KR20240053098A

KR20240053098A - mTOR 억제제 특이적 결합 도메인, 재조합 단백질 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240053098A
Application number: KR1020220132225A
Authority: KR
Inventors: 임광석; 김수경
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2022-10-14
Filing date: 2022-10-14
Publication date: 2024-04-24

Abstract

본 발명은 mTOR 억제제 특이적 결합 도메인, 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, mTOR 억제제 결합 도메인을 포함하여, 세포 침투성 mTOR 억제제 결합 도메인 또는 HER2 표적 mTOR 억제제 결합 도메인을 제공함으로써, 세포 침투성 mTOR 억제제 결합 도메인은 자연계에 존재하는 아미노산에 기반한 구조를 가져 인공적인 분자 구조에 기반한 다른 전달체에 비해 생체 친화성이 높아 독성 및 화학적 결합이 없이 mTOR 억제제를 암세포 내로의 도입 효율을 증가시키고, 나아가 HER2 표적 mTOR 억제제 결합 도메인은 HER2 표적 단백질이 발현되는 세포에 대해 mTOR 억제제의 암세포 내로의 도입 효율을 증가시킴으로써, 항암 치료제로 활용될 수 있다.

Description

mTOR 억제제 특이적 결합 도메인, 재조합 단백질 및 이의 용도{mTOR inhibitor specific binding domains, recombinant protein and uses thereof}

본 발명은 mTOR 억제제 특이적 결합 도메인, 재조합 단백질 및 이의 용도를 제공한다.

종양은 흔하고 자주 발생하는 질병의 일종으로, 체내와 체외의 각종 종양 형성 요인의 장기적인 영향을 받은 신체의 조직 세포에, 유전자 돌연 변이가 발생하여 정상적인 성장과 분화 조절 능력을 상실하고, 클론성 비정상적 증식 및 분화에 의해 형성된 신생물 또는 증식물이다. 종양은 양성 종양 및 악성 종양으로 분류되며, 악성 종양은 또 상피 조직에서 발생하는 암, 간엽 조직에서 발생하는 육종 및 암육종을 포함하여 총 3가지로 세분할 수 있다. 대중들이 말하는 “암”은 일반적으로 모든 악성 종양을 가리킨다.

악성 종양은 인류 건강을 위협하는 주된 악성 질환 중 하나이며, 현재 전세계 인구의 사망 원인 중 1위이다. 최근 통계 데이터에 따르면, 2007년 전세계 약 790만 명이 다양한 유형의 암으로 사망하였고, 이는 총 사망자수의 13%를 차지하며, 1,200만 건을 초과하는 종양 발병 사례가 진단되었고, 그 중 72% 이상의 종양 환자 및 사망 사례가 저개발국가에서 발생하였으며, 지속적으로 증가하는 추세를 보이고 있다. 2015년 전세계 종양 사망자가 900만 명으로 늘어났으며, 2030년에는 1,200만 명을 넘어설 것으로 예상되며; 현재, 중국의 연간 암 발병자는 약 280만 명이며, 그 중 사망자는 40만 명을 초과하여, 중국에서 질병별 사망 원인 중 1위가 되었으며, 지속적으로 증가하는 양상을 보이고 있다. 현대 사회의 생활 리듬이 빨라지고, 경쟁 스트레스가 커지며, 인류 생활 방식 및 환경이 변화함에 따라, 종양의 발병률 및 사망자수는 해마다 증가하고 있으며, 현대 사회에서 흔한 발병과 높은 발병율로, 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 줄 뿐만 아니라, 가정과 사회에 무거운 경제적 정신적 부담을 주고 있으며, 전세계를 괴롭히는 중대한 사회적 문제가 되었는바, 암의 치료 및 예방은 전세계적으로 해결이 가장 시급한 문제 중 하나이다.

포유류 라파마이신 표적 단백질(mammalian target ofrapamycin, mTOR)은 비정형 세린/트레오닌 단백질 키나아제이며, 포스포이노시타이드-3-키나아제 (phosphoinositide 3 kinase, PI3K) 관련 단백질 키나아제 그룹 중 하나이다. mTOR는 생체 내에서 mTORC1 및 mTORC2인 2종류의 복합체 형태로 존재한다. mTOR는 영양, 에너지 및 성장인자와 같은 다양한 세포 외 신호를 통합하고, 유전자 전사, 단백질 번역, 리보솜 합성 및 세포 골격 합성과 같은 생물학적 과정에 참여하며, 세포의 성장, 증식, 사멸 및 대사에서 매우 중요한 역할을 수행할 수 있다. 신호경로 활성화의 초기 작용 인자는 주로 아미노산, 다양한 성장 인자 및 저산소증 등이다.

라파마이신을 포함한 다수의 mTOR 억제제들이 특정 암을 포함한 다양한 장애를 치료하는데 효과적이다. 다수의 mTOR 억제제, 예컨대 라파마이신은 난수용성이며, 따라서 부형제, 예컨대 계면활성제 및 용매를 필요로 하는 것으로 공지되어 있다. 이들 부형제는 특히 비경구로, 예컨대 피하로 투여되는 경우에 자극, 염증 및 감소된 효능을 유발할 수 있다.

그러나 현재 라파마이신을 포함한 mTOR 억제제의 전달 및 암 표적 시스템에 관한 연구개발이 부족한 실정이다.

1. 대한민국 공개특허 10-2019-0057345호

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain)을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포 침투성 펩타이드(CPP) 또는 HER2 표적 도메인; 및 mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain)으로 구성된 재조합 단백질을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 단백질 생산 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain)을 제공한다.

또한, 본 발명은 세포 침투성 펩타이드(CPP) 또는 HER2 표적 도메인; 및 mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain)으로 구성된 재조합 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 단백질 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 mTOR 억제제 특이적 결합 도메인, 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, mTOR 억제제 결합 도메인을 포함하여, 세포 침투성 mTOR 억제제 결합 도메인 또는 HER2 표적 mTOR 억제제 결합 도메인을 제공함으로써, 세포 침투성 mTOR 억제제 결합 도메인은 자연계에 존재하는 아미노산에 기반한 구조를 가져 인공적인 분자 구조에 기반한 다른 전달체에 비해 생체 친화성이 높아 독성 및 화학적 결합이 없이 mTOR 억제제를 암세포 내로의 도입 효율을 증가시키고, 나아가 HER2 표적 mTOR 억제제 결합 도메인은 HER2 표적 단백질이 발현되는 세포에 대해 mTOR 억제제의 암세포 내로의 도입 효율을 증가시킬 수 있다.

도 1은 mTOR 억제제 결합 도메인(이하 MBD라 함.), 세포 침투성 MBD(이하 TMBD라 함.) 또는 HER2 표적 MBD(이하 HMBD라 함.)가 각각 포함된 재조합 단백질을 나타낸 것이다.
도 2는 TMBD 및 HMBD 재조합 단백질의 mTOR 억제제 전달 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 MBD, TMBD 및 HMBD의 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 시로리무스(sirolimus)와 TMBD 재조합 단백질의 복합체를 SK-BR-3 및 MCF-7에 처리하여 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 시로리무스(sirolimus)와 HMBD 재조합 단백질의 복합체를 SK-BR-3 및 MCF-7에 처리하여 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 6은 에버로리무스(everolimus)와 TMBD 재조합 단백질의 복합체를 SK-BR-3 및 MCF-7에 처리하여 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 7은 템시로리무스(temsirolimus)와 TMBD 재조합 단백질의 복합체를 SK-BR-3 및 MCF-7에 처리하여 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 8은 템시로리무스(temsirolimus)와 TMBD 재조합 단백질의 복합체를 MDA-MB-231에 처리하여 항암 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 MBD 재조합 단백질을 SK-BR-3 및 BT-474에 처리해 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain)을 제공한다.

상기 mTOR 억제제는 시로리무스(Sirolimus), 에버로리무스(Everolimus) 및 템시로리무스(Temsirolimus)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 mTOR 억제제 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.

상기 세포 침투성 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.

상기 HER2 표적 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.

상기 재조합 단백질은 히스티딘 태그를 더 포함할 수 있다.

상기 재조합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.

본 명세서에서 용어, "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다.

또한, 본 발명은 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.

본 발명에 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능한게 연결된 코팅 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.

그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험 예 1> 재조합 단백질 생성

MBD 서열 3종(MBD, TMBD, HMBD)이 클로닝 된 pET28A 벡터가 삽입된 E.coli BL21(DE3)을 액체 LB 배지(카나마이신 0.001% 포함) 5 mL에 37 ℃, 180 rpm으로 약 3 시간동안 전배양 하였다. 이후, 전배양한 E.coli BL21(DE3)을 액체 LB 배지(카나마이신 0.001% 포함) 1 L에 37 ℃, 180 rpm으로 본배양하였다. O.D.값을 0.6~0.8까지 본배양하고 IPTG를 본배양 배지의 0.001 %만큼 넣고, 20 ℃, 120 rpm으로 16 내지 18 시간 배양하여 재조합 단백질을 생산하였다.

<실험 예 2> 재조합 단백질 정제

키운 E.coli BL21(DE3) 배지를 원심분리기로 4500 g, 20 분, 4 ℃ 하에 셀 다운 시키고 상등액을 버린 다음 침전물(Pellet)을 20 ml PBS로 분산(suspension)시켰다. 이후 음파처리로 셀을 파쇄시키고 RNase와 DNase를 각 10 μg/ml, 5 μg/ml 농도로 추가하고 4℃에서 15분 반응시켰다. 그리고 10000 g, 20 분, 4 ℃ 하에 셀 다운 시켰다. 상등액을 0.22 μm 필터로 거르고 Invitrogen^™의 Ni-NTA 아가로오스 3 mL 컬럼과 4 ℃, 1시간 반응시켰다. 이미다졸 농도가 차이나는 세척 완충액 1(5 mM), 2(20 mM) 및 용해 완충액(300 mM)을 준비하였다. 세척 완충액 1을 이용하여 10 CV(column volume) 펌프를 사용하지 않고 중력으로 정제하고 세척 완충액 2를 이용하여 3 CV 펌프를 사용하지 않고 중력으로 정제했다. 이후, 용해 완충액을 이용해 2 CV 펌프를 사용하지 않고 중력으로 정제하고 용해 샘플을 3 kDa 투석막을 이용해 PBS에서 4 ℃에서 밤새 투석하였다.

<실험 예 3> SDS-PAGE

바이오라드에서 판매하는 재료와 알려진 바이오라드 SDS 젤 제조법을 참고하여 SDS gel (10%)을 만들어 사용했다. 상기 실험 예 2에서 정제한 단백질을 준비하고 바이오라드의 2x Laemmli 샘플 완충액과 바이오라드의 멜캡토에탄올을 95:5로 섞어서 샘플 로딩을 준비하였다.이 완충액과 단백질을 1:1로 섞은 뒤 95 ℃에서 15분간 인큐베이션하였으며, 반응시킨 샘플을 SDS 겔의 각 웰에 넣어 주었다. 이후, 40 V에서 15분 러닝하고 120 V에서 약 1시간 정도 다시 러닝하였다. 이후, 겔을 잘 꺼내서 증류수에서 5 분씩 3 번 세척을 진행하였다. 바이오라드의 코마시 염색 용액을 넣고 1 시간 동안 염색을 진행하였고 염색된 겔에 DW를 넣고 세척을 10 분간 3 회 반복하였다. 겔을 네오 사이언스의 FluoroBox로 촬영하여 데이터를 얻었다.

<실험 예 4> 웨스턴 블롯

웨스턴블롯 역시 널리 알려진 방법으로 진행했다. 상기 실험 예 3과 같이 바이오라드에서 판매하는 재료와 알려진 바이오라드 SDS 겔 제조법을 참고하여 SDS 겔 (10%)을 만들어 사용했다. 상기 실험 예 2에서 정제한 단백질을 준비하고 바이오라드의 2x Laemmli 샘플 완충액과 바이오라드의 멜캡토에탄올을 95:5로 섞어서 샘플 로딩을 준비하였다. 이 완충액과 단백질을 1:1로 섞은 뒤 95 ℃에서 15 분간 인큐베이션하였으며, 이것을 상기 SDS 겔의 웰에 넣어 주었다. 이후, 40 V에서 15 분 정도 러닝하고 120 V에서 약 1 시간 정도 다시 러닝하였다. 러닝 후 겔을 잘 꺼내서 증류수에서 5 분씩 3 번 세척을 진행하였다. 이후, 바이오라드의 Trans-blot turbo Transfer Pack (BR170-4156)을 준비하여 제조사의 지침에 따라 샌드위치를 만들었따. 이를 바이오라드의 Trans-Blot Turbo blotting 시스템에 넣고 7 분 동안 러닝을 하였다. 이후, 멤브레인을 5% 스킴 밀크 (TBS로 제작)에 넣고 4 ℃에서 1 시간 동안 넣고 흔들었다. 그 다음 스킴 밀크를 버리고 TTBS (0.05% tween 20 in TBS)를 넣고 4 ℃에서 10 분씩 3 회 세척을 진행하였다. 1차 항체 (6x his tag 항체, Invitrogen)를 4 ℃에서 2 시간 동안 반응하였다. 반응 후 TTBS로 5 분씩 3 회 세척을 진행했고, 2차 항체 (HRP conjμgate, Invitrogen)을 4 ℃에서 2 시간 동안 반응하였다. 반응 후 TTBS로 5 분씩 3 회 세척을 진행하였다. 이후 바이오라드의 Opti-4CN를 제조사 지침에 따라 멤브레인에 처리하고 20분동안 빛에 노출하지 않고 반응시켰다. 이 멤브레인을 FluoroBox로 촬영하여 데이터를 얻었다.

<실험 예 5> 항암 효과 확인 실험

(1)약물 단백질 실험(no washing)

셀을 96 웰 플레이트에 시딩하여 배양하였다. 이때, SK-BR-3는 0.5 x 10⁴ cell/well, MDA-MB-231 및 MCF-7은 0.3 x 10⁴ cell/well로 시딩하고 37 ℃, 24 시간동안 배양하였다. mTOR 억제제와 단백질을 정해진 양으로 섞어 4 ℃, 2 시간 동안 반응하였다. 반응 후 DMEM 배지(10% FBS 1% P/S)로 최종 농도를 맞춰주었다. 농도를 맞춘 배지로 배지 교체 후 37 ℃, 48 시간 배양하였다.

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (sigmaaldrich)를 PBS에 3 mg/mL 농도로 녹인 MTT 시약 3 mg/mL이 10 % 포함된 DMEM 배지(10 % FBS, 1 % P/S)를 만들고, MTT 시약이 10 % 포함된 DMEM 배지로 배지 교체 후 37 ℃, 4 시간동안 배양하였다. 이후, 다이메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide. DMSO)로 배지 교체 후 상온 암실에서 30 분 이상 반응시켰다. Microplate Reader (BioTek)으로 570 nm에서 세포 생존능을 측정했다.

(2) 약물 단백질 실험 (washing)

셀을 96 웰 플레이트에 시딩하여 배양하였다. 이때, SK-BR-3는 0.5 x 10⁴ cell/well, MDA-MB-231 및 MCF-7은 0.3 x 10⁴ cell/well로 시딩하고 37 ℃, 24 시간동안 배양하였다.

mTOR 억제제와 단백질을 정해진 양으로 섞어 4 ℃, 2 시간 동안 반응하였다. 반응 후 DMEM 배지(1 0% FBS 1 % P/S)로 최종 농도를 맞춰주었다. 농도를 맞춘 배지로 배지 교체 후 37℃, 4 시간 배양하고, DMEM 배지(10 % FBS, 1 % P/S)로 배지 교체 후 37 ℃, 44 시간 배양하였다.

Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (sigmaaldrich)를 PBS에 3 mg/mL 농도로 녹인 MTT 시약 3 mg/mL이 10 % 포함된 DMEM 배지(10 % FBS, 1 % P/S)를 만들고, MTT 시약이 1 0% 포함된 DMEM 배지로 배지 교체 후 37 ℃, 4 시간동안 배양하였다. 이후, 다이메틸설폭사이드(Dimethylsulfoxide, DMSO)로 배지 교체 후 상온 암실에서 30 분 이상 반응시켰다. Microplate Reader (BioTek)으로 570 nm에서 세포 생존능을 측정했다.

<실험 예 6> 재조합 단백질의 세포내 도입

(1)세포 도입(cell uptake)

셀을 6 웰 플레이트에 0.5 x 10⁵ cell/well, 37 ℃, 24 시간 조건하에 시딩하여 배양하였다. 각 웰당 100 μg 단백질을 섞어 제조한 배지로 배지 교체한 후 4 시간, 48 시간 후에 세포 용해를 진행하였다. 각 시간별 샘플을 웨스턴 블롯으로 세포 내 단백질이 도입되었다는 것을 확인하였다.

(2) 세포 용해(cell lysis)

부착 세포가 자란 플레이트에 PBS로 세척을 진행하였다. 이후 37 ℃, 3 분 동안 트립신을 처리하여 세포를 떼어냈다. DMEM 배지(10 % FBS, 1 % P/S)를 이용해 트립신을 중화시키고 1500 rpm, 5 분 조건 하에 셀 다운을 진행하였다. 그 다음, 4 ℃ PBS로 세척을 진행하였다. 각 세포 당 ripa buffer를 100 μl 첨가해 4 ℃에서 30 분 반응시켰다. 그 후, 원심분리해 상등액을 얻고, 상등액은 -20 ℃에서 보관하였다.

<실시 예 1> 재조합 단백질의 발현 확인

상기 실험 예 1 및 2에서 합성 및 정제한 재조합 단백질이 제대로 발현되었는지 확인하기 위해 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯을 진행하였다.

그 결과, 도 3에 따르면, MBD 재조합 단백질에 대하여 PBD 재조합 단백질에 대하여 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 11.9 kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었고, 우측 웨스턴 블롯 결과에서도 같은 크기의 밴드가 확인되어 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다. 또한, TPBD 재조합 단백질에 대하여 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 13.7 kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었고, 우측 웨스턴블롯 결과에서도 같은 크기의 밴드가 확인되어 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다. 나아가, HPBD 재조합 단백질에 대하여 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 69.08 kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었고, 우측 웨스턴블롯 결과에서도 같은 크기의 밴드가 확인되어 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다.

<실시 예 2> 유방암 세포주에 대한 재조합 단백질과 mTOR억제제 복합체의 항암 효과

(1) 시로리무스(sirolimus)

시로리무스-TMBD 재조합 단백질 복합체 또는 시로리무스-HMBD 재조합 단백질 복합체의 유방암 세포주(SK-BR-3, MCF-7)에 대한 항암 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 4에 따르면, SK-BR-3(washing, no washing), MCF-7(washing, no washing) 각 군에서 시로리무스를 단일 처리한 경우에 비해 시로리무스-TMBD 재조합 단백질 복합체를 형성한 경우가 세포 생존능이 더 떨어져 암세포 내로의 mTOR 억제제의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 5에 따르면, HER2 양성 세포인 SK-BR-3(no washing) 군에서 시로리무스를 단일 처리한 경우에 비해 시로리무스-HMBD 재조합 단백질 복합체를 형성한 경우가 세포 생존능이 더 떨어져 암세포 내로의 mTOR 억제제의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, HER2 음성 세포인 MCF-7(no washing) 각 군에서는 시로리무스를 단일 처리한 경우와 시로리무스-HMBD 재조합 단백질 복합체를 형성한 경우가 세포 생존능이 동일하게 떨어짐을 확인하여, HER2 양성 세포인 경우에 한해, 재조합 단백질 복합체가 mTOR 억제제의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

(2)에버로리무스(everolimus)

에버로리무스-TMBD 재조합 단백질 복합체의 유방암 세포주(SK-BR-3, MCF-7)에 대한 항암 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 따르면, SK-BR-3(washing, no washing), MCF-7(washing, no washing) 각 군에서 에버로리무스를 단일 처리한 경우에 비해 에버로리무스-TMBD 재조합 단백질 복합체를 형성한 경우가 세포 생존능이 더 떨어져 암세포 내로의 mTOR 억제제의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

(3)템시로리무스(temsirolimus)

템시로리무스-TMBD 재조합 단백질 복합체 또는 템시로리무스-HMBD 재조합 단백질 복합체의 유방암 세포주(SK-BR-3, MCF-7, MDA-MB-231)에 대한 항암 효과를 확인하였다.

그 결과, 도 7에 따르면, SK-BR-3(washing, no washing), MCF-7(washing, no washing) 각 군에서 템시로리무스를 단일 처리한 경우에 비해 템시로리무스-TMBD 재조합 단백질 복합체를 형성한 경우가 세포 생존능이 더 떨어져 암세포 내로의 mTOR 억제제의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8에 따르면, MDA-MB-231(washing, no washing) 각 군에서 템시롤리무스를 단일 처리한경우에 비해 템시롤리무스-TMBD 재조합 단백질 복합체를 형성한 경우가 세포 생존능이 더 떨어져 암세포 내로의 mTOR 억제제의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.

<실시 예 3> 재조합 단백질의 세포 내 도입 결과

유방암 세포주(SK-BR-3, BT-474)에 MBD 재조합 단백질을 도입시켰다. 그 결과, 도 9에 따르면, SK-BR-3, BT-474 각각에 대해, 4시간 도입시킨 경우 보다 48시간 도입시킨 경우 더 많이 도입되었음을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain).
청구항 1에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 라파마이신(Rapamycin), 에베로리무스(Everolimus) 및 템시로리무스(Temsirolimus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain).
세포 침투성 펩타이드(CPP) 또는 HER2 표적 도메인; 및
mTOR 억제제 결합 도메인(mTOR inhibitor binding domain)으로 구성된 재조합 단백질.
청구항 3에 있어서,
상기 mTOR 억제제 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
청구항 3에 있어서,
상기 세포 침투성 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
청구항 3에 있어서,
상기 HER2 표적 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
청구항 3에 있어서,
상기 mTOR 억제제는 시로리무스(Sirolimus), 에버로리무스(Everolimus) 및 템시로리무스(Temsirolimus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
청구항 3에 있어서,
상기 재조합 단백질은 히스티딘 태그를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
청구항 3에 있어서,
상기 재조합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질.
청구항 3 내지 청구항 9 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
청구항 10의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
청구항 11의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포.
청구항 12의 재조합 세포를 배양하여 청구항 3항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 청구항 3 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질 생산 방법.
청구항 3 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.