WO2022255708A1 - 화물분자 수송 도메인 rmmr1, 이의 변이체, 이를 포함하는 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법 - Google Patents

화물분자 수송 도메인 rmmr1, 이의 변이체, 이를 포함하는 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법 Download PDF

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rmmr1
peptide
cargo
cell
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박찬호
조성민
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to human MRPL15-derived cargo molecule transport domain RMMR1, variants thereof, a genetic construct encoding the same, a vector containing the genetic construct, a recombinant cargo molecule in which the cargo molecule and the above cargo molecule transport domain are combined, and a cargo molecule transport method using the same It relates to a cargo molecule transport domain comprising human MRPL15-derived RMMR1 or a variant thereof, and a cargo molecule delivery method into cells comprising the step of contacting a recombinant cargo molecule fused with the cargo molecule transport domain with the cell, etc. provides
  • Protein delivery technology is a protein transduction domain (PTD) or a cell penetrating peptide (CPP) called a cell penetrating peptide (CPP), usually composed of 5 to 30 amino acids, fused with macromolecules such as proteins or genes to mammalian cells and tissues It is a new concept delivery system that can be easily delivered into living organisms such as blood.
  • PTD protein transduction domain
  • CPP cell penetrating peptide
  • CPP cell penetrating peptide
  • protein delivery technology has been widely used to deliver therapeutic proteins into cells or tissues in vitro and in vivo, and a wide variety of protein transport domains are known. Bonding between protein transport domains and biological cargo molecules (eg, nucleic acids, proteins, peptides, small molecules, cytotoxic drugs, etc.) can be achieved by various methods, such as ionic bonding and electrostatic bonding, in addition to covalent bonding.
  • biological cargo molecules eg, nucleic acids, proteins, peptides, small molecules, cytotoxic drugs, etc.
  • the protein transport domain has the advantage of exhibiting low toxicity and less immunorejection compared to other carriers such as liposomes and polymers. However, until now, protein transport domains used clinically are rare.
  • the MRPL15 (39S ribosomal protein L15, mitochondrial) gene encodes a member of the Skp1-Cullin-F-box family of E3 ubiquitin ligases.
  • the encoded protein has been reported to bind to the transmembrane receptor interleukin 1 receptor-like 1 and regulate its ubiquitination and degradation. This protein has been implicated in the regulation of lung inflammation and psoriasis.
  • Alternative splicing of the MRPL15 gene produces several transcript variants. However, the possibility that some sequences of the MRPL15 protein can be used as cargo molecule transport domains has not been known so far.
  • An object of the present invention is to provide a cargo molecule transport domain that penetrates cargo molecules into cells or tissues with high efficiency and has no or little side effects when used in the human body, a recombinant cargo molecule using the same, and pharmaceutical compositions and cosmetics containing the same. .
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant cargo molecule bound to the cargo molecule transport domain and a method for permeating the cargo molecule into cells or tissues using the cargo molecule transport domain.
  • RMMR1 ERRPRGRRRGRKC derived from human MRPL15 protein
  • the deleted, substituted and/or added mutant peptides can smoothly penetrate macromolecules such as proteins and nucleic acids into cells, tissues, blood, etc., and the RMMR1 or variant peptides thereof are widely known as cargo molecule transport domains HIV Compared to the -Tat peptide, it was confirmed that the cell and tissue penetration ability was remarkably excellent.
  • the present inventors synthesized FITC and conducted a FACS experiment to verify the self-permeation efficacy using human MRPL15 protein-derived cell-penetrating peptide RMMR1. As a result, the RMMR1 peptide and its variant peptides were superior to HIV-Tat peptides into cells. It was confirmed that it permeated well.
  • the present inventors conducted an experiment by attaching EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) protein as a test cargo molecule to evaluate whether the RMMR1 peptide and its variant peptides bind to the cargo molecule, penetrate well into the cell, and deliver the cargo molecule into the cell. did A high-purity fusion protein was prepared through the design and purification of a fusion protein vector of EGFP and RMMR1, and using this protein, various verification methods such as Western blotting, FACS, and confocal microscopy were used to confirm that the EGFP-RMMR1 fusion protein was HIV-positive. Compared to the Tat peptide, it was confirmed that the ability to deliver cargo molecules into cells was superior.
  • EGFP Enhanced Green Fluorescence Protein
  • the cargo molecule transport domain newly discovered through the present invention has excellent cell penetrability and is useful as a cargo molecule delivery material. Since it is a material derived from the human body, it is safe because it does not cause an immune response when administered to the human body.
  • the cargo molecule transport domain of the present invention has significantly superior cell permeability compared to other conventional cargo molecule transport domains, and thus facilitates the permeation of various substances that are difficult to penetrate cells, such as protein drugs and antigen epitopes, and can be applied to pharmaceuticals, cosmetics, etc. do.
  • the cargo molecule transport domain of the present invention is selectively permeable to antigen-presenting cells and is useful for absorption of antibody drugs, etc., and is fused to immune cells or antigen-presenting cell-related diseases such as atopic dermatitis and autoimmune diseases through fusion with antibody proteins. It can be used for prevention or treatment of etc., and can also be applied to vaccines or anticancer drugs.
  • A is This is the secondary structure of the peptide predicted using the Pep-fold3 program.
  • B is a graph showing the Pepfold of the peptide.
  • 2A and B show the results of measuring the amount (fluorescence value) of FITC RMMR1 permeated into cells after treatment with 2.5 uM of FITC-conjugated RMMR1 and TAT using two cell lines, 3T3 and B16F10.
  • FIG. 3a to 3d show the vector map of EGFP-fused RMMR1 and the purity of the purified protein.
  • Figure 3a shows how EGFP-RMMR1 was sub-cloned into the pET28a vector using a restriction enzyme.
  • Figure 3b is the result of confirming the molecular weight of purified EGFP-RMMR1 through Coomassie blue.
  • Figure 3c is a Western blot result confirming that the purified EGFP-RMMR1 molecular weight and purification were successful.
  • Figure 3d is a result of comparing and confirming the delivery rate of EGFP with EGFP and EGFP-TAT by Western blotting after treatment of purified EGFP-RMMR1, EGFP, and EGFP-TAT to HaCaT cells.
  • FIG. 4a to 4d show the results of confirming cell permeability using FACS.
  • Figure 4a shows the result of confirming the amount of EGFP delivered to the cells after each treatment of 2.5 uM of EGFP-RMMR1, EGFP, and EGFP-TAT on HaCaT cells through FACS.
  • Figure 4b is a result showing the fluorescence numerical value from Figure 4a as a histogram.
  • Figure 4c shows the results of confirming the cell permeability of EGFP-RMMR1, EGFP, and EGFP-TAT by FACS after treatment with each dose for 2 hours.
  • 4D shows the results of FACS analysis of cell permeability of EGFP-RMMR1, EGFP, and EGFP-TAT after treatment with 2.5 uM per hour.
  • 5a is a result of confirming cell permeability through confocal microscopy of images of EGFP transferred to cells after HaCaT cells were treated with 2.5 uM of EGFP-RMMR1, EGFP, and EGFP-TAT, respectively.
  • FIG. 5b is a result of confirming the location of the fusion protein using a lysotracker or mitotracker after processing the fusion protein in the same manner as in FIG. 5a using a fluorescence microscope.
  • Fig. 6a is a test result of RMMR1's antigen-presenting cell penetration efficiency.
  • RMMR1-FITC SEQ NO.1
  • TAT-FITC TAT-FITC
  • Figure 6b is a result of measuring the intracellular fluorescence level according to the immune cell type using FACS after treating EGFP-RMMR1 to C57Bl/6 mouse splenocytes for 2 hours to confirm the permeability of mouse immune cells.
  • the two concentrations showed high permeability specifically to antigen-presenting cells, and superior cell permeability compared to EGFP-TAT and EGFP.
  • the graphs on the left are treated with a concentration of 200 nM, respectively, and the graphs on the right are treated with a concentration of 1 uM, respectively.
  • amino acid and amino acid residue refer to natural amino acids, non-natural amino acids or modified amino acids. Unless otherwise stated, all references to amino acids, either generically or specifically by designation, include reference to both the D and L stereoisomers (where the structure permits such stereoisomeric forms).
  • Natural amino acids include alanine (Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), cysteine (Cys), glutamine (Gln), glutamic acid (Glu), glycine (Gly), histidine (His), isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) and Valine (Val) is included.
  • Non-natural amino acids include modified amino acid residues that have been chemically modified on the N-terminal amino group or side chain group, or reversibly or irreversibly chemically blocked, such as N-methylated D and L amino acids or side chain functionalities that have been chemically modified with another functional group. residues are included.
  • a "cargo molecule” is a molecule that is not a transmembrane domain or a fragment thereof, which cannot originally enter a target cell or enter a target cell at an inherently useful rate, either as a target molecule itself or as a transmembrane domain before being fused with a transmembrane domain.
  • the cargo molecules include proteins, peptides, amino acids, nucleic acids, carbohydrates, lipids, aptamers, liposomes, exosomes, and mixtures of one or more of them.
  • Cargo molecule protein is a term referring to the case where the cargo molecule is a protein.
  • a “target protein” is a molecule that cannot originally enter a target cell or cannot enter a target cell at an inherently useful rate and is not a cell membrane penetrating domain or a fragment thereof, and is fused with a cell membrane penetrating domain. It refers to the protein molecule itself before becoming a target molecule or the target molecule portion of a cargo molecule transport domain-target molecule complex.
  • Target molecules include polypeptides, proteins, and peptides. Examples of target proteins belonging to target molecules include EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), superoxide dismutase, enzymes such as catalase, growth factors such as epidermal growth factor and fibroblast growth factor, antibodies, growth factor fusion proteins, etc.
  • a fusion protein may be used, but it is obvious to those skilled in the art that the target protein is not limited thereto, but only a partial example of the target protein.
  • Recombinant cargo molecule means a complex comprising a cell wall penetrating domain and one or more cargo molecule moieties formed by genetic fusion or chemical bonding of the cell wall penetrating domain and the cargo molecule.
  • Fusion protein means a recombinant cargo molecule formed by genetic fusion or chemical bonding between a cargo molecule protein and a cargo molecule transport domain. In the present specification, fusion protein is used as the same meaning as recombinant cargo molecule protein.
  • target cell refers to a cell to which a cargo molecule is delivered through a cell wall penetrating domain, and the target cell refers to a cell inside or outside the body. That is, target cells include cells in the body, that is, cells constituting organs or tissues of living animals or humans, or microorganisms found in living animals or humans. In addition, target cells are meant to include in vitro cells, that is, cultured animal cells, human cells, or microorganisms. In addition, although target cells are not particularly limited in the present invention, antigen-presenting cells are preferably mentioned.
  • the "cargo molecule transport domain” in the present invention forms a covalent bond with cargo molecules such as high-molecular organic compounds, such as oligonucleotides, peptides, proteins, oligosaccharides or polysaccharides, so that the cargo molecules can be transported without the need for a separate receptor, transporter or energy. Peptides capable of introducing them into cells or tissues.
  • cargo molecules such as high-molecular organic compounds, such as oligonucleotides, peptides, proteins, oligosaccharides or polysaccharides, so that the cargo molecules can be transported without the need for a separate receptor, transporter or energy. Peptides capable of introducing them into cells or tissues.
  • cargo molecules such as high-molecular organic compounds, such as oligonucleotides, peptides, proteins, oligosaccharides or polysaccharides, so that the cargo molecules can be transported without the need for a separate receptor, transporter or energy. Peptides capable of
  • “conservative substitution” refers to a modification of a cargo molecule transport domain that includes substituting one or more amino acids with amino acids having similar biochemical properties that do not cause loss of biological or biochemical functions of the cargo molecule transport domain. it means.
  • a “conservative amino acid substitution” herein is a substitution in which an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • Classes of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art and are well known. These classes include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), amino acids with acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), and amino acids with uncharged polar side chains (e.g. glycine).
  • amino acids with non-polar side chains e.g., alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acids with beta-branched side chains e.g threonine, valine, isoleucine
  • amino acids with aromatic side chains e.g tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine
  • the present invention provides: 1) RMMR1 peptide consisting of SEQ ID NO: 1 derived from human MRPL15; or 2) 5 to 50 amino acids, preferably 5 to 40 amino acids, more preferably 5 to 35 amino acids, more preferably 5 to 30 amino acids, in which one or more amino acids have been deleted, substituted and/or added in the RMMR1 peptide.
  • RMMR1 mutant peptide composed of amino acids relates to a cargo molecule transport domain that binds to a cargo molecule and transports the cargo molecule into mammalian cells or tissues.
  • the amino acid sequence of the RMMR1 peptide of SEQ ID NO: 1 is "ERRPRGRRRGRKC".
  • the RMMR1 peptide or the RMMR1 variant peptide of the present invention can permeate into cells or tissues of mammals by itself, and can penetrate into cells or tissues of mammals even when bound to cargo molecules.
  • the amino acid mutation sequence among the RMMR1 peptide variants refers to a peptide sequence in which one or more amino acid mutations have occurred individually at each amino acid residue position of SEQ ID NO: 1 above.
  • the sequence in which amino acids are deleted among the RMMR1 peptide variants refers to a peptide sequence in which at least 1 to at most 8 amino acids of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are independently deleted. Amino acid deletions may occur at either end of the sequence or anywhere in the middle, and amino acids may be deleted, either contiguous or non-contiguous.
  • the present invention is not particularly limited in amino acid substitution in the RMMR1 mutant peptide, but preferably relates to a cargo molecule transport domain characterized in that the amino acid substitution is a conservative amino acid substitution.
  • the RMMR1 variant peptide is a cargo molecule characterized in that the lysine residue position of SEQ ID NO: 1 is independently substituted with an arginine residue and / or the arginine residue position of SEQ ID NO: 1 is independently substituted with a lysine residue. It relates to the transport domain.
  • the peptide variant sequence in which one or more amino acids are deleted from the RMMR1 peptide of the present invention and / or the peptide variant sequence in which one or more amino acids are added have amino acid deletion and / or addition at any one or more of the N-terminus, C-terminus, and It relates to a cargo molecule transport domain, characterized in that it occurs.
  • the mammalian cell is an antigen-presenting cell, and relates to a cargo molecule transport domain.
  • RMMR1 peptide consisting of SEQ ID NO: 1 derived from human MRPL15; or 2) a RMMR1 mutant peptide consisting of 5 to 50 amino acids, preferably 6 to 40 amino acids, more preferably 7 to 30 amino acids, in which one or more amino acids have been deleted, substituted and/or added to the RMMR1 peptide; It relates to a cargo molecule transport domain, characterized in that at least one of them is coupled in the form of a dimer or a multimer without a linker or via a linker.
  • the cargo molecule transport domain of the present invention includes i) RMMR1 peptide, or ii) RMMR1 mutant peptide consisting of 5 to 50 amino acids in which one or more amino acids are deleted, substituted, and/or added to the RMMR1 peptide; A sequence in which the peptide of i) or ii) is repeated twice or more, and a cargo molecule transport domain in which the peptide i) and ii) the peptide are linked may be mentioned. It is apparent to those skilled in the art that the cargo molecule transport domain of the present invention is not limited to the peptides exemplified above.
  • the linker is not particularly limited as long as the activity of the cargo molecule transport domain is maintained, but is preferably glycine, alanine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, asparagine, aspartic acid, cysteine, or glutamine.
  • Glutamic acid, lysine, arginic acid and the like can be used to connect each cargo molecule transport domain monomer, more preferably a linker in which several valine, leucine, aspartic acid, glycine, alanine, proline, etc. are connected.
  • 1 to 5 amino acids such as glycine, valine, leucine, and aspartic acid may be linked together in consideration of ease of genetic manipulation.
  • a chemical linker may be used as long as the activity of the cargo molecule transport domain is maintained.
  • the RMMR1 peptide variant of the present invention may be caused by overlapping amino acid substitutions and/or deletions and/or additions.
  • additional amino acid additions and deletions may occur in RMMR1 amino acid substitution variants.
  • amino acid additions may occur to RMMR1 amino acid deletion variants.
  • amino acid substitutions and/or deletions and/or additions there is no change in the ability to transport cargo molecules.
  • the cargo molecule transport domain according to the present invention is a variant in which an amino acid residue is conservatively substituted at a specific amino acid residue position of the RMMR1 peptide or a RMMR1 peptide or 1 to 8 at the N-terminus and / or C-terminus and / or in the middle of the variant. It is interpreted as meaning including a peptide in which the amino acid of the dog is deleted.
  • the cargo molecule transport domain of the present invention is characterized in that it can still retain cargo molecule transport activity even if it has amino acid substitutions, deletions and insertions.
  • the cargo molecule transport domain variant according to the present invention has substantially the same function and / or effect as the cargo molecule transport domain according to the present invention, 80% or 85% or more, preferably 90% or more, more preferably It is interpreted to include cargo molecule transport domain variants or fragments thereof having 95% or more amino acid sequence homology.
  • cargo molecule transport domain of the present invention include the peptides of SEQ ID NOs: 1 to 23, but it is apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited thereto.
  • the present invention is a cargo molecule; and a recombinant cargo molecule having improved cell membrane permeability, wherein any one cargo molecule transport domain is fused to at least one of the N-terminus and C-terminus of the cargo molecule.
  • the cargo molecule and the cargo molecule transport domain may be fused without or in the presence of a linker.
  • the linker is not particularly limited as long as the cargo molecule transport activity of the cargo molecule transport domain and the cargo molecule activity are maintained, but is preferably glycine, alanine, leucine, isoleucine, proline, serine, threonine, Cargo molecule transport domains and cargo molecules can be linked using amino acids such as asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, lysine, and arginic acid, more preferably valine, leucine, aspartic acid, glycine, and alanine , Proline, etc.
  • amino acids such as glycine, valine, leucine, and aspartic acid may be connected in groups of 1 to 5.
  • a chemical linker may be used as long as the activity of the cargo molecule transport domain is maintained.
  • the present invention is characterized in that the cargo molecule is selected from nucleic acids such as proteins, peptides, oligonucleotides and polynucleotides, carbohydrates, lipids, and mixtures of one or more of them.
  • the present invention relates to a recombinant cargo molecule with improved cell membrane permeability, characterized in that the cargo molecule is a therapeutic protein, an antigenic protein or an epitope peptide.
  • the present invention relates to a recombinant cargo molecule with improved cell membrane permeability, characterized in that the cargo molecule is an antioxidant protein including superoxide dismutase.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease comprising the recombinant cargo molecule.
  • Cosmetics of the present invention may include color cosmetics such as foundation, lipstick, and eye shadow in addition to basic cosmetics such as lotion, cream, essence, water-in-water or water-in-oil emulsion, and ointment.
  • the present invention relates to a genetic construct comprising a polynucleotide encoding the recombinant cargo molecule.
  • the present invention relates to an expression vector for expressing a recombinant cargo molecule protein having improved cell membrane permeability, including the gene construct.
  • the present invention is the recombinant cargo molecule; the genetic construct; Or the expression vector; it relates to a pharmaceutical composition comprising.
  • the present invention is the recombinant cargo molecule; the genetic construct; Or the expression vector; It relates to a cosmetic composition comprising.
  • the present invention relates to a medical device containing the recombinant cargo molecule.
  • the medical device of the present invention may include a wound dressing, a filler, a composite filler, and the like.
  • the present invention relates to a genetic construct comprising a polynucleotide encoding the cargo molecule transport domain.
  • polynucleotides encoding the cargo molecule transport domain of the present invention include polynucleotides of SEQ ID NOs: 24 to 46, but it is known in the art that the scope of the present invention is not limited thereto. self-evident to those who have
  • the present invention relates to an expression vector for expressing a recombinant cargo molecule protein having improved cell membrane permeability, including the gene construct.
  • the present invention further comprises a gene encoding a cargo molecule protein so that the vector can express the recombinant cargo molecule protein in which the cargo molecule transport domain and the cargo molecule protein are fused. It relates to an expression vector for expressing a cargo molecule protein.
  • the present invention comprises preparing a recombinant cargo molecule in which the cargo molecule transport domain is fused to at least one of the N-terminus and the C-terminus of the cargo molecule; and bringing the prepared recombinant cargo molecule into contact with the cell.
  • the present invention relates to a method for delivering a cargo molecule into a cell, characterized in that the cargo molecule is a protein for preventing or treating disease or an antioxidant protein.
  • Proteins for disease prevention or treatment include growth factors such as epidermal growth factor, antibodies, antibody drugs, antibody Fc-containing fusion proteins, antibody-drug complexes, protein drugs, enzymes, etc., but are limited to these examples. It is not.
  • the present invention relates to a method for delivering a cargo molecule into a cell, characterized in that the cargo molecule is an antioxidant protein. It refers to antioxidant proteins such as superoxide dismutase and catalase, but is not limited to these examples.
  • the present invention is characterized in that the chemical bond between the cargo molecule transport domain and the cargo molecule is a covalent bond or a non-covalent bond.
  • the chemical bond may be a covalent bond or a non-covalent bond.
  • Non-covalent bonds may include ionic bonds, bonds by electrostatic attraction, or bonds by hydrophobic interactions.
  • the material capable of binding to the cargo molecule transport domain through an ionic bond or an electrostatic attraction may be a charged material such as DNA or RNA.
  • the present invention relates to a recombinant cargo molecule easily permeable into cells or tissues, characterized in that the cargo molecule transport domain is one selected from SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 23.
  • the cargo molecule transport domain of the present invention is not limited to SEQ ID NOs: 1 to 23, but it is clearly stated that representative peptides are shown in Table 1 for convenience of experiments.
  • the present invention relates to a polynucleotide characterized in that the polynucleotide sequence encoding the cargo molecule transport domain is one selected from SEQ ID NO: 24 to SEQ ID NO: 46.
  • Polynucleotides encoding the cargo molecule transport domain of the present invention are not limited to SEQ ID NOs: 24 to 46, but it is clearly stated that representative polynucleotides are shown in Table 2 for convenience of experiments.
  • a pharmaceutical composition containing the recombinant cargo molecule of the present invention, a polynucleotide encoding the same, or a vector containing the polynucleotide as an active ingredient is blended together with a carrier generally accepted in the pharmaceutical field, and prepared for external use on the skin by a conventional method. It can be formulated in various forms such as oral, spray, patch or injection.
  • oral compositions include tablets and gelatin capsules, which, in addition to the active ingredient, may contain diluents (e.g. lactose, dextrose, sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants (e.g. silica, talc).
  • the tablets may also contain a binder (eg magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidone). ), optionally containing disintegrants (eg starch, agar, alginic acid or its sodium salt) or boiling mixtures and/or absorbents, colorants, flavors and sweeteners.
  • a binder eg magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrants eg starch, agar, alginic acid or its sodium salt
  • absorbents colorants, flavors and sweeteners.
  • Injectable compositions are preferably isotonic aqueous solutions or suspensions, and the compositions mentioned are sterile and/or contain adjuvants (eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, salts and/or buffers for regulating osmotic pressure). In addition, they may contain other therapeutically useful substances.
  • adjuvants eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, salts and/or buffers for regulating osmotic pressure.
  • adjuvants eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, salts and/or buffers for regulating osmotic pressure.
  • adjuvants eg, preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution accelerators, salts and/or buffers for regulating osmotic pressure.
  • they may contain other therapeutically useful substances
  • the pharmaceutical preparation prepared in this way may be administered orally or parenterally, that is, intravenous, subcutaneous, intraperitoneal or topically applied, as desired.
  • the dose may be administered by dividing the daily dose of 0.0001 to 100 mg/kg into 1 to several times.
  • the dosage level for a specific patient may vary depending on the patient's weight, age, sex, health condition, administration time, administration method, excretion rate, severity of disease, and the like.
  • HaCaT, 3T3, and B16F10 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and an antibiotic solution (100 units/ml penicillin, 100 ⁇ g/ml streptomycin). It was cultured at 37°C, 95% humidity, and 5% CO 2 conditions, and when the cells reached 70-80% adherence to the culture dish, they were treated with trypsin-EDTA and subcultured.
  • HaCaT cells were purchased and cultured from the laboratory of Professor Kim Tae-yoon, College of Medicine, Democratic University of Korea, and 3T3 and B16F10 cells were purchased and cultured from Seoul National University Cell Line Bank.
  • RAW264.7 cells were distributed and cultured from the laboratory of Professor Kim Sang-beom, College of Pharmacy, Sahmyook University.
  • Annealing was performed at 94°C for 5 minutes and then at 25°C for 1 hour using the following oligonucleotides.
  • the recombinant RMMR1 was transformed into Escherichia coli strain DH5 ⁇ (RH618).
  • the DNA isolated from the transformed cells was linked to the EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) gene by cutting the BamHI and Hind III sites.
  • EGFP-RMMR1, EGFP, and EGFP-TAT proteins were purified using a pET28a plasmid vector containing N and C-terminal 6X his tags. Transformed into BL21-codon plus cells and colonies were inoculated into medium and grown. Large-scale cells were cultured in LB medium until OD 600 reached 0.5, and protein expression was induced using 0.5 mM IPTG at 4°C for 16 hours. A cell pellet was obtained from centrifugation and disrupted by sonication in 50 mM Tris buffer pH 7.5 containing 300 mM NaCl. Then, the supernatant was obtained by centrifugation at 20,000 g for 30 minutes. It was poured over a column containing Ni-NTA resin.
  • RMMR1 in HaCaT, 3T3, and B16F10 cells 1 ⁇ 10 5 HaCaT cells were attached to a 24-well plate 12 hours before. Then, after washing the cells using serum-free DMEM medium, 2.5 uM of protein was treated in serum-free medium for 2 hours. After 2 hours, it was washed three times with serum-free medium, and then treated with 150 ul of trypsin to remove the cells from the plate, and then neutralized by adding 850 ul of serum-containing medium. After centrifugation at 500 g for 10 minutes, the culture medium was removed, and then proteins deposited on the cells were removed through 500 ul of FACS buffer (1% BSA, 0.1% sodium azide). After repeating washing twice, FACS analysis was performed by adding FACS buffer.
  • FACS buffer 1% BSA, 0.1% sodium azide
  • a 9 mm coverslip was placed on a 24-well plate 12 hours before and 1 x 10 5 amount of HaCaT cells were attached. Thereafter, the cells were washed with serum-free DMEM medium and then treated with 2.5 uM protein in serum-free medium for 2 hours. After 2 hours, the cells were washed 3 times with a serum-free medium, and then stained with hoechst diluted in PBS at a ratio of 1:1000 for 5 minutes. Then, it was washed a total of 5 times using PBS, and the glass cover slip was removed from the well to remove water, and then mounting was performed.
  • proteins were transferred to a PVDF membrane and blocked for 1 hour using TBS-T buffer containing 5% skim milk. Then, for protein expression measurement, GFP antibody was used as a primary antibody, and then, horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit antibody was used as a secondary antibody. Then, after washing with TBS-T buffer, the cell permeability of each protein was measured.
  • mice 7-week-old C57BL/6 mice were sacrificed in order to confirm the permeability in immune cells of mice as well as cell lines. Then, splenocytes were removed and dissociated using RPMI medium containing 2% FBS and 1% streptomycin. Red blood cells were lysed in the spleen using red blood cell lysis solution (BD, 555899), and 1 ⁇ 10 6 cells were treated with 200 nM or 1 uM of EGFP, EGFP-RMMR1, or EGFP-TAT for 2 hours, and then 0.05% Proteins attached to the outside of the cell were removed by treatment with trypsin.
  • red blood cell lysis solution BD, 555899
  • 1 ⁇ 10 6 cells were treated with 200 nM or 1 uM of EGFP, EGFP-RMMR1, or EGFP-TAT for 2 hours, and then 0.05% Proteins attached to the outside of the cell were removed by treatment with trypsin.
  • the cells were stained with CD11b, CD11c, F4/80, MHC II, NK 1.1, and CD3 antibodies for 30 minutes at 4°C.
  • FACS analysis T cells, natural killer cells (NK), The values of EGFP delivered to macrophages and dendritic cells (DC) were measured.
  • the PEP-FOLD3 De novo peptide structure prediction program was used.
  • the model predicted by the program by writing the amino acid sequence of RMMR1 was imaged as a two-dimensional predicted structure with the PyMOL 2.4 program [Fig. 1A].
  • the lower bright part represents the spiral
  • the upper brightest part represents the extension
  • the part between the spiral and the extension represents the coil, and through this, the secondary prediction model was derived [Fig. 1 of B].
  • a fusion protein containing human-derived cell-penetrating peptide and EGFP the sequence encoding the RMMR1 polypeptide (gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt) was converted into Hind III and Xho I of the pET-28a plasmid EGFP-RMMR1 was cloned into the pET-28a plasmid by cutting the BamH I and Hind III sites of the recombinant RMMR1 DNA and the EGFP cDNA to confirm cell penetration efficiency [Fig. 3a].
  • EGFP and EGFP-TAT which will be used as controls, were also cloned in the same vector, pET-28a plasmid, in the same way as above.
  • the fusion protein containing his-tag after binding to the Ni-NTA column, in a low concentration of 15 mM imidazole solution After washing, it was eluted with a 300 mM imidazole solution.
  • the eluted fusion protein product a total of 10 ⁇ g of quantified protein was loaded using SDS-PAGE, and then the molecular weight of the purified fusion protein was confirmed using Coomassie blue staining reagent [Fig. 3b].
  • Western blotting was performed to confirm whether the stained fusion protein expressed the his-tag-containing EGFP-RMMR1 protein. It was confirmed that it coincided with [Fig. 3b, Fig. 3c].
  • the efficiency was confirmed while introducing the fusion protein into HaCaT, a cell line of human skin cells.
  • the recombinant proteins EGFP, EGFP-TAT, and EGFP-RMMR1 were treated with the same concentration of 1 uM to HaCaT cells for 2 hours.
  • the EGFP-RMMR1 fusion protein showed a significantly high level of cell permeation
  • the EGFP-TAT fusion protein containing TAT which is well known as a cell penetrating peptide, showed a cell permeability about 60% lower than that of EGFP-RMMR1. confirmation was confirmed.
  • EGFP-RMMR1 was treated with C57Bl/6 mouse splenocytes for 2 hours, and intracellular fluorescence levels were measured according to immune cell types using FACS.
  • 200nM left graph
  • 1uM right graph
  • Table 1 shows 23 amino acid sequences that are specific examples of cargo molecule transport domains of the present invention, and are SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 23, respectively, in the order of the table.
  • Table 2 shows polynucleotide sequences encoding 23 specific examples of cargo molecule transport domains of the present invention, which are SEQ ID NOs: 24 to SEQ ID NOs: 46, respectively, in the order of the table.
  • the present invention provides a cargo molecule transport domain that easily transports cargo molecules into cells by fusing with various cargo molecules including peptides, proteins, and nucleic acids that are difficult to penetrate into cells by itself, recombinant cargo molecules using the same, and cargo molecules into cells. It provides a way to move and can penetrate various cargo molecules such as therapeutic proteins, antigenic proteins or epitope peptides, and antioxidant proteins into cells, so it can be used in therapeutic drugs, cosmetics, treatment methods, and cell improvement methods. .

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Abstract

본 발명은 인간 MRPL15 유래의 세포 투과 펩타이드 및 이를 이용한 화물분자 전달 시스템에 관한 것으로, 인간 MRPL15 유래 RMMR1 또는 그의 치환 또는 결실에 의한 변이체를 포함하는 화물분자 수송 도메인 및 상기 화물분자 수송 도메인과 결합된 재조합 화물분자를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 화물분자 전달 방법을 제공한다. 본 발명의 화물분자 수송 도메인은 종래의 세포 침투성 펩타이드에 비하여 높은 효율로 화물분자를 세포 내로 도입할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 단백질에서 유래한 폴리펩타이드 서열로서 면역 반응 문제를 유발할 우려가 없으므로 다양한 고분자 물질을 인체 세포 내로 전달하는데 유용하다.

Description

화물분자 수송 도메인 RMMR1, 이의 변이체, 이를 포함하는 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법
본 발명은 인간 MRPL15 유래의 화물분자 수송 도메인 RMMR1, 이의 변이체, 이를 암호화하는 유전자 구조체, 이 유전자 구조체를 포함하는 벡터, 화물분자와 위 화물분자 수송 도메인이 결합한 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법에 관한 것으로, 인간 MRPL15 유래 RMMR1 또는 그의 변이체를 포함하는 화물분자 수송 도메인 및 상기 화물분자 수송 도메인과 화물분자가 융합된 재조합 화물분자를 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 내로의 화물분자 전달 방법 등을 제공한다.
단백질 전달기술이란 단백질 수송 도메인 (Protein Transduction Domain; PTD) 또는 세포 침투성 펩타이드 (Cell penetrating Peptide; CPP)라 불리며 대개 5~30개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 단백질이나 유전자 등의 고분자와 융합하여 포유류 세포, 조직, 혈액 등 생체 안으로 손쉽게 전달할 수 있는 새로운 개념의 전달 시스템이다.
비록 구체적인 기작은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만, 단백질 전달기술은 치료용 단백질을 인 비트로와 인 비보에서 세포 또는 조직 내로 전달하는데 많이 사용되어 왔으며 매우 다양한 단백질 수송 도메인이 알려져 있다. 단백질 수송 도메인과 생물학적 화물분자 (예를 들면, 핵산, 단백질, 펩타이드, 작은 분자, 세포독성 약물 등) 간의 결합은 공유결합 외에도 이온결합, 정전기적 결합 등의 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.
단백질 수송 도메인은 리포좀이나 폴리머 등 다른 전달체에 비하여 낮은 독성을 나타내고 면역거부반응이 적다는 장점이 있다. 그러나 지금까지도 임상 등에 이용되는 단백질 수송 도메인은 드물다.
MRPL15 (39S ribosomal protein L15, mitochondrial) 유전자는 E3 유비퀴틴 라이게이즈의 Skp1-Cullin-F-box 패밀리의 구성원을 암호화한다. 암호화된 단백질은 막 관통 수용체 인터루킨 1 수용체 유사 1에 결합하여 유비퀴틴화 및 분해를 조절하는 것으로 보고되었다. 이 단백질은 폐 염증 및 건선의 조절과 관련이 있다. MRPL15 유전자의 대체 스플라이싱은 여러 전사체 변형을 생성한다. 그러나 MRPL15 단백질의 일부 서열이 화물분자 수송 도메인으로 이용될 수 있다는 가능성에 대해서는 현재까지 알려진 바 없다.
본 발명은 높은 효율로 세포 또는 조직 내로 화물분자를 투과시키며, 인체에 이용시 부작용이 없거나 적은 화물분자 수송 도메인 및 이를 이용한 재조합 화물분자, 그리고 이를 포함하는 약학 조성물, 화장료 등을 제공하려는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 이 화물분자 수송 도메인과 결합한 재조합 화물분자 및 이 화물분자 수송 도메인을 이용하여 화물분자를 세포 또는 조직 내로 투과시키는 방법을 제공하려는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 수많은 인간 유래 후보 펩타이드를 선정하여 시험한 결과, 본 발명자들은 인간 MRPL15 단백질 유래 ERRPRGRRRGRKC의 13개 아미노산으로 구성된 펩타이드 (이하, 본 발명에서 "RMMR1"으로 칭함) 또는 이 중 일부 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 변이체 펩타이드가 단백질, 핵산 등의 고분자를 세포, 조직, 혈액 등의 생체 내로 원활하게 투과시킬 수 있으며, 상기 RMMR1 또는 이의 변이체 펩타이드가 화물분자 수송 도메인으로 널리 알려진 HIV-Tat 펩타이드와 비교하여 세포 및 조직 투과능이 현저히 우수함을 확인하였다.
본 발명자들은 인간 MRPL15 단백질 유래 세포 투과 펩타이드 RMMR1을 이용하여 자체 투과 효능을 검증하기 위하여 FITC를 합성하여 FACS 실험을 진행하였으며, 그 결과, RMMR1 펩타이드 및 이의 변이체 펩타이드들이 HIV-Tat 펩타이드보다 월등하게 세포 안으로 잘 투과하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 RMMR1 펩타이드 및 이의 변이체 펩타이드들이 화물분자와 결합하여 세포 내로 잘 투과하고 화물분자를 세포 내로 전달하는지를 평가하기 위하여 시험용 화물분자로 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) 단백질을 부착하여 실험을 진행하였다. EGFP와 RMMR1의 융합 단백질 벡터 디자인 및 정제를 통해 순도 높은 융합 단백질을 제조하였고, 이 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯팅, FACS, 공초점 현미경과 같은 다양한 검증 방법을 이용하여 EGFP-RMMR1 융합 단백질이 HIV-Tat 펩타이드와 비교하여 화물분자를 세포 내로 전달하는 능력이 우수하다는 것을 확인하였다.
본 발명을 통해 새로 발굴된 화물분자 수송 도메인은 세포 투과능이 우수하고 화물분자 전달 물질로 유용하며, 인체에서 유래한 물질이므로 인체에 투여시 면역반응을 일으킬 우려가 없어 안전하다.
또한, 본 발명의 화물분자 수송 도메인은 종래 다른 화물분자 수송 도메인과 비교하여 세포 투과능이 현저히 우수하여 단백질 약물, 항원 에피토프 등 세포 투과가 어려운 다양한 물질의 투과를 원활하게 하여 약제, 화장료 등으로 응용 가능하다.
특히 본 발명의 화물분자 수송 도메인은 항원 제시 세포에 선택적으로 투과 가능하여 항체 약물 등의 흡수에 유용하며, 항체 단백질과의 융합을 통해 면역 세포 또는 항원 제시 세포에 연관된 질병 예컨대 아토피 피부염, 자가면역질환 등의 예방 또는 치료에 이용할 수 있고, 백신 또는 항암제에도 응용할 수 있다.
도 1은 RMMR1 세포 투과 펩타이드의 2차 구조 예상도를 나타낸다. A는 Pep-fold3 프로그램을 이용하여 예측한 펩타이드의 2차 구조이다. B는 펩타이드의 Pepfold를 나타내는 그래프이다.
도 2의 A, B는 3T3, B16F10의 두 가지 세포주를 이용하여 2.5 uM의 FITC가 접합된 RMMR1 및 TAT을 처리한 후 세포 내로 투과된 FITC RMMR1의 양(형광값)을 측정한 결과이다.
도 3a 내지 도 3d는 EGFP가 융합된 RMMR1의 벡터 맵 및 정제된 단백질의 순도를 나타낸다. 도 3a는 EGFP-RMMR1가 어떤 제한효소를 사용하여 pET28a 벡터에 sub-cloning 되었는지를 나타낸다. 도 3b는 정제된 EGFP-RMMR1의 분자량을 Coomassie blue를 통해 확인한 결과이다. 도 3c는 정제된 EGFP-RMMR1의 분자량 및 정제가 잘 되었음을 확인할 수 있는 웨스턴 블롯 결과이다. 도 3d는 정제된 EGFP-RMMR1, EGFP, EGFP-TAT을 HaCaT 세포에 처리 후 EGFP의 전달률을 웨스턴 블롯팅을 이용해 EGFP, EGFP-TAT과 비교 확인한 결과이다.
도 4a 내지 도 4d는 FACS를 이용하여 세포 투과성을 확인한 결과를 나타낸다. 도 4a는 HaCaT 세포에 2.5 uM의 EGFP-RMMR1, EGFP, EGFP-TAT을 각 처리한 후 세포에 전달된 EGFP의 양을 FACS를 통해 확인한 결과이다. 도 4b는 도 4a에서 나온 형광수치값을 히스토그램으로 나타낸 결과이다. 도 4c는 EGFP-RMMR1, EGFP, EGFP-TAT의 세포 투과성을 도스별로 2 시간 처리한 후 FACS로 확인한 결과이다. 도 4d는 EGFP-RMMR1, EGFP, EGFP-TAT의 세포 투과성을 시간별로 2.5 uM 처리한 후 FACS로 확인한 결과이다.
도 5a는 HaCaT 세포에 2.5 uM의 EGFP-RMMR1, EGFP, EGFP-TAT을 각 처리한 후 세포에 전달된 EGFP의 이미지를 공초점 현미경을 통해 세포 투과성을 확인한 결과이다.
도 5b는 도 5a와 같은 방법으로 융합단백질을 처리한 후 lysotracker 또는 mitotracker를 이용하여 융합단백질의 위치를 형광 현미경으로 확인한 결과이다.
도 6a는 RMMR1의 항원 제시 세포 투과 효율 시험 결과이다. FITC가 부착된 펩타이드 RMMR1-FITC (SEQ NO.1)와 TAT-FITC를 이용하여 동일한 농도인 2.5 uM으로 각 세포주에 2시간 동안 처리한 결과, 두 세포주에서 대조군인 TAT-FITC 펩타이드에 비해 RMMR1-FITC 합성 펩타이드가 높은 세포 투과 수준을 보였다.
도 6b는 마우스의 면역세포에서의 투과율을 확인하기 위하여 EGFP-RMMR1을 C57Bl/6 mouse 비장세포에 2시간 처리 후 FACS를 이용하여 면역 세포 종류에 따른 세포내 형광 레벨을 측정한 결과이다. 200 nM 그리고 1 uM 처리하여 비교한 결과 두 농도에서 항원 제시 세포에 특이적으로 투과율이 높았고, EGFP-TAT 및 EGFP 대비 월등한 세포 투과능을 나타내었다. 왼쪽 그래프는 각각 200 nM 농도로 처리한 것이고, 오른쪽 그래프는 각각 1 uM 농도로 처리한 것이다.
본 발명의 설명 및 청구범위 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"아미노산" 및 "아미노산 잔기"는 천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 변형된 아미노산을 의미한다. 달리 언급되지 않는 한, 아미노산에 대한 모든 언급은 일반적으로 또는 명칭에 따라 특이적으로 D 및 L 입체이성질체(구조가 이같은 입체이성질체 형태를 허용하는 경우) 양쪽 모두에 대한 언급을 포함한다. 천연 아미노산에는 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라긴 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 라이신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 타이로신 (Tyr) 및 발린(Val)이 포함된다. 비천연 아미노산에는 N-말단 아미노기 또는 측쇄기 상에서 화학적으로 변형된, 또는 가역적 또는 비가역적으로 화학적으로 차단된 변형 아미노산 잔기, 예컨대 N-메틸화 D 및 L 아미노산 또는 측쇄 관능기가 또다른 관능기로 화학적으로 변형된 잔기가 포함된다.
"화물분자"란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는, 세포막 투과 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 세포막 투과 도메인과 융합되기 전의 목표 분자 그 자체 또는 세포막 투과 도메인-목표 분자 복합체의 목표 분자 부분을 의미한다. 화물분자로는 항체를 비롯한 단백질, 펩타이드, 아미노산, 핵산, 탄수화물, 지질 등의 고분자, 압타머, 리포좀 그리고 엑소좀 및 이들 중 1종 이상의 혼합물 중 선택된 것을 의미한다.
"화물분자 단백질"이란 화물분자가 단백질인 경우를 말하는 용어이다.
"화물분자"에 포함되는 개념으로서, "목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없으며, 세포막 투과 도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 세포막 투과 도메인과 융합되기 전의 단백질 분자 그 자체 또는 화물분자 수송 도메인-목표 분자 복합체의 목표 분자 부분을 의미한다. 목표 분자로서는 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드를 포함한다. 목표 분자에 속하는 목표 단백질의 예로는 EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 카탈라제와 같은 효소, 상피세포 성장인자, 섬유아세포 성장인자와 같은 성장인자, 항체, 성장인자 융합 단백질 등의 융합 단백질을 들 수 있으나, 이는 목표 단백질을 일부 예시한 것일 뿐, 목표 단백질이 이에 제한되는 것이 아님은 통상의 기술자에게 자명하다.
"재조합 화물분자"란 세포벽 투과 도메인 및 한 개 이상의 화물분자 부분을 포함하며, 세포벽 투과 도메인과 화물분자의 유전적 융합이나 화학결합으로 형성된 복합체를 의미한다. "융합 단백질"이란 화물분자 단백질과 화물분자 수송 도메인과 유전적 융합이나 화학결합으로 형성된 재조합 화물분자를 의미한다. 본 명세서에서 융합 단백질은 재조합 화물분자 단백질과 동일한 의미로 사용하였다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 또한, "표적 세포"란 세포벽 투과 도메인에 의해 화물분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 본 발명에서 표적 세포가 특별히 제한되지는 않으나, 바람직하게는 항원 제시 세포를 들 수 있다.
본 발명에서의 "화물분자 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등의 화물분자와 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 화물분자들을 세포 또는 조직 내로 도입시킬 수 있는 펩타이드를 말한다. 본 발명의 설명에서 "화물분자 수송 도메인"은 "단백질 수송 도메인" 또는 "세포 투과 도메인"과 혼용하였다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드 등의 화물분자를 세포 또는 조직 내로 "도입"하는 것에 대하여 "침투", "수송", "투과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 명세서에서 "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 화물분자 수송 도메인의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 화물분자 수송 도메인의 변형을 의미한다.
본 명세서에서 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기를 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체하는 치환이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 부류는 해당 기술분야에 규정되어 있으며, 잘 알려져 있다. 이들 부류는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 대전되지 않은 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지된 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다.
기타 본 명세서, 청구범위 및 도면에 기재된 용어는 특별히 명시되지 않은 경우 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 사용하는 의미로 사용되었음을 밝힌다.
본 발명은 1) 인간 MRPL15 유래의 서열번호 1로 이루어진 RMMR1 펩타이드; 또는 2) RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 5 ~ 50개 아미노산, 바람직하게는 5~40개, 더욱 바람직하게는 5~35개, 더욱 바람직하게는 5~30개 아미노산으로 이루어진 RMMR1 변이체 펩타이드;로서, 화물분자와 결합하여 포유류의 세포 내 또는 조직 내로 화물분자를 수송하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다. 서열번호 1의 RMMR1 펩타이드의 아미노산 서열은 "ERRPRGRRRGRKC"와 같다. 본 발명의 RMMR1 펩타이드 또는 상기 RMMR1 변이체 펩타이드는 그 자체로도 포유류의 세포 내 또는 조직 내로 투과할 수 있고, 화물분자와 결합한 상태로도 포유류의 세포 내 또는 조직 내로 투과할 수 있다. 또한, RMMR1 펩타이드 변이체 중 아미노산 변이 서열은 위 서열번호 1의 각 아미노산 잔기 위치에서 개별적으로 하나 이상의 아미노산 변이가 일어난 펩타이드 서열을 의미한다. 또한, RMMR1 펩타이드 변이체 중 아미노산이 결실된 서열은 위 서열번호 1의 아미노산 서열 중 적게는 1개 내지 많게는 8개의 아미노산이 독립적으로 결실된 펩타이드 서열을 의미한다. 아미노산 결실은 서열의 양 말단 또는 중간 어디에서나 일어날 수 있으며, 연속 또는 비연속인 아미노산이 결실될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RMMR1 변이체 펩타이드에서 아미노산 치환에 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 아미노산 치환이 보존적 아미노산 치환인 것을 특징으로 하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명에서 RMMR1 변이체 펩타이드는 서열번호 1의 라이신 잔기 위치가 독립적으로 아르기닌 잔기로 치환되고/되거나 서열번호 1의 아르기닌 잔기 위치가 독립적으로 라이신 잔기로 치환된 서열인 것을 특징으로 하는, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실된 펩타이드 변이체 서열 및/또는 하나 이상의 아미노산이 부가된 펩타이드 변이체 서열은 N 말단, C 말단 및 가운데 중 어느 한 곳 이상에서 아미노산 결실 및/또는 부가가 일어나는 것을 특징으로 하는, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명에서 상기 포유류의 세포는 항원 제시 세포인, 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 1) 인간 MRPL15 유래의 서열번호 1로 이루어진 RMMR1 펩타이드; 또는 2) RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 5 ~ 50개 아미노산, 바람직하게는 6~40개 아미노산, 더욱 바람직하게는 7~30개 아미노산으로 이루어진 RMMR1 변이체 펩타이드; 중 하나 이상이 링커 없이 또는 링커를 통해 이량체 이상의 다량체 형태로 결합된 것을 특징으로 하는 화물분자 수송 도메인에 관한 것이다.
예컨대, 본 발명의 화물분자 수송 도메인으로는 상기 i) RMMR1 펩타이드, 또는 ii) RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 5 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMMR1 변이체 펩타이드; 서열을 들 수 있으며, 또한, 상기 i) 또는 ii)의 펩타이드가 두 번 이상 반복되는 서열을 들 수 있고, 그 밖에도 상기 i) 펩타이드 및 ii) 펩타이드가 연결된 화물분자 수송 도메인을 들 수 있으나, 본 발명의 화물분자 수송 도메인이 위에 예시된 펩타이드로 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 상기 링커는 상기 화물분자 수송 도메인의 활성이 유지되는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 각 화물분자 수송 도메인 단량체를 연결시킬 수 있고, 좀 더 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등이 여러 개 연결된 링커를 이용하여 연결할 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 위와 같은 아미노산 링커, 펩타이드 링커 외에도 상기 화물분자 수송 도메인의 활성이 유지되는 한 화학적 링커의 사용도 가능하다.
또한, 본 발명의 상기 RMMR1 펩타이드 변이체는 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 부가가 중첩되어 일어난 것일 수 있다. 예컨대, RMMR1 아미노산 치환 변이체에서 더하여 아미노산 부가 및 결실이 일어날 수 있다. 또한, RMMR1 아미노산 결실 변이체에 아미노산 부가가 일어날 수 있다. 다만, 이와 같이 다양한 조합의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 부가를 통하더라도 화물분자 수송 기능을 보유하고 있음에는 변함이 없다.
본 발명에 따른 화물분자 수송 도메인은 RMMR1 펩타이드의 특정 아미노산 잔기 위치에서 아미노산 잔기가 보존적으로 치환된 변이체 또는 RMMR1 펩타이드나 이 변이체의 N-말단 및/또는 C-말단 및/또는 중간에서 1~8개의 아미노산이 결실된 펩타이드도 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 화물분자 수송 도메인은 아미노산 치환, 결실 및 삽입을 갖더라도 여전히 화물분자 수송 활성을 보유할 수 있음을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 화물분자 수송 도메인 변이체는 본 발명에 따른 화물분자 수송 도메인과 실질적으로 동일한 기능 및/또는 효과를 가지며, 80% 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 화물분자 수송 도메인 변이체들 또는 이의 절편들도 포함하는 의미로 해석된다.
본 발명의 화물분자 수송 도메인의 구체예로서 서열번호 1~23의 펩타이드를 들 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명은 화물분자; 및 상기 화물분자의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 상기 어느 하나의 화물분자 수송 도메인이 융합된, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자에 관한 것이다.
상기 화물분자와 화물분자 수송 도메인은 링커 없이 또는 링커의 존재 하에 융합될 수 있다. 또한, 상기 링커는 상기 화물분자 수송 도메인의 화물분자 수송 활성 및 화물분자의 활성이 유지되는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 화물분자 수송 도메인과 화물분자를 연결시킬 수 있고, 좀 더 바람직하게는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등이 여러 개 연결된 링커를 이용하여 연결할 수 있으며, 가장 바람직하게는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 5개씩 연결하여 사용할 수 있다. 위와 같은 아미노산 링커, 펩타이드 링커 외에도 상기 화물분자 수송 도메인의 활성이 유지되는 한 화학적 링커의 사용도 가능하다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 등의 핵산, 탄수화물, 지질 및 이들 중 1종 이상의 혼합물 중 선택된 것임을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 치료용 단백질, 항원성 단백질 또는 에피토프 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈를 비롯한 항산화 단백질인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자를 포함하는 질병 예방용 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자를 포함하는 화장료에 관한 것이다. 본 발명의 화장료는 화장수, 크림, 에센스, 수중유형 또는 유중수형 에멀젼, 연고 등의 기초 화장료 외에도 파운데이션, 립스틱, 아이섀도우 등의 색조 화장료도 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 구조체를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자; 상기 유전자 구조체; 또는 상기 발현 벡터;를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자; 상기 유전자 구조체; 또는 상기 발현 벡터;를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 화물분자를 포함하는 의료기기에 관한 것이다. 본 발명의 의료기기는 창상피복재, 필러, 복합 필러 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 화물분자 수송 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 구체예로서 서열번호 24~46의 폴리뉴클레오티드를 들 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 구조체를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 벡터가 상기 화물분자 수송 도메인과 화물분자 단백질이 융합된 재조합 화물분자 단백질이 발현될 수 있도록, 화물분자 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 화물분자의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 상기 화물분자 수송 도메인이 융합된 재조합 화물분자를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 재조합 화물분자를 세포와 접촉시키는 단계;를 포함하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 방법에서 상기 화물분자가 질병 예방 또는 치료용 단백질 또는 항산화 단백질임을 특징으로 하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법에 관한 것이다.
질병 예방 또는 치료용 단백질로는 상피세포 성장인자 등의 성장인자, 항체, 항체 의약품, 항체의 Fc를 포함하는 융합 단백질, 항체-의약품 복합체, 단백질 의약품, 효소 등을 의미하지만, 이러한 예시에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자가 항산화 단백질임을 특징으로 하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법에 관한 것이다. 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 카탈라제 등의 항산화 단백질을 의미하지만, 이러한 예시에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인과 화물분자의 화학결합이 공유결합 또는 비공유결합임을 특징으로 한다. 상기 화학결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다. 비공유결합으로는 이온결합 또는 정전기적 인력에 의한 결합 또는 소수성 상호작용에 의한 결합 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 이온결합 또는 정전기적 인력으로 화물분자 수송 도메인과 결합할 수 있는 물질은 DNA 또는 RNA와 같이 전하를 띠는 물질일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화물분자 수송 도메인이 서열번호 1 내지 서열번호 23 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 세포 내 또는 조직 내로 투과가 용이한 재조합 화물분자에 관한 것이다. 본 발명의 화물분자 수송 도메인은 서열번호 1 내지 23에 한정되는 것이 아니나, 실험의 편의를 위하여 대표적인 펩타이드들을 표 1에 예시한 것임을 분명히 밝힌다.
또한, 본 발명은 화물분자 수송 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 서열번호 24 내지 서열번호 46 중 선택된 1종임을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 화물분자 수송 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 24 내지 46에 한정되는 것이 아니나, 실험의 편의를 위하여 대표적인 폴리뉴클레오타이드들을 표 2에 예시한 것임을 분명히 밝힌다.
본 발명의 재조합 화물분자, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 피부 외용제, 경구, 스프레이, 패치 또는 주사 등 다양한 형태로 제형화할 수 있다. 예를 들면 경구용 조성물로는 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
1. 세포 배양
HaCaT, 3T3, 그리고 B16F10 세포는 DMEM 배지에 10% 우태혈청 (fetal bovine serum; FBS)과 항생물질용액 (100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신)이 첨가된 세포 배양액을 통해 배양되었다. 37℃, 95% 습도, 5% CO2가 유지되는 조건에서 배양하였고, 세포가 배양접시에 70-80% 유착되었을 때 트립신-EDTA를 처리하여 계대 배양하였다. HaCaT 세포는 카톨릭대학교 의과대학 김태윤 교수 실험실로부터 분양받아 배양하였으며 3T3와 B16F10 세포는 서울대학교 세포주은행으로부터 분양받아 배양하였다. RAW264.7 세포는 삼육대학교 약학대학 김상범 교수 실험실로부터 분양받아 배양하였다.
2. RMMR1 구축
다음의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 94℃에서 5분, 그 후 25℃에서 1시간 어닐링하였다.
센스 올리고뉴클레오타이드
5'-agcttgagagaagaccaagaggtcggagaagaggtagaaaatgtc-3' (서열번호 47)
안티센스 올리고뉴클레오타이드
5'-tcgagacattttctacctcttctccgacctcttggtcttctctca-3' (서열번호 48)
이후 pET-28a벡터의 HindIII와 XhoI 부위를 절단하고, 위에서 제조한 RMMR1 코딩 올리고뉴클레오타이드 쌍을 연결하였다. 재조합된 RMMR1을 대장균 Escherichia coli 균주 DH5α (RH618)에 형질전환하였다. 형질전환된 세포에서 분리한 DNA는 BamHI과 Hind III 부위를 절단하여 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein) 유전자를 연결하였다.
3. 융합 단백질 정제 방법
EGFP-RMMR1, EGFP, EGFP-TAT 단백질은 N, C- 말단 6X his 태그를 함유하는 pET28a 플라스미드 벡터를 이용하여 정제하였다. BL21- 코돈 플러스 세포로 형질 전환시키고 콜로니를 배지에 접종하여 키웠다. OD 600이 0.5에 도달할 때 까지 대규모의 세포를 LB 배지에서 배양하였고, 4 ℃에서 16 시간 동안 0.5 mM의 IPTG를 사용하여 단백질 발현을 유도하였다. 원심분리로부터 세포 펠렛을 획득하고, 300 mM NaCl을 함유하는 50 mM Tris buffer pH 7.5에서 초음파 처리하여 파쇄하였다. 그 후, 20,000 g에서 30 분 동안 원심분리하여 상층액을 얻었다. 이를 Ni-NTA 수지를 함유하는 칼럼 위에 부었다. 300 mM NaCl, 5% 글리세롤 및 15 mM 이미다졸을 함유하는 50 mM Tris, pH 7.5로 세척 단계를 수행하였다. 용출 완충액 (50 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl, 글리세롤 5%, 300 mM 이미다졸) 10 ml로 단백질을 칼럼으로부터 분리한 다음, Mustang 컬럼 (Pall, MSTG25E3)을 사용하여 endotoxin을 제거 후 LAL (limulus amebocyte lysate) 분석으로부터 0.5 EU/mg 이하의 적정 단백질을 전체 실험에 사용하였다.
4. FACS를 이용한 EGFP-RMMR1 융합단백질의 세포 도입
HaCaT, 3T3, B16F10 세포에서 RMMR1의 세포투과율을 평가하기 위해 12 시간 전 24 웰 플레이트에 1 x 105 양의 HaCaT 세포를 부착시켰다. 그 후, 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 워싱한 후 무혈청 배지 안에 2.5 uM의 단백질을 2 시간 동안 처리하였다. 2 시간 이후, 무혈청 배지로 총 3번 워싱해 주었고 이후 150 ul의 트립신을 처리하여 세포를 플레이트에서 떨어트린 후 850 ul의 혈청이 들어간 배지를 넣어주어 중화하였다. 이후 500 g로 10분간 원심분리를 한 다음, 배지를 제거하였으며 이후 500 ul의 FACS 완충액 (1% BSA, 0.1% sodium azide)을 통해 세포에 묻은 단백질을 제거하였다. 2번 세척을 반복한 후 FACS 완충액을 넣어 FACS 분석을 진행하였다.
5. 공초점 및 형광 현미경을 이용한 EGFP-RMMR1 융합단백질의 세포 도입
HaCaT 피부세포에서 RMMR1의 세포투과율을 평가하기 위해 12시간 전 24웰 플레이트에 9 mm 커버슬립을 올린 이후 1 x 105 양의 HaCaT 세포를 부착하였다. 그 후, 세포를 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 세척한 후 무혈청 배지 안에 2.5 uM의 단백질을 2시간 동안 처리하였다. 2시간 이후, 무혈청 배지로 총 3번 세척했고, 이후 hoechst를 1:1000 비율로 PBS에 희석하여 5분간 염색하였다. 이후 PBS를 이용하여 총 5번의 세척과정을 거쳤으며 웰에서 글라스 커버 슬립을 분리하여 물기를 제거하고 mounting을 진행 하였다. 이후 공초점 현미경을 이용하여 이미지를 얻었으며 형광 발현을 확인하였다. 형광현미경의 경우 96 well plate에 1 x 104 양의 HaCaT 세포를 전날 부착시켰으며 이후 위와 같은 방법으로 단백질을 처리하였다. 이후 실험이 끝나기 30분 전, 무혈청 배지로 세척 후 Mitotracker-deep red FM (1:2000) 또는 Lysotracer Red DND-99 (1:2000)를 처리하였으며 실험이 끝나기 5 분전 hoechst를 1:1000 비율로 PBS에 희석하여 5분간 염색하였다. 이후 Lionheart FX automated microscope (BioTek)를 사용하여 형광 신호를 관찰하였다.
6. 웨스턴 블롯팅
HaCaT 피부세포에서 RMMR1의 세포투과율을 평가하기 위해 12시간 전 12웰 플레이트에 3 x 105의 HaCaT 세포를 부착하였다. 그 후, 세포를 무혈청 DMEM 배지를 이용하여 세포를 세척한 후 무혈청 배지 안에 1 uM의 단백질을 2시간 동안 처리하였다. 2시간 이후, 세포 표면에 묻어있을 수 있는 단백질들을 제거하기 위해 무혈정 배지를 이용하여 총 3번 세척하였다. 이후 RIPA 용균 완충액과 원심분리를 통해 상층액에서의 단백질을 정량하였고 이후 30 ug의 단백질을 5X 시료 완충액과 혼합하였다. 준비된 단백질 시료는 10분간 끓였으며 12%의 SDS-PAGE 젤을 이용하여 분자량에 따라 분리하였다. 전기영동이 끝난 이후 PVDF 멤브레인으로 단백질을 옮긴 후 5% 탈지유를 포함하는 TBS-T 완충액을 이용하여 1시간 동안 블로킹하였다. 이후 단백질 발현 측정을 위해 1차 항체로 GFP 항체를 사용하였으며 이후 2차 항체로 양고추냉이 퍼옥시데이즈가 결합된 항-토끼 항체를 이용하여 반응시켰다. 이후 TBS-T 완충액으로 세척 후 각 단백질의 세포 투과율을 측정하였다.
세포주뿐만 아니라 마우스의 면역세포에서의 투과율을 확인하기 위해 C57BL/6 마우스 7주령을 희생시켰다. 이후 비장 세포를 적출하였으며 2% FBS 및 1% 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 배지를 이용하여 해리시켰다. 적혈구 용해 용액 (BD, 555899)을 이용하여 비장에서 적혈구를 용해시켰으며 1 X 106 양의 세포에 200 nM 또는 1 uM의 EGFP, EGFP-RMMR1, EGFP-TAT을 2시간 처리한 후 0.05%의 트립신을 처리하여 세포 외부에 붙은 단백질을 제거하였다. 이후 세포를 FACS 용액으로 3번 세척한 이후 CD11b, CD11c, F4/80, MHC II, NK 1.1, CD3 항체로 4℃에서 30분 동안 염색하였으며 FACS 분석을 통해 T 세포, 자연살해세포 (NK), 대식세포, 수지상 세포 (DC)에 전달된 EGFP의 값을 측정하였다.
결과 1 : RMMR1 펩타이드 2차 구조 예측도
RMMR1의 펩타이드 구조를 예측하기 위하여 PEP-FOLD3 De novo peptide structure prediction 프로그램을 이용하였다. RMMR1의 아미노산 서열을 기입하여 프로그램으로 예측된 모델을 PyMOL 2.4 프로그램으로 2차원 예측 구조를 이미지화 하였다 [도 1의 A]. 2차 구조 예측 분석을 위해 사용된 예측 프로파일에서 아래쪽의 밝은 부분은 나선형, 맨 위쪽의 가장 밝은 부분은 확장, 그리고 나선형과 확장 사이 부분은 코일을 나타내며, 이를 통해 2차 예측 모델이 도출되었다 [도 1의 B].
결과 2 : RMMR1-FITC 합성 펩타이드 세포 투과 효율
RMMR1의 세포 투과 효율을 확인하기 위하여 형광 발광하는 성질의 FITC를 부착한 합성 펩타이드를 이용하여 세포주 3T3와 B16F10을 이용한 도입 효율을 확인하였다. FITC가 부착되지 않은 세포의 경우 펩타이드의 투과성을 확인하기 어렵기 때문에 형광을 내는 FITC를 부착하면 세포 투과성을 확인하기 용이해진다. FITC 부착 펩타이드인 RMMR1-FITC, TAT-FITC 펩타이드를 이용하여 동일한 농도인 2.5 uM으로 각 세포주에 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, 두 세포주에서 대조군인 TAT-FITC 펩타이드에 비해 RMMR1-FITC 합성 펩타이드가 월등히 높은 세포 투과 수준을 보였다 [도 2].
RMMR1의 항원 제시 세포 투과 효율을 확인하기 위하여 형광 발광하는 성질의 FITC를 부착한 합성 펩타이드를 이용하여 세포주 RAW264.7을 이용한 도입 효율 을 확인하였다. FITC가 부착되지 않은 세포의 경우 펩타이드의 투과성을 확인하기 어렵기 때문에 형광을 내는 FITC를 부착하면 세포 투과성을 확인하기 용이해진다. FITC가 부착된 펩타이드 RMMR1-FITC (SEQ. NO. 1)와 TAT-FITC를 이용하여 동일한 농도인 2.5 uM으로 각 세포주에 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, 두 세포주에서 대조군인 TAT-FITC 펩타이드에 비해 RMMR1-FITC 합성 펩타이드가 높은 세포 투과 수준을 보였다 [도 6a].
결과 3: EGFP-RMMR1 융합단백질의 모식도 및 정제
인간 유래의 세포 침투성 펩타이드와 EGFP를 포함하는 융합단백질을 제작하기 위하여 RMMR1 폴리펩타이드를 코딩하는 서열 (gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt)을 pET-28a 플라스미드의 Hind III와 Xho I 부위에 클로닝 하였으며 재조합된 RMMR1 DNA와 세포 침투 효율을 확인하기 위한 EGFP cDNA를 BamH I 그리고 Hind III 부위를 절단하여 pET-28a 플라스미드에 EGFP-RMMR1를 클로닝하였다 [도 3a]. 대조군으로 쓰일 EGFP와 EGFP-TAT 역시 같은 벡터인 pET-28a 플라스미드에 위와 같은 방법으로 클로닝 되었으며 his-tag을 포함하는 융합단백질의 경우 Ni-NTA 컬럼에 결합된 이후 낮은 농도의 15 mM의 imidazole 용액에서 세척된 이후 300 mM의 이미다졸 용액에 의해 용출되었다. 용출된 융합단백질 산물의 경우 SDS-PAGE를 이용하여 총 10 ug의 정량된 단백질을 로딩하였으며 이후 쿠마시 블루 염색시약을 통해서 정제된 융합단백질의 분자량을 확인하였다 [도 3b]. 또한, 염색된 융합단백질이 his-tag를 포함하는 EGFP-RMMR1 단백질을 발현하는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였으며 his 항체를 이용하여 his-tag를 포함하는 융합단백질의 분자량이 쿠마시 블루 염색 결과와 일치하다는 점을 확인하였다 [도 3b, 도 3c].
결과 4: HaCaT 세포 내로의 RMMR1 융합단백질 도입
RMMR1 융합단백질의 세포 투과 효율을 확인하기 위해서 인간 피부세포의 세포주인 HaCaT에 융합단백질을 도입하면서 그 효율을 확인하였다. 재조합 단백질인 EGFP, EGFP-TAT, EGFP-RMMR1은 동일한 농도인 1 uM으로 HaCaT 세포에 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, EGFP-RMMR1 융합단백질이 월등히 높은 세포 투과 수준을 보였으며 두번째로 세포 투과 펩타이드로 기존에 잘 알려진 TAT을 포함하는 EGFP-TAT 융합단백질이 EGFP-RMMR1보다 약 60% 낮은 수준의 세포 투과율을 보임을 확인하였다. 또한 EGFP 단백질 자체만으로는 세포로 투과가 되지 않음을 확인할 수 있었다 [도 3d].
RMMR1 융합단백질의 세포 효능을 다른 실험 기법으로 분석, 농도에 따른 효율, 그리고 시간에 따른 효율을 확인하기 위하여 유세포분석기로 세포 내 형광을 측정하였다. 구체적으로는 농도에 따른 도입 효율을 분석하기 위해 0.1 uM 에서 12.5 uM 농도까지 5배 비율로 총 4 농도의 융합 단백질을 2시간 동안 처리하였다. 그 결과, 농도 의존적으로 HaCaT 세포에 RMMR1 융합 단백질이 전달되었음을 확인하였으며 위의 웨스턴 블롯팅 결과와 마찬가지로 TAT 융합 단백질에 비해 현저히 높은 세포 투과율을 확인할 수 있었다 [도 4a, 도 4b, 도 4c]. 또한, 처리 시간에 따른 도입 효율을 분석하기 위해 2.5 uM 농도의 융합단백질을 30분에서 4시간까지 배양하여 FACS 분석을 진행하였다. 그 결과, RMMR1 융합단백질은 시간 의존적으로 HaCaT 세포에 전달됨을 확인하였으며 2시간까지 꾸준히 증가된 단백질 양을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 RMMR1 도메인은 잘 알려진 세포 투과 도메인인 TAT 보다 효율적으로 단백질을 전달함을 다시 한 번 확인하였다 [도 4d].
세포로 도입된 EGFP-RMMR1 융합단백질의 위치를 확인, 실제로 세포 안으로 도입이 되었는지 확인, 그리고 세포 투과 효능을 다시 한 번 확인하기 위해 HaCaT 세포에 EGFP-RMMR1 융합 단백질을 처리한 후 형광현미경 및 공초점 현미경을 이용하여 세포 투과 효능을 확인하였다. 그 결과, 대조군인 EGFP 단백질의 경우 형광 신호를 관찰하지 못하였으나 EGFP-TAT 그리고 EGFP-RMMR1의 경우 공초점 현미경에서 세포질에서 주로 검출됨을 확인할 수 있었다 [도 5a]. 또한, EGFP-RMMR1의 경우 EGFP-TAT 융합단백질에 비해 월등히 높은 형광 신호가 관찰되었으며 이는 위의 웨스턴 블롯팅 및 FACS 결과와 일치함을 확인할 수 있었다. 형광현미경에서도 역시 같은 결과를 얻었으며 대부분의 도입된 EGFP-RMMR1의 경우 라이소좀 또는 미토콘드리아 위치를 나타내는 lysotracker, mitotracker와 대부분 동일 위치 (co-localization)에 있지 않음을 관찰하였으며 이를 통해 도입된 융합단백질이 세포질에 위치함을 재확인하였다 [도 5b].
세포주뿐만 아니라 마우스의 면역세포에서의 투과율을 확인하기 위하여 EGFP-RMMR1을 C57Bl/6 마우스 비장세포에 2시간 처리 후 FACS를 이용하여 면역 세포 종류에 따른 세포내 형광 레벨을 측정하였다. 각각 200nM (왼쪽 그래프) 및 1uM (오른쪽 그래프)로 처리하여 비교한 결과 두 농도에서 항원 제시 세포에 특이적으로 투과율이 높은 것이 확인되었으며 EGFP-TAT 그리고 EGFP 대비 월등한 세포 투과능을 확인하였다 [도 6b].
아래 표 1은 본 발명의 화물분자 수송 도메인 중 구체적인 예시인 23종의 아미노산 서열이며, 표의 순서대로 각각 서열번호 1 내지 서열번호 23이 된다.
아래 표 2는 본 발명의 화물분자 수송 도메인 중 구체적인 예시인 23종을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이며, 표의 순서대로 각각 서열번호 24 내지 서열번호 46이 된다.
Name Amino acid sequence Characteristics SEQ ID NO
RMMR1 ERRPRGRRRGRKC - 1
RMMR1-1 ERRPRGRRRGRK C 말단 1개 아미노산 결실 2
RMMR1-2 RRPRGRRRGRKC N 말단 1개 아미노산 결실 3
RMMR1-3 PRGRRRGRKC N 말단 3개 아미노산 결실 4
RMMR1-4 ERRPRGRRRG C 말단 3개 아미노산 결실 5
RMMR1-5 ERRPRGRRRGRRC K12R 치환 6
RMMR1-6 EKKPRGRRRGRKC R2K, R3K 치환 7
RMMR1-7 EKKPRGKKKGRKC R2K, R3K, R7K, R8K, R9K 치환 8
RMMR1-8 ERRPRRRRGRKC G6 결실 9
RMMR1-9 RRPRRRRGRKC E1, G6 결실 10
RMMR1-10 RRPRGRRRGRK N 말단 하나, C 말단 하나 결실 11
RMMR1-11 ERRPRGRGR R8G 치환, C 말단 네 개 결실 12
RMMR1-12 RPRGRGRKC N 말단 두 개 결실, R8 R9 결실 13
RMMR1-13 KKPERRPRGRRRGRKCG N 말단 세 개 부가, C 말단 하나 부가 14
RMMR1-14 KKPERRPRGRRRGRKCGR N 말단 세 개 부가, C 말단 두 개 부가 15
RMMR1-15 SKKPERRPRGRRRGRKC N 말단 네 개 부가 16
RMMR1-16 SKKPERRPRGRRRGRKCGR N 말단 네 개 부가, C 말단 두 개 부가 17
RMMR1-17 ERRPR C 말단 8개 결실 18
RMMR1-18 RRPGR E1, R5 결실, C 말단 6개 결실 19
RMMR1-19 RPRGR N 말단 2개, C 말단 6개 결실 20
RMMR1-20 PRGRR N 말단 3개, C 말단 5개 결실 21
RMMR1-21 RGRRR N 말단 4개, C 말단 4개 결실 22
RMMR1-22 RGRKC N 말단 8개 결실 23
Name polynucleotide sequence SEQ ID NO
RMMR1 gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 24
RMMR1-1 gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa 25
RMMR1-2 aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 26
RMMR1-3 cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 27
RMMR1-4 gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt 28
RMMR1-5 gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aga tgt 29
RMMR1-6 gag aaa aaa cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 30
RMMR1-7 gag aaa aaa cca aga ggt aaa aaa aaa ggt aga aaa tgt 31
RMMR1-8 gag aga aga cca aga cgg aga aga ggt aga aaa tgt 32
RMMR1-9 aga aga cca aga cgg aga aga ggt aga aaa tgt 33
RMMR1-10 aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa 34
RMMR1-11 gag aga aga cca aga ggt cgg ggt aga 35
RMMR1-12 aga cca aga ggt cgg ggt aga aaa tgt 36
RMMR1-13 aag aaa ccg gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt ggc 37
RMMR1-14 aag aaa ccg gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt ggc aga 38
RMMR1-15 tcc aag aaa ccg gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt 39
RMMR1-16 tcc aag aaa ccg gag aga aga cca aga ggt cgg aga aga ggt aga aaa tgt ggc aga 40
RMMR1-17 gag aga aga cca aga 41
RMMR1-18 aga aga cca aga ggt 42
RMMR1-19 aga cca aga ggt cgg 43
RMMR1-20 cca aga ggt cgg aga 44
RMMR1-21 aga ggt cgg aga aga 45
RMMR1-22 aga ggt aga aaa tgt 46
본 발명은 그 자체만으로는 세포 내로 투과가 어려운 펩타이드, 단백질, 핵산을 비롯한 다양한 화물분자와 융합하여 세포 내로 쉽게 화물분자를 운반하는 화물분자 수송 도메인 및 이를 이용한 재조합 화물분자, 그리고, 화물분자를 세포 내로 이동하는 방법을 제공하며, 치료용 단백질, 항원성 단백질 또는 에피토프 펩타이드, 항산화 단백질 등의 다양한 화물분자를 세포 내로 투과시킬 수 있으므로, 치료용 약제, 화장료 또는 치료방법, 세포 개선방법 등에 이용될 수 있다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (19)

1) 인간 MRPL15 유래의 서열번호 1로 이루어진 RMMR1 펩타이드; 또는
2) RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 5 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMMR1 변이체 펩타이드;로서,
세포 투과능을 가지며, 화물분자와 결합하여 포유류의 세포 내 또는 조직 내로 화물분자를 수송하는 화물분자 수송 도메인.
청구항 1에 있어서,
RMMR1 변이체 펩타이드에서 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환인, 화물분자 수송 도메인.
청구항 1에 있어서,
RMMR1 변이체 펩타이드는 서열번호 1의 라이신 잔기 위치가 독립적으로 아르기닌 잔기로 치환되고/되거나 서열번호 1의 아르기닌 잔기 위치가 독립적으로 라이신 잔기로 치환된 서열인, 화물분자 수송 도메인.
청구항 1에 있어서,
RMMR1 변이체 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실된 펩타이드 서열은 RMMR1 펩타이드의 아미노산 중 하나 내지 여덟 개가 결실된, 화물분자 수송 도메인.
청구항 1에 있어서,
RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실된 펩타이드 변이체 서열 및/또는 하나 이상의 아미노산이 부가된 펩타이드 변이체 서열은 N 말단, C 말단 및 가운데 중 어느 한 곳 이상에서 아미노산 결실 및/또는 부가가 일어나는, 화물분자 수송 도메인.
청구항 1에 있어서,
상기 포유류의 세포는 항원 제시 세포인, 화물분자 수송 도메인.
청구항 1 내지 청구항 6 중 선택된 어느 한 항에 있어서,
1) 인간 MRPL15 유래의 서열번호 1로 이루어진 RMMR1 펩타이드; 또는
2) RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 5 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMMR1 변이체 펩타이드; 중 하나 이상이 링커 없이 또는 링커를 통해 이량체 이상의 다량체 형태로 결합된 것을 특징으로 하는 화물분자 수송 도메인.
화물분자; 및
상기 화물분자의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 청구항 1 내지 청구항 6 중 선택된 어느 하나의 화물분자 수송 도메인이 융합된, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자.
청구항 8에 있어서,
상기 화물분자는 펩타이드, 단백질, 또는 핵산인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자.
청구항 8에 있어서,
상기 화물분자는 치료용 단백질, 항원성 단백질 또는 에피토프 펩타이드인 것을 특징으로 하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자.
청구항 8에 있어서,
상기 화물분자 수송 도메인은
1) 인간 MRPL15 유래의 서열번호 1로 이루어진 RMMR1 펩타이드; 또는
2) RMMR1 펩타이드에서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된, 5 ~ 50개 아미노산으로 이루어진 RMMR1 변이체 펩타이드; 중 하나 이상이 링커 없이 또는 링커를 통해 이량체 이상의 다량체 형태로 결합된 것을 특징으로 하는 재조합 화물분자.
청구항 8의 재조합 화물분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 구조체.
청구항 12의 유전자 구조체를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 발현 벡터.
1) 청구항 8 내지 청구항 11 중 선택된 어느 한 항의 재조합 화물분자;
2) 청구항 12의 유전자 구조체; 또는
3) 청구항 13의 발현 벡터;를 포함하는 약학 조성물.
1) 청구항 8 내지 청구항 11 중 선택된 어느 한 항의 재조합 화물분자;
2) 청구항 12의 유전자 구조체; 또는
3) 청구항 13의 발현 벡터;를 포함하는 화장료.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 화물분자 수송 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 구조체.
청구항 16의 유전자 구조체를 포함하는, 세포막 투과율이 향상된 재조합 화물분자 단백질 발현용 벡터.
화물분자의 N-말단 및 C-말단 중 어느 한 곳 이상에 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 화물분자 수송 도메인이 융합된 재조합 화물분자를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 재조합 화물분자를 세포와 접촉시키는 단계;를 포함하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법.
청구항 18에 있어서,
상기 화물분자는 치료용 단백질임을 특징으로 하는 세포 내로 화물분자를 전달하는 방법.
PCT/KR2022/007344 2021-06-03 2022-05-24 화물분자 수송 도메인 rmmr1, 이의 변이체, 이를 포함하는 재조합 화물분자 및 이를 이용한 화물분자 수송 방법 WO2022255708A1 (ko)

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