KR101040281B1

KR101040281B1 - Ｔａｔ-항원 융합단백질과 아쥬번트를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR101040281B1
Application number: KR1020080082599A
Authority: KR
Inventors: 김태규
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2011-06-10
Also published as: KR20100023696A

Abstract

본 발명은 백신 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 HIV TAT(transactivator protein)의 단백질전달도메인(protein transduction domain, PTD)과 항원이 연결된 융합단백질과 아쥬번트인 CpG-ODN 혹은 poly I:C 등을 혼합 병용 투여하여 면역반응을 효과적으로 유도하는 백신 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 세포독성 T 세포 활성을 증가시키고, 인터페론-γ(IFN-γ) 생성을 증가시키며, Th1 타입의 면역반응을 유도함으로써 백신 면역효과를 나타내고, 종래의 수지상세포를 사용하는 백신에 비하여 간편하고 안전하며 반복 투여가 가능하기 때문에 강력한 항원 특이면역 치료제로 사용될 수 있다.

TAT, CpG-ODN, poly I:C, 백신, 항종양 면역, CEA, 서비빈(SURVIVIN)

Description

ＴＡＴ-항원 융합단백질과 아쥬번트를 포함하는 백신 조성물{Vaccine compositions comprising TAT-fusion Antigen protein and adjuvants}

본 발명은 백신 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 HIV TAT(transactivator protein)의 단백질전달도메인(protein transduction domain, PTD)과 항원이 연결된 융합단백질과 아쥬번트인 CpG-ODN 혹은 poly I:C 등을 혼합 병용 투여하여 증강된 면역효과를 나타내는 백신에 관한 것이다.

현재의 암 치료법으로는 암세포화한 조직을 외과적으로 가능한 한 많이 제거하고 난 후, 잔존하는 암세포를 파괴하기 위한 방사선 요법과 화학요법을 행하는 것이 주종을 이루고 있다. 그러나, 외과적 수술의 경우에는 절제범위가 광범위하고, 미세전이 등에 의한 재발 위험성이 있으며, 방사선 요법과 화학요법의 경우에도 많은 부작용이 있고, 또한 각 항암제가 모든 암에 효능이 있는 것도 아니며, 많은 경우 항암제에 노출된 잔존 암세포들이 내성을 획득하고는 성장을 계속하고 급기야 다른 장기로 전이되어 치료 불가능한 상태로 빠지게 된다는 등의 여러 문제점이 있었다.

따라서, 이들 요법만으로 암을 정복하기에는 한계가 있다는 사실을 현실적으 로 인정하지 않을 수 없으며, 이에 새로운 암 치료법으로 기대를 모으고 있는 치료방법이 우리 몸 자체의 면역기능을 이용한 면역요법이다.

면역요법은 타 요법에 비해 부작용이 적고 타 요법과 병용시 우수한 효과를 발휘해, 최근에 중요성이 더욱 부각되고 있는 요법이다. 암 치료법 중 수술요법, 화학요법(항암제), 방사선요법은 암세포를 직접 공격하는 것인 반면 면역요법은 환자 자신이 가지고 있는 면역력에 작용해 이를 활성화시킴으로써 자신의 면역력으로 암을 치료하는 간접적인 치료방법이다.

인체의 면역기능에는 체액성 면역과 세포성 면역이 있다. 체액성 면역은 세균, 바이러스 등 항원이 체내에 들어왔을 때 그 항원을 분해 제거하기 위한 항체를 만들어 내는 것이다. 한편 세포성 면역은 어느 항원(암세포)에 반응하는 세포(림프구)를 만들어 내는 것으로 면역 감시기구를 작용시키는 것이다. 암에 관한 면역에서는 체액성 면역보다 림프구를 중심으로 한 세포성 면역이 더 중요한 역할을 한다. 이처럼, 항종양 면역반응에는 일반적으로 세포성 면역반응이 관여하고, 이러한 반응은 CD8+ 세포독성 T세포(CD8+ cytotoxic T lymphocyte, CTL)의 역할이 중요한 것으로 알려졌다. 이들 항종양 T세포를 유도하기 위해 종양-연관 항원(tumor-associated antigen; TAA)에 대한 연구가 지속되어 왔으며, 재조합 DNA 기술의 발달로 종양에 대한 T 세포 면역치료법의 개발을 위한 연구가 최근 계속되고 있다.

수지상세포는 종양백신에 사용되는 강력한 세포성 면역보강제로 많은 연구가 되고 있다. 수지상 세포를 사용하는 이유는 종양세포에 특이적으로 작용하는 항원-특이적인 세포독성 T세포를 유도하기 위해서는 MHC class I 분자에 항원이 제시되 는 과정이 필수적인데, 수지상 세포는 강력한 항원제시세포로서 기능을 할 수 있기 때문이다. 항원-특이적인 세포 독성 T 세포 유도에 사용되는 항원제시세포 중 수지상 세포는 골수에서 기원하여 말초 부위(peripheral site)에서 미성숙 상태로 존재한 후 항원을 인지하여 증식이 억제된 T세포를 자극하여 항원에 대해 활성을 갖는 T세포의 면역반응을 개시하거나 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한 수지상 세포는 세포 독성 T 세포 이외에도 면역반응에 관여하는 MHC, CD80, CD86, LFA(lymphocyte function-associated antigen) 1 및 3, I CAM(intracellular adhesion molecule) 1 및 3 등의 분자를 높은 수준으로 발현하므로 항종양 면역 반응을 유도하기 위하여 사용되는 항원제시세포로서 바람직하다.

수지상 세포가 면역치료를 위한 이상적인 백신으로 생각되지만, 수지상세포는 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 희박하게 존재하며, 시험관 내(in vitro)에서 잘 증식하지 않기 때문에, 임상적용을 위해서는 수지상세포의 이용에는 많은 제한점이 존재한다. 따라서, 종래의 수지상세포를 사용하는 백신에 비하여 간편하고 안전하며 반복 투여가 가능한, 효과적인 아쥬번트를 포함하는 단백질 백신은 유망한 종양항원 특이면역 치료법이 될 수 있다. 본 발명자들은 HIV-1 TAT 펩타이드가 거대분자(macromolecules)을 세포 안으로 이동시킬 수 있으며, 단백질들이 MHC(major histocompatibility complex)class I의 세포독성 T세포 반응의 면역원으로 작용함을 이용하여 HIV-1 TAT 펩타이드와 항원이 연결된 융합단백질 백신이 항원 특이적 면역반응을 수행할 수 있도록 신규한 재조합 융합 단백질을 제조하였고, 이의 면역 효과를 극대화하는 아쥬번트를 선별함으로써, 수지상세포 백신의 항종양 효과와 동 등한 효과를 가지면서도 간편하고 안전하며 반복 투여가 가능한 항원 특이 면역 치료제를 제공할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항종양 면역반응을 유도하는 HIV TAT(transactivator protein)의 단백질전달도메인(protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노 말단에 연결된 항원을 포함하는 융합단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 융합단백질과 아쥬번트를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 증강된 면역반응을 유도하는 HIV TAT(transactivator protein)의 단백질전달도메인(protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노 말단에 연결된 항원을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 융합단백질을 제조하기 위하여 pET15b 플라스미드에 primer를 이용하여 항원을 증폭하고 XhoⅠ과 BamH I의 절단효소를 사용하여 클로닝 한 후, HIV TAT의 PTD 를 클로닝하여 융합단백질 발현을 위한 재조합 발현벡터를 제작한다. 상기 재조합 발현벡터는 BL21 competent cell 에 도입되고, 형질전환된 세포주는 LB ampicillin 액체 배지에서 배양하고 발현 중에 IPTG(isopropyl-β-thiogal-actoside)를 넣어 단백질의 대량 생산을 유도한다. pET15b의 His-Taq과 Ni-NTA resin의 결합을 이용하여 융합단백질을 정제하며, SDS-PAGE법과 Western blot을 통해 단백질의 발현과 크기를 확인한다.(도 1(b) 및 도 6(b))

상기 PTD는 47-57번째 잔기인 ‘YGRKKRRQRRR’(서열번호 1)를 사용하였다. 이러한 아미노산 잔기는 세포내로 단백질을 전달할 수 있으며, 또한 양이온의 특성을 가지고 있으므로 본 발명에서 사용한 아쥬번트(CpG, polyIC 등)과 결합하여 아쥬번트와 항원이 생체내에서 희석되지 않고 주입한 부위에서 집중적으로 작용함으로서 면역반응을 강화한다. 이에 연결되는 항원은 종양항원, 감염체 항원 등의 전체 또는 일부분이며, 본 발명의 일실시예에서는 암태아항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 의 D1 도메인(서열번호: 2, 서열번호: 9) 및 서비빈(SURVIVIN)(서열번호: 3, 서열번호: 10)을 항원으로 사용하였으며, 상기 항원을 적절한 프라이머를 사용하여 증폭하여, 이를 pET15b 플라스미드에 클로닝하였다.

종양세포에 특이적으로 작용하는 항원-특이적인 세포 독성 T세포를 유도하기 위하여 종양연관 항원을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서 사용된 암태아항원(carcinoembryonic antigen, CEA)은 이는 180kDa의 암태아성 당단백질이며, 용해성의 종양 표지자이다. 암태아항원은 대장직장암, 위암, 췌장암에서 95％ 이상 발현되고, 유방암의 약 50％, 비소세포성 폐암의 70％에서 광범위하게 발현된다.

사람 암태아항원을 암호화하는 서열이 전체적으로 밝혀졌으며(Thompson JA , Grunert F, Zimmermann W. Carcinoembryonic antigen gene family : molecular biology and clinical perspectives . J Clin Lab Anal 5: 344-66, 1991.), 본 발명에서는 서열번호 2의 암태아항원의 D1도메인을 클로닝하여 TAT-CEA D1도메인(이하“TAT-CEA“이라 한다.) 융합단백질을 제조하였다. 본 발명에서 사용된 서열번호 2의 암태아항원의 D1도메인은 암태아항원의 항원성을 가지면서도, 세균에서 생산이 용이한 부위이다.

서비빈(SURVIVIN)은 세포사멸을 억제하는 IAPs(inhibitor of apoptosis) 단백질 족의 한 요소이며, 본 발명에서 HIV TAT와 융합되어 생체 내에서 항종양 면역반응을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명자들은 TAT-항원 융합단백질의 단독 투여 및 아쥬번트와의 혼합 병용투여에 따른 항종양 면역반응을 관찰하였다.

"아쥬번트"는 면역 반응을 향상시키는 물질을 말한다. 본 발명의 아쥬번트는 CpG-ODN, Poly I:C 인터페론, 인터루킨 또는 사이클로스포린 A 등에서 하나 이상 선택할 수 있으며, 본 발명의 구체적 실시에서는 CpG-ODN과 Poly I:C를 사용하였다.

CpG-ODN(cytosine-phosphorothioate-guanine-oligodeoxynucleotides)은 올리고디옥시뉴클레오타이드 (oligodeoxynucleotides; ODN)를 포함하고 있는 비메틸화 상태의 면역조절인자 및 아쥬번트로서, APCs(antigen presenting cells)의 TLR9(toll like receptor 9)에 결합함으로써 Th1-타입의 면역반응을 유도하는 물질이다. 또한 CpG-ODN은 B 세포, NK 세포, 수지상 세포(dentritic cell) 등을 활성화시켜 IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-γ 등의 다양한 사이토카인을 분비시키는 물질이다.

CpG-ODN의 혼합 병용사용에 따른 TAT-항원의 융합단백질의 항종양 면역효과의 증가 효과를 실험하였다.

C57BL/6 마우스에 일주일 간격으로 피하에 2회 걸쳐 주사 한 후, 일주일 후에 마우스를 희생시켜 비장을 적출하여 정제된 T 세포를 분리하였다. 이 T 세포를 미리 고정시킨 MC38/CEA2 표적 세포와 배양기에서 재 자극 시킨 후, 종양에 특이적인 세포독성 T 세포의 활성 및 IFN-γ 의 생성정도를 확인하였다. 대조군으로 PBS를 사용하였으며, 각 실험군은 항체 단독 투여군, TAT-항원 융합단백질 투여군, 항체와 CpG-ODN의 혼합 병용투여군, TAT-항원 융합단백질과 CpG-ODN의 혼합 병용 투여군을 사용하였다. 그리고 암태아항원(carcinoembryonic antigen, CEA)의 경우에는 positive control로 암태아항원(carcinoembryonic antigen, CEA) 감작 수지상 세포 백신을 사용하여, 항종양 면역반응의 정도를 비교하였다.

실험결과, TAT-항원 융합단백질 및 CpG-ODN을 혼합 병용하여 백신한 마우스는 항원과 CpG-ODN 혼합 병용백신이나 TAT-항원 백신에 비해 세포 독성 T 림프구 활성과 인터페론- γ 분비 T 세포 등에서 항원 특이 면역 반응이 증가되었으며, TAT-항원 융합단백질만을 사용한 경우의 면역반응 보다 60~90배 이상 증가된 면역활성을 나타냄을 알 수 있다. 또한 TAT-항원 융합단백질 및 CpG-ODN 혼합 병용백신은 Th1 타입 면역반응을 유도하여, 항원 특이 IgG2a/IgG1 항체의 비율이 높았다. MC38/CEA2를 이용한 종양 모델에서도 TAT-항원 융합단백질 및 CpG-ODN 혼합 병용백신의 생존률이 증가 되었으며, TAT-항원 융합단백질 및 CpG-ODN 혼합 병용백신은 CEA 펩타이드 감작 수지상세포 백신과 유사한 항종양면역반응을 보였다. 이러한 결과들은 CpG-ODN 아쥬번트를 TAT-항원 융합단백질과 혼합 병용백신으로 사용하면 항종양효과를 증가시키는 강력한 제제가 될 수 있음을 보여준다.

본 발명에 따른 항종양 백신 조성물은 세포독성 T 세포 활성을 증가시키고, 인터페론-γ(IFN-γ) 생성을 증가시키며, Th1 타입의 면역반응을 유도함으로써 항종양 면역효과를 나타내고, 종래의 수지상세포를 사용하는 백신에 비하여 비용이 저렴하고 간편하며, 안전하고 반복 투여가 가능하기 때문에 유망한 백신치료제로서 사용 될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

1-1. 세포주 및 실험동물

하기의 실시예에서 사용된 모든 세포주 및 실험동물의 준비는 다음과 같다.

6주에서 8주의 Female C57BL/6(H-2Kb) 쥐를 오리엔트(가평, 경기, 한국)에서 구입하였다. MC38/CEA2 선암 세포주는 Dr J. Schlom (종양면역 및 생물과, NIH,미국) 으로부터 입수하였다. 인간 CEA (MC38/CEA2)를 발현하는 쥐의 colon adenocarcinoma 세포는 MC38 세포들을 CEA cDNA로 RNA 종양 바이러스 형질전환함으로써 제조하였다. MC38/CEA2세포, MC38세포 및 GL26세포들은 10％의 열에 불활성 화된 FBS(우태아 혈청),100 U/ml 페니실린, 및 100㎍/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 포함된 complete DMEM(Dulbecco’'s Modified Eagle Medium;BioWhittaker사, 미국)배지에서 배양하였다.

MHC(major histocompatibility complex) I 의 발현을 증진시키기 위하여, 재자극 및 세포 독성 T 세포의 세포독성 측정 전에, MC38/CEA2 세포는 50 IU/mL의 쥐 인터페론 γ(murine interferon (IFN)-γ;Endogen Inc.사 제. 미국) 으로, 37°C에서 48시간 처리되었다.

1-2. 아쥬번트 CpG - ODN

여러 종류의 CpG-ODN 중 C57BL/6 쥐에 작용하는 Sequence 1826 (5′-TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT-3′(Hso -Chi Chaung . CpG oligodeoxynucleotides as DNA adjuvants in vertebrates and their applications in immunotherapy. international immunopharmacology 6: 1586-1596,2006) 을 갖는 CpG-ODN은 단백질 항원과 함께 아쥬번트 활성을 가진다. CpG-ODN(바이오니어 사 제,한국) 에서 구입하였으며, 뉴클레아제 -저항성(nucleaseresistant) 포스포로씨오에이트 백본(phosphorothioate backbone)으로 합성되었다. CpG-ODN은 수용성이며, 검지할 수 없는 세포 내 독성을 가진다.

1-3. 시험관 내 전사를 통한 CEA RNA 생성

pcDNA3-CEA 벡터는 SmaI으로 절단되어 선형화되었고, mMessage in mMachine ™ Ultra T7 kit(Ambion 사 제, 미국)로 manufacturer의 지시대로 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 수행하였다. mRNA 농도 및 질(quality)은 스펙트로포토미터(spectrophotometer) 및 agarose gel 전기영동을 사용하여 측정하였다. RNA 샘플은 formaldehyde/agarose gel 전기영동을 사용하여 크기 및 보존상태(integrity)를 주기적으로 확인하였으며, 70°C로 저장하였다.

1-4. CEA RNA 가 도입된 수지상세포의 준비

수지상세포는 Kim CH(Kim CH, et al., Cancer Immunol Immunother 2006; 55: 130919) 등에 의해 기술된 절차를 사용하여 생산하였다. 쥐의 골수(mouse bone marrow)에서 20 ng/mL의 쥐의 재조합 GM-CSF(granulocytemacrophage colony-stimulating factor) 및 20 ng/mL 의 IL-4 (R&D Systems사 제, 미국)를 사용하여 제조되었다. 7일 째의 전기천공법(electroporation)전에, 미성숙한 수지상세포는 serum-free medium 으로 2번 세척하고, 1 × 10⁷ cells/mL의 최종농도까지 재현탁(resuspended) 되었다. 200 μL의 세포 현탁액은 얼음에서 5분 동안 0.2-cm 구멍의 전기천공 큐벳(electroporation cuvette)에서 미리 인큐베이션 되었다. 다음으로, 20 μg의 RNA를 부가하고, 세포는 ECM 830 electroporator(BTX사, 미국)로 300 V의 전압과 50 μs의 시간간격으로 전자파를 적용하였다. 전기천공(electroporation)후에 세포들은 즉시 성숙 배지로 이동되었으며, 37°C에서 24시간 동안 배양되었다. 전기천공(electroporation)후 80%이상의 세포활성을 보였 다. 수지상세포에서 전기천공법(electroporation)에 따른 트랜스펙션(transfection) 효율은 FACS(fluorescenceactivated cell sorting) 분석을 이용하여 EGFP(enhanced green fluorescent protein)RNA로 결정하였다.

<실시예 2> TAT-CEA 융합단백질 제조

2-1. TAT - CEA 융합단백질 발현 벡터의 제조

CEA cDNA는 XhoI 부위를 포함하는 CEA domain 1(A1-B1) 센스 프라이머 5′-ACG CCA TAT GCT GCT GAT CCA GAA CA-3′(서열번호4) 및 BamHI 부위를 포함하는 CEA domain 1 안티센스 프라이머 5′-ATA TGG ATC CCG TCG TGA CTG TGG TCC T-3′(서열번호 5)를 사용하여 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)법으로 LoVo 세포주로부터 증폭하였다. 얻어진 RT-PCR 산물을 XhoI 과 BamHI으로 절단하고, 절단된 DNA 절편(fragment)을 젤 분리하였다.

CEA DNA 절편들은 pET-15b벡터(Novagen 사 제,미국)의 XhoI 및 BamHI부위에 클로닝 되었다. 본 플라스미드는 Escherichia coli DH5α(Real Biotech Corp.대만)으로 도입되었으며, 앰피실린(ampicillin)으로 선별되었다. HIV-1 TAT의 세포 내부 접착 도메인은 plasmid pNL4-3을 주형으로 하여 5′및 3′말단의 NdeI and XhoI 제한위치에서의 PCR을 통하여, 작은 TAT peptide , ‘YGRKKRRQRRR’를 제작하였다. 상기 절편은 NdeI and XhoI으로 절단하고, pET15b-CEA domain 1의 대응하는 제한효소 부위에 서브클로닝 되었다. 그 결과 도 1a에 도시된 개열지도의 플라스미드 pET15b-TAT-CEA domain 1 벡터를 제조하였으며, 상기 벡터는 정제되고, 다시 BL21 세포에 도입되었으며, 최종 100 μg/mL농도의, 앰피실린을 포함하는 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양되었다.

2-2. TAT - CEA 융합단백질의 생산

E. coli 의 BL21 strain은 박테리오파지 (bacteriophage) T7 프로모터를 포함하는 발현벡터에 존재하는 유전자를 발현할 수 있다. 실시예 2-1의 pET-15b 플라스미드로 형질전환 된 BL21 세포는 1.5 mmol의 IPTG(isopropyl β-D thiogalactoside)로 단백질 발현이 유도되었으며, 3시간 동안 배양되었다. 세포를 수집하여 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 세포 상층액은 실온(room temperature)에서 Buffer Z 와 10 mmol 이미다졸(imidazole)로 미리 균형화된 (Ni² ⁺ (Ni-NTA superflow;Qiagen사 제, 미국) 적용되어 중력에 의해 분리되었다. 다음으로, 점차적으로 유레아(urea)의 농도가 6.0에서 1 mol로 감소하고, 이미다졸의 농도가 점차 증가하는 재접힘(refolding)버퍼를 첨가하였다. 최종 산물은 잔존 염기를 제거하기 위하여 하루밤 투석(overnight dialysis)이 수행되었으며, 0.1 mol urea와 1 mol의 imidazole에서 획득되었다.

western blot 분석을 위하여, 정제된 단백질을 12.5％ SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용해서 분리한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인은 PBS(phosphate buffered saline)에서 5％ 무지방 우유와 함께 배양되었고, 그 후 4°C.에서 하루밤 동안 항 -His monoclonal antibody (mAb) 함께 배양하였다. 세척한 후에, 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 알칼라인 포스파테이즈-접합 고우트 항-마우스 IgG 항체(Amersham Biosciences사 제, 영국)를 사용하여 배양하였다. 면역 반응 밴드는 ECL 웨스턴 블라팅 분석 시스템(Amersham Biosciences사 제, 영국)을 사용하여 검출하였다.(도 1b).

<실시예 3> 세포 독성 T 세포 활성 측정

생체 내( in vivo )에서 초기 세포독성 T세포의 유도를 위하여, 동계의 (syngeneic) 쥐 그룹에 50 μg 의 CEA 단백질 [CEA], 50 μg 의 CEA 와 2 μmol의 CpG-ODN [CEA + CpG], 50 μg 의 CpG-ODN을 제외한 TAT-CEA 단백질[TAT-CEA]을 투여하였으며 대조군으로 PBS[PBS]를 투여하였다. CEA peptide를 함유하는 수지상세포[CEA peptide/DC]의 백신 투여는 Oh ST 등이 사용한 방법대로 수행되었다(Oh ST et al. Vaccine 2006; 24: 28608). 최초 투여일이 0일이며, 7일 째 되는 날에 쥐들은 상기의 방법과 동일하게 백신투여 되었다. 7일째의 2 번째 백신 투여 7일 후에 쥐들을 죽여서 비장세포(splenocytes)를 얻어 균질화하고, 적혈구(red blood cells (RBC))를 저삼투(hypotonic) 버퍼로 용해하였다.

비접착의 비장세포(splenocytes)는 90분 동안 플라스틱에의 접착을 통하여 수지상세포, 마크로파지 및 단핵구(monocytes)로부터 분리되었으며, 효과 세포(effector cell)로 사용되었다.

표적세포의 세포중개 살해 측정은 다양한 효과세포 대 표적세포의 비율로 표 준 4시간 크로미움(chromium) 어세이를 사용하여 시험관 내에서 수행되었다.

비장세포(splenocytes, 2×10⁷)는 10 IU/mL의 interleukin (IL)-2의 존재 하에4 %의 paraformaldehyde 및 미리 고정된 MC38/CEA2 세포와 5일 동안 재-자극되었다. MC38/CEA2, MC38 및 GL26 종양세포들은 3.7 mBq of [51Cr] sodium chromate/10⁶ cell에서 1시간 동안 표시(label)되었고, 5번 세척되었으며, 효과세포들의 비율을 달리하여 bottom microtiter plates의 4배수 웰에 첨가되었다. 효과세포(E)와 표적세포(T)의 비율(E : T)은 각각 10:1, 20:1,및 40:1로 실험하였다. 37°C에서 4시간동안 배양 후에, 각 웰에 100 μL의 상층액이 수집되었고 방사능은 감마 카운터(gamma counter)를 사용하여 측정하였다. 특이 용해의 비율은 Kim CH,et al.(Kim CH , et al ., Cancer Immunol Immunother 2006; 55: 130919) 등에 의해 기술된 절차를 사용하여 계산하였다.

TAT-CEA 와 CpG의 혼합 병용 및 CEA peptide/DC로 면역화된 쥐의 비장에서 동계의 MC38/CEA2 표적 세포에 대한 세포독성 실험은 도2b에서 보여지는 바와 같이, 다른 기준 집단(control group)의 면역화된 쥐들의 세포독성 보다 현저히 높게 나타났다. 이 세포독성 T세포(CTL) 활성은 도 2c및 2d에서 나타나는 바처럼, CEA-미포함 MC38 또는 관련성 없는 GL26 에 대하여 세포독성 활성을 보여주지 않는다는 점에서 CEA 특이적이다. 즉 본 실험을 통하여 TAT-CEA와 CpG-ODN을 혼합 병용사용하여 백신투여한 것이 생체 내에서 종양 특이적 세포독성 T세포(CTL) 반응을 증가시키는 것을 확인하였다. 세포 살해능은 기준 집단(control group)으로 백신 투여 된 효과세포에서는 관찰되지 않았다. 게다가, 효과세포들은 YAC-1표적 세포를 용해하지 않았으며, 이는 세포살해활성이 NK-세포를 통하지 않는 다는 것을 의미한다. (data not shown).

<실시예 4 > ELISPOT(Enzyme-linked immunospot) assay를 통한 IFN-γ생성 측정.

ELISPOT 키트(AID사 제, 독일)를 제조사의 방법에 따라 사용하였다. 간단하게, 미리 고정된 MC38/CEA2 세포와 5일 동안 재-자극된 비장세포는 세포 배지에서 1 × 10⁵cells/well의 농도로 항-쥐 IFN-γ(antimouse IFN-γ) 항체로 코팅된 96-well 마이크로플레이트(microplate)에 시드되었다. CEA RNA-전기천공된 수지상세포(5 × 104 cells/well)로 18 시간 동안 자극되었다. 플레이트는 37°에서 24시간 동안 배양되었다. 스폿(spot)이 나타난 후에 반응은 증류수로 중지하였으며, 플레이트는 암실에서 하루 밤 동안 건조되었다. 항원 특이적으로 IFN-γ를 생산하는 (종양 특이적) 세포독성 T 세포의 수는 자동 AID-ELISPOT-Reader를 사용하여 결정되었다.

도 3은 1 × 10⁵의 비장세포 당 IFN-γ의 평균숫자를 나타내고 있으며, TAT-CEA와 CpG-ODN의 혼합 병용 백신 및 CEA peptide/수지상세포로 백신 면역된 쥐들의 비장세포들은 IFN-γ-분비 T 세포의 숫자가 현저히 증가함을 볼 수 있다. 반대로, 다른 실험군 및 대조군은 IFN-γ를 유의미하게 생성하지 않는다. 이 결과들은 TAT-CEA와 CpG-ODN로 혼합 병용 백신면역된 쥐들이 CEA 특이적 면역반응을 증가시킴을 보여주고 있다.

<실시예 5> 쥐의 면역글로불린 변화(isotyping)

Mouse Immunoglobulin Screening/Isotyping Kit (Zymed Laboratories, Invitrogen Immunodetection)를 사용하여 특정 면역글로불린 서브클래스 항체에 대하여 실험되었다. 간략하게, 96-well 플랫 바텀 마이크로 플레이트(flat bottom microplate)는 500 ng/well의 CEA단백질로 코팅되었으며, PBS로 희석되고, 4°C에서 하루 밤 동안 배양되었다. 플레이트는 37°C에서 1시간 동안 1% 의 BSA(bovine serum albumin)을 포함하는 200 μL PBS로 봉쇄(block)되었다.

1% PBS에서 1:10 희석된 세럼이 각 웰에 50 μL씩 첨가되었고, 37°C에서 30분 동안 배양되었다. 플레이트는 블랭크(기준)를 50 μL의 PBS, 키트 안에 포함되어 있는 비오틴-처리된 항체(biotinylated antibody)의 한 방울(negative control) 및 키트 안에 포함되어 있는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, Ig A, 및 IgM의 항체들 한 방울로 실온에서 15분 동안 배양되었으며, horseradish peroxidase (HRP)treptavidin와 함께 실온에서 15분 동안 추가적으로 배양되었다.

마지막으로, 본 키트에서 제공하는 citrate buffer 에 ABTS (2,2′-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) 와 수소를 포함하는 100 μL 의 working substrate solution을 첨가하였다. 흡수율은 자동화된 ELISA reader(Molecular Devices사 제, 미국)를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.

본 발명자들은 IgG1과 IgG2a의 양을 측정하였으며, 도 4a에서 나타난 바와 같이 IgG2a양이 다른 그룹보다 TAT-CEA 와 CpG-ODN이 혼합 병용하여 백신 투여된 세럼에서 현저히 높게 나타남을 확인하였다. TAT-CEA 와 CpG-ODN이 혼합 병용하여 백신 투여된 쥐들은 IgG2a/IgG1비율이 다른 그룹보다 높은 결과를 보여준다.(도 4b). IgG1은 Th2-연관된 항체이며, IgG2a는 Th1-연관된 항체이기 때문에, 도 4a 및 4b에서 나타난 실험결과는 Th1 과 Th2 세포의 비율을 통하여 생체 내에서 TAT-CEA 와 CpG-ODN의 혼합 병용백신 투여를 통한 항원 특이적 항체반응 조절 효과를 의미한다. 결론적으로, CpG-ODN은 TAT-CEA에 의하여 유발된 Th1 유형의 면역반응을 증진시킨다.

<실시예 6 > 항종양 면역효과 측정

TAT-CEA 와 CpG-ODN의 혼합 병용투여가 종양 특이적 세포독성 T 세포를 유도하기 때문에, 본 발명자들은 백신처리에 따른 항종양 면역효과를 실험하였다. 쥐들에 1 x 10⁶ MC38/CEA2의 종양세포를 주입하였다. 쥐 7마리가 각 그룹별로 사용되었으며, 종양세포 접종 10일 째 되는 날에 쥐들은 TAT-CEA 및 CpG-ODN 혼합 병용백신과 CEA peptide/DC, CEA, TAT-CEA, PBS로 5주 동안 일주일 간격으로 백신 접종되었다.(도 5a), 종양의 부피와 생존률을 각각 도 5의 b 및 c에 도시하였으며, 종양의 부피와 생존률을 관찰 했을 때 TAT-CEA 및 CpG-ODN 혼합병용 백신 투여 그룹에서 종양 부피가 가장 많이 감소함으로써 TAT-CEA 및 CpG-ODN 혼합병용 백신투여 가 종양의 성장을 저해함을 알 수 있으며, 생존기간이 증가함에 따라 항종양 효과에 따른 우수한 생존률을 보임을 확인할 수 있다.

<실시예 7> TAT-서비빈(SURVIVIN) 융합단백질 제조

7-1. TAT - 서비빈 ( SURVIVIN ) 융합단백질 발현 벡터의 제조

TAT-서비빈(SURVIVIN) 융합단백질 발현벡터는 실시예 2-1.에 기재된 바와 동일하게 제작되었다. 서비빈(SURVIVIN) cDNA는 XhoI 부위를 포함하는 서비빈(SURVIVIN) 센스 프라이머 5′- CGAACTCGAGATGGGTGCCCCGACGTTG-3′(서열번호 6) 및 BamHI 부위를 포함하는 서비빈(SURVIVIN) 안티센스 프라이머 5′- GCAAGGATCCTCAATCCATGGCAGCCAG- 3′(서열번호 7)를 사용하여 RT-PCR(reverse transcriptasepolymerase chain reaction)법으로 LoVo 세포주로부터 증폭하였다. 얻어진 RT-PCR 산물을 XhoI 과 BamHI으로 절단하고, 절단된 DNA 절편(fragment)을 젤 분리하였다.

서비빈(SURVIVIN) 절편들은 pET-15b벡터(Novagen 사 제,미국)의 XhoI 및 BamHI부위에 클로닝 되었다. 본 플라스미드는 Escherichia coli DH5α(Real Biotech Corp.대만)으로 도입되었으며, 앰피실린(ampicillin)으로 선별하였다. HIV-1 TAT의 세포 내부 접착 도메인은 plasmid pNL4-3을 주형으로 하여 5′및 3′말단의 NdeI and XhoI 제한위치에서의 PCR을 통하여, 작은 TAT peptide , ‘YGRKKRRQRRR’를 제작하였다. 상기 절편은 NdeI and XhoI으로 절단하고, pET15b-서비빈(SURVIVIN)의 대응하는 제한효소 부위에 서브클로닝 하여, 플라스미드 pET15b-TAT-서비빈(SURVIVIN) 벡터를 제조하였으며, 상기 벡터는 정제되고, 다시 BL21 세포에 도입되었으며, 최종 100 μg/mL농도의, 앰피실린을 포함하는 LB(Luria-Bertani) 배지에서 배양되었다.

7-2. TAT - 서비빈 ( SURVIVIN ) 융합단백질의 생산

E. coli 의 BL21 strain은 박테리오파지 (bacteriophage) T7 프로모터를 포함하는 발현벡터에 존재하는 유전자를 발현할 수 있다. 실시예 7-1의 pET-15b 플라스미드로 형질전환된 BL21 세포는 1.5 mmol의 IPTG(isopropyl β-D thiogalactoside )로 단백질 발현이 유도되었으며, 3시간 동안 배양되었다. 세포를 수집하여 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 세포 상층액은 실온(room temperature)에서 Buffer Z 와 10 mmol 이미다졸(imidazole)로 미리 균형화된 (Ni2+ (Ni-NTA superflow;Qiagen사 제, 미국) 적용되어 중력에 의해 분리되었다. 다음으로, 점차적으로 유레아(urea)의 농도를 6.0에서 1 mol로 감소하고, 이미다졸의 농도가 점차 증가하는 재접힘(refolding)버퍼를 첨가하였다. 최종 산물은 잔존 염기를 제거하이 위하여 하루밤 투석(overnight dialysis)이 수행되었으며, 0.1 mol urea와 1 mol의 imidazole에서 획득되었다.

western blot 분석을 위하여, 정제된 단백질을 12.5％ SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 사용해서 분리한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼하였다. 멤브레인은 PBS(phosphate buffered saline)에서 5％ 무지방 우유와 함께 인큐베이트하였고, 그 후 4°C.에서 하루밤동 안 anti-His monoclonal antibody (mAb) 함께 배양하였다. 세척한 후에, 멤브레인을 실온에서 1시간 동안 알칼라인 포스파테이즈-접합 고우트 항-마우스 IgG 항체(Amersham Biosciences사 제, 영국)를 사용하여 배양하였다. 면역 반응 밴드는 ECL 웨스턴 블라팅 분석 시스템(Amersham Biosciences사 제, 영국)을 사용하여 검출하였다.

<실시예 8> TAT-서비빈(SURVIVIN) 융합단백질 및 CpG-ODN 혼합병용투여에 의한 세포 독성 T 세포의 유도 및 확인

생체 내( in vivo )에서 세포독성 T세포의 최초 유도를 위하여, 동계의 (syngeneic) 쥐에게 50 μg 의 TAT-서비빈(SURVIVIN) 단백질과 2 μmol 의 CpG-ODN이 백신 투여되었다. 쥐 그룹은 50 μg 의 서비빈(SURVIVIN) 단백질 [CEA], 50 μg 의 서비빈(SURVIVIN) 와 2 μmol의 CpG ODN[CEA + CpG], 50 μg 의 CpG-ODN을 제외한 TAT-서비빈(SURVIVIN) 단백질, 또는 PBS가 백신 투여되었다. 서비빈(SURVIVIN) peptide를 함유하는 수지상세포[서비빈(SURVIVIN) peptide/DC]로 백신 투여된 것은 미리 설명된 바와 같다. 최초 투여일이 0일이며, 7일 째 되는 날에 쥐들은 상기의 방법과 동일하게 증가된 백신투여 되었다. 7일째의 증가된 백신 투여의 7일 후에 쥐들을 죽여서 비장을 적출하여 nylon mesh를 사용하여 정제된 T 세포를 분리하였다. 이 T 세포를 미리 고정시킨 MC38/CEA2 표적 세포와 배양기에서 재자극 시켰다. 51Cr-release assay와 IFN-γ ELISPOT assay 를 이용해 세포 독성 T 세포의 반응을 확인하였다. 도 7에 보여지는 바 처럼, IFN-γ발현 림프구 빈도 는 대조군으로 사용한 PBS나 TAT-서비빈(SURVIVIN)만으로 유도한 효과 세포보다 TAT-서비빈(SURVIVIN)과 CpG의 혼합병용 투여로 유도했던 실험군 효과 세포에서 아주 많은 스팟(spot)이 붉은 색으로 발색하는 것이 관찰되었다.

또한, TAT-CEA 단백질과 Poly I:C의 혼합병용 투여가 CpG ODN의 혼합병용 투여와 유사한 항종양 반응을 유도함을 CEA-특이 T 세포의 세포 살해능 측정결과로 보였고 도 8에 도시하였다.

TAT-CEA과 poly I:C의 병용투여(co-administration)로 유도했던 실험군 마우스의 효과세포(effector cell)는 positive control인 Tat-CEA+CpG 와 비슷한 수준으로 MC38CEA2 표적세포(target cells)에 대해서 강한 살해 활성(killing activity)를 보였다. 또한, NK-민감성 YAC-1세포에서도 이러한 lymphocytes에 의해 살해 활성이 나타나지 않았다. 다른 control로 유도했던 대조군의 lymphocytes에서는 CTL이 유도되지 않았다.

통계적 분석

결과는 평균± 표준편차로 나타내었다. 통계적 분석은 ANOVA 테스트를 이용하여 수행되었다. 생존 데이터는 KaplanMeier 테스트를 통하여 분석되었고, log-rank 테스트를 이용하여 비교되었다. 데이터는 P < 0.05.에서 통계적으로 유의미하다.

본 발명에 따른 백신 조성물은 세포독성 T 세포 활성을 증가시키고, 인터페론-γ(IFN-γ) 생성을 증가시키며, Th1 타입의 면역반응을 유도함으로써 백신 면역효과를 나타내고, 종래의 수지상세포를 사용하는 백신에 비하여 간편하고 안전하며 반복 투여가 가능하기 때문에 강력한 항원 특이면역 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 TAT과 CEA Domain 1의 cloning 개요도와 western blot을 이용한 TAT-CEA융합단백질의 발현을 확인한 것이다.

도 2는 종양에 특이적인 세포 독성 T 세포의 효과를 나타낸 것으로, 도 2(a)는 세포 독성 시험을 위한 백신계획을 도시한 것이며, (b) 내지 (d)는 각각 CEA가 발현하는 표적 세포 MC38/CEA2(b)와 CEA 발현하지 않는 표적 세포 MC38(c), GL26(d)에서의 세포 독성 T 세포의 활성을 보여준다.

도 3은 면역된 비장세포의 인터페론-γ 생성을 측정한 것으로, 면역된 비장세포를 재자극주어 전기 천공법으로 CEA RNA로 주입한 수지상세포와 함께 배양했을 때 ELISPOT　kit 이용하여 1 × 10⁵의 비장세포 당 IFN-γ의 평균숫자를 측정한 결과, TAT-CEA와 CpG-ODN의 혼합 병용 백신 및 CEA peptide/수지상세포로 백신 면역된 쥐들의 비장세포들은 IFN-γ-분비 T 세포의 숫자가 현저히 증가함을 나타낸다.

도 4는 백신투여가 면역글로불린에 미치는 영향을 나타내는 것으로, 도 4(a)는 2회의 백신 주사 후 일주일 뒤에 마우스의 혈장에서 IgG1과 IgG2a의 항체를 ELISA를 이용하여 측정한 결과를 나타내며, 도 4(b)는 각 그룹의 IgG2a/IgG1의 비율을 도시한다.

도 5는 백신투여에 따른 항종양 효과를 나타내며, (a)는 백신 투여 일정을 보여주고, (b), (c)는 각각 백신투여에 따른 종양의 부피 및 생존률을 도시한다.

도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 TAT과 서비빈(SURVIVIN)의 cloning 개요 도와 western blot을 이용한 TAT-서비빈(SURVIVIN) 융합단백질의 발현을 확인한 것이다. 도 6(b)에서 1 레인은 pET를 포함하는 E. coli strain BL21 의 추출물이며, 2레인은 pET-nSVV(서비빈(SURVIVIN)), 3레인은 IPTG로 유도된 pET-tatSVV, 4레인은 재조합 nSVV를 나타낸고, 5레인은 Ni-NTA resin으로 분리 된 tatSVV를 나타낸다.

도 7은 TAT-서비빈(SURVIVIN) 융합단백질 및 TAT-서비빈(SURVIVIN) 융합단백질과 CpG-ODN 혼합 병용백신투여에 따른 IFN-γ ELISPOT assay를 이용한 세포 독성 T 세포의 IFN-γ 생성을 도시한다.

도 8은 CEA-특이 T 세포의 세포 살해능을 측정한 결과이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> VACCINE COMPOSITIONS COMPRISING TAT-FUSION ANTIGEN PROTEIN AND ADJUVANTS <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> HUMAN IMMUNO DEFICIENCY VIRUS 1 TAT PTD <400> 1 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 209 <212> PRT <213> CEA D1 DOMAIN <400> 2 Leu Leu Ile Gln Asn Ile Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu 1 5 10 15 His Val Ile Lys Ser Asp Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe 20 25 30 Arg Val Tyr Pro Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser 35 40 45 Lys Pro Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu 50 55 60 Thr Gln Asp Ala Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro 65 70 75 80 Val Ser Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu 85 90 95 Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln 100 105 110 Asn Pro Val Ser Ala Arg Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu 115 120 125 Tyr Gly Pro Asp Ala Pro Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg 130 135 140 Ser Gly Glu Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro 145 150 155 160 Ala Gln Tyr Ser Trp Phe Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln 165 170 175 Glu Leu Phe Ile Pro Asn Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr 180 185 190 Cys Gln Ala His Asn Ser Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr 195 200 205 Thr <210> 3 <211> 142 <212> PRT <213> HUMAN SURVIVIN <400> 3 Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp 1 5 10 15 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala 20 25 30 Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr 35 40 45 Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 50 55 60 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His 65 70 75 80 Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu 85 90 95 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys 100 105 110 Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala 115 120 125 Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp 130 135 140 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SENSE PRIMER FOR CEA D1 <400> 4 acgccatatg ctgctgatcc agaaca 26 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANTISENSE PRIMER FOR CEA D1 <400> 5 atatggatcc cgtcgtgact gtggtcct 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SENSE PRIMER FOR SURVIVIN <400> 6 cgaactcgag atgggtgccc cgacgttg 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANTISENSE PRIMER FOR SURVIVIN <400> 7 gcaaggatcc tcaatccatg gcagccag 28 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> CPG-ODN SEQUENCE 1826 <400> 8 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 9 <211> 627 <212> DNA <213> HUMAN CEA DOMAIN 1 <400> 9 ctgctgatcc agaacatcat ccagaatgac acaggattct acaccctaca cgtcataaag 60 tcagatcttg tgaatgaaga agcaactggc cagttccggg tatacccgga gctgcccaag 120 ccctccatct ccagcaacaa ctccaaaccc gtggaggaca aggatgctgt ggccttcacc 180 tgtgaacctg agactcagga cgcaacctac ctgtggtggg taaacaatca gagcctcccg 240 gtcagtccca ggctgcagct gtccaatggc aacaggaccc tcactctatt caatgtcaca 300 agaaatgaca cagcaagcta caaatgtgaa acccagaacc cagtgagtgc caggcgcagt 360 gattcagtca tcctgaatgt cctctatggc ccggatgccc ccaccatttc ccctctaaac 420 acatcttaca gatcagggga aaatctgaac ctctcctgcc acgcagcctc taacccacct 480 gcacagtact cttggtttgt caatgggact ttccagcaat ccacccaaga gctctttatc 540 cccaacatca ctgtgaataa tagtggatcc tatacgtgcc aagcccataa ctcagacact 600 ggcctcaata ggaccacagt cacgacg 627 <210> 10 <211> 429 <212> DNA <213> HUMAN SURVIVIN <400> 10 atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60 acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120 gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180 ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240 tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300 tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360 aagaaagaat ttgaggaaac tgcgaagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420 atggattga 429

Claims

항원 특이 면역반응을 유발할 수 있는 백신 조성물로서,

(a) 서열번호 1의 HIV TAT(transactivator protein)의 단백질전달도메인(protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노 말단에 연결된 항원을 포함하는 융합단백질,(b) 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 또는 (c) 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터; 및

아쥬번트로서 CpG ODN, Poly I:C 또는 이들의 혼합물

을 포함하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 항원은 암태아항원(CEA)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 항원은 서열번호 2에 제시된 암태아항원(CEA) D1도메인임을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 항원은 서열번호 3에 제시된 서비빈(SURVIVIN)인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 6의 개열지도를 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
삭제
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 세포독성 T 세포 활성을 증가시키고, 인터페론-γ(IFN-γ) 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 Th1 유형의 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.