KR20240021995A - Pde5 억제제 특이적 결합 도메인, 재조합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PDE5 억제제 특이적 결합 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, PDE5 억제제 결합 도메인을 포함하여, 세포 침투성 PBD 또는 HER2 표적 PBD를 제공한다. 세포 침투성 PBD는 자연계에 존재하는 아미노산에 기반한 구조를 가져 생체 친화성이 높고, 독성 및 화학적 결합이 없이 PDE5 억제제를 암세포 내로의 도입 효율을 증가시키며, HER2 표적 PBD는 HER2 표적 단백질이 발현되는 세포에 대해 PDE5 억제제의 암세포 내로의 도입 효율을 증가시키는 효과가 있으므로, HER2 서열 이외에 다양한 항체, scFv 및 homing peptide 등에 PDE5 억제제 결합 단백질을 도입하면 다양한 암을 표적으로 하는 치료제를 개발할 수 있다.
Description
본 발명은 PDE5 억제제 특이적 결합 도메인, 재조합 단백질 및 이의 용도를 제공한다.
포스포디에스테라제 5 (PDE5) 억제제의 도입은 발기 부전 치료 분야에 있어서 비약적인 발전을 가져왔다. 실데나필은 1998년에 미국 시장에 소개되었고, 바르데나필, 타다라필, 가장 최근에는 아바나필을 포함한 다른 PDE5 억제제가 뒤이어 소개되었다. 미국 이외의 지역에서 도입된 다른 PDE5 억제제에는 한국의 미로데나필과 유데나필과 브라질의 로데나필이 있다.
발기부전 치료제로 알려진 PDE5 억제제 계열 약물들은 현재 단일요법 또는 항암제의 화학 보조제로써 사용 시 다양한 유형의 암에 항암 효과를 보여주고 있는데, 대표적으로 실데나필의 경우, Bcl-xL 및 FAP-1 발현의 하향 조절을 유도하여 매개되는 세포 사멸을 증가시켜 활성 산소 종 (ROS) 생성을 향상시키고, BAD 및 Bcl-2를 인산화하고, 카스파제-3,8,9 활성을 상향 조절하고, G0/G1 세포 주기 단계에서 세포를 차단시킨다. 또한 ABCC4, ABCC5, ABCB1 및 ABCG2와 같은 ATP 결합 카세트 (ABC) 수송체의 유출 활성에 대한 억제 효과를 입증하여 궁극적으로 다제 내성을 역전시킨다. 따라서 EPR 증대 및 다양한 유형의 암 관리에서 단일요법 또는 화학 보조제로 실데나필을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다.
그러나 현재 실데나필을 포함한 PDE5 억제제의 전달 및 암 표적 시스템에 관한 연구개발이 부족한 실정이다.
본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain)을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 침투성 펩타이드 (CPP) 또는 HER2 표적 도메인 (HER2 Target Domain); 및 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain)으로 구성된 재조합 단백질을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 생산방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain)을 제공한다.
[서열번호 1]
TALCTIRMFT DLNLVQNFQM KHEVLCRWIL SVKKNYRKNV AYHNWRHAFN TAQCMFAALK AGKIQNKLTD LEILALLIAA LSHDLDHRGV NNSYIQRSEH PLAQLYCHSI MEHHHFDQCL MILNSPGNQI LSGLSIEEYK TTLKIIKQAI LATDLALYIK RRGEFFELIR KNQFNLEDPH QKELFLAMLM TACDLSAITK PWPIQQRIAE LVATEFFDQG DRERKELNIE PTDLMNREKK NKIPSMQVGF IDAICLQLYE ALTHVSEDCF PLLDGCRKNR QKWQALAEQQ EKMLI
또한, 본 발명은 세포 침투성 펩타이드 (CPP) 또는 HER2 표적 도메인 (HER2 Target Domain); 및 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain)으로 구성된 재조합 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 재조합 단백질 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 PDE5 억제제 특이적 결합 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, PDE5 억제제 결합 도메인을 포함하여, 세포 침투성 PDE5 억제제 결합 도메인 또는 HER2 표적 PDE5 억제제 결합 도메인을 제공함으로써, 세포 침투성 PDE5 억제제 결합 도메인은 자연계에 존재하는 아미노산에 기반한 구조를 가져 인공적인 분자 구조에 기반한 다른 전달체에 비해 생체 친화성이 높아 독성 및 화학적 결합이 없이 PDE5 억제제를 암세포 내로의 도입 효율을 증가시키고, 나아가 HER2 표적 PDE5 억제제 결합 도메인은 HER2 표적 단백질이 발현되는 세포에 대해 PDE5 억제제의 암세포 내로의 도입 효율을 증가시킬 수 있다.
도 1은 PDE5 억제제 결합 도메인 (이하 PBD라 함.),세포 침투성 PBD (이하 TPBD라 함.) 또는 HER2 표적 PBD (이하 HPBD라 함.)이 각각 포함된 재조합 단백질을 나타낸 것이다.
도 2는 HPBD 및 TPBD 재조합 단백질의 PDE5 억제제 전달에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 PBD의 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 TPBD의 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HPBD의 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 HER2 양성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 HER2 양성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 HER2 음성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 HER2 음성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리 하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외 하였다.
도 11은 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 12는 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 13은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 14는 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 후 배지 교체하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외하였다.
도 15는 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 16은 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 17은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 18은 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외 하였다.
도 19는 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간 동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 20은 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 21은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 22는 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외하였다.
도 23은 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 24는 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 25는 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 26은 mTOR 억제제 결합 도메인 단백질과 비교한 경쟁 분석 결과를 나타낸 것이다. (mTOR 결합 도메인 단백질은 서열목록 6에 따른 아미노산 서열, 세포 침투성 MBD 재조합 단백질은 서열목록 7에 따른 아미노산 서열 및 HER2 표적 MBD 제조합 단백질은 서열목록 8에 따른 아미노산 서열을 갖는다.)
[서열번호 6]
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[서열번호 7]
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[서열번호 8]
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도 2는 HPBD 및 TPBD 재조합 단백질의 PDE5 억제제 전달에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 3은 PBD의 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 TPBD의 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 HPBD의 SDS-PAGE 및 웨스턴블롯의 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 HER2 양성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 HER2 양성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 HER2 음성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 9은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 HER2 음성 유방암세포 약물의 IC50의 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리 하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외 하였다.
도 11은 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 12는 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 13은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 14는 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 후 배지 교체하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외하였다.
도 15는 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 16은 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 17은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 TPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 18은 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외 하였다.
도 19는 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간 동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 20은 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 21은 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하지 않고 48시간동안 배양한 조건하에 나타낸 것이다.
도 22는 SK-BR-3 (ER-, PR-, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다. PBD 단백질과 약물 복합체는 약물만 단일로 처리하였을 때와 결과가 유사하여 실데나필에 대한 실험 이후에는 제외하였다.
도 23은 BT-474 (ER+, PR+, HER2+)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 24는 MDA-MB-231 (ER-, PR-, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 25는 MCF-7 (ER+, PR+, HER2-)에 대한 HPBD 재조합 단백질의 실험 결과를 세척하고, 4시간 배양 후 배지 교체하에 나타낸 것이다.
도 26은 mTOR 억제제 결합 도메인 단백질과 비교한 경쟁 분석 결과를 나타낸 것이다. (mTOR 결합 도메인 단백질은 서열목록 6에 따른 아미노산 서열, 세포 침투성 MBD 재조합 단백질은 서열목록 7에 따른 아미노산 서열 및 HER2 표적 MBD 제조합 단백질은 서열목록 8에 따른 아미노산 서열을 갖는다.)
[서열번호 6]
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[서열번호 7]
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[서열번호 8]
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이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain)을 제공한다.
상기 PDE5 억제제는 실데나필 (Sildenafil), 바데나필 (Vadenafil), 타다라필 (Tadarafil), 유데나필 (Udenafil), 아바나필 (Avanafil) 및 미로데나필 (Mirodenafil)로 이루어진 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 세포 침투성 펩타이드 (CPP) 또는 HER2 표적 도메인 (HER2 Target Domain); 및 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain)으로 구성된 재조합 단백질을 제공한다.
상기 PDE5 억제제 결합 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질을 제공할 수 있다.
상기 세포 침투성 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.
[서열번호 2]
YGRKKRRQRRR
상기 HER2 표적 도메인은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.
[서열번호 3]
MYRMQLLSCI ALSLALVTNS MDFQVQIFSF LLISASVIMS RG DIQMTQSPSS LSASVGDRVTI TCRASQDVNTA VAWYQQKPGK APKLLIYSAS FLYSGVPSRF SGSRSGTDFT LTISSLQPED FATYYCQQHY TTPPTFGQGT KVEIKRT GSTSGSGKPG SGEGS EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDVW GQGTLVTVSS FVPVFLPAKP
상기 PDE5 억제제는 실데나필 (Sildenafil), 바데나필 (Vadenafil), 타다라필 (Tadarafil), 유데나필 (Udenafil), 아바나필 (Avanafil) 및 미로데나필 (Mirodenafil)로 이루어진 군에서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 재조합 단백질은 히스티딘 태그를 더 포함할 수 있다.
상기 재조합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖을 수 있다.
[서열번호 4]
M YGRKKRRQRRRGGGS TALCTIRMFT DLNLVQNFQM KHEVLCRWIL SVKKNYRKNV AYHNWRHAFN TAQCMFAALK AGKIQNKLTD LEILALLIAA LSHDLDHRGV NNSYIQRSEH PLAQLYCHSI MEHHHFDQCL MILNSPGNQI LSGLSIEEYK TTLKIIKQAI LATDLALYIK RRGEFFELIR KNQFNLEDPH QKELFLAMLM TACDLSAITK PWPIQQRIAE LVATEFFDQG DRERKELNIE PTDLMNREKK NKIPSMQVGF IDAICLQLYE ALTHVSEDCF PLLDGCRKNR QKWQALAEQQ EKMLIGGGSGGGSGGGS IE
[서열번호 5]
MYRMQLLSCI ALSLALVTNS MDFQVQIFSF LLISASVIMS RG DIQMTQSPSS LSASVGDRVTI TCRASQDVNTA VAWYQQKPGK APKLLIYSAS FLYSGVPSRF SGSRSGTDFT LTISSLQPED FATYYCQQHY TTPPTFGQGT KVEIKRT GSTSGSGKPG SGEGS EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDVW GQGTLVTVSS FVPVFLPAKPGGGS GGGSGGGSTALCTIRMFT DLNLVQNFQM KHEVLCRWIL SVKKNYRKNV AYHNWRHAFN TAQCMFAALK AGKIQNKLTD LEILALLIAA LSHDLDHRGV NNSYIQRSEH PLAQLYCHSI MEHHHFDQCL MILNSPGNQI LSGLSIEEYK TTLKIIKQAI LATDLALYIK RRGEFFELIR KNQFNLEDPH QKELFLAMLM TACDLSAITK PWPIQQRIAE LVATEFFDQG DRERKELNIE PTDLMNREKK NKIPSMQVGF IDAICLQLYE ALTHVSEDCF PLLDGCRKNR QKWQALAEQQ EKMLIGGGSGGGSGGGS IE
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA 분자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능한게 연결된 코팅 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다.
그 예로는 앰피실린 (ampicilin), 카나마이신 (kanamycin), G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin) 및 클로람페니콜 (chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 세포를 배양하여 상기 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구체적인 예로, 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 투여량이 0.01 mg/kg 내지 200 mg/kg, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실험 예 1> 재조합 단백질 생성
PBD 서열 3종 (PBD, HPBD, TPBD)이 클로닝된 pET28A 벡터가 삽입된 E.coli BL21 (DE3)을 액체 LB 배지 (카나마이신 0.001% 포함) 5mL에 37℃, 180 rpm으로 3시간 동안 전배양 하였다. 이후, 전배양한 E.coli BL21 (DE3)을 액체 LB 배지 (카나마이신 0.001% 포함) 1L에 37℃, 180 rpm으로 본배양하였다. O.D 0.6~0.8까지 본배양하고 IPTG를 본배양 배지의 0.001% 만큼 넣고 20℃, 120 rpm으로 오버나잇 배양하여 재조합 단백질을 생산하였다.
<실험 예 2> 재조합 단백질의 정제
오버나잇한 셀과 배지를 원심분리기로 4500g, 20 분, 4℃하에 셀 다운 시키고 상등액을 버린 다음 침전물 (Pellet)을 PBS로 분산 (suspension)시켰다. 이후, 음파처리로 셀을 파쇄 시키고 10000g, 20 분, 4℃하에 셀다운 시켰다. 상등액을 0.22um 필터로 거르고 Invitrogen™의 Ni-NTA 아가로오스 3mL 컬럼과 20℃, 1시간 반응시켰다. 이미다졸 농도가 차이나는 세척완충액1,2 및 용해 완충액을 준비하였다. 세척 완충액1 5 mM를 이용하여 10CV (column volume) 펌프를 사용하지 않고 중력으로 정제하고 세척 완충액2 20 mM를 이용하여 3CV 펌프를 사용하지 않고 중력으로 정제하였다. 이후, 용해 완충액 300 mM를 이용하여 2CV 펌프를 사용하지 않고 중력으로 정제하고 용해 샘플을 10kDa 투석막으로 pH 7.4 PBS에서 4℃, 오버나잇동안 투석하였다.
<실험 예 3> SDS-PAGE
바이오라드에서 판매하는 재료와 알려진 바이오라드 SDS 겔 제조법을 참고하여 SDS 겔 (10%)을 만들어 사용했다. 상기 실험 예 2에서 정제한 단백질을 준비하고 바이오라드의 2x Laemmli 샘플 완충액과 바이오라드의 멜캡토에탄올을 95:5로 섞어서 샘플 로딩을 준비하였다. 이 완충액과 단백질을 1:1로 섞은 뒤 95℃에서 15분간 인큐베이션하였으며, 이 것을 상기 SDS 겔의 웰에 넣어 주었다. 이후, 40 V에서 15분 정도 러닝하고 120 V에서 약 1시간 정도 다시 러닝하였다. 러닝 후 겔을 잘 꺼내서 증류수에서 5분씩 3번 세척을 진행하였다. 바이오라드의 코마시 염색을 넣고 1시간 동안 염색을 진행하였고 염색된 겔에 DW를 넣고 세척을 10분간 3회 반복하였다. 겔을 네오 사이언스의 FluoroBox로 촬영하여 데이터를 얻었다.
<실험 예 4> 웨스턴블롯
웨스턴블롯 역시 널리 알려진 방법으로 진행했다. 상기 실험 예 3과 같이 바이오라드에서 판매하는 재료와 알려진 바이오라드 SDS 겔 제조법을 참고하여 SDS 겔 (10%)을 만들어 사용했다. 상기 실험 예 2에서 정제한 단백질을 준비하고 바이오라드의 2x Laemmli 샘플 완충액과 바이오라드의 멜캡토에탄올을 95:5로 섞어서 샘플 로딩을 준비하였다. 이 완충액과 단백질을 1:1로 섞은 뒤 95℃에서 15분간 인큐베이션하였으며, 이것을 상기 SDS 겔의 웰에 넣어 주었다. 이후, 40 V에서 15분 정도 러닝하고 120 V에서 약 1시간 정도 다시 러닝하였다. 러닝 후 겔을 잘 꺼내서 증류수에서 5분씩 3번 세척을 진행하였다. 이후, 바이오라드의 Trans-blot turbo Transfer Pack (BR170-4156)을 준비하여 제조사의 지침에 따라 샌드위치를 만들었따. 이를 바이오라드의 Trans-Blot Turbo blotting 시스템에 넣고 7분동안 러닝을 하였다. 이후, 멤브레인을 5% 스킴 밀크 (TBS로 제작)에 넣고 4℃에서 1시간 동안 넣고 흔들었다. 그 다음 스킴 밀크를 버리고 TTBS (0.05% tween 20 in TBS)를 넣고 4℃에서 10분씩 3회 세척을 진행하였다. 1차 항체 (6x his tag 항체, Invitrogen)를 4℃에서 2시간 동안 반응하였다. 반응 후 TTBS로 5분씩 3회 세척을 진행했고, 2차 항체 (HRP conjμgate, Invitrogen)을 4℃에서 2시간 동안 반응하였다. 반응 후 TTBS로 5분씩 3회 세척을 진행하였다. 이후 바이오라드의 Opti-4CN를 제조사 지침에 따라 멤브레인에 처리하고 20분동안 빛에 노출하지 않고 반응시켰다. 이 멤브레인을 FluoroBox로 촬영하여 데이터를 얻었다.
<실험 예 5> MTT 분석
(1)약물 IC
50
MTT 분석 역시 널리 알려진 방법으로 진행하였다. 셀을 96 웰 플레이트에 시딩하여 SK-BR-3 및 BT-474 세포주는 0.3 x 104 cells/well, MDA-MB-231 및 MCF-7 0.2 x 104 cells/well, 37℃, 24시간하에 배양하였다. PDE5 억제제를 100 μg/mL에서 1.56 μg/mL까지 DMEM 배지 (10% FBS 1% P/S)로 연속희석하였다. 희석한 배지로 배지 교체하고 37℃, 48시간하에 배양하였다. 3 mg/mL의 MTT 시약이 10% 포함된 DMEM 배지 (10% FBS 1% P/S)를 만들고, 이 때 사용된 MTT 시약은 시그마알드리치의 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide를 PBS에 3mg/mL 농도로 녹여 만들었다. MTT 시약이 10% 포함된 DMEM 배지로 배지 교체 후 37℃, 4시간 배양 후, Dimethylsulfoxide (DMSO)로 배지 교체 후 상온 암실에서 30 분 이상 반응시킨 다음 바이오텍의 마이크로플레이트 리더로 570nm에서 세포 독성을 측정하였다.
(2)세척하지 않은 조건 하 약물 단백질 실험
셀을 96 웰 플레이트에 시딩하여 SK-BR-3 및 BT-474 세포주는 0.3 x 104 cells/well, MDA-MB-231 및 MCF-7 0.2 x 104 cells/well, 37℃, 24시간하에 배양하였다. PDE5 억제제 단백질을 선택한 비율 (1 : 10 = 20 μg/mL : 200 μg/mL)로 4℃, 1~2시간 하에 반응시켰다. 반응 후 DMEM 배지 (10% FBS 1% P/S)로 배지를 완성하였고, 농도를 맞춘 배지로 배지 교체 후 37℃, 48시간하에 배양하였다. 3 mg/mL의 MTT 시약이 10% 포함된 DMEM 배지 (10% FBS 1% P/S)를 만들고, 이 때 사용된 MTT 시약은 시그마알드리치의 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide를 PBS에 3mg/mL 농도로 녹여 만들었다. MTT 시약이 10% 포함된 DMEM 배지로 배지 교체 후 37℃, 4시간하에 배양하였다. 이후, Dimethylsulfoxide (DMSO)로 배지 교체 후 상온 암실에서 30 분 이상 반응시켰다. 그리고 바이오텍의 마이크로플레이트 리더로 570nm에서 세포 생존능을 측정하였다.
(3)세척하는 조건 하 약물 단백질 실험
셀을 96 웰 플레이트에 시딩하여 SK-BR-3 및 BT-474 세포주는 0.3 x 104 cells/well, MDA-MB-231 및 MCF-7 0.2 x 104 cells/well, 37℃, 24시간하에 배양하였다. PDE5 억제제 단백질을 선택한 비율 (1 : 10 = 20 μg/mL : 200 μg/mL)로 4℃, 1~2시간 하에 반응시켰다. 반응 후 DMEM 배지 (10% FBS 1% P/S)로 배지를 완성하였고, 농도를 맞춘 배지로 배지 교체 후 37℃, 4시간 배양하고 DMEM 배지 (10% FBS 1% P/S)로 다시 배지 교체 후 37℃, 44시간 배양하였다. 3 mg/mL의 MTT 시약이 10% 포함된 DMEM 배지 (10% FBS 1% P/S)를 만들고, 이 때 사용된 MTT 시약은 시그마알드리치의 Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide를 PBS에 3mg/mL 농도로 녹여 만들었다. MTT 시약이 10% 포함된 DMEM 배지로 배지 교체 후 37℃, 4시간 배양하였다. 이후, Dimethylsulfoxide (DMSO)로 배지 교체 후 상온 암실에서 30 분 이상 반응시켰다. 그리고 바이오텍의 마이크로플레이트 리더로 570nm에서 세포 생존능을 측정하였다.
<실시 예 1> 재조합 단백질의 발현 확인
실험 예 1 및 2에서 합성 및 정제한 재조합 단백질이 제대로 발현되었는지 확인하기 위해 SDS-PAGE와 웨스턴블롯 분석을 진행하였다.
그 결과, 도 3에 따르면, PBD 재조합 단백질에 대하여 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 36.4 kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었고, 우측 웨스턴블롯 결과에서도 같은 크기의 밴드가 확인되어 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 4에 따르면, TPBD 재조합 단백질에 대하여 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 38.2 kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었고, 우측 웨스턴블롯 결과에서도 같은 크기의 밴드가 확인되어 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5에 따르면, HPBD 재조합 단백질에 대하여 좌측 SDS-PAGE 결과에서 단백질 마커의 69.08 kDa와 비슷한 크기의 밴드가 확인되었고, 우측 웨스턴블롯 결과에서도 같은 크기의 밴드가 확인되어 잘 발현되었음을 확인할 수 있었다.
<실시 예 2> 유방암 세포주에 대한 PDE5 약물들의 항암 효과 확인
유방암 세포주에 대한 PDE 약물들의 항암 효과를 확인하기 위하여, SK-BR-3, BT-474, MDA-MB-231 및 MCF-7 세포주를 준비하고 이에 대한 실데나필, 바데나필, 타다라필 및 유데나필의 IC50을 확인해 보았다.
그 결과, 도 6에 따르면, SK-BR-3에 대하여 실데나필은 25~50 μg/mL, 바데나필은 25~50 μg/mL, 타다라필은 12.5~25 μg/mL 및 유데나필은 12.5~25 μg/mL의 IC50값을 가졌음을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7에 따르면, BT-474에 대하여 실데나필은 50~100 μg/mL, 바데나필은 50~100 μg/mL, 타다라필은 25~50 μg/mL 및 유데나필은 25~50 μg/mL의 IC50값을 가졌음을 확인할 수 있었다.
나아가, 도 8에 따르면, MDA-MB-231에 대하여 실데나필은 50~100 μg/mL, 바데나필은 12.5~25 μg/mL, 타다라필은 25~50 μg/mL 및 유데나필은 12.5~25 μg/mL의 IC50값을 가졌음을 확인할 수 있었다.
마지막으로, 도 9에 따르면, MCF-7에 대하여 실데나필은 50~100 μg/mL, 바데나필은 50~100 μg/mL, 타다라필은 25~50 μg/mL 및 유데나필은 25~50 μg/mL의 IC50값을 가졌음을 확인할 수 있었다.
<실시 예 3> 유방암 세포주에 대한 TPBD 재조합 단백질의 효과 확인
유방암 세포주에 대한 PDE5 약물들과 TPBD 재조합 단백질의 효과를 확인하기 위해 SK-BR-3, BT-474, MDA-MB-231 및 MCF-7 세포주에 대한 실데나필, 바데나필, 타다라필 및 유데나필과 TPBD 재조합 단백질을 함께 사용하여 그 효과를 확인하였다.
이때, IC50결과를 바탕으로 약물 농도를 설정하였다.
(1)세척하지 않고 48시간 배양후 효과
도 10에 따르면, SK-BR-3에 대하여 실데나필 및 실데나필-PBD 재조합 단백질 복합체에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 20% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었고 바데나필에 비하여 바데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 13% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 11에 따르면, BT-474에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 11% 감소, 바데나필에 비하여 바데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 11% 감소, 타다라필에 비하여 타다라필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 9% 감소 및 유데나필에 비하여 유데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 9% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 12에 따르면, MDA-MB-231에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 16% 감소 및 바데나필에 비하여 바데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 9% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 13에 따르면, MCF-7에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 17% 감소, 바데나필에 비하여 바데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 15% 감소, 타다라필에 비하여 타다라필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 9% 감소 및 유데나필에 비하여 유데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 10% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
(2)세척하고 4시간 배양 후 배지 교체 조건하의 효과
도 14에 따르면, SK-BR-3에 대하여 실데나필 및 실데나필-PBD 복합체에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 10% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 15에 따르면, BT-474에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 5% 감소, 바데나필에 비하여 바데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 4% 감소, 타다라필에 비하여 타다라필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 6% 감소 및 유데나필에 비하여 유데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 6% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 16에 따르면, MDA-MB-231에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 11% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 17에 따르면, MCF-7에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 8% 감소, 바데나필에 비하여 바데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 5% 감소, 타다라필에 비하여 타다라필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 4% 감소 및 유데나필에 비하여 유데나필-TPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 6% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 종합하여 보면, 어느 유방암 세포주든 단일 PDE5 약물에 비해 PDE5 약물-TPBD 재조합 단백질 복합체에 의한 경우 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시킴을 알 수 있었으며, PDE5 약물-TPBD 재조합 단백질 복합체는 HER2 음성인 경우, 즉 암세포 표면에 발현되는 표적 단백질이 없는 암의 종류에서도 PDE5 억제제의 도입 효율이 증가되어 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
<실시 예 4> 유방암 세포주에 대한 HPBD 재조합 단백질의 효과 확인
유방암 세포주에 대한 PDE5 약물들과 HPBD 재조합 단백질의 효과를 확인하기 위해 SK-BR-3, BT-474, MDA-MB-231 및 MCF-7 세포주에 대한 실데나필, 바데나필, 타다라필 및 유데나필과 HPBD 재조합 단백질을 함께 사용하여 그 효과를 확인하였다.
이때, IC50결과를 바탕으로 약물 농도를 설정하였다.
(1)세척하지 않고 48시간 배양 후 효과
도 18에 따르면, SK-BR-3에 대하여 실데나필 및 실데나필-PBD 재조합 단백질 복합체에 비하여 실데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 17% 감소 및 바데나필에 비하여 바데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 10% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 19에 따르면, BT-474에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 10% 감소, 바데나필에 비하여 바데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 8% 감소, 타다라필에 비하여 타다라필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 7% 감소 및 유데나필에 비하여 유데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 6% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 20에 따르면, MDA-MB-231에 대하여 실데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체나 바데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 단일 실데나필이나 바데나필에 비해 효과의 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
도 21에 따르면, MCF-7에 대하여 PDE5 약물-HPBD 재조합 단백질 복합체가 단일 PDE5 약물에 비해 효과의 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
(2)세척하고 4시간 배양 후 배지 교체 조건하의 효과
도 22에 따르면, SK-BR-3에 대하여 실데나필 및 실데나필-PBD 재조합 단백질 복합체에 비하여 실데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 9% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 23에 따르면, BT-474에 대하여 실데나필에 비하여 실데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 4% 감소, 바데나필에 비하여 바데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 5% 감소, 타다라필에 비하여 타다라필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 3% 감소 및 유데나필에 비하여 유데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 세포 생존능이 2% 감소하여 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
도 24에 따르면, MDA-MB-231에 대하여 실데나필-HPBD 재조합 단백질 복합체가 단일 실데나필에 비해 효과의 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
도 25에 따르면, MCF-7에 대하여 PDE5 약물-HPBD 재조합 단백질 복합체가 단일 PDE5 약물에 비해 효과의 차이가 없는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 종합하여 보면, PDE5 약물-HPBD 재조합 단백질 복합체는 HER2양성인 세포들에 대해서만 암세포 내로의 PDE5 약물의 도입 효율을 증가시킴을 알 수 있었다.
<실시 예 5> mTOR 억제제 결합 도메인 단백질과 비교한 경쟁 분석 결과
mTOR 결합 도메인 단백질 (이하 MBD라 함), 세포 침투성 MBD (이하 TMBD라 함) 및 HER2 표적 MBD (이하 HMBD라 함)와 본원발명의 재조합 단백질과의 PDE5약물의 암세포 내로의 도입 효율의 차이를 확인하기 위하여 경쟁 분석을 진행하였다. 상기 MBD, TMBD 및 HMBD는 전체 유전자를 Genscript사에 의뢰하여 전체 시퀀스 (full sequence)를 합성하여 pET28A vector에 클로닝했다.
그 결과, 도 26에 따르면, SK-BR-3에 대하여 실데나필-TMBD 복합체나 실데나필-HMBD 복합체에 비해 실데나필-TPBD 재조합 단백질과 실데나필-HPBD 재조합 단백질이 세포 생존능을 더 감소시켜 PDE5 약물의 암세포 내로의 도입 효율이 더 높음을 확인할 수 있었다. 또한, MDA-MB-231에 대하여 실데나필-TMBD에 비해 실데나필-TPBD 재조합 단백질이 세포 생존능을 더 감소시켜 PDE5 약물의 암세포 내로의 도입 효율이 더 높음을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (14)
- 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain).
- 청구항 1에 있어서,
상기 PDE5 억제제는 실데나필 (Sildenafil), 바데나필 (Vadenafil), 타다라필 (Tadarafil), 유데나필 (Udenafil), 아바나필 (Avanafil) 및 미로데나필 (Mirodenafil)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain). - 세포 침투성 펩타이드 (CPP) 또는 HER2 표적 도메인 (HER2 Target Domain); 및 PDE5 억제제 결합 도메인 (PDE inhibitor Binding Domain)으로 구성된 재조합 단백질.
- 청구항 3에 있어서,
상기 PDE5 억제제 결합 도메인은 서열번호 1으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 청구항 3에 있어서,
상기 세포 침투성 펩타이드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 청구항 3에 있어서,
상기 HER2 표적 도메인은 서열번호 3로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 청구항 3에 있어서,
상기 PDE5 억제제는 실데나필 (Sildenafil), 바데나필 (Vadenafil), 타다라필 (Tadarafil), 유데나필 (Udenafil), 아바나필 (Avanafil) 및 미로데나필 (Mirodenafil)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 청구항 3에 있어서,
상기 재조합 단백질은 히스티딘 태그를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 청구항 3에 있어서,
상기 재조합 단백질은 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질. - 청구항 3항 내지 9항 중 어느 한 항의 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
- 청구항 10항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 청구항 11항의 재조합 발현 벡터로 형질전환된 재조합 세포.
- 청구항 12항의 재조합 세포를 배양하여 청구항 3항 내지 9중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질을 발현시키는 단계 및 상기 발현된 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 청구항 3항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질 생산방법.
- 청구항 3항 내지 9항 중 어느 한 항에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| KR20190057345A (ko) | 2016-09-21 | 2019-05-28 | 아말 테라퓨틱스 에스에이 | 암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체 |
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| KR20190057345A (ko) | 2016-09-21 | 2019-05-28 | 아말 테라퓨틱스 에스에이 | 암 치료를 위한, 세포 투과 펩타이드, 멀티 에피토프 및 tlr 펩타이드 작용제를 포함하는 융합체 |
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