KR20220021684A - 나르제니신 a1 유도체를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

나르제니신 a1 유도체를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나르제니신 A1 유도체를 포함하는 위암 치료, 예방 또는 개선용 조성물 등에 관한 것으로, 본 발명의 컴파운드 9은 위암세포에서 우수한 증식 저해 활성, 전이 억제 활성을 가지고 있으며, 특히 시클로필린(cyclophilin) A의 발현 및 활성을 억제하는 효과가 있다는 점을 확인하였는바 의약품, 식품 산업 등에서 위암 치료, 예방 또는 개선용도로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

나르제니신 A1 유도체를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating gastric cancer comprising narcenicin A1 derivative}
본 발명은 나르제니신 A1 유도체를 포함하는 위암 치료, 예방 또는 개선용 조성물 등에 관한 것이다.
의학의 발달과 생활환경의 개선으로 삶의 질은 높아졌지만, 여전히 암은 가장 치명적인 질병으로 여겨진다. 위암은 전 세계에서 폐암 다음으로 가장 일반적으로 발병하며, 우리나라에서도 전체 암 중에서 가장 많은 비중을 차지하고 있으며, 여성보다는 남성에서 높은 발병률을 보이고 있다.
위암을 치료하기 위해 외과적 절제, 화학요법 등이 이용되고 있으며, 치료의 효과를 높이기 위해서 여러 치료법이 병행되기도 하고, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료 사례가 달라질 수 있다.
위암은 조기에 발견하지 못하면 좋은 예후를 기대하기 어렵고, 기존 항암제에 의한 부작용으로 인해 새로운 치료방법의 모색이 필요하다. 이러한 문제를 해결하기 위해 천연물질에서 항암성분을 찾는 연구가 지속적으로 진행되고 있다
한편, 나르제니신 (Nargenicin)은 28탄소로 이루어진 매크로라이드계 항생제이다. 나르제니신은 그람 양성균에 탁월한 효과를 보이며 메티실린에 저항성이 있는 포도상구균에 강력한 항생제 역할을 해왔다. 또한, 세포분화를 유도하는 역할도 있으며 종양 질환에 사용되어 지기도 하지만 이의 유도체들의 항암 활성에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다.
대한민국 공개특허공보 10-2010-0071835
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
[화학식 1]
Figure pat00001
본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 포함하는 시클로필린(cyclophilin) A의 발현 또는 활성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00002
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00003
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 포함하는 시클로필린(cyclophilin) A의 발현 또는 활성 억제용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00004
본 발명의 일 구현예로 상기 조성물은 아팝토시스(apoptosis) 및 오토파지(autophage)에 의한 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 시클로필린(cyclophilin) A에 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 시클로필린(cyclophilin) A의 활성 억제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염과 시클로필린(cyclophilin) A의 결합에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 컴파운드 9은 위암세포에서 우수한 증식 저해 활성, 전이 억제 활성을 가지고 있으며, 특히 시클로필린(cyclophilin) A의 발현 및 활성을 억제하는 효과가 있다는 점을 확인하였는바 의약품, 식품 산업 등에서 위암 치료, 예방 또는 개선용도로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명 화합물의 항암 활성을 확인한 것으로, 도 1a 및 1b는 컴파운드 9의 위암세포 전이 억제 효과를 확인한 것이고, 도 1c는 컴파운드 9이 위암세포의 세포주기에 미치는 영향을 관찰한 것이고, 도 1d는 컴파운드 9이 위암세포의 아팝토시스에 미치는 영향을 관찰한 결과이며, 도 1e는 세포 사멸 형태를 DAPI, MDC, Lysotracker 염색 후 형광현미경으로 분석한 결과를 나타낸 것이다(본 발명의 도면에서 9 이란 컴파운드 9을 의미한다).
도 2는 컴파운드 9 처리에 의한 위암세포 아팝토시스 매커니즘을 확인한 것으로, A는 컴파운드 9 처리 후 아팝토시스 유도 인자의 발현을 확인한 것이고, B는 활성산소종 생성 정도를 확인한 것이다.
도 3은 컴파운드 9 처리 전후의 세포 내 프로테옴 발현 변화를 비교 분석한 내용을 나타낸다.
도 4a는 컴파운드 9 처리 후 후보 표적단백질의 발현 감소 정도를 나타낸 것이다.
도 4b는 컴파운드 9에 의한 시클로필린 A 하위 신호전달체계로의 영향을 분석한 것이다.
도 5는 DARTS 방법을 적용한 컴파운드 9과 시클로필린 A의 직접적 결합 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 컴파운드 9과 시클로필린 A의 도킹 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 시클로필린 A 유전자의 녹다운에 의한 위암세포 증식 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 시클로필린 A 유전자의 녹다운에 의한 위암세포 전이 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 9는 시클로필린 A 유전자의 녹다운에 의한 위암세포 자멸사와 세포주기 정지 활성 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 시클로필린 A 유전자의 녹다운에 의한 위암세포 내 관련 분자마커들의 발현 변화를 나타낸 것이다.
본 발명의 발명자들은 방선균 유래 천연 항생물질로 알려진 Nargenicin A1의 생합성경로를 재설계하여 신규 Nargenicin A1 유도체인 컴파운드 9을 확보하였고 상기 화합물이 위암에 대한 우수한 항암활성 및 표적단백질을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00005
다른 양태로서 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00006
본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 23-demethyl 8,13-deoxynargenicin으로 명명되고, Nargenicin A1 유도체이며, 이하 컴파운드 9으로 지칭한다. 상기 화합물은 방선균 유래 이차대사산물일 수 있으며 뛰어난 항암 활성을 가진다.
본 발명에서 항암 효과를 가지는 것은 화학식 1로 표시되는 화합물뿐만 아니라 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
본 발명에서 "약학적으로 허용가능한 염"은 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성 및 물성을 손상시키지 않는 임의의 무기산 또는 유기산 또는 염기와 형성된 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염과 같이, 당업계에서 통상적으로 사용되는 염을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서,“약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 위암 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 위암 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “개선”이란, 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 식품 조성물은 건강기능성 식품을 포함하는 개념이다.
본 발명의 식품 조성물에서 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 염을 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 염의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있다.
본 발명의 건강기능성식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 성분을 함유하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능성식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 아팝토시스(apoptosis) 및 오토파지(autophage)에 의한 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명에서 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 시클로필린(cyclophilin) A에 결합할 수 있다.
다른 양태로서 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 포함하는 시클로필린(cyclophilin) A의 발현 또는 활성 억제용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00007
본 발명의 일 구현예로 상기 시클로필린(cyclophilin) A의 활성 억제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염과 시클로필린(cyclophilin) A의 결합에 의한 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1: 실험방법>
실시예 1-1. 컴파운드 9의 제조 및 분리
NMR 스펙트럼은 TCI CryoProbe (5mm, Bruker, Billerica, MA, USA)가 장착된 Avance II 900 Bruker BioSpin NMR 분광기에서 획득되었다. UPLC-PDA 분석은 220 nm의 흡광도에서 PDA (UPLC-LG 500 nm)에 연결된 역상 C18 컬럼 (ACQUITY UPLC BEH, C18, 1.7 μm, Milford, MA, USA)을 사용하여 수행하였다. HR-QTOF ESI / MS 분석은 SYNAPTG2-S (Waters Corp., Milford, MA, USA)를 사용하여 양이온 모드로 수행되었다. 표적 화합물을 UV 검출기 (220 nm)에 연결된 C18 컬럼 (YMC- 팩 ODS-AQ-HG, 250x20 mm, 10 μm, Kyoto, Japan)으로 prep-HPLC에 의해 정제하였다. 사용된 모든 용매 및 화학물질은 분석 등급이고 상업적으로 구입 가능하다.
세균 균주, 플라스미드 및 배양 조건
E. coli XL1 및 JM110는 37 ℃에서 고체 또는 액체 LB 배지에서 성장시켰다. pGEM®-T Easy (Promega, Madison, WI, USA)를 클로닝 벡터로 사용하였다. pKC1139를 서브 클로닝 벡터로 사용하였으며 pULVK2A를 Nocardia sp. CS682의 유전자 불활성화 실험에 사용하였다. Nocardia sp. CS682의 배양 및 유전자 조작은 알려진 통상적인 프로토콜에 따라 수행되었다 (Dhakal, D., and Sohng, J. K. (2015) Laboratory maintenance of Nocardia species. Curr. Protoc. Microbiol. 39, 10F.1.1 - 10F.1.8. 및 Dhakal, D., Kumar Jha, A., Pokhrel, A., Shrestha, A., and Sohng, J. K. (2016) Genetic manipulation 참조).
0.2 % 오트밀, 0.2 % 효모 추출물, 0.2 % 대두박, 0.1 % 염화칼슘, 1 % 맥아당, 0.1 % 염화 마그네슘 및 0.4 % 글리세롤을 함유하는 DD 배지를 생산 배지로 사용하였다. 항생제는 필요한 경우 apramycin (50 μg / mL), ampicillin (100 μg / mL) 및 thiostrepton (150 μg / mL)를 첨가하였다.
nargenicin A1 BCG의 이종 발현 및 캡쳐
pCAP0321을 사용하는 표준 프로토콜을 사용한 nargenicin BCG의 클로닝을 위해 TAR (Transformation Assisted Recombination)을 구현하였다. 게놈 DNA를 TIANamp 박테리아 DNA 키트를 사용하여 분리 및 정제하였으며, 대략 100 μg의 정제된 DNA가 TAR에 사용되었다.
벡터 pCAP03을 PmeI로 선형화하고 442bp 캡쳐 단편을 상업적으로 합성하였다 (Gene Universal Inc. USA). Saccharomyces cerevisiae 균주 VL6-48N은 Vladamir Larionov 로부터 얻었으며 캡처 단편의 서열은 하기 표 1에 기재하였다.
[표 1]
Figure pat00008
pCAP03-nar를 제조하기 위해 Nocardia sp. CS682의 정제된 게놈 DNA에서 nargenicin BCG 전체를 포함하는 대략 72kb의 영역을 pCAP03을 사용하여 캡쳐했다. pCAP03-nar의 BCG는 게놈 시퀀싱 (Macrogen, Inc., 대한민국)에 의해 확인되었다. pCAP03-nar는 Streptomyces venezuelae/pCAP03-nar를 생성하기 위해 E. coli ET12567 / pCAP03-nar 및 E. coli ET12567 / pUB307과의 tri-parental conjugation을 통해 Streptomyces venenzuelae YJ028에 도입되었다. 음성 대조군은 빈 pCAP03 플라스미드를 사용하였다.
야생형 균주 Nocardia sp. CS682 (양성 대조군), S. venenzuelae / pCAP03-nar (생산자) 및 Streptomyces venezuelae / pCAP03 (음성 대조군)을 DD 배지(0.05 % MgCl2, 0.01 % L- 메티오닌 및 0.1 % FeCl3이 보충된 DD 배지)에서 6일간 성장시켰다. 그 다음, 배양물을 원심 분리하고, 상청액을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 대사물을 초고압 액체 크로마토그래피-고해상도 질량 분석법 (UHPLC-HRMS)을 사용하여 분석하였다.
유전자 녹아웃 플라스미드 구축
유전자 녹아웃 플라스미드는 pULVK2A를 기본 벡터로 사용하여 제작되었다. 상이한 유전자의 불활성화를 위해, 각각의 유전자의 업스트림 및 다운스트림 영역에 상동성인 2 개의 단편을 PCR로 증폭시키고, pKC1139에 순차적으로 클로닝 하였다(하기 표 2 참조).
[표 2]
Figure pat00009
마커 유전자(thiostrepton 내성)를 XbaI의 업스트림 및 다운스트림 유전자 사이에 클로닝 하였다. 업스트림, 저항성 마커 및 다운스트림을 함유하는 완성된 유전자 녹아웃 단편을 pULVK2A에서 클로닝 하였다. 모든 클로닝 단계는 E. coli XL1에서 수행되었고, Nocardia sp. CS682에서 형질 전환을 위한 탈메틸화된 플라스미드를 얻기 위해 최종 작제물을 E. coli ET-12567로 형질 전환시켰다.
Nocardia sp. CS682 결실 돌연변이체 구축 및 형질전환
Nocardia sp. CS682는 통상적인 프로토콜에 따라 전기 천공에 의해 형질전환 되었다. 간단히 말하면, electrocompetent cell의 제조를 위해 Nocardia sp. CS682를 30 ℃에서 4 일 동안 2 % 글리신을 함유하는 50mL BHI에서 성장시킨 후, 세포를 수확하고 50mL 아이스-콜드 워터로 2 회 세척하였다. 이어서, 세포를 1 mL의 아이스-콜드 10 % 글리세롤에 재현탁 시켰다. 100 μL의 electrocompetent cell을 형질전환마다 사용하였으며, 냉각된 전기 천공 큐벳 (Biorad)으로 옮겼다. 대략 ~ 0.5 μg의 플라스미드 DNA (하기 표 3 참조)를 첨가하고 전기 천공기 (Biorad, USA)를 사용하여 세포를 1.8 kV에서 펄싱 하였다.
[표 3]
Figure pat00010
각각의 형질전환에는 500㎕의 BHI broth를 첨가하였으며, 세포를 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션 하였다. 형질전환체의 확인을 위해 세포를 50 μg / mL apramycin 및 150 μg / mL thiostrepton을 함유하는 BHI 플레이트상에 플레이팅 하였다. 이중 크로스 오버 돌연변이체는 150 μg / mL thiostrepton 에서 성장하지만 apramycin 함유 플레이트에서는 성장하지 않는 콜로니를 선택하였으며, 특정 프라이머를 사용한 PCR 분석에 의해 확인되었다(상기 표 1 참조).
컴파운드 9의 분리
컴파운드 9의 분리를 위해, 500μL Nocardia sp. ΔM을 100mL의 BHI 배지에 접종하였다. 배양은 37 ℃, 200rpm에서 48 시간 동안 수행되었다. 5mL의 시드 배양액을 생산 배지인 400mL의 DD 배지를 함유하는 2L 삼각 플라스크에 접종함으로써 총 8L 발효를 수행하였다. 상기 8L 배양 배지를 원심 분리를 통해 상청액 및 세포 펠렛으로 분리하였다. 세포 펠릿을 아세톤으로 2 회 세척하고, 아세톤을 증발시켜 제거한 후, 추출물을 상청액에 혼합하였다. 배양액을 pH 3으로 유지된 2배 부피의 에틸 아세테이트로 3 회 추출하였다.
에틸 아세테이트 추출물을 감압 농축하여 조추출물 (2.9 g)을 생성하고, 상기 조추출물을 100mL 냉각된 메탄올에 용해시키고 0.2μM 시린지 필터로 여과하였다. UV 검출기 (220 nm)에 연결된 C18 컬럼 (YMC-Pack ODS-AQ-HG, 250x20 mm, 10 μm, 일본 교토)을 장착한 semi prep-HPLC을 정제에 이용하였으며 2mL의 샘플을 사용하였다. 정제 프로그램은 물 (0.025 % 트리 플루오로 아세트산) 및 아세토 니트릴을 사용한 이원 조건이었다 : 아세토니트릴(acetonitrile) 농도 10 % (0-5 분), 30 % (5-15 분), 60 % (15-25 분), 70 % ( 25-35 분), 90 % (35-40 분) 및 10 % (40-45 분) 그리고 마지막으로 10mL / 분의 유속으로 46 분에 멈추었다. 화합물에 상응하는 표적화된 피크를 수집하고, 진공 건조시켜, d6-DMSO에 용해시킨 다음 NMR을 이용하여 분석하였다. 화합물의 순도를 확인한 후, 화합물을 추가 효소 분석에 이용하였다.
상기 컴파운드 9의 제조 및 분리에 관한 내용은 Characterization of Tailoring Steps of Nargenicin A1 Biosynthesis Reveals a Novel Analogue with Anticancer Activities (https://dx.doi.org/10.1021/acschembio.9b01034 ACS Chem. Biol. 2020, 15, 1370-1380) 및 이의 서포팅 데이터를 더 참고할 수 있다.
상기 컴파운드 9의 데이터는 아래와 같다.
23-demethyl 8,13-deoxynargenicin (컴파운드 9).
Amorphous pale yellow powder; HR-QTOF m/z values 488.2656 [M + H]+ (calcd for C27H37NO7, 488.2643);
1H NMR (700 MHz, DMSO-d6) δ 11.73 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 3.3 Hz, 2H), 6.76 (dd, J = 4.0, 1.9Hz, 2H), 6.16 (dt, J = 4.9, 2.6 Hz, 4H), 5.58 (ddd, J = 9.8, 5.8, 1.9 Hz, = 9.5, 5.3 Hz, 1H), 4.84 (d, J = 6.6 Hz, 1H), 3.93 (dd, J = 11.6, 5.2 Hz, 1H), 3.81 (dd, J = 14.9, 9.0 Hz, 2H), 3.73 (dp, J = 12.3, 6.4, 5.9 Hz, 1H), 2.80 (ddq, J = 6.4, 6.4, 6.3 Hz, 1H), 2.35 (td, J = 9.6, 9.4, 3.8 Hz, 1H), 2.20-2.10 (m, 1H), 2.19-2.10 (m, 1H), 1.96 (t, J = 12.1 Hz, 1H), 1.81 (qq, J = 6.6, 6.6, 3.4, 2.8 Hz, 1H), 1.64 (dt, J = 14.6, 3.5 Hz, 1H), 1.61-1.58 (m, 3H), 1.59-1.51 (m, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.48-1.38 (m, 1H), 1.11 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.04 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 0.83 (d, J = 6.6 Hz, 3H);
13C NMR (176 MHz, DMSO) δ 174.01, 160.43, 137.51, 131.80, 129.51, 129.04, 124.40, 122.56, 116.64, 115.51, 109.98, 78.15, 73.70, 72.77, 72.69, 64.97, 46.94, 43.06, 41.61, 40.15, 40.01, 39.92, 39.87, 39.79, 39.32, 35.51, 34.71, 34.15, 32.51, 31.50, 29.46, 21.62, 15.83, 14.70, 14.26.
실시예 1-2. 세포 배양 및 세포 성장 분석
AGS 위암, HCT116 결장암, MRC-5 래트 폐섬유 모세포 및 267B1 인간 상피 세포를 10 % 소태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)을 함유하는 RPMI 1640에서 유지시켰다. A549 폐암, A375SM 흑색종, B16F10 흑색종, MCF7 유방암, HeLa 자궁 경부암 및 HepG2 간암종 세포를 10% FBS 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 성장시켰다. U87MG 뇌종양 및 Hep3B 간암종 세포를 10% FBS 보충된 Minimum essential medium (MEM)에서 유지시켰다. 모든 세포는 가습된 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ℃로 유지시켰으며 세포 성장 분석을 위해, 2 x 103 cells / well 의 밀도로 다양한 암세포 및 정상세포를 96-well 배양 플레이트에 플레이팅 하였다.
화합물을 다양한 농도 (0-200 μM)로 각 well에 첨가한 다음, 세포를 72 시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포 성장은 3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 비색 분석을 사용하여 측정하였으며, 50 마이크로 리터의 MTT (2 mg mL-1 저장 용액)를 첨가하고, 플레이트를 추가로 3 시간 동안 인큐베이션 하였다. 배지를 제거한 후, 100 μL의 dimethyl sulfoxide(DMSO)를 첨가하였다. 마이크로 플레이트 분광 광도계 (Thermo Scientific Multiskan Spectrum)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1-3. 상처 치유 분석
상처 치유 분석을 사용하여 암세포의 이동 가능성을 분석하였다. 융합된 단층 AGS 세포를 10 p 팁을 사용하여 긁은 다음 각 well을 PBS로 세척하여 비부착성 세포를 제거하였다. 세포를 화합물 (100 및 200 μM)로 처리한 후 ≤24 시간 동안 배양하였다. 중심의 무세포 갭이 있는 영역 주변을 광학 현미경 (Olympus)으로 확인하고, 갭으로 이동한 세포를 세었다. 점선으로 된 검은색 선은 0 시간에서 간격의 가장자리를 나타낸다.
실시예 1-4. 마트리겔 침습 분석
트랜스웰 챔버 인서트(transwell chamber insert, Corning Costar)을 사용하여 세포 침습을 분석하였다. 필터의 하부는 10 μL의 젤라틴 (1 mg mL-1)으로 코팅되었고, 상부는 10 μL의 Matrigel (3 mg mL-1; BD Biosciences)로 코팅되었다. 필터의 상부 챔버에 AGS 세포 (4 × 104)를 놓고, 하부 챔버에 화합물 (200 μM)을 첨가하였다. 챔버를 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 세포를 메탄올로 고정시키고 헤마톡실린 / 에오신으로 염색하였다. 필터의 하부 챔버를 침범한 세포의 총 수는 광학 현미경 (Olympus)을 사용하여 계수되었다.
실시예 1-5. 세포주기 분석
컴파운드 9(400μM)으로 24 시간 동안 처리한 AGS 세포를 수확하고 70 % 에탄올에 고정하였다. 세포를 세척하고 30분 동안 어두운 곳에서 37 ℃의 염색 완충액 [10 mg mL-1 RNase 및 1 mg mL-1 propidium iodide(PI) (Sigma-Aldrich)]에서 배양하였다. 그 다음, 유세포 분석 장비 (BD Biosciences)를 사용하여 샘플을 분석하였으며, Cell Quest acquisition 소프트웨어를 사용하여 sub G1, G1, S 및 G2/M 단계에서 세포의 백분율을 계산하였다.
실시예 1-6. 세포 사멸 분석
제조사의 지시에 따라 ApopNexin Annexin V FITC Apoptosis Kit (Merck Millipore)를 사용하여 아팝토시스를 분석했다. AGS 세포에 컴파운드 9 (400 μM)를 24 시간 동안 처리하였고, 이어서 세포를 세척하고 1 x 106 cells / mL의 밀도로 1 x 결합 완충액에 재현탁 시켰다. 그 다음 세포를 실온의 어두운 곳에서 15 분 동안 5μL의 Annexin V-FITC 및 5μL의 PI (100μg / mL)와 함께 인큐베이션 하고, 염색된 세포를 400 μL의 결합 완충액으로 희석하고 유세포 분석법 (BD Biosciences)에 의해 즉시 검출하였다.
실시예 1-7. DNA fragmentation의 측정
4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; Molecular Probes)로 DNA의 조각화를 측정하였다. 24-well 흑색 배양 플레이트에 1 × 105 cells / well의 밀도로 시딩된 AGS 세포에 컴파운드 9 (100 및 200 μM)를 24 시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 실온의 어두운 곳에서 30 분 동안 DAPI (4 μg / mL)와 함께 인큐베이션 하고, DAPI의 형광 강도를 각각 360 및 460 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 현미경 (Olympus)을 사용하여 확인하였다.
실시예 1-8. 자가 포식 액포 측정
Dansylcadaverine (MDC; Molecular Probes)로 자가 포식 액포를 측정하였다. 24-well 흑색 배양 플레이트에 1 × 105 cells / well의 밀도로 시딩된 AGS 세포에 컴파운드 9 (100 및 200 μM)를 24 시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 37 ℃의 어두운 곳에서 60 분 동안 MDC (50 μM)와 함께 인큐베이션 하고, MDC의 형광 강도를 각각 335 및 512 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 현미경 (Olympus)을 사용하여 확인하였다.
실시예 1-9. 산성 세포 소기관 측정
LysoTracker™ Deep Red (Molecular Probes)로 산성 세포 소기관을 측정하였다. 24-well 흑색 배양 플레이트에 1 × 105 cells / well의 밀도로 시딩된 AGS 세포에 컴파운드 9 (100 및 200 μM)를 24 시간 동안 처리하였다. 이어서 세포를 세척하고 37 ℃의 어두운 곳에서 30 분 동안 LysoTracker™ Deep Red (50 nM)와 함께 인큐베이션 하고, LysoTracker™ Deep Red의 형광 강도를 각각 647 및 668 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 현미경 (Olympus)을 사용하여 확인하였다.
실시예 1-10. 웨스턴 블롯 분석
24 시간 동안 컴파운드 9(100, 200 및 400 μM)으로 처리한 AGS 세포 용해물을 10 % SDS-PAGE로 분리하고, 분리된 단백질을 표준 전기 블로팅 절차를 사용하여 polyvinylidene difluoride 멤브레인(Millipore)으로 옮겼다. 블롯은 4℃에서 밤새도록 phospho-PI3K, phospho-Akt, phospho-mTOR, PARP, cleaved caspase-9, cleaved caspase-3, beclin-1, ATG5, p62, LC3, MMP-2, MMP-9, HSP60, HP1-gamma, Annexin 7, Cyclophilin A, CD147, phospho-JNK, JNK, phospho-p38, p38, phospho-ERK1/2, ERK1/2 및 β-actin에 대한 1차 항체로 면역 표지 되었다. 제조업체의 지침에 따라 개선된 화학 발광 (ECL) 키트 (Bio-Rad)로 면역 표지를 검출했다.
실시예 1-11. 활성 산소종의 측정
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate(H2DCFDA; Molecular Probes)로 ROS 수준을 검출하였다. 96-well 흑색 배양 플레이트에 1 × 105 cells / well의 밀도로 시딩된 AGS 세포를 24 시간 동안 컴파운드 9 (100, 200 및 400 μM)으로 처리하였다. 10 분 동안 H2DCFDA (10 μM)와 인큐베이션 한 후, DCF의 형광 강도를 각각 495 및 529 nm의 여기 및 방출 파장에서 다중 모드 마이크로 플레이트 리더 (Thermo Scientific)를 사용하여 검출하였다.
실시예 1-12. 프로테오믹스 분석
AGS 세포에서 컴파운드 9에 의한 프로테옴 발현 변화를 분석하였다. 24 시간 동안 컴파운드 9(400 μM)으로 처리한 AGS 세포 용해물을 12 % 2-DE SDS-PAGE로 분리하고, Coomassie brilliant blue R-250으로 1 시간 동안 염색하였다. 겔을 GS-800 농도계 (Bio-Rad Laboratories, Inc.)에서 스캔하고, 대조군과 처리군의 겔에서 3.0 fold 이상 차이가 나는 스팟들을 선택하였다. 선택된 스팟들은 MALDI-Time of Flight (TOF) Autoflex 분광기 (Bruker Corporation)를 사용하여 분석하였고, 컴파운드 9 처리에 의해 변화된 단백질들을 동정 및 확인하였다.
실시예 1-13. 약물 친화성 반응 표적 안정성 (DARTS) 분석
컴파운드 9의 타겟 단백질을 검증하기 위해 DARTS 분석법이 사용되었다. AGS 세포를 1 x EzRIPA Lysis Kit (ATTO)로 용해시키고, 용해물에 각각 DMSO, CsA(100 μM) 및 컴파운드 9(400 μM)를 처리하였다. 각 샘플은 반으로 나누어 하나의 군에는 pronase(10 μg / mL)를 함께 처리하여 10 분 동안 반응하였다. 모든 단계는 조기 단백질 분해를 방지하기 위해 얼음 또는 4 ℃에서 수행되었다. 컴파운드 9와 약물 친화성 반응 표적 안정성을 나타내는 단백질은 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석되었다.
실시예 1-14. 도킹 분석
컴파운드 9가 cyclophilin A에 결합하는지 검증하기 위해 도킹 분석법을 사용하였다. 도킹 분석은 UCSF Chimera 1.13.1 프로그램을 사용하여 cyclophilin A와 컴파운드 9의 결합 부위 및 결합력을 분석하였으며, 대조군으로 Cyclophilin A와 CsA의 결합 부위를 분석하여 비교하였다.
실시예 1-15. Cyp A 녹다운 분석
컴파운드 9의 표적 단백질인 cyclophilin A의 녹다운을 위해, 12-well 배양 플레이트에 1 × 105 cells / well의 밀도로 시딩된 AGS 세포에 시퀀스가 다른 두 가지의 Cyclophilin A siRNA (10 및 100 nM)를 lipofectamine 3000 (ThermoFisher)(4 μL)와 함께 48 시간 동안 처리하였다. Cyclophilin A의 녹다운 여부는 웨스턴 블롯 분석을 통해 분석되었다. Cyclophilin A의 녹다운이 컴파운드 9와 같은 활성을 나타내는지 확인하기 위해 cyclophilin A를 녹다운한 AGS 세포를 이용해 세포 성장 분석, 상처 치유 분석, 마트리겔 침습 분석, 세포 주기 분석, 세포 사멸 분석 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
실시예 1-10. 컴파운드 1, 2, 8, 10, 11, 12, 13에 대한 데이터
본 발명에서 컴파운드 9과 대비되는 Nargenicin A1 유도체는 아래와 같다.
Figure pat00011
실시예 1-9. 통계 분석
결과는 평균 ± 표준 오차 (standard error, SE)로 표시하였다. 대조군과 시험 그룹을 포함하여 두 그룹 간의 통계적 유의성을 결정하기 위해 Student's t test를 사용했으며 p <0.05 값은 통계적으로 유의미한 결과를 나타내는 것으로 간주되었다.
<실시예 2: 암세포 성장 억제에 대한 컴파운드 9의 효과 확인
MTT 비색 분석법을 사용하여 다양한 암세포주 및 정상 세포주의 성장에 대한 Nargenicin A1 유사체의 효과를 평가하였다(표 4). 그 결과, 시험된 암세포주 중 컴파운드 9이 AGS 위암 세포의 성장을 가장 민감하게 억제함을 확인하였다. 또한, 컴파운드 9는 정상 세포주에 대해 세포 독성 효과를 나타내지 않는 것으로 관찰되었다 (표 4). 따라서, 이후 실험에서는 컴파운드 9의 항암 잠재력을 구체적으로 연구하였다.
[표 4]
Figure pat00012
(*첫째 줄 가로축의 숫자는 컴파운드 번호를 나타냄)
<실시예 3: 위암세포의 전이에 대한 컴파운드 9의 효과 확인>
상처 치유 및 마트리겔(Matrigel) 침습 분석을 사용하여 AGS 위암 세포에서 컴파운드 9의 전이 가능성을 평가했다. 그 결과 컴파운드 9는 대조군과 비교하여 AGS 세포의 이동 및 침습 속도를 유의하게 감소시켰지만, 컴파운드 1은 유망한 효과를 나타내지 않았다 (도 1a 및 1b). 이러한 결과는 컴파운드 9은 컴파운드 1과 달리 뚜렷한 항암 특성을 가지고 있음을 입증한다.
<실시예 4: 위암세포 세포주기에 대한 컴파운드 9의 효과 확인>
AGS 세포에 대한 컴파운드 9의 항증식 효과를 추가로 탐구하기 위해, 유동 세포 계측 분석(flow cytometric analysis)을 사용하여 세포주기 진행에 대한 효과를 정량화 하였다. 그 결과, 컴파운드 9는 G2 / M 세포수의 유의한 증가를 유도한 반면, G1 세포 집단은 이에 상응하게 감소시켜 컴파운드 9이 AGS 세포에서 G2 / M 정지를 유도함을 확인하였다(도 1c).
<실시예 5: 아팝토시스 또는 오토파지에 대한 컴파운드 9의 효과 확인>
세포 성장의 억제가 아팝토시스에 의해 유발되었는지를 확인하였다. 구체적으로, Annexin V/PI 이중 염색 및 유세포 분석을 수행한 결과, 아팝토시스 세포의 백분율은 대조군 비히클만 처리된 AGS 세포에서 4.42 %인 반면, AGS 세포를 컴파운드 9로 처리한 경우, 초기 및 후기 단계에서 아팝토시스 세포의 총 백분율은 55.34 % 였다(도 1d). 이러한 결과는 컴파운드 9이 AGS 세포의 아팝토시스 세포 사멸을 유도한다는 것을 의미한다. 또한, 세포 사멸 형태를 DAPI, MDC, Lysotracker 염색 후 형광현미경으로 분석한 결과, 컴파운드 9이 아팝토시스의 전형적 형태인 핵의 수축(chromatin condensation)과 오토파지의 특징인 다수의 자가포식체(autophagosome) 형성을 유도한다는 점을 확인하였다(도 1e).
컴파운드 9에 의해 유도된 AGS 세포의 아팝토시스를 담당하는 기본 분자 메카니즘을 조사하기 위해, 본 발명자들은 웨스턴 블롯 분석에 의해 컴파운드 9 처리 후 아팝토시스 유도 인자의 발현을 평가하였다. 그 결과 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, 컴파운드 9의 처리 후 cleaved caspase-compound 9 및 cleaved caspase-3의 발현 수준이 증가된 것을 확인하였다.
오토파지(Autophagy) 및 아팝토시스는 프로그램된 세포 사멸의 주요 모드이며 서로 상호 작용한다. 흥미롭게도, 컴파운드 9는 Beclin 1, ATG5, p62 및 LC3을 포함한 오토파지 마커 단백질의 발현 수준을 증가시켰다. 또한, 컴파운드 9는 포스포릴화 수준의 감소에 의해 나타난 바와 같이 라파마이신 (mTOR) 경로의 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt)/mammalian 표적의 활성화를 하향 조절하였고, 이러한 결과는 컴파운드 9이 아팝토시스 및 오토파지 유도 효과에 기여한다는 점을 의미한다.
<실시예 6: MMP-2 및 MMP-9 발현에 대한 컴파운드 9의 효과 확인>
아연 의존성 엔도펩티다제(endopeptidase)인 Matrix metalloproteinase(MMP)-2 및 MMP-compound 9는 세포 외 매트릭스를 통한 조직 리모델링 능력뿐만 아니라 기저막 분해 및 혈관 신생 유도에 의한 종양 침습 및 전이와 관련이 있다. 도 2의 A에 도시된 바와 같이, AGS 세포에 컴파운드 9 처리시 MMP-2 및 MMP-9의 발현 수준이 유의하게 감소되었으며, 이는 컴파운드 9의 항전이 효과가 MMP의 억제와 관련됨을 시사한다.
<실시예 7: 활성산소종 발생에 대한 컴파운드 9의 효과 확인>
활성산소종 (Reactive oxygen species, ROS)은 많은 세포 유형에서 아팝토시스 및 오토파지 과정에서 중요한 역할을 한다. 도 2의 B에 도시된 바와 같이, 컴파운드 9의 처리량이 증가됨에 따라 ROS 생성 정도를 나타내는 DCF 형광의 강도가 더 증가하였고, 증가된 ROS 수준은 컴파운드 9이 아팝토시스 및 오토파지에 영향을 미칠 수 있음을 의미한다.
<실시예 8: 컴파운드 9의 세포 내 표적단백질 확인 및 관련 신호전달체계로의 영항 확인>
프로테오믹스 기술은 세포의 생리적 상태변화에 따른 분자적인 현상과 세부적인 기전을 발굴할 뿐만 아니라 어떻게 단백질의 표현형(phenotype)이 질병과 약물 처리에 따라 변화하는 지를 분석할 수 있고, 이로 인해 약물표적의 식별과 검증이 가능하다.
본 발명자는 컴파운드 9의 세포내 표적단백질 동정과 단백질 간 상호작용에 미치는 영향을 분석하기 위해, 약물 처리 전과 후의 암세포 내 프로테옴 변화를 2-D 전기영동 분석과 MALDI-TOF에 의한 자동화된 단백질 분자 구조 분석 기술을 이용하여 분석하였다. 구체적으로, 컴파운드 9에 대한 가장 민감도가 높았던 암세포주인 AGS 위암세포주를 이용하여 컴파운드 9 처리 전후의 세포 내 프로테옴 발현 변화를 비교 분석한 결과, 위암의 진행과 예후에 기능적으로 연관되어 있는 것으로 보고된 핵심 후보 표적단백질들을 확인하였다(도 3).
그 다음, 컴파운드 9 처리 후 3배 이상 현저히 감소된 발현을 보인 몇몇 후보 표적단백질들을 대상으로 웨스턴 블롯을 통해 검증실험을 수행하였다. 그 결과 이들 단백질들 중 특히 cyclophilin A가 컴파운드 9 처리에 의해 가장 많은 발현감소를 보임을 확인하였다(도 4a).
또한, Cyclophilin A가 컴파운드 9의 표적단백질인지를 검증하기 위해, cyclophilin의 막수용체인 CD147과 조절 하위신호전달 경로를 분석하였다. 그 결과, 컴파운드 9에 의한 cyclophilin A 활성 저해가 CD147 매개 하위 MAPK 증식신호전달 경로들을 효과적으로 차단함을 확인하였다(도 4b).
<실시예 9: 컴파운드 9과 표적단백질의 직접적 결합 및 결합 구조 확인>
Cyclophilin A가 컴파운드 9의 세포 내 직접적인 표적단백질인지를 검증하기 위해, 비수식 화합물을 위한 표적동정 방법 중 하나인 Drug affinity responsive target stability(DARTS)를 적용하였다. 이 방법은 약물이 cell lysate(proteome) 내 표적단백질과 공유 혹은 비공유 결합을 통해 특이적인 결합을 하면, 표적단백질의 단백질분해효소(pronase)에 대한 반응성에 변화가 생기게 되는 원리를 이용한 것으로, 구체적으로 GS cell lysate에 각각 DMSO, 컴파운드 9, 대조군 Cyclosporin A(CsA), 단백질분해효소인 pronase, 컴파운드 9 + pronase, CsA + pronase를 처리해 각 처리군이 cell lysate 내 단백질과 반응하도록 한 후, 웨스턴 블롯 분석법을 통해 표적단백질의 발현수준을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 pronase 단독 처리는 cyclophilin A, HP1-gamma(Hp1γ), annexin 7, HSP60, actin을 모두 분해시키는 반면, 컴파운드 9과 CsA는 cyclophilin A를 표적하여 직접적으로 결합하였기 때문에 pronase에 의한 단백질 분해를 현저히 저해함을 확인하였다. 또한, 컴파운드 9이 cyclophilin A 뿐만 아니라 HP1-gamma와도 결합하여 pronase에 의한 단백질 분해를 저해함을 확인하였다. 그러나, annexin 7과 HSP60은 컴파운드 9의 표적단백질이 아니기 때문에 pronase에 의해 모두 분해되었다. Cyclophilin A의 잘 알려진 직접적 결합에 의한 저해화합물인 CsA는 cyclophilin A 이외의 HP1-gamma, annexin 7, HSP60와는 결합하지 않았기 때문에 pronase에 의해 단백질들이 분해됨을 확인하였다. 이러한 결과는 컴파운드 9이 CsA와 마찬가지로 cyclophilin A와 직접적 결합을 통해 표적단백질의 기능을 조절함을 명확히 확인한 것이다.
나아가, 도킹 프로그램을 이용하여 컴파운드 9과 cyclophilin A의 결합 구조를 분석한 결과, CsA의 cyclophilin A와의 결합 부위에 컴파운드 9 또한 결합이 가능함을 확인하였다(도 6). 이러한 결과는 컴파운드 9이 CsA와 유사한 기전으로 cyclophilin A와의 직접적 결합을 통해 그 기능을 저해할 수 있음을 의미한다.
<실시예 10: Cyclophilin A의 유전자 발현 억제에 의한 위암세포 증식 억제 효과 확인>
컴파운드 9에 의한 항암효과가 cyclophilin A를 표적단백질로 하여 나타나는 것인지 확인하기 위해 cyclophilin A 유전자를 siRNA를 이용하여 녹다운(knock-down)하였다. 그 결과, 두 가지 종류의 cyclophilin A 표적 siRNA 1과 2에 의해 위암세포에서 cyclophilin A의 발현이 현저히 감소하였음을 western blot 분석법을 통해 확인하였다. 이어서 siCypA 1과 2 (10, 100 nM)를 위암세포에 72시간 처리한 후 MTT assay를 통해 세포 증식에 대한 영향을 측정한 결과, siCypA-1과 siCypA-2 양쪽 모두에서 control 대비 약 30%의 증식 억제 효과를 나타냄을 확인하였다(도 7). 이러한 결과는 cyclophilin A가 위암세포의 증식에서 중요한 역할을 수행함을 의미한다.
<실시예 11: Cyclophilin A의 유전자 발현 억제에 의한 위암세포 전이능력 억제 효과>
siCypA-1과 siCypA-2가 위암세포의 침투능력과 이동능력에 영향을 미치는지 알아보기 위해, invasion assay와 migration assay를 수행하였다. 그 결과, siCypA-1과 siCypA-2 모두 control 대비 위암세포의 침투능력과 이동능력을 현저하게 억제함을 확인하였다(도 8). 상기 결과는 cyclophilin A는 위암세포의 증식뿐만 아니라 전이에서 중요한 역할을 담당함을 의미한다.
<실시예 12: Cyclophilin A의 유전자 발현 억제에 의한 위암세포 자멸사와 세포주기 정지 활성 확인>
Cyclophilin A의 녹다운이 세포주기 어느 단계를 정지시켜 세포증식 억제활성을 나타내는지 확인하였다. 그 결과, siCypA-1과 siCypA-2는 대조군과 비교하여 G2/M 단계를 47.2%에서 각각 50.1과 52.1%로 증가시켰으며, 이는 컴파운드 9에 의한 세포주기 정지단계와 동일한 G2/M 단계 정지를 통해 세포증식 억제활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서, 상기 결과는 컴파운드 9이 cyclophilin A의 기능을 저해하여 G2/M단계 세포주기 정지를 통해 세포증식을 억제한다는 것을 의미한다(도 9의 A).
다음으로, cyclophilin A의 녹다운이 세포 자멸사를 유도하는지 알아보기 위해 annexin V/PI 염색 분석을 수행한 결과, siCypA-1과 siCypA-2는 세포 자멸사를 유의적으로 유도하지 않았다(도 9의 B). 이러한 결과는 컴파운드 9이 cyclophilin A 이외의 세포 내 다른 표적분자의 기능을 제어함으로써 위암세포 자멸사를 유도하였을 가능성을 시사한다.
<실시예 13: Cyclophilin A의 유전자 발현 억제에 의한 위암세포 내 관련 분자 마커들의 발현변화 확인>
컴파운드 9에 의해 조절된 CD147 매개 신호전달 경로와 증식, 전이, 세포 자멸사, 자가 포식에 관여하는 분자마커들에 대한 siCypA-1과 siCypA-2의 영향을 웨스턴 블롯 분석법을 통해 확인하였다. 그 결과 도 10에 나타난 바와 같이 siCypA-1과 siCypA-2는 CD147의 발현을 억제하였으며 JNK와 ERK1/2의 인산화를 억제하였다. 그러나, p38의 인산화는 변화가 없었고, siCypA-1과 siCypA-2는 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로의 인산화와 전이와 관련된 MMP-9 및 MMP-2의 발현을 감소시킴을 확인하였다.
그러나, 세포자멸사 관련 분자마커인 cleaved caspase-3와 자가포식 관련 분자마커인 LC3의 발현에는 변화가 없었다(도 10의 B). 이러한 결과는 컴파운드 9에 의한 위암세포의 증식 및 전이 억제 효과는 cyclophilin A의 기능을 조절하여 나타난 반면, 컴파운드 9에 의한 위암세포의 자멸사와 자가 포식 유도 효과는 cyclophilin A 이외의 세포 내 다른 표적분자의 기능을 제어함으로써 나타난 결과일 가능성을 암시한다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00013

  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아팝토시스(apoptosis) 및 오토파지(autophage)에 의한 암세포의 사멸을 유도하는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 시클로필린(cyclophilin) A에 결합하는 것인, 약학적 조성물.
  4. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 유효성분으로 포함하는 위암 예방 또는 개선용 식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00014

  5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 아팝토시스(apoptosis) 및 오토파지(autophage)에 의한 암세포의 사멸을 유도하는 것인, 식품 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염은 시클로필린(cyclophilin) A에 결합하는 것인, 식품 조성물.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염을 포함하는 시클로필린(cyclophilin) A의 발현 또는 활성 억제용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pat00015

  8. 제7항에 있어서, 상기 시클로필린(cyclophilin) A의 활성 억제는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 염과 시클로필린(cyclophilin) A의 결합에 의한 것인, 조성물.
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