KR102224965B1

KR102224965B1 - 세포 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트

Info

Publication number: KR102224965B1
Application number: KR1020167000554A
Authority: KR
Inventors: 김상재
Original assignee: 주식회사 젬백스앤카엘; 김상재
Priority date: 2013-07-12
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2021-03-09
Also published as: WO2015005723A1; EP3020724A4; CN105531284A; JP2016523558A; EP3020724A1; US9757473B2; KR20160029069A; JP6574175B2; CN105531284B; US20160158374A1

Abstract

본 발명은 텔로머라제로부터 유래된 세포 투과성 펩티드, 그 세포 투과성 펩티드와 항암제와의 컨쥬게이트 및 상기 컨쥬게이트를 포함한 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포 투과성 펩티드를 이용하면 암 특이적인 항암제 전달에 효과적인 수단을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 세포 투과성 펩티드와 항암제를 결합한 컨쥬게이트를 제조하여 기존 항암제의 적용 농도를 감소시키고, 암 특이성을 부여할 수 있어 치료 과정에서의 부작용 감소 효과를 얻을 수 있다.

Description

세포 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트{CELL-PENETRATING PEPTIDE AND CONJUGATE COMPRISING SAME}

본 발명은 텔로머라제로부터 유래된 세포 투과성 펩티드 (Cell penetrating peptide, CPP), 그 세포 투과성 펩티드와 유효성분, 예컨대 항암제와의 컨쥬게이트 및 상기 컨쥬게이트를 포함한 조성물에 관한 것이다.

저분자 물질, 핵산, 단백질 또는 나노입자 등은 분자 수준의 치료 물질로서 큰 잠재력을 가지고 있으나, 조직 침투 및 세포막의 침투 저항성 때문에 사용이 제한 될 수 밖에 없다. 상기 물질들을 세포 내로 이동 시켜 줄 수 있는 시스템의 개발은 분자적 방법의 치료에서 화두가 되어 왔다. 저분자 물질, 핵산, 또는 나노입자의 경우, 다양한 시약, 전기천공법(electroporation) 또는 열충격(heatshock) 등의 방법으로 세포 내 수송을 가능케 하였으나, 단백질의 경우, 활성을 그대로 유지하면서 세포 내로 이동하는 것은 매우 어려운 문제로 해결의 실마리를 얻지 못하고 있었다. 그런데, 1980년대에 HIV의 세포막을 투과하는 연구과정에서 특정 11개의 아미노산 서열로 이루어진 HIV-TAT 단백질이 세포 내로의 전달과정에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀져 1990년대부터 본격적으로 단백질의 세포 내 전달 연구가 진행되었다.

텔로미어(telomere)는 염색체의 말단에 반복적으로 존재하는 유전 물질로서, 해당 염색체의 손상이나 다른 염색체와의 결합을 방지한다고 알려져 있다. 세포가 분열할 때마다 텔로미어의 길이는 조금씩 짧아지는데, 일정한 횟수 이상의 세포 분열이 있게 되면 텔로미어는 매우 짧아지고, 그 세포는 분열을 멈추고 죽게 된다. 반면 텔로미어를 길게 하면 세포의 수명이 연장된다고 알려져 있으며, 그 예로 암세포에서는 텔로머라제(telomerase)라는 효소가 분비되어 텔로미어가 짧아지는 것을 막기 때문에, 암세포가 죽지 않고 계속 증식할 수 있다고 알려져 있다.

STAT3 저해제는 세포사멸, 신생혈관 저해, 면역회피 차단의 복합적 항암 기작을 통해서 종양을 제어하는 효과를 나타낸다. NSC 74859는 STAT3 저해제의 하나인 화학적 합성약품으로, 투여할 때 용량의존적(dose-dependent)으로 정상세포 사멸의 부작용이 보고되어 있다. 따라서 적은 용량을 투여하면서도, 동일하거나 더 큰 종양 제어 효과를 발생시키는 방법에 대한 필요성이 제기되고 있다.

파클리탁셀은 난소암, 유방암, 폐암 또는 위암의 치료에 사용되는데 파클리탁셀의 투여할 때 용량의존적(dose-dependent)으로 골수저해에 의한 백혈구, 적혈구, 혈소판 감소 등의 부작용 들이 보고되어 있다. 따라서, 파클리탁셀 또한 또한 적은 용량 투여 하여, 동일하거나 더 큰 암 치료 효과를 발생시키는 효과적인 방법에 대한 필요성이 제기되고 있다.

식품, 의약품, 건강 보조제 등에 있어서, 체내 흡수율을 높일 필요가 있는 유용한 유효 성분, 예컨대 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 조영물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(chemical compounds)등에 있어서, 세포 내 전달능은 매우 중요하다.

예컨대, 항암제의 경우, 항암 효과를 발현시키기 위해 유효량 이상의 항암제를 사용하게 되는데, 종래의 항암제는 고용량을 투여하면 골수저해에 의한 백혈구, 적혈구, 혈소판 감소, 정상세포의 사멸 등 높은 부작용이 보고되어 있다. 따라서 저용량을 투여 하여, 동일하거나 더 큰 효과를 발생시키는 방법에 대한 필요성이 제기되고 있다.

본 발명의 목적은 세포 전달성이 높은 세포 투과성 펩티드 및 이를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 특이적인 항암제 전달에 효과적인 수단으로서 세포 투과성 펩티드와 항암제를 결합한 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 STAT3 저해제 전달에 효과적인 수단으로서 세포 투과성 펩티드와 STAT3 저해제를 결합한 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 파클리탁셀 전달에 효과적인 수단으로서 세포 투과성 펩티드와 파클리탁셀을 결합한 컨쥬게이트 및 이를 포함하는 약학 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 일측면에 따르면, 텔로머라제로부터 유래된 세포투과성 운반 펩티드(Cell penetrating carrier peptide)로서, 상기 펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 세포 투과성 운반 펩티드인 것이 제공될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 세포 투과성 운반 펩티드에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따르면, 세포 투과성 운반 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트(conjugate)로서, 상기 세포 투과성 운반 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하는 것인 컨쥬게이트가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 유효성분은, 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 조영물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(chemical compounds) 중 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 유효성분은 사이토카인, 항체, 항체 단편, 치료용 효소, 가용성 수용체, 또는 리간드일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 유효성분은 질환의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 컨쥬게이트를 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 또는 예방 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 컨쥬게이트의 질환 치료 또는 예방 용도가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일 측면에 따르면, 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 일 측면에 따른 컨쥬게이트가 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 질환은 피부병, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 간 세포암, 상피세포암, 비소세포성폐암(NSCLC), 피부상피세포암, 월경과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁선근종증(adenomyosis), 자궁섬유양(uterine fibroids), 여성 또는 남성 불임(female or male infertility), 소아 성조숙증(precocious puberty in children), 전립선 비대증, 상피세포 증식에 의한 피부질환, T-림프구(T-lymphocyte) 작용에 의한 염증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 유효성분은 항암제일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 항암제는 stat-3 저해제일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)일 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트에 있어서, 상기 운반 펩티드와 유효성분은 공유결합 또는 비공유 결합에 의해, 또는 링커에 의해 매개됨으로써, 접합되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 질환의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물을 질환의 치료 또는 예방이 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 질환의 치료 또는 예방 방법이 제공될 수 있다. 구체적으로, 상기 방법은 항암 치료 또는 암예방 방법일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명의 일 측면에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 약학조성물의 질환의 치료 또는 예방 용도가 제공될 수 있다. 구체적으로 상기 용도는 항암 치료 또는 암예방 용도일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것으로서 본 발명의 일 측면에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 약학조성물이 제공될 수 있다. 구체적으로 상기 약학조성물은 항암 치료 또는 암 예방을 위한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부병, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 간 세포암, 상피세포암, 비소세포성폐암, 피부상피세포암, 월경과다증, 자궁내막증, 자궁선근종증, 자궁섬유양, 여성 또는 남성 불임, 소아 성조숙증, 전립선 비대증, 상피세포 증식에 의한 피부질환, T-림프구 작용에 의한 염증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따른 약학 조성물에 있어서, 상기 약학 조성물은 항암 치료 또는 암예방을 위한 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 세포 투과성 운반 펩티드와, 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물; 및 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 대상의 세포 내 약물 전달용 키트가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 세포 내 유효성분 전달 시스템으로서, 상기 유효성분 전달 시스템은 본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트를 포함하며, 상기 세포 투과성 운반 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하며, 상기 유효성분의 세포 내 전달을 수행할 수 있는 세포 투과성을 보유한 것인, 세포 내 유효성분 전달 시스템이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 세포 투과성 운반 펩티드에 의해 유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 방법으로서, 본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 세포 투과성 운반 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하며, 상기 유효성분의 세포 내 전달을 수행할 수 있는 세포 투과성을 보유한 것인, 유효성분의 세포 내 전달 방법이 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따른 전달 방법에 있어서, 상기 방법은 유효성분을 세포 내 미토콘드리아로 국소 전달하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명의 일측면에 따른 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명의 또 다른 일측면에 따른 벡터를 포함하는 형질전환세포가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 제1항 또는 제2항에 따른 세포투과성 운반 펩티드의 용도가 제공될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일측면에 따르면, 본 발명의 다른 일측면에 따른 컨쥬게이트를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 세포 투과성 운반 펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 서열번호 1과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열, 또는 이들의 단편을 포함하며, 상기 유효성분의 세포 내 전달을 수행할 수 있는 세포 투과성을 보유한 것이고, 상기 질환은 피부병, 염증질환, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 간 세포암, 상피세포암, 비소세포성폐암, 피부상피세포암, 월경과다증, 자궁내막증, 자궁선근종증, 자궁섬유양, 여성 또는 남성 불임, 소아 성조숙증, 전립선 비대증, 상피세포 증식에 의한 피부질환, T-림프구 작용에 의한 염증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 질환의 치료 또는 예방 방법이 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 세포 투과성 펩티드를 이용하면 유효성분, 특히 암 특이적인 항암제 전달에 효과적인 수단을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명의 세포 투과성 펩티드와 항암제를 결합한 컨쥬게이트를 제조하여 기존 항암제의 적용 농도를 감소시키고, 암 특이성을 부여할 수 있어 치료 과정에서의 부작용 감소 효과를 얻을 수 있다.

도 1 은 본 발명에 따른 펩티드와 종래의 항암제 컨쥬게이트의 항암 활성에 대한 기작을 도식화한 다이아 그램이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩티드 와 조영물질(FITC)의 컨쥬게이트를 투여한 경우에 세포내 이입 양상을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩티드를 단독으로 투여한 경우에 농도에 따른 암세포 및 정상세포에 대한 사멸 능력을 나타낸 그래프이다.
도4는 기존의 STAT3 저해성 항암제인 NSC74859를 단독으로 투여한 경우에 농도에 따른 암세포 및 정상세포에 대한 사멸 능력을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩티드와 NSC74859의 컨쥬게이트를 투여한 경우에 농도에 따른 암세포 및 정상세포에 대한 사멸 능력을 나타낸 그래프이다.
도 6은 기존의 항암제인 파클리탁셀을 단독으로 투여한 경우에 농도에 따른 암세포 및 정상세포에 대한 사멸 능력을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 펩티드와 파클리탁셀의 컨쥬게이트를 투여한 경우에 농도에 따른 암세포 및 정상세포에 대한 사멸 능력을 나타낸 그래프이다.

2013년 7월 12일에 출원된 한국 특허 출원번호 10-2013-0082265호와 2013년 12월 27일에 출원된 한국 특허 출원번호 10-2013-0165071호는 모든 목적으로서 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한 본 출원은 그 전체가 본 명세서에서 참조로 포함되는 한국 특허 출원번호 10-2013-0082265호와 한국 특허 출원번호 10-2013-0165071호의 이익을 주장한다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

단백질, 핵산, 펩티드 또는 바이러스 등은 치료 물질로서 큰 잠재력을 가지고 있으나, 분자 수준의 크기를 가지므로 조직 및 세포막을 침투하지 못해 그 사용이 매우 제한적이었다. 또한 크기가 작은 물질이라 하더라도, 그 성질이나 구조상 세포막의 지질 이중층을 투과하지 못 하는 경우가 많다. 이에, 전기 천공법 또는 열 충격 등으로, 단백질, 핵산, 펩티드 또는 바이러스 등을 세포 내로 이동시키려는 시도가 있었으나, 세포막에 손상을 주지 않음과 동시에 상기 물질들의 활성을 그대로 유지하면서 상기 물질들을 세포 내로 이동시키기는 곤란하였다. 그러던 중 인간 면역 결핍 바이러스(Human Immuno-deficiency Virus: HIV)로부터 유래된 TAT(Trans-Activating Transcriptional activator) 단백질이 거대 활성 물질들을 세포 내로 이동시킬 수 있는 세포 투과성 펩티드(Cell Penetrating peptide)로 작용할 수 있음이 알려지면서, 이에 대한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 그러나 TAT 단백질은 세포 내 독성을 야기한다고 알려져 있어, 생체 내 독성을 야기하지 않으면서도, 더욱 효과적으로 단백질, 핵산, 펩티드 또는 바이러스 등과 같은 거대 분자를 표적 세포 내로 이동시킬 수 있는 물질에 대한 연구가 진행되어 왔다. 이에 본 발명자들은 지속적인 연구를 통해, 텔로머라제로부터 유래된 펩티드가 세포 독성이 거의 없으면서도 세포 투과성 펩티드로서 우수한 효과를 가짐을 발견하였다.

최근 대두 되고 있는 항암 치료에 있어서, 치료과정에서 환자의 삶의 질을 저하시키는 부작용의 우려가 높은 기존의 항암제를 대체하기 위해, 정상세포와 달리 암세포에만 성장 촉진 등의 역할을 가지는 암 특이적인 타겟 분자를 확인하려는 시도가 지속적으로 진행 중이고, 일부 암종을 대상으로 하는 Gleevec, Iressa등과 같은 암 분자표적치료제를 개발하여 실제 임상에서 활용 중이다.

이와 같이 암 특이적인 분자표적 치료제의 개발이 빈번하게 추구되고 있지만, 여전히 널리 이용되고 있는 항암제들이 5-FU, Cisplatin, Doxorubicin, Docetaxel 등과 같이 암세포 비특이적인 전통적인 독성 제제라는 점에서 이들의 암 특이적인 전달 수단의 개발은 분자표적치료제의 또 다른 개발수단이라고 할 수 있다.

이러한 상황에서 암 특이적인 항암제 전달 수단의 개발은, 정상세포보다 암세포에 많이 흡수되는 물질에 세포독성 약물(cytotoxic drug)을 부착하거나, 암 특이적인 항원을 인지하는 항체와 항암물질의 결합 또는 암 특이적인 주변 환경에 반응하여 항암제를 노출시키는 나노 캡슐 등의 개발을 통해 달성할 수도 있다.

본 발명에 따른 세포 투과성 펩티드를 이용하면 암 특이적인 항암제 전달에 효과적인 수단을 제공할 수 있다. 보다 구체적으로는 본 발명에 따라, 세포 투과성 펩티드와 항암제를 결합한 컨쥬게이트를 제조하여 기존 항암제의 적용 농도를 감소시키면서도, 암 특이성을 부여할 수 있어, 치료 과정에서의 부작용 감소 효과를 얻을 수 있다.

STAT3 저해제는 세포사멸, 신생혈관 저해, 면역회피 차단의 복합적 항암 기작을 통해서 종양을 제어함으로써 효과를 나타낸다. STAT3 저해제의 일종인 NSC 7485는 간 세포암, 상피세포암, 비소세포성폐암(NSCLC) 등 TGF-beta 신호전달이상기능에 의한 암, 상피세포 증식으로 인한 피부병 치료 및 T-림프구와 관련된 염증에 대한 항염에 탁월한 효과를 보이는 화학 약물이다.

파클리탁셀은“탁센”, “antimicrotubule agent” “plant alkaloids”로 분류되는 항암제로, 주목 나무로부터 만들어진다. 파클리탁셀은 세포 주기 선택적으로 다양한 세포 분열 주기 중 다양한 단계의 암세포를 공격한다. 이 약물은 세포분열 과정 중 분열과 자가 복제의 기구인 미세소관 (microtubule)이 분리되는 과정을 방해함으로써 암세포의 증식을 저해하여, 난소암, 유방암, 비소세포성폐암, 피부상피세포암 등의 치료에 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 세포 투과성 펩티드는 하기의 표 1에 개시된 서열번호 1의 “pep 98”이다. 본 발명의 실시예에서는 pep 98과 함께 텔로머라제에서 유래된 pep 1(16개의 아미노산으로 구성된 펩티드)의 활성이 함께 검토되었다. 서열번호 3은 텔로머라제 전장 단백질의 서열이다. 본 명세서에서 “pep”이라 함은 본 발명에서 하기의 서열을 갖는 펩티드, 또는 그 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 상기 서열의 단편을 총칭하는 용어이다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 또는 그 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 펩티드를 대량 생산할 수 있다. 예컨대, 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주 세포에 넣어 배양함으로써, 펩티드를 대량 생산할 수 있다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 성질에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.

본 명세서에서 “아미노산”이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 본 발명의 일측면에서 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다. 한편, 본 발명의 다른 측면에서 펩티드는 번역 후 변형(post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화(phosphorylation), 당화(glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화(acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화(palmitoylation)를 포함), 알킬화(alkylation), 카르복실화(carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응(glycation), 비오티닐화(biotinylation), 유비퀴티닐화(ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화(예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화(예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제(crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.

본 명세서에 개시된 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 본 명세서에 개시된 펩티드는 서열번호 1의 단편들인 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩(folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 교환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 다른 예는 다음 표와 같다.

펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다

펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.

펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.

펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 포함하는 펩티드, 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드와 이동 대상인 유효성분이 서로 컨쥬게이션된 컨쥬게이트를 제공한다. 본 발명의 일측면에서, 유효성분은 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 조영물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(compounds) 중 선택된 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 상기 유효성분은 펩티드일 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 상기 유효성분인 펩티드는, 사이토카인, 항체, 항체 단편, 치료용 효소, 가용성 수용체, 또는 리간드일 수 있다.

본 명세서에서,“세포 투과성 펩티드(Cell Penetrating peptide, CPP)”는 인비트로(in vitro) 및/또는 인비보(in vivo)에서 이동 대상(cargo)을 세포 내로 이동시킬 수 있는 펩티드를 의미한다. 본 명세서에서, “이동 대상”은 세포 투과성 펩티드와 결합하여 세포 내로 이동할 수 있는 물질을 모두 포함하며, 예를 들어 세포 투과 효율을 높이길 원하는 모든 물질, 구체적으로 약물, 더 구체적으로 일반적인 경로를 통해서는 세포 내로 이동이 용이하지 않은 물질, 보다 더 구체적으로 단백질, 핵산, 펩티드, 미네랄, 포도당을 예로 들 수 있는 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 바이러스, 조영물질 또는 기타 화학 물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, “약물”은 질병, 상처 또는 특정 증상을 완화, 예방, 치료 또는 진단하기 위한 물질을 포함하는 광범위한 개념이다.

본 명세서에서 “운반 펩티드 (carrier peptide)”는 유효성분과 결합하여 유효성분을 원하는 부위로 이동시키는 역할을 수행하는 펩티드를 의미한다.

본 발명의 일측면에서, 이동 대상으로서의 단백질 또는 펩티드는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 신호 전달 단백질(또는 펩티드), 항체 및 백신 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에서, 핵산은 자연발생적 또는 인공적 DNA 또는 RNA 분자일 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 하나 이상일 수 있는데, 동일한 유형의 (예컨대, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는) 핵산 분자일 수도 있고, 다른 유형으로 핵산 분자들일 수 도 있다. DNA, cDNA, decoy DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, stRNA, snoRNA, snRNA, PNA, 안티센스 올리고머(antosense oligomer), 플라스미드(plasmid) 및 그 외 변형된 핵산 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에서, 바이러스는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에서, 화학 물질은 약물로서 기능할 수 있는 화학 물질을 포함하는 광범위한 개념으로, 천연 또는 합성 화학 물질을 포함한다.

본 발명의 일측면에서, 세포 투과성 펩티드에 의해 세포 내로 전달되는 약물은 리포좀, 미셀, 나노 입자, 자성 입자 또는 콴텀 도트와 같은 약물 전달체를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일측면에서, 펩티드에 이동 대상을 직접 결합시킬 수 있다. 본 발명의 다른 일측면에서, 공유 결합 또는 비공유 결합을 예로 들 수 있는 여러 결합 방법을 통해, 펩티드에 이동 대상을 결합시킬 수 있다. 이동 대상은 예컨대, 본 발명의 일측면에 따른 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 결합할 수 있다. 예를 들어, 디설파이드(disulfide) 결합, 또는 펩티드 N-말단 글루타메이트(E)의 알파 아민(α-amine) 또는 C-말단 라이신(K) 잔기의 아민에 이동 대상을 결합시키는 공유 결합을 통해 펩티드에 이동 대상을 결합시킬 수 있다. 또는 펩티드와 이동 대상 중 어느 하나가 다른 하나를 캡슐 형태를 예로 들 수 있는 형태로 감싸는 비공유 결합을 통해 펩티드와 이동 대상을 결합시킬 수 있다.

본 발명의 다른 일측면에서, 링커(linker)를 통해 펩티드와 이동 대상을 결합시킬 수 있다. 예를 들어, 펩티드 N-말단 글루타메이트의 알파 아민(α-amine) 또는 C-말단 라이신 잔기의 아민에 Hynic(6-하이드라지노피리딘-3-카르복시산, 6-hydrazinopyridine-3-carboxylic acid) 링커와 같은 링커를 도입한 후, 링커에 이동 대상을 결합시킴으로써, 펩티드에 이동 대상을 결합시킬 수 있다.

운반 펩티드로 기능하는 본 명세서에 개시된 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드는 이동 대상(cargo)과 1:1의 몰비로 결합할 수 있지만, 그 외 다른 몰비로 결합하는 것도 가능하다. 예컨대, CPP : 이동 대상의 몰비가 2:1 이상일 수 있다. 구체적으로, 2:1 이상, 3:1 이상, 4:1 이상, 5:1 이상, 6:1 이상, 7:1 이상, 8:1 이상, 9:1 이상 또는 10:1 이상일 수 있다. 이는 복수개 분자의 운반 펩티드가 하나의 이동 대상 분자와 결합할 수 있음을 의미한다. 복수개의 운반 펩티드 분자는 서로 직렬 또는 병렬로 연결될 수 있다. 직렬로 연결된다는 것은 운반 펩티드의 말단 아미노산 부위에서 서로 결합함을 의미하며, 병렬로 연결된다는 것은 운반 펩티드의 말단 아미노산 이외의 부분에서 서로 결합함을 의미한다. 반대로, 운반 펩티드 : 이동 대상의 몰비가 1:2 이상일 수 있다. 이는 하나의 운반 펩티드 분자에 복수개의 이동 대상 분자가 결합할 수 있음을 의미한다. 예컨대, 운반 펩티드 : 이동대상의 몰비가 1:2 일 수 있다. 구체적으로, 1:2 이상, 1:3 이상, 1:4 이상, 1:5 이상, 1:6 이상, 1:7 이상, 1:8 이상, 1:9 이상 또는 1:10 이상일 수 있다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드의, 하나 이상의 유효성분을 전달하기 위한 약물 전달체로서의 용도를 제공한다.

본 발명의 일측면은 약물; 및 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함하는 조성물을 대상에게 적용하는 것을 포함하는 대상의 세포 내로 약물을 전달하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 및 이동 대상인 약물의 컨쥬게이트를 포함하는 조성물; 및 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 대상의 세포 내 약물 전달용 키트를 제공한다.

본 발명의 일측면은 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드, 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트를 포함하여, 유효성분을 세포 내로 전달하는 효과가 우수한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그의 단편들인 펩티드 또는 상기 펩티드 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 0.1 ㎍/㎎ 내지 1 ㎎/㎎, 구체적으로 1 ㎍/㎎ 내지 0.5 ㎎/㎎, 더 구체적으로 10 ㎍/㎎ 내지 0.1 ㎎/㎎ 함량으로 포함할 수 있다. 상기 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내 또는 피하 등으로 투여될 수 있다.

경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 분무제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 당업계의 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물의 유효성분은 투여 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 ㎍/kg/일 내지 1 g/kg/일, 구체적으로는 1 ㎍/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 구체적으로는 10 ㎍/kg/일 내지 1 mg/kg/일, 보다 더 구체적으로는 50 ㎍/kg/일 내지 100 ㎍/kg/일이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일측면에 따른 약학 조성물은 1일 1회 내지 3회 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).

수치를 범위로 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 이와 다른 언급이 없는 한, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 한계 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.

본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 용어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 용어도 청구범위에 언급되지 않음 임의의 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석돼서는 아니 된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 상기 기재된 바에 따라, 바람직한 구체예들은 다양하게 변형될 수 있음은 당업자에게 명백하다. 본 발명자들은 당업자들에 의해 그러한 변형이 적절히 이루어지길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 구체적으로 기재된 것과 다른 다양한 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 바와 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 모든 가능한 변형들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 임의의 조합도 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 범주내에서 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.

이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.

하기의 실시예에서는 서열번호 1에 기재된 서열을 갖는 펩티드(PEP 98) 및 항암제의 컨쥬게이트를 제조하여 암 특이적인 전달 효과를 확인하고자 하였다.

I. 펩티드의 제조

실시예 1: pep98 및 pep1의 제조

서열번호 1의 펩티드(pep98) 및 비교를 위한 pep1(16 aa길이의 텔로머레이즈 유래 펩티드)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다.

구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc (Fluorenylmethyloxycarbonyl) 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다.

다음과 같이, 펩티드의 C-말단의 첫 번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

(NH2-Leu-2-chloro-trityl resin).

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH.

커플링 시약으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다.

Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 수지(resin)에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) /H2O=92.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.

아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다.

합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.

Pep98의 구체적인 합성 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

NH2-Leu-2-chloro-trityl resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격 NH2-N(Trt)-R(Pbf)-G-F-K(Boc)-A-G-R(Pbf)-N(Trt)-M-R(Pbf)-R(Pbf)-K(Boc)-L-F-G-V-L-R(Boc)-L-2-chloro-trityl resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavagge): 합성이 완료된 펩타이드 resin에 절단 칵테일을 가하여 펩타이드를 resin에서 분리하였다.

5) 얻어진 혼합물(mixture)에 냉각 디에틸 에테르(cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩타이드를 침전시킨다.

6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 제조하였다.

상기 제조 방법은 pep98을 기준으로 하였으며, pep1 또한 pep98의 제조 방법과 같은 방법으로 제조하였다.

II. 세포 투과성 펩티드의 세포 내 이입 양상

실시예 2: pep98의 세포내 이입 양상 분석

(1) 세포주 배양

세포 투과성 펩티드의 세포 내 이입 양상을 보기 위하여, 한국인 두경부 암세포 (SNU-1041, SNU-1076), MD Anderson cancer center에서 확립한 두경부 암세포 (OSC19, HN5) 및 정상세포인 DPSC (Dental Pulp Stem Cell)를 사용하였다.

상기 세포주들은 적절한 배양용액인 RPMI-1640 또는 DMEM에 10% FBS와 Antibiotic-antimycotic 항생제를 첨가하여 100cm2-배양 접시에 각 세포를 살포(seeding)하여 인큐베이터(incubator) (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 각 세포의 성장 속도 및 상태를 매일 확인하면서 2-5일 간격으로 서브 배양(sub-culture)을 통해 세포의 상태를 양호하게 유지하였다.

(2) 유세포분석 (Flow Ctometry)을 이용한 두경부 암세포에서의 pep98 이입 경향 및 특성 분석

24시간 전에 6well-plate에 60-70% 수준으로 암세포를 준비하여 배양 후, FITC (10uM), pep1-FITC (10uM), FITC-TAT (10uM)를 각각 처리하고, 2.5시간 후에 배양액을 제거하고 식염수로 세척(washing) 및 Trypsin-EDTA 효소처리를 통해 cell을 분리하여 106 cells/ml로 튜브(tube)에 준비하여 FACS 측정 하였다.

확인 결과, pep98 및 pep1을 조영물질 FITC와 컨쥬게이트한 경우, FITC 단독의 경우보다 월등히 높은 세포 투과성을 나타내었다.

아울러, HN5 와 OSC19 과같이 pep1-FITC 의 이입율이 비교적 약한 두경부 암세포에서 pep98-FITC의 세포 이입율은 대조군과 pep1-FITC 에 비해 100-200 배 증가함이 확인 되었다.

또한, pep1의 이입율이 높은 두경부 암세포 SNU-1041(41로 표시), SNU-1076(76으로 표시)에서 pep98-FITC 는 pep1-FITC 와 비슷한 이입 양상을 보였다 (도 2 참조).

이러한 결과는 pep98과의 컨쥬게이트가 항상 높은 세포 투과성을 나타내는 것에서, pep98의 세포 투과능을 컨쥬게이트를 통해 활용할 수 있으며, 특히, 컨쥬게이트되는 유효성분으로 암세포 특이적인 항암제의 활용을 통해, 항암치료의부작용 경감 및 효능 증대를 추구할 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.

III. 항암제와 세포 투과성 펩티드 컨쥬게이트의 제조

실시예 3: STAT3 저해제 (NSC 74859)와 세포 투과성 펩티드(pep98) 컨쥬게이트 제조

(1) 커플링을 위한 pep98 기본골격 펩티드 resin 의 제조:

커플링을 위해 NH2-amino-2-choloro-trityl Resin에 보호된 아미노산(8당량)과 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척했다.

그 후 Fmoc 탈보호(deprotection)를 위해 20% DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척했다.

상기 반응을 반복적으로 수행하여 펩티드 pep98의 기본 골격(NH2-N(Trt)-R(Pbf)-G-F-K(Boc)-A-G-R(Pbf)-N(Trt)-M-R(Pbf)-R(Pbf)-K(Boc)-L-F-G-V-L-R(Boc)-L-2-chloro-Trityl Resin)을 만든다.

(2)STAT3 저해제(NSC 74859)와의 커플링:

NSC 74859 (Sigma Aldrich cat.# SML0330, 4당량)와 Coupling reagent HBTU(4당량)/HOBt(4당량)/NMM(8당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척한다.

합성이 완료된 펩티드 resin에 TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리한다.

HPLC로 정제 후, MS확인하고 동결 건조한다.

실시예 4: 파클리탁셀과 세포 투과성 펩티드(pep98) 컨쥬게이트 제조

(1) 말레이미드(Maleimide)가 도입된 파클리탁셀의 합성:

pep98과 파클리탁셀(Sigma-Aldrich Inc., USA St Louis)의 접합(conjugation)을 위해 링커(4-Maleimidobutyric acid)를 파클리탁셀에 도입하여 티올(Thiol) 반응성있는(reactive) 말레이미드 작용기를 도입하였다.

파클리탁셀 1g (1.17mmol, 1 eq), 4-Maleimidobutyric acid 210 mg

(1.17mmol, 1eq), 디메칠아미노피리딘(DMAP) 140mg(2.34mmol, 2eq), 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) 480mg(1.17mmol, 1eq)을 100ml 둥근 플라스크(Round flask)에 담고, 메틸렌 클로라이드(Methylene chloride) 50ml를 넣은 후, 상온에서 교반하여 반응 시켰다.

반응의 진행은 TLC(Thin Layer Chromatography)법을 이용하여 관찰하고 반응이 끝나면, 증류수(DW) 50ml를 넣어 흔들어 섞었다(Work up). (Rf Value = 0.43, Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1)

유기층을 모아 마그네슘 설파이드(Magnesium sulfide)로 수분을 제거한 후, 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 이용하여 분리하였다. (Hexane : Ethyl acetate = 1 : 1) 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 얻은 물질을 농축하여 말레이미드가 도입된 파클리탁셀의 화합물 620mg을 얻었다.

(2) 티올(Thiol) 변형된(modified) 펩티드(pep98) (Mercaptoacetyl-Ahx-NRGFKAGRNMRRKLFGVLRL) 합성:

서열번호 1의 펩티드(pep98)를 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드의 C-말단의 첫 번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

(NH2-Leu-2-chloro-Trityl Resin).

펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu, Pbf 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:

Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Ahx-OH (Ahx = 6-aminohexanoic acid이며 펩티드 합성에는 Fmoc-Ahx-OH를 사용하였다.)

커플링 시약으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] /HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM[4-Methylmorpholine]를 사용하였다.

Fmoc 제거는 20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF)를 이용하였다. 합성된 펩티드를 수지(Resin)에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA(trifluoroacetic acid) /EDT(ethanedithiol) /TIS(triisopropylsilane) /H2O = 92.5 / 2.5 / 2.5 / 2.5]을 사용하였다.

구체적인 과정을 설명하면 다음과 같다.

1) 커플링

2) Fmoc 탈보호

20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF)을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.

3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩타이드 기본 골격 Trt-Mercaptoacetyl-Ahx-N(Trt)-R(Pbf)-G-F-K(Boc)-A-G-R(Pbf)-N(Trt)-M-R(Pbf)-R(Pbf)-K(Boc)-L-F-G-V-L-R(Boc)-L-2-chloro-trityl resin)을 만들었다.

4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩타이드 수지에 절단 칵테일을 가하여 펩타이드를 수지에서 분리하였다.

5) 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시켰다.

(3) 말레이미드가 도입된 파클리탁셀과 티올(Thiol) 변형된 펩티드(pep98)의 컨쥬게이션의 제조:

1) 상기 합성한 말레이미드가 도입된 파클리탁셀 100mg(98mol, 1eq)을 1ml DMSO에 녹였다.

2) 상기 합성한 티올 변형된 pep98 100mg(48mol, 2eq)을 1ml DMSO에 녹인 후, 이 용액을 1)에서 준비한 용액에 첨가하였다.

3) 여기에 DIPEA(Diisopropyl ethyl amine) 2~3 방울을 넣은 후, Vortex에서 5분간 반응 시켰다.

4) 반응의 종결은 Elman 시약으로 확인하고, 노란빛이 사라지면, 얻어진 혼합물에 냉각 디에틸에테르(Cooling diethyl ether)를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 화합물을 침전시켰다.

5) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 분말(powder)로 만들었다.

IV. 항암제와 세포 투과성 펩티드 컨쥬게이트의 항암 활성

실시예 5: STAT3 저해제(NSC 74859)와 세포 투과성 펩티드(pep98)컨쥬게이트의 항암 활성 확인

(1) 세포주 배양

세포주는 상기 실시예 2 에서 언급한 세포 및 세포 배양방법과 동일하게 제조 및 사용하였다.

(2) 항암 활성 확인

아래와 같이 pep98, NSC 74859, 및 NSC 74859-pep98 컨쥬게이트 별로 투여량에 따른 암세포주 및 정상세포주에서의 세포 사멸 정도를 측정하여 확인하였다.

24시간 전에 96well-plate에 30-40% 수준으로 암세포 및 정상세포를 선 살포(pre-seeding)하여 배양 후, 해당 약물을 각각 처리 후, 24시간/48시간/72시간에 현미경 관찰을 통해 세포 모양(cell shape)분석을 통한 살상능 예비 평가 후, 72시간에 MTT 어세이(MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, a yellow tetrazole) assay)를 통한 광학밀도(OD, optical density)측정을 통해 정량 분석을 실시하였다.

pep98을 단독 처리하는 경우 암세포의 증식(proliferation)에 영향이 거의 없음을 확인하여, pep98는 자체적으로 암세포 사멸능력을 보유 하고 있는 것이 아니라는 것을 확인할 수 있었다 (도 3 참조).

NSC 74859 는 단독으로 처리하였을 때, 두경부 암세포에서 50 μM 부터 암세포 사멸을 시작하며, 200 μM 에서 거의 모든 암세포를 사멸 시켰다. 정상세포인 DPSC의 경우에는, 100μM까지 큰 변화 없다가, 200 μM 에서 세포 사멸이 나타났다 (도 4 참조).

반면 pep98-NSC 74859 의 경우, 5 μM 부터 암세포를 사멸시키기 시작하여, 20 μM 에서 거의 모든 암세포 사멸을 확인할 수 있었다.

또한, pep98-NSC 74859의 경우 모든 암세포를 사멸시키는 범위의 농도에서도 정상세포인 DPSC 를 사멸시키지 않음을 확인할 수 있었다 (도 5 참조).

상기 실시예의 결과를 토대로 NSC 74859-pep98 컨쥬게이트는 pep98와의 결합을 통해 암세포 특이적인 전달이 가능하였으며, NSC 74859의 항암활성에 의해 암세포 살상이 유발되는 것과 DPSC(정상세포)의 경우에, NSC 74859에 의한 정상세포의 세포사멸이 일어나지 않는 범위 내에서, NSC 74859가 암세포에 대한 세포사멸을 완료할 수 있는 것으로 본 발명에 따른 컨쥬게이트가 항암제의 부작용을 감소시키게 할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.

실시예 5: 파클리탁셀과 세포 투과성 펩티드(pep98) 컨쥬게이트의 항암 활성 확인

(1) 세포주 배양

(2) 항암 활성 확인

아래와 같이 파클리탁셀 및 파클리탁셀-pep98 컨쥬게이트 별로 투여량에 따른 암세포주 에서의 세포 사멸 정도를 측정하여 확인하였다.

SNU-1041, SNU-1076, HN5, OSC-19의 각 두경부 암세포주를 96well 배양용기에 준비한 후 37℃ 세포배양기에서 24시간 동안 안정화 과정을 미리 진행하였다. 이후에, 72시간 동안 파클리탁셀(0μM, 0.5μM, 1μM, 2μM, 5μM, 10μM) 그리고 파클리탁셀-pep98 컨쥬게이트(0μM, 0.25 μM, 0.5μM, 1μM, 2μM, 5μM)를 각 처리한 후, MTT를 처리하고, 3시간 뒤에 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포 성장능 변화를 모니터링 하였다.

확인 결과 4가지 두경부 암세포주 모두(SNU-1041, SNU-1076, HN5, OSC-19)에서 파클리탁셀만을 단독 투여한 경우에는 5 내지 10 μM 투여 구간에서 암세포 사멸이 나타났다 (도 6 참조).

반면에, 4가지 두경부 암세포주 모두(SNU-1041, SNU-1076, HN5, OSC-19)에서 파클리탁셀-pep98 컨쥬게이트를 투여한 경우에는 0.5μM 투여 구간부터 암세포 사멸이 나타나는 것을 확인 하였다(도 7 참조).

상기 결과를 토대로 파클리탁셀-pep98 컨쥬게이트는 파클리탁셀의 단독 투여와 비교할 때 적은 농도의 투여로도 암세포 특이적인 전달이 가능하다는 결론을 내릴 수 있다.

상기 실시예 들에서 제시된 모든 항암 활성 확인 실험들의 결과는 pep98을 활용하여 적은 양의 항암제 (예를 들어 STAT3 저해제인 NSC 74859, 파클리탁셀)를 통해 큰 항암 효과를 낼 수 있음을 의미하고, 이를 통해 항암치료의 부작용 경감 및 항암제의 효과 증대를 달성할 수 있음을 시사한다고 할 수 있다.

이에 더하여, pep98과의 컨쥬게이션을 매개로 NSC 74859와 유사한 프로브 형태의 작은 분자량의 약물, 예를 들어 T-림프구관련 염증 질환을 타깃으로 하는 항염제, 상피세포증식과 관련된 피부병 치료제, 또는 파클리탁셀과 유사하게 천연물질에서 추출된 항암, 항염에 효과를 보이는 약물 들이 세포 투과도 증가로 더 높은 효과를 보일 수 있는 데에 기여할 수 있음을 예측할 수 있다.

<110> KAEL-GemVax Co., Ltd. KIM, Sangjae <120> CELL PENETRATING PEPTIDE, AND CONJUGATE COMPRISING THE SAME <130> OF14P129PCT <150> KR 10-2013-0082265 <151> 2013-07-12 <150> KR 10-2013-0165071 <151> 2013-12-27 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 1 5 10 15 Val Leu Arg Leu 20 <210> 2 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln Gln 1010 1015 1020 Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp Thr Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly Met Ser Leu 1045 1050 1055 Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu Ala Val Gln Trp 1060 1065 1070 Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr Arg His Arg Val Thr 1075 1080 1085 Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr Ala Gln Thr Gln Leu Ser 1090 1095 1100 Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys Thr Ile Leu Asp 1125 1130

Claims

텔로머라제로부터 유래된 세포투과성 운반 펩티드(cell penetrating carrier peptide)로서, 상기 펩티드가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 세포투과성 운반 펩티드.
유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 분리된 세포 내 유효성분 전달 시스템으로서, 제1항에 따른 세포투과성 운반 펩티드를 포함하는, 분리된 세포 내 유효성분 전달 시스템.
제1항에 따른 세포 투과성 운반 펩티드와 유효성분의 컨쥬게이트(conjugate).
제3항에 있어서, 상기 유효성분은, 단백질, 핵산, 펩티드, 지질, 당지질, 미네랄, 당, 나노 입자, 생물학적 제제, 조영물질, 약물(drugs) 및 화학 물질(chemical compounds) 중 선택된 하나 이상인 컨쥬게이트.
제3항에 있어서, 상기 유효성분은 사이토카인, 항체, 항체 단편, 치료용 효소, 가용성 수용체, 또는 리간드인, 컨쥬게이트.
제3항에 있어서, 상기 유효성분은 질환의 치료 또는 예방을 위한 유효성분인 컨쥬게이트.
제6항에 있어서, 상기 질환은 피부병, 염증질환, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 간 세포암, 상피세포암, 비소세포성폐암(NSCLC), 피부상피세포암, 월경과다증(menorrhagia), 자궁내막증(endometriosis), 자궁선근종증(adenomyosis), 자궁섬유양(uterine fibroids), 여성 또는 남성 불임(female or male infertility), 소아 성조숙증(precocious puberty in children), 전립선 비대증, 상피세포 증식에 의한 피부질환, T-림프구(T-lymphocyte) 작용에 의한 염증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 컨쥬게이트.
제6항에 있어서, 상기 유효성분은 항암제인 컨쥬게이트.
제8항에 있어서, 상기 항암제는 stat-3 저해제인 컨쥬게이트.
제8항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 컨쥬게이트.
제3항에 있어서, 상기 운반 펩티드와 유효성분은 공유결합 또는 비공유 결합에 의해, 또는 링커에 의해 매개됨으로써, 접합되는 것인 컨쥬게이트.
제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 약학 조성물은 질환의 치료 또는 예방을 위한 것인 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 약학 조성물은 피부병, 염증질환, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 간 세포암, 상피세포암, 비소세포성폐암, 피부상피세포암, 월경과다증, 자궁내막증, 자궁선근종증, 자궁섬유양, 여성 또는 남성 불임, 소아 성조숙증, 전립선 비대증, 상피세포 증식에 의한 피부질환, T-림프구 작용에 의한 염증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 것인 약학 조성물.
제12항에 있어서, 상기 약학 조성물은 항암 치료 또는 암예방을 위한 것인 약학 조성물.
제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 포함하는 조성물; 및 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 횟수 및 적응증 중 하나 이상을 개시한 지시서를 포함하는 대상의 세포 내 약물 전달용 키트.
유효성분을 분리된 세포 내로 전달하기 위한 분리된 세포 내 유효성분 전달 시스템으로서,상기 유효성분 전달 시스템은 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 포함하며, 상기 유효성분의 세포 내 전달을 수행할 수 있는 세포 투과성을 보유한 것인, 분리된 세포 내 유효성분 전달 시스템.
세포 투과성 운반 펩티드에 의해 유효성분을 세포 내로 전달하기 위한 조성물로서, 제1항에 따른 펩티드를 포함하며, 상기 세포 투과성 운반 펩티드는, 상기 유효성분의 세포 내 전달을 수행할 수 있는 세포 투과성을 보유한 것인, 유효성분의 세포 내 전달용 조성물.
제 18항에 있어서,상기 조성물은 유효성분을 세포 내 미토콘드리아로 국소 전달하는 것인, 유효성분의 세포 내 전달용 조성물.
제1항에 따른 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제20항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제21항에 따른 벡터를 포함하는 형질전환세포.
제3항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 컨쥬게이트를 포함하며, 상기 세포 투과성 운반 펩티드는 유효성분의 세포 내 전달을 수행할 수 있는 세포 투과성을 보유한 것이고, 피부병, 염증질환, 췌장암, 전립선암, 유방암, 난소암, 폐암, 위암, 간 세포암, 상피세포암, 비소세포성폐암, 피부상피세포암, 월경과다증, 자궁내막증, 자궁선근종증, 자궁섬유양, 여성 또는 남성 불임, 소아 성조숙증, 전립선 비대증, 상피세포 증식에 의한 피부질환, T-림프구 작용에 의한 염증 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 개선용 식품 조성물.
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