ID NO: 53 RISTFKNWPF 서비빈 에피토프
SEQ ID NO: 54 MESPSAPPHRWCIPWQRLLLTASLLTFWNPPTTAKLTIESTPFNVAEGKEVLLLVHNLPQHLFGYSWYKGERVDGNRQIIGYVIGTQQATPGPAYSGREIIYPNASLLIQNIIQNDTGFYTLHVIKSDLVNEEATGQFRVYPELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPETQDATYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDTASYKCETQNPVSARRSDSVILNVLYGPDAPTISPLNTSYRSGENLNLSCHAASNPPAQYSWFVNGTFQQSTQELFIPNITVNNSGSYTCQAHNSDTGLNRTTVTTITVYAEPPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSAELPKPSISSNNSKPVEDKDAVAFTCEPEAQNTTYLWWVNGQSLPVSPRLQLSNGNRTLTLFNVTRNDARAYVCGIQNSVSANRSDPVTLDVLYGPDTPIISPPDSSYLSGANLNLSCHSASNPSPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVAL
 CEA
SEQ ID NO: 55 YLSGANLNLS CEA 에피토프
SEQ ID NO: 56 SWRINGIPQQ CEA 에피토프
SEQ ID NO: 57 MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTKSFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQDLARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTPGCVKIKKCIIM Kirsten Ras
SEQ ID NO: 58 VVVGAGGVG Kirsten Ras 에피토프
SEQ ID NO: 59 MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQEAASSSSTLVEVTLGEVPAAESPDPPQSPQGASSLPTTMNYPLWSQSYEDSSNQEEEGPSTFPDLESEFQAALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGNWQYFFPVIFSKAFSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIFATCLGLSYDGLLGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIWEELSVLEVFEGREDSILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALVETSYVKVLHHMVKISGGPHIS YPPLHEWVLREGEE
MAGE-A3
SEQ ID NO: 60 KVAELVHFL MAGE-A3 에피토프
SEQ ID NO: 61 MAFVCLAIGCLYTFLISTTFGCTSSSDTEIKVNPPQDFEIVDPGYLGYLYLQWQPPLSLDHFKECTVEYELKYRNIGSETWKTIITKNLHYKDGFDLNKGIEAKIHTLLPWQCTNGSEVQSSWAETTYWISPQGIPETKVQDMDCVYYNWQYLLCSWKPGIGVLLDTNYNLFYWYEGLDHALQCVDYIKADGQNIGCRFPYLEASDYKDFYICVNGSSENKPIRSSYFTFQLQNIVKPLPPVYLTFTRESSCEIKLKWSIPLGPIPARCFDYEIEIREDDTTLVTATVENETYTLKTTNETRQLCFVVRSKVNIYCSDDGIWSEWSDKQCWEGEDLSKKTLLRFWLPFGFILILVIFVTGLLLRKPNTYPKMIPEFFCDT IL13Ralpha2
SEQ ID NO: 62 LPFGFIL IL13R알파2 에피토프
SEQ ID NO: 63 LFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEG Mad12
SEQ ID NO: 64 LVQFIKDRISVVQA gp70CD4 펩타이드
SEQ ID NO: 65 SPSYVYHQF gp70CD8 펩타이드
SEQ ID NO: 66 ASMTNMELM adpgk 펩타이드
SEQ ID NO: 67 ATKNWPFL 서비빈 20-28
SEQ ID NO: 68 TVSEFLKL 서비빈 97-104
SEQ ID NO: 69 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLFRAAQLANDVVLQIMEHLELASMTNMELMSSIVVISASIIVFNLLELEGSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 Z13Mad12Anaxa
SEQ ID NO: 70 MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV Her2/neu
SEQ ID NO: 71 STVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE TLR 펩타이드 작용제 "Anaxa" 서열 변이체
SEQ ID NO: 72 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE ATP110
SEQ ID NO: 73 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALILGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP111
SEQ ID NO: 74 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP112
SEQ ID NO: 75 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP113
SEQ ID NO: 76 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP114
SEQ ID NO: 77 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSEYKLVVVGAVGVGKSALTAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP115
SEQ ID NO: 78 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE

 ATP116
SEQ ID NO: 79 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP117
SEQ ID NO: 80 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAPPQVLAFGLLLAAATAYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP118
SEQ ID NO: 81 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKLGDPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPASYEFLWGPRALVETSYVKVALSRKVAELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE


 ATP119
SEQ ID NO: 82 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE ATP120
SEQ ID NO: 83 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALIAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP121
SEQ ID NO: 84 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSSHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP122
SEQ ID NO: 85 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP123
SEQ ID NO: 86 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILCKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP124
SEQ ID NO: 87 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDRPALGSTAPPVHNVTSAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE

 ATP125
SEQ ID NO: 88 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAPPQVLAFGLLLAAATALIYYVDEKAPEFSMQGLKAGVIAVIVVAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE ATP127
SEQ ID NO: 89 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE ATP128
SEQ ID NO: 90 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE ATP129
SEQ ID NO: 91 KRYKNRVASRKSRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKNRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGSEGALSPAERELLDFSSWLGGYSTVHEILSKLSLEGDHSTPPSAYGSVKPYTNFDAE
 ATP130
SEQ ID NO: 92 MDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY ASCL2
SEQ ID NO: 93 SAVEYIRALQ ASCL2 에피토프
SEQ ID NO: 94 ERELLDFSSW ASCL2 에피토프
SEQ ID NO: 95 APTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRER 서비빈 단편
SEQ ID NO: 96 NRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSA CEA 단편
SEQ ID NO: 97 AAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGY ASCL2 단편
SEQ ID NO: 98 NRTLTLFNVTRNDARAYVSGIQNSVSANRSDPVTLDVLPDSSYLSGANLNLSCHSASPQYSWRINGIPQQHTQVLFIAKITPNNNGTYACFVSNLATGRNNSIVKSITVSASGTSPGLSAAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGSAVKKQFEELTLGEFLKLDRERAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPSEGALSPAERELLDFSSWLGGY ATP128의 항원 화물
SEQUENCE LISTING <110> Amal Therapeutics SA, Geneva, Switzerland <120> A NOVEL COMPLEX COMPRISING A CELL PENETRATING PEPTIDE, A CARGO AND A TLR PEPTIDE AGONIST FOR TREATMENT OF COLORECTAL CANCER <130> AM05P013WO <150> PCT/EP2016/072475 <151> 2016-09-21 <160> 98 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP: Penetratin <400> 1 Arg Gln Ile Lys Ile Tyr Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP: TAT minimal domain <400> 2 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEBRA amino acid sequence (natural sequence from Epstein - Barr virus (EBV)) (YP_401673) <400> 3 Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val 20 25 30 Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu 35 40 45 Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr 50 55 60 His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro 65 70 75 80 Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro 85 90 95 Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu 100 105 110 Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val 115 120 125 Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile 130 135 140 Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg 145 150 155 160 Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu 165 170 175 Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys 180 185 190 Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser 195 200 205 Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser 210 215 220 Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu 225 230 235 240 Asp Leu Leu Asn Phe 245 <210> 4 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP1 (Z11) <400> 4 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser 20 25 30 Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys 35 40 45 <210> 5 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP2 (Z12) <400> 5 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser 20 25 30 Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys 35 40 <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP3 (Z13) <400> 6 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser 20 25 30 Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys 35 40 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CPP4 (Z14) <400> 7 Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe 1 5 10 15 Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys 20 25 30 <210> 8 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<220> <223> Survivin fragment <400> 95 Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg 1 5 10 15 Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala Val Lys 20 25 30 Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg 35 40 45 Glu Arg 50 <210> 96 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA fragment <400> 96 Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro 20 25 30 Val Thr Leu Asp Val Leu Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn 35 40 45 Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile 50 55 60 Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala 85 90 95 Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser 100 105 110 Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala 115 120 <210> 97 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ASCL2 fragment <400> 97 Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu 1 5 10 15 Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly 20 25 30 Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu 35 40 45 Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg 50 55 60 Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala 65 70 75 80 Pro Arg Gly Pro Ser Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu 85 90 95 Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr 100 105 <210> 98 <211> 276 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antigenic cargo of ATP128 <400> 98 Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala 1 5 10 15 Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro 20 25 30 Val Thr Leu Asp Val Leu Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn 35 40 45 Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile 50 55 60 Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala 85 90 95 Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser 100 105 110 Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp 115 120 125 Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro 130 135 140 Phe Leu Glu Gly Ser Ala Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu 145 150 155 160 Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Ala Val Ala Arg Arg 165 170 175 Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln 180 185 190 Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser 195 200 205 Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln 210 215 220 Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly 225 230 235 240 Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Ser Glu 245 250 255 Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp 260 265 270 Leu Gly Gly Tyr 275

Claims (117)

  1. 결장직장암(colorectal cancer)의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 다음을 포함하는 복합체:
    a) 세포 투과 펩타이드;
    b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
    c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
    여기서 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합됨.
  2. 제1항에 있어서, 복합체는 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질인 것인 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 다음을 가지는 것인 복합체:
    (i) 상기 펩타이드의 총 5 내지 50개 아미노산, 바람직하게는 총 10 내지 45개 아미노산, 더 바람직하게는 총 15 내지 45개 아미노산의 아미노산 서열 길이; 및/또는
    (ii) ZEBRA의 최소 도메인의 단편, 상기 최소 도메인은 SEQ ID NO: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열의 잔기 170 부터 잔기 220까지 확장되며, 여기서, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산은 상기 펩타이드의 세포 투과 능력을 폐기하지 않으면서 선택적으로, 치환, 삭제, 및/또는 추가됨, 또는 이의 변이체를 포함하는 아미노산 서열.
  4. 제3항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 3에 따른 ZEBRA 아미노산 서열에서의 포지션 189에 상응하는 위치에 세린(Ser, S)을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것인 복합체.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 다음을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것인 복합체:
    (i) 하기 일반식 (I)에 따른 서열:
    X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11SX13X14X15X16X17
    여기서 0, 1, 2, 3, 4, 또는 5개 아미노산이 상기 펩타이드의 세포 투과 능력을 폐기하지 않으면서 치환, 삭제, 및/또는 추가되고,
    X1은 K, R, 또는 H 이며, 바람직하게는 X1은 K 또는 R 이며;
    X2는 R, K, 또는 H 이며, 바람직하게는 X2는 R 또는 K 이며;
    X3은 Y, W, 또는 F 이며, 바람직하게는 X3은 Y, W, 또는 F 이며;
    X4는 K, R, 또는 H 이며, 바람직하게는 X4는 K 또는 R 이며;
    X5는 N 또는 Q 이며;
    X6은 R, K, 또는 H 이며, 바람직하게는 X6은 R 또는 K 이며;
    X7은 V, I, M, L, F, 또는 A 이며, 바람직하게는 X7은 V, I, M 또는 L 이며;
    X8은 A, V, L, I, 또는 G 이며, 바람직하게는 X8은 A 또는 G 이며;
    X9는 S 또는 T 이며;
    X10은 R, K, 또는 H 이며, 바람직하게는 X10은 R 또는 K 이며;
    X11은 K, R, 또는 H 이며, 바람직하게는 X11은 K 또는 R 이며;
    X13은 R, K, 또는 H 이며, 바람직하게는 X13은 R 또는 K 이며;
    X14는 A, V, L, I, 또는 G 이며, 바람직하게는 X14는 A 또는 G 이며;
    X15는 K, R, 또는 H 이며, 바람직하게는 X15는 K 또는 R 이며;
    X16은 F, L, V, I, Y, W, 또는 M 이며, 바람직하게는 X16은 F, Y 또는 W 이며; 및
    X17은 K, R, 또는 H 이며, 바람직하게는 X17은 K 또는 R임.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 4 - 13에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 펩타이드의 세포 투과 능력을 폐기하지 아니하는 이의 서열 변이체, 특히 상기 펩타이드의 세포 투과 능력을 폐기하지 아니하면서 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성 및 더 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 이의 서열 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 것인 복합체.
  7. 제6항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13), SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15), 또는 SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18)에 따른 아미노산 서열, 또는 상기 펩타이드의 세포 투과 능력을 폐기하지 아니하는 이의 서열 변이체, 특히 상기 펩타이드의 세포 투과 능력을 폐기하지 아니하면서 적어도 70% 서열 동일성(sequence identity), 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성 및 더 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 이의 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 아미노산 서열을 가지는 것인 복합체.
  8. 제7항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 SEQ ID NO: 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것인 복합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 (i) 펩타이드, 폴리펩타이드, 또는 단백질, (ii) 폴리사카라이드, (iii) 지질, (iv) 지질단백질, (v) 당지질, (vi) 핵산, 및 (vii) 소분자 약물 또는 독소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 적어도 하나의 종양 에피토프, 바람직하게는 적어도 하나의 결장직장암 에피토프를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것인 복합체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 적어도 하나의 CD4+ 에피토프 및/또는 적어도 하나의 CD8+ 에피토프인 것인 복합체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질인 것인 복합체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 항원 또는 항원성 에피토프를 포함하는 것인 복합체.
  14. 제13항에 있어서, 한 개 초과의 항원 또는 항원성 에피토프, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 항원 또는 항원성 에피토프가 복합체 내에서 연속으로 위치하는 것인 복합체.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 종양 에피토프는 EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈(survivin), CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프인 것인 복합체.
  16. 제10항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 종양 에피토프는 ASCL2, EpCAM, HER-2, MUC-1, TOMM34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, 서비빈, CEA, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프인 것인 복합체.
  17. 제15항에 있어서, 적어도 하나의 종양 에피토프는 EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas, MAGE-A3 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프, 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas 및 MAGE-A3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프, 더 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 EpCAM, MUC-1, 서비빈 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프인 것인 복합체.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 적어도 하나의 종양 에피토프는 ASCL2, EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas, MAGE-A3 및 IL13R알파2로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프, 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 ASCL2, EpCAM, MUC-1, 서비빈, CEA, KRas 및 MAGE-A3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프, 더 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 ASCL2, EpCAM, MUC-1, 서비빈 및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프, 보다 더 바람직하게는 적어도 하나의 종양 에피토프는 ASCL2, EpCAM, 서비빈및 CEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원의 에피토프인 것인 복합체.
  19. 제18항에 있어서, 복합체는 서비빈의 에피토프를 포함하는 것인 복합체.
  20. 제19항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  21. 제20항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 53에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 것인 복합체.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  23. 제18항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 CEA의 에피토프를 포함하는 것인 복합체.
  24. 제23항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  25. 제24항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 55에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 것인 복합체.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 ASCL2의 에피토프를 포함하는 것인 복합체.
  28. 제27항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  29. 제28항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 93에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 것인 복합체.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  31. 제12항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    e) KRas의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
    f) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  32. 제12항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    e) KRas의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    f) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
    g) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) 1 이상의 에피토프를 포함하는 EpCAM의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) 1 이상의 에피토프를 포함하는 MUC-1의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 1 이상의 에피토프를 포함하는 서비빈의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) 1 이상의 에피토프를 포함하는 CEA의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    e) 1 이상의 에피토프를 포함하는 KRas의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
    f) 1 이상의 에피토프를 포함하는 MAGE-A3의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  34. 제31항 또는 제32항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) 1 이상의 에피토프를 포함하는 EpCAM의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) 1 이상의 에피토프를 포함하는 MUC-1의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 1 이상의 에피토프를 포함하는 서비빈의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) 1 이상의 에피토프를 포함하는 CEA의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    e) 1 이상의 에피토프를 포함하는 KRas의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    f) 1 이상의 에피토프를 포함하는 MAGE-A3의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
    g) 1 이상의 에피토프를 포함하는 ASCL2의 단편 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    f) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  36. 제31항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    f) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  37. 제31항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    e) KRas의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  38. 제31항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    f) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  39. 제31항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
    f) MAGE-A3의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  40. 제31항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  41. 제40항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  42. 제40항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    b) MUC-1의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  43. 제40항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  44. 제40항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  45. 제40항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  46. 제31항 내지 제34항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및/또는
    g) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  47. 제46항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    a) EpCAM의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    g) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  48. 제46항에 있어서, 복합체는 다음을 포함하는 것인 복합체:
    c) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    d) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    g) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  49. 제48항에 있어서, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함하는 것인 복합체:
    (i) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    (ii) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    (iii) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  50. 제49항에 있어서, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함하는 것인 복합체:
    (i) SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    (iii) SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체.
  51. 제50항에 있어서, (i) SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 C-말단이 (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접 연결되고; 그리고 (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 C-말단이 (iii) SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접 연결된 것인 변이체.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및 SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 98에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  54. 제46항에 있어서, 복합체는
    g) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  55. 제10항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 종양 에피토프는 신생항원(neoantigen)의 에피토프, 바람직하게는 결장직장암-특이적 신생항원의 에피토프인 것인 복합체.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 TLR2, TLR4 및/또는 TLR5 펩타이드 작용제, 바람직하게는 TLR2 펩타이드 작용제 및/또는 TLR4 펩타이드 작용제인 것인 복합체.
  57. 제56항에 있어서, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 SEQ ID NO: 15 또는 71에 따른 아미노산 서열; 또는 이의 서열 변이체, 특히 상기 펩타이드의 TLR 작용제 능력을 폐기하지 않으면서 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성 및 더 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성을 공유하는 이의 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것인 복합체.
  58. 제57항에 있어서, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 SEQ ID NO: 71에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드; 또는 상기 펩타이드의 (TLR 작용제 능력을 폐기하지 않으면서) 적어도 70% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성 및 더 바람직하게는 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것인 복합체.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 한 개 초과의 TLR 펩타이드 작용제, 특히 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 TLR 펩타이드 작용제를 포함하는 것인 복합체.
  60. 제1항 내지 제59항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 세포 투과 펩타이드의 C-말단에 위치하고, 여기서 세포 투과 펩타이드 및 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프가 선택적으로 부가적 성분, 예컨대 링커, 스페이서에 의해, 또는 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의해 연결되는 것인 복합체.
  61. 제60항에 있어서, 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프는 세포 투과 펩타이드의 C-말단에 위치하고, 여기서 세포 투과 펩타이드 및 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프가 선택적으로 부가적 성분, 예컨대 링커, 스페이서에 의해, 그러나 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제에 의하지는 않고, 연결되는 것인 복합체.
  62. 제2항 내지 제61항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 복합체는 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질이고, 성분 a) 내지 c)는 상기 복합체의 주사슬의 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서로 위치하는 것인 복합체:
    (α) 성분 a) - 성분 b) - 성분 c); 또는
    (β) 성분 c) - 성분 a) - 성분 b),
    여기서 성분들은 부가적 성분, 특히 링커 또는 스페이서에 의해 연결될 수 있음.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바람직하게는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에, 다음 성분을 포함하는 것인 복합체:
    (i) SEQ ID NO: 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (ii) SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (iii) SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (iv) SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    (v) SEQ ID NO: 71에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체.
  64. 제1항 내지 제62항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 복합체는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 87 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지거나; 또는 상기 복합체는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 87 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것인 복합체.
  65. 제1항 내지 제63항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 복합체는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 91 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지거나; 또는 상기 복합체는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 91 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것인 복합체.
  66. 제1항 내지 제63항 및 제65항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 복합체는 SEQ ID NO: 89에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 것인 복합체.
  67. 다음을 포함하는 복합체:
    a) 세포 투과 펩타이드;
    b) 적어도 3개의 항원성 에피토프; 및
    c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
    여기서 성분 a) - c)는 공유적으로 연결되고, 그리고
    여기서 적어도 3개의 항원성 에피토프는 (i) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 (a) 이의 기능적 서열 변이체(들) (ii) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 (a) 이의 기능적 서열 변이체(들), 및 (iii) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 (a) 이의 기능적 서열 변이체(들)을 포함함.
  68. 제67항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  69. 제68항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 53에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 것인 복합체.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  72. 제71항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 55에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 56에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 것인 복합체.
  73. 제71항 내지 제72항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  75. 제74항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 93에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및/또는 SEQ ID NO: 94에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 포함하는 것인 복합체.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  77. 제67항 내지 제76항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함하는 것인 복합체:
    (i) CEA의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체;
    (ii) 서비빈의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    (iii) ASCL2의 1 이상의 에피토프 또는 이의 기능적 서열 변이체.
  78. 제77항에 있어서, 복합체는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음을 포함하는 것인 복합체:
    (i) SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    (iii) SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 10 아미노산 길이를 갖는 이의 단편, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체.
  79. 제78항에 있어서, (i) SEQ ID NO: 54에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 C-말단은 (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접 연결되고; 그리고 (ii) SEQ ID NO: 52에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 C-말단은 (iii) SEQ ID NO: 92에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 이의 단편 또는 변이체의 N-말단에 직접 연결되는 것인 복합체.
  80. 제67항 내지 제79항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및 SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  81. 제67항 내지 제80항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 SEQ ID NO: 98에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하는 것인 복합체.
  82. 제67항 내지 제81항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복합체는 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질인 것인 복합체.
  83. 제67항 내지 제82항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 투과 펩타이드는 제3항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 것인 복합체.
  84. 제67항 내지 제83항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제는 제56항 내지 제58항 중 어느 하나의 항에 정의된 바와 같은 것인 복합체.
  85. 제67항 내지 제84항 중 어느 하나의 항에 있어서, 바람직하게는 N- 내지 C-말단으로의 방향 중에 다음 성분을 포함하는 것인 복합체:
    (i) SEQ ID NO: 6에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (ii) SEQ ID NO: 96에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (iii) SEQ ID NO: 95에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체;
    (iv) SEQ ID NO: 97에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체; 및
    (v) SEQ ID NO: 71에 따른 아미노산 서열을 갖는 펩타이드; 또는 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체,
    여기서 성분 (i) - (v)는 선택적으로 링커 또는 스페이서에 의해 연결됨.
  86. 제67항 내지 제85항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 복합체는 SEQ ID NO: 89에 따른 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어진 것인 복합체.
  87. 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제66항 중 어느 하나의 항에 정의된 복합체를 암호화하는 핵산으로서, 여기서 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질인 것인 핵산.
  88. 제67항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 따른 복합체를 암호화하는 핵산으로서, 여기서 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질인 것인 핵산.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 핵산은 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 87 중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 87 중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 핵산.
  90. 제87항 또는 제88항에 있어서, 핵산은 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 91중 어느 하나에 따른 아미노산 서열, 또는 SEQ ID NOs: 26 - 28, 33 - 34, 37 - 41, 46, 69, 또는 72 - 91중 어느 하나와 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 적어도 98% 서열 동일성을 공유하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 핵산.
  91. 제90항에 있어서, 핵산은 SEQ ID NO: 89에 따른 아미노산 서열, 또는 적어도 50%의 서열 동일성을 갖는 이의 기능적 서열 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 핵산.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산은 DNA 분자 또는 RNA 분자; 바람직하게는 게놈 DNA; cDNA; siRNA; rRNA; mRNA; 안티센스 DNA; 안티센스 RNA; 리보자임(ribozyme); 상보(complimentary) RNA 및/또는 DNA 서열; 발현요소(expression elements), 조절요소(regulatory elements) 및/또는 프로모터가 있거나 또는 없는 RNA 및/또는 DNA 서열; 벡터; 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 핵산.
  93. 제87항 내지 제92항 중 어느 하나의 항에 정의된 핵산을 포함하는 벡터로서, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 벡터.
  94. 제93항에 정의된 벡터를 포함하는 숙주 세포로서, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 벡터.
  95. 제1항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 정의된 복합체 제조 방법으로서, 복합체는 폴리펩타이드 또는 단백질이고, 제72항에 정의된 숙주 세포를 배양 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지로부터 또는 숙주 세포 용해 후 숙주 세포 용해물로부터 상기 복합체를 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  96. 제1항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 정의된 복합체가 탑재된 세포로서, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 세포.
  97. 제96항에 있어서, 상기 세포는 항원 제시 세포, 바람직하게는 수지상 세포인 것인 세포.
  98. 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 다음 중 적어도 하나를 포함하는 조성물:
    (i) 제6항 내지 제86중 어느 하나의 항에 정의된 복합체;
    (ii) 제87항 내지 제92중 어느 하나의 항에 정의된 핵산;
    (iii) 제93항에 정의된 벡터;
    (iv) 제94항에 정의된 숙주 세포; 또는
    (v) 제96항 또는 제97항에 정의된 복합체가 탑재된 세포.
  99. 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한, 다음 중 적어도 하나를 포함하는 백신:
    (i) 제1항 내지 제86중 어느 하나의 항에 정의된 복합체;
    (ii) 제87항 내지 제92중 어느 하나의 항에 정의된 핵산;
    (iii) 제93항에 정의된 벡터;
    (iv) 제94항에 정의된 숙주 세포; 또는
    (v) 제96항 또는 제97항에 정의된 복합체가 탑재된 세포.
  100. 제1항 내지 제86중 어느 하나의 항에 정의된 적어도 하나의 복합체 또는 제96항 또는 제97항에 정의된 적어도 하나의 세포, 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약학 조성물로서, 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 약학 조성물.
  101. 제100항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 2개의 상이한 복합체를 포함하는 것인 약학 조성물.
  102. 제1항 내지 제86중 어느 하나의 항에 정의된 복합체를 포함하는 진단용 조성물.
  103. 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 다음의 조합:
    (i) 제1항 내지 제86중 어느 하나의 항에 정의된 복합체; 및
    (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제.
  104. 제103항에 있어서, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 대략 동시에 투여되는 것인 조합.
  105. 제103항 또는 제104항에 있어서, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 연속하여 투여되는 것인 조합.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 동일한 투여 경로를 통하여 투여되는 것인 조합.
  107. 제103항 내지 제105항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 별개의 투여 경로를 통하여 투여되는 것인 조합.
  108. 제103항 내지 제107항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 별개의 조성물 중에 제공되는 것인 조합.
  109. 제103항 내지 제106항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i) 복합체 및 (ii) 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제는 동일한 조성물 중에 제공되는 것인 조합.
  110. 제103항 내지 제109항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 치료제는 면역 체크 포인트 조절제인 것인 조합.
  111. 제110항에 있어서, 면역 체크 포인트 조절제는 PD-1 억제제인 것인 조합.
  112. 바람직하게는 결장직장암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한,
    제1항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 정의된 복합체, 제87항 내지 제92항 중 어느 하나의 항에 정의된 핵산, 제93항에 정의된 벡터, 제94항, 제96항 또는 제97항에 정의된 세포, 제98항에 정의된 조성물, 제99항에 정의된 백신, 및/또는 제100항 또는 제101항에 정의된 약학 조성물을 포함하는 키트.
  113. 제112항에 있어서, 키트는 제1항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 정의된 복합체, 제87항 내지 제92항 중 어느 하나의 항에 정의된 핵산, 제93항에 정의된 벡터, 제94항, 제96항 또는 제97항에 정의된 세포, 제98항에 정의된 조성물, 제99항에 정의된 백신, 및/또는 제100항 또는 제101항에 정의된 약학 조성물을 사용하는 것에 의하여 결장직장암을 예방 또는 치료하기 위한 지침을 구비한 패키지 삽입물 또는 지시 리플렛을 추가로 포함하는 것인 키트.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 키트는 화학 요법제, 표적 약물 및/또는 면역 체크 포인트 조절제와 같은 면역 치료제를 추가로 포함하는 것인 키트.
  115. 치료를 필요로 하는 대상체 중의 결장직장암을 예방 및/또는 치료하거나, 또는 항-종양-반응을 개시, 증진 또는 연장시키는 방법으로서, 다음을 포함하는 복합체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 방법:
    a) 세포 투과 펩타이드;
    b) 적어도 하나의 항원 또는 항원성 에피토프; 및
    c) 적어도 하나의 TLR 펩타이드 작용제,
    여기서 성분 a) 내지 c)는 공유적으로 결합됨.
  116. 제115항에 있어서, 제1항 내지 제86항 중 어느 하나의 항에 정의된 복합체, 제87항 내지 제92항 중 어느 하나의 항에 정의된 핵산, 제93항에 정의된 벡터, 제94항, 제96항 또는 제97항에 정의된 세포, 제98항에 정의된 조성물, 제99항에 정의된 백신, 및/또는 제100항 또는 제101항에 정의된 약학 조성물이 대상체에게 투여 되는 것인 방법.
  117. 제115항 또는 제116항에 있어서, 대상체는 결장직장암을 가진 것인 방법.

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