JP2007519612A - 結腸直腸癌抗原 - Google Patents

Abstract

本明細書においてＣＯＡ−１として示される広く発現される遺伝子内の位置３９９での点突然変異は、結腸直腸癌の診断に用いられ、すべての介在性免疫応答を誘発することができる。

Description

発明の分野
本発明は、結腸直腸癌のための新規の診断用抗原、その使用、ならびに特に結腸直腸癌に対する免疫療法治療におけるその使用に関する。

発明の背景
結腸癌は、西欧諸国における死亡率の主な原因である。手術および化学療法治療の改善にもかかわらず、５年生存率は数十年にわたって大幅に変化している（１、２）。免疫学的療法は、メラノーマを有する患者において集中的に検討され、ＩＬ−２による治療ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏにおける培養した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子免疫伝達により、相当な割合の患者で癌の退行がもたらされることが認められている（３、４）。

その一方、免疫療法は結腸直腸癌患者に対して利益を提供していないが、これはこの癌の免疫学的特性が乏しいことに起因するかもしれない。これによってこの疾患を有する患者に対する治療上の選択肢が制限されている（５、６）。結腸癌におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞浸潤物の存在は予後における価値を有する（７）にもかかわらず、本報告では炎症性浸潤物の存在が癌に対する全身性免疫に関連しなかった。結腸直腸癌では、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方においてＨＬＡクラスＩの発現が失われることがよく記述されており、これは腫瘍の進行に関連するように見える（８〜１０）。

さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて樹立された腫瘍系および特異的Ｔリンパ球の入手が困難であることが、結腸直腸癌における免疫系の役割に関する分析を妨げている。多数の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が同定されているが、これらの大部分はメラノーマにおける発現が限定的であるか、メラノーマだけでなく乳房、卵巣、肺および前立腺腫瘍を含む多数の他の組織においても発現されるかのいずれかである（１１）。

結腸癌において過剰発現されるように見える、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子のＥＰ−ＣＡＭ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、およびシクロフィリンＢなどの候補抗原は、特定のＨＬＡ対立遺伝子に結合するこれらの分子由来の候補ペプチドと一緒にｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＰＢＭＣの感作を行うことによる結腸直腸癌療法における有望な標的として評価されている。

しかしながら、このアプローチを用いて同定されているのは比較的少数の有望なエピトープにすぎず、多数のこれらペプチドを用いて生成されているＴ細胞は、天然の操作されていない腫瘍細胞を効率的に認識しなかった（１２〜１５）。

発明者らは今回、Ｔ細胞介在性免疫応答を誘発することができる結腸直腸癌における新たな腫瘍関連抗原を同定している。

発明の要約
したがって第１の態様では、本発明は、位置３９９でのアラニン残基がバリン残基によって置換されている、Ｓｏｃｉｕｓ遺伝子産物のヒト相同体に対する抗体産生を刺激する工程を含む、結腸直腸癌に対する免疫を刺激するための方法を提供する。結腸直腸抗原ＣＯＡ−１のコーディング配列およびその転写産物は、好ましくは、配列番号１に示されるとおりであり、該配列は遺伝子配列と結腸直腸抗原ＣＯＡ−１転写産物との関係を示し（図５にも示される）、位置３９９でアラニンを有することを示している。本発明にしたがって免疫応答を増強できる対象はこの抗原である。

さらに詳細には、ＣＯＡ−１に対する免疫応答を刺激するためのワクチンの製造における、配列番号６に示されるアミノ酸配列の全部もしくは免疫原性部分を含むペプチドの使用が提供される。同配列の免疫原性部分は、本明細書において同配列のエピトープ部分として言及され、同配列の単離される部分としてまたはより長い配列の一部を形成する任意の周辺アミノ酸配列との関連においてＣＯＡ−１に対する応答を樹立するのに十分である。

特に同配列の免疫原性部分は、ワクチンの形態で投与される場合は殊更に、Ｔ細胞の成熟を介して免疫応答を刺激するのに十分である。

ラットＳｏｃｉｕｓ遺伝子産物のヒト相同体は、新たに発見されたＣＯＡ−１タンパク質と比べて７５個のアミノ酸残基を余分に有するが、非癌細胞において発現される際に３９９に相当する位置でアラニンも含む。ＣＯＡ−１タンパク質は、位置３９９でバリンもしくはアラニンを有し、後者が癌細胞、特に結腸直腸癌細胞による発現と関連するように見えることが判明している。理論に拘束されることなく、ＣＯＡ−１タンパク質の位置３９９でのアラニンの存在は、少なくとも同組織が結腸直腸である場合にはそれを発現する組織における癌であるように診断されるかまたは少なくとも示唆するように見える。

Ｓｏｃｉｕｓ遺伝子のヒト相同体のヌクレオチド配列およびその遺伝子産物は、それぞれ配列番号１９および２０に示される。

しかしながら、特に驚くべきことは、ＣＯＡ−１転写産物のアミノ酸３７２〜３８５（両端を含む）に位置するエピトープが同タンパク質の腫瘍変異体に対する免疫の刺激に関与し、免疫ペプチドが位置３９９で突然変異を含む必要がないことが確立されている点である。

免疫ペプチドは、ペプチドＴＬＹＱＤＤＴＬＴＬＱＡＡＧ（配列番号６）のエピトープ部分を含む。この配列は、ＣＯＡ−１の全体残存配列（ｅｎｔｉｒｅ ｒｅｍａｉｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むまで、いずれかの末端において追加配列で補足されることができ、さらに、必要に応じて例えば融合タンパク質と会合されうるなど、それを超える追加配列によっても補足されうる。本明細書において示されるように、Ｎ末端でＦＳＴＦＰＰ（配列番号９）および／またはＣ末端でＬＶＰＫＡＡ（配列番号１０）を含むより特異的な追加配列はいずれも刺激を可能にする。一般にエピトープは、１４アミノ酸もの長さをもつ必要がなく、エピトープのいずれかの末端からアミノ酸残基が数個欠失しても依然として免疫をもたらす働きをする場合があることが認識されるであろう。

したがって本発明は、配列番号６のエピトープ部分を含むペプチド配列が意図される。同エピトープ部分は、好ましくは配列番号６の８個以上、好ましくは１０個以上の隣接アミノ酸残基からなる。それらがより長いペプチドもしくは他の分子の一部である場合、エピトープ部分は、好ましくは免疫応答を刺激できるように適切に暴露されるか、または宿主の免疫系に提示される場合にかかる刺激が得られるための処理できるような方法で提示される。この点において、完全長ＣＯＡ−１タンパク質を用いることは一般に望ましくなく、それが癌形態に突然変異するかそうでなければ同エピトープが癌形態で潜在する可能性がある。

同エピトープが、対立遺伝子のＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２もしくはＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１と協同する抗原提示細胞によって優先的に発現されることも立証されている。これらの交感性対立遺伝子（Ｓｙｍｐａｔｈｅｔｉｃ ａｌｌｅｌｅ）が必ずしもＣＯＡ−１に対する免疫を刺激できる唯一のＨＬＡ対立遺伝子ではなく、本発明が他の交感性対立遺伝子にまで及ぶことが認識されるであろう。好ましくは、エピトープはＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２もしくはＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１対立遺伝子のいずれかまたは両方に関連した抗原提示細胞によって優先的に発現される。

交感性ＨＬＡ−ＩＩ対立遺伝子はヒト集団の全メンバー内に必ずしも存在しないが、ある個体がこれらの対立遺伝子のいずれかに対する自己もしくは同種のＰＢＭＣ（末梢血単核球）を有する場合、ＣＯＡ−１の免疫部分を含むワクチンを提供するだけで十分である。

ＣＯＡ−１の免疫部分は、位置３９９での突然変異の有無にかかわらず分子全体の量に匹敵する場合があるが、より好ましくは、少なくともＣＯＡ−１転写産物の位置３７２〜３８５（両端を含む）に位置する免疫エピトープを含むペプチドを単に含むだけである。さらに本発明は、エピトープとしてＣＯＡ−１の３７１〜３８４の配列のみならず、３７１〜３８５の配列（両端を含む）にも及び、かつ３７２〜３８４（両端を含む）に及ぶ。

免疫エピトープは、任意の適切な形態で存在しうる。その最も単純な場合、同ペプチドおよび適切な担体を含むワクチンは、必要に応じて例えば任意の適切な賦形剤および／またはアジュバントとともに提供されうる。

免疫原性ペプチドは、ワクチン中の弱毒化ウイルスなどの宿主生物内またはｉｎ ｖｉｖｏにおける発現に適する発現ベクターの形態で、患者における発現に適する形態で核酸の形態でも存在しうる。

本発明がＣＯＡ−１における配列ならびにその転写産物に及ぶことが認識されるであろう。さらに本発明は、１つまたは複数のイントロンが欠如するＣＯＡ−１配列に及ぶ。野生型転写産物のアミノ酸３７２〜３８５に提供される免疫エピトープがコードされるという条件で、本発明の配列は１つまたは複数のエクソンが欠失する場合がある。位置３９９でのアミノ酸置換がコードされる必要はなく、一般にこの置換が本発明のヌクレオチド配列によってコードされないことが好ましい。理論に拘束されずに、正常細胞の配列におけるこの置換が同抗原の処理に作用しうることが免疫原性エピトープの発現の欠如を招く可能性がある。遺伝コードの変性によってヌクレオチド配列が幅広く変化しても同配列が依然として免疫原性配列をコードしうるが、例えばスプライス部位の設計が望ましくない場合、簡素化のために野生型配列を用いることが一般に好ましいことが認識されるであろう。

患者が交感性ＨＬＡ−ＩＩ対立遺伝子を発現しない場合は、多くの方法で免疫が付与されうるが、それらの方法は交感性対立遺伝子を発現する患者において用いられる場合もある。

交感性対立遺伝子は、Ｂ細胞および線維芽細胞などのＰＢＭＣによって発現される。したがって一態様では、患者由来のＰＢＭＣもしくはその前駆体を単離し、例えばこれらの細胞をＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１もしくはＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２対立遺伝子で形質転換すれば十分である。一旦形質転換がうまく実行されると、ＰＢＭＣは直接形質転換されても前駆体から得られても、それを用いることで、患者内への再導入後に適切な免疫が刺激されうる。これは患者内にＰＢＭＣを導入した後に上記のようなワクチン投与を行うことによっても達成されうる。すなわちＰＢＭＣは、ＣＯＡ−１もしくはその前駆体、または免疫エピトープもしくはその前駆体と接触しうる。そして好ましくは、一旦エンドサイトーシスが起こる何らかの機会が生じていると、その処理されたＰＢＭＣが患者に投与される。これらの環境下で、「前駆体」が例えばＰＢＭＣの培養における発現に適する融合タンパク質または核酸を含みうることが認識されるであろう。

適切なＰＢＭＣが例えば万能供血者から得られる場合があり、免疫調製物が患者自身由来の形質転換細胞に対する上記の場合と同様の方法でかかる細胞から作製されうることも認識されるであろう。

本発明は、免疫エピトープがそれによって発現される転写産物内に含まれるという条件で、上記のようなワクチンおよび免疫調製物、ならびにＣＯＡ−１もしくはその前駆体を発現する宿主細胞に及ぶことが認識されるであろう。

本発明は、位置３９９にアラニンを有するＣＯＡ−１を認識する抗体の使用に及ぶことも認識されるであろう。かかる抗体は、例えば受動ワクチンとして使用されるかまたは結腸直腸癌に対する診断アッセイにおいて使用されうる。かかるアッセイは、例えばＥＬＩＳＡアッセイの形態をとるかまたは適切なイムノブロッティング技術において使用されうる。

本発明は、上記のようにエピトープ配列を含むＣＯＡ−１タンパク質および特にその断片に及ぶ。かかる断片は、配列番号１の位置３９９でアラニンを含むまで追加アミノ酸残基をさらに含む場合があり、同エピトープと位置３９９の間の残基が保存的に置換される、またはエピトープの抗原性を遮断しない１つもしくは複数の欠失、挿入および／または逆位が存在する場合の断片などを含む。

本発明は、本発明のペプチドおよびそのための交感性対立遺伝子を発現するＰＢＭＣ、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を含むワクチンをさらに提供する。

それ故に、ＣＯＡ−１は結腸直腸癌（ＣＲＣ）患者における抗腫瘍免疫応答を媒介する免疫優性抗原であると考えられる。したがって、ＣＯＡ−１は、ＣＲＣ患者において好ましくは同疾患の進行と相関する抗腫瘍免疫応答を媒介するための免疫原性抗原として有用であると考えられる。それ故に、ＣＲＣにおけるペプチドワクチン注射または抗原特異的なＴ細胞の養子免疫伝達などの免疫療法プロトコルの提供において有用であるとともに、同疾患の予後にとって有用なマーカーであるとも考えられる。

好ましくは、同ペプチドは、好ましくはＣＯＡ−１のアミノ酸配列の５０％以下、好ましくは４０％以下、好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下、そして最も好ましくは１０％以下を有するオリゴペプチドである。

好ましくは、同ペプチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含み、その投与によって免疫原性応答を増強し、好ましくは一個体においてＣＤ４^＋Ｔ細胞応答を誘発する。

発明者らは、同ペプチドがメラノーマ細胞内で免疫原性応答を増強することも認めている。したがって、メラノーマ細胞に対して免疫応答が刺激されることも好ましい。

以下の実施例では、添付の図面に対して参照を行う。

発明の詳細な説明
自己の培養結腸腫瘍細胞系の樹立後、取得したＰＢＭＣおよびＴＩＬからいくつかの腫瘍反応性ＣＤ４^＋Ｔリンパ球を単離した。これらの試験では、自己腫瘍細胞に強力に応答するＣＤ４^＋Ｔ細胞の単一クローンであるＣ１１１に着目し、自己ＥＢＶ Ｂ細胞との低くても顕著な反応性があることを実証したが、自己ＣＤ４０Ｌで刺激されたＢ細胞に対して応答することはなかった。クローンＣ１１１ Ｔ細胞を含む自己ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによってこのＣＯＡ−１と称される抗原をコードする遺伝子を単離した。この遺伝子は、ＧＴＰアーゼのＲｎｄファミリーメンバーを餌として使用するイースト２−ハイブリッドスクリーニングアッセイを用いて最近クローン化されたラットＳｏｃｉｕｓタンパク質のヒト相同体をコードする遺伝子とほぼ同一のように見えた（２０）。Ｓｏｃｉｕｓ産物はラットの睾丸では高レベルで発現したが、ラットの肺、胸腺および脳での発現は大幅に低下したレベルであった。

ＣＯＡ−１転写産物における最長オープンリーディングフレームは、ヒトＳｏｃｉｕｓ遺伝子産物の一部に対応する４３７のアミノ酸産物をコードし、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２もしくは１３０１を発現する標的細胞を感作できるこのオープンリーディングフレーム由来の２つの重複ペプチドを同定した。ペプチドでパルスした標的で観察した刺激は、認識された腫瘍細胞系で認めたものに比べて弱く、Ｃ１１１ Ｔ細胞からの顕著なサイトカイン放出を刺激するのに約１０μＭの最小濃度が必要であった（表４）。

チロシナーゼ（２３）およびＴＲＰ−１もしくはＴＲＰ−２（１７）などの非突然変異腫瘍抗原由来のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性の腫瘍反応性Ｔ細胞からの比較的低レベルのサイトカイン放出を刺激するにすぎないことも認めており、Ｔ細胞認識のために標的細胞を感作するのにこれらの試験で同定した最小濃度１〜１０μＭのペプチドが必要であった。これはこれらが非突然変異自己抗原を表し、自己寛容が高親和性を有するクラスＩＩ分子に結合するペプチドを認識するＴ細胞の欠失をもたらすという事実を反映する場合がある。

さらに、自己腫瘍細胞系はＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２および１３０１の両方の制限因子との関連でこのペプチドを提示する必要があり、これはこのエピトープと反応するＴ細胞の刺激を高めることになる。ＣＯＡ−１産物を発現するトランスフェクタントが刺激したＣ１１１ Ｔ細胞からのサイトカイン放出は、高レベルのＨＬＡクラスＩＩ分子の発現を誘発した自己腫瘍細胞系に比べて顕著に低下した。しかしながら、この観察に対する１つの有力な説は、ＣＯＡ−１遺伝子産物のトランスフェクションに対する標的として用いたＨＬＡクラスＩＩ陽性２９３細胞がこのエピトープの処理に関連する最適レベルのアクセサリー分子を発現できなかったということである。

ＣＯＡ−１転写産物は、種々の組織および腫瘍細胞系由来の配列とほぼ同一である。しかしながら、これらの転写産物は、染色体１ｐ３６．１−ｐ３５遺伝子座の場所に存在する少なくとも１５個のエクソン由来の大量に並ぶ２０を超える交互にスプライスされた産物を含む。結腸腫瘍細胞系において発現したＣＯＡ−１産物は、ＥＳＴおよびＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて同定された転写産物のいずれにも対応しない固有のスプライシングパターンを含むように見えた。ここで同データベースは、Ｃ１１１ Ｔ細胞によって認識された産物をコードすることはない。２つのほぼ同一のＣＯＡ−１遺伝子産物は、ＥＢＶ Ｂ細胞から増幅され、それらの１つは結腸腫瘍細胞から単離されたものと同一であり、位置３９９でのバリン残基のアラニン残基に対する置換をもたらす単一ヌクレオチドの位置１２８０での改変を含む２つめは、優性の結腸腫瘍細胞産物をコードしていた。Ｃ１１１ Ｔ細胞が適切なＨＬＡクラスＩＩ遺伝子産物を発現するＥＢＶ Ｂ細胞をわずかに認識するように単に見えた理由は明らかでないが、これらの観察結果は結腸腫瘍細胞およびＥＢＶで形質転換したＢ細胞の抗原処理能力における固有の差異に起因する可能性があった。

これまでの結果は、様々な細胞によって発現したプロテオソームサブユニットにおける差異が抗原認識に多大な影響を与える場合があることを示唆し、これはこの知見に対する１つの有力な説を提供する（２４）。正常Ｂ細胞および線維芽細胞から増幅したＲＴ−ＰＣＲ産物は、アミノ酸３９９でバリン残基を発現するＣＯＡ−１変異体を独自にコードするようにも見え、そして正常細胞系から増幅したＣＯＡ−１産物でトランスフェクトした標的細胞はＣ１１１ Ｔ細胞によって認識されなかった。

したがって、正常Ｂ細胞および線維芽細胞は、Ｃ１１１ Ｔ細胞に対して処理および提示できるＣＯＡ−１転写産物を発現できないかまたはこの産物を比較的低レベルでしか発現しないように見える。これら２つの転写産物の優先的発現に関与する機構は不明であるが、これらは異なる形で発現調節を行う２つのほぼ同一の遺伝子産物を表す場合がある。これらの産物の発現とＣ１１１ Ｔ細胞がもつ同産物によってコードされるエピトープに対する認識能の間の相関は、これらのＴ細胞によって認識される天然産物を表し、天然エピトープのペプチドミミックを表さないという更なる証拠を提供する。

更なる観察として、位置３９９での改変がＣＯＡ−１転写産物のアミノ酸３７２〜３８５を含む細胞エピトープの認識にいかに影響を与えるかということがあり、これについては以下にさらに考察する。先行試験の結果は、末端残基の改変が腫瘍反応性ＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤＣ−２７遺伝子産物の突然変異産物に対する認識能に影響を与える可能性があることを示した（２１）。先行試験において提示された予備段階の結果は、突然変異ＣＤＣ−２７遺伝子産物の改変された細胞内標的化がこの遺伝子産物の処理への影響上重要な役割を果たしている可能性があることを示した。正常および腫瘍細胞におけるＣＯＡ−１タンパク質の細胞局在化に関する検討は、類似機構がこの産物のＴ細胞認識と関与しうるか否かを示すのに役立ちうる。

トランスフェクション試験およびペプチドパルス実験は、自己ＨＬＡ−ＤＲβ１対立遺伝子であるＤＲβ１^＊０４０２もしくはＤＲβ１^＊１３０１のいずれかがＴ細胞エピトープをクローンＣ１１１ Ｔ細胞に対して提示できることを示した。これによってこれらのクラスＩＩ対立遺伝子を発現する患者１８６９および他の個人におけるこのペプチドの免疫原性を潜在的に高めうる。しかしながら、クラスＩＩおよびクラスＩ拘束性エピトープの無差別な認識例が先行試験で示されていることからこの観察結果が唯一ではない。１つの報告では、ＤＲβｌ^＊０４０２、１１０２もしくは１３０１と関連するＶＰ１６であるがいくつかの密接に関連するＤＲ４、１１もしくは１３のサブタイプではない単純ヘルペスウイルス２型ビリオンタンパク質のエピトープも認識するＣＤ４＋Ｔ細胞が同定された（２５）。アミノ酸６７〜７１の多形性領域においてＤＲβ１^＊０４０２、１１０２および１３０１分子の配列は同一であり、部位特異的な突然変異誘発試験によってこれらの残基がウイルスエピトープの認識にとって重要であることが実証された。

腫瘍内への高レベルのリンパ球浸潤が良好な予後と相関することが一部の試験で示されているが（２６）、Ｔ細胞浸潤の反応性に関して詳細な検討が行われている。結腸直腸癌細胞上でのＨＬＡクラスＩＩ分子の発現は、好ましい予後マーカーでもある（２７）（２８）。先行試験は結腸癌患者からＨＬＡクラスＩ（２９）およびクラスＩＩ（３０、３１）拘束性腫瘍反応性Ｔ細胞の単離をもたらしたが、これらの試験では限られた共通の腫瘍特異的な抗原パネルが同定されたにすぎなかった。

ＣＲＣ（結腸直腸癌）患者から単離した末梢血リンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＣＯＡ−１由来のエピトープで刺激し、腫瘍の反応性を検証している。初期段階の腫瘍を有するＣＲＣ患者（ｎ．４）においてＣＯＡ−１に特異的なＴ細胞を生成する際に１度の失敗を観察したが、進行性疾患を有する３名の患者から腫瘍に特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞を単離した。

Ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｅｎｔｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｔｅｂｅｎｅｆｒａｔｅｌｌｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、ローマと共同で、ＣＲＣ患者由来の末梢血試料を採取し、ＣＯＡ−１に特異的な免疫応答が特異的ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しかつ転移性疾患を有する多数の患者において共通に検出できるか否かを確認している。これらの結果が実証しようとしていることは、ＣＯＡ−１がＣＲＣ患者における抗腫瘍免疫応答における関連抗原であり、疾患の進行と相関するという点である。

さらに、発明者らは、専門的な抗原提示細胞、すなわち腫瘍に発現される抗原アレイに富む樹状細胞（ＤＣ）を用いてＣＲＣ患者のＰＢＭＣからＣＯＡ−１に特異的な反応性を単離できることも示している。１名のＣＲＣ患者の単球からＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−αの存在下でＤＣを生成し（実施例では同一患者から抗−ＣＯＡ−１ Ｔ細胞を予め単離した）、自己ＣＲＣ系由来の溶解物で満たし、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＢＭＣの刺激用に用いた。

３回の刺激後、抗−ＣＯＡ−１および腫瘍反応性Ｔ細胞の両方を単離している。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて無傷の腫瘍細胞および腫瘍溶解物でパルスしたＤＣのいずれかでＰＢＭＣを刺激することにより、腫瘍反応性があり、ＣＯＡ−１に特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞を同一ＣＲＣ患者から単離することができた。これらの結果は、ＣＯＡ−１がＣＲＣ患者における抗腫瘍免疫応答を媒介する免疫優性抗原を表しうることを示す。

ＣＯＡ−１に特異的なＴ細胞は、腫瘍細胞だけを特異的に認識し、正常細胞を認識しなかったが、両タイプの細胞はこの抗原を発現する（実施例参照）。これは悪性または正常細胞内でこの抗原の特異的局在化および／または処理が起こり得たことを示唆している。この論点を検討するため、ＣＯＡ−１に特異的なポリクローナル抗体を用いることによって正常および腫瘍細胞系パネルに対してレーザ走査型共焦点顕微鏡解析を行った。ＣＯＡ−１の細胞膜に対する細胞内局在化および転座経路を試験した。

細胞質内のタンパク質の局在化を腫瘍および正常細胞の両方において観察する一方、タンパク質の核局在化をＣＲＣおよび線維芽細胞の細胞系に限って認めた。同タンパク質のゴルジ装置との関連性は、腫瘍細胞内で選択的に検出されており、さらにＣＯＡ−１の微小管成分の１つであるチューブリンとの同時局在化が線維芽細胞に限って生じた。

ＣＯＡ−１が腫瘍細胞内のＨＬＡクラスＩＩ分子のみに関連したことは注目に値する。したがって、これらの結果を総合すると、ＣＯＡ−１抗原に関しては、細胞転座の特異的局在化および明確な経路が正常および悪性細胞において生じたことが示される。

したがって、発明者らはタンパク質の特異的局在化がＣＯＡ−１に由来する免疫原性エピトープのＨＬＡ分子に関連する提示に作用しうることから抗原の腫瘍特異的な免疫応答に対する増強能をもたらしたと結論付ける。

今回、組換えＣＯＡ−１タンパク質を合成しており、これを用いることでモノクローナル抗体を含む特異的抗体が産生できる。さらに、多量体の免疫原性ペプチド、すなわち複数の鎖を有するＣＯＡ−１由来エピトープ複合体を合成して用いることで、免疫応答を増強できるＣＯＡ−１のエピトープに特異的な抗体を産生している。

これらの試薬は、ＣＲＣ患者の血清における、ＣＯＡ−１に特異的な抗体またはタンパク質自体の存在を評価するのに有用なツールを表す。さらに、この検討は、同疾患に対する予後マーカーとしてのＣＯＡ−１を評価するための患者の追跡調査と相関させるべきものといえる。さらに、新規に合成した抗−ＣＯＡ−１抗体を用いることで、ＣＯＡ−１細胞局在化の分析結果を確認できる。

本発明は、添付の特許請求の範囲に記載される場合を除き、特別に示され説明されていることによって制限されるべきではない。確かに本発明はここで以下の実施例と関連して例示されるが、これらの特定の実施形態に対して本発明を制限しようとしていないことが理解されるであろう。それに対し、添付の特許請求の範囲による定義に準じて本発明の範囲内に含めうるものとして、全部の代替物、修正および等価物を対象とすることを意図するものではない。

材料および方法
細胞系および抗体
Ｔｈｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ、メリーランド州、米国に入院した５名の患者の腫瘍肝転移から結腸癌系を生成した。同組織を小さい断片に切断した後に無菌ガーゼを通してろ過することによって腫瘍試料から同細胞系を生成した。表皮成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（０．５μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびアンフォテリシン−Ｂ（５０ｎｇ／ｍｌ）を含むＭＥＧＭ ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（クロネティクス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）、ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）、メリーランド州）を加えた１０％胎児ウシ血清を含むＡＣＬ−４培地（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバード、カリフォルニア州）中でコラーゲンでコーティングした６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、フランクリンレークス、ニュージャージー州）で同腫瘍細胞を培養した。５日ごとに新鮮培地を同細胞に添加し、短時間トリプシン処理を施すことによって培養物から線維芽細胞を枯渇させた。細胞表面ＨＬＡ遺伝子の発現を評価するために、抗−クラスＩ ｍＡｂ Ｗ６／３２および抗−ＤＲ ｍＡｂ Ｌ２４３（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて免疫蛍光染色アッセイを実施した。

発現が上皮組織に限局されるように見える細胞表面分子に特異的なｍＡｂ ＢｅｒＥＰ４（ダコ（ＤＡＫＯ）、クパティーノ、カリフォルニア州）を用いて細胞系を染色し、サイトケラチン反応性のｍＡｂｓ ＣＤ１８、ＬＰ３４およびＭＮＦ１１６ダコ（ＤＡＫＯ）を用いて細胞内染色を行った。ｍＡｂ Ｃｏｌ−１（ザイメド（Ｚｙｍｅｄ）、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）を用いて結腸腫瘍内で過剰発現されることが多い分子である癌胎児性抗原（ＣＥＡ）の発現分析を行った。コラーゲンの合成に関与するタンパク質であるプロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニットに特異的なｍＡｂ ５Ｂ５（ダコ（ＤＡＫＯ））を用い、培養した結腸腫瘍細胞系における線維芽細胞の存在を評価した。ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いてフローサイトメトリーを実施した。樹立した結腸癌系のＳＷ１４６３、ＳＷ４８０およびＣｏｌｏ２０５をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州）から入手した。Ｓｕｒｇｅｒｙ Ｂｒａｎｃｈにおいてメラノーマ細胞系１６８１、線維芽細胞系１５１９ならびにＥＢＶで形質転換したＢ細胞系の１８６９および１５１９を樹立し、１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩで培養した。１００ＩＵ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（イミュネックス（Ｉｍｍｕｎｅｘ）、シアトル、ワシントン州）および１００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−４（ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）の存在下で１０％ヒト血清を加えたＩＳＣＯＶＥ’ｓ培地（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））でＰＢＬを培養することにより、上記のように正常Ｂ細胞系の１８４７、１６８１、１８７２および１８６９を生成した（１６）。ＮＩＨ ＨＬＡタイピング実験室において実施した一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ−ＰＣＲタイピングにより、ＰＢＬおよびこの試験で用いた腫瘍系のタイピングを行うＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩを決定したので、それを表１にまとめる。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分析の実施に用いる抗体をベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ）（マイアミ、フロリダ州）またはピアース・エンドジェン（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｅｎｄｏｇｅｎ）（ロックフォード、イリノイ州）から入手した。

腫瘍反応性Ｔ細胞の同定および特徴づけ
結腸癌患者由来のＰＢＭＣおよび腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）から腫瘍反応性Ｔリンパ球を生成した。１５０Ｇｙを照射した自己腫瘍細胞とのＰＢＭＣのインキュベーションを、１０％ヒト血清（ＨＳ）を加えた３００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２を含むＲＰＭＩ培地でリンパ球に対する腫瘍細胞の比率を１〜５にして実施した。５〜６週にわたって週ごとに自己照射腫瘍細胞で培養物を刺激した。１０％ＨＳおよび１，０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含むＲＰＭＩ中、２４ウェルプレート内で、１ウェル当たり５×１０^５細胞で最初に播種した新鮮非培養腫瘍によってＴＩＬ培養物を樹立した。Ｔ細胞刺激用に用いる腫瘍細胞を１０％ＨＳを含むＲＰＭＩで少なくとも１０日間培養し、ＦＢＳに対して反応性を有するＴ細胞の生成を回避した。さらに、腫瘍細胞によってＭＨＣ分子の発現を最適化するかまたはアップレギュレートするために、これらの細胞をＩＦＮ−γ（５００ＩＵ／ｍｌ）とともに４８時間インキュベートした。５×１０^４の自己もしくは同種腫瘍細胞の存在下で平底９６ウェルプレートでの２×１０^４または一部のアッセイでは５×１０^４のＴ細胞のインキュベーションにより、Ｔ細胞系の結腸癌系に対する反応性を試験した。５％ＣＯ_２中、３７℃で一晩インキュベート後、上清を収集し、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗−ＩＦＮ−γ抗体（エンドジェン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）、ロックフォード、イリノイ州）を用いてＴ細胞応答を評価した。

培養の３週間後、１０％ＨＳを加えたＲＰＭＩに３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３ ｍＡｂを含むＲＰＭＩ培地中で５０Ｇｙを照射した同種ＰＢＭＣの存在下で、限界希釈法によってＴ細胞系をクローン化した。翌日、ｒｈ−ＩＬ−２（３００ｌＵ／ｍｌ）を加えた新鮮培地を同培養物に添加した。２週間の培養後、増殖陽性ウェルを、腫瘍刺激に応答するＩＦＮ−γに対する同ウェルの放出能についてスクリーニングした。更なる分析のために選択した感作ＰＢＭＣ由来のＴリンパ球Ｃ４、Ｃ４９およびＣ１１１を１ウェルあたり５細胞で播種された培養物から単離したが、これらの条件下で増殖が陽性であったのはウェルの２７％にすぎず、これはこれらの細胞の一部もしくは全部がＴ細胞クローンを表すことを示した。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ファミリーに特異的な抗体を用いて行った分析は、９５％を超えるクローンＣ４ Ｔ細胞が抗−Ｖβ５反応性抗体と反応性を有するＴＣＲを発現する一方で、Ｃ４９が市販の抗体のいずれかによって検出されるＴＣＲを発現できないことを示した。ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施したクローンＣ１１１ ＴＣＲ Ｖβ領域産物の増幅は、このクローンがＶβ１８生殖系遺伝子由来の単一の配列を発現することを示した。フローサイトメトリー解析によって約８０％のＣ１１１ Ｔ細胞がＶｂ１８を発現することを示したが、Ｔ細胞クローンの拡大に用いられる支持細胞の汚染がこれらの結果間の相違に関与しうる。２つのＣＤ４＋腫瘍反応性Ｔ細胞培養物のＣ５およびＣ１５を１８６９ＴＩＬからも同定した。これらの培養物を１ウェルあたり１細胞で播種された細胞から単離し、増殖が陽性であったのは播種されたウェルの３％にすぎなかったことから、これらがＴ細胞クローンを表す。さらに、抗体で均質染色したこれらの培養物がＶｂ２に特異的であったが、これは同培養物がＴ細胞クローンを表すことをさらに示している。

次いで、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（３００ＩＵ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ中で５０Ｇｙを照射した同種ＰＢＬの存在下で腫瘍反応性培養物を拡大した。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６およびＣＤ５６に特異的なｍＡｂを用いて陽性培養物の免疫蛍光分析を実施した（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））。Ｗ６／３２というｐａｎ−ＭＨＣクラスＩエピトープに特異的な抗体、またはＬ２４３というｐａｎ−ＨＬＡクラスＩＩ ＤＲエピトープに特異的なｍＡｂとともに標的細胞を１時間予備インキュベートすることによって抗体ブロッキングアッセイ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｓｓａｙ）を実施した。次いで、Ｔ細胞を標的細胞に添加し、一晩インキュベートした後にＩＦＮ−γ放出を測定した。

腫瘍系のＣＩＩＴＡ形質導入
細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子の安定な発現を誘発するため、レトロウイルス発現ベクターｐＣＬＲＣＸ内にヒトクラスＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）をコードする遺伝子をクローン化することによって生成した組換えレトロウイルスで腫瘍系１８６９ｃｏｌ、ＳＷ４８０およびＣｏｌｏ２０５を形質導入した（１７）。次いで、形質導入した１８６９腫瘍細胞をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（商標）セルソーター（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて選別することで比較的高レベルの細胞表面ＨＬＡクラスＩＩ発現を均質に発現する細胞を取得した。

ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲβ１分子の単離
腫瘍系１８６９ｃｏｌ由来のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施することによってＤＲβ１^＊０４０２遺伝子を単離し、そして自己Ｔ細胞系由来のＲＮＡを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施することによってＤＲβ１^＊１３０１遺伝子を得た。ＨＬＡ−ＤＲを増幅するのに用いたプライマーは、５’−ＴＣＣＡＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＴＣＴＧＡ−３’（配列番号１３）および５’−ＣＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＴ−３’（配列番号１４）であった。ＨＬＡ−ＤＲ１３遺伝子産物である５’ＣＧＴＴＴＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＣＴＡＣＧＴＣ−３’（配列番号１５）および５’−ＣＣＡＣＣＧＣＧＧＣＣＣＧＣＴＣＧＴＣＴ−３’（配列番号１６）を特異的に増幅するように２つの追加プライマーを設計した。プラスミドベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバード、カリフォルニア州）内で単離した産物をクローン化し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃアナライザ（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、シェルトン、コネクチカット州）を用いて配列決定した。次いで、上記のように真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））およびレトロウイルス発現ベクターＣＬＲＣＸ４内で同遺伝子をクローン化した。

ＨＬＡ−ＤＲβ１遺伝子のいずれかをコードする構築物とＨＬＡ−ＤＲα遺伝子を２９３細胞内にコードする構築物とを同時トランスフェクトした。安定なトランスフェクタントをＦＩＴＣで標識した抗−ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂ Ｌ２４３で染色し、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（商標）セルソーター（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））を用いて細胞表面ＨＬＡ−ＤＲ分子の発現に対して強い陽性を示した細胞を単離した。次いで、クラスＩＩ不変鎖、ＤＭＡおよびＤＭＢ遺伝子などのＨＬＡクラスＩＩ抗原の処理に関与する分子の発現を誘発するために、上記のようにＨＬＡ−ＤＲ構築物でトランスフェクトした２９３細胞をＣＬＲＣ−ＣＩＩＴＡ構築物を用いて生成した組換えレトロウイルスの上清で形質導入した（１７）。

ｃＤＮＡライブラリの構築およびスクリーニング
Ｔｒｉａｚｏｌ（ＧＩＢＣＯ、ＢＲＬ）を用いて１８６９ｃｏｌ腫瘍系から全ＲＮＡを抽出し、次いでｐｏｌｙ（Ａ）Ｔｒａｃｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン、ワイオミング州）を用いてｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを単離した。次いで、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成キット（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、エピソーム（ｅｐｉｓｏｍａｌ）哺乳類発現ベクターｐＥＡＫ８（エッジ・バイオシステムズ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、ゲイザーズバーグ、メリーランド州）内でクローン化した。融合構築物としてｃＤＮＡ挿入物を発現し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原提示経路に対して同遺伝子産物を標的化するために、ＥＦ１−αプロモーターの下流のヒト不変鎖（Ｉｉ）のアミノ酸１〜８０をコードする断片をクローン化することによってｐＥＡＫ８ベクターを修飾した。次いで、組換えｃＤＮＡをＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））内にエレクトロポレートし、約５０個のｃＤＮＡ組換え体を含むプラスミドプールを上記のように調製した（１８）。製造業者の指示に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２（２９３−ＤＲ０４０２）もしくはＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３０１（２９３−ＤＲ１３）でトランスフェクトした２９３細胞系をｃＤＮＡプール（２００ｎｇ）から調製したＤＮＡで一時的にトランスフェクトした。

Ｃ１１１ Ｔ細胞を保存するため、９６ウェル平底プレート内のｃＤＮＡライブラリプールで５×１０^４ ２９３−ＤＲ^＊０４０２および５×１０^４ ２９３−ＤＲ^＊１３０１細胞の混合物をトランスフェクトすることにより、最初にスクリーニングアッセイを実施した。翌日、同細胞を洗浄し、２％ＨＳを加えたＡＩＭ−Ｖ培地中の１×１０^５細胞Ｔ細胞を各ウェルに添加した。３７℃および５％ＣＯ_２でのインキュベーションの１８時間後、上清１００μｌを収集し、ＩＦＮ−γ放出をＥＬＩＳＡによって評価した。その後のアッセイにおいて、ｃＤＮＡプールおよびクローンを単一のＨＬＡ ＤＲ対立遺伝子のみを発現した２９３細胞内にトランスフェクトし、これらの細胞のＣ１１１ Ｔ細胞に対する刺激能について試験した。

ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）
１８６９ｃｏｌ腫瘍細胞系から全ＲＮＡを抽出し、製造業者の使用説明書（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）に従い、Ｓｍａｒｔ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キットを用いて５’ＲＡＣＥを実施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をｐＣＤＮＡ３．１ Ｔｏｐｏクローニングベクター（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））内にクローン化し、組換えＤＮＡを配列分析のために調製した。さらに、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲキット（クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いて完全長ＣＯＡ−１遺伝子産物の増幅を行った。９５℃で１分間インキュベートした後、９５℃で３０秒のインキュベーション、６２℃で３０秒のアニーリング工程および６８℃で２分の延長工程からなる３５回の増幅サイクルを経ることによって増幅を行った。

Ｔ細胞エピトープの同定
単離した元のｃＤＮＡクローンの長いオープンリーディングフレームによってコードしたアミノ酸１５個分重複する長さが２０個もしくは２１個のアミノ酸のペプチドを、ペプチドシンセサイザー（ＡＭＳ４２２；ギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ Ｃｏ．、Ｉｎｃ．）、ミドルトン、ウィスコンシン州）を用いて固相法によって合成した。質量分析（トフツ・コア・ファシリティ（Ｔｕｆｔ’ｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、ボストン、マサチューセッツ州）によって同ペプチドの純度を検証した。ＤＲβ１^＊０４０２もしくはＤＲβ１^＊１３０１分子を発現する同種Ｂ細胞（１×１０^５細胞／ウェル）を、平底９６ウェルプレート内で１００μｌ／ウェルの１０％ＨＳを加えたＩＳＣＯＶＥ’Ｓ培地中の５０μｇ／ｍｌとともにインキュベートした。３時間後、１〜５×１０^４Ｔ細胞を１５０μｌ／ウェルの培地のウェルに添加し、３７℃および５％ＣＯ２で１８時間インキュベートしてからＥＬＩＳＡによってＩＮＦ−γの放出を測定した。

結果
結腸癌系の生成および特徴づけ
最初に培養した結腸癌系を５名の結腸直腸癌患者から得た肝転移標本から樹立した。入手した最も迅速に増殖する細胞系の１つである１８６９ｃｏｌの分析により、これらの細胞が共通の上皮マーカーを発現し、上皮細胞に関連したサイトケラチンを発現し（図１）、そして上皮細胞の典型である組織培養における形態を維持することを実証した（データは示さず）。

その一方で同細胞系は、線維芽細胞内に発現される細胞表面マーカーであるプロリル−４−ヒドロキシラーゼのβサブユニットに特異的な抗体で染色されなかった。総合すれば、これらの結果は、これらの細胞が上皮由来であり、結腸癌細胞系を表し、極めて多数の正常細胞を含まないことを示した。１８６９ｃｏｌ細胞系は均一レベルのＭＨＣクラスＩ分子を発現し、かつ低いかもしくは検出できないレベルの細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を同一細胞上に認めたが（図１）、ＩＦＮ−γによる１８６９ｃｏｌ細胞の処理はＨＬＡクラスＩＩ発現の強力なアップレギュレーションをもたらした（データは示さず）。

癌胎児性抗原は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて結腸腫瘍細胞ならびに多数の結腸腫瘍細胞系上で高レベルに発現されるが線維芽細胞または肝細胞によって発現されないマーカーを表す。１８６９ｃｏｌ細胞の分析は、それらがＣＥＡを発現し（図１）、生成した追加結腸腫瘍細胞系が類似レベルのこの遺伝子産物を発現するように見えることを示した（データは示さず）。１８６９ｃｏｌ細胞系の初期継代は高レベルのＣＥＡの発現を示し、１８６９ｃｏｌ細胞の後期継代においては低下しても依然として有意レベルのＣＥＡの発現を観察した（図１）。これらの観察結果は、種々の結腸腫瘍細胞系上にＣＥＡの異種発現が観察された先行試験と一致している（１９）。

結腸癌反応性Ｔリンパ球の単離および特徴づけ
結腸腫瘍反応性Ｔ細胞を引き出す最初の試みにおいて、患者の１８６９由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を高用量のＩＬ−２中で培養した。さらに、ＩＦＮ−γで処理してＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現をアップレギュレートした自己腫瘍細胞を用いることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて患者の１８６９由来のＰＢＭＣとの混合リンパ球腫瘍培養（ＭＬＴＣ）を実施した。３つのＣＤ４^＋腫瘍反応性Ｔ細胞クローンのＣ４、Ｃ４９およびＣ１１１を最初に選択したのは、それらの自己腫瘍細胞系との高度の反応性に基づく更なる分析のためであった。

ＰＢＭＣ由来の３つのクローンはＩＦＮ−γで処理した自己腫瘍細胞に応答してＩＦＮ−γを放出し、そしてこれらのクローンは、ＣＩＩＴＡで処理して高レベルの細胞表面ＨＬＡクラスＩＩ分子を構成的に発現する細胞を対象に選抜した１８６９腫瘍細胞に応答して極めて高レベルのＩＦＮ−γを放出した（表２）。

３つのＴ細胞クローン由来の自己１８６９ＥＢＶ Ｂ細胞系で刺激後に比較的低レベルのＩＦＮ−γが放出された。全部のＴ細胞クローンは、ＨＬＡクラスＩＩ陽性腫瘍細胞で刺激後にＩＦＮ−γおよびＧＭ−ＣＳＦを放出するがＩＬ−４を放出しない（データは示さず）。これはそれらがＴｈ１細胞表現型の細胞を表すことを示している。

ＰＢＭＣから単離したクローンがＭＨＣ拘束性における方法で腫瘍細胞を認識したか否かを試験するため、刺激細胞を担持する種々のＭＨＣハプロタイプを用いて抗−ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩに特異的な抗体の存在下でサイトカイン放出アッセイを行った（表１）。同結果は、Ｃ４、Ｃ４９およびＣ１１１ Ｔ細胞クローンがＨＬＡ ＤＲクラスＩＩ制限因子との関連で自己腫瘍細胞を認識することを示した（表２）。Ｃ４９およびＣ１１１ Ｔ細胞クローンは、自己腫瘍とともにＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３０１の発現を共有する、ＣＩＩＴＡで形質導入した同種ＭＨＣクラスＩＩ^＋結腸癌系のＳＷ４８０およびＣｏｌｏ２０５も認識し、抗−ＨＬＡ−ＤＲ ｍＡｂとともに腫瘍細胞系を予備インキュベートすることによってこの認識を遮断した。

一般に、抗−ＨＬＡ ＤＲ抗体との予備インキュベーションによって同応答が５０〜９０％だけ阻害された一方で抗−ＨＬＡクラスＩ抗体の場合には２０％未満の阻害を観察した。ＳＷ４８０ ＣＩＩＴＡで処理した腫瘍細胞系に対するＣ４系の応答ならびにＣｏｌｏ２０５ ＣＩＩＴＡに対するＣ１１１の応答は、これらのＴ細胞が典型的ＴＣＲ以外の追加リガンドを認識できるという事実を反映しうる抗−ＨＬＡ ＤＲ抗体によって部分的に阻害されただけであった。Ｃ４、Ｃ４９およびＣ１１１クローンは、自己ＥＢＶ Ｂ細胞ならびに自己細胞とＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１の発現を共有する同種ＥＢＶ Ｂ細胞系を認識した。ＩＬ−４を加えたＣＤ４０リガンドで自己ＰＢＭＣを刺激することによって生成した正常Ｂ細胞ならびに１８６９ｃｏｌ腫瘍とＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１の発現を共有し、かつＩＦＮ−γで処理することでＨＬＡクラスＩＩ遺伝子の発現をアップレギュレートされる同種線維芽細胞系は、これらＴ細胞からのサイトカイン放出をほとんど刺激することがなかった（表３）。

自己ＨＬＡクラスＩＩ陽性腫瘍細胞に対する予備アッセイに応答するＴＩＬ １８６９由来の２つのＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにおける自己および同種結腸腫瘍細胞系に対する認識能も試験した。クローンのＣ４、Ｃ４９およびＣ１１１、ならびに１８６９ＴＩＬ由来の２つのクローンであるＣ５およびＣ１５は、自己腫瘍とＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３０１遺伝子産物の発現を共有する同種結腸腫瘍細胞系１８４７ｃｏｌに応答した。その一方で、１８６９ｃｏｌ腫瘍といずれのＨＬＡ−ＤＲ遺伝子産物の発現も共有しない同種１８７２ｃｏｌ細胞系は、Ｔ細胞クローンからの顕著なサイトカイン放出を刺激できなかった。

Ｃ１１１ Ｔ細胞によって認識される抗原の同定
更なる試験の狙いは、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを可能にするのに十分に拡大する唯一のＴ細胞クローンであるＣ１１１ Ｔ細胞を対象とする１８６９ｃｏｌ細胞上に発現される腫瘍抗原を同定することであった。更なる腫瘍組織を用いて実施した試験の結果は、Ｃ１１１ Ｔ細胞が１８６９ｃｏｌ細胞系とＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３０１の発現を共有する２つの同種腎細胞系および前立腺腫瘍細胞系を認識しないことを示した（データは示さず）。ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２を発現する単一の同種メラノーマ細胞系１６８１ ｍｅｌを同定した。ＩＦＮ−γを用いて１６８１ ｍｅｌ細胞系を処理した後、細胞表面ＨＬＡクラスＩＩの発現をアップレギュレートし、処理した細胞をＣ１１１ Ｔ細胞によって認識させた。これは特定の腫瘍タイプがこれらのＴ細胞によって認識された抗原の発現を共有することを示した（表３）。

次いで、自己ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲβ１^＊０４０２もしくは１３０１遺伝子産物分子を発現する２９３細胞系の安定なトランスフェクタントを同数ずつ混合し、自己腫瘍細胞ｃＤＮＡライブラリから生成したＤＮＡプールで一時的にトランスフェクトした。約３×１０^４クローン４Ｇ３のスクリーニング後に最初に同定した陽性プールは、Ｃ１１１ Ｔ細胞による認識において２９３−ＤＲβ１^＊０４０２もしくは１３０１標的細胞を感作するように見え、そしてＣ１１１ Ｔ細胞による認識において標的細胞を感作できる単一ｃＤＮＡクローン１Ｄ８を同定した（図２）。

２９３−ＤＲβ１^＊０４０２^＋もしくは１３０１^＋細胞系を１Ｄ８ ｃＤＮＡで個々にトランスフェクトすることによって実施したアッセイは、これらＨＬＡクラスＩＩ拘束因子（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）のいずれかがＴ細胞エピトープをＣ１１１ Ｔ細胞に提示できることを示した。その一方で、１Ｄ８ ｃＤＮＡクローンのトランスフェクション後に、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０１０１、０４０１、０７０１もしくは１６０１クラスＩＩ対立遺伝子を発現する２９３細胞系がこれらのＴ細胞を刺激できなかった（データは示さず）。これはこのエピトープのＣ１１１ Ｔ細胞への提示が１８６９ｃｏｌ細胞によって発現された２つの自己ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に限定される場合があることを示している。さらに、同ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングは、１Ｄ８クローンとほぼ同一である第２のｃＤＮＡクローンの単離をもたらした。ほぼ同一の配列を有する第２のクローンの単離は、同クローンがＣ１１１ Ｔ細胞によって認識される抗原をコードする天然の転写産物を表すという知見を支持する。

結腸直腸腫瘍関連抗原ＣＯＡ−１の特徴づけ
１Ｄ８挿入物は３’末端での４４ｂｐのポリＡテイルを含むが、２９１ｂｐの長さにすぎないことから部分的ｃＤＮＡクローンを表すように見えた。次いで、１Ｄ８クローン配列に相補的な入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）内部プライマーを用いてｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）反応を実施することにより、１８６９ｃｏｌ細胞系において発現した遺伝子産物の５’末端を単離した。この反応からクローン化した産物の配列決定により、１４１２ｂｐ産物が結腸直腸抗原−１（ＣＯＡ−１）に示される、Ｃ１１１ Ｔ細胞によって認識される抗原をコードする１８６９ｃｏｌ細胞系における遺伝子の優性の転写産物を表すことを示した（図３）。

ＣＯＡ−１配列とゲノムＤＮＡ配列データベースとの比較は、この産物が１３個のエクソン由来であるが、この遺伝子の少なくとも２つの交互にスプライスした追加産物をＲＡＣＥ反応から単離することを示した。ＣＯＡ−１転写産物とヒトＥＳＴデータベースとのアラインメントは、これが正常なヒトの脳、胎盤、卵巣、および睾丸から得たいくつかの配列、ならびに種々の腺癌から得た配列に同一もしくはほぼ同一であることを示した。

ＲＡＣＥ反応からクローン化した転写産物の５’末端が同データベース内に認めたいくつかのＥＳＴ配列の５’末端に対応し、かつ元のｃＤＮＡクローンの３’末端がいくつかの細胞系由来のＥＳＴ転写産物の３’末端に対応する。これはこれらが優性のＣＯＡ−１結腸腫瘍細胞転写産物の真の５’および３’末端を表す場合があることを示している。ＣＯＡ−１配列は、ＧＴＰアーゼのＲｎｄファミリーメンバーに対する結合能に基づいて最近クローン化した分子であるラットＳｏｃｉｕｓタンパク質のヒト相同体をコードする転写産物の配列にほぼ同一である（２０）。

次いで、クローン化したＲＡＣＥ産物が正常な転写産物の一部を含むにすぎないことから推定上のＣＯＡ−１遺伝子産物の５’および３’末端の場所もしくはその近隣に位置する順方向および逆方向プライマーを用いることで１８６９ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＣＯＡ−１転写産物の３’末端に近接した高度に反復したＧ／Ｃリッチ配列に相補的なプライマーと関連する、推定上の転写産物の５’末端に近接したいくつかのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施すると、種々の非特異的な転写産物が生成された（データは示さず）。しかしながら、推定上の完全長ＣＯＡ−１転写産物のヌクレオチド２９０〜１３１８の領域を包含する２つのプライマーを用い、ＣＯＡ−１ａに示される産物の１８６９ｃｏｌ ＲＮＡからの増幅が成功した。

ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２もしくは１３０１とともにＣＯＡ−１ａ遺伝子を同時発現するトランスフェクタントは、Ｃ１１１ Ｔ細胞からの切断した１Ｄ８ ｃＤＮＡクローンでトランスフェクトしたものに匹敵するレベルのサイトカイン放出を刺激するように見えた。これは完全長遺伝子が比較的効率的にプロセシングできることを示す（図２）。ＣＯＡ−１ａ遺伝子と完全長ヒト不変鎖（Ｉｉ）をコードする構築物との同時トランスフェクションは、Ｃ１１１ Ｔ細胞によるＣＯＡ−１ａ産物でトランスフェクトした標的細胞の認識に対してほとんど効果を示さなかった。したがって、ＣＩＩＴＡ遺伝子産物をコードする構築物でもトランスフェクトした２９３細胞におけるいずれのＩｉ発現レベルもこのエピトープの認識にとって十分であった。すなわち、Ｉｉの発現はＣＯＡ−１エピトープの処理に対してあまり影響を与えない。

さらにＣＯＡ−１ａ産物は、一部のＨＬＡクラスＩＩ抗原の認識を高めることを既に示したヒトＩｉ分子のアミノ酸１〜８０と融合しなかった（２１）。

ｃＤＮＡクローンの不変鎖との融合がＣＤ４＋Ｔ細胞による認識を高めなかったという観察は、ＣＯＡ−１抗原が結腸腫瘍細胞内の内在性ＨＬＡクラスＩＩの処理経路を自然に標的化する場合があることを示している。

次いで、いくつかの結腸直腸、メラノーマ、およびＥＢＶ−Ｂ細胞系、ならびにＣＤ４０Ｌで刺激したＢ細胞および線維芽細胞系を含むいくつかの正常細胞系において、ＣＯＡ−１遺伝子の発現パターンを試験した。ノーザンブロット解析の結果は、この遺伝子が結腸およびメラノーマ腫瘍細胞系、ＥＢＶ Ｂ細胞、正常Ｂ細胞および線維芽細胞において比較的低レベルで発現することを示し、定量ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲは、これらの細胞間で発現レベルに顕著な差異がないことを示した（データは示さず）。

ＣＯＡ−１遺伝子の発現レベルがＣ１１１ Ｔ細胞によって認識される細胞系または認識されない細胞系と顕著に異ならなかったという観察は、これらの細胞が類似するが同一でない産物を発現することを示した。したがって、自己および同種ＣＤ４０Ｌで刺激したＢ細胞ならびに同種線維芽細胞系において発現したＣＯＡ−１遺伝子の転写産物をＲＴ−ＰＣＲを用いて単離し、配列を決定した。

バルク（ｂｕｌｋ）ＲＴ−ＰＣＲ産物を用いて実施した配列決定の結果は、ヌクレオチド位置１２８０でのＣ残基に対するＴの単一置換の場合を除き、ＣＤ４０Ｌで刺激したＢ細胞および線維芽細胞系が１８６９ｃｏｌ細胞由来のＣＯＡ−１転写産物と同一であるように見えた産物を優性発現することにより、アミノ酸３９９で変化をもたらすことを示した。

ＲＴ−ＰＣＲを実施して結果産物をクローン化することによってＣＤ４０Ｌ Ｂ細胞内で発現したＣＯＡ−１転写産物を単離した。配列決定したＣＤ４０ＬＢ細胞由来の全クローンは、位置１２８０でＴを含むがそれ以外では１８６９ｃｏｌ ＣＯＡ−１転写産物と同一であった。

同種結腸直腸腫瘍系のＳＷ１４６３、ＳＷ４８０および１８４７ｃｏｌならびに１６８１ ｍｅｌ系由来のＣＯＡ−１遺伝子産物の増幅により、これらの細胞から増幅する非クローン化バルクＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定によって判定された位置１２８０でＣ残基を含む産物を同細胞が優性発現することを示した（データは示さず）。ＣＯＡ−１転写産物の位置１２８０のＣおよびＴ残基に対応する同程度の高さの２つのピークは、自己ＥＢＶ Ｂ細胞由来の非クローン化ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定を行うことによって導き出された。これは、これらの産物がこれらの細胞において同様のレベルで発現されうることを示している。自己ＣＤ４０Ｌで刺激したＢ細胞、ＥＢＶ Ｂ細胞、および結腸腫瘍細胞系由来のＲＮＡを用いて得た結果を４つの独立したＲＴ−ＰＣＲ反応から得た産物に関して繰返し行った分析によって確認した。これはＣＯＡ−１転写産物のヌクレオチド１２８０で認めた残基がＰＣＲ突然変異を表さなかったことを示している（データは示さず）。

ＣＯＡ−１ａ配列における位置１２８０での単一の塩基対変化の重要性を評価するために、自己ＣＤ４０Ｌで刺激したＢ細胞から得たＲＴ−ＰＣＲ産物を真核生物の発現ベクター内でクローン化した。次いで、正常Ｂ細胞から増幅したＣＯＡ−１ａ転写産物を含むプラスミドにおけるＣ１１１ Ｔ細胞による認識の場合での２９３−ＤＲ^＊０４０２もしくは２９３−ＤＲ^＊１３０１細胞に対する感作能に対し、同プラスミドを１８６９ｃｏｌ細胞からクローン化した産物と比較した。ＣＤ４０Ｌで活性化したＢ細胞から単離した産物でない、ＣＯＡ−１ａもしくは１Ｄ８遺伝子産物でトランスフェクトした自己ＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のいずれかを発現する標的細胞は、Ｃ１１１ Ｔ細胞からのサイトカイン放出を刺激した（図４）。これらの結果は、正常Ｂ細胞および腫瘍細胞の認識と、Ｃ１１１ Ｔ細胞による認識の場合でのこれらの細胞によって発現されるＣＯＡ−１遺伝子産物の標的に対する感作能との間には相関があることを示した。

ＣＤ４^＋クローンＣ１１１によって認識されるエピトープの同定
切り取ったＣＯＡ−１遺伝子産物を用いて実施したトランスフェクション試験の結果は、Ｃ１１１ Ｔ細胞エピトープがＣＯＡ−１転写産物のヌクレオチド１１２１〜１２８８に位置する領域によってコードされることを示した。Ｓｏｃｉｕｓ遺伝子産物（２０）と重複するＣＯＡ−１転写産物における最長オープンリーディングフレームを、Ｃ１１１ Ｔ細胞によって認識されるＴ細胞エピトープの同定に用いるペプチドの合成のための基本として使用した。

次いで、長さが２０もしくは２１個のアミノ酸であり、１４もしくは１６個のアミノ酸だけ重複するペプチドを合成し、Ｃ１１１ Ｔ細胞による認識の場合での同ペプチドの標的細胞に対する感作能について試験した。自己正常Ｂ細胞は効率的に拡大できなかったことから、ＤＲβ１^＊０４０２もしくはＤＲβ１^＊１３０１を発現する同種正常Ｂ細胞を用いてこれらのアッセイを実施した。

１６８１および１８４７ ＣＤ４０Ｌで刺激した正常Ｂ細胞系は、自己腫瘍細胞系とＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２およびＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３０１分子の発現をそれぞれ共有した。これらの細胞をペプチドパネルとともにインキュベートしてから、同細胞のＣ１１１ Ｔ細胞からのサイトカイン放出に対する刺激能を試験した。同結果は、ＦＳＴＦＰＰＴＬＹＱＤＤＴＬＴＬＱＡＡＧ（配列番号１７）およびＴＬＹＱＤＤＴＬＴＬＱＡＡＧＬＶＰＫＡＡ（配列番号１８）の２つの重複ペプチドのいずれかでパルスした１６８１および１８４７ ＣＤ４０Ｌ Ｂ細胞がＣ１１１ Ｔ細胞からの顕著なサイトカイン放出を刺激することを示した。

したがってこれらのＴ細胞は、これらのペプチド内の重複領域を表すペプチドＴＬＹＱＤＤＴＬＴＬＱＡＡＧ（配列番号６）を認識する。この配列内の位置２でのＬ、位置７でのＴおよび位置１０でのＬは、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２クラスＩＩ対立遺伝子において同定されているＨＬＡ結合モチーフに一致する（２２）。しかしながら、ＨＬＡ−ＤＲβ１^＊１３０１対立遺伝子への結合に関与する、この配列内の有望なアンカー残基を同定することは不可能であった。にもかかわらず、これらの観察結果はＣ１１１ Ｔ細胞がＨＬＡ−ＤＲβ１^＊０４０２もしくは１３０１のクラスＩＩ遺伝子産物との関連で単一のペプチドエピトープを認識することを示す。

参考文献
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７．ナイトウ、Ｙ．（Ｎａｉｔｏ、Ｙ．）、サイトウ、Ｋ．（Ｓａｉｔｏ、Ｋ．）、シイバ、Ｋ．（Ｓｈｉｉｂａ、Ｋ．）、オーウチ、Ａ．（Ｏｈｕｃｈｉ、Ａ．）、サイゲンジ、Ｋ．（Ｓａｉｇｅｎｊｉ、Ｋ．）、ナグラ、Ｈ．（Ｎａｇｕｒａ、Ｈ．）およびオータニ、Ｈ．（Ｏｈｔａｎｉ、Ｈ．） 「ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｎｅｓｔｓ ａｓ ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５８：３４９１−３４９４頁、１９９８年
８．ブラウニング、Ｍ．（Ｂｒｏｗｎｉｎｇ、Ｍ．）、ペトロンツェッリ、Ｆ．（Ｐｅｔｒｏｎｚｅｌｌｉ、Ｆ．）、ビックネル、Ｄ．（Ｂｉｃｋｎｅｌｌ、Ｄ．）、クラウサ、Ｐ．（Ｋｒａｕｓａ、Ｐ．）、ローワン、Ａ．（Ｒｏｗａｎ、Ａ．）、トンクス、Ｓ．（Ｔｏｎｋｓ、Ｓ．）、マレー、Ｎ．（Ｍｕｒｒａｙ、Ｎ．）、ボドマー、Ｊ．（Ｂｏｄｍｅｒ、Ｊ．）およびボドマー、Ｗ．（Ｂｏｄｍｅｒ、Ｗ．） 「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｌｏｓｓ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ．」 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、４７：３６４−３７１頁、１９９６年
９．ガリド、Ｆ．（Ｇａｒｒｉｄｏ、Ｆ．）、カブレラ、Ｔ．（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｔ．）、コンチャ、Ａ．（Ｃｏｎｃｈａ、Ａ．）、グルー、Ｓ．（Ｇｌｅｗ、Ｓ．）、ルイス・カベロ、Ｆ．（Ｒｕｉｚ−Ｃａｂｅｌｌｏ、Ｆ．）およびスターン、Ｐ．Ｌ．（Ｓｔｅｒｎ、Ｐ．Ｌ．） 「Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ＨＬＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｕｍｏｕｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．」 Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、１４：４９１−４９９頁、１９９３年
１０．クーリエ、Ｐ．Ｇ．（Ｃｏｕｌｉｅ、Ｐ．Ｇ．）、イケダ、Ｈ．（Ｉｋｅｄａ、Ｈ．）、バウレイン、Ｊ．Ｆ．（Ｂａｕｒａｉｎ、Ｊ．Ｆ．）およびチアリ、Ｒ．（Ｃｈｉａｒｉ、Ｒ．） 「Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｔ ｗｏｒｋ ｉｎ ａ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔ．」 Ａｄｖ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、７６：２１３−２４２頁、１９９９年
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１３．アカギ、Ｊ．（Ａｋａｇｉ、Ｊ．）、ナカガワ、Ｋ．（Ｎａｋａｇａｗａ、Ｋ．）、エガミ、Ｈ．（Ｅｇａｍｉ、Ｈ．）およびオガワ、Ｍ．（Ｏｇａｗａ、Ｍ．） 「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ−ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｄ ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ−ＩＩ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ＭＵＣ−１ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＭＵＣ−１ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ．」 Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、４７：２１−３１頁、１９９８年
１４．ブロッサール、Ｐ．（Ｂｒｏｓｓａｒｔ、Ｐ．）、スチューラー、Ｇ．（Ｓｔｕｈｌｅｒ、Ｇ．）、フラッド、Ｔ．（Ｆｌａｄ、Ｔ．）、ステファノヴィッチ、Ｓ．（Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ、Ｓ．）、ラメンゼー、Ｈ．Ｇ．（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ、Ｈ．Ｇ．）、カンツ、Ｌ．（Ｋａｎｚ、Ｌ．）およびブラッガー、Ｗ．（Ｂｒｕｇｇｅｒ、Ｗ．） 「Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｉｎｅｓ ａｎｄ ａｒｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５８：７３２−７３６頁、１９９８年
１５．イトウ、Ｍ．（Ｉｔｏ、Ｍ．）、シチジョウ、Ｓ．（Ｓｈｉｃｈｉｊｏ、Ｓ．）、ツダ、Ｎ．（Ｔｓｕｄａ、Ｎ．）、オチ、Ｍ．（Ｏｃｈｉ、Ｍ．）、ハラシマ、Ｎ．（Ｈａｒａｓｈｉｍａ、Ｎ．）、サイトウ、Ｎ．（Ｓａｉｔｏ、Ｎ．）およびイトウ、Ｋ．（Ｉｔｏｈ、Ｋ．） 「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、６１：２０３８−２０４６頁、２００１年
１６．ラポインテ、Ｒ．（Ｌａｐｏｉｎｔｅ、Ｒ．）、レミュウ、Ｒ．（Ｌｅｍｉｅｕｘ、Ｒ．）、オリビエ、Ｍ．（Ｏｌｉｖｉｅｒ、Ｍ．）およびダルブ、Ａ．（Ｄａｒｖｅａｕ、Ａ．） 「Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｃＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ＣＤ４０−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．」 Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｕｎｏｌ、２６：２３７６−２３８２頁、１９９６年
１７．ロビンス、Ｐ．Ｆ．（Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｐ．Ｆ．）、エル・ガミル、Ｍ．（Ｅｌ−Ｇａｍｉｌ、Ｍ．）、リ、Ｙ．Ｆ．（Ｌｉ、Ｙ．Ｆ．）、ツォン、Ｇ．（Ｚｅｎｇ、Ｇ．）、ダドリー、Ｍ．（Ｄｕｄｌｅｙ、Ｍ．）およびローゼンバーグ、Ｓ．Ａ．（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ａ．） 「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ａｒｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ａ Ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｍｅｌａｎｏｍａ．」 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６９：６０３６−６０４７頁、２００２年
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１９．ロペス・コネホ、Ｔ．（Ｌｏｐｅｚ−Ｃｏｎｅｊｏ、Ｔ．）、オルモ、Ｎ．（Ｏｌｍｏ、Ｎ．）、ターネイ、Ｊ．（Ｔｕｒｎａｙ、Ｊ．）、ナバロ、Ｊ．（Ｎａｖａｒｒｏ、Ｊ．）およびリザルベ、Ａ．（Ｌｉｚａｒｂｅ、Ａ．） 「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｓｕｂ−ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｐｏｏｒｌｙ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ−ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．」 Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ、６７：６６８−６７５頁、１９９６年
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２１．ワン、Ｒ．Ｆ．（Ｗａｎｇ、Ｒ．Ｆ．）、ワン、Ｘ．（Ｗａｎｇ、Ｘ．）、アトウッド、Ａ．Ｃ．（Ａｔｗｏｏｄ、Ａ．Ｃ．）、トパリアン、Ｓ．Ｌ．（Ｔｏｐａｌｉａｎ、Ｓ．Ｌ．）およびローゼンバーグ、Ｓ．Ａ．（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ａ．） 「Ｃｌｏｎｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ：ｍｕｔａｔｅｄ ＣＤＣ２７ ａｓ ａ ｔｕｍｏｕｒ ａｎｔｉｇｅｎ．」 Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８４：１３５１−１３５４頁、１９９９年
２２．ラメンゼー、Ｈ．（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ、Ｈ．）、バックマン、Ｊ．（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｊ．）、エメリッヒ、Ｎ．Ｐ．（Ｅｍｍｅｒｉｃｈ、Ｎ．Ｐ．）、バコール、Ｏ．Ａ．（Ｂａｃｈｏｒ、Ｏ．Ａ．）およびステファノヴィッチ、Ｓ．（Ｓｔｅｖａｎｏｖｉｃ、Ｓ．） 「ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ：ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ．」 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５０：２１３−２１９頁、１９９９年
２３．トパリアン、Ｓ．Ｌ．（Ｔｏｐａｌｉａｎ、Ｓ．Ｌ．）、ゴンザレス、Ｍ．Ｌ．（Ｇｏｎｚａｌｅｓ、Ｍ．Ｌ．）、パークハースト、Ｍ．（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ、Ｍ．）、リ、Ｙ．Ｆ．（Ｌｉ、Ｙ．Ｆ．）、サウスウッド、Ｓ．（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ、Ｓ．）、セッテ、Ａ．（Ｓｅｔｔｅ、Ａ．）、ローゼンバーグ、Ｓ．Ａ．（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ．Ａ．）およびロビンス、Ｐ．Ｆ．（Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｐ．Ｆ．） 「Ｍｅｌａｎｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋Ｔ ｃｅｌｌｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ｎｏｎｍｕｔａｔｅｄ ＨＬＡ−ＤＲ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．」 Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８３：１９６５−１９７１頁、１９９６年
２４．モレル、Ｓ．（Ｍｏｒｅｌ、Ｓ．）、レヴィ、Ｆ．（Ｌｅｖｙ、Ｆ．）、バーレット・シルツ、Ｏ．（Ｂｕｒｌｅｔ−Ｓｃｈｉｌｔｚ、Ｏ．）、ブラッスール、Ｆ．（Ｂｒａｓｓｅｕｒ、Ｆ．）、プロブスト・ケッパー、Ｍ．（Ｐｒｏｂｓｔ−Ｋｅｐｐｅｒ、Ｍ．）、ペイトレクイン、Ａ．Ｌ．（Ｐｅｉｔｒｅｑｕｉｎ、Ａ．Ｌ．）、モンサラート、Ｂ．（Ｍｏｎｓａｒｒａｔ、Ｂ．）、ヴァン・ベルトーベン、Ｒ．（Ｖａｎ Ｖｅｌｔｈｏｖｅｎ、Ｒ．）、チェロッティーニ、Ｊ．Ｃ．（Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ、Ｊ．Ｃ．）、ブーン、Ｔ．（Ｂｏｏｎ、Ｔ．）、ガイリン、Ｊ．Ｅ．（Ｇａｉｒｉｎ、Ｊ．Ｅ．）およびヴァン・デン・アインデ、Ｂ．Ｊ．（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅ、Ｂ．Ｊ．） 「Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｓｏｍｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｂｙ ｔｈｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｂｕｔ ｎｏｔ ｂｙ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｐｏｏｒ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．」 Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１２：１０７−１１７頁、２０００年
２５．ドハーティー、Ｄ．Ｇ．（Ｄｏｈｅｒｔｙ、Ｄ．Ｇ．）、ペンゾッティ、Ｊ．Ｅ．（Ｐｅｎｚｏｔｔｉ、Ｊ．Ｅ．）、ケッレ、Ｄ．Ｍ．（Ｋｏｅｌｌｅ、Ｄ．Ｍ．）、クウォック、Ｗ．Ｗ．（Ｋｗｏｋ、Ｗ．Ｗ．）、リブランド、Ｔ．Ｐ．（Ｌｙｂｒａｎｄ、Ｔ．Ｐ．）、マシューイック、Ｓ．（Ｍａｓｅｗｉｃｚ、Ｓ．）およびネポム、Ｇ．Ｔ．（Ｎｅｐｏｍ、Ｇ．Ｔ．） 「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：ｐｌｕｒｉａｌｌｅｌｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｂｏｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ｐｅｐｔｉｄｅ，ａｎｄ ＨＬＡ−ＤＲ．」 Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６１：３５２７−３５３５頁、１９９８年
２６．ディ・ジョルジオ、Ａ．（Ｄｉ Ｇｉｏｒｇｉｏ、Ａ．）、ボッティ、Ｃ．（Ｂｏｔｔｉ、Ｃ．）、トッチ、Ａ．（Ｔｏｃｃｈｉ、Ａ．）、ミンガッツィーニ、Ｐ．（Ｍｉｎｇａｚｚｉｎｉ、Ｐ．）およびフラミア、Ｍ．（Ｆｌａｍｍｉａ、Ｍ．） 「Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｕｍｏｕｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｓｕｒｇｉｃａｌｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｃｏｌｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．」 Ｉｎｔ．Ｓｕｒｇ．、７７：２５６−２６０頁、１９９２年
２７．キニヒロ、Ｍ．（Ｋｉｎｉｈｉｒｏ、Ｍ．）、タナカ、Ｓ．（Ｔａｎａｋａ、Ｓ．）、ハルマ、Ｋ．（Ｈａｒｕｍａ、Ｋ．）、ヨシハラ、Ｍ．（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ、Ｍ．）、スミイ、Ｋ．（Ｓｕｍｉｉ、Ｋ．）、カジヤマ、Ｇ．（Ｋａｊｉｙａｍａ、Ｇ．）、シマモト、Ｆ．（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ、Ｆ．） 「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ−ＤＲ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ．」 Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、５５：３２６−３３３頁、１９９８年
２８．ランサム、Ｊ．Ｈ．（Ｒａｎｓｏｍ、Ｊ．Ｈ．）、ペッレ、Ｂ．（Ｐｅｌｌｅ、Ｂ．）およびハンナ、Ｊｒ．、Ｍ．Ｇ．（Ｈａｎｎａ、Ｊｒ．、Ｍ．Ｇ．） 「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｔｕｍｏｕｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ．」 Ｃａｎ．Ｒｅｓ．、５２：３４６０−３４６６頁、１９９２年
２９．ヤング、Ｄ．（Ｙａｎｇ、Ｄ．）、ナカオ、Ｍ．（Ｎａｋａｏ、Ｍ．）、シチジョウ、Ｓ．（Ｓｈｉｃｈｉｊｏ、Ｓ．）、ササトミ、Ｔ．（Ｓａｓａｔｏｍｉ、Ｔ．）、タカス、Ｈ．（Ｔａｋａｓｕ、Ｈ．）、マツモト、Ｈ．（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ、Ｈ．）、モリ、Ｋ．（Ｍｏｒｉ、Ｋ．）、ハヤシ、Ａ．（Ｈａｙａｓｈｉ、Ａ．）、ヤマナ、Ｈ．（Ｙａｍａｎａ、Ｈ．）、シロウズ、Ｋ．（Ｓｈｉｒｏｕｚｕ、Ｋ．）およびイトウ、Ｋ．（Ｉｔｏｈ、Ｋ．） 「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｓｈａｒｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＨＬＡ−Ａ２４−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ．」 Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、５９：４０５６−４０６３頁、１９９９年
３０．ブレマーズ、Ａ．Ｈ．Ａ．（Ｂｒｅｍｅｒｓ、Ａ．Ｈ．Ａ．）、アンドレオラ、Ｓ．（Ａｎｄｒｅｏｌａ、Ｓ．）、レオ、Ｅ．（Ｌｅｏ、Ｅ．）、ガリーノ、Ｆ．（Ｇａｌｌｉｎｏ、Ｆ．）、リニ、Ｆ．（Ｒｉｎｉ、Ｆ．）、ロンバルド、Ｃ．（Ｌｏｍｂａｒｄｏ、Ｃ．）、ベッリ、Ｆ．（Ｂｅｌｌｉ、Ｆ．）、クッペン、Ｐ．Ｊ．Ｋ．（Ｋｕｐｐｅｎ、Ｐ．Ｊ．Ｋ．）、パルミアーニ、Ｇ．（Ｐａｒｍｉａｎｉ、Ｇ．）およびカステッリ、Ｃ．（Ｃａｓｔｅｌｌｉ、Ｃ．） 「Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｃｌａｓｓ−ＩＩ ＨＬＡ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈａｒｅｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎｓ．」 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎ．、８８：９５６−９６１頁、２０００年
３１．セイテルダル、Ｉ．（Ｓａｅｔｅｒｄａｌ、Ｉ．）、ビョルハイム、Ｊ．（Ｂｊｏｒｈｅｉｍ、Ｊ．）、リズレルッド、Ｋ．（Ｌｉｓｌｅｒｕｄ、Ｋ．）、ジェルトセン、Ｍ．Ｋ．（Ｇｊｅｒｔｓｅｎ、Ｍ．Ｋ．）、ブクホルム、Ｉ．Ｋ．（Ｂｕｋｈｏｌｍ、Ｉ．Ｋ．）、オールセン、Ｏ．Ｃ．（Ｏｌｓｅｎ、Ｏ．Ｃ．）、Ｎｅｓｌａｎｄ、Ｊ．Ｍ．、エリクセン、Ｊ．Ａ．（Ｅｒｉｋｓｅｎ、Ｊ．Ａ．）、モラー、Ｍ．（Ｍｏｌｌｅｒ、Ｍ．）、リンドブロム、Ａ．（Ｌｉｎｄｂｌｏｍ、Ａ．）およびガウデルナック、Ｇ．（Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ、Ｇ．） 「Ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ−ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｉｎ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ａｎｄ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．」 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９８：１３２５５−１３２６０頁、２００１年

図面の説明
結腸直腸癌系１８６９ｃｏｌの表現型の特徴づけを示す。 図１Ａは、ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）およびクラスＩＩ（Ｌ２４３）分子、上皮マーカー（Ｂｅｒ−ＥＰ４）、ならびに線維芽細胞内で特異的に発現されたタンパク質であるプロリル−４−ヒドロキシラーゼ（５Ｂ５）のβサブユニットに特異的な抗体を用いて染色した１８６９ｃｏｌ細胞系を示す。 図１Ｂは、サイトケラチン１８と反応するＣＫｌ８；複数のサイトケラチンと反応するＬＰ３４；およびサイトケラチン５、６、８、１７そしておそらくは１９と反応するＭＮＦｌ１６といった３つのサイトケラチン反応性モノクローナル抗体を用いて実施した細胞内染色を示す。 図１Ｃは、抗−ＣＥＡモノクローナル抗体Ｃｏｌ−１を用いて実施した継代６（Ｐ６）および継代２０（Ｐ２０）での１８６９ｃｏｌ細胞の染色を示す。 Ｃ１１１ Ｔ細胞によって認識される抗原をコードする１８６９ｃＤＮＡライブラリから単離したｃＤＮＡクローンを示す。 １Ｄ８ ｃＤＮＡクローンまたはＣＯＡ−１遺伝子のヌクレオチド２０９−１３１８に対応するＣＯＡ−１ａでＭＨＣ ＤＲβ１^＊０４０２もしくは１３０１分子を発現する２９３細胞をトランスフェクトした（図３参照）。 標的細胞をＣＯＡ−１ａ産物単独でトランスフェクトするかまたはＣＯＡ−１ａおよび完全長ＨＬＡクラスＩＩ不変鎖（Ｉｉ）の混合物で同時トランスフェクトした。ＧＦＰをコードする対照プラスミドで更なる標的をトランスフェクトした。トランスフェクタントに５×１０^４Ｃ１１１ Ｔ細胞を添加して１８時間後、上清を収集し、ＩＦＮ−γ放出をＥＬＩＳＡによって測定した。 腫瘍系１８６９ｃｏｌのｍＲＮＡから単離されたＣＯＡ−１遺伝子（配列番号１）の配列を提供する。 ＲＴ−ＰＣＲによって１８６９ｃｏｌ腫瘍細胞系からＣＯＡ−１遺伝子を単離した。１Ｄ８ ｃＤＮＡクローン（配列番号１２）のアミノ酸配列を太字で示す。Ｔ細胞エピトープ（配列番号６）に対応するアミノ酸配列を下線で示し、位置１２８０での正常および腫瘍転写産物の間の単一ヌクレオチドの差異を示す。 正常Ｂ細胞由来のＣＯＡ−１転写産物がクローンＣ１１１ Ｔ細胞によって認識されないことを示す。 指定のＭＨＣ ＤＲβ１分子を発現する２９３細胞を、１８６９ｃｏｌ細胞系のいずれかまたは１８６９ ＣＤ４０Ｌで刺激したＢ細胞からＲＴ−ＰＣＲによって単離したＣＯＡ−１ａ ｃＤＮＡでトランスフェクトした。ＧＦＰおよびＩｉ−１Ｄ８構築物をそれぞれ陰性および陽性の制御として用いた。トランスフェクタントに５×１０^４Ｃ１１１ Ｔ細胞を添加して１８時間後、上清を収集し、ＩＦＮ−γ放出をＥＬＩＳＡによって測定した。黒塗りは２９３−ＤＲ^＊１３０１を表す。斜線は２３−ＤＲ^＊０４０２を表す。 ＣＯＡ−１遺伝子配列の転写産物との関係を示す。 ＣＯＡ−１ヌクレオチド配列をタンパク質配列と関連させて示す。ヌクレオチド位置１２８０にＣを含むｇＣｃトリプレットはアラニンをコードする。Ｓｏｃｉｕｓ遺伝子産物（２０）に類似するこの転写産物内の最長オープンリーディングフレームのアミノ酸配列（配列番号２）をヌクレオチド配列の真下に示す。

Claims (21)

1. ＣＯＡ−１（配列番号２）に対する抗癌免疫応答を刺激するワクチンの製造における配列番号６に示されるアミノ酸配列の全部または免疫原性部分を含むペプチドの使用であって、
   前記配列の前記免疫原性部分は、交感性ＭＨＣクラスＩＩ分子と共同して抗原提示細胞によって処理および発現される、使用。
2. 前記配列の免疫原性部分が配列番号６の８個以上の連続したアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の使用。
3. 前記配列の免疫原性部分が配列番号６の１０個以上の連続したアミノ酸残基を含む、請求項２に記載の使用。
4. 前記配列の免疫原性部分が、Ｎ末端に配列番号９を含み、および／またはＣ末端に配列番号１０を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
5. 前記配列の免疫原性部分が配列番号６からなる、請求項１に記載の使用。
6. 結腸直腸癌細胞に対して前記免疫応答が刺激される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
7. 前記ペプチドがオリゴペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
8. 前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２および／またはＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１対立遺伝子である、請求項１に記載の使用。
9. 前記ワクチンがＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２および／またはＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１対立遺伝子を発現するＰＢＭＣ（末梢血単核球）をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
10. 前記ワクチンが、配列番号６に示されるアミノ酸配列の全部または免疫原性部分を含むペプチドでパルスされた、又は前記ペプチドをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされた樹状細胞をさらに含み、該樹状細胞が、ＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２および／もしくはＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１対立遺伝子を発現する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。
11. 請求項１〜１０のいずれか１項において定義されるペプチドを含むワクチン。
12. 適切な担体を含む、請求項１１に記載のワクチン。
13. 前記ペプチドおよびそれに対する交感性ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子を発現するＰＢＭＣを含む、請求項１１または１２に記載のワクチン。
14. 前記ＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子がＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２および／またはＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１対立遺伝子である、請求項１３に記載のワクチン。
15. 請求項１〜１２のいずれか１項に定義されるように、ペプチドに対する抗体の産生を刺激する工程を含む、結腸直腸癌に対する免疫を刺激するための方法。
16. 配列番号６に示されるアミノ酸配列の全部もしくは免疫原性部分を免疫原性のある形で提示できる少なくとも１つの交感性ＨＬＡ−ＩＩ対立遺伝子のための同種または自家ＰＢＭＣによって、患者において免疫が刺激される、請求項１５に記載の方法。
17. 前記対立遺伝子がＨＬＡ ＤＲβ１^＊０４０２およびＨＬＡ ＤＲβ１^＊１３０１から選択される請求項１６に記載の方法。
18. 前記患者が、ＣＯＡ−１エピトープを免疫原性のある形で提示できる少なくとも１つの交感性ＨＬＡ−ＩＩ対立遺伝子のための自家または同種ＰＢＭＣを有し、請求項１〜１７のいずれか１項において定義されるように、ＣＯＡ−１の免疫部分またはその前駆体を含むワクチンを前記患者に投与する工程を含む、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
19. 患者における結腸直腸癌に対する免疫を刺激するための方法であって、
    ｉ）前記患者からＰＢＭＣまたはそれらの前駆体を単離し、前記ＣＯＡ−１エピトープを免疫原性のある形で提示できる少なくとも１つの交感性ＨＬＡ−ＩＩ対立遺伝子で該細胞を形質転換する工程と、
    ｉｉ）前記形質転換されたＰＢＭＣを前記患者内に再導入する工程と、
    ｉｉｉ）請求項１〜１２のいずれか１項において定義されるように、ＣＯＡ−１の前記免疫部分またはその前駆体を含むワクチンを前記患者に投与する工程と、
    を含む、方法。
20. ＣＯＡ−１の前記免疫部分またはその前駆体が前記形質転換されたＰＢＭＣとともに投与される、請求項１９に記載の方法。
21. メラノーマ細胞に対して前記免疫応答が刺激される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。

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