PT90118B - Processo para a preparacao de novos polipeptidos exibindo actividade de factor de crescimento e de sequencias de acidos nucleicos que codificam esses polipeptidos - Google Patents

Description

D E S C R 1 T 1 V A

REFERENCIAS RELACIONADAS COM PEDIDOS DE PATENTE DE INVENÇÃO

O presente pedido de patente de invenção constitui uma continuação em parte do pedido de patente de invenção NS.

de Série 172.653 requerido em 24 de Março de 1988,que por sua vez constitui uma continuação em parte do pedido cie patente de invenção NS. de série 115.139 requerido em 30 de Outubro de 1987 e NS. de série 149.965 requerido em 3 de Fevereir o de 1988^ que constituem uma continuação do pedido de patente de invenção

NS. 791.247, requerido em 25 de Outubro de 1985, pr c-sen cemen te abandonado e que constitui uma continuação em parte do pedido de patente de invenção NS. de série 666.520 requerida em 30 de

Outubro de 1984, agora abandonado, cujas descrições aqui são incorporadas por referência.

INTRODUÇÃO

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a composições poIipeptídicas novas que exibem actividade de factor de crescimento que incluem polipéptidos quiméricos e métodos para a sua preparação, que utilizam técnicas de recombinaçào cie DNA.

BAD ORIGINAL tf

Antecedentes

Descobriu—se que um número significativo de polipéptidos segregados por células de mamífero, exibem actividade de factor de crescimento. A sequência destes polipéptidos é substancia 1mente conservada em toda uma larga variedade de mamíferos. Grande parte do interesse destes compostos è incentivada pela sua associação com oncogénese. Também tem interesse a -forma como a produçâro dos factores de crescimento é regulada e como estes, por sua vez,regulam a actividade celular.

Também se verificou que a infecçâo de célula de mamífero por vírus resulta na pro 1 i f eraçâfo do crescimento das células infectadas. Para a finalidade da presente invenção, têm particular interesse os membros da família dos poxvírus tais como o vírus da varíola, da vaccinia e virus associados com doenças particu1 ares, tais como o vírus do fibroma de Shope, vírus do tumor de Yaba e virus de Molluscum contagiosum (MCV).

Também terá interesse determinar se os vírus que causam a proliferação celular após infecçào, produzem polipéptidos relacionados com factores de crescimento quer actuando sob a forma de factor de crescimento quer sob a forma de receptor de factor de crescimento. Estes compostos podem entâfo ser utilizados nos estudos das acçôes virais, em ensaios para determinar a presença dos vírus em meios nutrientes, como mitogénios e no desenvolvimento de agentes terapêuticos para o tratamento das infecçôes virais.

Também tem interesse o desenvolvimento de compostos que possam constituir agonistas ou antagonistas de factores de

• crescimento para se utilizarem (in vitro) no desenvolvimento de culturas de células, na investigação dos processos de mitose e em terapêutica.

Literatura Importante

Venkatesan et a 1. , J. Viro1. 44:657-646, (1982) descreve a sequenciação de DNA do gene estruturado que codifica as proteínas do vírus da vaccinia mas nâfo foi reconhecido se qualquer destas proteínas possui actividade de factor de crescimento. Cooper et a 1. . ibid 37/284-294 (1981), descrevem a traduçâío de mRNAs codificados com o terminal de repetição invertido do genoma do vírus da vaccinia. Doenças proliferativas devido a membros da família dos poxvirus foram descritas para o vírus do fibroma de Shope (Shope, J . Exp. Med. 56/793-822, (1932), vírus do tumor de Yaba (Niven et a 1 . . J.

Path. Bacteriol. BI : 1-14, (1961)) e virus de Molluscum contagiosum (MCO) (Post1ethwaite, ftrch, Environ. Health 21;432452, (1970)). Descrições de factor de crescimento epidérmico (EGF) podem ser consultadas em Scott et a 1. , Science 221:236-

240 (1983) e	Gr ay	et a 1 . . Nature	303:722-725,	l1983).	A
presença	de	t rés	pontes dissulfureto	no EGF e no	factor	de
transformação	do	crescimento (TGF) é	referida por	Savage	et
â 1 « J	Biol	Chem. 248: 7669-7692.	(1973). Cônsul	tar também
Doo1i 111e	et	é_L· ,	Nature 307:558-560	(1984) e d	pedido	de

patente de invenção australiano N2. 850062B8. Tem-se sugerido que a região de ligação com o receptor da molécula de EGF esteja ligada, na ansa, entre os restos da terceira e quarta cisteína (Komoriya et a 1 . , Proce. Natl. Acad. Sc 1 USA SI;1351-1355, (1983).

Podem-se consultar novas descrições do factor de crescimento do vírus da vaccinia ( VGF ) em Brown et a 1 . , Nature

313;491-492. (1985); Reisner, Nature 313:601-803, (1983) e

Blomquist et a 1 . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81;7283—7367.

(1984). □ factor de crescimento do vírus do fibroma de Shope natural (SFGF) foi descrito por Chang, W.C. , et a 1. , em

Molecular and Cellular Biol. 7:535-540, (1987). Shope refere em

J. Exp. Med.58:793-802 (1932), que a infecção de coelhos adultos pelo vírus de fibroma de Shope provoca uma proliferação rápida de fibroblastos que origina um fibroma benigno. A infecção de coelhos adultos ou recém-nascidos imunodeprimidos provoca a rápida proliferação de fibroblastos conduzindo a um fibrossarcoma atípico e invasivo. ftllison, A.C., J. Natl.

Câncer Inst. 36:869 — 876 (1966); Smith, et a 1 . , J. Na11 . Câncer

Inst. 50:1529-1539, (1973); Allison, A.C., J. Natl. Câncer

Inst. 35:859-868. (1966).

factor de crescimento do vírus do mixoma natural (MGF ) foi descrito por Upton et a I . , J. Virol . 61:1271-1275 (1987). A infecção de coelhos adultos pelo vírus do mixoma provoca uma proliferação rápida de um tumor mιxossarcDmatoso invasivo. Strayer, D.S. e Sell, S., J. Natl. Câncer Inst.

71:105-116 (1983). Foi detectada uma sequência de DNA capaz de codificar um factor de crescimento conservado (factor de crescimento do vírus de Molluscum contagiosum natural (NCGF)).

Porter, C.D. e Archard, L.C., J. Gen. Virol. 68:673-682, (1987). As infecçfles em seres humanos pelo vírus de Molluscum contagiosum induzem à formação de tumores benignos da pele cracterizados por células em proliferação rápida. Brown , et a 1. . Sex. Transm. Pis, 8:227-234 (1981). 0 vírus de tumor de

Yaba provoca histocitomas subcutâneos nos macacos e nos seres humanos, Bearcroft, et a 1. , Nature (London) 182:195-196. (1958) e previu-se haver uma relação com d factor de crescimento devido à sua relação com o vírus de fibroma de Shope, vírus do mixoma e vírus de Molluscum contagiosum.

EGF murino (mEGF) (Scott et al.. supra, 19B3; Gray et al . . supra, 1983) e EGF humano (hEGF) (Gregory et a 1 . . Int,

J. Pept, Protein Res. 9:107-118, (1977), sabe-se que sâo homólogos de TGF humano, de murganho e de rato, (Marquardt et a 1 , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80.:4684-4688, (1983)) e com restos de 45 a 85 de um polipéptido com 140 resíduos, factor de crescimento da vaccinia (OGF) codificado pelo genoma do vírus da vaccinia (Oenkatesan et a 1 . , supra. 1982) .

A expressão de péptidos estranhos que utilizam um vector de baculovirus em células de insecto, está descrita por

Maeda et a 1. . Nature 315;592-594, (19B5), e Carbonell et al. .

J. of Vi ro1oqy 56:153-160, (1985).

As descrições destas referências sào incluídas aqui para consu1 ta.

RESUMO DA INVENÇÃO

Proporcionam-se composições de novos polipéptidos que encontram analogia com fragmentos de proteínas virais, »

composições estas que têm acçâro como mitogénios e podem ser utilizados em meios nutrientes, como reagentes para a detecção de receptores de factor de crescimento ou da presença de factor de crescimento e como competidores para o factor de transformação de crescimento e factor de crescimento epidérmico. As composições têm utilização terapêutica, por exemplo, para promover a epi te 1 i zaçâfo e cicatrização de queimaduras e de feridas. As novas composições podem ser sintetizadas. Os péptidos referidos podem ser formados sob a forma de o1igopéptidos ou de proteínas fundidas, utilizando-se técnicas recombinantes, numa grande variedade de hospedeiros.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa a comparação duma sequência de aminoácidosda proteína do vírus da vaccinia com o factor de crescimento conhecido, onde o aminoácido inicial do VGF é o ácido aspártico (D) na posiçâfo 20 da metionina, cuja posição corresponde ao aa~^=A dos péptidos descritos; e a Figura 2 representa a estrutura proposta de um VGF maduro com substituições por asparagina (N). Os asteriscos indicam os sítios de g 1 icosi 1 açâfo potenciais em MGF e em SFGF .

DESCRIÇÃO DE ASPECTOS ESPECIFÍCOS

Proporcionam-se novas composições que podem agir como agentes agonistas ou antagonistas do factor de crescimento da epiderme (EGF) ou do factor de transformaçào do crescimento (TGF) e que encontram uma grande variedade de aplicações em híbridos anticorpos culturas de células, diagnósticos, terapêutica in vivo e em associação com outros péptidos, na formação de polipéptidos como agentes imunogénicos para a produção de

Podem isolar-se ou preparar-se as sequências polinucleotídicas que podem ser introduzidas num vector de expressão para a expressão das composições citadas antes.

As composições encontram analogia com fragmentos de proteínas virais, particu1armente com proteínas de poxvirus.

Como se representa na Figura 1, o VGF tem restos isentos de carga e hidrofóbicos, perto do N-terminal, entre os restos 5 e e perto do C-terminal, entre os restos 100 e 124. Estes ser considerados pela analogia com as restos podem g1icoproteínas de membrana integral como tendo uma sequência de sinal hidrofóbica de N-terminal que é removida proteo1iticamente durante ou imediatamente após a tradução e uma sequência transmembranosa de C—terminal, que serve como âncora da proteína madura na membrana. A cisão do polipéptido virai na arg-43 e na arg-90 do péptido maduro conduzirá â libertação de um polipéptido solúvel.

□ resto 140 do polipéptido 00 pode ser considerado como dando origem primeiro a uma proteína associada com a membrana com aproximadamente 121 restos após a remoção de lg da sequência de aminoácidos, A seguir ao processo intracelular obteve-se um factor de crescimento peptidico solúvel com cerca de 77 restos. Stroodant P. et a 1 . Ce 11 42:303 — 393, (1905).

A comparação do factor de crescimento de mixoma (MGF) e do factor de crescimento do fibroma de Shope (SFGF) com outros membros da família de factores de crescimento (ver

Figura 1) revelam certas diferenças notáveis. 0 MGF e o SFGF , sintetizados como moléculas precursoras, têm uma sequência de sinal no N-terminal mas, diferentemente doutros membros de factor de crescimento, nào apresentam domínio de transmembrana no C-terminal o que indica que sâfo moléculas segregadas. A análise de sequência mostra o uso significativo de asparagina em ambos os MGF e SFGF.

Nas seis posições, quer o MGF quer o SFGF, exibem asparaginas conservadas onde outros membros nâfo têm asparagina.

Destas posições as asparaginas substituem dois restos de glicina, conservados completamente nas posições Θ e 31, onde a primeira cisteina está na posiçâfo 2. Ambos estes restos de glicina ocorrem em associação com restos de tirosina favoravelmente conservados nas posições 9 e 32. Devido â natureza conservada de um modo favorável dos aminoácidos nesta parte da molécula, acredita-se que as ansas de cisteina presentes presentes nesta face estâfo relacionadas com a ligação aos receptores e com a funçâfo dos factores de crescimento nesta família.

□s aminoácidos de glicina e asparagina prevê-se que possuem o potencial de retorno Beta, o mais elevado (Chou e

Fassman, An. Rev. Biochem. 47:251-276, (1978). Portanto, parece que a conservação deste potencial de retorno é extremamente importante para a actividade de factor de crescimento. Gs factores de crescimento diferentes dos de mixoma e de Shope utilizam, quase exclusivamente, glicina nas regiões de retorno

B importantes da molécula. Nos NGF e SFGF, quase todas estas glicinas têm sido convertidas para asparaginas (ver Figura 2).

Este facto indica que uma importante funçâfo biológica é devida à substituição de glicina, altamente conservada, por um resto de asparagina. Existe a possi bi 1 id.ade de que a substituição de glicina, nas regiões de retorno conservadas na estrutura do factor de crescimento pela asparagina possa conduzir ao aumento do funcionamento de factor de crescimento, quer através do aumento da ligação do receptor de EGF ou de um receptor relacionado, quer por reforço do efeito directo do factor de crescimento nas células afectadas ou, ainda, por aumento da estabilidade da molécula.

Duas das novas ocorrências de asparaginas no MGF e no

SFGF fornecem sítios de g1icosi1 ação, ligados a N, potenciais.

Além disso, estes sítios estão presentes nas duas ansas de cisteína que permitem números variáveis de aminoácidos. Assim, as novas ocorrências de asparagina podem oferecer vantagens múltiplas para o factor de crescimento, além da sua funcionalidade aumentada. Uma destas vantagens pode ser a estabi1ização da proteína In vivo, por protecçâo contra a degradação ou por sítios imunogénicos, por g1icosi1 ação.

Os polipéptidos referidos, são caracterιzados por serem capazes de exibirem, pelo menos, uma ansa ou círculo, usualmente três ansas ou ’ círculos, como um resultado de cisteínas que formam pontes, onde a fracção activa sob o ponto de vista fisiológico da molécula que proporciona uma actividade relacionada com o factor de crescimento deverá incluir cerca de até 65 aminoácidos, usualmente 15 a 60 aminoácidos. Destas três ansas, duas incorporam 12 a 15 aminoácidos, (14-17 aminoácidos aneliformes) exclusivos da ponte de cisteína, mais particularmente, uma tem de 12 a 13 aminoácidos (14 ou 15 aminoácidos aneliformes) e outra de 15 aminoácidos (17 aminoácidos aneliformes) em que a ansa próxima do N-terminal apresentará usualmente de 12 •frequentemente 12 aminoácidos, aminoácidos.

ma í s a 13 aminoácidos, e a ansa média terá

A terceira ansa ou a ansa próxima do C-terminal terá

Θ aminoácidos (10 aminoácidos aneliformes) e que incluem os aminoácidos f1anqueadores que apresentarão a fórmula seguinte:

PP³- (aa²⁵-C-aa²⁷

Pp4-(aa⁴0-aa³9-aa

- C-aa²⁹-aa³⁰-G-Y _n-C- R- aa³⁵- G-aa³³ na qual:

os símbolos de uma letra para os aminoácidos têm o significado convencional, em que C representa cisteína, G representa glicina, N representa asparagina, Y representa tirosina e R representa arginina;

aa*⁰ representa um aminoácido neutro que pode ser um aminoácido alifâtico comportando de 3 a 4 átomos de carbono ou um aminoácido aromático, particularmente com 9 átomos de carbono e apresentando de 0 a 1 grupo de hidroxilo como, por exemplo, alanina, serina, treomna, ί

tirosina ou feni1 a 1anina;

aa²⁷ representa um aminoácido neutro ou básico comportando em especial de 3 a 6 átomos de carbono e que quando representa um aminoácido neutro este exibe de 0 a i grupo carboxamida como, por exemplo, arginina, alanina, valina, leucina, isoleucina, asparagina ou glutaminaj aa²’ representa um aminoácido neutro ou um aminoácido básico, podendo ser alifático ou aromático em que o aminoácido aromático é exemplificado pela histidina, ou um aminoácido alifático .comportando de 2 a 6 átomos de carbono, mais usualmente de 3 a 6 átomos de carbono, apresetando de 0 a 1 grupo hidroxilo como, por exemplo, serina, treonina, leucina, valina, isoleucina ou arginina;

aa³° representa um aminoácido neutro, podendo ser alifático ou aromático em que o aminoácido aromático é exemplificado pela histidina, ou um aminoácido alifático comportando de 3 a 6 átomos de carbono e de 0 a 1 grupo hidroxilo em especial serina, isoleucina e valina;

aa⁷' representa um aminoácido alifático neutro comportando de 2 a 6 átomos de carbono, mais usualmente de a ó átomos de carbono, e de 0 a 1 grupo hidroxilo, mais particu 1armente serina, treonina, valina, leucina ou isoleucina, ou um aminoácido ácido como por exemplo o ácido glutâmico e o ácido aspártico;

aa^3S representa um aminoácido neutro ou ácido comportando de 3 a 6 átomos de carbono cujo aminoácido neutro é exemplificado pela alanina, valina, leucina,

isoleucina e serina, e o aminoácido ácido é exemplifiçado pelos ácidos aspártico e glutâmico;

aa³® representa um aminoácido alifático neutro substituído comportando como substituinte um grupo carboxamida e de 4 a 5 átomos de carbono ou um aminoácido ácido, por exemplo asparagina, glutamina, ácido aspártico ou ácido glutâmico;

aa³’ representa um aminoácido aromático ou um aminoácido alifático neutro comportando de 3 a 4 átomos de carbono e geralmente, como substituinte, um grupo hidroxilo, de preferência aromático, por exemplo fenilalanina, histidina, tirosina, serina ou treonina;

aa^4i:’ representa um aminoácido alifático neutro facu 1 tativamente substituido comportando e 3 a 6 átomos de' carbono ou 1 aminoácido básico, por exemplo alanina,

valina, isoleucina,	g 1 utamina	OU	arg ini na;
m e n representam, cada	um ,	0 ou 1 ;
PP-· e PP4 ,	poden d o	ser	iguais ou	d i feren tes,
representam ambos	1 átomo	de	hi d rogénιo,	ιnd i c ando a

c adeias terminaçâfo do polipéptido ou podem polipeptídicas comportando nâfo mais de um total de 1000 aminoácidos de um modo habitual nâfo mais de um total de

500 aminoácidos, de preferência pelo menos 90Z de aminoácidos, de um modo mais preferencial pelo menos cerca de 95'/. dos aminoácidos presentes, constituem uma das duas cadeias polipeptídicas; em alguns casos a cadeia pode ser de apenas 1 aminoácido e não mais de 100 aminoácidos, !

frequentemente,

de nâfo mais do que 50 aminoácidos, dependendo da utilização do polipéptido e do desempenho da cadeia prolongada; as cadeias polipeptídicas podem estar relacionadas com cadeias po1ipeptídicas de ocorrência natural associadas com factores de cresciqiento de ocorrência natural ou com proteínas de poxvirus ou podem ser muito diferentes das cadeias de ocorrência natural ou seus fragmentos, associados com a cadeia polipeptídica especificamente indicada na fórmula, usualmente sem reiaçâo.

As definições dos aminoácidos sâo indicadas em seguida.

Neutro (Ne) alifático (A1 ) insubstituídos G, A, V, L, I, P substituído ox i S, T tio C , 1*1 amida N, Q aromático (Ar) insubstituído F substituído Y heterocíclico H, W

Com Carga (a pH 6,0) básico (Ba) ácido (Ac)

K, R

D, E

A, V, L, I , Ρ, Μ , F, W

G, S, T, C, Y , N, Q

As abreviaturas entre parêntesis reterem-se a grupos de aminoácidos especiais.

Pela designação insubstituído entende-se a ausência.

de qualquer heterogrupo como substituinte diferente de grupos carboxilo ou amina presentes na glicina. Os aminoácidos são L-aminoácidos de ocorrência natural. Os aminoácidos neutros também podem ser descritos como incluindo grupos representados pelo símbolo R polares ou não polares (mas sem carga). Os aminoácidos que sào abrangidos por esta definição sào os seguintes:

Aminoácidos não polares

Aminoácidos polares

As cisteínas entre as ansas nas posiçbes 2Θ e 37 na forma anteriormente citada, têm de 0 a 1 aminoácidos ácidos (S). Os aminoáçidos que flanqueiam imediatamente as cisteínas pelo lado externo da ansa, isto é, 27 e 30 aminoácidos, podem incluir pelo menos um aminoácido com carga e pelo menos um aminoácido alifático substituído. Dos aminoácidos da ansa (20-37) são aminoácidos alifáticos neutros de 4a 6, frequentemente 5 aminoácidos, e não mais do que 2, habitualmente i, são aminoácidos aromáticos.

Têm especial interesse os compostos em que o polipéptido abrange menos de 130 aminoácidos mais particularmente menos do que 55 aminoácidos mas pelo menos 44 aminoácidos, de preferência pelo menos 53 aminoácidos. De interesse especial são os polipéptidos que incluem de 44 até 00 aminoácidos e seus fragmentos de VGF (aa¹ a aa‘ consu1tar '4

Figura 1 ) .

De preferência aa~' constitui um aminoácido alifático, facultativamente, substituido, de 3 a 6 átomos de carbono, incluindo de 0 a 1 grupo hidroxilo, particu1armente a serina ou a valina; ou um aminoácido aromático, em especial a histidina.

□ aa³⁰ é de preferência a histidina, serina ou um aminoácido alifático insubstituído, comportando de 5 a 6 átomos de carbono, particu 1armente a isoleucina;

o aa³³ é de preferência um aminoácido alifático facultativamente substituido incluindo de 0 a 1 grupo hidroxilo e de 3 a 6 átomos de carbono;

o aa³’ é de preferência um aminoácido alifático, comportando de 3 a 6 átomos de carbono;

o aa^3e ê de preferência a glutamina ou o ácido g1utâmico;

o aa³'*’ é de preferência aromático, de um modo mais conveniente a histidina ou a feni1 a 1anina;

o aa'²*'^:' ê de preferência um aminoácido neutro ou um aminoácido básico.

Tem particular interesse a presença de duas ansas com a ansa no C próximo ligada à segunda ansa em que os aminoácidos da segunda ansa podem variar amplamente. A segunda ansa é composta, de preferência, de cerca de 14 a 16 aminoácidos com a exclusão da ponte cisteína, mais preferencia 1mente de cerca de aminoácidos. Destes aminoácidos de 6 a 9, de preferência de a 9 e de um modo mais conveniente de cerca de Θ, sâfo aminoácidos alifáticos facultativamente substituídos, de preferência nào mais de 3 aminoácidos substituídos, de uma modo mais preferencial de 1 a 2 aminoácidos substituídos; poderão de 2 a 4 aminoácidos aromáticos, mais particu1armente 3 aminoácidos aromáticos, de um modo conveniente a histidina e a tirosina; também poderâfo existir de 2 a 4 aminoácidos, de preferência 3 aminoácidos ácidos, mais particu1armente o ácido aspártico; existirá de 0 a 2, mais habitualmente 1 aminoácido básico, em especial a arginina. De um modo desejável, a cisteína que forma a referida ansa, mais próxima da cisteína da outra ansa, estará separada por 0 a 2, mais frequentemente por

O a 1 aminoácidos, em particular pela arginina.

Tem especial interesse para algumas aplicações dos compostos referidos anteriormente os compostos que apresentam a fórmula geral seguinte:

N

na qua1:

os símbolos de aa-’ até aa'*¹²' têm os significados como definidos antes;

PP¹ e PP⁼ , iguais ou diferentes, podem representar átomos de hidrogénio que indicam a porção terminal do polipéptido em causa ou podem representar polipéptidos comportando um total de aminoácidos até 1000, mais habitua 1mente até cerca de 500 aminoácidos e podem apresentar apenas um total de um aminoácido e individual ou separadamente podem representar polipéptidos de 1 até

100 aminoácidos mais frequentemente de cerca de 1 até 75 aminoácidos, mais particularmente de cerca de 5 até 50 aminoácidos; estes polipéptidos terão aplicações específicas na modificaçâro da sequência especificamente descrita antes para fins pré-determinados ; PP¹ e PP- podem ser iguais ou diferentes dos polipéptidos de poxvirus mas sâTo usualmente diferentes;

aa¹ pode representar qualquer aminoácido, em especial um aminoácido alifático, com carácter básico ou ácido de preferênc i a um aminoácido alifático insubstituido, comportando de 2 a 6 átomos de carbono incluindo glicina, ácido glutâmico ou ácido i 5 i na, leucina, valina, aspártico;

aa’ representa um aminoácido neutro particularmente de 2 a 4 átomos de carbono, mais especia 1mente asparagina, glicina e prolina;

aa⁴ pode representar qualquer aminoácido alifático ou aromático em especial comportando de 2a 6 átomos de carbono, neutro ou ácido, mais especia 1menfe de 3 a 6 átomos de carbono incluindo prolina, ácido aspártico, histidina, serina e leucinaj aa^s representa um aminoácido alifático substituído ácido ou neutro, em particular o ácido glutâmico ou o ácido aspártico ou um aminoácido hidroxi substituído comportando de 3 a 4 átomos de carbono, mais particu1armente serina;

aa* representa um aminoácido alifático insubstituído comportando de 2 a 6, usualmente de 2a 3 átomos de carbono, ou um aminoácido aromático em especial glicina, histidina ou tirosina;

aa⁷ representa um aminoácido neutro, básico ou ácido, em especial de 3 a 6 átomos de carbono, tais como o ácido glutâmico, o ácido aspártico, a lisina e a treonina;

aa® representa um aminoácido alifático insubstituído de 2 a 3 átomos de carbono ou um aminoácido substituído apresentando como substituinte um grupo carboxamida de 4 a átomos de carbono, por exemplo asparagina, glutamina ou g1ic ina;

aa¹¹ representa um aminoácido neutro alifático ou aromático, mais especia 1mente alifático, particu 1armente de 5 a 6 átomos de carbono, mais particularmente a leucina ou a feni1 a 1anina;

aa¹¹ representa um aminoácido aromático ou aminoácido alifático carboxamida substituído comportando de 4 a 5 átomos de carbono, particu1armente a histidina ou a asparagina;

1Θ aa¹²· representa um aminoâcido neutro ou um aminoácido ácido mais particu1armente a glicina, a asparagina ou o ácido aspárticoj aa¹⁴ representa um aminoácido neutro ou ácido,' alifático, facultativamente substituído com 4 a 5 átomos de carbono, comportando de 0 a 1 grupo hidroxilo, par ticu 1 armen te o ácido aspártico, a treomna ou a valinaj aa¹⁰ representa uma ligação ou um aminoácido alifático básico ou neutro facultativamente substituído, comportando de 4 a 6 átomos de carbono, em especial a isoleucina, a arginina ou a metionina;

Arrepresenta um aminoácido aromático que pode comportar um núcleo carboxílico ou heterocíc1ico e nos quais se incluem a histidina, a fenilalanina ou a t i rosina;

aa¹⁷’’*· representa um aminoácido alifático neutro, facultativamente substituído com 3 a 6 átomos de carbono, habitua 1mente com 3 a 5 átomos de carbono, comportando de a 1 grupo hidroxilo e incluindo a valina, a leucina, a isoleucina e a treonina;

aaⁱ⁷° representa um aminoácido neutro insubstituído com 5 a 6 átomos de carbono ou um aminoácido ácido, em especial a valina, isoleucina ou o ácido glutámico;

aa^ie representa um aminoácido alifático neutro facu 1tativamente substituído, comportando de 2 a 6 átomos, de preferência de 3 a 6 átomos de carbono e de 0 a i grupo hidroxilo substituinte, em particular a alanina, a serina ou a g 1utamina;

aa¹’ representa qualquer aminoácido em especial um aminoácido básico ou ácido, mais particu1armente com 4 a 6 átomos de carbono, de preferência com 5 a 6 átomos de carbono, em especial a arginina, a leucina, a valma e o ácido glutâmico;

aa ^{= ,;}' representa -um aminoácido ácido ou um aminoácido alifático carboxamida substituído, e inclui o ácido aspártico, a asparagina, o ácido glutâmico ou a glutamina.

aa¹¹ representa um aminoácido alifático insubstituído neutro ou um aminoácido básico com 3 a 6 átomos de carbono e 0 a 1 grupo hidroxilo ou carboxamida em que se incluem a isoleucina, a leucina, a asparagina, a serina, a treonina, a lisina e a arginina;

aa*⁼ representa uma ligação ou um aminoácido ácido que é o ácido aspártico ou o ácido glutâmico ou um aminoácido neutro em particular a valina;

aa**· representa um aminoácido alifático neutro comportando de O a 1 grupo hidroxilo, em particular um grupo hidroxilo mais especialmente a serina;

aa*^2b representa um aminoácido alifático neutro comportando de 4 a 6 átomos de carbono, em particular a leucina ou a isoleucina;

aa*-' representa uma ligaçào ou um aminoácido neutro, alifático, facultativamente substituído, comportando de 2 a 6 átomos de carbono e de O a 1 grupo hidroxilo substituinte incluindo a glicina, a serina, a treonina e a

- 20 1

asparagina;

aa⁼⁴ representa um aminoácido alifático, particularmente tio-substituído, mais particu1armente a metionina, a prolina ou um aminoácido aromático em particular a tirosina;

aa⁴ⁱ representa um aminoácido alifático facultativamente substituído, neutro, ou ácido de 4a 6 átomos de carbono, em particular a valina, a asparagina ou o ácido aspártico;

aa⁴³ representa um aminoácido alifático neutro ácido ou básico facultativamente substituído, comportando de 4 a átomos de carbono e inclui a valina, a leucina, a isoleucina, a arginina, a lisina e o ácido aa⁴⁴ pode representar gualquei particu1armente um aminoácido diferente do aminoácido básico ou pode ser um aminoácido ácido neutro ou aromático comportando de 3 a 6 átomos de carbono quando é um aminoácido nào aromático, em particular o ácido aspártico, a alanina, a leucina, o triptofano ou a treonina; e p representa o número 0 ou 1.

Tem particular interesse o símbolo PP¹ quando representa a sequência seguinte:

PP¹'-âa-²4_âa-23__aa-22__aa-21__aa-20_aa-19__aa-18

-aa^-aa’^-aa'^-aa~¹⁴-aa^_^-aâ^_12-dd’¹¹ aa aa aa aa aa aa aa aa aa dd na qua1:

ami noác ido,

PP¹- ' considerado em conjunto com os aminoácidos subsequentes tem, na sequência anterior, os significados equivalentes aos significados definidos para PP¹. A sequência anterior é abrangida pela definição do símbolo PP¹; PP¹' pode representar um átomo de hidrogénio ou uma sequência de aminoácidos. Um ou mais dos aminoácidossimbo1izados por aa^_K (x representa qualquer número) pode representar uma ligação de modo a reduzir o número de aminoácidos da cadeia de N-terminal. Portanto, pode estar presente toda ou uma parte da sequência de aminoácidos citada antes. Quando está presente uma fracçâo da sequência, de preferência a sequência abrange aminoácidos contíguos, isto é, os aminoácidos na sua ordem numérica isenta de delecçbes. Habitua 1mente comportará pelo menos um aminoácido, mais habitua 1mente pelo menos três, de um modo mais conveniente pelo menos 6, e que os aminoácidos restantes a montante podem faltar, de tal modo que PP¹ possa apresentar-se ligado a aa^_1 ou a aa~ idêntico;

aa^_1 pode representar qualquer aminoácido, particular um aminoácido alifático, comportando 3 a 6 átomos de carbono, de preferência neutro ou básico, incluindo mais especia 1mente a lisina, a arginina, a prolina, a asparagina ou a serina;

aa^_- pode representar qualquer aminoácido alifático ou aromático, especia 1mente alifático, mais especιa 1mente comportando de 3 a 6 átomos de carbono;

ou em aa^-* pode representar qualquer aminoácido alifâtico ou aromático, par ticu 1 armen te alifâtico polar ou nâfo polar com 2 a 6 átomos de carbono, mais habitua 1mente com 2 a 5 átomos de carbono e geralmente incluindo de 0 a 1 grupo hidroxilo substituinte;

aa⁴ pode representar qualquer aminoácido alifâtico neutro ou básico comportando geralmente de 3 a 6 átomos de carbono, usualmente de 5 a 6 átomos de carbono em especial a asparagina, a prolina ou a lisina;

aa pode representar qualquer aminoácido alifâtico em particular neutro, comportando de um modo geral 3a 6 átomos de carbono, especia 1mente a valina ou a isoleucina;

aa* representa um aminoácido neutro ou ácido que quando é um ácidD alifâtico comporta de 3 a 6 átomos de carbono, mais usualmente 4 a 6 átomos de carbono, mais especia 1mente a isoleucina, a valina ou o ácido aspárticoj aa' aa' aa' aa' aa aa aa' aa aa' aa' representam, cada um, átomos de aminoácidos alifáticos comportando de 3a 6 carbono polares ou não polares, em especial polares, com 0 a 1 grupo hidroxilo substituinte ou aromático;

aa^-1'^:‘ e aa*° representam cada um, aminoácidos alifáticos nâfo polares ou aminoácidos ácidos com 2 a 6 átomos de carbono, mais habitua 1mente com 2 a 3 átomos de carbono;

aa aminoácidos a) i ^——⁴ representam cada um, polares ou ácidos comportando de 4 ââ~ a 6 átomos de carbono especia 1mente incluindo um grupo carboxamida substituinte;

aa' e aa' representam aminoácidos alifáticos polares ou nâfo polares ou aminoácidos ácidos.

Tem particular interesse um fragmento N-terminal representado por desde aa^-1 até aa^_~^A ou de aa^-i até aa⁷, mais particularmente de aa^-1 até aa~^&. PP·¹·· pode representar, de um modo conveniente, uma sequência de aminoácidos nào relacionados que pode servir como uma proteína de fusão, espec i a 1 men te para proporcionar um péptido imunogénico para a produção de anticorpos para o composto.

□s aspectos principais das composições referidas são a sequência desde aa^=s até aa^4,;', espec i a 1 men te a sequência desde a cisteina na posição 2Θ até á cisteína na posição 37 e as ansas geradas pelas cisteínas nas posições 2 e 10 e as cisteínas nas posições 15 e 26. Desejavelmente as composições em referência exibem a ansa formada pelas cisteínas nas posições 2Θ e 27 em conjunto com a ansa originada pelos grupos cisteínas nas posições 15 e 26. As sequências po1ιpeptídícas quiméricas podem ser preparadas por associação de fragmentos de vários polipéptidos incorporando uma sequência, substancialmente idêntica às cadeias polipeptídicas de ocorrência natural, associadas com factores do crescimento de ocorrência natural e com proteínas de poxvirus. Os polipéptidos quiméricos resultantes, comportarão de cerca de 40 até 65 aminoácidos, usualmente de cerca de 45 até 60 aminoácidos, em especial de 49 a 53 aminoácidos. Em cada caso a estrutura de apoio dos grupos

I cisteína é mantida pelas pontes de cisteína que definem as ansas das dimensões descritas anteriormente. Portanto pode ser utilizado um fragmento de qualquer factor de crescimento que apresente uma homologia substancial com VGF (ver, por exemplo, a Figura 1), ou com outro factor de crescimento comportando a mesma cadeia estrutural das composições citadas antes e actividade fisiológica idêntica, independentemente da fonte de mamífero, tais como os primatas, por exemplo seres humanos, roedores, por exemplo ratos ou murganhos, bovinos, aves, porcinos, etc. .

Podem ser necessárias três ligações dependendo da fonte e dos fragmentos e do comprimento do polipéptido desejado. Convenientemente as ligações poderão realizar-se em qualquer sítio entre aa^-* e aa¹; aa¹¹ e aa¹®; aa²’ e aa²’; e aa⁴² e aa°³. A sequência entre cerca de aa* e cerca de aa¹’ é referida como a sequência N-terminal; a sequência entre cerca de aa¹⁴ e cerca de aa³’ é referida como o fragmento centralj e a sequência entre cerca de aa²’ e a extremidade do péptido (geralmente de aa⁴⁴ até aa⁴⁷) é referida como domínio C-terminal. 0 ponto exacto da ligação poderá variar dependendo da localização dos sítios de restrição, etc.. Além disso, uma sequência de um extremo N-terminal compreendendo-se desde cerca de aa~²⁴ até aa^-7, mais frequentemente desde aa^-3- até aa^-7 também pode ser ligada ao polipéptido quimérico.

De um modo geral os fragmentos serão desde cerca de a 50, usualmente desde 15 a 45 aminoácidos, uma vez que o aa³° não se estende até ao aminoácido vigésimo primeiro do

composto mas apenas á sequência específica que especificamente fora definida (ver Figura 1).

Nos genes sintéticos, estão designados sítios de restrição diversos, convenientes utilizados para construir os polipéptidos quiméricos. Quando possível os sítios de restrição deixam a sequência de aminoácidos do gene do factor de crescimento inalterada. Contudo, em alguns casos, a incorporação de novos sítios de restrição conduz a uma sequência de aminoácidos alterada. Tem particular interesse a sequência codificadora para VGF ser modificada para introduzir um sítio de restrição Kpnl, por alteração da sequência de aminoácidos em aa¹' atê aa¹’, de GDC até GTC e para introduzir um sítio Sph I em aa-³ até aa-^e, mediante alteração da sequência GMVCRC para GYACVC. Estas alterações fornecem sítios convenientes para a ligação de fragmentos do gênero VGF, a fragmentos de outros factores de crescimento. Por exemplo, o fragmento do gene de aa-* até aa⁴⁷, pode ser unido, de um modo conveniente, a um fragmento do gene de α-TGF que codifica os aminoácidos correspondentes aos restos aa^-<±> até aa*⁵, para produzir um polipéptido híbrido TGF/VGF. Deste modo, a sequência do péptido quimérico compreenderá de aa^-* até aa¹³ (N-terminal) e de aa¹⁴ até aa*⁵ (fragmento central) derivada de a TGF, e da aa-* até aa⁴⁷ (C-terminal) derivada de VGF, modificado como citado antes.

Na secção experimental está descrita, em pormenoç a preparação de plasmídeos capazes de exprimir em proteínas quiméricas incorporando sequências de aminoácidos derivadas de

- 26 fragmentos de mais de um factor de crescimento ou de polipéptidos de poxvirus, com alterações de sequência onde é necessário introduzir um sítio de restrição conveniente.

Também podem ser preparadas proteínas de fusâro onde é expresso um factor de crescimento ou um polipéptido quimérico, ligadas aos aminoácidos de N-terminal de uma sequência de sinal ou aos aminoácidos de N-terminal de uma bactéria, de um bacteriófago ou de um gene eucariútico altamente expresso. Além disso pode ser proporcionado um sítio de cisâO química ou enzimática, a seguir à sequência líder, para fornecer a separação do polipèptido maduro da sequência líder estes preparaç âfo de plasmídeos capazes de exprimirem polipéptidos de fusâío e métodos para a separação e isolamento do polipèptido desejado estão descritos em pormenor na secção experimental.

Preparação de Factores de Crescimento

As composições, citadas antes, podem ser preparadas por diversas vias que dependem da dimensão da composição.

Especia 1mente abaixo de cerca de Θ0, mais particularmente abaixo de cerca de 60 aminoácidos, a composição pode ser preparada por síntese de acordo com vias convencionais.

Consultar, por exemplo, Merrifield, Solid-Phase Peptide

Synthesis, The Peptides Analysis, Syntesis Biology, Special

Methods in Peptide Synthesis, Part A, Vol. 2, Gross and

Meinhofer eds., Academic Press, NY , pp. 1-2B4, 1980. Consultar ainda a patente de invenção norte americana NQ . 4 j.27 526.

Alternativamente, a utilização de tecnologia de DNA híbrido pode ser utilizada quando se podem manipular sequências de DNA que codificam para o polipéptido ou um seu precursor desejado. As sequências de DNA que codificam o factor de crescimento em causa podem ser sintetizadas utilizando técnicas convencionais tal como a sobreposição de cadeias simples que podem ser ligadas conjuntamente para definir a sequência codificadora desejada. Os terminais podem ser designados para proporcionar sítios de restrição em uma ou em ambos os terminais que podem ser tornados coincidentes para ligação com extremidades comp1ementares do vector de expressão. Para a expressão da sequência é fornecida uma metionina inicial. Ds vectores de expressão são, de um modo geral, comerc1 a 1izados e estão amplamente descritos na bib1iografia.

Em vez de se sintetizar o gene de interesse o gene de factor de crescimento pode ser isolado mediante a aplicação de diversas técnicas. Por exemplo, quando o factor de crescimento consiste num factor de crescimento virai, o mRNA pode ser isolado do vírus que codifica para o polipéptido que inclui o factor de crescimento, o mRNA inverso transcrito, a cadeia simples de DNA resultante ( ss ) utilizada como matriz para preparar DNA de cadeia dupla (ds), e isolar o gene de DNA ds.

Outra técnica, consiste em isolar uma porção de DNA virai e utilizando-se uma sonda, degenerada de um modo adequado que compreende uma região das sequências mais conservadas num gene de factor de crescimento, identifiçando as sequências que codificam um factor no genoma virai. A sonda pode ser conside20 ravelmente menor do que a sequência completa, mas tem que comportar pelo menos 10, de preferência, pelo menos 14, mais preferencialmente pelo menos 20 nucleótidos de comprimento.

Também são utilizáveis oligonucleótidos maiores, até ao comprimento completo, do gene do factor de crescimento. Podem-se utilizar quer sondas de DNA quer sondas de RNA.

Na sua utilização, as sondas são tipicamente marcadas de um modo detectável, por exemplo, com ³⁼P ou nucleótidos biotinilados e são incubadas com DNA de cadeia simples ou RNA proveniente do organismo do qual um gene se pretende. A hibridação é detectada por meio do marcador, após se ter separado o DNA (ou DNA/RNA) de cadeia simples e cadeia dupla (hibridado), utilizando-se, tipicamente, papel de nitrocelulose. As técnicas de hibridação apropriadas para a utilização com oligonucleótidos são bem familiares dos técnicos nesta ma tér i a.

Ainda que as sondas sejam, normalmente, utilizadas com um marcador detectável que permite a identificação fácil, também são utilizáveis oligonucleótidos não marcados, como precursores de sondas, marcadas ou para utilização em métodos que proporcionam a detecção directa de DNA de cadeia dupla (ou

DNA/RNA). Deste modo o termo o 1igonuc1eótido refere-se a formas quer marcadas quer não marcadas.

Uma vez obtida a sequência de DNA desejada, esta pode ser, em seguida, manipulada de diversas formas para proporcionar a expressão; por exemplo, sequências polipeptídicas quiméricas podem ser preparadas mediante <

i associação de fragmentos genéticos de pelo menos dois polipéptidos que apresentam as sequências que exibem pelo menos mais de 30'/. de homologia com os factores de crescimento de ocorrência natural que se ligam aos receptores de EGF (ligandos naturais). É muito desejável que a estrutura tridimensional, especialmente a estrutura em ansa, do polipéptido seja mantida, particu 1armente aquela fracção(ftes) da estrutura que pode ser responsável pela ligaçâfo com o receptor de EGF e pela actividade biológica de factores de crescimento de ocorrência natural que se ligam aos receptores de EGF.

Dependendo da fonte dos fragmentos e do comprimento do polipéptido desej ado, podem ser designados sítios de restrição convenientes nos genes sintéticos, utilizados para construir polipéptidos quiméricos, como descrito antes. Quando possível, o(s) sítio(s) de restrição deixa a sequência de aminoácidos do polipéptido inalterada. Contudo, em alguns casos, a incorporação de um(s) sítio(s) de restrição pode gerar uma sequência de aminoácidos alterada, actividade da proteína.

Quando o gene se destina a hospedeiro que reconhece as regiões reguladoras da transcrição e da traduçâfo, de tipo selvagem, do factor de crescimento, o gene inteiro com as suas regiões reguladoras 5' e 3 do tipo selvagem, pode ser introduzido num vector de expressão apropriado. Existem vários vectores de expressão que utilizam sistemas de replicaçâfo provenientes de vírus de mamíferos tais sem alteração da ser expresso como o Vírus 40 de Símio, o adenovirus, o vírus do papiloma bovino, o vírus da vaccinia, o baculovirus de insectos, etc..

Estes sistemas de replicação têm sido desenvolvidos para fornecer marcadores que permitem a selecção de assim como para proporcionarem sítios de convenientes, em que um gene possa ser inserido.

Quando o gene se destina a ser expresso num hospedeiro que· não reconhece as regiões reguladoras, da transcrição e da tradução do tipo selvagem, é necessária maior manipulação. De um modo conveniente, pode ser inserida a jusante dos codôes de paragem uma variedade de regiões reguladoras da transerição-3' conhecidas. A região 5', não codificadora, a montante do gene em causa pode ser removida por endonuclease de restrição, re-secçào de Ba 131 ou outro método.

Alternativamente, quando está presente um sítio de restrição conveniente perto do terminal 5' do gene em causa este gene pode ser limitado e utilizado um adaptador para ligação do gene citado à região promotora, onde o adaptador proporciona os nucleótidos perdidos do gene. Podem ser utilizadas diversas estratégias para proporcionarem uma cassette de expressão que possui uma região reguladora transc ric ιona 1 na direcção 5 ' -*3 ' da transcrição e uma região iniciadora da tradução que pode também incluir sequências reguladoras que permitem a indução de regulação, o gene em causa, sob o controlo de transcrição e tradução da região de iniciação e a região de terminação da restr içâfo, transcrição e tradução.

A escolha das sequências reguladoras apropriadas terá que considerar os seguintes factores, que afectam a expressão.

Em termos de regulação da transcrição, a quantidade e a estabilidade do RNA mensageiro são factores importantes que influenciam a expressão dos produtos genéticos. A quantidade de mRNA é determinada pelo número de cópias do gene especial, a eficiência relativa do seu promotor e os factores que regulam o promotor, tais como os agentes reforçadores e os repressores. A iniciação considera-se que ocorre na região exactamente a montante do início da sequência codificadora, abrange promotor das células sequências nuc1eotídicas que podem afectar a eficácia da transcrição. As sequências incluem as regióes reguladoras até cerca de -35 e -10 nucleótidos desde o início da cadeia de DNA.

Os promotores eficazes incluem aqueles em que a sequência nucleótidica das regiftes reguladoras de -35 e -10 é substancia 1mente idêntica às sequências de consensos para estas regióes nos promotores bacterianos de genes altamente eficazes.

De um modo geral, estas regiões incluem cerca de 5 nucleótidos e 6 nucleótidos, respectivamente, no seu comprimento e cada sequência pode variar de cerca de i nucleótido em comprimento e/ou em sequência. Uma sequência preferida para a sequência reguladora de consenso -35 è a do promotor trp, designadamente

TGACA, e a sequência reguladora de consenso -10, é proveniente do promotor 1ac, nomeadamente TATAAT.

Nâfo somente as sequências nucleotídicas mas também as sequências espaçadoras e de consensos das regiões reguladoras

-35 e -10 rei ativamente uma à outra sâfo importantes para a obtenção de transcrição óptima do gene de interesse.

Geralmente, as sequências de consensos das regiões reguladoras

-35 e -10 sâfo separadas por cerca de 16 a 1B nucleótidos, de preferência por cerca de 17 nucleótidos. Cada sequência pode variar de cerca de i nucleótido.

Regiões reguladoras transericionais ilustrativas ou promotoras incluem, para bactérias, o promotor (3-gal, os promotores lambda esquerdo é direito, os promotores trp e lac, o promotor de fusão trp-lac, et.; os promotores sintéticos, que comportam sequências, substancialmente idênticas a estas sequências também podem ser utilizados. Um promotor preferido para bactérias consiste num promotor de fusão que comporta a região reguladora -35 do promotor trp e a região reguladora -10.

do promotor lac. Mais preferencia 1 , é o promotor em que a sequência de consensos trp -35 está localizada cerca de 17 nucleótidos a montante da sequência de consenso -10 lac; para leveduras, promotores de enzimas glicolíticos.

tais como os promotores ADH-I e ADH-II, o promotor GPK e o promotor PGI, o promotor trp, etc.; para células de mamífero, os promotores

S040 próximo e afastado, os promotores afastados principais do adenovirus, o promotor 15 ou as sequências reforçadoras e i dên ti c os.

A região reguladora transericiona1 ppde incluir, adiciona1mente, sequências reguladoras que permitem modular o tempo de expressão do gene de interesse, por exemplo, por meio da presença ou ausência de nutrientes ou de produtos de expressão no meio de desenvolvimento, temperatura, etc.. Por exemplo, a expressão do gene em causa pode ser regulada pela temperatura do meio de crescimento da célula hospedeira, mediante inclusão de uma sequência reguladora que inclua o promotor P_L do bacteriófago lambda, o operador 0i_ do bacteriófago lambda e o gene CI057 que codifica para o repressor Cj sensível à temperatura no vector de expressão.

Assim, poderá permitir a regulação do promotor por acção entre o repressor e o operador, a baixas temperaturas, por exemplo, a cerca de 30°C. 0 aumento da temperatura para cerca de 42°C o repressor e permitiria a expressão do gene em c ausa.

Como um exemplo de modulação que utiliza nutrientes do meio de crescimento, a regulação do promotor 1ac ou do promotor híbrido trp-lac pode ser realizada mediante utilização do gene para o repressor Lac1 que se liga à região promotora lac a jusante da região reguladora -10. □ gene do repressor

LacI pode estar presente num epissoma, de preferência um mutante Lac1 reforçado ou pode ser incluído ele próprio numa cassette de expressão. A presença de uma concentração significativa da molécula do repressor no meio de desenvolvimento inibe a função do promotor na ausência de indutores. Portanto a adição de IPTG ou lactose ao meio de desenvolvimento da célula hospedeira reforça a função promotora. Quando uma estirpe bacteriana é Lac, pode utilizar34

-se lactose como indutor em substituição de IPTG. Nos sistemas eucarióticos e procarióticos as regiftes de terminação podem ainda conter sequências ou estruturas que aumentam a estabilidade das espécies de mRNA e permitem uma expressão mais elevada. Assim, a regiâfo reguladora transe ric iona 1 pode, adicionalmente, incluir sequências reguladoras que terminam a transcrição e que proporcionam sequências ou estruturas que inibem a degradação do mRNA e deste modo aumentam a estabilidade das espécies de mRNA e permitem uma expressão mais elevada. Sâío conhecidos diversos exemplos de sequências procarióticas, por exemplo o terminador Trp, o terminador do gene 32(T4), ou os terminadores sintéticos que são idênticos na sequência ao gene 32.

Nos sistemas eucarióticos são necessárias as regibes de terminação da transcrição, de cisão de RNA e de pol iadeni 1 açâfo de RNA promoverem a maturação adequada para as transcrições de mRNA e expressão eficaz. A região não traduzida

3' natural pode ser suficiente mas também pode ser utilizado o sinal de ρο1iadeni1 ação, por exemplo o SV40, particu1 armente incluindo um sítio de excisâfo que. proporciona uma expressão mais eficaz,. De um modo alternativo a região não traduzida 3' derivada de um gene altamente expresso num tipo de célula especial, por exemplo, Ig em célula de mieloma, pode ser fundida com o gene de interesse. Estas sequências 3' podem ser emparelhadas com sequências reguladoras 5 'do mesmo gene altamente expresso e podem ainda incluir regiões çodιfιcadoras na cadeia de leitura para gerar proteínas de fusão como descrito posteriormente.

Em termos de regulação da transcrição, dada a presença de mRNA, a expressão pode ser regulada mediante influência da velocidade de iniciação (ligação ribossómica ao mRNA), a taxa de enlongação (trans1ocaçâo do ribossoma através do mRNA), a taxa de modificações post-tradução e a estabilidade do produto genético. A taxa de enlongação é provável mente afectada pelo uso do codão; o uso de cod&es para tRNAs raros pode reduzir a velocidade da tradução. É portanto preferível utilizar codòes que frequentemente aparecem em genes geralmente expressos pela célula hospedeira para aumentar a taxa de tradução.

Nos as regibes a jusante das regibes reguladoras -35 e -10 é uma sequência nucleôtidica de consenso, geralmente AGGA, designada por sequência de Shine-Da1garno que se considera estar relacionada com a ligação ribossómica. A ligação ribossómica óptima e a iniciação da tradução pode ser obtida mediante utilização de um sítio de ligação ribossómica funcional na célula hospedeira de um gene altamente expresso.

Os factos também apontam para sequências nuc1eotídicas que rodeiam a sequência de Shine-Da1garno e sequências com a região codificadora que pode afectar a ligação ribossómica possivelmente mediante a formação de motivos estruturais através dos quais o ribossoma reconhece o sítio de iniciação.

A alteração de sequências nucleotídicas da região codificadora, portanto, pode ser utilizada para se obter uma ligação e iniciação óptimas da tradução. A sequência dos

Ν primeiros cerca de 7 a 30 codões após d codào de iniciação ATG também pode afectar a ligação e a expressão. De preferência a sequência líder e a sequência de Shine-Da1garno são obtidas a partir do mesmo gene ou, quando estas são obtidas de genes diferentes os codftes da sequência líder podem ser modificados utilizando-se a degeneração de codão para aproximar a sequência nucleótidica do gene natural que segue a sequência líder como descrito no pedido de patente de invenção norte americana copendente série número 264 09Θ , requerido em 2Θ de Outubro de

19ΒΘ cuja descrição é incorporada aqui por referência.

A posição da sequência AGGA re1ativamente ao codão de iniciação ATG pode influenciar a expressão. Geralmente a sequência de Shine-Da1garno está localizada cerca de 5 a 9 nucleótidos do codão de iniciação ainda que inesperadamente possam ser obtidos níveis de expressão elevados utilizando-se cassettes de expressão em que a sequência Shine-Da1garno está localizada cerca de 10 a 13 nucleótidos de preferência 11 a 12 nucleótidos do codão de iniciação.

A estabilidade do mRNA é orientada pela sua susceptibi1 idade às enzimas ribonuc1eases. Em geral a digestão por exonuclease é inibida pela presença de motivos estruturais nas extremidades do mRNA; as estruturas pa1indrómicas, os nucleótidos alterados ou os nucleótidos específicos. A digestão por endonuclease considera-se ocorrer em sitios de reconhecimento específicos do mRNA e o mRNA estável poderá nào apresentar estes sítios. Também existem algumas provas de que os mRNAs sob elevados níveis de tradução também são protegidos da degradação pela presença de ribossomas no mRNA.

A estabilidade do produto de expressão pode ser obtida proporcionando a síntese de uma proteína de fusão em que o polipéptido desejado é expresso conjuntamente com um segundo polipéptido ou com um seu fragmento. De preferência a estabi1 idade do produto de expressão é obtida proporcionando-se a síntese de uma proteína de fusão em que o polipéptido em causa é expresso conjuntamente com uma sequência líder. Uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos de ou bac teriano um gene

N-terminal de,' por exemplo, bacteriofágico altamente expresso tal como o gene da proteína do bacteriófago lambda-N, o gene cro ou de (3-ga 1 ac toc idase ou um gene eucariútico é unido a montante de e na cadeia de leitura com o gene em causa. A sequência líder habitua 1 mente inclui entre cerca de Θ a cerca de 50 de preferência entre cerca de 15 a cerca de 45, mais preferencia 1mente 1B a 25 aminoácidos no N-terminal.

A expressão do polipéptido em causa sob a forma de uma proteína fundida com uma sequência líder de outro gene tem diversas vantagens além de promover a estabilidade. Por exemplo, a presença de aminoácidos N-terminal proporciona um meio para a utilização de técnicas de purificação gerais para a purificação de qualquer variedade de polιpêptidos. Por exemplo, os aminoácidos de N-terminal da N-proteína são particularmente antigénicos e portanto os anticorpos específicos originados contra os aminoácidos de N-terminal da

N-proteína podem ser utilizados como um meio de purificação de

- 3B proteínas de fusão contendo o N-terminal da N-proteína. Além disso o N-terminal da N-proteína tem uma carga positiva elevada por f ac i1i ta que a purificação da proteína desejada cromatografia de permuta iónica ou outra.

A sequência líder também pode ser uma sequência de aminoácidos hidrofóbica que pode ainda funcionar como uma sequência de sinal para a secreção. Uma sequência de DNA que codifica a sequência do sinal é ligada a montante de e na cadeia de leitura com o gene em causa. Tipicamente a sequência sinal inclui um sítio de separação que ê reconhecido por uma peptidase de sequência de sinal. Assim, o posicionamento do polipéptido em causa directamente após o sítio de cisâfo da sequência de sinal permitirá este polipéptido de ser cindido especificamente da sequência sinal e segregado sob a forma de um polipéptido maduro.

Exemplos de sequências de aminoácidos hidrofóbicas incluem a sequência de sinal da fosfatase alcalina bacteriana, a sequência de sinal OMP-A-B-C-D-E ou F, a sequência de sinal

LPP, a sequência de sinal de Í3~lactamase e as sequências de sinal de toxina e seus mutantes. Para células eucarióticas as sequências de sinal podem incluir a sequência de sinal proveniente do gene P97 de TGF-f3 de símio (antigénio de melanona humano) a sequência de toxina assassina de K lactis e o factor de tipo α-empare1hamento e outras sequências de sinal de toxinas assassinas ou sequências de sinal normais associadas com o gene em causa conjuntamente com mutantes de qequências de sina 1 .

Outras sequências líder que podem ser utilizadas incluem sequências hidrofí1icas, por exemplo restos de 41 aminoácidos de proporcionar a anfirregulina que pode função do polipéptido com

N-terminal da modificação da

Além disso pode ser ligado um agente citotóxico tal como um fragmento de a cadeia A de toxina, a cadeia A de ricina, um péptido que detém o desenvolvimento de veneno de serpente ou uma molécula alvejada tal como uma hormona ou um anticorpo, de um modo co-valente com uma sequência líder que na maior parte dos casos afecta minimamente a actividade biológica do produto genético em causa. Como descrito para outras sequências líder a sequência de DNA que codifica a sequência líder é ligada a montante de e na cadeia de leitura com o gene de interesse.

Quando a sequência líder não constitui uma sequência sinal ou nâfo contém um sítio de clivagem natural conveniente, podem ser inseridos mais aminoácidos que fornecem um sítio de clivagem quimica ou enzimática para a separação do péptido líder, seguida de purificação da proteína de fusão para permitir a subsequente purificaçâro do polipéptido maduro. Por exemplo, a introduçâfo de ligações aspa r t i 1 — pr o 1 i na lábeis ao meio ácido entre dois segmentos da proteína de fusão facilita a sua separação a um valor pH baixo. Este método não é apropriado se o polipéptido que se procura é lábil ou ácido. Como um outro exemplo, a proteína de fusão pode ser separada com, por exemplo, brometo de cianogènio que é específica para o carboxilo lateral dos restos de metionina. 0 posicionamento de uma metionina entre a sequência líder e o polipéptido procurado permite a libertação deste polipéptido. Este método não é apropriado quando o polipéptido desejado contém restos de metionina.

Quando a sequência líder comporta uma sequência de sinal, podem ser expressos os genes de interesse com as sequências líder secretoras com ou isentas da sequência líder sob condições em que a sequência pode ser mantida ou separada. Além disso para se obter uma proporção elevada do polipéptido desejado sob a forma madura, separado e péptido de esÇrutura em pregas segregado no meio é preferível utilizar um promotor tal como o promotor tac que pode operar a uma temperatura menor, por exemplo a cerca de 30°C. Inesperadamente, níveis mais altos de secreção podem ser obtidos a temperaturas menores. Níveis de expressão extremamente elevados podem obstar à ocorrência de modificações de tradução totais de proteína, que resultem na agregação e acumulação do precursor nào separado (isto é, proteína estrutural e líder secretora). Identicamente o desenvolvimento a temperaturas elevadas, por exemplo à temperatura de 42°C, também tende para resultar na agregação e acumulação do precursor não separado. A preparação de proteínas fundidas que incluem métodos de separação e de pregueamento do polipèptido de interesse estão ainda descritos no pedido de patente de invenção norte americano co-pendente com o número de série 264

098 supra

Após cada manipulação do DNA no desenvolvimento da cassette o plasmideo serà clonado e isolado como apropriado, o componente da cassettes particular analisado assim como a sua sequência para assegurar que a sequência apropriada foi a obtida. Dependente da natureza da manipulação a sequência desejada pode ser excisada do plasmideo e introduzida num vector diferente ou o plasmideo pode ser restringido e o componente da cassette de expressão manipulado de um modo adequado. Em alguns casos um vector shuttle pode ser utilizado sendo o vector capaz de replicaçâo em diferentes hospedeiros que requerem sistemas diferentes de replicaçào. Isto pode ou não requerer marcadores adicionais que são funcionais nos dois hospedeiros. Quando são necessários, esses marcadores podem ser incluídos no vector.

plasmideo que contém a cassette, os dois sistemas de replicaçào e o marcador (es) pode ser transferido de um hospedeiro para outro como necessário. Para a selecção pode ser utilizado qualquer marcador aplicável. Têm interesse a resistência à neomicina ou à tetracic1ina. Contudo, ainda que um marcador para selecção seja muito desejável e conveniente, têm sido descritos outros processos para a sondagem das células transformadas. Consultar por exemplo G. Reipin, et a 1 . . Current

Genetics, 189-193, 19B2. As células transformadas também podem ser sondadas pelos produtos específicos que fabricam, por exemplo, a síntese do produto desejado pode ser determinada por métodos imunológicos ou enzimáticos.

A cassete de expressão pode ser incluída num sistema de replicaçào para manutenção do epissoma num hospedeiro celular apropriado ou pode ser proporcionada sem um sistema de replicação onde esta pode integrar-se no genoma do hospedeiro.

□ DNA pode ser introduzido no hospedeiro de acordo com técnicas conhecidas tais como a transformação, utilizando-se DNA precipitado com sulfato de cálcio, transfecçâo mediante contacto das células com o vírus, microinjecçào do DNA nas células e outros.

Logo que o gene de interesse tenha sido introduzido no hospedeiro apropriado, o hospedeiro pode desenvolver-se para exprimir o gene em causa.

Podem ser utilizadas diversas células hospedeiras. Os

exemplos de células hospedeiras procariótic	; as ίnc1uem
organismos aram neqativos tais como a E. Coli,	por exemplo

JN109, JM1O1 e JM1O7, HbiOl, DH1 ou DH5. São partieularmente

apropriados organismos gram positivos tais como B.	subti1i s que
não possuem espaço perip1asmático e podem segregar	d i rec tamen te
polipéptidos no meio de crescimento. Células	hospedei ras
eucarióticas podem incluir as células de levedura,	c é1u1 as de

insecto e células de mamífero, por exemplo, as células COS, as células CHO, as células de nm de macaco e as células do bicho da seda (sf9).

A construção gue contém o gene de interesse e as

regiões f1anqueadoras que proporcionam a regulação	da expressão
podem ser introduzidas na hospedeira de expressão	por qual quer
meio apropriado, por exemplo, transformação, como	por exemp1 o,

DNA precipitado com fosfato de cálcio, transfecçâo, transducçào, conjugação, microinjecção, etc.. 0 hospedeiro pode em seguida desenvolver-se a uma densidade elevada num meio nutriente apropriado. Quando o promotor ê um promotor índu43 zível, serão então utilizadas condições permissivas, por exemplo, alteração da temperatura, esgotamento ou excesso dum produto metabólico ou nutriente, ou outras.

Por exemplo, quando a sequência reguladora incorpora o promotor lambda P_L do bacteriófago o operador lambda 0_L do bacteriófago e o repressor sensível à temperatura CIB57, as células hospedeiras podem desenvolver-se a temperaturas permissivas, geralmente a cerca de 30°C, temperatura em que é reprimida a transcrição do promotor P_u e as células hospedeiras podem desenvolver-se nâfo detidas pelas exigências da síntese do produto genético estranho que além disso pode ser tóxico para o organismo hospedeiro. Quando as células hospedeiras alcançaram uma densidade óptima pode aumentar-se a temperatura para uma temperatura não permissiva por exemplo para cerca de 42°C, momento em que o repressor CI é inactivado, permitindo a transcrição do permutor Pi_ . Pode obter-se a secreção máxima mediante utilização do promotor 1ac ou de um promotor trp-lac e induçâro com um indutor metabólico tal como a lactose para uma estirpe hospedeira lac’ e fornecer num vector o 1ac I^a.

Exemplos de células hospedeiras que podem ser utilizadas com este tipo de sistema incluem as células DH1, DH5 e HB101.

Quando o produto é retido na célula hospedeira, as células sâro colhidas, lisadas e o produto isolado e purificado por extracção, precipitação, cromatografia, e1ectroforese, etc.. Quando o produto é segregado, pode recolher-se o meio nutriente e isolar-se o produto por meios convencionais, por exemplo, por crornatografia de afinidade. Para a produção de uma proteína activa pode ser necessário permitir a formação da estrutura em pregas da proteína. Se a proteína é expressa sob forma de uma proteína de fusão com a sequência líder, esta pode ser retirada mediante tratamento por exemplo com ácido fórmico ou brometo de cianogénio. De preferência a sequência líder é removida após pregueamento da proteína.

□s produtos recombínantes podem ser ou não glicosilados tendo o tipo natural ou outro de g 1 i cosi 1 aç ào. Em geral a glicosilaçào diferirá por nào mais de 50Z, usualmente nào mais do que cerca de 20Z da glicosilaçào de tipo natural. A quantidade de glicosilaçào dependerá em parte da sequência do péptido particular assim como do organismo em que este é produzido. Assim, a expressão do produto em células de E. Co1i resultará em um produto nào glicosilado e a expressão do produto em células de insecto geralmente resulta numa glicosilaçâo menor do que a expressão do produto em células de mamí fero.

Utilização de Factores de Crescimento

As composições citadas encontram uma ampla variedade de aplicações in vitro e in vivo como agonistas ou antagonistas de factores de crescimento tais como do factor de crescimento epidérmico (EGF) e do factor de transformação do crescimento, particu1armente do α-TGF. Um estudo sobre a utilização de factores de crescimento isoladamente ou em associação comoutras composições, em particular com composições polipeptídicas, para regulação do crescimento de células e de outras actividades pode encontrar-se, por exemplo, no Handbook of

5

Experimental Pharmacο 1oqy, Tissue Growth Factors, ed. Baseraga,

Vol. 57, Springer-Ver1ag, Berlim, 1981, Capitulo 3, particularmente nas páginas 98-109; e Carpenter, Ann. Rev. Biochem.

48:193-216, (1979).

O EGF humano apresenta-se idêntico ao urogastrone humano e exerce uma diversidade de efeitos sobre o desenvolvimento dos tecidos prè-nataise neo-natais. Entre esses efeitos encontram-se a abertura precoce dos olhos, a cicatrização de feridas, o aparecimento dos incisivos, a maturação acelerada do pulmão. Ds receptores de EGF encontram-se numa grande diversidade de tecidos adultos. Descobriu-se que o EGF estimula a fosforilação dos seus próprios receptores. □ EGF também se verificou estar relacionado ,com a reabsorção óssea aumentada.

D factor de transformação do crescimento em particular α-TGF apresenta muitas actividades análogas com as do EGF.

□ TGF liga-se ao receptor de EGF conduzindo à fosforilação do receptor, reforço da sua actividade de tirosinoquinase específica e com a estimulação do crescimento celular. Cohen, in:

Bioloqical Response Mediators and Modulators (ed. de Agosto,

J.T.), Academic, Nova Iorque, pp. 7-12, 1983; Tam et al. ,

Nature 509:376-578, (1984); Ibbotson et a 1 . , Science 221:1292-1294. (1983).

Os vírus do mixoma e do fibroma de Shope induzem a um aumento significativo do potencial de proliferação de células na área afectada. Enquanto que o vírus da vaccinia induz a uma menor proliferação no local da infecção, o vírus do fibroma de Shope induz a uma proliferação maior que conduz à t

formação do tumor que em coelhos adultos è benigno mas que em adultos imunodeprimidos ou recém-nascidos é pro11ferativo e invasivo. D virus do mixoma induz á formação de um mixossarcoma de rápida disseminaçâfo . Ainda que estas ocorrências proliferativas possam ser devidas a outros factores virais os factores de crescimento virais apresentam-se como estando altamente implicados na pro 1 i f eraç âfo celular induzida causada pela infecçâro virai .

□s compostos referidos têm aplicação particular como fármacos agonistas de EGF e para a cicatnzação referidas tais como a epi te 1 i z aç âfo de feridas como nas queimaduras, feridas oculares, incisões cirúrgicas e outras.

□ ingrediente activo pode ser utilizado com um veículo conveniente, por exemplo, Silvadene, numa quantidade suficiente para proporcionar a epi te 1 i z aç âfo e/ou a cicatrização de feridas, geralmente em quantidades que variam entre 0,01 e pg/ml, usualmente de cerca de 0,075 atê 05,0 pg/ml equivalentes de EGF, de preferência de 0,5 a 5 pg/ml. A composição ê espalhada sobre a ferida de modo a proporcionar uma cobertura completa da ferida. 0s tratamentos podem ser com uma frequência de 4 vezes ao dia ou pouco frequentes, como por exemplo, em dias alternados ou menos dependendo da natureza da ferida, a resposta ao tratamento, a concentração do ingrediente activo e ou tros.

As composições citadas podem ser utilizadas também como reagentes para ensaios de diagnóstico ou para a preparação de reagentes tais como anticorpos policlonais ou monoclonais.

Como reagentes podem ser utilizadas para a detecção de factores de crescimento análogos ou para a detecção de anticorpos para os factores de crescimento nos líquidos fisiológicos tal como no sangue.

Dependendo de o protocolo especial e da finalidade do reagente, o polipéptido pode ser eventualmente marcado. Tem sido utilizada uma ampla variedade de marcadores que proporcionam um sinal detectável de um modo directo ou indirecto.

Estes marcadores incluem radionuc1 idos, enzimas, agentes fluorescentes, partículas, agentes quimio1uminescentes, substractos de enzima ou co-factores, inibidores de enzimas, partículas magnéticas, etc.. Consultar, por exemplo, as patentes de invenção norte americanas N°^w . 3.654.090, 3.Θ17. Θ37,

3.935.074, 3.996.345, 4.277.437, 4.374.925 e 4.366.241.

Para a ligação de marcadores aos polipéptidos existe uma grande variedade de métodos que podem envolver o grupo N-terminal amina para funciona 1izaçâo para a formação de pirazolona enquanto que outros grupos amina livres são protegidos podendo então a pirazolona ser posta em contacto com diversos reagentes, por.exemplo, grupos amina para ligação a um sinal detectável que gera um radical. Com a protecção dos aminoácidos de arginina associados coma terceira ansa ou com a ansa proximal, podem ser funeiona1izados outros grupos de arginina para conjugação a grupos amina ou a grupos tio de acordo com métodos convencionai5. Alternativamente, pode fazer-se contactar o polipéptido com um agente activo, por.exemplo, um ácido carboxílico activado e substituído randomizadamente, em

- 4B que o material biologicamente activo pode ser preparado do material biologicamente inactivado como um resultado da substituição ao acaso. Finalmente, dependendo do método de síntese o polipéptido pode ser modificado para proporcionar o grupo funcional desejado como uma parte do processo sintético.

As composições citadas antes também podem ser utilizadas para o controlo dos receptores de EGF. Estas composições também podem ser utilizadas para controlar a resposta celular a

EGF e/ou TGF proporcionando para isso a competição entre os materiais de ocorrência natural e uma composição de acordo com a presente. invenção, Deste modo podem ser controladas as alterações da conformação do receptor.

As presentes composições também podem ser utilizadas para diversos fins terapêuticos relacionados com a estimulação do crescimento'e controlo da formação óssea. Estes compostos podem ser administrados com veículos fisiológicos compatíveis para via intraperitonia1, subcutânea, intravenosa ou íntra-arterial ou por aplicação no local em causa. Além disso as presentes composições podem ser introduzidas em lipossomas que podem envolver eventua 1mente a utilização de anticorpos para direcção de sítio. Os vários veículos incluem solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato, solução de cloreto de sódio, água. A concentração do aditivo variará amplamente dependendo da utilização final e da actividade.

Também podem ser incluídos outros aditivos nas composições tais como EGF, TGF ou outros factores de crescimento, agentes bactericidas, por exemplo antibióticos,

'!

ticos, agentes tampão, etc..

Para a preparação de anticorpos os presente polipéptidos em que PP¹-⁴ representa um átomo de hidrogénio ou uma cadeia ou cadeias oligopeptidicas curtas (menos de 5 aminoácidos) podem ser ligados a proteínas ou polipéptidos antigénicos, para injecção em hospedeiros mamíferos. A proteína antigénica deverá ter pelo menos cerca de 60 aminoácidos e usualmente não mais de 100 quilodaltons (kDal). Existem numerosas técnicas de ligação a polipéptidos quer num sítio específico quer ' randomizadamente, utilizando reagentes bifuncionais, por exemplo ácido ρ-ma1eimidobenzóico, g1utara 1deído, [□, p' — benzidina, etc.. AS proteínas antigénicas comuns incluem a albumina de soro bovino, a hemocianina de lapa, o toxoide tetânico, etc.. Os presentes polipéptidos são unidos á proteína antigénica no número suficiente para promover a resposta imunogénica desejada.

Usualmente haverá duas ou mais injecçóes de renovação (rappel) após a injecção inicial. Para anti-soros colhe-se sangue do hospedeiro imunizado e isola-se a fraeção de ímunoglobulina. Para anticorpos monoclonais são isolados os baços e fundidos os esplenócitos com um parceiro de fusão apropriado de acordo com métodos convencionais. Os hibridomas resultantes são em seguida sondados para a ligação de anticorpos a sítios e epitópicos do polipèptido em causa. Estes anticorpos podem ser utilizados para uma diversidade de fins tais como para reagentes de diagnóstico, terapêutica, etc.. Os anticorpos, quando são utilizados como reagentes, podem ser eventua 1mente marcados como se descreveu para os polipéptidos.

Os exemplos que se seguem são oferecidos a título de ilustração e não têm carácter limitante.

EXPERIENCIA

Quadro de Matérias

Exemp1o	I: Preparação de Genes sintéticos com	Interesse
	A .	01igonuc1eótidos sintéticos	de	TGF
	0 .	Oligonucleótidos sintéticos	de	VGF
	C .	Oligonucleótidos sintéticos	de	EGF
Exemp 1 o	II: Descrição da Clonaqem de	Plasmídeos de

A.	P 1 asmídeo	pLEBam
B.	P1asmídeo	pBMll
C.	P1asmídeo	pBMUMA
D .	P1asmídeo	pBOl105
E .	P1asmídeo	pBMll/NDP
F .	P1asmídeo	pBMll/PAD
G.	P1asmídeo	pBMll/ΡΑΚ
H .	P1asmí deo	pTCPt
I .	Plasmideo	plac/cro-flga 1
J .	P1asmí deo	ptac /c ro-flga 1
K .	P1asmídeo	pRSV
L .	P1asmídeo	pAcòlO
0 .	P1 asm í deos	pToxl e ρ T o x 2
N .	T akPak

I

Exemp1 d III; Reunião de Genes de Factor de Crescimento para Expressão em Células Procarióticas

A. Preparação do plasmideo pLEBam/TW

B. Preparação do plasmideo pLEBam/TW VGF e seus fragmentos

Exemp1 ο IV;

Expressão dos Polipéptidos com Interesse sob a Forma de Proteína de Fusão com Proteína N

A. TGF sintético modificado

B. TGF-VGF híbrido sintético modificado

Exemp1 o_V; Preparação do Polipéptido com Interesse Sob a

Forma duma Proteína de Fusão com Proteína N e Um Sítio de Clivagem_

A. VGF sintético modificado

B. TGF-VGF híbrido sintético modificado

C. EGF sintético

Exemp1 ο VI; Preparação do PolipéptidD com Interesse Sob a

Forma duma Proteína de Fusão com Sequência de Sinal de Fosfatase Alcalina Modificada

A. Preparação de pBMl1/PAD/EGF

B. Preparação de pBMl1/PAD/nVGFa

Exemplo VII; Expressão do Polipéptido com Interesse Sob a Forma de Proteína de Fusão com um Sinal de Fosfatase Alcalina

A. Preparação de pBMl1/PAK/nVGFa (Sequência de sinal de fosfatase alcalina/nVGFa com N-terminal de

	VGF natural e sequência GTC e GYACRC)
B .	Preparação de pBMl1/PAK/EGF
C .	Preparação de TacPak/EGF (sequência de sinal de fosfatase

alcalina/EGF humano)

Expressão dum Polipéptido de Interesse Sob a

Forma de Uma Proteína de Fusão com a Sequência de Sinal de Fosfatase Alcalina Utilizando uma

Cassete de Expressão que comporta Uma Região de

Terminação da Transcrição

Exempl□ VIII

A. Preparação de pTCPt/EGF ([trp35]16pb[1ac-10][1acSD]11pb[ATG]/ sinal de fosfatase alcalina/EGF humano/NEO-term. de trans.)

B. Preparação de pTCPt/nVGFa ([trp35]16pb[lac-10]C1acSD][croSD]1lpb [ATG]/si'naI de fosfatase alcalina/ VGFa de n-terminal com sequência GTC e GYACRC)/NEO-term. de trans.)

C. Preparação de pTNPt/EGF ([trp35]17pb[1ac-10][nSD]Bpb[ATG]/ sinal de fosfatase alcalina/EGF humano/NEO-term. de trans.)

Exemp I o_I X : Reunião de Genes de Factor de Crescimento para

Expressão em Células Eucanóticas

A .	Preparação	do	p1asmí deo	PRSV/VGF
B.	Preparação	do	p1asmídeo	pAc/VGF
C .	Preparação	de	pAc/SFGF

Exemp 1 o_X_

Preparação de Polipéptidos

A. Síntese de fase sólida para BGF e TGF

B. Isolamento de polipéptidos recombinantes preparados em células procarióticas

C. Isolamento de UGF e SFGF produzido pela expressão eucariótica dos genes naturais

D . EGF na tura1

Exempl o_X I : Ensaios de Actividade_

A. Ensaio de mitogénese

B. Ensaio de estimulação de crescimento colónias em agar mole

C. Ensaio de inibição da ligação ao receptor de EGF

D. Radioimunoensaio

E. Cicatrização de feridas

Exemp1 ο XII: Actividade Biológica de Factores do Crescimento

Recombinantes Preparados em Células

A. Ligação do receptor de EGF

B. Actividade mitogénica

C. Cicatrização de feridas

Exemplo XIII

Actividade Biológica de VGF Preparado em Células Eucarióticas

A. VGF preparado em células (BSC-1) de nm de macaco

B. VGF preparado em células CHO

C. VGF preparado em bichos da seda

D. Comparação imunológica de VGF e TGF

Depósitos de -Agentes Biológicos □s plasmideos de expressão que se seguem, todos transformados na E. Coli HB1O1 foram depositados na data indicada na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn

Drive, Rockville, MD 20852 e foi-lhes atribuído a identificação e designações da ATCC a seguir indicadas:

Identificação	Designação da ATCC	Data de Depósito
PBM11	67366
PBM14	67367
PBM11/PA/VGF	67417	3 de Junho, 1987
PBM11/DP/VGFa	67418	3 de Junho, 1987
PBM11/PA/EGF	67419	3 de Junho, 1987
PBM11/M5	67436
PBM11/C2	67437
PBM11/NDP/EGF	67547 23	de Outubro, 1987

Métodos

Uti11zaram-se técnicas de clonagem gerais como descrito em Maniatis et a 1 . , 1982, Molecular Cloning: A

Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, Nova

Iorque. Todas as enzimas modificadoras de DNA foram obtidas de fornecedores comerciais. Foram utilizadas de acordo com as instruções dos fabricantes. Os materiais e aparelhos para purificação e separação de DNA foram utilizados de acordo com as intruções do fornecedor.

Exemplo I

Preparação de Genes Sintéticos de Interesse

Designaram-se genes de factor de crescimento sintético que utilizaram codões da célula hospedeira optimizados para níveis elevados de expressão. Além disso designaram-se sítios de restrição convenientes diversos nos genes sintéticos. Quando possível os novos sítios de restrição deixaram a sequência de aminoácidos do gene do factor de crescimento inalterado, contudo, em alguns casos, a incorporação do novo sítio de restrição gerou uma sequência de aminoácidos alterada. Estes sítios dividem grosseiramente os genes sintéticos em 3 partes fornecendo domínios de N-terminal, de centro e de C-terminal.

□ produto do gene de VGF natural contém um domínio de extremidade N-terminal que não tem correspondente no TGF maduro. Os fragmentos de VGF a que faltam este domínio são referidos como truncados. Os sitios de restrição foram utili55 zados para a construção inicial dos genes finais dos fragmentos o 1igonuc1eotidicossintéticos parciais compreendidos desde um sitio de restrição até ao outro. Os oiigonucleótidos foram sintetizados num sintetizador de oligonucleótidos Applied

Biosystems e foram purificados sobre um gel de acrilamida. Os o 1igonuc1eótidos foram fosforilados na extremidade 5' utilizando-se T4 po1inuc1eótido quinase e cada o 1igonuc1eótido foi em seguida circu1 arizado para o seu complemento.

A. 01igonuc1eótidos Sintéticos de TGF

i. Domínio de N-terminal de TGF humano:

TGF ->

BSSHIINCOI

MVVSHFNDCPDSHTQFC 5' CGCGCCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGC 3¹ ggtaccaacaaagagtgaaattgctgacgggcctgagagtatgagtcaaaacg

Kpnl F H G T

TTTCATGGTAC 3' TGF104 AAAGTAC 5' TGF103

2. Domínio m édio de TGF humano modificado com sequência humana QEDK alterada para QEEK, a sequência que se encontra em TGF murino:

Kpnl Sphl

CRFLVQEEKPAC

5' CTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATG 3

3' CATGGACGGCAAAAGACCAAGTCCTTCTTTTTGGCC 5

TGF101

TGF102

3. Domínio de XC-terminal de TGF humano:

S£hl

VCHSGYVGARCEHADLL

CGTTTGCCATTCTGGCTACGTTGGCGCACGTTGCGAACACGCTGACCTGCTG

3¹ GTACGCAAACGGTAAGACCGATGCAACCGCGTGCAACGCTTGTGCGACTGGACGAC

BamH I

A Ter

GCTTAAG 3' TGF205

CGAATTCCTAG 5' TGF206

Β □1iqonuc1eátidos Sintéticos de VGF

1. Domínio da extremidade N—terminal de VGF:

HindiII

EDSGNAIETTSPEITNATT 5' AGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACT 3 ‘ ^v 3' CTGAGACCATTGCGATAGCTTTGATGAAGAGGCCTTTAGTGATTGCGATGATGA 5 ' V

2. Domínio de N-terminal de VGF modificado incluindo o sitio de clivagem Asp-Pro com a sequência_HG~i substituindo a sequência natural HGD:

BamHI

IDPMDIPAIRLCGPEGDGY

5’ GATCGATCCCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTAC 3' CTAGGGTACCTGTAGGGCCGATAGGCAGACACGCCGGGCCTTCCGCTGCCGATG

Kpnl

C L H G T

TGCCTGCATGGTAC 3' VGF104a ACGGACGTAC 5' VGF103a

3.	Domín io	méd io	de VGF modificado comportando	a
	sequênc i a	GYAC	□ue substitui a sequência natural
	GNYC :
Κρη I T	C I Η A	R D	Sphl I D G ' Y A C

5' CTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATG 3' VGFlOla

3' CATGGACGTAGGTACGTGCACTGTAGCTGCCGATGC 5' VGF102a

4. Domínio de C—terminal de VEF, extremidade 5':

Sphl EcoRI

CRCSHGYTG

5' CCGTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3' VGF1A

3' GTACGGCAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5' VGF2A

5. Domínio de C-terminal de VGF modificado, extremidade

5', com a sequência VCS substituindo a sequência naturaI RC5:

Sphl ECORI

VCSHGYTG

5' CGTTTGCTCTCATGGCTACACTGG 3' VGF1

3' GTACGCAAACGAGAGTACCGATGTGACCTTAA 5' VGF2

6. Domínio de C-terminal de VGF,_f r aqmen to 3 , terminando YKR em substituição de PNT, o C-terminal deduzido de VGF natural segregado:

EcoRI BamHI . 7“ RCQHVVLVDYQR Ter

5' AATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATC 3’ VGF3 3' GCAACGGTCGTACAACAAGACCAGCTGATGGTCGCAATTC 5' VGF4

C. Oligonucleótidos Sintéticos de EGF

Sintetizaram—se .3 conjuntos de oligonucleótidos sintéticos sobrepostos 1(A,B), 2(A,B) e 3(A,B) que codificam para EGF humano num sintetizador de oligonucleótidos Applied Biosystems e purificaram-se sobre gel de acrilamida. Os oligonucleótidos foram fosforilados na extremidade 5', utilizando-se para isso T4 po1inuc1eótido quinase. Cada oligonucleótido foi. circu1 arizado para o seu complemento.

.

NcoIEcoRI

MNSDSECPLSHDGY 5' CATGAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTAC 3' EGF1A

3' TTAAGACTGAGACTTACGGGCGACAGAGTACTGCCGATGACGGAC 5' EGF2A

2.

Nsil Sphl

CLHDGVCMYIEALDKYAC

5' TGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATG 3' EGF1B 3' GTACTGCCGCATACGTACATGTAGCTTCGAGACCTGTTCATGC 5' EGF2B .

Sphl ncv.vgyigercqyrdlk

5' CAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAA

3' gtacgttgacgcaacaaccgatgtagccgcttgcaacggtcatggcaçtggacttt

BamHI

W W E L R *

TGGTGGGAACTGCGTTAAG 3' EGF3

ACCACCCTTGACGCAATTCCTAG 5' EGF4

5B

ι

Exemplo II

Descrição de Plasmídeos de Expressão e de Clonagem

A. Utilizou-se o plasmideo pLEBam para clonizar fragmentos olígonucleotídicos sintéticos devido aos sçus sítios de restriçâfo convenientes BssHI I e BamHI . Pode ser utilizado para a clonagem de fragmentos nuc1eotídicos sintéticos e outras sequências de DNA com interesse um plasmideo com sítios de restrição Ncol e BamHI tais como o plasmideo pBNll ou pBMll/NDP (descrito a seguir).

B. 0 Plasmideo pBNll, descrito no pedido de patente de invenção norte americano co-pendente com o número de série

264 09B , requerido em 2Θ de Outubro de 1968, permite a clonagem de um gene com interesse a jusante de sequências de DNA que codificam para os 33 aminoácídos de N-terminal do gene N do bacteriófago lambda num sítio de restrição BamHI. Após indução do promotor P,_ lambda pela inactivaçâo do repressor sensível â temperatura a 42°C C1857, o produto do gene estranho é expresso como a parte de C-terminal de uma proteína de fusão cuja sequência de N-terminal é do gene N.

C. □ Plasmideo pBNHN4, descrito no pedido de patente de invenção norte americano co-pendente com o número de série 264 096, requerido em 2B de Outubro de 1966, e derivado do pBMll e permite a clonagem de um gene de interesse directamente num sítio de restriçâfo BamH 1 após a metiomna de iniciaçâO do gene N. 0 plasmideo pBMll/M4 também contém um sítio Ncol no gene de neomicina.

D. □ Plasmideo pBNilNS, descrito no pedido de patente de invenção norte americano co-pendente com o número de série 264 09B , requerido em 2Θ de Outubro de 1988, é derivado do pBNll em que o sítio NcoI presente no gene de resistência à neomicina foi removido por mutagénese de sítio dirigido. A clonagem de um gene com interesse no pBMl 1/ΙΊ5 , portanto, não requer digestâro parcial do vector com Ncol.

E. 0 Plasmideo pBNll/NDP, descrito no pedido de patente de invenção norte americano co-pendente com o número de série 264 098, requerido em 28 de Outubro de 1988, é derivado do pBMli e comporta sequências de DNA que codificam para um dipéptido de ácido aspártico-prolina lábil ao ácido inserido entre as sequências codificadoras para o gene N e para um gene de interesse. 0 plasmideo contém um sítio Ncol e um sítio 01 a I para clonagem dum gene com interesse a jusante do promotor P_u.

F. 0 Plasmideo pBNll/PAD, descrito no pedido de patente de invenção norte americano co-pendente com o número de série 264 098, requerido em 28 de Outubro de 19ΒΘ, é derivado do plasmideo ρΒΙΊ11Μ4 e permite a clonagem de um gene com interesse num sítio HindIII, SmaI ou BamHI a jusante de uma sequência de sinal de fosfatase alcalina modificada.

G. 0 Plasmideo pBNll/PAK, descrito no pedido de patente de invenção norte americano co-pendente com o número de série 264 098, requerido em 28 de Outubro de 1988, e derivado do plasmideo ρΒΓ111Μ4 e permite a clonagem de um gene com interesse num sítio HindIII, SmaI ou BamHI a jusante de uma sequência de sinal de fosfatase alcalina.

Η.

□ Plasmideo pTCPt, é designado para comportar elementos do promotor tac e utilizar o SD cro para exprimir o gene com interesse de trás da sequência de sinal de fosfatase alcalina. 0 exemplo da construção deste plasmideo é descrito a seguir na construção de pTCPt/EBF.

Construção de pTNPt (Çtrp-35]17pb[1ac-10]CnSDj8pb[ATG3/ sinal de fosfatase alcalina/adaptadorZNEQ-term. de trans.

Este .plasmideo ê designado para comportar elementos do promotor tac e utilizar o SD do gene N para exprimir um dado gene atrás da sequência de sinal de fosfatase alcalina. Este apresenta uma substrutura de pBR322 com o gene de resistência á neomicina. D plasmideo pTNPt foi construído do seguinte modo:

(a) Preparação do Fragmento EcoRI-BamHI com 2,8kb de pBN16t/VGFa a Que Falta o Sítio HindIII □ plasmideo pBMlót/VGFa foi digerido com EcoRI e

BamHI isolando-se um fragmento com 2,8k b. □ fragmento de 2,8 kb foi ligado a um adaptador EcoR1-BamHI e uma construção correcta foi isolada por análise de restrição e é referida por Intermédiário I.

único sítio HindIII perto do gene da resistência á neomicina foi removido do plasmideo Intermédio I por digestão com Hindi I1 , e reuniram-se extremidades tornadas coincidentes utilizando o fragmento de Klenow. Daqui resultou o plasmideo

Intermédio II que nào possuía o sítio Hindi I I .

fragmento de 2,8 kb EcoRI-BamHI de pBM16t/VGFa sem o sítio Hindi II foi isolado por digestão com o plasmideo

Intermédio II com EcoRI e BamHI. 0 fragmento de 2,8 kb resultante foi isolado por electroforese sobre gel de agarose.

(b) Preparação do Fragmento BamHI-Bsml com 150 pb de pBNl1/PAK plasmideo pBMll/PAK é idêntico ao plasmideo pBMl1/PAK/EGF excepto no facto de conter uma região adaptadora com sítios HindIII. SmaI e BamHI a jusante da sequência de sinal de fosfatase alcalina em vez do gene de EGF. □ pBMll/PAK foi digerido com BsmI e BamHI e isolou-se o fragmento com 150 pares de bases que continham o N-gene de SD, a sequência de sinal de fosfatase alcalina e a região adaptadora.

(c) Preparação de □1igonuc1eótidos Tacft+ e TacASintetizaram-se os o 1ígonuc1eó11Pos lacA+ e lacA- por meio de um sintetizador de o 1igonuc1eótidos Applied Biosystems que foram idealizados para conterem um EcoRI adiconado na extremidade 5 com a sequência de consensos trp-35 separada da sequência de consenso lac-10 por 17 nucleótidos em que está contido um sítio SstI. A sequência tamPêm continha uma extremidade 5' do mRNA iac, o sítio de ligação do repressor lac e um

Bsml adicionado.

TacA+ 5¹AATTACTCCCCATCCCCCTGTTGACAATTAATCATCGAGCTC

GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAG 3’

TacA- 5¹GTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATA

CGAGCTCGATGATTAATTGTCAACAGGGGGATGGGGAGT 3¹ (d ) Ligação e Isolamento de pTNRt □ fragmento com 2,8 kb Ec oR1—BamHI , □ fragmento com

150 pb Bsm I -BamH I e os ol ígonuc leótidos TacA·*· e TacA- foram ligados conjuntamente utilizando-se DNA ligase e o DNA foi utilizado para transformar JM109 competente (laclq). Isolou-se a construção correcta por análise de restrição e sequenciação de DNA.

( EcoRI sítio de pBMll)

GAATTACTCCCCATCC

Sstl trp-35 (17bp) lac-10

CCCTG [TTGACA] ATTAATCATCGAGCTCG (TATAATG)

Bsml

5'lac mRNA-> n mRNA->

TGTGG/AATTGTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCT

TTGGGGTGTGTGATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGC

TGCCAATGTGCCAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACC

Pvul ^mSD (8bp) Sequência sinal

ACCAAAGCTAACTGAC {AGGA} GAATCCAG ATGAAACAATCTACGATCGCCC M-KQSTIAL

Sma I

HindIII BamHI

TCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTTCCCGGGATCCGTG

ALLPLLFTPVTK (BamHI sítio de pBMll) Trans. Terra. [

ACTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC

I . □ plasmídeo plac/cro—[3 qal consiste em a região operador-promotor de o operon de lactose (1ac)E. Co1i assim como os sítios de ligação ribossómica de 1ac e cro. □ plasmídeo foi construído como descrito no pedido de patente de invenção c o-penden te norte americano nQ. de série 264 098 requerido em de Outubro de 1988. As proteínas de fusão expressas por este vector consistem na proteína Cro de N-terminal do bacteriôfago lambda, a sequência de aminoácidos codificada pelo DNA inserido e o C — terminal de (3-galactoxidase. Ds elementos que controlam este vector são a região operador-promotor do operon de lactose ( 1 ac ) de E. Co1ι assim como os sítios de ligação ribossómica de

1ac e cro.

J. □ plasmideo ptac/cro-p-qal permite a clonagem do gene desejado a jusante de os 21 aminoácidos de N-terminal da proteína Cro bacteriana. □ plasmideo foi construído como descrito no pedido de patente de invenção co—pendente norte americano nS. de série 264 098 requerido em 28 de Outubro de

1988. 0 vector de expressão ptac/cro-R-ga1 é idêntica ao pl ac/cro-fl-ga 1 com excessào que o promotor de p tac/c ro-R-ga 1 consiste em a região -35 do promotor do operon tnptoiano e a caixa Pribnow do operon 1ac Este promotor híbrido permite um nível mais elevado de expressão do que o p 1 ac / c r o-fl-g a 1 .

K. 0 plasmideo pRSV permite a expressão dum gene com interesse nas células eucarióticas com o promotor RSV LTR,

Gorman et a 1 . . Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:6777-6781, (1982).

L. 0 plasmideo pAc610, Smith et a 1 . , tio 1 ec . Ce 1 1 .

Biol 12: 2156-2165, (1983), permite a expressão de um gene estranho em células de insectos.

' N. Os plasmídeos pToxl e pTox2 permitem a expressão dum gene com interesse em células de levedura uti1ιzando-se a sequência de sinal de toxina assassina de X. 1ac 11s (ENBQ 6, »

229-234 (198/); Biochem, Biophys. Res

Comm ,

144, 613-619 (1987)). Esta construção tem o gene URA3 para selecção em levedura e o gene AMP para selecção em bactérias. A transcrição inicia-se com o promotor CYC1 e GAL a montante da sequência de activação (Methods Enzimol., 101, 101-191 (1983) e termina na extremidade 3' do gene FLP (Mol. Gel 1 . Biol , ϋ, 2770-2780 (1985)). A construção tem ambas as origens de 2 micrones e a origem de pBR322 para replicação em levedura e em E. Coli, respectivamente. A região de N-terminal de toxina assassina com a sequência de sinal e o sítio de clivagem Ke x 2 foram introduzidos em o 1igonuc1eótidos e contêm a região rica A-T imediatamente precedendo o codâo de iniciação para manter a iniciação da tradução óptima e os sinais de enlongaçào. Foram construídos vários sítios de restrição para permitir a inserção de genes de interesse a jusante de o sítio de clivagem de sinal e o sítio de clivagem Kex2.

Preparação do fragmento com 3kb EcoRI-EspI de

PBR322 que contém a origem do gene de resistência para ANP.

□ plasmideo pLGSD5(-ATG), um vector de espressão de levedura (Methods Enzimol. 101:181-191 (1983), foi digerido com

EcoRI e E5pI e isolado o fragmento com 3,Ok b.

2. Preparação do fragmento de 2,lkb EcoRI-EspI do plasmideo de 2 micrones que contém a extremidade

3' do gene FLP e a origem, plasmideo pLGSD5(-ATG), foi digerido com EcoRI e

EspI e isolado o fragmento com 2,lkb.

Ligação e isolamento do plasmideo intermédio

Utilizando-se DNA ligase ligaram-se os fragmentos em

RcoRI-EspI de 2,1 k b e 3k b conj untamen te e o DNA foi utilizado para transformar células HB101 competentes. A construção correcta foi isolada por análise de restrição.

4. Preparação do fragmento EcoRI-BamHI de l,Bkb de pLG5D5(~ATG) que contém o gene URA5, o GAL UAS e o promotor CYC1.

Com EcoRI e BamHI digeriu-se o plasmideo pLGSD5(-ATG) e isolou —se o f ragmen to de 1,Bk b. O sitio BamHI está presente em uma inserção de 4 pb de ligação a montante do iniciador CYC1.

5. Preparação de ol iqonuc 1 eótidos pToxiA-t-, 2A-,

ΙΒ-t-, 2B-.

Projectaram-se o 1ιgonuc1eó11dos para ligação a codões para a sequência sinal da toxina assassina de k . lactis para o sítio BamHI a jusante do iniciador CYC1. Para conservação de uma iniciação de tradução óptima, incluiu-se a sequência rica

A-T a montante do codão iniciador de toxina assassina. Esta sequência ajusta-se á sequência de consensos determinada para codOes de iniciação de levedura. Um sitio Bq1II foi colocado directamente a montante da região A-T para permitir a mutagénese da região de iniciação e da sequência sinal. Colocou-se um sítio Hindi II 10 nucleótidos a montante do sítio de clivagem de sinal para permitir a mutagénese de sequências a jusante e a ligação de um gene com interesse. Localizou-se directamente em pToxl um sitio Aval, X ho I a jusante do sitio de clivagem de — 66 —

X!

I · sinal enquanto que no pTox 2 foi colocado um sitio Nae1 no sitio de clivagem de sinal para clonagem duma extremidade tornada coincidente sobre o sitio de clivagem de sinal que foi alterado de Gly—Leu para Ala-Glys. A resolução do heteroduplex no sítio de clivagem deve resultar na geração de clones que contêm a sequência de pToxl e nos que contêm a sequência pTox2. Em ambas as construções as sequências subsequentes codificam para o resto da sequência precursora de toxina assassina a seguir ao sítio de clivagem Lys-Arg de Kex 2 em que foram colocados vários sítios de restrição (Stu1. 5a1I. Acc1, Hinc1I. e BamHI) para facilitar a clonagem do gene com interesse. □ sítio S tu I permite a clonagem directa de extremidade tornada coincidente após o codâo Arg do sítio de clivagem Kex2. Os oligonucleótidos têm uma extremidade BamHI na extremidade 5' e uma extremidade

Hindi I I na extremidade 3' para permitir a clonagem no vector intermédio I. A sequência resultante não possui já qualquer dos dois sítios.

(BamHI) BglII

1A + 2AHindIII

MNIFYIFLFLLS

5¹gatcagatctaataattataaaatgaatatattttacatatttttgtttttcctaagc 3' TCTAGATTATTAATATTTTACTTATATAAAATGTATAAAAACAAAAACGATTCGAAG

Sítio de clivagem de sinal Sitio de clivagem Kex2 (pToxl) / AvaI,XhoX / StuI SalI,Acci BamH

FVQGLEHTHRRGSLVKRPLSTDP

1B+ 5'TTCGTTCAGGGCCTCGAGCATACTCATAGAAGAGGCTCCTTAGTCAAAAGGCCTTTGTCGACGGATCC

2b_ 3 AAGTCCGGCCGCTCGTATGAGTATCTTCTCCGAGGAATCagttttccggaaacagctgcctaggtcg

A G (pTox2) Nael

- 67 Estes o 1igonuc1eótidos foram sintetizados num sintetizador Applied Biosystems e foram purificados por electroforese sobre gel. Subsequentemente foram fosforilados usando-se

T4 quinase e os pares complementares foram c1rcu1 ar1zados conjuntamente, ligados e purificados sobre gel.

6. Preparação de EcoR1-Ηιnd I 1 1 , vector intermédio I □ vector intermédio I foi digerido com EcoR1 e

Hind III e em seguida tratado com fosfatase alcalina de vitela.

Este tratamento eliminou um pequeno fragmento EcoR1-HindIII e deixou um sítio Hindi II a montante da sequência 3 de FLP.

7. Ligação e isolamento de pToxl e pTox2, fragmento EcoRI —BamHI de i,Bkb foi ligado ao fragmento oligonucleotídico usando-se DNA ligase e o fragmento resultante purificou—se sobre gel e 1igou-se subsequentemente ao vector intermédio I, EcoRI-Hind111 e utilizou-se o DNA para transformar células competentes HB101. As construções correctas foram ιdentιtιcadas utι1ιzando-se analise de restrição e sequenciação de DNA e isolou—se um clone exibindo a sequência de pToxl e um outro exibindo a sequência de pTox2. Em ambos os clones faltava o sítio BamHI na junção dos o 1igonuc1eótidos e do vector intermédio I.

Exemplo III

Reunião dos Genes do Factor de Crescimento Para a Expressão em

Células Procarióticas

A. Preparação do Plasmideo pLEBam/TTV □ factor de crescimento quimérico sintético designado

6B

ΤΤ9 ou (TGF/TGF/VGF) foi reunido no vector de clonagem pLEBam.

Este factor de crescimento hibrido continha a sequência de aminoácidos de TGF humano em dois terços do N-terminal do gene com excessâo da sequência QEEK que estava alterada relativamente à sequência QEDK humana natural. 0 terminal carboxilo foi derivado da sequência de aminoácidos de VGF e terminada com a sequência YQR a montante da sequência natural PNT. 0 plasmideo pLEBam foi digerido com BssHII e BamHI. Em seguida BssHII-BaroHI pLEBam foi ligado com os oligonucleótidos TGF101, 102, 103, e

104, e VGF1, '2, 3, e 4 utilizando-se DNA ligase sendo os plasmídeos resultantes utilizados para transformar HBlOi competentes. Os transformandos foram escolhidos em ampicilina e sondados por análise de restrição utilizando-se Ec oRI , Nc ο I e

BamHI e por sequenciação nucleotidica utilizando-se um protocolo de Naxam-Gi1bert. A construção correcta foi isolada e designada por pLEBam/TTV.

TGF Ncol

CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT

MVVSHFNDCPDSHTQFCF

VGF Kpnl Sphl

TCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT

HGTCRFLVQEEKPACVCS

EcoRl

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT HGYTGIRC QHVVLVDYQR

BaroHI

TAAGGATCC

Ter

I

χ. ' ·

Β. Preparação do Plasmideo pLEBam/TW factor de crescimento quimérico sintético designado por TW ou por TGF/OGF/OGF foi reunido no vector de clonagem pLEBam. Este factor de crescimento híbrido continha a sequência de aminoácidos de TGF humano no domínio N-terminal do gene. Os domínios médio e C-terminal são derivados da sequência de VGF truncada e a extremidade com a sequência YQR a montante da sequência natural PNT. Além disso o gene sintético exibe a modificação de GYACOC para 6MYCRC.

(a) Preparação do fragmento de 4,3 kb, Kpnl-Sphl de pLEBam/TTO plasmideo pLEBam/TW foi digerido com Kpnl e SphI e o fragmento de 4,3 kb ΚρηI-SphI foi purificado sobre gel. Esta digestão removeu o domínio médio de TGF do TTV do gene sintético no plasmideo de clonagem pLEBam.

(b) Ligação e isolamento de pLEBam/TW

Ligaram-se os oligonucleótidos VGFlOla e 102a ao fragmento de 4,3kb Kpnl-SphI de pLEBam/TTV e utι1ιzando-se DNA ligase e a mistura resultante foi utilizada para transformar células competentes HBiOl. Os transtormantes foram escolhidos em ampicilina e sondados por sequenciaçâo nucleôtidica utilizando-se o método de didesoxi de Sanger. A construção correcta foi isolada e designada por pLEBam/TW.

TGF Ncol

CCÃTGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT

MVVSHFNDCPDSHTQFCF

VGF

Kpnl Sphl

TCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT

HGTCIHARDIDGYAC VCS

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGCTCGACTACCAGCGT

HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI TAAGGATCC Ter

Exemplo IV

Expressão da Polipèptido com Interesse Sob a Forma de uma

Proteína de Fusão com N-proteína

A · TGF Sintético Modificado

1. Preparação de pBMll/N/TGF

TGF humano modificado foi expresso neste sistema sob a forma de uma parte de uma fusão com 33 aminoácidos de N—terminal do gene N e exibia a sequência DEEK que substituía a sequência humana QEDK.

(a) Preparação de um fragmento Sphl-Pvul com 7BQ pb de pBMll/N/TTV plasmideo pBMll/N/TTV foi digerido com Sph1 e PvuI e o fragmento com 7B0 pb SphI-PvuI foi purificado sobre gel. Este fragmento contém parte do plasmideo pBMll na extremidade

PvuI e na extremidade Sphl 2/3 do N-terminal do gene N do gene de TGF humano.

(b ) Preparação do fragmento de 5kb BamHl-PvuI de pBMll/N/TTV plasmideo pBMll/N/TTV foi digerido com BamH1-PvuI e o fragmento de 5kb BamHI-PvuI foi purificado sobre gel.

( c ) Ligação e isolamento de pBN 11 /N/ TGE

Os oligonucleótidos 205 e 206 de TGF, o fragmento

Sphl-PvuI com 7B0 pb e o fragmento de 5kb BamH1-PvuI de pBMll/N/TTV foram ligados conjuntamente e utilizados para transformar células competentes HBlOi . Colheram-se os transformantes em neomicina e sondaram-se por análises de restrição utilizando-se EcoRI e sequenciação nucleotídica seguindo o método de didesoxi de Sanger. Foi isolada uma construção correcta e designada por pBMl1/N/TGF.

N-gene ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

BamHI

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCCGCAT AANPLLVGVSAKPVRI RM

TGF GGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCAT

VVSHFNDCPDSHTQFCFH

Kpnl Sphl

GGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCCATTCTG

GTCRFLVQEEKPACVCHSG

BamHI

GCTAGGTTGGCGCACGTTGCGAACACGCTGACCTGCTGGCTTAAGGATCC

YVGARCEHADLLATer

B. TGF-VGF Hibndo Sintético Modificado

1. Preparação de pBMII/N/TTV

Nesta construção um gene quimérico de TTV modificado sintético foi expresso como a porção C-termínal duma proteína de fusão exibindo os primeiros 33 aminoácidos do gene N no N72

I

-terminal. Este factor de crescimento híbrido continha a sequência de aminoácidos de TGF humano em dois terços do aminotermina1 do gene com excessào da sequência QEEK gue fora alterada re1 ativamente á sequência QEDK humana natural. 0 terminal carboxilo foi derivado da sequência de aminoácidos de

VGP e terminado com a sequência VQR a montante da sequência PNT natura1.

(θ) Preparação do gene sintético de TTV Ncol(blunt)-BamHI □ plasmideo pLEBam/TTV foi digerido com Nc ο I e as extremidades foram tornadas coincidentes por preenchimento com o fragmento Klenow de DNA polimerase. □ DNA foi em seguida digerido com BamHI e o fragmento de 170 pb Ncol (blun t)-BamHI

TTV foi purificado sobre gel.

( b) Preparação de pBlhll digerido com BamHI □ plasmideo pBNll foi digerido com BamHI.

(c ) Ligação e isolamento de pBMll/N/TTV □ pBNll digerido com BamHI. o fragmento de TTV

Ncol(blunt)-BamHI e os adaptadores de BamHI (5GATCCG3') foram ligados entre si utilizando-se DNA ligase e a mistura resultante foi utilizada para transformar células HB101 competentes.

□s transformantes foram escolhidos em neomicina e sondados utilizando-se análise de restrição e sequenciação nucleótidica pelo método de didesoxi de Sanger. Isolou-se uma construção correcta que se designou por pBMll/N/TTV.

N-gene ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

BamHI

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCCGCAT

AANPLLVGVSAKPVRIRM

TGF GGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTTTCAT

VVSHFNDCPDSHTQFCFH

Kpnl' Sphl VGF GGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCTCATG GTCRFLVQEEKPACVCSHG

EcoRI

GCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAG YTGIRCQHVVLVDYQR Ter

BamHI

GATCC

Exemplo V

Preparação do Polipéptido Com Interesse Sob a Forma de Uma

Proteína de Fusâfo Com N-proteina e Um Sítio de Clivagem

A. VGF Sintético Modificado . Preparação de pBl^vl 11 / NDP / VGF A

A sequência de N-terminal do gene VGFA sintético é uma versão truncada da sequência de VGF natural e inicia-se com a sequência DIPAIR. Neste plasmideo o fragmento VGFA está localizado a jusante de 32 aminoácídos da N-proteína de lambda e o dipèptido de ácido aspártico-pro1ina. A fim de preservar o sítio de clonagem Kpnl, a sequência sintética foi alterada para codificar para CLHCGTC em vez de a sequência de VGF natural

CLHGDC e termina com a sequência YQR a montante da sequência natural PNT. Além disso o gene de VGFA codifica para a sequência GYACVC que substitui a sequência natural GMYCRC.

a. Preparação de um fragmento de C-terminal com SO pb Kpnl-BamHI do gene de VGF sintético □ plasmídeo pLEBam/TVV foi digerido com ΚρηI e BamHI e o fragmento de Θ0 pb Kpnl-BamHI foi purificado sobre gel.

Este fragmento contém dois terços do C-terminal do gene de VGF sintético com o sítio Kpnl na extremidade 5'.

b . Preparação de pBMll desf osf on I ado digerido com

BamHI plasmídeo pBMli/N/TTV foi digerido com BamHI e os fosfatos 5' foram eliminados por tratamento com fosfatase alcalina intestinal de vitela. □ fragmento plasmídico BamHI de

5,6kp foi purificado sobre gel.

c . Ligação e isolamento de pBMl17NDP/VGFA □s o1igonuc1eótidos de VGF 103a, 104a, o fragmento de

5,6kb BamH1 de pBMll e o fragmento Kpnl-BamHI de SOpb de pLEBam/TVV foram ligados entre si utι1ιzando-se DNA ligase e em seguida utilizados para transformar células HB101 competentes.

Os transformantes foram escolhidos em neomicina e sondados por análise de restrição utilizando-se Clal e sequenciação nucleotídica seguindo a técnica de didesoxi de Sanger. A construção correcta foi isolada e designada por pBM11/NDP/VGFA. Esta construção apresenta as sequências GTC e GYACVC em substituição das sequências de VGF autêntico, GDC e GMYCRC.

N-gene ->

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

Ciai aagcagcaaatcccctgttggttggggtaagcgcaaaaccagttcggatcgatc aanpllvgvsakpvri DP

Ncol VGF ->

ccatggacatcccggctatccgtctgtgcggcccggaaggcgacggctactgcct mdipairlcgpegdgycl

Kpnl Sphl

GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT hgtcihardidgyacvcs

EcoRI catggctacactggaattcgttgccagcatgttgttctggtcgactaccagcgt

HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI

TAAGGATCC

Ter

2. Preparação de pBNi1/NDP/VGFa

A sequência de N-terminal de VGFa é uma versão truncada da sequência de VGF natural e inicia-se com a sequência DIPAIR. Além disso a sequência de VGFa contém as sequências alteradas GTC e GYACRC em vez das sequências de VGF natural GDC e GNYCRC. Neste plasmideo o gene de VGFa está localizado a jusante de 32 aminoácidos da N-proteína de lambda e do dipéptido ácido aspártico-pro1ina. □ tratamento da proteína de fusão purificada com ácido fórmico resulta na cisão da ligação peptidica de ácido aspártico-pro1ina lábil a ácido, permitindo a separação da proteína de VGFa do aminotermina1 da

N—proteína lambda. A cisâfo é de tal forma que a proteína de

VGFa fica com o resto de prolina no terminal amina.

- 76 Ί a . Preparação de pBNl1/DP/VGFA desfosfonlado digerido com Sphl plasmideo pBMl1/DP/VGFA (10 pg) foi digerido com 30 unidades de Sphl eliminando-se os 5' fosfatos mediante tratamento com fosfatase alcalina intestinal de vitela. □ fragmento plasmídico de 5kb foi recolhido após e1ectroforese sobre gel de agarose.

b. Preparação de um fragmento de 70pb EcoRl-Sphl de pBNll/DP/VGFA

Utilizando 10 pg do plasmideo pBNl1/DP/VGFA digeriram-se estas com 30 unidades de EcoRI , e em seguida com 30 unidades de Sphl. 0 fragmento de de 70pb foi recolhido após electroforese sobre gel de agarose.

. Ligação e isolamento de pBMl1/NDP/VGFa fragmento com 24pb que continha os o 1ígonuc1eó11dos

VGF IA e 2A, o fragmento de 5kb Sphl e o fragmento de 70pb

EcoRI-Sphl de pBMl1/DP/VGFa foram interligados e a mistura foi utilizada para transformar células de E. Co1ι HB1Õ1 competentes. 0s tran5formantes foram sondados por sequenciação nucleotídica utilizando-se o método nucleótico de didesoxi de Sanger.

Isolou-se um clone correcto designado por pBM11/NDP/VGFa.

N-gene

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATCGA mdaqtrrrerraekqaqwk

A A A A

Clal aagcagcaaatcccctgttggttggggtaagcgcaaaaccagttcggatcgatcc

AANPLLVGVSAKPVRIDP

Ncol VGF ->

CCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT mdipairlcgpegdgycl

Kpnl SphI

GCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCTCT hgtcihardidgyacrcs

EcoRI catggctacactggaattcgttgccagcatgttgttctggtcgactaccagcgt h gytgircqhvvlvdyqr

BaroHI TAAGGATCC Te r

B. Híbridos TGF-VGF Sintéticos Nodifiçados

1. Preparação de pBNl1/NDP/TTV

Nesta construção o gene quimérico de TTV modificado sintético é expresso sob a forma da porção C-terminal de uma proteína de fusão que comporta os 32 primeiros aminoácidos do gene N no N-terminal. □ dipéptido lábil ao ácido, ácido aspártico-pro1ina separa as duas partes da fusão. □ factor de crescimento híbrido contém a sequência de aminoácidos de TGF humano nos dois terços do aminotermina1 do gene com excepçâo da sequência QEEK que foi alterada da sequência QEDK de ΤΓΊΡ humano natural. □ terminal carboxilo derivou da sequência de aminoácidos VGF e terminou com a sequência YQR a montante da sequência natural PNT.

a . Preparação de um fragmento do plasmideo pBNll, de 5k b Ncol

O plasmideo pBM11/NDP/VGFA foi digerido com Ncol e o fragmento plasmídico Ncol de 5kb foi purificado sobre gel.

Este fragmento tem uma extremidade Nc□I no sítio de clivagem de

ácido aspártico-prolina a jusante da sequência codificadora para os primeiros 32 aminoácidos do gene N. O outro sítio Ncol é um gene de resistência à neomicina.

b. Preparação de um fragmento de 0,6kb NcoI-BamHI do pBNll □ plasmideo pBMll/N/TTV foi digerido com Nc ο I e BamHI e o fragmento plasmídico Ncol-BamHI de 0,6k b foi purificado sobre gel. Este fragmento comporta uma extremidade Nc o 1 no gene de resistência á neomicina.

c. Preparação de um fragmento de TGF/TGF/VGE sintético com 170pb □ plasmideo pLEBam/TTV foi digerido com Nc o 1 e BamHI e o fragmento com 17Opb NcoI-BamHI que continha o gene sintético de TGF/TGF/VGF foi purificado sobre gel. Este fragmento exibe uma extremidade Ncol na extremidade 5' do gene e a extremidade BamHI na extremidade 3' do gene.

d. Ligação e isolamento de pBNl1/NDP/TTV □ s fragmentos plasmídicos de 5kb Nc ο I e de 0,6kb

Nc ο I—BamH1 foram ligados com o fragmento de í7Opb Nc o 1-BamH1 do gene de TTV utilizando-se DNA ligase e a mistura resultante foi utilizada para transformar células HB101 competentes. Os transformantes foram escolhidos em neomicina de tal modo que apenas as colónias com os genes de resistência à neomicina reconstruídos correctamente podiam sobreviver. Os transformantes foram sondados utilizando-se análise de restrição com Nc ο I e sequenciação nucleotídica com a técnica de didesoxi de Sanger.

Uma construção correcta foi isolada e designada por

- 79 pBMll/NDP/TTV.

N-gene -» atggatgcacaaacacgccgccgcgaacgtcgcgcagagaaacaggctcaatgga

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

Ciai

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC AANPLLVGV’SAKPVR I DP

Ncol TGF CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT

MVVSHFNDCPDSHTQFCF

Kpnl Sphl VGF ·

TCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT

HGTCRFLVQEEKPACVCS

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT

HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI

TAAGGATCC

Ter

2. Preparação de pBNl1/NDP/VTV

Nesta construção o gene quimérico de VTV modificado sintético foi expresso sob a forma da porção de C-terminal de uma proteína de fusão comportando os primeiros 32 aminoácidos do gene N no terminal N. 0 dipéptido ácido aspártico-prolina, lábil ao ácido, separa as duas partes da fusão. □ factor de crescimento híbrido continha a sequência de aminoácidos de TGF humano no domínio médio com a sequência de aminoácidos QEEK em substituição da sequência DEDK natural. Ds domínios de N—terminal e de C-terminal foram derivados da sequência de TGF truncada, e iniciava-se com a sequência DIPAIR e terminava com

- 80 1 a sequênc1 a a

YQR que está a montante cia sequência natural PNT.

Preparação de um fragmento de 5kb BamHl-Ncpl de pBNl 1 plasmideo pBMl1/N/TTO foi digerido com BamHI e Ncol e o fragmento de 5kb BamHI-Ncol foi purificado sobre gel. Este fragmento contém uma extremidade BamHI na extremidade 3' da sequência codificadora para os primeiros 32 aminoácidos do gene

N e um sítio Nc ο I no gene de resistência à neonucina,

b. Preparação de um fragmento com 700pb, Kpnl-Ncol de pBMll/N/TTV plasmideo pBMll/N/TTV foi digerido com Kpnl e Ncol e o fragmento de 7OOpb ΚρηI-Nc ο I foi purificado sobre gel. Este fragmento foi construído de parte do plasmideo pBMll que contém parte do gene de resistência á neomicina na extremidade Nc ο I e o domínio de VGF C-terminal do gene sintético de TTV na extremidade Kpnl.

C. Ligação e i so1amen to de pBMll/NDP/VTV □ s o 1igonuc1eótidos VGF 103a e 104a, o fragmento com

5k b BamHI-Nc ο I do pBMll e o fragmento de 700pb Κ pnI-Nc ο I de pBMli/N/TTO foram interligados uti1izando-se DNA ligase e em seguida utilizados para transformar células HB101 competentes.

Os transformantes foram se 1eccιonados em neomicina e sondados por análise de restrição utilizando-se C1 a 1 e sequenciação nucleotídica seguindo a técnica de didesoxi de Sanger.

- BI (

N-gene ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

Ciai

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC

AANPLLVGVSAKPVRIDP

Ncol VGF CCATGGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCT MDI. PAIRLCGPEGDGYCL

Kpnl TGF - Sphl VGF ·

GCATGGTACCTGCCGTTTTCTGGTTCAGGAAGAAAAACCGGCATGCGTTTGCTCT

HGTCRFLVQ EEKPACVCS

EcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTCGCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT

HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI TAAGGATCC Te r

3. Preparação de pBMIó/NDP/TW

Nesta construção, o gene quimérico de TVV modificado sintético foi expressa como a fracção de C-terminal duma proteína de fusão contendo os primeiros 32 aminoácidos do gene

N no N-terminal. 0 dipéptido ácido aspártico-pro 1ιna, lábil ao ácido, separa as duas partes da fusão. O factor de crescimento híbrido contém a sequência de aminoácidos de TGF humano no domínio N—terminal. Os domínios médio e C-terminal foram derivados da sequência de VGF truncada e termina com a sequência YQR . Além disso o ,gene sintético contém a modificação

GYACVC para GMYCRC.

a. Preparação de um fragmento Ncol-Bqlll de 4,3kb de pBNll/NDP/VGFa □ plasmideo pBMl1/NDP/VGFa foi digerido com Nc ο I e

B2

I !

χΐ

Bq1II e o fragmento de 4,3kb purificado em gel. A extremidade

Ncol está colocada no sitio de cisão ácido aspár tico-prolina exactamente a jusante dos primeiros 32 aminoácidos do gene N.

b. Preparação do fragmento BamHI-BGlII de l,2kb de pBNl 1ΡΊ5 plasmideo ρ Β N i 1ΙΊ 5 foi digerido com BamHI e Bq 1 I 1 e foi purificado em gel o fragmento de l,2kb. Este fragmento difere do fragmento de pBNll normal no facto do sítio Nc ο I no gene de resistência á neomicina ter sido eliminado e todos os vectores subsequentes sem este sítio Nc ο I são referidos por pBMlò.

c. Preparação de NcoI-BamHI com 170pb do gene sintético TW plasmideo pLEBam/TW foi digerido com Nc o 1 e BamHI e o fragmento com 170pb Ncol-BamHI purificado em gel. Este fragmento do gene sintético contém o sítio Nco1 na extremidade

5' e o sítio BamHI na extremidade 3'.

d . Ligação e isolamento de pBNlò/NDP/TW

O fragmento de 4,3kb Nco I -Bq I I I do pBtlll/NDP/VGFa e o fragmento de i,2kb BamHI-BqIII do pBMilN5 e o fragmento com

17Opb NcoI-BamHI do gene sintético TW foram ligados conjuntamente utilizando-se DNA ligase e a mistura resultante foi utilizada para transformar células competentes HB101. Os transformantes foram escolhidos em neomicina e sondados por análise de restrição e sequenciaçâo nucleótidica uti1ízando-se a técnica de didesoxi de Sanger. 0 plasmideo é designado por pBM16 para indicar a perda do sítio de restrição Nc ο I no gene

B3 de resistência á neomicina.

N-gene *

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGGCTCAATGGA mdaqtrrrerraekqaqwk ★ I A á

Ciai

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATC AANPLLVGV.SAKPVR I DP

Ncol TGF CCATGGTTGTTTCTCACTTTAACGACTGCCCGGACTCTCATACTCAGTTTTGCTT

MVVSHFNDCPDSHTQFCF

Kpnl VGF - Sphl

TCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCGTTTGCTCT

HGTCIHARDIDGYACVCS

FcoRI

CATGGCTACACTGGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGT

HGYTGIRCQHVVLVDYQR

BamHI

TAAGGATCC

Ter

G· EGF Sintético

1. Preparação de pBNl1/NDP/EGF

Nesta construção o gene de EGF humano é expresso sob uma parte de uma fusão com os 32 aminoácidos do N-terminal do gene N que está a jusante do sítio de clivagem Asp-Pro.

a. Preparação de um fragmento Ncol de 5kb de pBNll □ plasmideo pBMl1/DP/VGFA foi digerido com Ncol e os fosfatos 5' foram eliminados por tratamento com fosfatase intestinal alcalina de vitela. □ fragmento plasmidico de 5kb foi purificado em gel. Este fragmento exibe uma extremidade

Ncol no sítio de clivagem Asp-Pro a jusante da sequência codificadora para os primeiros 32 aminoácidos do gene N. 0 outro sítio Nc□I está no gene de resistência à neomicina.

b. Preparação de um fragmento Ncol-BamHI de O.òkb de pBMll □ plasmideo pBMl1/N/TTV foi digerido com Nc o 1 e BamHI e o f ragmen to plasmídico Ncol-BamHI de 0,6k b foi purificado em gel. Este fragmento exibe uma extremidade Nc□I no gene de resistência á neomicina.

c. Ligação e isolamento de pBMll/DP/EGF □ s três conjuntos de o 1igonuc1eótidos de EGF circularizado com uma extremidade Nc ο I na extremidade 5 e uma extremidade BamHI na extremidade 3' , o fragmento Nc o 1 de 5kb do pBMll e o fragmento Nc ο I -BamH I de 0,6kb de PBfjl 1 foram interligados uti1ιzando-se T4 DNA ligase, e a mistura resultante foi utilizada para transformar E. c o 1ι Η Β101 competente.

Os transformantes foram escolhidos em neomicina de tal modo que apenas as colónias com um gene de resistência á neomicina correctamente reconstruído podiam sobreviver. Os transformantes foram sondados por análise de restrição utilizando-se EcoRI e

BamHI e por sequenciação de DNA como descrito anteriormente.

N-gene *

ATGGATGCACAAACACGCCGCCGCGAACGTCGCGCAGAGAAACAGCGTCAATGGA

MDAQTRRRERRAEKQAQWK

A A A

AAGCAGCAAATCCCCTGTTGGTTGGGGTAAGCGCAAAACCAGTTCGGATCGATCC

AANPLLVGVSAKPVRIDP

B5

EGF1 - ECORI EGF2 ->

CATGAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCATGAC MNSDSECPLSHD GYCLHD

EGF3 ->

Nsil Sphl

GGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTG

GVCMYIEALDKYACNCVVG

GCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTA

YIGERCQYRDLKWWELR*

BamHI

AGGATCC

Exemplo VI

Preparação do Polipéptido de Interesse Como Uma Proteína de

Fusãro Com Uma Sequência de Sinal de Fosfatase Alcalina

Modi ficada

A . Preparação de pBMi1ZPAD/EGF

Oligonucleótidos sintéticos foram projectados para permitir a inserção de DNA que codifica para um péptido de sinal de fosfatase alcalina modificada e uma região adaptadora com três sítios de clonagem (Hindi II , SmaI e BamH1 ) no vector de expressão de pBMll a jusante do promotor P_L e do sítio de ligação nbossómica do gene N. A sequência nucleotídica foi optimizada para ser tâfo idêntica quanto possível á sequência nucleotídica do aminotermina 1 do gene N de lambda porque a sequência do gene N de lambda envolve-se com a do seu sitio de ligação nbossómica para iniciação e tradução de nbossoma eficiente. Além disso o segundo aminoácido da sequência sinal de fosfatase alcalina, o aminoácido básico lisina foi substituído por um aminoácido ácido, o ácido aspártico.

B6

1. Preparação do f raqmen to EcoR I-BamH1 de 0,1 7 k b de EGF plasmideo pBMl1/NDP/EGF (30 pg ) foi digerido com 30 unidades de EcoRI e em seguida tratado com 4 unidades do fragmento Klenow de DNA polimerase para se criarem extremidades coincidentes. Finalmente o DNA foi digerido com 30 unidades de

BamHI e o fragmento de 0,17kb do gene de EGF foi recuperado após e1ectroforese em gel de agarose. □ DNA purificado deste modo contém um sítio EcoRI tornado coincidente na ex t rem idade

5' e uma extremidade BamH1 na extremidade 3'.

2. Preparação do fragmento Pvu I-Hind III de 0,5kb de pBMll/PAD plasmideo pBMll/PAD (18 pg ) foi digerido com 30 unidades de Hindi I I e em seguida tratado com o fragmento de

Klenow para se formarem extremidades coincidentes. 0 DNA foi em seguida digerido com PvuI e o fragmento PvuI-HindI1I (blunt) de 0,5kb foi recolhido após e1ectroforese em gel de agarose.

3. Preparação dum fragmento Pvu Ι-BamHI de 5,2kb de pBMll/PAD plasmideo pBNii/PAD (1B pg) foi digerido com 30 unidades de PvuI seguida de 30 unidades de BamHI. 0 fragmento de 5,2kb foi recuperado após e1ectroforese em gel de agarose.

4. Liqaçàp e isolamento de pBMi1/PAD/EGF fragmento EcoRI (b1un t)-BamHI de 0,17kb, o fragmento PvuI-HindIII (blunt) de 0,5kb e o fragmento PvuI -BamHI de 5,2kb foram ligados entre si e a mistura resultante foi utilizada para transformar E^. c o 1 i competente HB101. Os transformantes foram sondados utilizando-se sequenciação de DNA

B7 como descrito anteriormente. A sequência sinal desejada/região de EGF apresentava a sequência seguinte:

Sequência sinal

ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACT MDQSTIALALLPLLF T

EGF

CCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGAC

PVTKANSDSECPLSHD

Nsil

GGCTACTGGCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTG

GYCLHDGVCMYIEAL

Sphl

GACAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGT dkyacncvvgyiger

BamHI

TGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCC

CQYRDLKWWELR*

A eficácia da produção da proteína estranha no sistema de expressão pBMll/PAD e a capacidade para purificar funcionalmente proteínas estranhas activas do produto de fusão foi demonstrado utilizando-se como um exemplo pBMl1/PAD/EGF.

Após crornatografιa de exclusão (TSK-250), recuperaram-se 10,3 mg de equivalentes do polipéptido de fusão de EGF activo de 23 g (B 1) de E. coli desreprimido para expressar o gene de EGF.

Quarenta por cento da actividade de EGF foi derivado de EDF cindido da sequência sinal.

B. Preparação de pBMl1/PAD/nVGFa

Os o 1ιgonuc1eótidos sintéticos foram projectados para ligar o gene sintético de VGFa com uma sequência sinal de

BB fosfatase alcalina modificada, para proporcionar um sitio de cisão de sequência sinal óptimo, por codificação para restos de

N-terminal adicionais que ocorrem imediatamente a jusante do sítio de clivagem da sequência sinal no VGF natural, designado por extremidade N-terminal anterior. A sequência de nVGFa contém as sequências GTC e GYACRC alteradas em vez das sequências GDC e GMYCRC de VGF natural e termina com a sequência YQR a montante da sequência PNT natural. Neste sistema de expressão para a maior parte das moléculas, a sequência sinal permanece ligada ao nVGFa formando uma proteína de fusão com nVGFa no C-terminal.

1. Preparação de HindlII-PvuI de 0,5kb de pBMll/PAD digerido □ plasmideo pBMll/PAD foi digerido com Hindi 1 I e

PvuI e o fragmento O,5kb foi purificado em gel. □ sítio Hindi I I está localizado no C-terminal da sequência sinal fosfatase alcalina modificada.

2. Preparação do fragmento Pvul-BamHl de 5,2kb do plasmideo pBMll □ plasmideo pBMl1/NDP/VGFa foi digerido com PvuI e

BamHI e o fragmento plasmídico de 5,2kb foi purificado em gel.

3. Preparação do Ncο I (b1unt)-BamHI , de 170pb do gene de □ plasmideo pBMl1/NDP/VGFa foi digerido com Nc ο I e foram eliminadas as extremidades 5' por tratamento com SI nuclease. Deste modo criou-se uma extremidade coincidente no primeiro codão do gene sintético truncado de VGFa. 0 DNA em

- B9 seguida foi digerido com BamH1 e o fragmento Ncol(blunt)-BamHI de 170pb foi purificado em gel.

Ligação e isolamento de pBMl1/PAD/nVGFa □ s o 1igonuc1eótídos VGF105 e 106, o fragmento

HindIII-PvuI de 0,5kb do pBMll/PAD, o fragmento PvuI-BamHI de

5,2kb de pBMll e o fragmento Ncol(blunt)-BamHI de 170pb do gene de VGFa sintético foram ligados entre si utilizando-se DNA ligase e a mistura resultante foi utilizada para transformar

HB101 competentes. Os transformantes foram seleccionados em neomicina e sondados por análise de restrição e sequenciação nucleótidica utilizando-se a técnica de didesoxi de Sanger. A construção correcta foi isolada contendo uma sequência de sinal de fosfatase alcalina modificada na cadeia com o gene nVGFa.

Sequênci» sinal —*

ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA

MDQSTIALALLPLLFTPVT nVGF CAAAAGCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGC KADSGNAIETTSPEITNA

TACTACTGACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGC ttdipairlcgp'egdgyc

Kpnl Sphl

CTGCATGGTACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCT

LHGTCIHARDIDGYACRCS

EcoRI ctcatggctacactggaattcgttgccagcatgttgttctggtcgactaccagcg hgytgircohvvlvdyqr

BamHI

TTAAGGATCC

Ter

Exemplo VI 1

Expressão do Polipéptido de Interesse Sob a Forma Duma Proteína de Fusão Com Uma Sequência de Sinal de Fosfatase Alcalina

A. Preparação de pBMl1/PAK/nVGFa [sequência sinal de fosfatase alcalina/nVGFa com N-terminal e sequências GTC e

GYACRC de VGF natural)

Foi submetido a mutagênese o plasmideo pBMl1/PAD/nVGF in vitro (Monnaga et a 1 . . Biotechno1oqy 2:636-643 (19B4)) para alteração dos codbes que codificam para o segundo aminoácido na sequência sinal, nomeadamente para alterar o codâo de Asp (D) para o codâo de Lys í K) o resíduo que se encontra na sequência natural. Esta mutagênese também -introduziu um sitio P vu I na sequência sinal.

Sequência sinal—.

ATGGATCAATCTACAATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAA

MDQSTIALALLPLLFTPVTK nVGF GCTGACTCTGGTAACGCTATCGAAACTACTTCTCCGGAAATCACTAACGCTACTACT

ADSGNAIETTSPEITNATT

Kpnl

GACATCCCGGCTATCCGTCTGTGCGGCCCGGAAGGCGACGGCTACTGCCTGCATGGT

DIPAIRLCGPEGDGYCLHG

Sphl

ACCTGCATCCATGCACGTGACATCGACGGCTACGCATGCCGTTGCTCTCATGGCTACACT

TCIHARDIDGYACRCSHGYT

EcoRI ' BamHI GGAATTCGTTGCCAGCATGTTGTTCTGGTCGACTACCAGCGTTAAGGATCC GIRCQHVVLVDYQR Ter

Β. Preparação de pBNl1/PAK/EGF

Nesta cassete de expressão o gene de EGF faz parte duma fusão com a sequência sinal de fosfatase alcalina.

Submeteu-se a mutagénese o plasmideo pBMl1/PAD/EGF in vitro para alterar os codòes que codificam para o segundo aminoácido na sequência sinal, para a mudança do codão (D) de

Asp para o codão (K) de Lys, o resíduo que se encontra na sequência natural. Esta mutagénese também introduziu um sítio

PvuI na sequência sinal.

EvuJ

Sequência sinal —»

ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA

MKQSTIALALLPLLFTPVT

EGF CAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCA

KANSDSECPLSHDGYCLH

Nsi I Sphl

TGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTT

DGVCMYIEALDKYACNCV

GTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGC

VGYIGERCQYRDLKWWELR

BamHI

GTTAAGGATCC *

G. Preparação de TacPak/EGF (sequência sinal de fosfatase alcalina/EGF humano)

1. Preparação de fragmentos plasmídicos □ plasmideo pl35-l foi derivado do plasmideo pDR540 (Farmácia) contendo o gene SD Cro e um sítio Bq11I a jusante do t

dSD lac. O pDR54O constitui um vector de expressão que contém o promotor híbrido trp-lac. 0 plasmideo pi35-i foi digerido com

Bq111 e BamH1 e tratado com fosfatase alcalina bacteriana.

plasmideo pBMl1/PAK/EGF foi digerido com

Pvu I I e

BamHI e isolou-se o f ragmen to c om cerca de 23Opb que codifica para parte da sequência sinal de fosfatase alcalina e para EGF humano.

2. Preparação de oligonucleótidos TacPakl e TacPak2

Oligonucleótidos sintéticos TacPakl e TacPak2 foram projectados com uma extremidade compatível com o sítio Bq111 do plasmideo pl35-l e uma extremidade PvuII compatível com o sítio

PvuII no fragmento de fosfatase alcalina/EGF PvuII/BamHI. Os oligonucleótidos foram sintetizados num Applied Biosystems

01igonuc1eotide Synthesizer.

BqlII

Pvul

TacPakl 5' GATCTATGAAACAATCTACGAT 3 TacPak2 3' ATACTTTGTTAGATGC 5

3. Ligação e isolamento do clone TacPak/EGF plasmideo pl35-l digerido com Bq111-BamHI, o fragmento PAK/EGF com 230 pb e os oligonucleótidos TacPakl e

TacPak2 foram ligados utilizando-se DNA ligase, transformados

sequenciação de DNA.

(HindIII sítio de pDR540)

AAGCTTACTCCC trp-35 (16pb) lac-10

CATCCCCCTG (TTGACA] ATTAATCATCGGCTCG (TATAATG) mRNA 5' sítio de ligação lacl lacSD TGTGG/AATTGTG AGCGGATAACAATTTCACAC {AGGA} AACAGGATCACTA

Pvul croSD (llpb)BglII {AGGA} GGTTCAGATCT

Sequência sinal —>

ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGA MKQSTIAL ALLPLLFTPVT

EGF ->

CAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCATGACGGCTACTGCCTGCA

KANSDSECPLSHDGYCLH

Nsil Sphl

TGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGACAAGTACGCATGCAACTGCGTT

DGVCMYIEALDKYACNCV

GTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGC

VGYIGERCQYRDLKWWELR

BaniHI

GTTAAGGATCC *

Exemplo VIII

Expressão Dum Polipéptido Apropriado Sob a Forma Duma Proteína

de Fusão Com Sequência Sinal de Fosfatase Alcalina	Ut i1i z ando-
-se uma Cassete de	Expressão Que Compreende A	Reqiâo de
Terminação de Expressão
A. Preparação de	pTCPt/EGF	([trp-35]16pbElac	-10][lacSDj

11pb[ATG]/sina 1 de fosfatase alcalina/EGF humano/term.

trans.-NEO)

Este ρ1 asmídeo é projectado para conter elementos do promotor tac e utiliza o SD cro para exprimir EGF humano antes de sequência sinal de fosfatase alcalina. Este contém uma base pBR322 com o gene de resistência à neomicina.

1. Preparação do fragmento HindI1(b1unt)-BamHI com 420pb de TacPak/EGF

TacPak/EGF foi digerido com Hindi I I e em seguida tratado com o fragmento de Klenow de DNA polimerase para se formarem extremidades coincidentes. □ DNA em seguida foi digerido com BamHI e o fragmento de 420pb, contendo elementos do promotor tac e a região codificadora para a sequência sinal de fosfatase alcalina e EGF humano, foi isolado por electroforese em gel de agarose.

2. Preparação do fragmento EcoRl(b1unt)-BamH1 de 2,Bkb de pBMlòt/NDP/VGFa □ pSMlót/NDP/VGFa foi digerido com EcoRI e em seguida tratado com Klenow para se formarem extremidades coincidentes.

□ DNA foi depois digerido com BamHI e_isolado o fragmento com

2,8kb. Este fragmento de DNA contém a origem de pBR322, o gene i

C. Preparação de pTNPt/EGF_( [trp-35]17pb[1ac-10]ÇnSDISpb

ÇATGj/sinal de fosfatase alcalina/EGF humano/term. trans.-NEO)

Este plasmideo é projectado para conter elementos do promotor lac e utiliza SD do gene N para exprimir EGF humano por trás da sequência sinal de fosfatase alcalina. O plasmideo contém uma base de pBP322 e o gene de resistência á neomicina.

1. Preparação do fragmento Pvul-BamHI de 2,8kb de pTNPt □ plasmideo pTNPt foi digerido com PvuI e BamHI e isolado o fragmento de 2,Bkb por e1ectroforese em gel.

2. Preparação do fragmento Pvul-BamHI de 300pb de pBMll/PAK/EGF

D plasmideo pBNl1/PAK/EGF foi digerido com PvuI e

BamHI e isolado o fragmento com 300pb.

3. Ligação e isolamento de pTNPt/EGF □ fragmento de 2,8kb e o fragmento de 300pb foram ligados utilizando-se DNA ligase e o DNA foi transformado em

JN109 competente (laclq). Isolou-se uma construção correcta por análise de restrição e sequenciação de DNA.

(EcoRI sítio de pBMll)

GAATTACTCCCCATCC

SstI trp-35 (17 P^b) lac-10 5 ¹ lac

CCCTG (TTGACA] ATTAATCATCGAGCTCG (TATAATG) TGTGG/AATTG

Bsml mRNA-> n mRNA->

TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGCATTCAAAGCAGAAGGCTTTGGGGTGTGT

GATACGAAACGAAGCATTGGCCGTAAGTGCGATTCCGGATTAGCTGCCAATGTGC

- 99 CAATCGCGGGGGGTTTTCGTTCAGGACTACAACTGCCACACACCACCAAAGCTAA

Pvul nSD (8pb) Sequência sinal

CTGAC {agga} GAATCCAG ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTC

MKQSTIALALL

EGF ->

CCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGT

PLLFTPVTKANSDSECPLS

Nsil

CTCATGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGA HDGYCLHDGVCMYI EALD

Sphl

CAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTTGGCTACATCGGCGAACGTTGCCAGTACCGT

KYACNCVVGYIGERCQYR

BamHI BamHI

GACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCGTGACTAATTGGGGA

DLKW WELR* ( BamHI sítio de pBMIl) frans.íerm. j

CCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAACGATCC

Exemplo IX

Montagem dos Genes de Factor de Crescimento Para a Expressão em

Células Eucarióticas

A. Preparação do Plasmideo pRSV/VGF

A transfecçâo deste plasmideo em células de ovário de hamster chinês resultou na produção de VGF natural.

(a) Preparação de HindIII(blunt)—Bq1II(b1unt)_de pRSV. 0 plasmideo pRSV foi digerido com Hindi I I e BqIII e purificado o fragmento de 4kb em gel. As extremidades protrundentes foram tornadas coincidentes com o f ragmen to de Klenow e

100

DNA polimerase e em seguida foram eliminados os 5' fosfatos com fosfatase intestinal alcalina de vitela.

(b) Preparação dum fragmento Ddel contendo o gene de

VGF. Um fragmento genómico subclonado em DNA de vaccinia foi digerido com Ddel e as extremidades protrundentes tornadas coincidentes utilizando-se o fragmento de klenow purificando-se em gel um fragmento Ddel com 550pb.

(c) Ligação e isolamento de pRSV/VGF. 0 fragmento

Hindi I I (blunt)-BqlII(blunt) com 4kb de pRSV e o fragmento

DdeI (b1unt) com 55Opb de DNA de vaccinia foram ligados entre si uti1izando-se DNA ligase, e as transformantes escolhidas com ampicilina e sondadas por análise de restrição. Isoiou-se uma construção correcta que se designou por pRSV/VGF.

(d) Transfecção de células CHO por pRSV/VGF. □ plasmideo pRSV/VGF foi co-transfectado com um plasmideo pRSV por precipitação com fosfato de cálcio em células de ovário de hamster chinês (CHO). As transfectantes foram sondadas por hibridação de dot blot de Southern e isolado o clone positivo designado por pRSV/VGF52.

B. Preparação do Plasmideo pAc/VGF:

□ sistema de expressão adicional que é utilizado para exprimir a proteína recombinante de VGF é constituído por um sistema de insecto. Consultar Maeda et a 1 e Carbonell e t a 1 . , supra. Num sistema destes é utilizado o vírus da polihedrose nuclear de Autpqrapha ca 1i formca (AcNPV), como vector para exprimir genes estranhos. 0 vírus desenvolve-se em células de

Spodoptera f rugiperda. 0 gene envolvido pode ser clonado em

101 regiões não essenciais (por exemplo o gene de polihedrina do vírus) e é colocado sob o controlo de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor de polihedrina). A inserção bem sucedida da construção do gene de VGF resulta na inactivaçào do gene de polihedrina e na produção de um vírus recombinante não ocluído (isto é, um vírus sem revestimento proteinãcio codificado pelo gene de polihedrina). Estes vírus recombinantes são em seguida utilizados para infectar células de Spodoptera fruq1perda em que o gene inserido é expresso.

□ gene VGF que interessa foi colocado sob o controlo dum promotor apropriado para o sistema de células de insecto. 0 plasmideo pAcòlO contém o gene de polihedrina clonado num vector plasmídico que possui um marcador de resistência à ampicilina. São inseridos po11-adaptadores neste gene que contém 50 bases a jusante do sítio de início da transcrição do gene de polihedrina e 7 bases antes do primeiro ATG. 0 gene de

VGP é clonado num sítio de polι-adaptador conveniente de tal modo que está sob o controlo do promotor de polihedrina. 0 codão de metionina de iniciação ATG e os codòes de terminação da tradução são os do gene de OGF; os sítios de inicio de transcrição e os sinais de políadeni1 ação são os do gene de polihedrina.

(a ) Preparação de Smal-BamHl de pAcòíO. □ plasmideo pAcólO foi digerido com Sma1 e BamHI.

(b ) Preparação do fragmento HindIII (b1unt)-Bq1II do gene de OGF . 0 plasmideo de pRSV/OGF foi digerido com Hindi II e as extremidades salientes foram tornadas coincidentes utili102 zando-se o fragmento de Klenow. □ DNA foi em seguida digerido com Bq1II e o fragmento com 560 pb foi purificado em gel.

(c) Ligação e isolamento de pAc/VGF. □ fragmento

SmaI-BamHI de pAc610 e o fragmento 560 pb de pRSV/VGF, contendo o gene de VGF, foram ligados em conjunto utilizando-se DNA ligase, e as transformantes sondadas por análise de restrição.

Isolou-se uma construção correcta designada pAc/VGF.

(d) Transfecção de células Sf9 com pAc/VGF. 0 plasmideo pAc/VGF foi co-transfectado com DNA de baculovirus, de tipo selvagem, de AcNPV, em células de insecto Sf9, (Spodop tera f rugi perda) . As transfectantes foram sondadas para o fenotipo de oclusão negativa em ensaios de placa. Uma placa de oclusão negativa foi isolada e, após cinco passagens de purificação em placa sucessivas, foi preparado um stock de vírus recombinante de elevado título.

C . Preparação de pAc/SFGF

Expressão de baculovírus de factor de crescimento de vírus do fibroma de Shope natural.

(a ) Preparação de pAc610 digerido com BaroHI . 0 plasmideo pAcólO foi digerido com BamH1 e SmaI. 0 sítio SmaI neste plasmideo está localizado a jusante do promotor do gene de polihedrina de baculovírus.

(b) Preparação de um fragmento Hincll-Sau3a de 430pb do DNA genómico do vírus de fibroma de Shope. 0 fragmento Bq1II de 3,7kb do C-fragmento BamHI de 19kb, do DNA genómico do vírus de fibroma de Shope, foi clonado em um plasmideo SP64 digerido com BamHI e designado por SP64/3,7. □ plasmideo SP64/3,7 foi

103 digerido com HincII e o fragmento HincII de lkb foi purificado em gel. Em seguida o fragmento de ikb foi digerido com Sau3a e o fragmento HincII-5au3a de 430pb foi purificado em gel.

(c) Ligação e isolamento de pAc/SFGF. 0 pAc 610 digerido com BamHI-SmaI foi ligado ao fragmento HincII-Sau3a de 430pb que contém o gene de SFGF, e a mistura resultante foi transformada em E. coli HB10I competentes. As transformantes foram sondadas por análise de restrição e foi isolada uma construção correcta designada por pAc/SFGF.

Exemplo X

Preparação de Polipéptidos

A. Sintese de Fase Sólida de VGF e TGF

1. Fragmento de VGF sintético. A sequência que corresponde ao VGF truncado, que se inicia com a sequência DIPAIR e que termina com a sequência LVDY, foi reunido num Applied

Biosystems Model 430A Peptide Synthesizer utilizando o protocolo padrão. 0 tratamento da resina peptídica final com ácido fluorídrico liquido, sob condições Standard low-high, forneceu o péptido desprotegido impuro. 0 péptido foi submetido a cromatografocagem em PBE94 (Farmácia). □ péptido parcialmente purificado foi eluído a pH 6,5. □ tratamento rápido com hidróxido de sódio 0,2 N removeu os grupos de protecção de cisteína (etilcarbamoílo), e o péptido foi oxidado na presença de glutatião oxidado e reduzido. A purificação em filtração de gel e HPLC forneceu VGF muito purificado com a sequência seguin te:

D IPA I RLCGPEGDGÍCLHGDCI HA RD IDGMYCRCSHGYTGIRCQHVVLVDY

104

À

2. TGF-α humano e murino sintético. TGF-α humano e murino foram sintetizados por via química, essencialmente como descrito anteriormente para VGF, e foram fornecidos pelo

Penninsula Labs.

B. Isolamento, de Polipéptidos Recombinantes Preparados em

Células Procarióticas

1. Factores de crescimento produzidos em vectores de base pBM utilizando o promotor PL e o repressor Cl de ts

E. co 1 i B (HB1Q1) contendo os plasmideos do factor de crescimento pBMll/NDP desenvolveu-se em caldo Lúria à temperatura de 30°C. A densidade da cultura foi avaliada a 550 nm e, quando a densidade alcançou uma absorvência de 0,7 a 0,9, a síntese da proteína de fusão do factor de crescimento foi induzida por aumento da temperatura para 42°C. A cultura foi incubada a esta temperatura durante 5 a 20 horas e, em seguida, as bactérias foram isoladas por centrifugação e congeladas à temperatura de -70°C até á sua utilização.

Para isolamento da proteína recombinante as células foram mergulhadas em tampão contendo 0,05 ΙΊ de NaH₂PQ₄ pH 7,2,

0,5 M de NaCl, 0,01 M de EDTA. Cento e cinquenta ml de tampão foram utilizados para a preparação de 50 g de bactérias. As células foram desagregadas por sonicaçào sobre gelo durante 15 minutos utilizando-se uma sonda de 1/4 de polegada, 507. de mareagem a 60 watts. A seguir à desagregação das células a proteína insolúvel foi recolhida por centrifugação a 12 000 rpm

105 num rotor GSA durante 90 minutos. 0 pellet contendo a proteína insolúvel foi em seguida re-suspenso em 50 ml de cloridrato de guanidina de 6 Μ. O material insolúvel foi recolhido por centrifugação durante 2 horas a 25 000 rpm num rotor de u1tracentrífuga Beckman tipo 30. 0 sobrenadante foi recolhido e guardado á temperatura de -20°C até utilização posterior.

A purificação da proteína de fusão foi realizada em colunas Sephacryl S300 ou Fractogel HW-55, equilibradas com cloridrato de guanidina i M. As fracções que continham a proteína de fusão foram identificadas como aquelas fracções que continham um polipéptido comportando um peso molecular consistente com o peso molecular do polipéptido codificado pelo gene sintético como determinado sobre gel de poliacri1amida-ureia a

157..

Para obtenção duma forma activa do factor de crescimento recombinante, a proteina Oe fusão foi deixada em dobragem por incubação em tampão 50 mM Tris-HCl, pH B,7, contendo cloridrato de guanidina 1 M, 1,25 mM de glutatião reduzido e

0,25 mM de glutatião oxidado â temperatura de 4°C durante 3 a dias. A actividade biológica do factor de crescimento foi controlada por um ensaio de ligação ao receptor competitivo como descrito anteriormente (ver Exemplo I.C.). Guando se obteve o nível máximo de actividade a proteína foi dialisada contra água destilada e liofilizada.

Se se pretende eliminar a sequência líder a proteína foi cindida ou por re-suspensão em ácido fórmico a 707. e incubação a 40°C durante 3 dias, ou por incubação durante a

106 noite à temperatura ambiente num excesso molar de 100 vezes de brometo de cianogénio. 0 produto cindido foi dialisado contra água destilada e liofilizado. Para posterior purificação o factor de crescimento recombinante foi re-suspenso em 407. de ace ton i t r i 1 o , TFA 0,17. e purificado por HPLC u 11 1 ι z ando-se uma coluna BioRad TSK-250. As fracções contendo o factor de crescimento foram reunidas e posteriormente purificadas utilizando-se HPLC de fase inversa num Waters pBondapak C-1B ou em

Rainin Dynamax C-B. 0 eluente constituía um gradiente 1inear de a 407. de acetonitrilo contendo 0,17. de TFA. As fracções que continham actividade de ligação ao receptor foram reunidas, liofilizadas e conservadas à temperatura de -20°C até á sua utili z ação.

(a ) TGF e TGF modificado (i ) N/TGF

TGF humano modificado recombinante foi produzido a partir do plasmideo pBNll/N/TGF e continha 33 aminoácidos do gene N no N-terminal e a sequência QEEK modificada em substituição da sequência QEDK humana natural .

(b) VGF modificado e truncado ( ι ) PAD/nVGFa

VGF modificado recombinante foi produzido a partir do plasmideo pBMll/PAD/nVGFa contendo a sequência da extremidade

N-terminal de VGF e as sequências modificadas GTC e GYACRC em substituição das sequências GDC e GNVCRC de VGF natural. D fragmento n VGFA foi expresso sob a forma duma proteína de fusão com uma sequência de sinal de fosfatase alcalina no N107

-termina 1 ( ii ) e foi truncado na sequência YQR no C-terminal.

NDP/VGFa

VGF modificado recombinante foi produzido a partir do plasmideo pBMl1/NDP/VGFa iniciando —se na sequência DIPAIR e terminando na sequência YKQR em VGF. Este tinha as sequências modificadas GTC e GYACRC em vez das sequências de VGF natural

GDC e GMYCRC. 0 fragmento VGFa foi expresso sob a forma duma proteína de fusão com 32 aminoácidos do gene N no N-terminal e o dipéptido de ácido aspártico-prolina lábil ao ácido.

( i i i ) VGF a □ fragmento VGF foi preparado como descrito em 2.b anteriormente e após cisão da proteína de fusão por tratamento com ácido foi subsequentemente purificado por HPLC.

(iv) NDP/VGFA

VGF modificado recombinante foi produzido a partir do plasmideo pBM11/NDP/VGFA iniciando-se na sequência DIPAIR e terminando na sequência YKQR em VGF e comportando as sequências modificadas GTC e GYACVC em vez das sequências de VGF natural,

GDC e GMYCRC. O fragmento de VGFA foi expresso sob a forma duma proteína de fusão com 32 aminoácidos do gene N no terminal N e o dipéptido de ácido aspártico-prolina lábil ao ácido.

(c ) Híbridos de TGF/VGF quiméricos (i) N/TTV (TGF/TGF/VGF)

A	pa r 11r	do	plasmideo pBMll/N/TTV	produz iu-se	TTV
mod i f i c ado	recombinan te	contendo a sequência	de aminoácidos	de
TGF humano	em 2/3	do	aminotermina1 do gene	com excepção	da
sequênc i a	QEEK que	tinha sido alterada da	sequência humana

108 natural QEDK. 0 terminal carboxilo foi derivado da sequência de aminoácidos de VGF e terminado com a sequência YQR a jusante da sequência natural PNT. O fragmento de TTV foi expresso como uma proteína de fusão com 33 aminoácidos do gene N no terminal N.

(ii ) NDP/TTV □ TTV recombinante foi produzido a partir do plasmideo pBMll/N/TTV e modificado como descrito em (a) excepto no facto do fragmento TTV ser expresso como uma proteína de fusão de 32. aminoácidos do gene N no N-terminal e o dipéptido, lábil ao ácido, de ácido aspártico-prolina.

(iii) NDP/VTV

VTV modificado recombinante foi produzido a partir do plasmideo pBNl1/NDP/VTV contendo a sequência de aminoácidos de TGF humano no domínio médio com a sequência de aminoácidos

QEEK substituindo a sequência natural QEDK. Os domínios de N-terminal e de C-terminal foram derivados da sequência de VGF truncada e começam com a sequência DIPAIR e terminam com a sequência YQR. □ fragmento VTV foi expresso como uma proteína de fusão com 32 aminoácidos do gene N no N-terminal e o dipéptido lábil ao ácido de ácido aspártico-prolina.

(iv) NDP/TVV □ VTV modificado recombinante foi produzido a partir do plasmideo pBMl1/NDP/TVV contendo a sequência de aminoácidos de TGF humano no domínio de N-terminal do gene. Os domínios médio e de C-terminal foram derivados da sequência de VGF truncada e terminam com a sequência YQR. Além disso o gene sintético tem a modificação GYACVC por GMYCRC. □ fragmento TVV

109 foi expresso como uma proteína de fusão com 32 aminoácidos do gene N no N-terminal e o dipéptido lábil ao ácido de ácido aspártico-prolina.

2. Factores de crescimento produzidos em vectores comportando os promotores tac ou lac

Bactérias hospedeiras contendo as cassetes de expressão que comportam os promotores lac ou tac foram desenvo1 vi das a temperatura entre 30 e 37°C para uma densidade óptica de 0,2 a 0,B a A600 quer em caldo LB ou quer em meio definido quimicamente tal como o meio M9 suplementado com tiamina e glucose. Um antibiótico apropriado foi incluído no meio de crescimento para selecçâo dos hospedeiros contendo a cassete de expressão. As culturas bacterianas foram induzidas com uma concentração de 100 a 1 000 mM de IPTG e desenvolveram-se à temperatura de 30°C durante 16 a 24 horas. Para as cassetes de expressão sem um gene lacl os hospedeiros bacterianos comportavam um factor F com o gene lacql tal como JI4109, XL1, JM103, etc. Para cassetes de expressão que comportavam o gene lacl, exemplos de hospedeiros bacterianos são HB101, DHl, DH5, etc.

No caso em que o hospedeiro bacteriano tinha um operon lac funcional (lac+) a cassete de expressão pode ser induzida com lactose a 17.. Após o período de indução, os factores de crescimento podem ser isolados do meio ou do pellet celular.

(a ) PAK/EGF

A partir de cassetes de expressão TacPak/EGF e pTcCPt/EGF, o EGF humano foi isolado a partir do meio em uma forma activa com a sequência de sinal de fosfatase alcalina

110 e1iminada

Aproximadamente 857. de EGF activo foi encontrado no meio com o restante associado com pellet celular. Estas cassetes de expressão geraram 4 mg/1 de EGF activo. As células foram retiradas do meio por centrifugação e o meio passado através de um filtro de espiral de cutoff 30 000 M_r Amicon

SY30, e em seguida através de uma coluna de Q-Sepharose e EGF humano altamente purificado foi eluido com 20 mM de NâP0₄ pH 7 com um gradiente de cloreto de sódio de 0 a 0,5 M. Alternativamente os factores de crescimento podem ser isolados do pellet celular por choque osmótico ou por sonicação e purificação pelo processo essencia 1 mente idêntico ao descrito anterιormente.

(b) PAK/nVGFa nVGFa recombinante foi produzido a partir da cassete de expressão pTCPt/nVGFa. 0 nVGFa foi isolado do pellet celular por sonicaçâo e mostrou constituir aproximadamente 407. da proteína bacteriana total.

C. Isolamento de VGF e de 5FGF Produzidos Por Expressão

Eucariótica de Genes Naturais

i. Preparação de VGF em células de rim de macaco.

VGF natural foi Produzido por infecçâo de células de rim de macaco com vírus de vaccinia. Monocamadas de células (BSC-1) de rim de macaco Cercopithecus foram infectadas com 15 unidades de formação de placa ipfu) por célula de VV purificado (estirpe WR desenvolvida em células Hela e purificada por sedimentação em gradiente de densidade de sacarose (Moss, B., (1981) em Gene Amplιfication and analysis, eds. Chirickjian,

J.G. and Papis, T.S. (E1sevier/North-Ho1 1 and, NY) , Vol. 2, pp.

111

253-266)). As células infectadas foram incubadas á temperatura de 37°C com aproximadamente 1 ml de meio basal de Eagle suplementado com soro fetal de vitela a 27. por 2x10* células.

As células de substituição infectadas foram tratadas de maneira idêntica. Os sobrenadantes de cultura celular foram clarificados por centrifugaçào de pequena velocidade e 11ofi1izados.

resíduo foi em seguida re-suspenso em ácido acético 1M e dialisado extensivamente contra ácido acético 0,2M. □ material insolúvel foi removido por centrifugação e o sobrenadante liofilizado e re-suspenso em 1/100 do volume original de ácido acético 1ΙΊ e conservado á temperatura de 4°C.

2. Preparação de VGF em células CHO.

Também foi produzido VGF natural por transfecção do plasmídeo pRSV/VGF contendo o fragmento do gene de VGF em células de ovário de hamster chinês. As células transfectadas foram expandidas e o meio e o peliet celular foi analisado para a presença de VGF por imunoprecιpitaçào utilizando-se um anti-soro contra um péptido de VGF de N-terminal.

3. Preparação de VGF no bicho da seda utilizando o promotor do baculovírus (a) Transformação. A célula hospedeira para AcNPV é a Spodoptera f rugi perda (sf9) . A fim de produzir um stock de vírus recombinante o plasmídeo contendo VGF foi misturado com

DNA de AcNFV e transfectado em células sf9 utilizando-se a técnica do fosfato de cálcio. Os vírus recombinantes foram isolados do meio e purificados em placa em células sf9. As placas recombinantes foram identificadas por hibridaçâo utili112 zando-se como sonda DNA de VGF radiomarcado.

(b) E x pressão. Uma vez identificado o vírus recombinante em seguida foi expandido em células sf9. □ stock de vírus recombinante foi em seguida utilizado para infectar células sf, as células lisadas.e os sobrenadantes sondados para a produção da proteina de VGF que foi purificada como descrito anteriormente para as células de mamífero infectadas com vírus da vaccinia.

A sequência prevista de VGF produzida em células de insecto é:

DSGNAIETTSPEITNATTDIPAIRLCGPEGDGYCLHGDCIHARDIDGMYCRCSHGYTGIR

CQHWLMYQRSENPNTTTSYIPSPGIMLVLVGIIIITCCLLSVYRFTRRTKLPIQDMWP oc or re na

Um sítio de glicosilação potencial asparagina na posição 15 da extremidade N-terminal do polipêptido. Esta sequência de 121 resíduos inicia-se com a sequência de N-terminal que tem sido determinada directamente para VGF purificado de células de macaco infectado com VV (isto é, no resíduo 20 da cadeia de leitura aberta de VGF) e continua até ao último resíduo da cadeia de leitura aberta. Portanto falta o péptido sinal (resíduos de 1 a 19 da cadeia de leitura aberta) mas inclui a sequência transmembranosa ( Y I P S P G I M L V L V G I I I ί T C C L LSVY ) .

D peso molecular previsto do péptidD de 121 resíduos é de 13 304 não contando o hidrato de carbono. O peso molecular aparente do VGF produzido por baculovírus é de 17 000 significativamente menor do que o Dbtido a partir de células infectadas com vírus da vaccinia (VV) indicando que as duas formas

113 t

têm que ser provavelmente processadas de um modo diferente. 0

VGF produzido de baculovírus pode não ter uma fracção adicional da sequência N-terminal ou uma fracção da sequência de C-terminal, ou ambas, e/ou pode diferir no tipo e na extensão de g1icosi1 ação.

4. Preparação de SFGF em bicho de seda utilizando-se o promotor de baculovírus.

(a ) Transfecçào de células sf9 com pAc/SFGF.

□ plasmideo pAc/SFGF foi co-transfectado em DNA de baculovírus de tipo selvagem AcNPV em células de insecto sf9 (Spodoptera f ruqιperda). As transfectantes foram sondadas para um fenotipo de oclusão negativa em ensaios de placa. Uma placa de oclusão negativa foi isolada e após 5 passagens de purificação em placa sucessiva foi preparado um stock de vírus recombinante de elevado título. 0 vírus recombinante tinha sido detectado como contendo o gene de SFGF por uma análise de

Southern.

D . EGF natural

1. Foi isolado EGF natural a partir de glândulas salivares de murganho ou adquirido do Co1 1 abora11ve Research.

Exemplo XI

Ensaios de Actividade

A . Ensaio de Mitogénese

Ds ensaios de mitogénese foram realizados do seguinte modo: fibroblastos humanos diplóides obtidos a partir de transplantes de prepúcio de recém-nascido foram disseminados

114 com uma densidade de 3 x 10⁴ células/cavidade (em placas de cavidades, Nunclon, Roskilde, Dinamarca) e desenvo1 veram-se até á confluência em meio de Eagle modificado de Dulbecco (GIBCO)/soro de vitela recém-nascida a 107.) . As culturas foram em seguida colocadas em meio contendo soro de vitela recémnascida a 0,27., e 2 dias depois EGF (10 ng/ml) ou factor de crescimento a ser ensaiado (10 ng equivalentes de EGF/ml) foi adicionado. Após B horas as culturas foram marcadas com 5-[i=»I]iodo-2'-desoxiuridina (Amersham, 10 pCi/ml, 5 Ci/mg; 1 Ci = 37 GBq), e a quantidade de isótopo incorporado em material insolúvel de TCA foi determinado como descrito em (Twardzik e t al , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1B2:5300-5304 (19B5)).

B. Ensaio de Estimulação de Desenvolvimento de Colónias em

Agar Mole

Uma camada base de 0,5 ml de agar a 0,57. (Agar Noble;

Difco Laboratories, Detroit, Michigan) em meio de crescimento foi adicionada às placas de cultura de tecidos Costar de 24 cavidades. Na camada de base de agar foi sobreposto 0,5 ml de agar a 37. em meio de crescimento contendo i a l,5xl0⁴ células/ml de células NRK, ou outra linha de células com interesse, e concentraçÓes várias do factor a ser ensaiado. As placas foram incubadas à temperatura de 37°C numa atmosfera humidificada de ar com 57. de dióxido de carbono e rea 1 ι men tadas após 7 dias por adição de 0,5 ml de meio de crescimento com agar a 0,37., e contendo a mesma concentração do factor a ser ensaiado. As colónias foram inumeradas não fixadas e não coradas. Foi registado o número de colónias com mais de 6

115 células.

C. Ensaio de Inibição de Ligação aci Receptor de EGF □s ensaios de rádio-receptor foram realizados do seguinte modo: a ligação de EGF marcado com i = ®I ( ¹ -=¹1 -EGF ) ao receptor correspondente em monocamadas de células A431 foi modificado do processo descrito por Cohen e Carpenter, Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 72:1317-1321 (1975). As células (1x10’ por cavidade) foram fixadas em placas de 24 cavidades, Linbro, Flow

Labora tor ies) com formalina a 107. em solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato antes do ensaio. As células fixadas com formalina não se desprendem das placas tão facilmente como as células não fixadas e os valores replicativos foram portanto mais consistentes. Sob as condições deste ensaio -^L-⁼'I-EGF ( 1 x 10^1<:’cpm/nmo 1 e ) satura o ensaio de ligação a 3nM; os ensaios foram realizados a 107. do valor de saturação. As concentrações de factor de crescimento são expressas como ng equivalentes de

EGF/ml, isto é, a quantidade requerida para produzir uma inibição de ligação de ^12?I-EGF equivalente á produzida por uma quantidade conhecida de EGF.

D. Ràdio-imunoensaio

Cada reacção de 50 μΐ continham o seguinte: 20 mM de fosfato de sódio a pH 7,4, 200mM de cloreto de sódio, 40mM de d i t i o t r e i t o 1 , 0,17. de albumina de soro de bovino, 0,17. de NaN3, péptído ^i2S5l marcado (2xl0‘*cpm) cor respondendo a 17 resíduos de terminal carboxilo de a TGF (Linsley et a 1 . , Proc. Na11 .

Ac ad . 5c i . USA S2:356-369 (1985)), anti-soro a uma diluição final de 1:5000 e outras adições como especificado. A reacção

116 iniciou-se pela adição de anti-soro e continuou à temperatura de 23°C durante 90 minutos. Em seguida adicionou-se um volume igual de Eu. aureus fixado com formalina a 10'/. (Pansorbin,

Calbiochem) e continuou-se a incubação por mais 30 minutos á temperatura de 23°C. 0 imuno-absorvente foi retirado por sedimentação e a quantidade péptido ·»·=®Ι marcado ligado foi avaliada. A Quantidade de péptido ligado, como corrigido para avaliação da ligação não específica na ausência de anticorpo (menos do que 5/. do total ) , e expresso sob a forma de percentagem de ligação máxima.

E. Cicatrização de Feridas

1. Ferimentos térmicos na mesoderroe·

Fizeram-se ferimentos térmicos na derme média no tórax dorsal de porcos Yorkshire fêmeas anestesiados (30 libras) cujos dorsos tinhapn sido rapados e depilados com um creme depilatório comercial. Uma matriz metálica (3x3 cm,

147gm) foi mantida à temperatura de 70^JC. em banho de água e colocado em contacto firme com a pele durante exactamente 10 segundos. Em seguida a ampola resultante foi retirada. Cinco queimaduras da mesoderme foram colocadas em cada lado da espinha dorsal e separadas uma das outras por aproximadamente uma polegada. As queimaduras foram tratadas duas vezes ao dia com aproxιmadamente 3 ml de um veículo em creme (Silvadene ^ ) isolado ou contendo factor de crescimento ou não foram tratados. Apds 9 ou 10 dias de tratamento com VGF natural, os porcos foram anestesiados e as escaras retiradas das queimaduras. Foram feitas biópsias de cada queimadura das áreas com

117

re-epitelizaçào.

em enxertos da mesoderme do dador

Um pequeno suíno com 5 meses de idade e 20,5 Kg foi anestesiado com 20 mg/Kg de ketamine e 2 mg/Kg de Rompum.

Barbeou-se o tórax dorsal preparou—se com betadine e lavou-se cuidadosamente com solução de cloreto de sódio. Fez-se uma série de seis incisões de 5x5 cm, no tórax dorsal do dador, com um dermatoma de Padgett de 60/1000 polegada por meio de duas incisões de 30/1000 de polegada. A terapêutica tópica incluía 1 ml de solução de cloreto- de sódio em 20 g de Silvadene distribuída unιformemente por entre as 6 feridas. Todas as feridas foram cobertas com uma gaze para queimaduras, chux, ace wrap, e gerkin'.' animal foi anestesiado c orno descrito anteriormente nos dias i, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10 e 11 do pós de operatório. Retiraram-se as gazes. As feridas foram cuidadosamente limpas com betadine e lavadas com solução de cloreto de sódio. Aplicou-se o agente apropriado e as foram recobertas como descrito anterιormente.

Exemplo XII

Actividade Biológica de Factores de Crescimento Recombinante

Preparados em Células Procarióticas

A. Ligação ao receptor de EGF

Este ensaio determina a capacidade de uma molécula para se ligar com o receptor de EGF avaliada pela sua capacidade para inibir a ligação de EGF com os seus receptores.

Todos os factores de crescimento e factores de crescimento

118 ·» quimérico, se modificados ou truncados, isolados até ao momento se apresentaram activos no ensaio de inibição da ligação de EGF com os receptores. Um resumo destes resultados mostram-se no quadro a seguir:

Quadro

Factores de crescimento recombinantes

de liqacâro com os receptores de EGF
Péptido	Cassette de E x pressão	Ligação Para
o Receptor	EGF Puro
N/TGF - fusão truncado modίf i c ado	p.BMll/N/TGF	9 57.	Sim
PAD/nVGFa - truncado	fusão modi f icado	pBMl1/PAD/nVGFa	9 57.	Sim
NDP/VGFa - truncado	fusão mod i f i c ado	pBMl1/NDP/VGFa	9 57.	Sim
NDP/VGFA - truncado	fusão modίf icado	pBMl1/NDP/VGFA	9 57.	Sim
N/TTV truncado quimérico	fusão mod i ficado	pBMl1/N/TTV	9 57.	Sim
NDP/TTV truncado quίmér ico	fusão modίf i c ado	pBMl1/NDP/TTV	9 57.	Sim
NDP/VTV truncado quimérico	fusão mod i f icado	pBMl1/NDP/V TV	9 5 7.	Sim
NDP/TVV truncado quimérico	fusão modi fiçado	pBMl1/NDP/TVV	9 57.	Sim
PAK/EGF		pBMl1/PAK/EGF	9 57.	Sim

119

EGF		pBMll/PAK/EGF		9 57.	Sim
PAD/EGF		pBMl1/PAD/EGF		9 57.	Sim
EGF		pBMl1/PAD/EGF		9 57.	Sim
PAK/EGF		TacPak/EGF		9 57.	Sim
EGF		TacPak/EGF		9 57.	Sim
PAK/EGF		pTCPt/EGF		9 57.	Sim
EGF		pTCPt/EGF		957.	Sim
	Uma comparação	das curvas de inibição	de	1ιgaçào	para
EGF de	murganho natural e para o factor	de	c resc i men to
quimérico	recombinante	N/TTV expresso por	bac	tèrιas	( um

polipéptido de fusão com 32 aminoácidos de N-terminal do gene N lambda e o híbrido modificado e truncado TGF/VGF) sugere que não existem diferenças na actividade de ligação.

B. Actividade mitoqénica vários factores de e em todos os casos com o efeito provocado indicados a seguir:

A actividade de purificados foi avaliada determinada era comparável compostos ensaiados sâo os c rescιmen to a ac 11vidade por EGF. Os

Quadro

Actividade Mitoqénica de Factores de Crescimento

Ac t i vidade

Péptido Mitoqénica*

TTV - quimérico truncado modificado Sim

N/TTV - fusão quimérico truncado modificado Sim •Avaliado pela incorporação -Ή-timidina ou de ^i=eI-ldU

120

C. Cicatrização de Ferimentos

1. Feridas na derme média □ efeito de TGF, EGF e VGF naturais ou sintéticos assim como de factores de crescimento recombinantes nos ferimentos da mesoderme foi avaliado como descrito no Exemplo

XI EI. A percentagem de área queimada original que cicatrizou foi medida por telemetria computorizada e determinada a percentagem de ferida com re-epitelização. As fendas maltratadas foram aproximadamente re-epitel izadas em 157.. □ tratamento com

Silvadene isolado ou com Silvadene e EGF resultou em uma re-epite 1ização de aprox imadamen te 507. enquanto com o tratamento com TGF sintético ou com VGF natural resultou numa re-epi tel i zaçâfo de aproximadamente 907.. A concentração óptima para provocar a re-epite 1ização de EGF foi entre 1 e 10 pg/ml, enquanto TGF sintético e VGF natural produziram a resposta máxima a 0,1 pg/ml.

Experiências idênticas às descrita foram realizadas para ensaiar o efeito na c feridas do TGF, o VGF (VGFa) sob a forma truncada, modificada ou de TGF e de VGF (TTV) de fusão quiméricos truncados modificados, todos produzidos por tecnologia de recombinação em

Estes factores de crescimento recombinantes e anteriormente

11r i zaçâfo das de crescimento híbridos aceleraram a c.

zaçào de feridas na mesma extensão que TGF uma concentração óptima de 0,1 pg/ml ou VGF natural com

121 em Enxertos da Mesoderme do Dador .

Ensaiou-se VGFa truncado modificado re1 a11vamente à sua capacidade para acelerar a cicatrizaçâo de fendas num modelo de enxerto de um dador. 0 regime de tratamento foi o descrito anteriormente no Exemplo I utilizando-se 1 ml em 20 g de Silvadene de VGFa a 5 pg/ml. Tiraram-se fotografias diariamente. 0 resumo dos resultados é referido em seguida:

Quadro

Efeito de VGFa Recombinante Sobre a Cicatrizaçâo de Feridas

Estado da Ferida

T ratamento*	POD** 7	POD 8	POD 9	POD 10
Solução de	mui to	aberto com	a maior	cicatri-
Cloreto de	aberto	a 1guma c ic a-	par te	zado
sódio		trização	cicatri- zada
VGFa truncado,	aberto;	a maior	cicatri-	cicatri-
mod í f i c ado	epi teli-	parte	z ado	zado
	zação	cicatri-
	eviden te	zado

* Silvadene éo veiculo ** POD = Dia Após a Operação

OGFa truncado modificado acelerou a cicatrizaçâo de feridas em comparação com um veículo de controlo.

As fotografias (não apresentadas) no dia pós-operatório Θ exibiram diferenças substanciais entre a solução de cloreto de sódio e o VGFa.

122

I

Exemplo XIII

Actividade Biológica de VGFa Preparado em Células

A. VGFa Preparado em Células BSC-1 de Rim de Macaco

1. □ meio proveniente de células BSC-1 após 24 horas de infecção com vírus da vaccinia (W) foi ensaiado para a presença de material que poderia competir com ⁱ-’l-EGF na ligação aos receptores de EGF de células de carcinoma epidermóide humano (A431) ricas. As células infectadas com VV libertaram uma actividade potente que competia com EGF a qual foi designada por VGF. 0 volume do meio de controlo de cultura de células BSC-1 supostamente infectadas continha uma actividade mínima na competição com EGF.

No controlo da produção de EGF no exame precoce, 2 dias após a infecção, observaram-se níveis reforçados de VGF no meio de cultura. Perto das 12 horas detectaram-se quantidades máximas desta actividade no sobrenadante da cultura com apenas um aumento ligeiro às 24 horas.

D nível de produção de VGF verificou-se ser uma função da multiplicidade da infecção do vírus como se demonstra no quadro seguinte.

123

I

Quadro

Efeito da Mu1tiplicidade de Infecção na Libertação de VGF

Multiplicidade de Vírus VGF Libertado em nq eq .

( pfu por célula) de EGF por ml

2)7

4,5

6,1

10,1

As culturas de células BSC-1 foram infectadas numa relação célula/pfu indicada e os sobrenadantes (aproximadamente m1/2x10^ô células) foram colhidos às 24 horas após a infecção.

Cada amostra foi acidificada, liofilizada e analisada em duplicado por ensaios de rádio-receptor para EGF como descrito por (Delarco and Todaro, Proc. Natl. Acad. 5c i USA 7 5:401-40 5, (1978)). ng eq . , equivalentes em nanogramas.

pareιa 1 de VGF.

A actividade que compete com EGF encontrada em células BGC-l infectadas por VV foi purificada parcialmente por extracçâo dos sobrenadantes de cultura em meio ácido às 24 horas após infecção, como descrito antes. Ds polipéptidos solubilizados por meio ácido (10,5 mg)' dos sobrenadantes foram aplicados numa coluna Bio-Gel PIO equilibrada com ácido acético

1M e as amostras de cada fracção analisadas para a sua actividade de competição com EGF. 0 pico activo principal

124

( fracçâo	42) eluiu ligeiramente após o marcador	de	anidrase
carbóni c a	de Mr 29. 000 com	um Mr aparente de 25 .	000 .	□	peso
mo 1ecu1 ar	foi c on firmado	uti1ízando-se colunas	de	HPLC	de
exc1usão	Bio-Sil TSK 250	ligadas em tandem, em	que	toda a
ac tividade	que eluiu sob a	forma de um pico de um	marc ador	de
proteina	na região de I4r-	25. 000. Um micrograma	de	VGF
pu rιf i c ad o	parcialmente foi equivalente a 90 ng	de	EGF	no
ensaio de	competição com rádιo-receptor.

. Posterior purificação de VGF.

As fracções reunidas da coluna de filtração em gel (25-35) foram concentradas por centrifugação sob vácuo, resuspensas em ácido trif luoroacêtico a 0,057. (TFA), clarificadas e injectada5 em colunas de 3,9 mm x 30 cm pBondapak C_ie (Waters, Milford, Ma). Os péptidos eluiram com um gradiente inear entre 20 e 607. de acetonitrilo em TFA a 0,057. com débito de 1,0 ml/ minuto à temperatura de 22°C. Analisaram-se aliquotas de cada fracçâo num ensaio de rádio-receptor para a actividade competitiva com EGF. 0 péptido que correspondia á actividade máxima foi recolhido e diluído com TFA a 0,057. , re-injectado numa coluna pBondapak e eluído utilizando-se condições isocráticas. A concentração de acetonitrilo era cerca de 22 a 257..

A, comparação dos níveis de VGF produzidos por células

BSC-1, infectadas, com 15pfu de VV por célula com os níveis de α-TGF produzido por células transformadas com retrovirus está representada no quadro seguinte.

125

Quadro

Comparação da Actividade Biológica de

VGF com q—TGF e EGF

	Ligação ao Receptor de EGF-	indução de Síntese de DNA-	Estimulação de Crescιmento Ce1u1 ar I ndependen te da Ancoraqem4
Factor de	ng eq. de	[ ^ = =-1 ] IdU	Colónias em
c resc imen to1	EGF/ml de meio	incorporado (cpm por placa)	Agar mole/placa
Nen hum
	—	1,779	<20
VGF	2% 3	3,760	108
TGF-q	0,’2	NT	294
EGF	——	8,482	346

NT não testado.

VGF (90 ng equivalentes ( eq ) de EGF/pg de proteína) foi purificado por filtração em gel seguida de eluiçâo numa coluna pBondapak C_ie (Waters Associates). 0 α-TGF foi purificado de células de embrião de rato Fisher transformadas com o vírus de sarcoma· felino Snyder-Theilen como descrito em Narquardt et a 1 , Proc. Natl. Acad. 5ci. USA 80:4684-4688 (1983); o EGF foi purificado a partir de glândula submaxilar de murganho (Cohen et a 1 . , JBiol . Chem. 255:41834—41B42 (1980)).

A quantificação de EGF em equivalentes numa curva de competição de ligaçào ^--‘'I-EGF descrito.

foi baseada padrão, como

126 c omo : foram mesmo

Os ensaios de mitogénese foram descritos culturas inactivas de fibroblastos humanos diplóides tratados com 10 ng de EGF purificado por ml ou com o número de EGF equivalente de VGF por ml. Os valores para [ χ = =Ί ] iodo-desox iur i d i na ( [ ^{1 =} 1 ] I dU ) incorporada representam a média de determinações em triplicado.

0 número de colónias em agar mole representa o número médio de colónias contendo um mínimo de 20 células NRK por seis campos de baixa concentração escolhidos ao acaso 10 dias após a sementeira (1,5χ10^Λ células/ml) com EGF purificado (5 ng/ml) ou o mesmo número de equivalentes de EGF de VGF/ml e 2,0 ng de TGF-(3/ml purificado de plaquetas humanas como descrito em Assoian et a 1 . , J. Biol. Chem. 258:7155-7160, (1983). As placas de células NRK tratadas com TGF-β isolado citadas ante.s não formaram colónias.

B. VGF Preparado em Células CHO

A actividade biológica de VGF preparado em células

CHO foi avaliada utilizando-se o ensaio de ligação com o receptor de EGF. □ meio de crescimento de cultura foi utilizado sem outra purificação. 0 factor de crescimento 1ígou-se com o receptor de EGF.

C. VGF Preparado no Bicho de Seda

A actividade biológica de VGF purificado parcialmente (aproximadamente 507.) preparado no bicho de seda foi avaliado utilizando-se o ensaio de ligação com o receptor de EGF, e mostrou ligar-se com o receptor de EGF.

127

Quadro

	Percentaqem de	Epítel izaçâfo	de Feridas Após	T ratamento
		Com Factor de Crescimento
	Suíno 1
	(9 d ias
após	queimadura)			VGF em pg/ml
				natura1
Lado	direito	Si 1vadene	Não tratado
		157.	07.
Lado	esquerdo	Si 1vadene	Nâo tratado
		7 57.	557.
	Suíno 2
	(10 dias
após	queimadura)
Lado	d i rei to	Si 1vadene	Não tratado
		507.	07.
Lado	esquerdo	Si 1vadene	Nâo tratado
		507.	07.
	Suíno 3
(9 dias			TGF em pg/ml
a pós	queimadura)			de rato
Lado	d i rei to	Silvadene	Não tratado
		207.	157.
				TGF em pg/ml
				humano
Lado	esquerdo	Si 1vadene	Nâo tratado
		257.	57.

* VGF :

VGF natural de células infectadas com vírus de vaccinia

128

D. Comparação Imunológicá de EGF e de TGF

No rádio-imunoensaío descrito anteriormente observou-se um deslocamento de 507. do antigénio do anticorpo nos 17 aminoácídos do terminal carboxilo da molécula de TGF-α de rato, com uma concentração antigénica de aproximadamente 0,2 a 0,3 ng equivalentes de EGF em que TGF-α marcado com ^{Χ =} compete com

TGF-α. Quando se ensaiou VGF em concentrações equivalentes não se observou competição. No rádio-imunoensaío competitivo para preparações de EGF natural e de VGF, ainda que quando testados na dose de 50 ng de EGF equivalentes por ml exibiram um deslocamento mínimo (<107.) de ^X=SI-EGF do um anticorpo policlonal para EGF natural.

É evidente, pelos resultados anteriores, que o VGF é um agente de epitelização potente comparando-se satisfatoriamente com outros factores de crescimento que foram prevlamente ensaiados e que demonstraram possuir actividade mitogènica. Os referidos polipéptidos podem ser utilizados em vários hospedeiros para induzir uma resposta imunogénica, reforçar a proliferação celular, a cicatrização de fendas, etc. Nas feridas observa-se epitelização e vascu1 arιzaçâo assim como um restabelecimento rápido da força de fenda, isto é , da resistência à separação ou dilaceração. Os hospedeiros incluem mamíferos tais como os roedores, os animais domésticos, os primatas e os seres humanos.

129 'Ή

De acordo com a presente invenção proporcíonam-se novas composições que apresentam uma larga escala de capacidade numa variedade de campos tais como em diagnóstico, in vitro e efeitos in vivo sobre as células, actuando como mitogénios, agentes aditivos em meios nutrientes, utilização como agonistas ou como antagonistas para EGF e TGF, actuando como agentes imunogénicos actuando como agentes terapêuticos, reforçando a cicatrização de feridas, etc. Além disso proporcionando um pequeno oligopéptido com actividade de ligação, o oligopéptido pode ser utilizado por si ou em associação com outros polipéptidos, fundido com outros polipéptidos para variar as propriedades dos outros polipéptidos resultando na ligação do polipéptido a células que contêm receptores para o factor de crescimento. Deste modo podem ligar-se revers1ve1mente vários polipéptidos a células que contêm receptores para o factor de crescimento, alterando as propriedades das células de formas pré-determinadas.

Todas as publicações e pedidos de patentes de.

invenção mencionados nesta memória descritiva sàD indicadores do nível técnico para os especialistas nesta matéria. Todas as publicações e pedidos de patentes de invenção são citados pela referência na mesma extensão como se cada publicação du pedido de patente individual fosse específica e ind 1 vídualmente indicado para ser incorporado pela referência.

Tendo a presente invenção sido descrita na totalidade, é evidente para um técnico nesta matéria que muitas alterações e modificações podem ser feitas sem afastamento do espírito e do âmbito das reivindicações anexas.

130

Claims (23)

1 - Método para a preparação de uma sequência de DNA que codifica um polipéptido, o qual: (1) é capaz de se ligar a um receptor de EGF, (2) exibe, substancialmente, a estrutura em ansa idêntica à do factor de crescimento de ocorrência natural capaz de ligação com um receptor de EGF (ligando natural), e (3) exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com um ligando

131 ι

do receptor de EGF natural, incluindo o dito polipéptido três domínios constituindo, cada um deles, uma sequência de aminoácidos que exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com fragmentos de ligandos naturais, iguais ou diferentes, e uma posição relativa idêntica à dos ditos fragmentos dos ditos ligandos naturais, definindo-se os domínios referidos do seguinte modo:

um primeiro domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de N-terminal, que se inicia próximo do aminoácido aa^

1 1 1 até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido aa

1 5 até ao aminoácido aa ;

um segundo domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de fragmento central, que se inicia próximo do aminoácido

11 15 aa até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido

25 29 aa até ao aminoácido aa um terceiro domínio de, pelo menos, cerca de 14 aminoácidos de C-terminal amino, que se inicia próximo do aminoácido

2 c o q aa até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido aa⁴^ até ao aminoácido aa^³; e a referida sequência de DNA codifica ainda, facultativamente.um quarto domínio como um domínio de N-terminal extremo de, pelo menos, cerca de 5 aminoácidos, que se inicia próximo

- 7 -1 do aminoácido aa até ao aminoácido aa , e termina próximo do - 4 5 - 7 aminoácido aa até ao aminoácido aa , comportando, facultativamente, uma sequência de aminoácidos capaz de ser se 1ectivamen132

I te cindida, inserida no terminal carboxilo do dito quarto domínio, unida ao terminal amina do primeiro domínio referido, com a condição de estar presente a referida sequência de DNA que codifica o referido quarto domínio e codifica outros aminoácidos além dos aminoácidos de extremidade de N-terminal do ligando natura1,codificado pela dita sequência de DNA, quando o referido polipéptido possui uma sequência de aminoácidos idêntica à do ligando natural, caracterizado pelo facto de:

se preparar a dita sequência adicionando, em série, desoxinucleótidos, para se obter a totalidade ou uma fracção da sequência de DNA pretendida, e de se ligar qualquer sequência restante à fracção sintetizada.

2 - Método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um ligando natural escolhido entre VGF, TGF-alfa, EGF, MGF, SFGF, ou anfir^egu 1 ina .

3 - Método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência de DNA codificar, ainda,uma sequência líder comportando, eventualmente, uma sequência de aminoácidos capaz de ser se 1ectivamente cindida, inserida num terminal carboxilo da referida sequência líder, ligada ao terminal amina do primeiro domínio referido, ou ao terminal amina do quarto domínio referido, quando este quarto domínio está presente .

4 - Método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência líder ser um fragmento

133 de N-terminal de uma N-proteína-1ambda, cro proteína, ou anfirre g u 1 i n a .

5- Método, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a sequência líder ser uma sequência sinal ou uma sequência sinal modificada.

6- Método, conforme reivindicado na reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a sequência sinal ser uma sequência sinal de fosfatase alcalina, uma sequência sinal de TGF-beta de macaco ou uma sequência sinal de toxina assassina de K.1act i s.

7- Método, conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 1 e 3 a 6, caracterizado pelo facto de, pelo menos, um dos domínios citados exibir uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com um fragmento de VGF, TGF-alfa, EGF ou SFGF.

8- Método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de a referida sequência de DNA codificar VGF.

9- Método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterí zado pelo facto da referida sequência de DNA codificar SFGF.

10- Método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência referida incluir, pelo menos, uma alteração da sequência que codifica um ligando natural, que resulta nas alterações da sequência dos aminoácidos seguintes: HGD para HGT; GMYC para GYAC; RCS para VCS; CLHGDC para CLHGTC;

e GMYCRC para GYACVC.

11- Método, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a sequência de DNA referida se ligar, peí<

1 34 menos, a uma sequência adicional, e de produzir um plasmideo que inclui os domínios funcionais de:

ρΒΜΓΐ/NDP/EGFj pBMll/PAD/EGFj pBMl1/PAK/EGFj pBMll/N/TGF; pBMll/NDP/VGFA/ pBMl1/NDP/VGFâ; pBMl1/PAD/nVGFa,· pBMll/PAK/nVGFa; pRSV/VGF) pAc/SFGF; pAc/VGFj ptac/TTV; TacPak/EGFj pTCPt/EGFj pTCPt/nVGFa; pBMll/N/TTV; pBMll/NDP/TTV; pBMll/NDP/VTV; ou pBMlfi/NDP/TW.

12- Método para a preparação de uma sequência de expressão (cassette de expressão) que inclui, na direcção de transcrição, uma região reguladora de iniciação de transcrição e de tradução, funcional numa célula hospedeira; uma sequência de DNA que codifica um polipéptido, o qual (1) é capaz de se ligar a um receptor de EGF, (2) exibe, substancialmente, a estrutura em ansa similar à do factor de crescimento de ocorrência natural, capaz de se ligar a um receptor de EGF (ligando natural), e (3) exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com um ligando natural, incluindo o dito polipéptido três domínios, cada um dos quais constitui uma sequência de aminoácidos que exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com fragmentos de ligandos naturais, iguais ou diferentes, e posição relativa idêntica à dos fragmentos do ligando natural referido, definindo-se os domínios referidos do seguinte modo:

um primeiro domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de N-terminal, iniciando-se próximo do aminoácido aa^ até

1 1 1 ao aminoácido aa , e terminando próximo do aminoácido aa até ao

135 aminoácido aa

15 .

} um segundo domínio de, pelo menos, 11 aminoácidos de fragmento central, que se inicia próximo do aminoácido aa^

15 2 5 até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido aa até ao aminoácido aa ;

um terceiro domínio de, pelo menos, cerca de 14 aminoácidos de C-terminal amino, que se inicia próximo do aminoác_i_

25 2 9 do aa até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido aa⁴^ até ao aminoácido aa^³; θ codificando, ainda, a sequência de DNA referida, facultativa mente, um quarto domínio como um domínio de extremidade

N-terminal, de, pelo menos, seis aminoácidos, que se inicia pró -7 -1 ximo do aminoácido aa até ao aminoácido aa , e que termina - 4 5 - 7 próximo do aminoácido aa até ao aminoácido aa , incluindo, facultativamente, uma sequência de aminoácidos capaz de ser se lectivamente cindida, inserida no terminal carboxilo do quarto referido, unida ao terminal amina do dito primeiro domínio, com a condição de estar presente a referida sequência de DNA que codifica o quarto domínio citado, e codifica outros aminoácidos além dos aminoácidos de extremidade N-terminal do ligando do receptor EGF na tiural, codificado pela sequência de DNA citada, quando o poiipéptido possui uma sequência de aminoácidos similar a um ligando de receptor de EGF natural; e uma região reguladora de terminação de transcrição e de tradução, funcional na referida célula hospedeira, caracterizado pelo facto de compreender:

136 a ligação da referida sequência de DNA às ditas regiões reguladoras citadas, para se obter a sequência de expressão referida (cassette de expressão).

13- Método para a preparação de uma célula hospedeira compreendendo uma sequência de expressão (cassette de expressão) que inclui, na direcção de transcrição, uma região reguladora de iniciação de transcrição e de tradução, funcional numa célula hospedeira; uma sequência de DNA que codifica um polipéptido, o qual (1) é capaz de se ligar a um receptor de EGF, (2) exibe, substancialmente, a estrutura em ansa similar à do factor de crescimento de ocorrência natural, capaz de se ligar a um receptor de EGF ( Π gando natural), e (3) exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com um ligando natural, incluindo o polipéptido citado três domínios, cada um dos quais constitui uma sequência de aminoácidos que exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com os fragmentos de ligandos naturais, iguais ou diferentes, de receptor de EGF, ,e que exibe uma posição relativa idêntica à dos referidos fragmentos do dito ligando natural, definindo-se os domínios referidos do seguinte modo:

um primeiro domínio de, pelo menos, cerca de 11 amin_o ácidos de N-terminal, que se inicia próximo do aminoácido aa~^

1 1 1 até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido aa

1 5 até ao aminoácido aa ;

um segundo domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de fragmento central, que se inicia próximo do aminoácido

137

11 15 aa até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido

25 29 aa até ao aminoácido aa ;

um terceiro domínio de, pelo menos, 14 aminoácidos 2 5 de C-terminal amino, que se inicia próximo do aminoácido aa até

29 40 ao aminoácido aa , e que termina cerca do aminoácido aa até ao aminoácido a a $ ; θ a referida sequência de DNA codifica ainda, facultatg vamente, um quarto domínio como um domínio extremo de N-terminal de, pelo menos, cerca de 6 aminoácidos, que se inicia próximo do - 7 -1 aminoácido aa até ao aminoácido aa , e termina próximo do ami-45 - 7 noácido aa até ao aminoácido aa , comportando, f acu 1 tat i vamejn te, uma sequência de aminoácidos capaz de ser se 1ectivamente cindida, inserida no terminal carboxilo do quarto domínio citado, Π gada ao terminal amina do primeiro domínio citado, com a condição de estar presente a referida sequência de DNA que codifica o quar to domínio referido, e codifica outros aminoácidos além dos amino ácidos de extremidade N-terminal do ligando natural, codificado pela dita sequência de DNA quando o polipéptido inclui uma sequên cia de aminoácidos idêntica a um ligando natural; e uma região reguladora de terminação de transcrição e de tradução, funcional na dita célula hospedeira, caracterizado pelo facto de compreender :

a transformação da dita célula hospedeira, sob condições de transformação com a dita sequência de expressão (cassette de expressão).

138

14- Método para a preparação de um polipéptido, o qual (1) é capaz de se ligar a um receptor de EGF, (2) exibe, substancialmente.a estrutura em ansa similar à do factor de crescimento de ocorrência natural, capaz de se ligar a um receptor de EGF (ligando natural), e (3) exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com um ligando natural, incluindo o polipéptido referido três domínios, constituindo cada um deles uma sequência de aminoácidos que exibe uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com fragmentos de ligandos de receptor de EGF natural, iguais ou diferentes, e exibindo uma posição relativa idêntica à dos fragmentos citados do dito ligando natural, definindo-se os referidos domínios do seguinte modo:

um primeiro domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de N-terminal, que se inicia próximo do aminoácido aa θ até ao aminoácido aa\ e que termina próximo do aminoácido aa^

1 5 até ami noác i do aa ;

um segundo domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de fragmento central, que se inicia próximo do aminoácido

11 15 aa até ao aminoácido aa , e que termina próximo do aminoácido

25 29 aa até ao aminoácido aa um terceiro domínio de, pelo menos, cerca de 14 amin_o ácidos de C-terminal amino, que se inicia próximo do aminoáci25 29 . · do aa até ao aminoácido aa , e que termina proximo do aminoácido aa⁴⁰ até ao aminoácido aa⁵^; e a sequência de DNA citada codifica ainda, faculta139 tivamente, um quarto domínio como um domínio extremo de N-termi nal de, pelo menos, seis aminoácidos que se inicia próximo do -7 -1 aminoácido aa até ao aminoácido aa , e que termina próximo -45 -7 do aminoácido aa até ao aminoácido aa , comportando, facultativamente uma sequência de aminoácidos capaz de ser selectivamente cindida, inserida no terminal carboxilo do quarto domínio referido, ligada ao terminal amina do primeiro domínio referido, com a condição de estar presente a sequência de DNA citada que codifica o quarto domínio referido, e codifica outros aminoácidos além dos aminoácidos de extremidade N-terminal do ligando natural, codificado pela dita sequência de DNA, quando o polipéptido inclui uma sequência de aminoácidos idêntica a um ligando de receptor de EGF natural; e uma região reguladora de terminação de transcrição e de tradução, funcional na dita célula hospedeira, caracterizado pelo facto:

de se desenvolver uma célula hospedeira que inclui uma sequência de expressão (cassette de expressão), na direcção da transcrição, uma região reguladora de iniciação de transcrição e de tradução, funcional na dita célula hospedeira, uma sequência de DNA que codifica o dito polipéptido, e uma região reguladora de terminação de transcrição e de tradução, num meio de cultura apropriado, pelo que o dito polipéptido é expresso; e de se isolar o dito polipéptido.

15- Método para a preparação de um polipéptido, o qual (1)

140 é capaz de se ligar a um receptor de EGF,(2) exibe, susbtancíalmente, a estrutura em ansa idêntica à de um factor de crescimen· to de ocorrência natural, capaz de se ligar a um receptor de EGF (ligando natural), e (3) inclui uma homologia de, pelo menos, cerca de 30% com um ligando natural, incluindo, o dito polipéptido três domínios, constituindo, cada um destes, uma sequência de aminoácidos que exibe uma homologia de, pelo menos, 30% com os fragmentos dos ligandos naturais, iguais ou diferentes, e uma posição relativa idêntica à dos fragmenos citados, do dito ligando natural, definindo-se os domínios referidos do seguinte modo: .

um primeiro domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de N-terminal, que se inicia próximo do aminoácido aa” até ao aminoácido aa , e termina próximo do aminoácido aa 1 5 até ao aminoácido aa ;

um segundo domínio de, pelo menos, cerca de 11 aminoácidos de fragmento central, que se inicia próximo do ami11 15 noácido aa até ao aminoácido aa , e termina próximo do ami25 29 noácido aa até ao aminoácido aa ;

um terceiro domínio de, pelo menos, cerca de 14 aminoácidos de C-terminal amino, que se inicia próximo do ami2 5 2 9 noácido aa até ao aminoácido aa , e termina próximo do aminoácido aa⁴^ até ao aminoácido aa$³; e a sequência de DNA citada codifica ainda, facultativamente, um quarto domínio como um domínio extremo de N-ter141 minai de, pelo menos, cerca de 6 aminoácidos, que se inicia pró ximo do aminoácido aa”? até ao aminoácido aa”¹, e termina pró-45 - 7 ximo do aminoácido aa até ao aminoácido aa , comportando, facu 1 tativamente, uma sequência de aminoácidos capaz de ser seIectivamente cindida, inserida no terminal carboxilo do quarto domínio referido, ligado ao terminal amina do primeiro domínio referido, com a condição de estar presente a sequência de DNA referida que codifica o quarto domínio referido, e codifica outros aminoácidos além dos aminoácidos da extremidade N-terminal do ligando natural, codificado pela referida sequência de DNA, quando o polipéptido referido inclui uma sequência de aminoácidos idêntica a um ligando natural, caracterizado pelo facto:

de se preparar a dita sequência adicionando-se , em série, aminoácidos protegidos, para se obter a sequência do polipéptido refer i do;

de se eliminarem os grupos de protecção; e de se isolar o polipéptido pretendido.

16- Método, conforme reivindicado em qualquer das reivindicações 14 e 15, caracterizado pelo facto de o polipéptido citado incorporar a seguinte sequência, de aminoácidos ou um seu fragmento de, pelo menos, 37 aminoácidos que inclui, pelo menos, cerca dos aminoácidos de 1 a 37;

142 «a -24 -20 -15 -10 -5 -1

DSGNAIETTSPEITNATTDIPAIR

1 ' 5 10 ' 15 20

LCGPEGDGYCLHX¹GDCIHX²ARD

25 30 35 40

IDGX3MYCRCSHGYTGIRCQHVV

45 50 53

LVDYQRSENPNT

1 ’ 2 na qual X representa uma ligação dupla ou um aminoácido; X representa uma ligação dupla ou de um a dois aminoácidos; X3 repre1 2 senta uma ligação dupla ou de 1 a 4 aminoácidos; e X , X , e X3 podem ser iguais ou diferentes.

17- Método, conforme reivindicado na reivindicação 16, carac14 terizado pelo facto do aa referido representar treonina; do

24 2 5 aa referido representar tirosina; do aa referido reoresentar

2 7 alanina; e do aa referido representar valina.

18- Método, conforme reivindicado na reivindicação 16, caracterizado pelo facto de a dita sequência de aminoácidos compreender desde o aa^ até ao aa⁴\

19- Método, conforme reivindicado na reivindicação 18, carac1 4 terizado pelo facto de o dito aa representar treonina, o dito

24 2 5 aa representar tirosina, e o dito aa representar alanina.

20- Método, conforme reivindicado na reivindicação 19, caracterizado pelo facto de se substituir a sequência de aminoácidos

- 6 1 3 referida, desde aa até aa , pela sequência de aminoácidos seguinte:

143 ** 6 -11 5 10 13

VV8HPNDCPDSHTQPCFHO

21- Métodoconf orme reivindicado na reivindicação 19, caracterizado pelo facto de se substituir a sequência de aminoácídos referida, desde aa¹⁴ até aa²⁷, pela sequência de aminoácídos seguinte: „ _{i4 20 25} 27

TC8FLV0BDKPACV

22- Método, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se substituir pelo ácido glutâmico o ami22 noácido ·representado pelo símbolo aa referido.

23- Método para a preparação de uma sequência de DNA que codifica um polipéptido que possui uma sequência, conforme reivindicado em qualquer das reivindicações de 16 a 22, caracterizado pelo facto de compreender:

a preparação da dita sequência,.adicionando-se, em série, desoxinuc1eótidos, para se obter uma sequência de DNA citada total ou uma sua fracção, e de se ligar qualquer sequência restante à fracção sintetizada.