JPH0482900A - 新規ｍ―ｃｓｆ及びその製造方法 - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は遺伝子工学に関し、特にヒト由来ＭＣＳＦをコ
ードする遺伝子より、天然のヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦの
カルボキシ末端を有し、Ｎ末端側に変異を持つ新規Ｍ−
ＣＳＦのポリペプチド及びその遺伝子工学的な製造方法
に関する。
ードする遺伝子より、天然のヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦの
カルボキシ末端を有し、Ｎ末端側に変異を持つ新規Ｍ−
ＣＳＦのポリペプチド及びその遺伝子工学的な製造方法
に関する。
Ｍ−ＣＳＦは抗癌剤投与や放射線照射による白血球減少
の回復促進剤、あるいは種々の感染症の治療剤、抗腫瘍
剤、骨髄移植後の白血球増加剤、高コレステロール血症
治療剤、動脈硬化治療剤として医薬への応用の他、白血
球減少症、再生不良性貧血等の診断剤としての用途が期
待される物質である（Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ、に、ｅｔ
ａｌ、 ；Ｊａｐ、Ｊ、Ｍｅｄ、、２１１８７（１９８
２））。
の回復促進剤、あるいは種々の感染症の治療剤、抗腫瘍
剤、骨髄移植後の白血球増加剤、高コレステロール血症
治療剤、動脈硬化治療剤として医薬への応用の他、白血
球減少症、再生不良性貧血等の診断剤としての用途が期
待される物質である（Ｍｏｔｏｙｏｓｈｉ、に、ｅｔ
ａｌ、 ；Ｊａｐ、Ｊ、Ｍｅｄ、、２１１８７（１９８
２））。
［従来の技術］
ＣＳＦは哺乳動物の骨髄白血球前駆細胞に作用し、その
細胞を顆粒球またはマクロファージへと分化増殖させる
といわれている。ＣＳＦはＩｎｖｉｔｒｏで骨髄細胞を
培養するときに必須の物質であり、この物質の存在下で
骨髄白血球前駆細胞は分化増殖し、より成熟した細胞の
集落（コロニー）を形成する （Ｐｌｕｚｎｉｋ、Ｄ、
Ｈ，＆ ５ａｃｈｓ、Ｈ。
細胞を顆粒球またはマクロファージへと分化増殖させる
といわれている。ＣＳＦはＩｎｖｉｔｒｏで骨髄細胞を
培養するときに必須の物質であり、この物質の存在下で
骨髄白血球前駆細胞は分化増殖し、より成熟した細胞の
集落（コロニー）を形成する （Ｐｌｕｚｎｉｋ、Ｄ、
Ｈ，＆ ５ａｃｈｓ、Ｈ。
Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、、６６３１９ （１９
６５）、 Ｂｒａｃｌｌｙ、Ｔ、Ｒ，＆Ｍｅｔｃａｌｆ
、Ｄ、 ； Ａｕ５ｔ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ
、、４４２８７ （１９６６））。
６５）、 Ｂｒａｃｌｌｙ、Ｔ、Ｒ，＆Ｍｅｔｃａｌｆ
、Ｄ、 ； Ａｕ５ｔ、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍｅｄ
、、４４２８７ （１９６６））。
ＣＳＦは種々の動物細胞や組織が生産する糖蛋白質てあ
り、Ｉｎ ｖｉｔｒｏの機能、即ち半固形培地中で骨
髄白血球前駆細胞が分化増殖したコロニーの形態から４
種に分類されている。即ち、顆粒球コロニー刺激因子（
Ｇ−ＣＳＦ） 、単球マクロファージコロニー刺激１１
（Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１）、顆粒球、マクロファ
ージまたは両者の混合コロニーを生じさせる顆粒球−マ
クロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び
より未分化な骨髄白血球前駆細胞に作用するマルチＣＳ
Ｆ （ＩＬ−３）である。
り、Ｉｎ ｖｉｔｒｏの機能、即ち半固形培地中で骨
髄白血球前駆細胞が分化増殖したコロニーの形態から４
種に分類されている。即ち、顆粒球コロニー刺激因子（
Ｇ−ＣＳＦ） 、単球マクロファージコロニー刺激１１
（Ｍ−ＣＳＦまたはＣＳＦ−１）、顆粒球、マクロファ
ージまたは両者の混合コロニーを生じさせる顆粒球−マ
クロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び
より未分化な骨髄白血球前駆細胞に作用するマルチＣＳ
Ｆ （ＩＬ−３）である。
従来報告されているヒト単球−マクロファージコロニー
刺激因子の起源は、ヒト尿（Ｄａｓ、Ｓ、に、 ＆５ｔ
ａｎｌｅｙ、Ｅ、Ｒ，； Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
２５７１３６７９ （１９ｇ２））、膵臓癌株化細胞Ｍ
ＩＡ−ＰａＣａ−２の培養上清（Ｓｈｉｅｎ、Ｊ、−
Ｈ，ｅｔ ａｌ、 ；Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ２５３２０５（１９８７））な
どが報告されている。
刺激因子の起源は、ヒト尿（Ｄａｓ、Ｓ、に、 ＆５ｔ
ａｎｌｅｙ、Ｅ、Ｒ，； Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
２５７１３６７９ （１９ｇ２））、膵臓癌株化細胞Ｍ
ＩＡ−ＰａＣａ−２の培養上清（Ｓｈｉｅｎ、Ｊ、−
Ｈ，ｅｔ ａｌ、 ；Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ２５３２０５（１９８７））な
どが報告されている。
さらに遺伝子クローニング技術を用いてヒトＭＣＳＦ遺
伝子の単離が行われ、その遺伝情報が解析された。その
結果、ヒトＭ−ＣＳＦｃＤＮＡは翻訳領域の異なる３種
類が存在し、３′非翻訳領域も２種類存在することが明
らかとなった。Ｋａｗａｓａｋｉらの報告したｃＤＮＡ
は約１．６Ｋｂ長で３２個のシグナルペプチドを含む２
５６アミノ酸をコードしている（Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｂ
、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、； ５ｃｉｅｎｃｅ ２３０２
９１ （１９８５）、特表昭６２−５０１６０７） 。
伝子の単離が行われ、その遺伝情報が解析された。その
結果、ヒトＭ−ＣＳＦｃＤＮＡは翻訳領域の異なる３種
類が存在し、３′非翻訳領域も２種類存在することが明
らかとなった。Ｋａｗａｓａｋｉらの報告したｃＤＮＡ
は約１．６Ｋｂ長で３２個のシグナルペプチドを含む２
５６アミノ酸をコードしている（Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｂ
、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、； ５ｃｉｅｎｃｅ ２３０２
９１ （１９８５）、特表昭６２−５０１６０７） 。
Ｗ。
ｎｇらの報告したｃＤＮＡは４Ｋｂ弱で３２個のシグナ
ルペプチドを含む５５４アミノ酸をコードしている（Ｗ
ｏｎｇ、Ｇ、Ｇ、 ｅｔ ａｌ、 ； ５ｃｉｅｎｃｅ
２３５１５０４（１９８７） 、特表平１−５０２３
９７） 、更にＣｅｒｒｅｔｔｉらの報告で４３８アミ
ノ酸をコードしているｃＤＮＡの存在が示されている（
Ｃｅｒｒｅｔｔｉ、Ｄ、Ｐ、 ｅｔ ａｌ、 ； Ｍｏ
ｌ。
ルペプチドを含む５５４アミノ酸をコードしている（Ｗ
ｏｎｇ、Ｇ、Ｇ、 ｅｔ ａｌ、 ； ５ｃｉｅｎｃｅ
２３５１５０４（１９８７） 、特表平１−５０２３
９７） 、更にＣｅｒｒｅｔｔｉらの報告で４３８アミ
ノ酸をコードしているｃＤＮＡの存在が示されている（
Ｃｅｒｒｅｔｔｉ、Ｄ、Ｐ、 ｅｔ ａｌ、 ； Ｍｏ
ｌ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ２５７６１ （１９８８）） 。ま
たコードするアミノ酸は５５４個で、２５６個のアミノ
酸をコードしているｃＤＮＡの３′非翻訳領域を持つｃ
ＤＮＡの報告もある（特開平１−１０４１７６）。また
シグナルペプチドのアミノ酸配列は不完全であるが、同
様のタイプの遺伝子が取得されている（特表平１５０１
２８３）。さらにＷｏｎｇらのアミノ酸配列と若干具な
り、５′非翻訳領域の長い４Ｋｂ強の長さを持ツＣＤ
Ｎ Ａも得られている（特願平１−１９２５９２）。
たコードするアミノ酸は５５４個で、２５６個のアミノ
酸をコードしているｃＤＮＡの３′非翻訳領域を持つｃ
ＤＮＡの報告もある（特開平１−１０４１７６）。また
シグナルペプチドのアミノ酸配列は不完全であるが、同
様のタイプの遺伝子が取得されている（特表平１５０１
２８３）。さらにＷｏｎｇらのアミノ酸配列と若干具な
り、５′非翻訳領域の長い４Ｋｂ強の長さを持ツＣＤ
Ｎ Ａも得られている（特願平１−１９２５９２）。
一方、ヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦは２１４個と２３８個のア
ミノ酸を有するものか報告されている（特開昭６４−２
２８９９．特開昭６４−３４９９８． ＢｆＯｍｅｄｉ
ｃａ ３１０２３ （１９８３））。
ミノ酸を有するものか報告されている（特開昭６４−２
２８９９．特開昭６４−３４９９８． ＢｆＯｍｅｄｉ
ｃａ ３１０２３ （１９８３））。
上記の様にＭ−ＣＳＦ活性を有しているにも関わらず、
サイズの異なるｃＤＮＡが少なくとも４種類、ポリペプ
チドが少なくとも５種類存在し、アミノ酸配列に於いて
も相違がみられている。このような相違は、Ｍ−ＣＳＦ
遺伝子がハブロイドゲノム中に１コピーしか存在しない
と考えられていることから、ｍＲＮＡのスプライス部位
の変化あるいはアミノ酸への翻訳後の蛋白修飾酵素の作
用の差に依存するものと思われる。
サイズの異なるｃＤＮＡが少なくとも４種類、ポリペプ
チドが少なくとも５種類存在し、アミノ酸配列に於いて
も相違がみられている。このような相違は、Ｍ−ＣＳＦ
遺伝子がハブロイドゲノム中に１コピーしか存在しない
と考えられていることから、ｍＲＮＡのスプライス部位
の変化あるいはアミノ酸への翻訳後の蛋白修飾酵素の作
用の差に依存するものと思われる。
この様に複数の遺伝子が取得されており、遺伝子操作技
術を用いた様々な発現系を利用して、マウス骨髄細胞の
コロニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性を持つ異なっ
た分子量のタンパク質が得られている（Ｋａｗａｓａｋ
ｉ、Ｅ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、； ５ｃｉｅｎｃｅ ２
３０２９１ （１９８５）、特表昭６２−５０１６０７
．Ｗｏｎｇ、Ｇ、Ｇ、 ｅｔａｌ、 ・５ｃｉｅｎｃｅ
２３５１５０４（１９８７）、特表平］−５０２３９
７、Ｃｅｒｒｅｔｔｉ、Ｄ、Ｐ、ｅｔ ａｌ、 ； Ｍ
ｏ１． Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ２５７６１ （＋９８８）
、特開平１−１０４１７６、特表千１−５０１２８３．
特願平１−１９２５９２．特開平２−２３９１．特願乎
２−３６３５１． ＷＯ３９１０６５４６、特開昭６３
−６８０９５）。この様に種々の大きさのＭ−ＣＳＦが
得られ、さまざまな発現方法が行われているが、宿主と
して動物細胞を使用した場合、Ｍ−ＣＳＦが糖タンパク
質であることを考慮すると、ヒト細胞を使用しない限り
生産されるＭＣＳＦの糖鎖組成は異なることが指摘しう
る。
術を用いた様々な発現系を利用して、マウス骨髄細胞の
コロニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性を持つ異なっ
た分子量のタンパク質が得られている（Ｋａｗａｓａｋ
ｉ、Ｅ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、； ５ｃｉｅｎｃｅ ２
３０２９１ （１９８５）、特表昭６２−５０１６０７
．Ｗｏｎｇ、Ｇ、Ｇ、 ｅｔａｌ、 ・５ｃｉｅｎｃｅ
２３５１５０４（１９８７）、特表平］−５０２３９
７、Ｃｅｒｒｅｔｔｉ、Ｄ、Ｐ、ｅｔ ａｌ、 ； Ｍ
ｏ１． Ｉｍｍｕｎｏｌ、 ２５７６１ （＋９８８）
、特開平１−１０４１７６、特表千１−５０１２８３．
特願平１−１９２５９２．特開平２−２３９１．特願乎
２−３６３５１． ＷＯ３９１０６５４６、特開昭６３
−６８０９５）。この様に種々の大きさのＭ−ＣＳＦが
得られ、さまざまな発現方法が行われているが、宿主と
して動物細胞を使用した場合、Ｍ−ＣＳＦが糖タンパク
質であることを考慮すると、ヒト細胞を使用しない限り
生産されるＭＣＳＦの糖鎖組成は異なることが指摘しう
る。
さらに糖鎖の影響が少ないとしても、動物細胞の培養で
はＭ−ＣＳＦ生産性が低く、またその培養方法も比較的
むづかしく、培養に高価な培地を大量に使用する必要が
あるなど、原核生物の培養に対してコスト的に及ばない
。また酵母を利用した発現系の場合も、異なった糖鎖が
付加されるということが指摘しうる。さらに種々の大き
さのＭＣＳＦが得られることから、Ｍ−ＣＳＦ活性を示
すために必須なアミノ酸配列、すなわち活性部位がどこ
に存在するのか明確ではない。これを解明するための遺
伝子操作を用いたＣ末端側除去の情報は、ＷＯ３９１０
６５４６，特表平１−５０１２８３．特開平２−２３９
１等に表されており、Ｍ−ＣＳＦの１５０番目以降のア
ミノ酸はマウス骨髄細胞のコロニー形成刺激活性に影響
を与えないといわれている。一方、これらの先行技術に
於いてもＮ末端側除去についての実施例をはじめとした
具体的記載は少ない。
はＭ−ＣＳＦ生産性が低く、またその培養方法も比較的
むづかしく、培養に高価な培地を大量に使用する必要が
あるなど、原核生物の培養に対してコスト的に及ばない
。また酵母を利用した発現系の場合も、異なった糖鎖が
付加されるということが指摘しうる。さらに種々の大き
さのＭＣＳＦが得られることから、Ｍ−ＣＳＦ活性を示
すために必須なアミノ酸配列、すなわち活性部位がどこ
に存在するのか明確ではない。これを解明するための遺
伝子操作を用いたＣ末端側除去の情報は、ＷＯ３９１０
６５４６，特表平１−５０１２８３．特開平２−２３９
１等に表されており、Ｍ−ＣＳＦの１５０番目以降のア
ミノ酸はマウス骨髄細胞のコロニー形成刺激活性に影響
を与えないといわれている。一方、これらの先行技術に
於いてもＮ末端側除去についての実施例をはじめとした
具体的記載は少ない。
Ｎ末端側の最初の３アミノ酸までの除去はマウス骨髄細
胞のコロニー形成刺激活性に影響がないといわれている
が、それ以上の除去の実験はなく、Ｎ末端側の必須な最
小単位は未だ不明である。
胞のコロニー形成刺激活性に影響がないといわれている
が、それ以上の除去の実験はなく、Ｎ末端側の必須な最
小単位は未だ不明である。
またＡＧＲ−ＯＮ細胞の生産するＭ−ＣＳＦの場合、バ
リンをＮ末端アミノ酸の主成分として、異なる２ケ所の
グルタミン酸を副成分とすることが報告されている（特
開平１−１０４１７６）。このような場合、副産物を伴
わない単一成分としてのＭ−ＣＳＦ生産が困難であり、
その精製による分離も非常に困難であることか予想され
る。それゆえ均質なＭ−ＣＳＦ生産方法が望まれ、Ｎ末
端の不均一性を防ぐためにＭ−ＣＳＦ遺伝子の改良が望
まれている。
リンをＮ末端アミノ酸の主成分として、異なる２ケ所の
グルタミン酸を副成分とすることが報告されている（特
開平１−１０４１７６）。このような場合、副産物を伴
わない単一成分としてのＭ−ＣＳＦ生産が困難であり、
その精製による分離も非常に困難であることか予想され
る。それゆえ均質なＭ−ＣＳＦ生産方法が望まれ、Ｎ末
端の不均一性を防ぐためにＭ−ＣＳＦ遺伝子の改良が望
まれている。
Ｍ−ＣＳＦがヒトに対して作用する場合、以下に示す作
用を有することが望まれている。すなわちＩｎ ｖｉ
ｔｒｏで １）ヒト骨髄細胞を分化・増殖し、単球また
はマクロファージまたは顆粒球のコロニーを形成するこ
と ２）ヒト単球あるいはマクロファージに作用し、こ
れらの細胞を増殖及びまたは活性化すること、またＩｎ
ｖｉｖＯでも同様に骨髄細胞の分化・増殖作用およ
び単球あるいはマクロファージの増殖及びまたは活性化
すること等である。ヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦは上記１）、
２）の作用を有することについて報告されている （Ｄａｓ、Ｓ、に、 ｅｔ ａｌ、 ：Ｂｌｏｏｄ ５
８６３０ （１９８１）、特願平２−６５６３９）が、
前出のＫａｗａｓａｋｉらの報告して得られるｃＤＮＡ
を酵母あるいは動物細胞（ＣＯ３−７）で発現したＭ−
ＣＳＦは、ヒト骨髄細胞を分化増殖しなかった（Ｃｅｒ
ｒｅｔｔｉ、Ｄ、Ｐ、 ｅｔ ａｌ、 ；Ｊ、Ｃｅ１ｌ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｓｕｐｐｌｅ
ｍｅｎｔ ＩＩＡ ２１２ （１９８７）） 、このこ
とはＫａｗａｓａｋｉらの遺伝子より誘導したＭ−ＣＳ
Ｆに欠けている１５０番目［式（Ｉ）の１４４番目］か
ら２１４または２３８番目までのアミノ酸配列の存在が
、極めて重要であることを示しており、ただ単にＣ末端
を欠損させれば良いという訳ではない。
用を有することが望まれている。すなわちＩｎ ｖｉ
ｔｒｏで １）ヒト骨髄細胞を分化・増殖し、単球また
はマクロファージまたは顆粒球のコロニーを形成するこ
と ２）ヒト単球あるいはマクロファージに作用し、こ
れらの細胞を増殖及びまたは活性化すること、またＩｎ
ｖｉｖＯでも同様に骨髄細胞の分化・増殖作用およ
び単球あるいはマクロファージの増殖及びまたは活性化
すること等である。ヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦは上記１）、
２）の作用を有することについて報告されている （Ｄａｓ、Ｓ、に、 ｅｔ ａｌ、 ：Ｂｌｏｏｄ ５
８６３０ （１９８１）、特願平２−６５６３９）が、
前出のＫａｗａｓａｋｉらの報告して得られるｃＤＮＡ
を酵母あるいは動物細胞（ＣＯ３−７）で発現したＭ−
ＣＳＦは、ヒト骨髄細胞を分化増殖しなかった（Ｃｅｒ
ｒｅｔｔｉ、Ｄ、Ｐ、 ｅｔ ａｌ、 ；Ｊ、Ｃｅ１ｌ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 Ｓｕｐｐｌｅ
ｍｅｎｔ ＩＩＡ ２１２ （１９８７）） 、このこ
とはＫａｗａｓａｋｉらの遺伝子より誘導したＭ−ＣＳ
Ｆに欠けている１５０番目［式（Ｉ）の１４４番目］か
ら２１４または２３８番目までのアミノ酸配列の存在が
、極めて重要であることを示しており、ただ単にＣ末端
を欠損させれば良いという訳ではない。
ヒト尿由来ｕＭ−ＣＳＦは上記のように有用な性質を有
するが、ヒト骨髄細胞に対する分化増殖作用が弱い点、
またＩｎ ｖｉｔｒｏでは単球・マクロファージを増
殖させるがＩｎ ｖｉｖｏでの作用が不明確等の問題点
もある。そのためにも尿由来型Ｍ−ＣＳＦの改良が望ま
れている。
するが、ヒト骨髄細胞に対する分化増殖作用が弱い点、
またＩｎ ｖｉｔｒｏでは単球・マクロファージを増
殖させるがＩｎ ｖｉｖｏでの作用が不明確等の問題点
もある。そのためにも尿由来型Ｍ−ＣＳＦの改良が望ま
れている。
［発明が解決しようとする問題点］
従来ヒト尿由来のＭ−ＣＳＦを製造する原料としては、
健康ヒト尿が工業原料とされている。しかし、尿中のＭ
−ＣＳＦ含量は微量（１Ｆｇ／ｌ以下）であり、さらに
は大量の健康ヒト尿を入手することは非常に困難である
点が指摘される。さらにＭ−ＣＳＦ低含量の原料を大量
に処理しなければならないため、その精製単離操作が繁
雑になるとともに非常にコストがかかる。その結果高純
度かつ経済的なヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦの取得は、非常な
困難を伴うという問題点も指摘される。そのためヒト尿
由来型のＭ−ＣＳＦを大量にかつ安価に得るための別の
方法が望まれている。
健康ヒト尿が工業原料とされている。しかし、尿中のＭ
−ＣＳＦ含量は微量（１Ｆｇ／ｌ以下）であり、さらに
は大量の健康ヒト尿を入手することは非常に困難である
点が指摘される。さらにＭ−ＣＳＦ低含量の原料を大量
に処理しなければならないため、その精製単離操作が繁
雑になるとともに非常にコストがかかる。その結果高純
度かつ経済的なヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦの取得は、非常な
困難を伴うという問題点も指摘される。そのためヒト尿
由来型のＭ−ＣＳＦを大量にかつ安価に得るための別の
方法が望まれている。
また、ある種のヒト細胞培養上清を原料とするＭ−ＣＳ
Ｆの生産方法も考えられる。この場合に於いても、Ｍ−
ＣＳＦの生産量か比較的少ないこと、高価な栄養源（例
えば牛血溝）を必要とすること、細胞の培養条件の設定
が難しいこと、その細胞の目的物生産性を維持させるの
が難しいこと等の問題点がある。従っていずれの方法も
Ｍ−ＣＳＦを高純度かつ経済的に取得するには適さない
。そこでＭ−ＣＳＦを大量に得るため の方法として考
えられるのか遺伝子操作技術の利用である。すなわち、
遺伝子工学的手法を用いＭ−ＣＳＦ遺伝子を発現ベクタ
ーに接続し、宿主に導入する。この場合、宿主として動
物細胞を利用するか、大腸菌なとの原核生物を利用する
かにより、その方法論は異なる。
Ｆの生産方法も考えられる。この場合に於いても、Ｍ−
ＣＳＦの生産量か比較的少ないこと、高価な栄養源（例
えば牛血溝）を必要とすること、細胞の培養条件の設定
が難しいこと、その細胞の目的物生産性を維持させるの
が難しいこと等の問題点がある。従っていずれの方法も
Ｍ−ＣＳＦを高純度かつ経済的に取得するには適さない
。そこでＭ−ＣＳＦを大量に得るため の方法として考
えられるのか遺伝子操作技術の利用である。すなわち、
遺伝子工学的手法を用いＭ−ＣＳＦ遺伝子を発現ベクタ
ーに接続し、宿主に導入する。この場合、宿主として動
物細胞を利用するか、大腸菌なとの原核生物を利用する
かにより、その方法論は異なる。
また、Ｎ末端側についての必要最小単位か不明なため新
規Ｍ−ＣＳＦの取得が望まれている。
規Ｍ−ＣＳＦの取得が望まれている。
上記問題点を解決するための手段として考えられるのが
遺伝子操作技術の利用である。すなわち、遺伝子工学的
手法を駆使してＭ−ＣＳＦ遺伝子を発現ベクターに接続
して、宿主に導入し、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドを生産さ
せるという方法である。
遺伝子操作技術の利用である。すなわち、遺伝子工学的
手法を駆使してＭ−ＣＳＦ遺伝子を発現ベクターに接続
して、宿主に導入し、Ｍ−ＣＳＦポリペプチドを生産さ
せるという方法である。
［問題を解決するための手段］
本発明者らは上記問題点を解決するために鋭意検討を重
ねた結果、本出願人が先に取得したヒト細胞由来Ｍ−Ｃ
ＳＦ遺伝子（ｃＤＮＡ）より遺伝子操作の手法を用い、
新規Ｎ末端を存する新規ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦの取得
方法、発現ベクターの作製方法、及び大腸菌内で効率よ
く大量にＭ−ＣＳＦモノマータンパク質を発現させ、そ
の効果的な分離再生を含む製造方法を確立し、本発明を
完成した。
ねた結果、本出願人が先に取得したヒト細胞由来Ｍ−Ｃ
ＳＦ遺伝子（ｃＤＮＡ）より遺伝子操作の手法を用い、
新規Ｎ末端を存する新規ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦの取得
方法、発現ベクターの作製方法、及び大腸菌内で効率よ
く大量にＭ−ＣＳＦモノマータンパク質を発現させ、そ
の効果的な分離再生を含む製造方法を確立し、本発明を
完成した。
本発明の目的は遺伝子工学的な手法を駆使して、新規な
Ｎ末端を有する新規Ｍ−ＣＳＦを大腸菌発現系を用いて
効率よく大量に製造供給することにある。
Ｎ末端を有する新規Ｍ−ＣＳＦを大腸菌発現系を用いて
効率よく大量に製造供給することにある。
従って本発明は以下を要旨とするものである。
（１）下記式（Ｉ）のアミノ酸配列で示されるヒ）Ｍ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチド式（Ｉ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｍｅ
ｔ ｌｉｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＧｌｙＨｉｓ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ｌ
ｉｅ Ａｓｐ ５ｅｒＧｉｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ（Ｘ） Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ ＶａｔＣｙｓ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＧｌｎＡｓｐ ｌｉｅ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ
Ａｒｇ ＡｓｐＡｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌ
ａ Ｉｌｅ Ａｌａ ［１ｅ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ＰｈｅＴｈｒ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ａｌａ ＣｙｓＶａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
ＬｅｕＬｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａ
ｓｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ ＴｈｒＬｙｓ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｔｒｐ Ａｓｎ ｒｌｅ ＰｈｅＳｅｒ Ｌｙｓ Ａｓ
ｎ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ｇ］、ｕ ＣｙｓＳｅｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｃ
ｙｓＡｓｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ａｌａ ［ｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ ５ｅｒＡｓｐ Ｐ
ｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｈｉ
ｓ Ｇｉｎ Ｐｒｏ ＬｅｕＡｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌ
ｅｕ ＴｈｒＴｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ５ｅｒＬ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｒ
ｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ ＶａｌＡｓｐ Ｐｒｏ
（Ｙ）ｎ （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−３ｅｒ
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｇ １ｕ−Ｐ ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ １ ｕ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｖａ ｌ −Ｖａ １−Ｌｙｓで示されるア
ミノ酸配列を示し、ｎ＝ｏまたは１を示す。）、 （２）下記式（Ｉ［）のアミノ酸配列で示されるヒ１−
Ｍ −ＣＳ Ｆ活性を有するポリペプチド式（ＩＩ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｍｅｔ ［ｌ
ｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＨｉｓＬｅｕ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ［１ｅ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ ＧｉｎＭｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｇｉｎ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇ１．ｕ
（Ｘ）Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ ＣｙｓＴｙｒ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇ１．ｎ Ａｓｐ［１ｅ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ
円〕ｅ Ａｒｇ Ａｓｐ ＡｓｎＴｈｒ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ Ｇｉｎ Ｌｅｕ ＧｌｎＧｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅ
ｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ ＴｈｒＬｙｓ Ａｓｐ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ｃｙｓ ＶａｌＡｒｇ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇ］、ｎ Ｌｅｕ
ＬｅｕＧｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａ
ｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ＬｙｓＡｓｎ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ ５ｅｒＬ
ｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈ
ｅ Ａ１．ａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ ５ｅｒＳｅｒ Ｇｉｎ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ｃｙｓ ＡｓｎＣｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒ
ｏ Ｌｙｓ Ａ１．ａ Ｉｌ、ｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ ＡｓｐＰｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅ
ｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａ
ｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＴｒｐＧＸｕ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＬｅｕＬｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ
ＡｓｐＰｒｏ （Ｙ）ｎ （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−３ｅｒ
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇ１．ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−３ｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇ ｌ ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｖａ ］、 −Ｖａ ■−Ｌｙｓで示される
アミノ酸配列を示し、ｎ＝ｏまたは１を示す。）、 （３）下記式（Ｉ）のアミノ酸配列で示されるヒ）Ｍ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチド式帽） （Ｍｅｔ）ｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ ＬｅｕＧｉｎ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｎ ＭｅｔＧｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ （Ｘ）
ＶａｌＡｓｐ Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ ＴｙｒＬｅｕ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｇｉｎ Ａｓｐ ＩｌｅＭｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ａｓｎ ＴｈｒＰｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ ｌｉｅ Ａｌ
ａ ｌｉｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ ＬｙｓＡｓｐ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｖａｌ ＡｒｇＴｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
ＧｌｕＬｙｓ Ｖａｔ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｔ Ｐ
ｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＬｅｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ、Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ＬｙｓＡｓｎ Ｃｙｓ Ａｓ
ｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ
Ｓｅｒ ５ｅｒＧｉｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔ
ｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｃｙ
ｓＬｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｒ。
ＣＳＦ活性を有するポリペプチド式（Ｉ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｍｅ
ｔ ｌｉｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ＧｌｙＨｉｓ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ｌ
ｉｅ Ａｓｐ ５ｅｒＧｉｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ（Ｘ） Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌ
ｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ ＶａｔＣｙｓ
Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＧｌｎＡｓｐ ｌｉｅ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ
Ａｒｇ ＡｓｐＡｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｌ
ａ Ｉｌｅ Ａｌａ ［１ｅ Ｖａｌ Ｇｉｎ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ ＰｈｅＴｈｒ Ｌｙｓ
Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｌｙｓ Ａｌａ ＣｙｓＶａｌ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｐｈ
ｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
ＬｅｕＬｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａ
ｓｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ ＴｈｒＬｙｓ
Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｔｒｐ Ａｓｎ ｒｌｅ ＰｈｅＳｅｒ Ｌｙｓ Ａｓ
ｎ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ｇ］、ｕ ＣｙｓＳｅｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｃ
ｙｓＡｓｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ａｌａ ［ｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ ５ｅｒＡｓｐ Ｐ
ｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｔ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｈｉ
ｓ Ｇｉｎ Ｐｒｏ ＬｅｕＡｌａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｔ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌ
ｅｕ ＴｈｒＴｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ ５ｅｒＬ
ｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｒ
ｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ ＶａｌＡｓｐ Ｐｒｏ
（Ｙ）ｎ （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−３ｅｒ
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａ
ｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈ
ｅ−Ｇ １ｕ−Ｐ ｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ １ ｕ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｖａ ｌ −Ｖａ １−Ｌｙｓで示されるア
ミノ酸配列を示し、ｎ＝ｏまたは１を示す。）、 （２）下記式（Ｉ［）のアミノ酸配列で示されるヒ１−
Ｍ −ＣＳ Ｆ活性を有するポリペプチド式（ＩＩ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｍｅｔ ［ｌ
ｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ＨｉｓＬｅｕ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ ［１ｅ Ａ
ｓｐ Ｓｅｒ ＧｉｎＭｅｔ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｃｙｓ Ｇｉｎ ｌｉｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇ１．ｕ
（Ｘ）Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｌ
ｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ ＣｙｓＴｙｒ
Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇ１．ｎ Ａｓｐ［１ｅ Ｍｅｔ
Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ
円〕ｅ Ａｒｇ Ａｓｐ ＡｓｎＴｈｒ Ｐｒｏ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａ
ｌ Ｇｉｎ Ｌｅｕ ＧｌｎＧｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅ
ｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅ
ｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ ＴｈｒＬｙｓ Ａｓｐ Ｔ
ｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌ
ａ Ｃｙｓ ＶａｌＡｒｇ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇ］、ｎ Ｌｅｕ
ＬｅｕＧｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａ
ｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ ＬｙｓＡｓｎ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ ５ｅｒＬ
ｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈ
ｅ Ａ１．ａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ ５ｅｒＳｅｒ Ｇｉｎ
Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ｃｙｓ ＡｓｎＣｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒ
ｏ Ｌｙｓ Ａ１．ａ Ｉｌ、ｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ ＡｓｐＰｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅ
ｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａ
ｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ＴｒｐＧＸｕ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＬｅｕＬｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌ
ｕ Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ
ＡｓｐＰｒｏ （Ｙ）ｎ （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−３ｅｒ
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇ１．ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−３ｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇ ｌ ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｔｈｒ
−Ｐｒｏ−Ｖａ ］、 −Ｖａ ■−Ｌｙｓで示される
アミノ酸配列を示し、ｎ＝ｏまたは１を示す。）、 （３）下記式（Ｉ）のアミノ酸配列で示されるヒ）Ｍ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチド式帽） （Ｍｅｔ）ｎ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ ＬｅｕＧｉｎ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓ
ｅｒ Ｇｌｎ ＭｅｔＧｌｕ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ （Ｘ）
ＶａｌＡｓｐ Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｙ
ｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ ＴｙｒＬｅｕ
Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖ
ａｌ Ｇｉｎ Ａｓｐ ＩｌｅＭｅｔ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｓｐ
Ａｓｎ ＴｈｒＰｒｏ Ａｓｎ Ａｌａ ｌｉｅ Ａｌ
ａ ｌｉｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓ
ｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ ＬｙｓＡｓｐ Ｔｙｒ
Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｖａｌ ＡｒｇＴｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
ＧｌｕＬｙｓ Ｖａｔ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｔ Ｐ
ｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＬｅｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｌｙｓ、Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ
Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ ＬｙｓＡｓｎ Ｃｙｓ Ａｓ
ｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ
Ｓｅｒ ５ｅｒＧｉｎ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔ
ｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｃｙ
ｓＬｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｒ。
Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｈｉｓ
Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒ。
Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒ。
Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇ
ｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇ、１ｕＡｓｐ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＬｅｕＰｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇ
ｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓ
ｐ Ｐｒ。
ｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇ、１ｕＡｓｐ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ ＬｅｕＰｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇ
ｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓ
ｐ Ｐｒ。
（Ｙ） ｎ
（式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＣ１，ｙ−３ｅ
ｒＡ １ａ−Ｌｙｓ−Ｇ Ｉｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−３ｅｒ
−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ ｏ−Ｇ １ｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ −Ｖａ ＩＬｙｓで示されるア
ミノ酸配列を示し、ｎ＝０またはｌを示す。）、 （４）下記式（ＩＶ）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ
−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド式（ＩＶ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｈｉｓ Ｍｅｔ ｒｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇ１ｎ５ｅｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ａｒｇ、Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇ
ｉｎ Ｍｅｔ ＧｌｕＴｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｉｎ
Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ （Ｘ） Ｖａｌ
ＡｓｐＧｉｎ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｙｒ ＬｅｕＬｙｓ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｉｎ Ａｓｐ ｒｌｅ ＭｅｔＧ
ｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒ
ｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒ。
ｒＡ １ａ−Ｌｙｓ−Ｇ Ｉｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−３ｅｒ
−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒ ｏ−Ｇ １ｕ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ −Ｖａ ＩＬｙｓで示されるア
ミノ酸配列を示し、ｎ＝０またはｌを示す。）、 （４）下記式（ＩＶ）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ
−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド式（ＩＶ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｈｉｓ Ｍｅｔ ｒｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｇ１ｎ５ｅｒ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ａｒｇ、Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇ
ｉｎ Ｍｅｔ ＧｌｕＴｈｒ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｇｉｎ
Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ （Ｘ） Ｖａｌ
ＡｓｐＧｉｎ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓ
ｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｔｙｒ ＬｅｕＬｙｓ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｉｎ Ａｓｐ ｒｌｅ ＭｅｔＧ
ｌｕ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ａｒ
ｇ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒ。
Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ ｌｉｅ Ｖａｌ Ｇ
ｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ ＬｅｕＳｅｒ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＡｓｐＴｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉ
ｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
ＴｈｒＰｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇ１．ｕ ＬｙｓＶａ
ｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ ＬｅｕＬｅｕ Ａｓｐ Ｌ
ｙｓ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅ
ｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＣｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇ
ｉｎＡｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ ＬｅｕＴｙｒ Ｐ
ｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ ＡｌａＳｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｐｒｏ ＳｅｒＭｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒ。
ｌｎ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ ＬｅｕＳｅｒ Ｌｅｕ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ ＡｓｐＴｙｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｈｉ
ｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
ＴｈｒＰｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌ
ｅｕ Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇ１．ｕ ＬｙｓＶａ
ｌ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ ＬｅｕＬｅｕ Ａｓｐ Ｌ
ｙｓ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅ
ｒ Ｌｙｓ ＡｓｎＣｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇ
ｉｎＡｓｐ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ ＬｅｕＴｙｒ Ｐ
ｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅ
ｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ ＡｌａＳｅｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ｐｒｏ ＳｅｒＭｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌ
ａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓ
ｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒ。
Ｇａｙ Ｇｌｕ Ｇｉｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔ
ｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ （Ｙ）ｎ（式中ＸはＰ
ｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−３ｅｒＡｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−３ｅｒ
−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ
１−Ｖａ １−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を示し、
ｎ＝ｏまたはｌを示す。）、 （５）下記式（Ｖ）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ−
ＣＳ Ｆ活性を有するポリペプチド式（Ｖ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉ
ｓ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｓｅｒ ＬｅｕＧｉｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ ｌｉｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇ
ｌｕ Ｔｈｒ ５ｅｒＣｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｇｌｕ （Ｘ） Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ
ＧｌｕＧｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＬｙｓＡｌａ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＧＩｎ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＡｓｐＴｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ
Ｐｈｅ ＡｒｇＡｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａ
ｓｎ Ａｌａ［１ｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＬｅｕＡ
ｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ ＧｌｕＧｌｕ Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔ
ｈｒ Ｐｈｅ ＴｙｒＧｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ
ＬｙｓＡｓｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＡｓｐＬｙｓ
Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌ
ｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ ＡｓｎＡｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ
Ａｓｐ ＶａｌＶａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓ
ｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒ。
ｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ （Ｙ）ｎ（式中ＸはＰ
ｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−３ｅｒＡｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−３ｅｒ
−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−ＧＩｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ １ｕ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ
１−Ｖａ １−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を示し、
ｎ＝ｏまたはｌを示す。）、 （５）下記式（Ｖ）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ−
ＣＳ Ｆ活性を有するポリペプチド式（Ｖ） （Ｍｅｔ）ｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｈｉ
ｓ Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｓｅｒ ＬｅｕＧｉｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ ｌｉｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｇ
ｌｕ Ｔｈｒ ５ｅｒＣｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ Ｇｌｕ （Ｘ） Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ
ＧｌｕＧｌｎ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａ
ｌ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ ＬｙｓＡｌａ
Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ ＧＩｎ Ａｓｐ Ｉ
ｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｕ ＡｓｐＴｈｒ Ｍｅｔ Ａｒｇ
Ｐｈｅ ＡｒｇＡｓｐ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａ
ｓｎ Ａｌａ［１ｅ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｇｉｎ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ ＬｅｕＡ
ｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ ＧｌｕＧｌｕ Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｔ
ｈｒ Ｐｈｅ ＴｙｒＧｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｇｉｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ
ＬｙｓＡｓｎ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｈ
ｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ ＡｓｐＬｙｓ
Ａｓｐ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌ
ｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ ＡｓｎＡｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｉｎ
Ａｓｐ ＶａｌＶａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓ
ｐ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｐｒ。
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａ
ｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ ＶａｌＳｅｒ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｍｅｔ ＡｌａＰｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ
ＧｌｕＧｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ＧｌｕＧｌｎ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ
Ｐｒｏ （Ｙ）ｎ（式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、Ｙ
はＧｌｙ−３ｅｒＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇ１
、 ｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ ｌ ｕ−Ｐｒ ｏ −Ｐ
ｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ ｌ −Ｖａ
１−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を示し、ｎ＝０ま
たは１を示す。）及びそれらのホモダイマ一体に関する
。
ｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ ＶａｌＳｅｒ Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｍｅｔ ＡｌａＰｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｓｅｒ
ＧｌｕＧｌｙ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓ
ｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ＧｌｕＧｌｎ
Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ
Ｐｒｏ （Ｙ）ｎ（式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、Ｙ
はＧｌｙ−３ｅｒＡｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇ１
、 ｎ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇ ｌ ｕ−Ｐｒ ｏ −Ｐ
ｒｏ−Ｇ １ｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｖａ ｌ −Ｖａ
１−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を示し、ｎ＝０ま
たは１を示す。）及びそれらのホモダイマ一体に関する
。
本発明は、また上記の式（Ｉ）から（Ｖ）まてのいずれ
かのヒトＭＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列にも関する 。
かのヒトＭＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列にも関する 。
また本発明は、上記式（Ｉ）から（Ｖ）までのヒ）Ｍ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチドのいずれかをコードす
るＤＮＡ配列及び微生物中で機能するレプリコンを含ん
で成る複製可能なりローニングベクターにも関する。
ＣＳＦ活性を有するポリペプチドのいずれかをコードす
るＤＮＡ配列及び微生物中で機能するレプリコンを含ん
で成る複製可能なりローニングベクターにも関する。
さらにまた本発明は、適当な制御配列に作用可能に連結
された式（Ｉ）から（Ｖ）までのヒトＭＣＳＦ活性を存
するポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡ配列を
含んで成る発現系に関し、さらにその発現系が宿主微生
物中て複製可能なベクターに組込まれているところの発
現系、そしてさらにはその発現系がヒトＭ−ＣＳＦモノ
マー蛋白質の発現が２・シストロン法によるようになさ
れているところの発現系にも関する。
された式（Ｉ）から（Ｖ）までのヒトＭＣＳＦ活性を存
するポリペプチドのいずれかをコードするＤＮＡ配列を
含んで成る発現系に関し、さらにその発現系が宿主微生
物中て複製可能なベクターに組込まれているところの発
現系、そしてさらにはその発現系がヒトＭ−ＣＳＦモノ
マー蛋白質の発現が２・シストロン法によるようになさ
れているところの発現系にも関する。
本発明によれば、以上のような発現系て形質転換された
組換え宿主微生物も提供され、その微生物を利用した効
率的なヒトＭ−ＣＳＦ活性生成物の製造法が提供される
。
組換え宿主微生物も提供され、その微生物を利用した効
率的なヒトＭ−ＣＳＦ活性生成物の製造法が提供される
。
本発明は、このように上記式（Ｉ）乃至（Ｖ）のアミノ
酸配列で示されるヒトＭＣＳＦ活性を有するポリペプチ
ドのいずれかをコードしているＤＮＡを含み、ヒトＭ−
ＣＳＦモノマー蛋白質を発現可能とされたプラスミドを
保有する形質転換体を培養し、ヒｌ−Ｍ−ＣＳＦモノマ
ー蛋白質を生産せしめ、次にそのヒトＭ−ＣＳＦモノマ
ー蛋白質を採取し、必要に応じてさらにその得られたヒ
）Ｍ−ＣＳＦモノマー蛋白質を生物学的に活性なホモダ
イマーに再構成するヒトＭ−ＣＳＦの製造方法を提供す
るものである。
酸配列で示されるヒトＭＣＳＦ活性を有するポリペプチ
ドのいずれかをコードしているＤＮＡを含み、ヒトＭ−
ＣＳＦモノマー蛋白質を発現可能とされたプラスミドを
保有する形質転換体を培養し、ヒｌ−Ｍ−ＣＳＦモノマ
ー蛋白質を生産せしめ、次にそのヒトＭ−ＣＳＦモノマ
ー蛋白質を採取し、必要に応じてさらにその得られたヒ
）Ｍ−ＣＳＦモノマー蛋白質を生物学的に活性なホモダ
イマーに再構成するヒトＭ−ＣＳＦの製造方法を提供す
るものである。
以下、さらに本発明について詳しく説明する。
本発明の第一の大きな目的は遺伝子工学的な手法を駆使
して、ヒト尿型Ｍ−ＣＳＦを大腸菌発現系を用いて効率
よく大量に製造供給する方法を与えることである。
して、ヒト尿型Ｍ−ＣＳＦを大腸菌発現系を用いて効率
よく大量に製造供給する方法を与えることである。
本発明の上記Ｍ−ＣＳＦ遺伝子はヒトＭ−ＣＳＦｃＤＮ
Ａ及びその一部ＤＮＡの化学合成、制限酵素による切断
、修飾酵素による削除、付加、結合により作製できる。
Ａ及びその一部ＤＮＡの化学合成、制限酵素による切断
、修飾酵素による削除、付加、結合により作製できる。
また、その目的遺伝子はそれを完全化学合成することに
よっても取得できる。本出願人が先に取得したヒトＭ−
ＣＳＦｃＤＮＡ（特願平１−１９２５９２）は本発明の
目的に好適に使用することかできる。なお、この約４Ｋ
ｂｐの遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＩＩＣＳＦを保有
する大腸菌ＪＭ１０９株は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている（微工研条寄第２５２６号［ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２５２６］ ）。本発明の上記Ｍ−ＣＳＦ
遺伝子は、このプラスミドｐＢＳＩＩＣＳＦ及び上記特
願平１−１９２５９２号に記載されたヒトＭ−ＣＳＦｃ
ＤＮＡの全部または一部を有するプラスミドを利用して
効率よく得ることができる。また動物細胞発現ベクター
に絹み込まれ３２個のシグナルペプチドとヒト尿由来型
の２１４個または２３８個のアミノ酸を有するＭ−ＣＳ
Ｆ活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有してい
るｐＳＶＬＣＳＦ２１４あるいはｐＳｖＬ−ＣＳＦ２３
８（特願平２−３６３５１）も本発明の目的に好適に使
用することかできる。
よっても取得できる。本出願人が先に取得したヒトＭ−
ＣＳＦｃＤＮＡ（特願平１−１９２５９２）は本発明の
目的に好適に使用することかできる。なお、この約４Ｋ
ｂｐの遺伝子を含むプラスミドｐＢＳＩＩＣＳＦを保有
する大腸菌ＪＭ１０９株は工業技術院微生物工業技術研
究所に寄託されている（微工研条寄第２５２６号［ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２５２６］ ）。本発明の上記Ｍ−ＣＳＦ
遺伝子は、このプラスミドｐＢＳＩＩＣＳＦ及び上記特
願平１−１９２５９２号に記載されたヒトＭ−ＣＳＦｃ
ＤＮＡの全部または一部を有するプラスミドを利用して
効率よく得ることができる。また動物細胞発現ベクター
に絹み込まれ３２個のシグナルペプチドとヒト尿由来型
の２１４個または２３８個のアミノ酸を有するＭ−ＣＳ
Ｆ活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有してい
るｐＳＶＬＣＳＦ２１４あるいはｐＳｖＬ−ＣＳＦ２３
８（特願平２−３６３５１）も本発明の目的に好適に使
用することかできる。
本発明に従い、具体的には３２個のシグナルペプチドと
２１４個または２３８個のアミノ酸をコードするｐＳＶ
Ｌ−ＣＳＦ２１４あるいはｐＳｖＬ−ＣＳＦ２３８ （
特願平２−３６３５１）を利用し、適当な制限酵素で切
断してマルチクローニング部位を持つベクター（例えば
ｐＵＣｌ ３）に組換え、後の組換えが行い易いように
する。次に、シグナルペプチド部分をまったく含まず、
ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端に最も近い部分を適当
な制限酵素で消化後、Ｍ−ＣＳＦアミノ酸をコードする
ＤＮＡ断片を分離回収する。この操作によって生じる不
足したＤＮＡ配列を補うようにｆＭｅｔ（翻訳開始コド
ン）と、変異を加えたＮ末端アミノ酸をコードするＤＮ
Ａ及びＮ末端側で不足しているＤＮＡをそれぞれ化学合
成する。ＤＮＡの化学合成法としては、例えばβ−シア
ノエチルアミダイド法あるいはＨ−ホスホネート法が例
示できるが、他の一般に知られた方法も適宜使用し得る
。次に、大腸菌で発現可能なベクターを構築する゜先ず
上記Ｍ−ＣＳＦをコードする回収ＤＮＡ及び合成りＮＡ
と結合可能なように適当な制限酵素て発現ベクターを切
断し、次にこれらＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合した。こうして得られた結合物を大腸菌に導入し、目
的の形質転換体を得ることができる。
２１４個または２３８個のアミノ酸をコードするｐＳＶ
Ｌ−ＣＳＦ２１４あるいはｐＳｖＬ−ＣＳＦ２３８ （
特願平２−３６３５１）を利用し、適当な制限酵素で切
断してマルチクローニング部位を持つベクター（例えば
ｐＵＣｌ ３）に組換え、後の組換えが行い易いように
する。次に、シグナルペプチド部分をまったく含まず、
ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端に最も近い部分を適当
な制限酵素で消化後、Ｍ−ＣＳＦアミノ酸をコードする
ＤＮＡ断片を分離回収する。この操作によって生じる不
足したＤＮＡ配列を補うようにｆＭｅｔ（翻訳開始コド
ン）と、変異を加えたＮ末端アミノ酸をコードするＤＮ
Ａ及びＮ末端側で不足しているＤＮＡをそれぞれ化学合
成する。ＤＮＡの化学合成法としては、例えばβ−シア
ノエチルアミダイド法あるいはＨ−ホスホネート法が例
示できるが、他の一般に知られた方法も適宜使用し得る
。次に、大腸菌で発現可能なベクターを構築する゜先ず
上記Ｍ−ＣＳＦをコードする回収ＤＮＡ及び合成りＮＡ
と結合可能なように適当な制限酵素て発現ベクターを切
断し、次にこれらＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結
合した。こうして得られた結合物を大腸菌に導入し、目
的の形質転換体を得ることができる。
これらＤＮＡ断片の分離精製並びに回収、制限酵素や修
飾酵素での処理方法及び大腸菌への導入方法等の一般的
な遺伝子組換え技術は公知の方法、例えば（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９りに記載されて
いる方法に従うことができる。
飾酵素での処理方法及び大腸菌への導入方法等の一般的
な遺伝子組換え技術は公知の方法、例えば（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９りに記載されて
いる方法に従うことができる。
またアミノ酸配列の一部改変は部位特異的変異（Ｋｕｎ
ｋｅｌ、Ｔ、Ａ、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２４８８ （１９８５）
）や、一部化学合成したＤＮＡを制限酵素による切断部
位を利用して導入することで行うことができる。
ｋｅｌ、Ｔ、Ａ、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８２４８８ （１９８５）
）や、一部化学合成したＤＮＡを制限酵素による切断部
位を利用して導入することで行うことができる。
本発明によって得られるＤＮＡの配列の確認はジデオキ
シ・チエイン・ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｐ
、 ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ ７４５４６３（１９７７））あるいはマク
サム−ギルバート法（Ｍａｙａｍ、Ａ、Ｍ、 ＆ Ｇ
１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、 ６５４９９ （１９８０））によって行うことが
できる。
シ・チエイン・ターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｐ
、 ｅｔ ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ
ｉ、ＵＳＡ ７４５４６３（１９７７））あるいはマク
サム−ギルバート法（Ｍａｙａｍ、Ａ、Ｍ、 ＆ Ｇ
１１ｂｅｒｔ、Ｗ、、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、 ６５４９９ （１９８０））によって行うことが
できる。
こうして得られた形質転換大腸菌を培養すれば、ヒト尿
由来型のＭ−ＣＳＦモノマーを製造することができる。
由来型のＭ−ＣＳＦモノマーを製造することができる。
ここで大腸菌発現用ベクターとして利用できるものとし
ては通常発現させようとする遺伝子の上流にプロモータ
ー・オペレーター系、ＳＤ（シャインーダルガーノ）配
列、及び蛋白合成開始コドン（例えばＡＴＧ） 、下流
にターミネータ−を有するものがあげられる。プロモー
ター・オペレーター系としてはｌａｃプロモーター・オ
ペレーター系、ｔｒｐプロモーター・オペレーター系、
λファージのＰＬプロモーター・オペレーター系、ｔａ
ｃプロモーター・オペレーター系等が用いられるが、こ
こに挙げたプロモーター・オペレーター系に限定される
ものではなく、本発明の目的を達成しうる限り公知のも
のを広く使用できる。
ては通常発現させようとする遺伝子の上流にプロモータ
ー・オペレーター系、ＳＤ（シャインーダルガーノ）配
列、及び蛋白合成開始コドン（例えばＡＴＧ） 、下流
にターミネータ−を有するものがあげられる。プロモー
ター・オペレーター系としてはｌａｃプロモーター・オ
ペレーター系、ｔｒｐプロモーター・オペレーター系、
λファージのＰＬプロモーター・オペレーター系、ｔａ
ｃプロモーター・オペレーター系等が用いられるが、こ
こに挙げたプロモーター・オペレーター系に限定される
ものではなく、本発明の目的を達成しうる限り公知のも
のを広く使用できる。
本発明においては、発現制御のためにリブレッサー遺伝
子を導入したプラスミドを構築したり、リプレッサー遺
伝子を染色体上に持つ宿主大腸菌を使用することが有効
である。例えばｌａｃプロモーター・オペレーター系、
ｔａｃプロモーター・オペレーター系に対するラクトー
スリプレッサ−（ＩａｃＩ）やλファージのＰＬプロモ
ーター・オペレーター系に対するｃｌリプレッサー及び
その変異型であるｃＩ８５７リプレツサー、あるいはｔ
ｒｐプロモーター・オペレーター系に対するｔｒｐＲな
どは広く知られており本発明において好適に使用できる
が、さらに使用するプロモーター・オペレーター系に対
応するリプレッサーを用いることが良く、そしてここに
挙げたプロモーター・オペレーター系とリプレッサーの
組み合わせだけに限定するものではなく、本発明におい
ては広く一般に知られている系か使用できる。
子を導入したプラスミドを構築したり、リプレッサー遺
伝子を染色体上に持つ宿主大腸菌を使用することが有効
である。例えばｌａｃプロモーター・オペレーター系、
ｔａｃプロモーター・オペレーター系に対するラクトー
スリプレッサ−（ＩａｃＩ）やλファージのＰＬプロモ
ーター・オペレーター系に対するｃｌリプレッサー及び
その変異型であるｃＩ８５７リプレツサー、あるいはｔ
ｒｐプロモーター・オペレーター系に対するｔｒｐＲな
どは広く知られており本発明において好適に使用できる
が、さらに使用するプロモーター・オペレーター系に対
応するリプレッサーを用いることが良く、そしてここに
挙げたプロモーター・オペレーター系とリプレッサーの
組み合わせだけに限定するものではなく、本発明におい
ては広く一般に知られている系か使用できる。
本発明においては、このようなリプレッサーで制御され
た大腸菌の形質発現は、種々の条件でその発現を誘発で
きる。例えば、ラクトースリプレッサーの場合にはラク
トースまたはＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ
ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）で、ｃＩリプレッサーあるい
はｃＩ８５７リプレツザーの場合にはＤＮＡ合成阻害剤
あるいは高温条件、例えば４２°Ｃて、ｔｒｐＲの場合
にはｒｎｄｏｌｙｌ−３−ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄあ
るいはＩｎｄｏｌｙｌ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃ
ｉｄまたはトリプトファンの枯渇で発現を誘発てきるが
、本発明においては使用するリプレッサーに対応する形
質発現の誘発方法を用いれば良く、例示のみに限定する
ものではない。
た大腸菌の形質発現は、種々の条件でその発現を誘発で
きる。例えば、ラクトースリプレッサーの場合にはラク
トースまたはＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ
ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）で、ｃＩリプレッサーあるい
はｃＩ８５７リプレツザーの場合にはＤＮＡ合成阻害剤
あるいは高温条件、例えば４２°Ｃて、ｔｒｐＲの場合
にはｒｎｄｏｌｙｌ−３−ａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄあ
るいはＩｎｄｏｌｙｌ−３−ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃ
ｉｄまたはトリプトファンの枯渇で発現を誘発てきるが
、本発明においては使用するリプレッサーに対応する形
質発現の誘発方法を用いれば良く、例示のみに限定する
ものではない。
さらに、使用する発現ベクターやクローニングベクター
に前もって薬剤耐性遺伝子などを組み込み、組換え体の
選択を容易にすることもできる。
に前もって薬剤耐性遺伝子などを組み込み、組換え体の
選択を容易にすることもできる。
この様なマーカー遺伝子としては、アンピシリン、テト
ラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシンな
どの抗生物質耐性遺伝子、あるいはラクトースオペロン
のα−相補性によりＸ−ｇａｌの分解による青色呈色反
応でＤＮＡの挿入の有無を判定できる１ａｃＺ遺伝子な
どが挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、
その目的に応じて適宜選択して用いることかできる。
ラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシンな
どの抗生物質耐性遺伝子、あるいはラクトースオペロン
のα−相補性によりＸ−ｇａｌの分解による青色呈色反
応でＤＮＡの挿入の有無を判定できる１ａｃＺ遺伝子な
どが挙げられるが、これらに限定されるわけではなく、
その目的に応じて適宜選択して用いることかできる。
本発明において、得られた発現ベクターを大腸菌に導入
し形質転換体を得る方法としては一般に使用されている
方法を広く適用でき、例えば宿主大腸菌を塩化カルシウ
ムによる処理、あるいは塩化カルシウム、塩化マグネシ
ウム、塩化ルビジウム存在下に処理した後にプラスミド
ＤＮＡと混合することで容易に行うことができる（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、 ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９乃。
し形質転換体を得る方法としては一般に使用されている
方法を広く適用でき、例えば宿主大腸菌を塩化カルシウ
ムによる処理、あるいは塩化カルシウム、塩化マグネシ
ウム、塩化ルビジウム存在下に処理した後にプラスミド
ＤＮＡと混合することで容易に行うことができる（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、 Ｔ、 ｅｔ ａｌ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９乃。
かくして得られた形質転換体は常法に従って培養するこ
とができ、適当な発現誘導により大腸菌体内にヒト尿由
来Ｎ末端変異型Ｍ−ＣＳＦを生産蓄積せしめることがで
きる。該培養に用いられる培地としては、ＬＢ培地、Ｅ
培地、Ｍ９培地、Ｍ６３培地のような一般的に大腸菌の
培養に用いられる培地でよく、必要に応じて通常知られ
ている各種の窒素源、炭素源、無機塩、ビタミン類等を
添加できる。培養の途中でｐＨ調整のために水酸化ナト
リウムのようなアルカリ類あるいは硝酸のような酸類、
また必要に応じて消泡剤、例えばシリコンＫＭ−７０（
信越化学社製）カラリン１０２（三洋化成社製）等を添
加して、培養条件の改善をすることも許される。使用す
る培養装置も大腸菌の培養で広く一般に用いられている
ものが使用てきる。さらに宿主大腸菌の培養条件は、ｐ
Ｈ６〜８、好ましくは７またはその付近の培地で、培養
温度２０〜４５°Ｃ１好ましくは２８〜４２°Ｃを採用
できるが、これらは目的に応じて適宜選ぶことができる
。
とができ、適当な発現誘導により大腸菌体内にヒト尿由
来Ｎ末端変異型Ｍ−ＣＳＦを生産蓄積せしめることがで
きる。該培養に用いられる培地としては、ＬＢ培地、Ｅ
培地、Ｍ９培地、Ｍ６３培地のような一般的に大腸菌の
培養に用いられる培地でよく、必要に応じて通常知られ
ている各種の窒素源、炭素源、無機塩、ビタミン類等を
添加できる。培養の途中でｐＨ調整のために水酸化ナト
リウムのようなアルカリ類あるいは硝酸のような酸類、
また必要に応じて消泡剤、例えばシリコンＫＭ−７０（
信越化学社製）カラリン１０２（三洋化成社製）等を添
加して、培養条件の改善をすることも許される。使用す
る培養装置も大腸菌の培養で広く一般に用いられている
ものが使用てきる。さらに宿主大腸菌の培養条件は、ｐ
Ｈ６〜８、好ましくは７またはその付近の培地で、培養
温度２０〜４５°Ｃ１好ましくは２８〜４２°Ｃを採用
できるが、これらは目的に応じて適宜選ぶことができる
。
上記の方法で得られた培養大腸菌は回収せしめられ、菌
体中のヒト尿由来Ｎ末端変異型Ｍ−ＣＳＦ蛋白が回収さ
れる。
体中のヒト尿由来Ｎ末端変異型Ｍ−ＣＳＦ蛋白が回収さ
れる。
本発明においてＭ−ＣＳＦ製造のための好ましい方法と
しては、２・シストロン法によりＭ−ＣＳＦを効率よく
発現させる方法が例示できる。従って、本発明の別の目
的は、２・シストロン法を駆使してＭ−ＣＳＦを大腸菌
等の微生物中で効率よく得ることにもある。この２・シ
ストロン法とは２つの連続するシストロンからなる遺伝
子発現系であり（Ｔｅｓｓｉｅｒ、Ｌ、−Ｈ，ｅｔ ａ
ｔ、 ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 １２７
６６３ （１９８４）） 、これにより本発明では宿主
大腸菌内に安定かつ大量にＭ−ＣＳＦを生産蓄積できる
。
しては、２・シストロン法によりＭ−ＣＳＦを効率よく
発現させる方法が例示できる。従って、本発明の別の目
的は、２・シストロン法を駆使してＭ−ＣＳＦを大腸菌
等の微生物中で効率よく得ることにもある。この２・シ
ストロン法とは２つの連続するシストロンからなる遺伝
子発現系であり（Ｔｅｓｓｉｅｒ、Ｌ、−Ｈ，ｅｔ ａ
ｔ、 ；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、 １２７
６６３ （１９８４）） 、これにより本発明では宿主
大腸菌内に安定かつ大量にＭ−ＣＳＦを生産蓄積できる
。
該発現方法に従う本発明の詳細な説明すれば、ファース
トシストロン（Ｆｉｒｓｔ ｃｉｓｔｒｏｎ）として適
当なポリペプチドあるいはその一部をコードする遺伝子
と、セカンドシストロン（Ｓｅｃｏｎｄ ｃｉｓｔｒｏ
ｎ）としてＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つものからなる発現ベ
クターを作製する。該ベクターのファーストシストロン
上流には該遺伝子発現のためのプロモーター及びＳＤ配
列が配置されているとともに、ファーストシストロンの
終始コドンとセカンドシストロンの間にセカンドシスト
ロン発現のためのＳＤ配列と開始コドンが配されている
ことか重要である。
トシストロン（Ｆｉｒｓｔ ｃｉｓｔｒｏｎ）として適
当なポリペプチドあるいはその一部をコードする遺伝子
と、セカンドシストロン（Ｓｅｃｏｎｄ ｃｉｓｔｒｏ
ｎ）としてＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つものからなる発現ベ
クターを作製する。該ベクターのファーストシストロン
上流には該遺伝子発現のためのプロモーター及びＳＤ配
列が配置されているとともに、ファーストシストロンの
終始コドンとセカンドシストロンの間にセカンドシスト
ロン発現のためのＳＤ配列と開始コドンが配されている
ことか重要である。
上記のファーストシストロンとして利用する遺伝子とし
ては宿主内で発現されるものであれば、特に制限はない
。しかし、そのファーストシストロン部により生産され
るものは、本発明Ｍ−ＣＳＦと同一系内に産生されるポ
リペプチドであるため、本発明Ｍ−ＣＳＦと容易に分離
できる性質のものが好ましい。さらに使用するプロモー
ター系が直接支配している遺伝子である方が好ましい。
ては宿主内で発現されるものであれば、特に制限はない
。しかし、そのファーストシストロン部により生産され
るものは、本発明Ｍ−ＣＳＦと同一系内に産生されるポ
リペプチドであるため、本発明Ｍ−ＣＳＦと容易に分離
できる性質のものが好ましい。さらに使用するプロモー
ター系が直接支配している遺伝子である方が好ましい。
より具体的にはＰＬプロモーターとＰＬプロモーターの
支配下にあるＮ蛋白が例示できる。使用にあたっては、
このＮ蛋白を最大でも１００個以下のアミノ酸残基しか
コードしないように制限酵素で切断し、不要のＤＮＡ配
列を除去後、合成りＮＡを導入して改変する。この合成
りＮＡには、改変したＮ蛋白の終止コドンとセカンドシ
ストロン発現用のＳＤ配列と開始コドンが含まれるよう
にする。さらに上流からのリードスルーを防ぐために、
３つの読み枠（リーディングフレーム）全てに終止コド
ンを導入しておくことが望ましい。本発明においては、
合成りＮＡ中の終止コドンと開始コドンは天然界に存在
する全てのものが利用できる。
支配下にあるＮ蛋白が例示できる。使用にあたっては、
このＮ蛋白を最大でも１００個以下のアミノ酸残基しか
コードしないように制限酵素で切断し、不要のＤＮＡ配
列を除去後、合成りＮＡを導入して改変する。この合成
りＮＡには、改変したＮ蛋白の終止コドンとセカンドシ
ストロン発現用のＳＤ配列と開始コドンが含まれるよう
にする。さらに上流からのリードスルーを防ぐために、
３つの読み枠（リーディングフレーム）全てに終止コド
ンを導入しておくことが望ましい。本発明においては、
合成りＮＡ中の終止コドンと開始コドンは天然界に存在
する全てのものが利用できる。
特に好ましい方法によれば、まずＰＬプロモーターとＰ
Ｌプロモーターの支配下にあるＮ蛋白を含む発現ベクタ
ーを作製し、該ベクターを制限酵素で切断し不要のＤＮ
Ａ配列を除去後、単離精製する。一方ヒト尿由来型Ｍ−
ＣＳＦをクローニングしたベクターを、適当な制限酵素
で処理してＭＣＳＦ遺伝子部分を回収する。上記両回収
断片のうちの不足なりＮＡ部分（Ｎ蛋白の終止コドンと
セカンドシストロン発現用のＳＤ配列と開始コドン及び
制限酵素処理のために不足したコドン）を補うための合
成りＮＡと、上記両回収断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等
を用いて連結させることにより所望の発現ベクターを得
ることができる。こうして得られた発現ベクターは、Ｎ
蛋白の一部をファーストシストロンとし、Ｍ−ＣＳ Ｆ
をセカンドシスドロンとする。この発現ベクターを使用
したＭ−ＣＳＦ発現方法は新規発現方法であり、ＭＣＳ
Ｆの高発現が可能となりその効果も大きい。 本発明で
は、好ましくは上記で得られる発現ベクターをｃＩ８５
７リプレツサーを持つ宿主大腸菌（例えばＮ４８３０−
１．Ｋ１２ｄｅｌｔａＨ１）に導入して形質転換し、２
・シストロン法に基づく所望の形質転換体を取得できる
。 かくして得られた形質転換体は、常法に従い培養で
きる。例えば、ＬＢ培地中で２６〜３７°Ｃ１より好ま
しくは２８〜３５°Ｃで振どうあるいは撹はんしながら
培養し、対数増殖期の適当な時期で培養温度を３７〜４
２°Ｃに上昇させ、さらに一定時間、例えば２〜２４時
間、３７〜４２°Ｃで培養を行うことができる。この様
な培養を行って宿主大腸菌にＭ−ＣＳＦを生産させるこ
とが可能である。さらに後の精製を容易にするためには
菌体内に生産されたＭ−ＣＳＦがＩｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙ （凝集塊）を形成せしめることが望ましい。
Ｌプロモーターの支配下にあるＮ蛋白を含む発現ベクタ
ーを作製し、該ベクターを制限酵素で切断し不要のＤＮ
Ａ配列を除去後、単離精製する。一方ヒト尿由来型Ｍ−
ＣＳＦをクローニングしたベクターを、適当な制限酵素
で処理してＭＣＳＦ遺伝子部分を回収する。上記両回収
断片のうちの不足なりＮＡ部分（Ｎ蛋白の終止コドンと
セカンドシストロン発現用のＳＤ配列と開始コドン及び
制限酵素処理のために不足したコドン）を補うための合
成りＮＡと、上記両回収断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等
を用いて連結させることにより所望の発現ベクターを得
ることができる。こうして得られた発現ベクターは、Ｎ
蛋白の一部をファーストシストロンとし、Ｍ−ＣＳ Ｆ
をセカンドシスドロンとする。この発現ベクターを使用
したＭ−ＣＳＦ発現方法は新規発現方法であり、ＭＣＳ
Ｆの高発現が可能となりその効果も大きい。 本発明で
は、好ましくは上記で得られる発現ベクターをｃＩ８５
７リプレツサーを持つ宿主大腸菌（例えばＮ４８３０−
１．Ｋ１２ｄｅｌｔａＨ１）に導入して形質転換し、２
・シストロン法に基づく所望の形質転換体を取得できる
。 かくして得られた形質転換体は、常法に従い培養で
きる。例えば、ＬＢ培地中で２６〜３７°Ｃ１より好ま
しくは２８〜３５°Ｃで振どうあるいは撹はんしながら
培養し、対数増殖期の適当な時期で培養温度を３７〜４
２°Ｃに上昇させ、さらに一定時間、例えば２〜２４時
間、３７〜４２°Ｃで培養を行うことができる。この様
な培養を行って宿主大腸菌にＭ−ＣＳＦを生産させるこ
とが可能である。さらに後の精製を容易にするためには
菌体内に生産されたＭ−ＣＳＦがＩｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙ （凝集塊）を形成せしめることが望ましい。
本発明で作製した２・シストロン法を使用した発現ベク
ターを導入した菌体は誘導により効率よく菌体内に凝集
塊を形成する。このようにＭ−ＣＳＦ凝集塊を形成した
菌体を遠心で回収し、菌体を破壊して不溶性画分として
Ｍ−ＣＳＦ凝集塊を得る。菌体の破壊方法としては、例
えば超音波処理による破壊やＮａｇａｉらの方法（Ｎａ
ｇａｉ、に、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ８２７２５２ （１９８５）
）によって行うことができる。この様にして得られたＭ
−ＣＳＦ凝集塊の可溶化ならびに変性（ここでいう変性
とは蛋白質の三次構造を破壊することを意味する）は、
例えば２〜８Ｍ尿素、４〜７Ｍ塩酸グアニジンあるいは
０．１％（Ｗ／Ｖ）以上のドデシル硫酸ナトリウムを含
む緩衝液の添加または強アルカリ性条件下（例えばｐＨ
ｌＯ以上）、強酸性条件下（例えばｐＨ４以下）で、ホ
モジナイザー等を使用することによって行うことができ
る。かくして得られたＭ−ＣＳＦモノマーは、種々の方
法によって精製でき、例えば可溶化変性条件下で精製す
ることができる。精製方法としては、例えば逆相クロマ
トグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、高
速液体クロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィー
法、ゲルろ適法などが例示できるが、その他一般にペプ
チド等の精製法として知られた方法を単独でまたは組み
合わせて使用できる。
ターを導入した菌体は誘導により効率よく菌体内に凝集
塊を形成する。このようにＭ−ＣＳＦ凝集塊を形成した
菌体を遠心で回収し、菌体を破壊して不溶性画分として
Ｍ−ＣＳＦ凝集塊を得る。菌体の破壊方法としては、例
えば超音波処理による破壊やＮａｇａｉらの方法（Ｎａ
ｇａｉ、に、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ８２７２５２ （１９８５）
）によって行うことができる。この様にして得られたＭ
−ＣＳＦ凝集塊の可溶化ならびに変性（ここでいう変性
とは蛋白質の三次構造を破壊することを意味する）は、
例えば２〜８Ｍ尿素、４〜７Ｍ塩酸グアニジンあるいは
０．１％（Ｗ／Ｖ）以上のドデシル硫酸ナトリウムを含
む緩衝液の添加または強アルカリ性条件下（例えばｐＨ
ｌＯ以上）、強酸性条件下（例えばｐＨ４以下）で、ホ
モジナイザー等を使用することによって行うことができ
る。かくして得られたＭ−ＣＳＦモノマーは、種々の方
法によって精製でき、例えば可溶化変性条件下で精製す
ることができる。精製方法としては、例えば逆相クロマ
トグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、高
速液体クロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィー
法、ゲルろ適法などが例示できるが、その他一般にペプ
チド等の精製法として知られた方法を単独でまたは組み
合わせて使用できる。
本発明では、さらに上記方法を駆使して精製されたＭ−
ＣＳＦモノマーは、Ｍ−ＣＳＦダイマーへの再構成（Ｒ
ｅｆｏｌｃｌｉｎｇ）処理を受けることができる。この
ような、本発明に従った独特な処理により、大腸菌のよ
うな微生物を使用して、効率よ＜Ｍ−ＣＳＦ活性を有す
る生産物を得ることか可能である。再構成を始めるにあ
たっては、Ｍ−ＣＳＦモノマーは上記のような可溶化剤
で可溶比変性処理せしめられ、次に還元剤を添加してシ
スティン残基同士のランダムなジスルヒド結合を開裂さ
せ、遊離のスルヒドリル基に還元しなければならない。
ＣＳＦモノマーは、Ｍ−ＣＳＦダイマーへの再構成（Ｒ
ｅｆｏｌｃｌｉｎｇ）処理を受けることができる。この
ような、本発明に従った独特な処理により、大腸菌のよ
うな微生物を使用して、効率よ＜Ｍ−ＣＳＦ活性を有す
る生産物を得ることか可能である。再構成を始めるにあ
たっては、Ｍ−ＣＳＦモノマーは上記のような可溶化剤
で可溶比変性処理せしめられ、次に還元剤を添加してシ
スティン残基同士のランダムなジスルヒド結合を開裂さ
せ、遊離のスルヒドリル基に還元しなければならない。
この場合のＭ−ＣＳＦモノマー蛋白の濃度は５〜１０ｍ
ｇ／ｍｌが好ましく、以下に記載の反応条件下でその最
終Ｍ−ＣＳＦモノマー蛋白濃度か０．０５〜１．Ｏｒｎ
ｇ／ｍｌの濃度範囲となることが好ましい。可溶化変性
時に添加する還元試薬として一般的なものは、例えば２
−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、ジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）のようなチオール含有成分が使用でき、使
用濃度は１００ｍＭ以下、より好ましくは０〜２０ｍＭ
である。再構成は上記のような還元試薬入りの可溶化剤
を希釈、透析等の方法を用いて、徐々にあるいは急速に
除去することによって達成される。この操作は通常Ｏ〜
２５°Ｃ１より好ましくは２〜１０°Ｃで行うことがで
き、反応は２時間〜１週間より好ましくは３時間〜５日
間で達成される。また可溶化剤の濃度は、尿素ならば１
Ｍ以下、より好ましくは０．５Ｍ以下で、塩酸グアニジ
ンならば２Ｍ以下、より好ましくは１Ｍ以下である。可
溶化剤がこの濃度以下になると破壊されていたＭ−ＣＳ
Ｆモノマー蛋白の三次構造が戻りはじめ、Ｍ−ＣＳＦ
ダイマー形成に好適な条件となる。ジスルフィド結合の
形成は、自然酸化あるいは上記再構成条件下に適当な酸
化−還元試薬を加えることで達成される。この方法に一
般に用いられる試薬としては酸化型及び還元型グルタチ
オンを例示することができるがこれらに限定されるわけ
ではない。また、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎあるいはｐｕ
ｒｏｔｈｉｏｎｉｎのような酵素によっても再構成処理
される。酸化型及び還元型グルタチオンは、例えば１０
ｍＭ以下、より好ましくは０〜５ｍＭで使用される。ま
た酸化型と還元型のモル比は、例えばＩ：Ｉ〜１．５０
が使用でき工：２〜Ｉ：１５が好適に用いられる。
ｇ／ｍｌが好ましく、以下に記載の反応条件下でその最
終Ｍ−ＣＳＦモノマー蛋白濃度か０．０５〜１．Ｏｒｎ
ｇ／ｍｌの濃度範囲となることが好ましい。可溶化変性
時に添加する還元試薬として一般的なものは、例えば２
−メルカプトエタノール（２ＭＥ）、ジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）のようなチオール含有成分が使用でき、使
用濃度は１００ｍＭ以下、より好ましくは０〜２０ｍＭ
である。再構成は上記のような還元試薬入りの可溶化剤
を希釈、透析等の方法を用いて、徐々にあるいは急速に
除去することによって達成される。この操作は通常Ｏ〜
２５°Ｃ１より好ましくは２〜１０°Ｃで行うことがで
き、反応は２時間〜１週間より好ましくは３時間〜５日
間で達成される。また可溶化剤の濃度は、尿素ならば１
Ｍ以下、より好ましくは０．５Ｍ以下で、塩酸グアニジ
ンならば２Ｍ以下、より好ましくは１Ｍ以下である。可
溶化剤がこの濃度以下になると破壊されていたＭ−ＣＳ
Ｆモノマー蛋白の三次構造が戻りはじめ、Ｍ−ＣＳＦ
ダイマー形成に好適な条件となる。ジスルフィド結合の
形成は、自然酸化あるいは上記再構成条件下に適当な酸
化−還元試薬を加えることで達成される。この方法に一
般に用いられる試薬としては酸化型及び還元型グルタチ
オンを例示することができるがこれらに限定されるわけ
ではない。また、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎあるいはｐｕ
ｒｏｔｈｉｏｎｉｎのような酵素によっても再構成処理
される。酸化型及び還元型グルタチオンは、例えば１０
ｍＭ以下、より好ましくは０〜５ｍＭで使用される。ま
た酸化型と還元型のモル比は、例えばＩ：Ｉ〜１．５０
が使用でき工：２〜Ｉ：１５が好適に用いられる。
ところで従来技術、特に特願平Ｍ９２５９２．２−３６
３５１のＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ配列をつぶさに検討すると
、そこではｃＤＮＡ内のメチオニン（６５残基目のアミ
ノ酸）から再翻訳開始を起こす可能性が示唆される。そ
れは、再翻訳開始部位として利用されているメチオニン
残基のコドンの５〜ＩＯ塩基上流に、ＳＤ配列として利
用され得るＧＧＡＧＧＡの配列が存在していることに起
因するものと考えられる。類似の記載が特表千１−５０
１２８３にもあるが、それは５９残基目のアミノ酸がチ
ロシンの場合に内因性の再翻訳開始が認められ、アスパ
ラギン酸（コドンとしてはＧＡＴ）の場合には認められ
ないという記載である。この記載にも拘らず、上記コド
ンのアスパラギン酸の場合においても、ＧＧＡＧＧＡの
配列が存在するため、内因性の再翻訳開始が起こるもの
と予想され、抜本的な解決手段にはなっていないと考え
られる。一方、本発明においては５９残基目のアミノ酸
はチロシンであるが、上記ＧＧＡＧＧＡという配列のコ
ードするアミノ酸を変えることなく’ＧＧＡＡＧＡに変
化させることにより、内因性の再翻訳開始を十分抑制す
ることが可能となったという点でたいへん大きな効果上
の利点を有すると思われる。
３５１のＭ−ＣＳＦｃＤＮＡ配列をつぶさに検討すると
、そこではｃＤＮＡ内のメチオニン（６５残基目のアミ
ノ酸）から再翻訳開始を起こす可能性が示唆される。そ
れは、再翻訳開始部位として利用されているメチオニン
残基のコドンの５〜ＩＯ塩基上流に、ＳＤ配列として利
用され得るＧＧＡＧＧＡの配列が存在していることに起
因するものと考えられる。類似の記載が特表千１−５０
１２８３にもあるが、それは５９残基目のアミノ酸がチ
ロシンの場合に内因性の再翻訳開始が認められ、アスパ
ラギン酸（コドンとしてはＧＡＴ）の場合には認められ
ないという記載である。この記載にも拘らず、上記コド
ンのアスパラギン酸の場合においても、ＧＧＡＧＧＡの
配列が存在するため、内因性の再翻訳開始が起こるもの
と予想され、抜本的な解決手段にはなっていないと考え
られる。一方、本発明においては５９残基目のアミノ酸
はチロシンであるが、上記ＧＧＡＧＧＡという配列のコ
ードするアミノ酸を変えることなく’ＧＧＡＡＧＡに変
化させることにより、内因性の再翻訳開始を十分抑制す
ることが可能となったという点でたいへん大きな効果上
の利点を有すると思われる。
以下実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１］２１４△５アミノ酸型ＩＶＩ−ＣＳＦの大
腸菌発現ベクターの作製 ■ＰＬプロモーターを持つベクターの作製最初にコピー
数の増加とより高い生物学的封じ込めを目的として、発
現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）と、
ｐＡＴ１５３（アマジャム社製）の複製起点を含む領域
の交換を行った。すなわち、ｐＫＫ２２３−３ （５μ
ｇ）を制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉ（全酒造社製）とＡｌｗ
Ｎｌ（ＮＥＢ社製）の各々１０単位で３７℃、２時間処
理し、完全に消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動
（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ
（ＢＩＯＩ Ｏ１社製）を用い、その操作方法に従って
約３Ｋｂｐの断片を回収した。一方、ｐＡＴ１５３（５
μｇ）も同様の制限酵素で消化し、複製起点を含む約５
ｏｏｂｐの領域を同様の電気泳動及び回収操作を行い回
収した。
腸菌発現ベクターの作製 ■ＰＬプロモーターを持つベクターの作製最初にコピー
数の増加とより高い生物学的封じ込めを目的として、発
現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）と、
ｐＡＴ１５３（アマジャム社製）の複製起点を含む領域
の交換を行った。すなわち、ｐＫＫ２２３−３ （５μ
ｇ）を制限酵素ＥｃｏＴ１４Ｉ（全酒造社製）とＡｌｗ
Ｎｌ（ＮＥＢ社製）の各々１０単位で３７℃、２時間処
理し、完全に消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動
（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ
（ＢＩＯＩ Ｏ１社製）を用い、その操作方法に従って
約３Ｋｂｐの断片を回収した。一方、ｐＡＴ１５３（５
μｇ）も同様の制限酵素で消化し、複製起点を含む約５
ｏｏｂｐの領域を同様の電気泳動及び回収操作を行い回
収した。
このようにして回収した両断片をＤＮＡライゲーション
キット（全酒造社製）の方法に従ってライゲーションを
行い、ついで大腸菌ＨＢ １０１のコンピテントセルに
導入した。この大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養し
た。ここで得たコロニーを無作為に１２個選択し、アン
ピシリン（１００μｇ／ｍ］）を含むＬＢ培地中、３７
°Ｃで一夜培養した。この菌体からアルカリ−３ＤＳ法
（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ、Ｊ、 ；
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
キット（全酒造社製）の方法に従ってライゲーションを
行い、ついで大腸菌ＨＢ １０１のコンピテントセルに
導入した。この大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養し
た。ここで得たコロニーを無作為に１２個選択し、アン
ピシリン（１００μｇ／ｍ］）を含むＬＢ培地中、３７
°Ｃで一夜培養した。この菌体からアルカリ−３ＤＳ法
（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ、Ｊ、 ；
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ。
７１５１３ （１９７９））を用いてプラスミドを調製
した。このプラスミドを制限酵素ＰｖｕＩ［（全酒造社
製）１０単位で３７°Ｃ，２時間処理し、完全に消化し
、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする
約３．８８Ｋｂｐを与えるクローンを選択して得、これ
をｐＡＴ２２３−３と命名した。 次に、ＰＬプロモー
ターを持つ熱誘導性発現ベクターｐＫｃ３０ （ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨＬａｂ社製）のＰＬプロモーターを含む領域
と、ｐＡＴ２２３−３のｐＫＫ２２３−３由来のＴａｃ
プロモーターを含む領域との交換を行った。すなわち、
ｐＡＴ２２３−３ （５μｇ）を制限酵素ＢａｍＨＩ（
全酒造社製）とＮｒｕＩ（全酒造社製）各々１０単位で
３７°Ｃ，２時間処理し、完全に消化し、１．０％アガ
ロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約３Ｋｂｐの断片を回収し
た。一方、ｐＫＣ３０（５μｇ）を制限酵素ＰｖｕＩ（
全酒造社製）１０単位で３７℃、２時間処理し、完全に
消化した。これをプランティングキット（全酒造社製）
のＴ４ＤＮＡポリメラーセを用いて、３７℃、５分間反
応させて平滑末端とし、フェノール抽出後エタノール沈
澱により断片を回収した。さらに、制限酵素ＢａｍＨＩ
１０単位で３７°Ｃ，２時間処理し、完全に消化した
。次に、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、
２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約１
．３Ｋｂｐの断片を回収した。このようにして回収した
両断片を、ＤＮＡライゲーションキットの方法に従って
ライゲーションを行い、次に大腸菌Ｎ９９ｃＩ＋のコン
ピテントセルに導入した。この大腸菌をアンピシリン（
１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３７°
Ｃで一夜培養した。ここで得たコロニーを無作為に１２
個選択し、アンピシリン（５０℃ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
培地中、３７°Ｃで一夜培養した。この菌体からアルカ
リ−３ＤＳ法を用いてプラスミドを調製した。このプラ
スミドを制限酵素ＨｐａＩ（全酒造社製）１０単位で３
７°Ｃ１２時間処理し、完全に消化し、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、目的とする約４．３Ｋｂｐの
断片を与えるクローンを選択しｐＰＬＮと命名した（第
２図）。
した。このプラスミドを制限酵素ＰｖｕＩ［（全酒造社
製）１０単位で３７°Ｃ，２時間処理し、完全に消化し
、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い、目的とする
約３．８８Ｋｂｐを与えるクローンを選択して得、これ
をｐＡＴ２２３−３と命名した。 次に、ＰＬプロモー
ターを持つ熱誘導性発現ベクターｐＫｃ３０ （ＣＬＯ
ＮＴＥＣＨＬａｂ社製）のＰＬプロモーターを含む領域
と、ｐＡＴ２２３−３のｐＫＫ２２３−３由来のＴａｃ
プロモーターを含む領域との交換を行った。すなわち、
ｐＡＴ２２３−３ （５μｇ）を制限酵素ＢａｍＨＩ（
全酒造社製）とＮｒｕＩ（全酒造社製）各々１０単位で
３７°Ｃ，２時間処理し、完全に消化し、１．０％アガ
ロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥ
ＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約３Ｋｂｐの断片を回収し
た。一方、ｐＫＣ３０（５μｇ）を制限酵素ＰｖｕＩ（
全酒造社製）１０単位で３７℃、２時間処理し、完全に
消化した。これをプランティングキット（全酒造社製）
のＴ４ＤＮＡポリメラーセを用いて、３７℃、５分間反
応させて平滑末端とし、フェノール抽出後エタノール沈
澱により断片を回収した。さらに、制限酵素ＢａｍＨＩ
１０単位で３７°Ｃ，２時間処理し、完全に消化した
。次に、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、
２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約１
．３Ｋｂｐの断片を回収した。このようにして回収した
両断片を、ＤＮＡライゲーションキットの方法に従って
ライゲーションを行い、次に大腸菌Ｎ９９ｃＩ＋のコン
ピテントセルに導入した。この大腸菌をアンピシリン（
１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３７°
Ｃで一夜培養した。ここで得たコロニーを無作為に１２
個選択し、アンピシリン（５０℃ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
培地中、３７°Ｃで一夜培養した。この菌体からアルカ
リ−３ＤＳ法を用いてプラスミドを調製した。このプラ
スミドを制限酵素ＨｐａＩ（全酒造社製）１０単位で３
７°Ｃ１２時間処理し、完全に消化し、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動を行い、目的とする約４．３Ｋｂｐの
断片を与えるクローンを選択しｐＰＬＮと命名した（第
２図）。
■ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４とｐＵＣｌ ３の組換え特願
平２−３６３５１明細書に記載の動物細胞発現用ベクタ
ーｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４（７）Ｍ−ＣＳＦＤＮＡ部分
を、ｐＵｃ１３（ファルマシア社製）のマルチクローニ
ング部位に組換えた。すなわち、ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１
４ Ｃ５ａｇ’）を制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）と
ＸｈｏＩ（宝酒造社製）各々１０単位で３７°Ｃ，２時
間反応処理し、完全に消化し、１．０％アガロースゲル
電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥ
ＡＮＴＭを用いて約９５０ｂｐの断片を回収した。一方
、ｐＵｃ１３ （５μｇ）を制限酵素ＸｂａＩと５ａＩ
Ｉ（宝酒造社製）各々１０単位で３７°Ｃ，２時間反応
させ、完全に消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動
（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ
を用いて約２．７Ｋｂｐの断片を回収した。このように
して回収した両断片をＤＮＡライゲーションキットの方
法に従ってライゲーションを行い、次に大腸菌ＪＭ１０
９のコンピテントセルに導入した。この大腸菌をアンピ
シリン（１００μｇ／ｍ １）とＸ−ｇ、ａｌ （４
０μｇ／ｍ１）及びＩＰＴＧ （５ｍＭ）を含むＬＢ寒
天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養した。白色コロニー
として組換え体を得た。ここで得たコロニーを無作為に
１２個選択し、アンピシリン（５０μｇ／ｍ１）を含む
ＬＢ培地中、３７°Ｃで一夜培養した。この菌体からア
ルカリ−３ＤＳ法を用いてプラスミドを調製した。この
プラスミドを制限酵素ＸｂａＩとＸｈｏＩとの２種類そ
れぞれ１０単位と、３７°Ｃ，２時間の条件で反応させ
、１．０％アガロースゲル電気泳動を行った。制限酵素
ｘｈｏＩで切断されず、制限酵素ＸｂａＩで一カ所だけ
切断され、そして目的とする約３．６Ｋｂｐの断片のみ
を与えるクローンを選択した。このものをｐ２１４と命
名した（第３図）。
平２−３６３５１明細書に記載の動物細胞発現用ベクタ
ーｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１４（７）Ｍ−ＣＳＦＤＮＡ部分
を、ｐＵｃ１３（ファルマシア社製）のマルチクローニ
ング部位に組換えた。すなわち、ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２１
４ Ｃ５ａｇ’）を制限酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）と
ＸｈｏＩ（宝酒造社製）各々１０単位で３７°Ｃ，２時
間反応処理し、完全に消化し、１．０％アガロースゲル
電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥ
ＡＮＴＭを用いて約９５０ｂｐの断片を回収した。一方
、ｐＵｃ１３ （５μｇ）を制限酵素ＸｂａＩと５ａＩ
Ｉ（宝酒造社製）各々１０単位で３７°Ｃ，２時間反応
させ、完全に消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動
（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭ
を用いて約２．７Ｋｂｐの断片を回収した。このように
して回収した両断片をＤＮＡライゲーションキットの方
法に従ってライゲーションを行い、次に大腸菌ＪＭ１０
９のコンピテントセルに導入した。この大腸菌をアンピ
シリン（１００μｇ／ｍ １）とＸ−ｇ、ａｌ （４
０μｇ／ｍ１）及びＩＰＴＧ （５ｍＭ）を含むＬＢ寒
天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養した。白色コロニー
として組換え体を得た。ここで得たコロニーを無作為に
１２個選択し、アンピシリン（５０μｇ／ｍ１）を含む
ＬＢ培地中、３７°Ｃで一夜培養した。この菌体からア
ルカリ−３ＤＳ法を用いてプラスミドを調製した。この
プラスミドを制限酵素ＸｂａＩとＸｈｏＩとの２種類そ
れぞれ１０単位と、３７°Ｃ，２時間の条件で反応させ
、１．０％アガロースゲル電気泳動を行った。制限酵素
ｘｈｏＩで切断されず、制限酵素ＸｂａＩで一カ所だけ
切断され、そして目的とする約３．６Ｋｂｐの断片のみ
を与えるクローンを選択した。このものをｐ２１４と命
名した（第３図）。
■合成りＮＡの作製
下記■の組換えの接続を行うためのリンカ−として利用
するために、オリゴヌクレオチドをＢｉｏｓｅａｒｃｈ
８６００ＤＮＡ合成装置（ＭｉｌＩｉｐｏｒｅ社製）で
合成した。その配列は以下５’ −ＴＡＡＣＴＴＡＡＧ
ＧＡＧＧＴＡＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＣＡＣ
ＡＴＧＡ−３’・ ・ ・（１） ５−ＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＣ
ＴＣＣＴＴＡＡＧＴＴＡ−３’・ ・ ・（２） ５−ＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＧＴＡ
ＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣ
ＧＴＴＴＴＣＧＣＧＡＴＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＣ
ＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧ−３’
・ ・ ・（３）５’ −ＣＴＧＣＡＣＡ
ＡＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＡＴ
ＣＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＴ
ＧＡＴＡＴＣＴＴＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＡＡＡＴＧ
ＡＡＴＴＣ−３’ ・
・ ・（４）合成オリゴヌクレオチドの精製はオリゴヌ
クレオチド精製カートリッジ（アプライド・バイオシス
テムズ・ジャパン社製）あるいはＫｈｏｒａｎａらの方
法（Ｋｈｏｒａｎａ、Ｈ，Ｇ、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８１２２８
５ （１９８４））に従って行った。
するために、オリゴヌクレオチドをＢｉｏｓｅａｒｃｈ
８６００ＤＮＡ合成装置（ＭｉｌＩｉｐｏｒｅ社製）で
合成した。その配列は以下５’ −ＴＡＡＣＴＴＡＡＧ
ＧＡＧＧＴＡＡＣＡＴＡＴＧＴＡＴＴＧＴＴＣＣＣＡＣ
ＡＴＧＡ−３’・ ・ ・（１） ５−ＧＴＧＧＧＡＡＣＡＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＴＡＣＣ
ＴＣＣＴＴＡＡＧＴＴＡ−３’・ ・ ・（２） ５−ＴＴＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＧＴＡ
ＣＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣ
ＧＴＴＴＴＣＧＣＧＡＴＡＡＣＡＣＣＣＣＣＡＡＴＧＣ
ＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＧＴＧＣＡＧ−３’
・ ・ ・（３）５’ −ＣＴＧＣＡＣＡ
ＡＴＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＴＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＡＴ
ＣＧＣＧＡＡＡＡＣＧＣＡＴＧＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＴ
ＧＡＴＡＴＣＴＴＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＡＡＡＴＧ
ＡＡＴＴＣ−３’ ・
・ ・（４）合成オリゴヌクレオチドの精製はオリゴヌ
クレオチド精製カートリッジ（アプライド・バイオシス
テムズ・ジャパン社製）あるいはＫｈｏｒａｎａらの方
法（Ｋｈｏｒａｎａ、Ｈ，Ｇ、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８１２２８
５ （１９８４））に従って行った。
精製後のオリゴヌクレオチドはそれぞれＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造社製）を用いて、５″末端のリ
ン酸化を行った。続いて上記断片（１）は（２）と、（
３）は（４）とアニールさせて、２本鎖ＤＮＡリンカ−
を２種類（前者を△５リンカー９後者を△６４リンカ−
と命名）作製した。
オチドキナーゼ（宝酒造社製）を用いて、５″末端のリ
ン酸化を行った。続いて上記断片（１）は（２）と、（
３）は（４）とアニールさせて、２本鎖ＤＮＡリンカ−
を２種類（前者を△５リンカー９後者を△６４リンカ−
と命名）作製した。
■ｐ２１４とｐＰＬＮの組換え
まず発現ベクターのｐＰＬＮ（５μｇ）を制限酵素Ｈｐ
ａＩ（宝酒造社製）とＨｉｎｄｌｌｌ （宝酒造社製）
各々１０単位で３７°Ｃ，２時間反応処理し、完全に消
化し、次に１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ
、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約
３．５Ｋｂｐの断片を回収した。
ａＩ（宝酒造社製）とＨｉｎｄｌｌｌ （宝酒造社製）
各々１０単位で３７°Ｃ，２時間反応処理し、完全に消
化し、次に１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ
、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約
３．５Ｋｂｐの断片を回収した。
次にｐ２１４ （５μｇ）を制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［１
０単位で３７°Ｃ，２時間反応処理し、完全に消化した
。続いて、制限酵素ＢｓｔＸＩ（ＮＥＢ社製）１０単位
で５５°Ｃ，２時間反応後、１．０％アガロースゲル電
気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡ
ＮＴＭを用いて約６４０ｂｐの断片を回収した。
０単位で３７°Ｃ，２時間反応処理し、完全に消化した
。続いて、制限酵素ＢｓｔＸＩ（ＮＥＢ社製）１０単位
で５５°Ｃ，２時間反応後、１．０％アガロースゲル電
気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡ
ＮＴＭを用いて約６４０ｂｐの断片を回収した。
以上のようにして回収した両断片と上記■記載の△５リ
ンカーの計３断片を、ＤＮＡライゲーションキットの方
法に従ってライゲーションを行い、次に大腸菌Ｎ４８３
０−］のコンピテントセルに導入した。この大腸菌をア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に
まき、３２°Ｃで一夜培養した。ここで得たコロニーを
無作為に１２２個選択、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ
）を含むＬＢ培地中、３２°Ｃて一夜培養した。この菌
体からアルカリ−８ＤＳ法を用いてプラスミドを調製し
た。このプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩ（ＢＲＬ社製）
あるいはＢｓ ｔＸＩで消化し、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、目的とする約４．２Ｋｂｐを与える
クローンを、３つ選択した。
ンカーの計３断片を、ＤＮＡライゲーションキットの方
法に従ってライゲーションを行い、次に大腸菌Ｎ４８３
０−］のコンピテントセルに導入した。この大腸菌をア
ンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地に
まき、３２°Ｃで一夜培養した。ここで得たコロニーを
無作為に１２２個選択、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ
）を含むＬＢ培地中、３２°Ｃて一夜培養した。この菌
体からアルカリ−８ＤＳ法を用いてプラスミドを調製し
た。このプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩ（ＢＲＬ社製）
あるいはＢｓ ｔＸＩで消化し、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、目的とする約４．２Ｋｂｐを与える
クローンを、３つ選択した。
■ＤＮＡ配列の確認
上記■で得た各クローンからアルカリ−３ＤＳ法を用い
てプラスミドを調製し、そのプラスミド各々５μｇを制
限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）とＢｇｌＩＩ（宝酒造社
製）各々１０単位で３７°Ｃ２時間消化し、１．０％ア
ガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約５００ｂｐの断片を回
収した。
てプラスミドを調製し、そのプラスミド各々５μｇを制
限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）とＢｇｌＩＩ（宝酒造社
製）各々１０単位で３７°Ｃ２時間消化し、１．０％ア
ガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約５００ｂｐの断片を回
収した。
方、Ｍｌ ３ｍｐ １８ＲＦ （宝酒造社製）５μｇを
制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＢａｍＨＩ （宝酒造社製
）各々１０単位で３７°Ｃ，２時間消化し、１．０％ア
ガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約７．２Ｋｂｐの断片を
回収した。こうして回収した両断片をＤＮＡライゲーシ
ョンキットの方法に従ってライゲーションを行い、次に
大腸菌ＪＭＩＯ９のコンピテントセルに導入した。この
大腸菌をＪＭ１０９を指示菌としてＸ−ｇａｌ及びＩＰ
ＴＧを含むＢｂｒｏｔｈ寒天培地にまき、３７°Ｃで一
夜培養した。白色プラークとして組換え体を得た。ここ
て得たプラークを無作為に各々４個選択し、常法に従っ
て一本鎖組換え体ファージを調製した。塩基配列の決定
はジデオキシ・チエイン・ターミネーション法で行い、
目的とする 組換え体の確認と選択を行った。この結果
上記■で得られた組換え体のうち、正しいことの確認で
きた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１．４△５と
命名した（第４図）。
制限酵素ＰｓｔＩと制限酵素ＢａｍＨＩ （宝酒造社製
）各々１０単位で３７°Ｃ，２時間消化し、１．０％ア
ガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約７．２Ｋｂｐの断片を
回収した。こうして回収した両断片をＤＮＡライゲーシ
ョンキットの方法に従ってライゲーションを行い、次に
大腸菌ＪＭＩＯ９のコンピテントセルに導入した。この
大腸菌をＪＭ１０９を指示菌としてＸ−ｇａｌ及びＩＰ
ＴＧを含むＢｂｒｏｔｈ寒天培地にまき、３７°Ｃで一
夜培養した。白色プラークとして組換え体を得た。ここ
て得たプラークを無作為に各々４個選択し、常法に従っ
て一本鎖組換え体ファージを調製した。塩基配列の決定
はジデオキシ・チエイン・ターミネーション法で行い、
目的とする 組換え体の確認と選択を行った。この結果
上記■で得られた組換え体のうち、正しいことの確認で
きた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１．４△５と
命名した（第４図）。
■ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△５の作製上記■で得たｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△５を母体として、内在性の発現
を抑制するための発現ベクターの構築を行った。
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△５を母体として、内在性の発現
を抑制するための発現ベクターの構築を行った。
すなわち、上記発現ベクター５μｇを制限酵素Ａｆ１１
１（宝酒造社製）０．１単位、３７６Ｃ，５分間部分消
化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２
時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．
２Ｋｂｐの断片を回収した。次にＰｖｕＩ［（宝酒造社
製）１０単位、３７℃、２時間消化し、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮ
ＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．ＩＫｂｐの断片を回収
した。この回収断片と■で作製した△６４リンカ−とを
、ＤＮＡライゲーションキットの方法に従ってライゲー
ションを行い、次に大腸菌Ｎ４８３０１のコンピテント
セルに導入した。この大腸菌をアンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３２°Ｃで一夜
培養した。ここで得たコロニーを無作為に１２２個選択
、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、
３２°Ｃで一夜培養した。この菌体からアルカリ−３Ｄ
Ｓ法を用いてプラスミドを調製した。このプラスミドを
制限酵素Ｎｄｅ Ｉ、Ｂｓ ｔＸＩあるいはＥＣｏＲＶ
（宝酒造社製）で各々消化し、１．０％アガロースゲル
電気泳動を行い、全ての制限酵素で１カ所でのみ切断さ
れるところの目的とする約４．２Ｋｂｐを与えるクロー
ンを、３クロ一ン選択した。
１（宝酒造社製）０．１単位、３７６Ｃ，５分間部分消
化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２
時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．
２Ｋｂｐの断片を回収した。次にＰｖｕＩ［（宝酒造社
製）１０単位、３７℃、２時間消化し、１．０％アガロ
ースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮ
ＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．ＩＫｂｐの断片を回収
した。この回収断片と■で作製した△６４リンカ−とを
、ＤＮＡライゲーションキットの方法に従ってライゲー
ションを行い、次に大腸菌Ｎ４８３０１のコンピテント
セルに導入した。この大腸菌をアンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天培地にまき、３２°Ｃで一夜
培養した。ここで得たコロニーを無作為に１２２個選択
、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、
３２°Ｃで一夜培養した。この菌体からアルカリ−３Ｄ
Ｓ法を用いてプラスミドを調製した。このプラスミドを
制限酵素Ｎｄｅ Ｉ、Ｂｓ ｔＸＩあるいはＥＣｏＲＶ
（宝酒造社製）で各々消化し、１．０％アガロースゲル
電気泳動を行い、全ての制限酵素で１カ所でのみ切断さ
れるところの目的とする約４．２Ｋｂｐを与えるクロー
ンを、３クロ一ン選択した。
■ＤＮＡ配列の確認
■で得た各クローンからアルカリ−３ＤＳ法を用いてプ
ラスミドを調製し、各々５μｇを制限酵素５ｔｕＩ （
宝酒造社製）とＢｇｌｌＩ各々１０単位で、３７°Ｃ，
２時間消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１０
０Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用い
て、約７５０ｂｐの断片を回収した。一方、Ｍｌ ３ｍ
ｐ １８ＲＦ５μｇを制限酵素ＨｉｎｃｌＩ （宝酒造
社製）とＢａｍＨＩ各々１０単位で３７°Ｃ，２時間消
化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２
時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＩＪを用いて、約
７゜２Ｋｂｐの断片を回収した。このようにして回収し
た両断片をＤＮＡライゲーションキットの方法に従って
ライゲーションを行い、次に大腸菌ＪＭ１０９のコンピ
テントセルに導入した。この大腸菌をＪＭＩ０９を指示
菌としてＸ−ｇａｌ及び■ＰＴＧを含むＢｂｒｏｔｈ寒
天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養した。白色プラーク
として組換え体を得た。ここで得たプラークを無作為に
各々４個選択し、常法に従って一本鎖組換え体ファージ
を調製した。塩基配列の決定はジデオキシ・チエイン・
ターミネーション法で行い、目的とする組換え体の確認
と選択を行った。
ラスミドを調製し、各々５μｇを制限酵素５ｔｕＩ （
宝酒造社製）とＢｇｌｌＩ各々１０単位で、３７°Ｃ，
２時間消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１０
０Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用い
て、約７５０ｂｐの断片を回収した。一方、Ｍｌ ３ｍ
ｐ １８ＲＦ５μｇを制限酵素ＨｉｎｃｌＩ （宝酒造
社製）とＢａｍＨＩ各々１０単位で３７°Ｃ，２時間消
化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２
時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＩＪを用いて、約
７゜２Ｋｂｐの断片を回収した。このようにして回収し
た両断片をＤＮＡライゲーションキットの方法に従って
ライゲーションを行い、次に大腸菌ＪＭ１０９のコンピ
テントセルに導入した。この大腸菌をＪＭＩ０９を指示
菌としてＸ−ｇａｌ及び■ＰＴＧを含むＢｂｒｏｔｈ寒
天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養した。白色プラーク
として組換え体を得た。ここで得たプラークを無作為に
各々４個選択し、常法に従って一本鎖組換え体ファージ
を調製した。塩基配列の決定はジデオキシ・チエイン・
ターミネーション法で行い、目的とする組換え体の確認
と選択を行った。
この結果、■で得られた組換え体のうち、正しいことの
確認できた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ
△５と命名した（第４図）。
確認できた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ
△５と命名した（第４図）。
この大腸菌ＰＬＮ２１４Ｃ△５Ｈは工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている（微工研菌寄第１１６１
４号（ＦＥＲＭ Ｐ’−１１６１４））。
業技術研究所に寄託されている（微工研菌寄第１１６１
４号（ＦＥＲＭ Ｐ’−１１６１４））。
［実施例２］２１４△５型及び２１４Ｃ△５型ＭＣＳＦ
の大腸菌ての発現 ■形質転換体の培養 実施例１−■で作製した発現ベクターｐＰＬＮＣＳＦ２
１４△５て形質転換した大腸菌Ｎ４８３０−１を用いて
、２１４△５型Ｍ−ＣＳＦの発現を行った。なおｐＰＬ
Ｎ−ＣＳＦ２１４△５て形質転換した大腸菌は、ＰＬＮ
２１４△５と命名した。
の大腸菌ての発現 ■形質転換体の培養 実施例１−■で作製した発現ベクターｐＰＬＮＣＳＦ２
１４△５て形質転換した大腸菌Ｎ４８３０−１を用いて
、２１４△５型Ｍ−ＣＳＦの発現を行った。なおｐＰＬ
Ｎ−ＣＳＦ２１４△５て形質転換した大腸菌は、ＰＬＮ
２１４△５と命名した。
まず上記形質転換菌をアンピシリン（５０μｇ／ｍ１）
を含む５０ｍ１のＬＢ培地中、３２°Ｃで一夜前培養し
た。この前培養液をアンピシリン（５０μｇ／ｍ１）を
含む１１のＬＢ培地に加え、３２°ＣでＯ、Ｄ 、 ５
５０ｎｍが０．５になるまで培養し、６５°Ｃの水浴中
で培養液温度が４２°Ｃになるまで加温熱処理した。そ
の後、４２°Ｃで６時間培養した。この段階で菌体の一
部を採取し、位相差顕微鏡下で観察すると、菌体内に形
質転換していない大腸菌Ｎ４８３０−１には存在しない
ところの凝集塊（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）か認
められた。
を含む５０ｍ１のＬＢ培地中、３２°Ｃで一夜前培養し
た。この前培養液をアンピシリン（５０μｇ／ｍ１）を
含む１１のＬＢ培地に加え、３２°ＣでＯ、Ｄ 、 ５
５０ｎｍが０．５になるまで培養し、６５°Ｃの水浴中
で培養液温度が４２°Ｃになるまで加温熱処理した。そ
の後、４２°Ｃで６時間培養した。この段階で菌体の一
部を採取し、位相差顕微鏡下で観察すると、菌体内に形
質転換していない大腸菌Ｎ４８３０−１には存在しない
ところの凝集塊（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）か認
められた。
この凝集塊を含む菌体を５．００Ｏｒｐｍ、１０ｍ１ｎ
遠心して集菌し、ＰＢＳ （リン酸緩衝生理食塩水）１
００ｍｌに懸濁した。再度５．０００ｒｐｍ、ｌ０ｍ１
ｎ遠心して集菌した。
遠心して集菌し、ＰＢＳ （リン酸緩衝生理食塩水）１
００ｍｌに懸濁した。再度５．０００ｒｐｍ、ｌ０ｍ１
ｎ遠心して集菌した。
この菌体を超音波破砕し、還元下で５ＤＳ−ＰＡＧＥを
行い、クロマトスキャナー（高滓社製）で分析した。そ
の結果、２１４△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの生産量は全
菌体タンパク質の１０％以上であり、さらに△６４型と
思われるバンドが全菌体タンパク質の５％前後の量で観
察された。
行い、クロマトスキャナー（高滓社製）で分析した。そ
の結果、２１４△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの生産量は全
菌体タンパク質の１０％以上であり、さらに△６４型と
思われるバンドが全菌体タンパク質の５％前後の量で観
察された。
一方実施例１−■て作製した発現ベクターｐＰＬＮ−Ｃ
ＳＦ２１４Ｃ△５て形質転換した大腸菌Ｎ４８３（１−
１を用いて、２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦの発現を行った
。なおｐＰＬＮ−ＣＳＦ２ ＋４Ｃ△５で形質転換した
大腸菌は、ＰＬＮ２１４Ｃ△５と命名した。
ＳＦ２１４Ｃ△５て形質転換した大腸菌Ｎ４８３（１−
１を用いて、２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦの発現を行った
。なおｐＰＬＮ−ＣＳＦ２ ＋４Ｃ△５で形質転換した
大腸菌は、ＰＬＮ２１４Ｃ△５と命名した。
上記形質転換菌をＰＬＮ２１４△５と同様にアンピシリ
ン（５０μｇ／ｍｌ）を含む５０ｍ１のＬＢ培地中、３
２°Ｃで一夜前培養した。この前培養液をアンピシリン
（５０μｇ／ｍｌ）を含む１１のＬＢ培地に加え、３２
°Ｃで領Ｄ 、 ５５０ｎｍが０．５になるまで培養し
、６５°Ｃの水浴中で培養液温度が４２°Ｃになるまで
加温熱処理した。その後、４２°Ｃて６時間培養した。
ン（５０μｇ／ｍｌ）を含む５０ｍ１のＬＢ培地中、３
２°Ｃで一夜前培養した。この前培養液をアンピシリン
（５０μｇ／ｍｌ）を含む１１のＬＢ培地に加え、３２
°Ｃで領Ｄ 、 ５５０ｎｍが０．５になるまで培養し
、６５°Ｃの水浴中で培養液温度が４２°Ｃになるまで
加温熱処理した。その後、４２°Ｃて６時間培養した。
この段階で菌体の一部を採取し位相差顕微鏡下で観察す
ると、菌体内に形質転換していない大腸菌Ｎ４８３０−
１には存在しないところの凝集塊（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙ）が認められた。この凝集塊を含む菌体を５
，０００ｒｐｍ、ｌｏｍｉｎ遠心して集菌し、ＰＢＳ
（リン酸緩衝生理食塩水）１００ｍｌに懸濁した。
ると、菌体内に形質転換していない大腸菌Ｎ４８３０−
１には存在しないところの凝集塊（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ
ｂｏｄｙ）が認められた。この凝集塊を含む菌体を５
，０００ｒｐｍ、ｌｏｍｉｎ遠心して集菌し、ＰＢＳ
（リン酸緩衝生理食塩水）１００ｍｌに懸濁した。
再度５．００Ｏｒｐｍ、１０ｍ１ｎ遠心して集菌した。
この菌体を超音波破砕し、還元下でＳＤ５−ＰＡＧＥ
を行い、クロマトスキャナー（高滓社製）で分析した。
を行い、クロマトスキャナー（高滓社製）で分析した。
その結果、２１４Ｃ△５型ＭＣＳＦモノマーの生産量は
、全菌体タンパク質の１５％以上であり、さらに△６４
型と思われるバンドはほとんど観察されなかった。その
結果以下の検討は、ＰＬＮ２１４Ｃ△５を用いて行った
■凝集塊の回収 上記■で集菌したＰＬＮ２１４Ｃ△５菌体からＮａｇａ
ｉらの方法（Ｎａｇａｉ、に、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ８２７２５
２ （１９８５））に従って、凝集塊を回収した。
、全菌体タンパク質の１５％以上であり、さらに△６４
型と思われるバンドはほとんど観察されなかった。その
結果以下の検討は、ＰＬＮ２１４Ｃ△５を用いて行った
■凝集塊の回収 上記■で集菌したＰＬＮ２１４Ｃ△５菌体からＮａｇａ
ｉらの方法（Ｎａｇａｉ、に、 ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ ８２７２５
２ （１９８５））に従って、凝集塊を回収した。
すなわち、菌体を湿重量１０ｇあたり８ｍｌの５０ｒｎ
Ｍトリス塩酸緩衝液（２５％（Ｗ／Ｖ） Ｓ ｕ ｃｒ
ｏｓｅと１．ｍＭＥＤＴＡを含む；ｐＨ８，０）に懸濁
した。次に菌体湿重量１０ｇあたり２０ｍｇのリゾチー
ムを加え、氷上で約３０ｍ１ｎ放置した。ＭｇＣ１２，
ＭｎＣｌ２をそれぞれ最終濃度１０ｍＭ、１ｍＭとなる
ように加え、ＤＮａｓｅ工も最終濃度１０μｇ／ｒｎｌ
となるように添加し、４°Ｃで約３０ｍ１ｎ放置した。
Ｍトリス塩酸緩衝液（２５％（Ｗ／Ｖ） Ｓ ｕ ｃｒ
ｏｓｅと１．ｍＭＥＤＴＡを含む；ｐＨ８，０）に懸濁
した。次に菌体湿重量１０ｇあたり２０ｍｇのリゾチー
ムを加え、氷上で約３０ｍ１ｎ放置した。ＭｇＣ１２，
ＭｎＣｌ２をそれぞれ最終濃度１０ｍＭ、１ｍＭとなる
ように加え、ＤＮａｓｅ工も最終濃度１０μｇ／ｒｎｌ
となるように添加し、４°Ｃで約３０ｍ１ｎ放置した。
さらに、菌体湿重量１０ｇあたり２０ｍ１の２０ｍＭ）
リス塩酸緩衝液（０，２ＭＮａＣ１，２ｍＭＥＤＴＡ、
１．６％ＮＰ−４０．１％デオキシコール酸を含む、ｐ
Ｈ７，５）を加えた。４°Ｃで約３０ｍ１ｎ放置した後
５．ＯＯＯｘｇ１０ｍｉｎ遠心して沈澱を回収した。こ
の沈澱に５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（５０ｍＭＮａＣ１
，１０ｍＭＥＤＴＡ、 ０゜５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００を含む、ｐＨ８゜０）を、沈澱湿重量の１０倍量加
えて懸濁し、４°Ｃで５ｍ１ｎ放置後、５，０００ｘｇ
、 １０ｍ１ｎ遠心して沈澱を回収した。このＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を含むトリス塩酸緩衝液での操作を３回
行い、凝集塊の沈澱を得た。
リス塩酸緩衝液（０，２ＭＮａＣ１，２ｍＭＥＤＴＡ、
１．６％ＮＰ−４０．１％デオキシコール酸を含む、ｐ
Ｈ７，５）を加えた。４°Ｃで約３０ｍ１ｎ放置した後
５．ＯＯＯｘｇ１０ｍｉｎ遠心して沈澱を回収した。こ
の沈澱に５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（５０ｍＭＮａＣ１
，１０ｍＭＥＤＴＡ、 ０゜５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００を含む、ｐＨ８゜０）を、沈澱湿重量の１０倍量加
えて懸濁し、４°Ｃで５ｍ１ｎ放置後、５，０００ｘｇ
、 １０ｍ１ｎ遠心して沈澱を回収した。このＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００を含むトリス塩酸緩衝液での操作を３回
行い、凝集塊の沈澱を得た。
■凝集塊の可溶化と２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマー
の分離精製 上記■で調製した凝集塊にその湿重量Ｌｏｇあたり９０
ｍ１の５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（８ＭＵｒ ｅ ａ、
１ｍＭＥＤＴＡ、ｌ ＯｍＭＤＴＴを含む；ｐＨ８，０
）を添加し、ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡ
ＴＩＣＡ社製）を使用して可溶化した。
の分離精製 上記■で調製した凝集塊にその湿重量Ｌｏｇあたり９０
ｍ１の５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（８ＭＵｒ ｅ ａ、
１ｍＭＥＤＴＡ、ｌ ＯｍＭＤＴＴを含む；ｐＨ８，０
）を添加し、ポリトロンホモジナイザー（ＫＩＮＥＭＡ
ＴＩＣＡ社製）を使用して可溶化した。
この溶液にトリフルオロ酢酸を最終濃度０．１％になる
ように添加し、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化した
ＹＭＣ５Ｈ−８４３−１５−３０［５−１５３００Ａ
Ｃ４（ＹＭＣ社製）］カラム（２０ｘ２５０ｍｍ）に
通液した。吸着後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む４
０〜７０％アセトニトリルによる直線濃度勾配溶出を行
い、アセトニトリル６２〜６８％の分画を回収した。
ように添加し、０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化した
ＹＭＣ５Ｈ−８４３−１５−３０［５−１５３００Ａ
Ｃ４（ＹＭＣ社製）］カラム（２０ｘ２５０ｍｍ）に
通液した。吸着後、０．１％トリフルオロ酢酸を含む４
０〜７０％アセトニトリルによる直線濃度勾配溶出を行
い、アセトニトリル６２〜６８％の分画を回収した。
この溶液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析
を行い、１５．００Ｏｒｐｍ、１０ｍ１ｎ遠心し、沈澱
として２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再凝集塊を
得た。この段階で２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの
純度は９５％以上であった。なお、この２１４Ｃ△５型
Ｍ−ＣＳＦモノマーの還元下で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥ
による分子量は、約２８，０００であった。
を行い、１５．００Ｏｒｐｍ、１０ｍ１ｎ遠心し、沈澱
として２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再凝集塊を
得た。この段階で２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの
純度は９５％以上であった。なお、この２１４Ｃ△５型
Ｍ−ＣＳＦモノマーの還元下で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥ
による分子量は、約２８，０００であった。
■２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦダイマーの形成■で得た２
１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再凝集塊を最少量の
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（８ＭＵｒ ｅａ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１ ＯｍＭＤＴＴを含む、ｐＨ８，０）で再度
可溶化し、Ｏ，Ｄ、２８０ｎｍが０．１５となるように
再構成緩衝液［５０ｍＭトリス塩酸、５ｍＭＥＤＴＡ、
２ｍＭＧＳＨ（還元型グルタチオン）、１ｍＭＧ５５Ｇ
（酸化型グルタチオン）； ｐＨ８，５］で希釈し、
４°Ｃで３日間撹拌した。反応終了後、この溶液を０゜
０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、その溶
液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロニー形成を指標
としたＭ−ＣＳＦ活性測定（Ｔｕｎｅｏｌ（ａ、に、
＆ ５ｈｉｋｉｔａ、Ｍ、 ；ＰＥＢ５ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ７７２４３ （１９７７））を行った。その結果、
７１．０００単位／ｍｌであった。
１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの再凝集塊を最少量の
５０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（８ＭＵｒ ｅａ、１ｍＭＥ
ＤＴＡ、１ ＯｍＭＤＴＴを含む、ｐＨ８，０）で再度
可溶化し、Ｏ，Ｄ、２８０ｎｍが０．１５となるように
再構成緩衝液［５０ｍＭトリス塩酸、５ｍＭＥＤＴＡ、
２ｍＭＧＳＨ（還元型グルタチオン）、１ｍＭＧ５５Ｇ
（酸化型グルタチオン）； ｐＨ８，５］で希釈し、
４°Ｃで３日間撹拌した。反応終了後、この溶液を０゜
０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、その溶
液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロニー形成を指標
としたＭ−ＣＳＦ活性測定（Ｔｕｎｅｏｌ（ａ、に、
＆ ５ｈｉｋｉｔａ、Ｍ、 ；ＰＥＢ５ Ｌｅｔｔｅｒ
ｓ ７７２４３ （１９７７））を行った。その結果、
７１．０００単位／ｍｌであった。
さらに形成されたコロニーの形態をエステラーゼ二重染
色法（Ｙａｍ、Ｌ、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、＋Ａｍ、 Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｐａｔｈｏｌ、 ５５２８３ （１９７
９））で調へた結果、全てが単球−マクロファージのコ
ロニーであり、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであること
が証明された。
色法（Ｙａｍ、Ｌ、Ｔ、 ｅｔ ａｌ、＋Ａｍ、 Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｐａｔｈｏｌ、 ５５２８３ （１９７
９））で調へた結果、全てが単球−マクロファージのコ
ロニーであり、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであること
が証明された。
また形成された２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦダイマーの分
子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００
であった。
子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６０，０００
であった。
■Ｎ末端アミノ酸配列の分析
Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２１４Ｃ△５型
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２１４Ｃ△５の生産
する２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
する２１４Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｘ−８ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−１１ｅ
−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−ＨｉｓＬｅｕ−Ｇｉｎ−３
ｅｒ−Ｌｅａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓ
ｐなお、３サイクル目の未同定アミノ酸は、２１４Ｃ△
５型Ｍ−ＣＳＦモノマーをＣｒｅｓｔｆｉｅｌｄらの方
法（Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄ、Ａ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、 ２３８６２２ （１９６
３））に従ってカルボキシメチル化し、プロティンシー
ケンサ−にかけることにより、システィンであることを
確認した。
−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−ＨｉｓＬｅｕ−Ｇｉｎ−３
ｅｒ−Ｌｅａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓ
ｐなお、３サイクル目の未同定アミノ酸は、２１４Ｃ△
５型Ｍ−ＣＳＦモノマーをＣｒｅｓｔｆｉｅｌｄらの方
法（Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄ、Ａ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、 ２３８６２２ （１９６
３））に従ってカルボキシメチル化し、プロティンシー
ケンサ−にかけることにより、システィンであることを
確認した。
［実施例３］ ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△６〜△８の
作製 ■ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△６〜△８の構築実施例１
で作製したｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△５を出発材料と
して、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△６〜△８の作製を行
った。
作製 ■ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△６〜△８の構築実施例１
で作製したｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△５を出発材料と
して、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△６〜△８の作製を行
った。
すなわちｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△５の５μｇを制限
酵素Ｎｄｅ１１０単位、３７°Ｃ，２時間消化した後、
Ｂｓ ｔＸＩ １０単位、５５℃、２時間消化した。１
．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を
行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．２Ｋｂｐ
の断片を回収した。
酵素Ｎｄｅ１１０単位、３７°Ｃ，２時間消化した後、
Ｂｓ ｔＸＩ １０単位、５５℃、２時間消化した。１
．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を
行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．２Ｋｂｐ
の断片を回収した。
一方、実施例１−■に記載の方法に従って以下の組換え
を行うためのリンカ−として利用するオリゴヌクレオチ
ドを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８６００ＤＮＡ合成装置（Ｍ
ｉ ］ １１ｐｏｒｅ社製）で合成した。その配列は以
下に示す通りである。
を行うためのリンカ−として利用するオリゴヌクレオチ
ドを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８６００ＤＮＡ合成装置（Ｍ
ｉ ］ １１ｐｏｒｅ社製）で合成した。その配列は以
下に示す通りである。
５’ −ＴＡＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣＡＴＧＡ−３’
・ ・ ・（５）５’ −ＧＴＧＧＧＡＡＣ
ＡＣＡ−３° ・ ・ ・（６）５’
−ＴＡＴＧＴＣＣＣＡＣＡＴＧＡ−３’
・ ・ ・（７）５’ −ＧＴＧＧＧＡＣＡ−３’
・ ・ ・（８）５’ −Ｔ
ＡＴＧＣＡＣＡＴＧＡ−３’ ・
・ ・（９）５’ −ＧＴＧＣＡ−３’
・ ・ ・（１０）合成オリゴヌクレオ
チドの精製は、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（
アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）で行っ
た。
・ ・ ・（５）５’ −ＧＴＧＧＧＡＡＣ
ＡＣＡ−３° ・ ・ ・（６）５’
−ＴＡＴＧＴＣＣＣＡＣＡＴＧＡ−３’
・ ・ ・（７）５’ −ＧＴＧＧＧＡＣＡ−３’
・ ・ ・（８）５’ −Ｔ
ＡＴＧＣＡＣＡＴＧＡ−３’ ・
・ ・（９）５’ −ＧＴＧＣＡ−３’
・ ・ ・（１０）合成オリゴヌクレオ
チドの精製は、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（
アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）で行っ
た。
精製後のオリゴヌクレオチドはそれぞれＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて、５°末端のリン酸化を行った
。続いて上記（５）は（６）と、上記（７）は（８）と
、上記（９）は（１０）とアニールさせて、２本鎖ＤＮ
Ａリンカ−を３種類（それぞれ△６Ｂ リンカ−１△７リンカー、△８リンカーと命名）作製し
た。前出のｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△５のからの回収
断片と上記各リンカ−を 個別にＤＮＡライゲーション
キットの方法に従ってライゲーションを行い、次に大腸
菌Ｎ４８３０−１のコンピテントセルに導入した。この
大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
寒天培地にまき、３２°Ｃで一夜培養した。ここで得た
コロニーを無作為に１２個選択し、アンピシリン（５１
ｚｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、３２°Ｃで一夜培養し
た。この菌体からアルカリ＝ＳＤＳ法を用いてプラスミ
ドを調製した。このプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩある
いはＢｓ ｔＸＩで各々消化し、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、どちらの制限酵素でも１カ所でのみ
切断され、目的とする約４．２Ｋｂｐを与える△６及び
△７リンカーを導入したクローンとＢｓ ｔＸＩでは消
化されない△８リンカーを導入したクローンを、各々３
クローンづつ選択した。
オチドキナーゼを用いて、５°末端のリン酸化を行った
。続いて上記（５）は（６）と、上記（７）は（８）と
、上記（９）は（１０）とアニールさせて、２本鎖ＤＮ
Ａリンカ−を３種類（それぞれ△６Ｂ リンカ−１△７リンカー、△８リンカーと命名）作製し
た。前出のｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△５のからの回収
断片と上記各リンカ−を 個別にＤＮＡライゲーション
キットの方法に従ってライゲーションを行い、次に大腸
菌Ｎ４８３０−１のコンピテントセルに導入した。この
大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ
寒天培地にまき、３２°Ｃで一夜培養した。ここで得た
コロニーを無作為に１２個選択し、アンピシリン（５１
ｚｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中、３２°Ｃで一夜培養し
た。この菌体からアルカリ＝ＳＤＳ法を用いてプラスミ
ドを調製した。このプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩある
いはＢｓ ｔＸＩで各々消化し、１．０％アガロースゲ
ル電気泳動を行い、どちらの制限酵素でも１カ所でのみ
切断され、目的とする約４．２Ｋｂｐを与える△６及び
△７リンカーを導入したクローンとＢｓ ｔＸＩでは消
化されない△８リンカーを導入したクローンを、各々３
クローンづつ選択した。
■ＤＮＡ配列の確認
■で得た各クローンからアルカリ＝ＳＤＳ法を用いてプ
ラスミドを調製し、各々５μｇを制限酵素ＰｓｔＩ（宝
酒造社製）とＢｇｌＩ［の各々１ｅ単位で、３７°Ｃ，
２時間消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１０
０Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用い
て約５０ ｏｂｐの断片を回収した。一方、Ｍｌ ３ｍ
ｐ ｌ ８ＲＦ５ μｇを制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨ
Ｉの各々１ｅ単位で３７°Ｃ，２時間消化し、１．０％
アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、
ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約７．２Ｋｂｐの断片
を回収した。このようにして回収した両断片をＤＮＡラ
イゲーションキットの方法に従ってライゲーションを行
い、次に大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入し
た。この大腸菌をＪＭ１０９を指示菌としてＸ−ｇａｌ
及びＩ ＰＴＧを含むＢｂｒｏｔｈ寒天培地にまき、３
７°Ｃて一夜培養した。白色プラークとして組換え体を
得た。ここで得たプラークを無作為に各々４個選択し、
常法に従って一本鎖組換え体ファージを調製した。塩基
配列の決定はジデオキシ・チエイン・ターミネーション
法て行い、目的とする組換え体の確 認と選択を行った
。
ラスミドを調製し、各々５μｇを制限酵素ＰｓｔＩ（宝
酒造社製）とＢｇｌＩ［の各々１ｅ単位で、３７°Ｃ，
２時間消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１０
０Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用い
て約５０ ｏｂｐの断片を回収した。一方、Ｍｌ ３ｍ
ｐ ｌ ８ＲＦ５ μｇを制限酵素ＰｓｔＩとＢａｍＨ
Ｉの各々１ｅ単位で３７°Ｃ，２時間消化し、１．０％
アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時間）を行い、
ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約７．２Ｋｂｐの断片
を回収した。このようにして回収した両断片をＤＮＡラ
イゲーションキットの方法に従ってライゲーションを行
い、次に大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入し
た。この大腸菌をＪＭ１０９を指示菌としてＸ−ｇａｌ
及びＩ ＰＴＧを含むＢｂｒｏｔｈ寒天培地にまき、３
７°Ｃて一夜培養した。白色プラークとして組換え体を
得た。ここで得たプラークを無作為に各々４個選択し、
常法に従って一本鎖組換え体ファージを調製した。塩基
配列の決定はジデオキシ・チエイン・ターミネーション
法て行い、目的とする組換え体の確 認と選択を行った
。
この結果、■で得られた組換え体のうち、正しいことの
確認できた発現ベクターを、それぞれｐＰＬＮ−ＣＳＦ
２１４Ｃ△６．ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４ｃ△７．ｐＰＬ
Ｎ−ＣＳＦ２１４Ｃ△８と命名した（第５図）。
確認できた発現ベクターを、それぞれｐＰＬＮ−ＣＳＦ
２１４Ｃ△６．ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４ｃ△７．ｐＰＬ
Ｎ−ＣＳＦ２１４Ｃ△８と命名した（第５図）。
また、それぞれの発現ベクターで形質転換した大腸菌を
、ＰＬＮ２１４Ｃ△６．ＰＬＮ２１４Ｃ△７．ＰＬＮ２
１４Ｃ△８と命名した。
、ＰＬＮ２１４Ｃ△６．ＰＬＮ２１４Ｃ△７．ＰＬＮ２
１４Ｃ△８と命名した。
［実施例４］２１４Ｃ△６型〜２１４Ｃ△８型Ｍ−ＣＳ
Ｆの大腸菌での発現 ■発現 実施例３で作製した形質転換体ＰＬＮ２１４Ｃ△６．Ｐ
ＬＮ２１４Ｃ△７．ＰＬＮ２１４Ｃ△８を、実施例２の
方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモツマ−の回収、精製、
Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了後、この溶液
を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、
その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロニー形成
を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。その結果、
各々２．７００．８１０．７１０単位／ｍｌであった。
Ｆの大腸菌での発現 ■発現 実施例３で作製した形質転換体ＰＬＮ２１４Ｃ△６．Ｐ
ＬＮ２１４Ｃ△７．ＰＬＮ２１４Ｃ△８を、実施例２の
方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモツマ−の回収、精製、
Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了後、この溶液
を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、
その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロニー形成
を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。その結果、
各々２．７００．８１０．７１０単位／ｍｌであった。
さらに形成されたコロニーの形態をエステラーゼ二重染
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが
証明された。
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが
証明された。
なお、この２１４Ｃ△６〜２１４Ｃ△８型ＭＣＳＦモノ
マーの還元下で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は
、約２８，０００であった。
マーの還元下で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は
、約２８，０００であった。
また形成された２１４Ｃ△６〜２１４Ｃ△８型Ｍ−ＣＳ
Ｆダイマーの分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで
約６０，０００であった。
Ｆダイマーの分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで
約６０，０００であった。
■Ｎ末端アミノ酸配列の分析
Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２１４Ｃ△６〜
２１４Ｃ△８型Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのま
ま ４７７Ａ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒ （
ＡＢＩ社製）に供し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ
（フェニルヒダントイン）アミノ酸を分析することで確
認した。２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２１４Ｃ△
６の生産する２１４Ｃ△６型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からの
アミノ酸配列は、以下の通りであった。
２１４Ｃ△８型Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのま
ま ４７７Ａ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒ （
ＡＢＩ社製）に供し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ
（フェニルヒダントイン）アミノ酸を分析することで確
認した。２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２１４Ｃ△
６の生産する２１４Ｃ△６型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からの
アミノ酸配列は、以下の通りであった。
Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅ ｔ−［］ ］ｅ−Ｇｌｙ−８ｅ
ｒ−Ｇ１ｙ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｎ−３ｅｒ−ｎ
−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒ［１ｅ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ
２１４Ｃ△７の生産する２１４Ｃ△７型Ｍ−ＣＳＦのＮ
末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ｒ−Ｇ１ｙ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｎ−３ｅｒ−ｎ
−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒ［１ｅ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ
２１４Ｃ△７の生産する２１４Ｃ△７型Ｍ−ＣＳＦのＮ
末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
５ｅｒ−Ｈｉｓ −Ｍｅ ｔ −ｒ １ ｅ−Ｇ １ｙ
−３ｅｒ−Ｇ １ｙ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−３
ｅｒＬｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−［１ｅ−Ａｓｐ
−Ｓｅｒ−Ｇ１．ｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果
、ＰＬＮ２１４Ｃ△８の生産する２１４Ｃ△８型Ｍ−Ｃ
ＳＦのＮ末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであっ
た。
−３ｅｒ−Ｇ １ｙ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−３
ｅｒＬｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−［１ｅ−Ａｓｐ
−Ｓｅｒ−Ｇ１．ｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果
、ＰＬＮ２１４Ｃ△８の生産する２１４Ｃ△８型Ｍ−Ｃ
ＳＦのＮ末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであっ
た。
Ｍｅ ｔ −Ｈｉｓ−Ｍｅ ｔ−１１ｅ−Ｇ １ｙ−３
ｅｒ−Ｇ １ｙ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−３ｅｒＬ
ｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１ｉｅ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔこの結果、ＰＬＮ２１４Ｃ△６から
生産されるＭ−ＣＳＦは、ＰＬＮ２１４Ｃ△７の生産す
るＭＣＳＦと同一のものであることが確認された。
ｅｒ−Ｇ １ｙ−Ｈ１ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−３ｅｒＬ
ｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１ｉｅ−Ａｓｐ−３ｅ
ｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔこの結果、ＰＬＮ２１４Ｃ△６から
生産されるＭ−ＣＳＦは、ＰＬＮ２１４Ｃ△７の生産す
るＭＣＳＦと同一のものであることが確認された。
ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△６のＤＮＡ配列が正しいこ
とを考慮すると、これらの結果は生産されたＭ−ＣＳＦ
モノマーのＮ末端側が翻訳後に菌体内でプロテアーゼで
修飾を受けるために生じた結果ではないかと推察される
。
とを考慮すると、これらの結果は生産されたＭ−ＣＳＦ
モノマーのＮ末端側が翻訳後に菌体内でプロテアーゼで
修飾を受けるために生じた結果ではないかと推察される
。
△５を出発材料として、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△９
の作製を行った。
の作製を行った。
すなわちｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△５の５μｇを制限
酵素Ａｆ１１１Ｏ，１単位で、３７°Ｃ，５分間消化し
た後、Ｎｄｅ１１０単位、３７°Ｃ，２時間消化した。
酵素Ａｆ１１１Ｏ，１単位で、３７°Ｃ，５分間消化し
た後、Ｎｄｅ１１０単位、３７°Ｃ，２時間消化した。
次に１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時
間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．２
Ｋｂｐの断片を回収した。
間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約４．２
Ｋｂｐの断片を回収した。
一方、実施例Ｉ−■に記載の方法に従って以下の組換え
を行うためのリンカ−として利用するオリゴヌクレオチ
ドを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８６００ＤＮＡ合成装置（Ｍ
ｉ １１１ｐｏｒ ｅ社製）で合成した。その配列は以
下に示す通りである。
を行うためのリンカ−として利用するオリゴヌクレオチ
ドを、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ８６００ＤＮＡ合成装置（Ｍ
ｉ １１１ｐｏｒ ｅ社製）で合成した。その配列は以
下に示す通りである。
［実施例５］ ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△９の作製
５’ −ＴＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡ−３
’ ・ ・ ・（１１）５’ −ＡＴＧＴＴＡ
ＣＣＴＣＣ−３’ ・ ・ ・（
１２）■ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△９の構築実施例１
で作製したｐＰＬＮ＝ｃｓＦ２１４Ｃ合成オリゴヌクレ
オチドの精製は、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ
（アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）で行
った。
’ ・ ・ ・（１１）５’ −ＡＴＧＴＴＡ
ＣＣＴＣＣ−３’ ・ ・ ・（
１２）■ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△９の構築実施例１
で作製したｐＰＬＮ＝ｃｓＦ２１４Ｃ合成オリゴヌクレ
オチドの精製は、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ
（アプライド・バイオシステムズ・ジャパン社製）で行
った。
精製後のオリゴヌクレオチドはそれぞれＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いて、５′末端のリン酸化を行った
。続いて上記（Ｉｆ）と（１２）をアニルさせて２本鎖
ＤＮＡリンカ−（△９リンカーと命名）を作製した。
オチドキナーゼを用いて、５′末端のリン酸化を行った
。続いて上記（Ｉｆ）と（１２）をアニルさせて２本鎖
ＤＮＡリンカ−（△９リンカーと命名）を作製した。
この△９リンカーと上記の回収断片とをＤＮＡライゲー
ションキットを用いて連結させ、実施例３−■の方法に
従って大腸菌に導入し、プラスミドの調整を行った。こ
のプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩあるいはＢｓ ｔＸＩ
で各々消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い
、ＮｄｅＩで１カ所のみ切断され、Ｂｓ ｔＸＩで切断
されない約４．２Ｋｂｐのクローンを、３クロ一ン選択
した■ＤＮＡ配列の確認 実施例３−■に記載の方法とまったく同様の方法を用い
て、■で取得したプラスミドのＰｓｔＩ／Ｂｇｌ］Ｉ断
片をＭｌ ３ｍｐ １８ＲＦのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部
位にリクローニングし、塩基配列の確認を行った。その
結果目的とする塩基配列を与えたクローンを選択し、ｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△９と命名した（第６図）。さ
らにこの発現ベクターで形質転換した大腸菌をＰＬＮ２
１４ Ｃ△９と命名した。この大腸菌ＰＬＮ２１４Ｃ△
９は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る（微工研菌寄第１１６１５号（ＦＥＲＭＰ−１１６１
５））。
ションキットを用いて連結させ、実施例３−■の方法に
従って大腸菌に導入し、プラスミドの調整を行った。こ
のプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩあるいはＢｓ ｔＸＩ
で各々消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い
、ＮｄｅＩで１カ所のみ切断され、Ｂｓ ｔＸＩで切断
されない約４．２Ｋｂｐのクローンを、３クロ一ン選択
した■ＤＮＡ配列の確認 実施例３−■に記載の方法とまったく同様の方法を用い
て、■で取得したプラスミドのＰｓｔＩ／Ｂｇｌ］Ｉ断
片をＭｌ ３ｍｐ １８ＲＦのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部
位にリクローニングし、塩基配列の確認を行った。その
結果目的とする塩基配列を与えたクローンを選択し、ｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ△９と命名した（第６図）。さ
らにこの発現ベクターで形質転換した大腸菌をＰＬＮ２
１４ Ｃ△９と命名した。この大腸菌ＰＬＮ２１４Ｃ△
９は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る（微工研菌寄第１１６１５号（ＦＥＲＭＰ−１１６１
５））。
［実施例６］２１４Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦの大腸菌ての発
現 ■発現 実施例５で作製した形質転換体ＰＬＮ２１４Ｃ△９を、
実施例２の方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの回
収、精製、Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了後
、この溶液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透
析し、その溶液の希釈列をとり、マウス骨髄細胞のコロ
ニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。そ
の結果、各々１，５７０単位／ｍｌであった。
現 ■発現 実施例５で作製した形質転換体ＰＬＮ２１４Ｃ△９を、
実施例２の方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの回
収、精製、Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了後
、この溶液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透
析し、その溶液の希釈列をとり、マウス骨髄細胞のコロ
ニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。そ
の結果、各々１，５７０単位／ｍｌであった。
さらに形成されたコロニーの形態をエステラーゼ二重染
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦかＭ−ＣＳＦであることか
証明された。
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦかＭ−ＣＳＦであることか
証明された。
なお、この２１４Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦモノマーの還元下
で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、約２７．０
００であった。
で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、約２７．０
００であった。
また形成された２１４Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦダイマーの分
子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約５９，０００
であった。
子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約５９，０００
であった。
■Ｎ末端アミノ酸配列の分析
Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■て得た２１４Ｃ△９型
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２１４Ｃ△９の生産
する２１４Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
する２１４Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
Ｍｅ ｔ−Ｉ １ｅ−Ｇ １ｙ−３ｅｒ−Ｇ １ｙ−Ｈ
１ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ Ｉｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎＡ
ｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅ
ｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ［実施例７］２３８△５アミノ酸型
Ｍ−ＣＳＦの大腸菌発現ベクターの作製 ■ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８とＩ）ＵＣ１３（７）組換え
実施例１−■に記載の方法と同様に、特願平２３６３５
１明細書に記載の動物細胞発現用ベクターｐＳＶＬ−Ｃ
ＳＦ２３８のＭ−ＣＳＦ２３８部分を、ｐＵｃ１３（フ
ァルマシア社製）のマルチクロニング部位に組換えた。
１ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ Ｉｎ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎＡ
ｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅ
ｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ［実施例７］２３８△５アミノ酸型
Ｍ−ＣＳＦの大腸菌発現ベクターの作製 ■ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８とＩ）ＵＣ１３（７）組換え
実施例１−■に記載の方法と同様に、特願平２３６３５
１明細書に記載の動物細胞発現用ベクターｐＳＶＬ−Ｃ
ＳＦ２３８のＭ−ＣＳＦ２３８部分を、ｐＵｃ１３（フ
ァルマシア社製）のマルチクロニング部位に組換えた。
すなわち、ｐＳＶＬ−ＣＳＦ２３８ （５μｇ）を制限
酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）とＸｈｏＩ（宝酒造社製）
各々１ｅ単位で３７°Ｃ，２時間反応させ、完全に消化
し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時
間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約１Ｋｂ
ｐの断片を回収した。この断片と実施例１−■で調整し
たｐＵｃ１３の約２．７Ｋｂｐの断片を、ＤＮＡライゲ
ーションキットの方法に従ってライゲーションを行い、
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入した。この
大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍＩ）とＸ−ｇａ
ｌ （４０μｇ／ｍｌ）及びＩＰＴＧ（５ｍＭ）を含む
ＬＢ寒天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養した。白色コ
ロニーとして組換え体を得た。ここで得たコロニを無作
為に１２個選択し、実施例１−■とまったく同様にプラ
スミドを調製し、制限酵素ＸｈｏＩて切断されず、制限
酵素ＸｂａＩで一カ所だけ切断され、約３．７Ｋｂｐの
断片のみを与えるクローンを、選択した。このクローン
をｐ２３８と命名した（第７図）。
酵素ＸｂａＩ（宝酒造社製）とＸｈｏＩ（宝酒造社製）
各々１ｅ単位で３７°Ｃ，２時間反応させ、完全に消化
し、１．０％アガロースゲル電気泳動（１００Ｖ、２時
間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用いて約１Ｋｂ
ｐの断片を回収した。この断片と実施例１−■で調整し
たｐＵｃ１３の約２．７Ｋｂｐの断片を、ＤＮＡライゲ
ーションキットの方法に従ってライゲーションを行い、
大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入した。この
大腸菌をアンピシリン（１００μｇ／ｍＩ）とＸ−ｇａ
ｌ （４０μｇ／ｍｌ）及びＩＰＴＧ（５ｍＭ）を含む
ＬＢ寒天培地にまき、３７°Ｃで一夜培養した。白色コ
ロニーとして組換え体を得た。ここで得たコロニを無作
為に１２個選択し、実施例１−■とまったく同様にプラ
スミドを調製し、制限酵素ＸｈｏＩて切断されず、制限
酵素ＸｂａＩで一カ所だけ切断され、約３．７Ｋｂｐの
断片のみを与えるクローンを、選択した。このクローン
をｐ２３８と命名した（第７図）。
■ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８△５の作製
最初に組換え中間体としてｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８△５
を作製した。すなわち実施例１−■で取得したｐＰＬＮ
と実施例１−■で作製した△５リンカー及び上記■で作
製したｐ２３８を、実施例１−■記載の方法に従って組
換えを行った。まずｐ２３８ （５μｇ）を制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩ［１ｅ単位て３７°Ｃ，２時間反応させ、完全
に消化した。
を作製した。すなわち実施例１−■で取得したｐＰＬＮ
と実施例１−■で作製した△５リンカー及び上記■で作
製したｐ２３８を、実施例１−■記載の方法に従って組
換えを行った。まずｐ２３８ （５μｇ）を制限酵素Ｈ
ｉｎｄＩ［１ｅ単位て３７°Ｃ，２時間反応させ、完全
に消化した。
続いて、制限酵素Ｂｓ ｔＸＩ １０単位で５５°Ｃ１
２時間反応後、１．０％アガロースゲル電気泳動（１０
０Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用い
て約７１０ｂｐの断片を回収した。
２時間反応後、１．０％アガロースゲル電気泳動（１０
０Ｖ、２時間）を行い、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＴＭを用い
て約７１０ｂｐの断片を回収した。
回収した断片と発現ベクターのｐＰＬＮのＨｐａＩ／Ｈ
ｉｎｄｌ［Ｉの約３．５Ｋｂｐ断片並びに実施例１−■
記載の△５リンカーの３断片を、ＤＮＡライゲーション
キットの方法に従ってライゲーションを行った。次に大
腸菌Ｎ４８３０−１のコンピテントセルに導入した後、
ＬＢ−アンピシリンプレートにまき、翌日はえたコロニ
ーから無作為に１２個選択し、この菌体から実施例１−
■記載の方法に従ってプラスミドを調製した。このプラ
スミドを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ （ＢＲＬ社製）あるいは
Ｂｓ ｔＸＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳
動を行い、目的とする約４．３Ｋｂｐを与えるクローン
を、３クロ一ン選択した。
ｉｎｄｌ［Ｉの約３．５Ｋｂｐ断片並びに実施例１−■
記載の△５リンカーの３断片を、ＤＮＡライゲーション
キットの方法に従ってライゲーションを行った。次に大
腸菌Ｎ４８３０−１のコンピテントセルに導入した後、
ＬＢ−アンピシリンプレートにまき、翌日はえたコロニ
ーから無作為に１２個選択し、この菌体から実施例１−
■記載の方法に従ってプラスミドを調製した。このプラ
スミドを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ （ＢＲＬ社製）あるいは
Ｂｓ ｔＸＩで消化し、１．０％アガロースゲル電気泳
動を行い、目的とする約４．３Ｋｂｐを与えるクローン
を、３クロ一ン選択した。
■ＤＮＡ配列の確認
実施例Ｉ−■の方法に従って塩基配列の決定を行った。
すなわち、■で得た各クローンがら調整したプラスミド
のＰｓｔＩ／Ｂｇ］ＩＩである断片約５ｏｏｂｐの断片
を調整し、実施例１−■で調整したＭｌ ３ｍｐ １８
ＲＦのＰｓｔＩ／ＢａｍＨ■断片約７．２Ｋｂｐにリク
ローニングし、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに
導入して組換え体を得た。ここで得たプラークを無作為
に各々４個選択し、常法に従って一本鎖組換え体ファー
ジを調製した。塩基配列の決定はジデオキシ・チエイン
・ターミネーション法で行い、目的とする組換え体の確
認と選択を行った。
のＰｓｔＩ／Ｂｇ］ＩＩである断片約５ｏｏｂｐの断片
を調整し、実施例１−■で調整したＭｌ ３ｍｐ １８
ＲＦのＰｓｔＩ／ＢａｍＨ■断片約７．２Ｋｂｐにリク
ローニングし、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに
導入して組換え体を得た。ここで得たプラークを無作為
に各々４個選択し、常法に従って一本鎖組換え体ファー
ジを調製した。塩基配列の決定はジデオキシ・チエイン
・ターミネーション法で行い、目的とする組換え体の確
認と選択を行った。
この結果、■で得られた組換え体のうち、正しいことの
確認できた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８△
５と命名した（第８図）。
確認できた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８△
５と命名した（第８図）。
■ｐ ＰＬＮ−ＣＳＦ ２３８ Ｃ△５の構築上記■て
得たｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８△５を母体として、実施例
１−■の方法に従ってｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５の
構築を行った。
得たｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８△５を母体として、実施例
１−■の方法に従ってｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５の
構築を行った。
すなわち、上記発現ベクターのＡｆｌｌＩ部分を消化し
、ＰｖｕｌＴで完全消化して約４．２Ｋｂｐ断片を調整
した。この回収断片と実施例１−■で作製した△６４リ
ンカ−とを、ＤＮＡライゲーションキッＩ・の方法に従
ってライゲーションを行い、大腸菌Ｎ４８３０−１のコ
ンピテントセルに導入した。この大腸菌を常法に従って
培養し、組換え体コロニーを得た。ここで得たコロニー
を無作為に１２２個選択、゛この菌体からアルカリ−３
ＤＳ法を用いてプラスミドを調製した。調整したプラス
ミドを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ、Ｂｓ ｔＸＩあるいはＥｃ
ｏＲＶで各々消化し、３種の制限酵素とも１カ所でのみ
切断する目的の約４．３Ｋｂｐを与えるクローンを、３
クロ一ン選択した。
、ＰｖｕｌＴで完全消化して約４．２Ｋｂｐ断片を調整
した。この回収断片と実施例１−■で作製した△６４リ
ンカ−とを、ＤＮＡライゲーションキッＩ・の方法に従
ってライゲーションを行い、大腸菌Ｎ４８３０−１のコ
ンピテントセルに導入した。この大腸菌を常法に従って
培養し、組換え体コロニーを得た。ここで得たコロニー
を無作為に１２２個選択、゛この菌体からアルカリ−３
ＤＳ法を用いてプラスミドを調製した。調整したプラス
ミドを制限酵素Ｎｄｅ Ｉ、Ｂｓ ｔＸＩあるいはＥｃ
ｏＲＶで各々消化し、３種の制限酵素とも１カ所でのみ
切断する目的の約４．３Ｋｂｐを与えるクローンを、３
クロ一ン選択した。
■ＤＮＡ配列の確認
塩基配列の決定は実施例Ｉ−■記載の方法に従った。す
なわち上記■で得た各クローンからアルカリ−３ＤＳ法
を用いてプラスミドを調製し、Ｓｔｕ’Ｉ／ＢｇｌｌＩ
の約７５０ｂｐの断片を回収した。この断片を実施例１
−■で調整したＭ１３ｍｐ１８ＲＦのＨｉｎｃＩ［／Ｂ
ａｍＨｉ断片約７゜２Ｋｂｐにリクローニングし、大腸
菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入した。この大腸
菌を常法に従って培養し、白色プラークとして組換え体
を得た。ここで得たプラークを無作為に各々４個選択し
、−本鎖組換え体ファージを調製した。塩基配列の決定
はジデオキシ・チエイン・ターミネーション法て行い、
目的とする組換え体の確認と選択を行った。
なわち上記■で得た各クローンからアルカリ−３ＤＳ法
を用いてプラスミドを調製し、Ｓｔｕ’Ｉ／ＢｇｌｌＩ
の約７５０ｂｐの断片を回収した。この断片を実施例１
−■で調整したＭ１３ｍｐ１８ＲＦのＨｉｎｃＩ［／Ｂ
ａｍＨｉ断片約７゜２Ｋｂｐにリクローニングし、大腸
菌ＪＭ１０９のコンピテントセルに導入した。この大腸
菌を常法に従って培養し、白色プラークとして組換え体
を得た。ここで得たプラークを無作為に各々４個選択し
、−本鎖組換え体ファージを調製した。塩基配列の決定
はジデオキシ・チエイン・ターミネーション法て行い、
目的とする組換え体の確認と選択を行った。
この結果■で得られた組換え体のうち、正しいことの確
認できた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△
５と命名した（第８図）。さらにこの発現ベクターで形
質転換された大腸菌を、ＰＬＮ２３８Ｃ△５と命名した
。
認できた発現ベクターを、ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△
５と命名した（第８図）。さらにこの発現ベクターで形
質転換された大腸菌を、ＰＬＮ２３８Ｃ△５と命名した
。
［実施例８］２３８Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦの大腸菌での発
現 ■発現 実施例７て作製した形質転換体ＰＬＮ２３８ Ｃ△５を
、実施例２の方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの
回収、精製、Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了
後、この溶液を０，０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して
透析し、その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロ
ニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。そ
の結果、５３０００単位／ｍｌであった。
現 ■発現 実施例７て作製した形質転換体ＰＬＮ２３８ Ｃ△５を
、実施例２の方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの
回収、精製、Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了
後、この溶液を０，０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して
透析し、その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロ
ニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。そ
の結果、５３０００単位／ｍｌであった。
さらに形成されたコロニーの形態をエステラーゼ二重染
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが
証明された。
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭ−ＣＳＦであることが
証明された。
なお、この２３８Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦモノマーの還元下
で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、約３１，０
００であった。
で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、約３１，０
００であった。
また、形成された２３８Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦダイマーの
分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６３．００
０であった。
分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６３．００
０であった。
■Ｎ末端アミノ酸配列の分析
Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２３８Ｃ△５型
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢ１社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢ１社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２３８Ｃ△５の生産
する２３８Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
する２３８Ｃ△５型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｘ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−［１ｅ
−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−ＨｉｓＬｅｕ−Ｇｉｎ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓ
ｐなお、３サイクル目の未同定アミノ酸は、２３８Ｃ△
５型Ｍ−ＣＳＦモノマーをＣｒｅｓｔｆｉｅｎｄらの方
法（Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄ、Ａ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、 ２３８６２２ （１９６
３））に従ってカルボキシメチル化し、プロティンシー
ケンサ−にかけ、システィンであることを確認した。
−Ｇｌｙ−３ｅｒ−Ｇｌｙ−ＨｉｓＬｅｕ−Ｇｉｎ−３
ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓ
ｐなお、３サイクル目の未同定アミノ酸は、２３８Ｃ△
５型Ｍ−ＣＳＦモノマーをＣｒｅｓｔｆｉｅｎｄらの方
法（Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄ、Ａ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、 ２３８６２２ （１９６
３））に従ってカルボキシメチル化し、プロティンシー
ケンサ−にかけ、システィンであることを確認した。
［実施例９］ ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△６〜△８の
作製 ■ｐＰＬＩｌ−ＣＳＦ２３８Ｃ△６〜△８の構築実施例
８で作製したｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５を出発材料
として、実施例３の方法に従ってｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３
８Ｃ△６〜△８の作製を行った。
作製 ■ｐＰＬＩｌ−ＣＳＦ２３８Ｃ△６〜△８の構築実施例
８で作製したｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５を出発材料
として、実施例３の方法に従ってｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３
８Ｃ△６〜△８の作製を行った。
すなわちｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５からＮｄｅＩ／
ＢｓｔＸＩの約４．３Ｋｂｐの断片を回収した。この断
片と先に記載の△６リンカー、△７リンカー、△８リン
カーを、個別にＤＮＡライゲーションキットの方法に従
ってライゲーションを行い、大腸菌Ｎ４８３０−１のコ
ンピテントセルに導入し常法に従って形質転換体の選択
を行った。ここで得た形質転換体を無作為に１２個選択
し、この菌体からプラスミドを調製した。このプラスミ
ドをＮｄｅＩあるいはＢｓ ｔＸＩで消化し、どちらの
制限酵素でも１カ所でのみ切断され、目的とする約４．
３Ｋｂｐを与える△６及び△７リンカーを導入したクロ
ーンと、Ｂｓ ｔＸＩでは消化されない△８リンカーを
導入したクローンを、各々３クローンづつ選択した。
ＢｓｔＸＩの約４．３Ｋｂｐの断片を回収した。この断
片と先に記載の△６リンカー、△７リンカー、△８リン
カーを、個別にＤＮＡライゲーションキットの方法に従
ってライゲーションを行い、大腸菌Ｎ４８３０−１のコ
ンピテントセルに導入し常法に従って形質転換体の選択
を行った。ここで得た形質転換体を無作為に１２個選択
し、この菌体からプラスミドを調製した。このプラスミ
ドをＮｄｅＩあるいはＢｓ ｔＸＩで消化し、どちらの
制限酵素でも１カ所でのみ切断され、目的とする約４．
３Ｋｂｐを与える△６及び△７リンカーを導入したクロ
ーンと、Ｂｓ ｔＸＩでは消化されない△８リンカーを
導入したクローンを、各々３クローンづつ選択した。
■ＤＮＡ配列の確認
■で得た各プラスミドのＰｓｔＩ／ＢｇｌＩ［断片的５
００ｂｐを回収し、既出のＭ１３ｍｐ１８ＲＦＰｓ ｔ
Ｉ／ＢａｍＨＩ部位にリクローニングし、大腸菌ＪＭ
１０９のコンピテントセルに導入した。この大腸菌を常
法に従って培養し、白色プラークとして組換え体を得た
。ここで得たプラークを無作為に各々４個選択し、常法
に従って一本鎖組換え体ファージを調製した。塩基配列
の決定はジデオキシ・チエイン・ターミネーション法で
行い、目的とする組換え体の確認と選択を行ったこの結
果■で得られた組換え体のうち、正しいことの確認でき
た発現ベクターをそれぞれ、ｐＰＬＮ−、ＣＳＦ２３８
Ｃ△６．ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△７．ｐＰＬＮ−Ｃ
ＳＦ ２３８ Ｃ△８と命名した（第９図）。
００ｂｐを回収し、既出のＭ１３ｍｐ１８ＲＦＰｓ ｔ
Ｉ／ＢａｍＨＩ部位にリクローニングし、大腸菌ＪＭ
１０９のコンピテントセルに導入した。この大腸菌を常
法に従って培養し、白色プラークとして組換え体を得た
。ここで得たプラークを無作為に各々４個選択し、常法
に従って一本鎖組換え体ファージを調製した。塩基配列
の決定はジデオキシ・チエイン・ターミネーション法で
行い、目的とする組換え体の確認と選択を行ったこの結
果■で得られた組換え体のうち、正しいことの確認でき
た発現ベクターをそれぞれ、ｐＰＬＮ−、ＣＳＦ２３８
Ｃ△６．ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△７．ｐＰＬＮ−Ｃ
ＳＦ ２３８ Ｃ△８と命名した（第９図）。
また、それぞれの発現ベクターで形質転換した大腸菌を
ＰＬＮ−２３８Ｃ△６．ＰＬＮ２３８Ｃ△７、ＰＬＮ２
３８Ｃ△８と命名した。
ＰＬＮ−２３８Ｃ△６．ＰＬＮ２３８Ｃ△７、ＰＬＮ２
３８Ｃ△８と命名した。
［実施例１０］２３８Ｃ△６型〜２３８Ｃ△８型Ｍ−Ｃ
ＳＦの大腸菌ての発現 ■発現 実施例９で作製した形質転換体ＰＬＮ２３８Ｃ△６．Ｐ
ＬＮ２３８Ｃ△７．ＰＬＮ２３８Ｃ△８、を実施例２の
方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの回収、精製、
Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了後、この溶液
を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、
その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロニー形成
を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。その結果、
各々５３，０００．８８０．７３０単位／ｍ、Ｉであっ
た。
ＳＦの大腸菌ての発現 ■発現 実施例９で作製した形質転換体ＰＬＮ２３８Ｃ△６．Ｐ
ＬＮ２３８Ｃ△７．ＰＬＮ２３８Ｃ△８、を実施例２の
方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの回収、精製、
Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了後、この溶液
を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して透析を行い、
その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロニー形成
を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。その結果、
各々５３，０００．８８０．７３０単位／ｍ、Ｉであっ
た。
さらに形成されたコロニーの形態をエステラーゼ二重染
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭＣＳＦであることが証
明された。
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭＣＳＦであることが証
明された。
なお、この２３８Ｃ△６〜２３８Ｃ△８型ＭＣＳＦモノ
マーの還元下で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は
、約３１，０００であった。
マーの還元下で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は
、約３１，０００であった。
また形成された２３８Ｃ△６〜２３８Ｃ△８型Ｍ−ＣＳ
Ｆダイマーの分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥ
で約６３，０００であった。
Ｆダイマーの分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥ
で約６３，０００であった。
■Ｎ末端アミノ酸配列の分析
Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２３８Ｃ△６〜
２３８Ｃ△８型Ｍ−ＣＳ Ｆモノマー分画の一部をその
まま ４７７Ａ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒ
（ＡＢＩ社製）に供し、エドマン分解後に得られるＰＴ
Ｈ（フェニルヒダントイン）アミノ酸を分析することで
確認した。
２３８Ｃ△８型Ｍ−ＣＳ Ｆモノマー分画の一部をその
まま ４７７Ａ ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒ
（ＡＢＩ社製）に供し、エドマン分解後に得られるＰＴ
Ｈ（フェニルヒダントイン）アミノ酸を分析することで
確認した。
２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２３８Ｃ△６の生産
する２３８Ｃ△６型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は、以下の通りであった。
する２３８Ｃ△６型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は、以下の通りであった。
５ｅｒ−Ｈｉ ｓ−Ｍｅ ｔ −［１ｅ−Ｇ １ｙ−３
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｊｓ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌ ｎ−３ｅｒＬ
ｅｕ−Ｇ１．ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−３
ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果、ＰＬ
Ｎ２３８Ｃ△７の生産する２３８Ｃ△７型Ｍ−ＣＳＦの
Ｎ末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｊｓ−Ｌｅｕ−Ｇ ｌ ｎ−３ｅｒＬ
ｅｕ−Ｇ１．ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−３
ｅｒ−Ｇｉｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果、ＰＬ
Ｎ２３８Ｃ△７の生産する２３８Ｃ△７型Ｍ−ＣＳＦの
Ｎ末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
５ｅｒ−Ｈｉ ｓ−Ｍｅ ｔ −［１ｅ−Ｇ Ｉｙ−３
ｅｒ−Ｇ １ｙ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−３ｅｒ
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−３
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果、ＰＬ
Ｎ２３８Ｃ△８の生産する２３８Ｃ△８型Ｍ−ＣＳＦの
Ｎ末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
ｅｒ−Ｇ １ｙ−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇ ｉｎ−３ｅｒ
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ａｓｐ−３
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ２０サイクル分析した結果、ＰＬ
Ｎ２３８Ｃ△８の生産する２３８Ｃ△８型Ｍ−ＣＳＦの
Ｎ末端からのアミノ酸配列は、以下の通りであった。
Ｍｅ ｔ−Ｈｉ ｓ−Ｍｅ ｔ−［１ｅ−Ｇ １ｙ−３
ｅｒ−Ｇ ｌ ｙ−Ｈ４ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ Ｉｎ−３ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｃ１，ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−［１ｅ−Ａｓｐ
−３ｅｒ−Ｇｌｎ−ＭｅｔＪ この結果ＰＬＮ２３８Ｃ△６から生産されるＭＣＳＦは
、ＰＬＮ２３８Ｃ△７の生産するＭＣＳＦと同一のもの
であることか確認された。ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△
６のＤＮＡ配列が正しいことを考慮すると、ｐＰＬＮ２
１４Ｃ△６で起きた現象とまったく同一のことか起こっ
ていると思われる。
ｅｒ−Ｇ ｌ ｙ−Ｈ４ｓ−Ｌｅｕ−Ｇ Ｉｎ−３ｅｒ
−Ｌｅｕ−Ｃ１，ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−［１ｅ−Ａｓｐ
−３ｅｒ−Ｇｌｎ−ＭｅｔＪ この結果ＰＬＮ２３８Ｃ△６から生産されるＭＣＳＦは
、ＰＬＮ２３８Ｃ△７の生産するＭＣＳＦと同一のもの
であることか確認された。ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△
６のＤＮＡ配列が正しいことを考慮すると、ｐＰＬＮ２
１４Ｃ△６で起きた現象とまったく同一のことか起こっ
ていると思われる。
［実施例１１コｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△９の作製
■ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△９の構築実施例９で作製
したｐ ＰＬＮ−ＣＳＦ ２３８ Ｃ△５を出発材料と
して、実施例５に記載の方法に従ってｐＰＬＮ−ＣＳＦ
２３８Ｃ△９の作製を行った。
したｐ ＰＬＮ−ＣＳＦ ２３８ Ｃ△５を出発材料と
して、実施例５に記載の方法に従ってｐＰＬＮ−ＣＳＦ
２３８Ｃ△９の作製を行った。
すなわちｐＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５をＡｆｌ■部分
消化、ＮｄｅＩ消化し、約４．３Ｋｂｐの断片を回収し
た。この断片と実施例５で調整し９ま た△９リンカーとを、ＤＮＡライゲーションキットを用
いて連結させ、実施例３−■の方法に従って大腸菌に導
入し、プラスミドの調整を行った。
消化、ＮｄｅＩ消化し、約４．３Ｋｂｐの断片を回収し
た。この断片と実施例５で調整し９ま た△９リンカーとを、ＤＮＡライゲーションキットを用
いて連結させ、実施例３−■の方法に従って大腸菌に導
入し、プラスミドの調整を行った。
このプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩあるいはＢｓｔＸ工
で各々消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い
、Ｎｄｅｌで１カ所のみ切断され、Ｂｓ ｔＸＩで切断
されない約４．３Ｋｂｐのクローンを、３クロ一ン選択
した。
で各々消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動を行い
、Ｎｄｅｌで１カ所のみ切断され、Ｂｓ ｔＸＩで切断
されない約４．３Ｋｂｐのクローンを、３クロ一ン選択
した。
■ＤＮＡ配列の確認
実施例３−■に記載の方法とまったく同様の方法を用い
て、■で取得したプラスミドのＰｓｔＩ／Ｂｇ］Ｉｆ断
片を、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位
にリクローニングし、塩基配列の確認を行った。その結
果、目的とする塩基配列を与えたクローンを選択し、ｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△９と命名した（第１０図）。
て、■で取得したプラスミドのＰｓｔＩ／Ｂｇ］Ｉｆ断
片を、Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ部位
にリクローニングし、塩基配列の確認を行った。その結
果、目的とする塩基配列を与えたクローンを選択し、ｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△９と命名した（第１０図）。
さらにこの発現ベクターで形質転換した大腸菌を、ＰＬ
Ｎ２３８Ｃ△９と命名した。
Ｎ２３８Ｃ△９と命名した。
［実施例１２］２３８Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦの大腸菌での
発現 マーの分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６２
，０００であった。
発現 マーの分子量は、非還元下の５ＤＳ−ＰＡＧＥで約６２
，０００であった。
■発現
実施例１１で作製した形質転換体ＰＬＮ２３８Ｃ△９を
、実施例２の方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの
回収、精製、Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了
後、この溶液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して
透析し、その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロ
ニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。そ
の結果、各々２，０４５単位／ｍｌであった。
、実施例２の方法に従って培養、Ｍ−ＣＳＦモノマーの
回収、精製、Ｍ−ＣＳＦダイマー形成を行い、反応終了
後、この溶液を０．０５％ＰＥＧを含むＰＢＳに対して
透析し、その溶液の希釈列をとりマウス骨髄細胞のコロ
ニー形成を指標としたＭ−ＣＳＦ活性測定を行った。そ
の結果、各々２，０４５単位／ｍｌであった。
さらに形成されたコロニーの形態をエステラーゼ二重染
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭＣＳＦであることが証
明された。
色法で調べた結果、全てが単球−マクロファージのコロ
ニーであり、得られたＣＳＦがＭＣＳＦであることが証
明された。
なお、この２３８Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦモノマーの還元下
で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、約３０，０
００であった。
で行った５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量は、約３０，０
００であった。
また形成された２３８Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦダイ■Ｎ末端
アミノ酸配列の分析 Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２３８Ｃ△９型
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
アミノ酸配列の分析 Ｎ末端アミノ酸配列の分析は、■で得た２３８Ｃ△９型
Ｍ−ＣＳＦモノマー分画の一部をそのまま４７７Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ５ｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＡＢＩ社製）に供
し、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニルヒダン
トイン）アミノ酸を分析することで確認した。
２０サイクル分析した結果、ＰＬＮ２３８Ｃ△９の生産
する２３８Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
する２３８Ｃ△９型Ｍ−ＣＳＦのＮ末端からのアミノ酸
配列は以下の通りであった。
Ｍｅ ｔ −Ｉ １ｅ−Ｇ １ｙ−３ｅｒ−Ｇ ］ ｙ
−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇ １ｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−［１ｅ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ［発明の効果］ 本発明によれば、ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を好敵
な発現ベクターに組み込み、次に大腸菌に代表される微
生物に導入し、次いてこうして得られた形質転換体を培
養することにより、効率良く、そして高純度、高品質の
ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ遺伝子及びその類縁体を大量に
製造することができ、医薬等への応用の道が開かれる。
−Ｈｉ ５−Ｌｅｕ−Ｇ １ｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−［１ｅ−Ａｓｐ−３ｅｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ［発明の効果］ 本発明によれば、ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ遺伝子を好敵
な発現ベクターに組み込み、次に大腸菌に代表される微
生物に導入し、次いてこうして得られた形質転換体を培
養することにより、効率良く、そして高純度、高品質の
ヒト尿由来型Ｍ−ＣＳＦ遺伝子及びその類縁体を大量に
製造することができ、医薬等への応用の道が開かれる。
さらにまた、本発明に従えば、簡単な操作で微生物の形
質転換体より得られた遺伝子産物から高純度でかつ有用
なＭ−ＣＳＦ活性を有する製品を得ることができ、実用
上の利点が大きい。
質転換体より得られた遺伝子産物から高純度でかつ有用
なＭ−ＣＳＦ活性を有する製品を得ることができ、実用
上の利点が大きい。
以下の図中および本明細書中のポリペプチド及び塩基配
列の符号は以下の略号である。 Ａｌａ：Ａｌａｎｉｎｅ Ａｓｎ ：Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｃｙｓ：Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｇｉｎ：Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｈｉｓ：Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｌｅｕ：Ｌｅｕｃｉｎｅ Ａｒｇ：Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ａｓｐ：Ａｓｐａｒａｔｉｃ ａｃｉｄＧｌｕ：Ｇｌｕ
ｔａｍｉｃ ａｃｉｄ Ｇｌｙ：Ｇｌｙｃｉｎｅ １１ｅ：ｌ５ｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｌｙｓ：Ｌｙｓｉｎｅ Ｍｅｔ ：Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｐｈｅ：
ＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＰｒｏ：Ｐｒｏｌｉｎｅ
Ｓｅｒ：５ｅｒｉｎｅＴｈｒ ：Ｔｈｒ
ｅｏｎ ｉｎｅ Ｔｒｐ ： Ｔｒｙｐｔｏ
ｐｈａｎｅＴｙｒ：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｖ
ａｌ ：ＶａｌｉｎｅＡ：Ａｄｅｎｉｎｅ
Ｃ：ＣｙｔｏｓｉｎｅＧ：Ｇｕａｎｉｎｅ
Ｔ：Ｔｈｙｍｉｎｅ第１図（ａ）は、本発明の
ヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦの２１４番目のアミノ酸プロリン
をＣ末端とするＮ末端変異体のアミノ酸配列を示す。式
中ＸはＴｙｒ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−、Ｃｙｓ−３
ｅｒ−Ｈｉｓ−、５ｅｒ−Ｈｉｓ−、Ｈｉｓ−あるいは
０個のアミノ酸を示し、ＹはＳｅｒまたはＰｈｅを示す
。ｎ＝ｏまたは１を示す。 第１図（ｂ）は、本発明のヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦの２３
８番目のアミノ酸リジンをＣ末端とするＮ末端変異体の
アミノ酸配列を示す。式中ＸはＴｙｒＣｙｓ−３ｅｒ−
Ｈｉｓ−、Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−、５ｅｒ−Ｈｉｓ
−、Ｈｉｓ−あるいは０個のアミノ酸を示し、ＹはＳｅ
ｒまたはＰｈｅを示す。ｎ＝０または１を示す。 第２図は、発現ベクターｐＰＬＮの構築図を示す示す。 第３図は、ｐ２１４の構築図を示す。 第４図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△５及びｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４
Ｃ△５の構築図を示す。 第５図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△６〜ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ
△８まての構築図を示す。 第６図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△９の構築図を示す第７図は、ｐ
２３８の構築図を示す。 第８図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５の構築図を示す。 第９図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△６〜ｐ Ｐ ＬＮ−ＣＳＦ２
３８Ｃ△８までの構築図を示す。 第１０図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクター
ｐ ＰＬＮ−ＣＳＦ ２３８ Ｃ：△９の構築図を図中
、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＡｌｗＮＩ、ＮｒｕＩ
、Ｐｖｕｌ、 ＡｆｌＩ［、ＮｄｅＩ、ＨｐａＩ、
ＰｖｕＩ［、ＨｉｎｄＩ［、ＸｈｏＩ。 Ｘｂａｌ、５ａｌＩ及びＢｓ ｔＸＩは、それぞれ制限
酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＴ１４１．ＡＩｗＮＩ、Ｎｒｕ
Ｉ、ＰｖｕＩ、Ａｆ ＩＩＩ、ＮｄｅＩ。 ＨｐａＩ、ＰｖｕｌＩ、ＨｉｎｄＩ［、ＸｈｏＩ、Ｘｂ
ａＩ、５ａｌＩ及びＢｓｔＸＩの認識部位を示す。また
、ＣＳＦ、Ａｐｒ、Ｔｃｒ、Ｎ、Ｎ’ 。 Ｐｔａｃ、 ＰＬ、 Ｔ ４ Ｐ ｏ １はそれぞれＣ
ＳＦ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子、λファージのＮ蛋白遺伝子、Ｎ蛋白遺伝
子のＮ末端３３アミノ酸相当の遺伝子、 ＴａＣプロモ
ーター、ＰＬプロモーター及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
を示す。また、ＣＳＦの後の３桁の数字はＣ末端アミノ
酸の部位を、△はＮ末端の欠損を意味しその後ろの数字
は欠損のアミノ酸数を表す。 α Ｏｅ Ｑ −−ロ ω 二 α −
ムく■（Ｊ ＋−１ｈトくヘー〇〇ト ０ α コ ｑ ψ −−仁 ｇ ｏ
〕 コ、−２＜ １−１ （Ｃｊ ｌ−＋←くく歯
〇−Ｖ取 Ω ｈ Ω 田 旺 旺
列の符号は以下の略号である。 Ａｌａ：Ａｌａｎｉｎｅ Ａｓｎ ：Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ Ｃｙｓ：Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｇｉｎ：Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｈｉｓ：Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｌｅｕ：Ｌｅｕｃｉｎｅ Ａｒｇ：Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ａｓｐ：Ａｓｐａｒａｔｉｃ ａｃｉｄＧｌｕ：Ｇｌｕ
ｔａｍｉｃ ａｃｉｄ Ｇｌｙ：Ｇｌｙｃｉｎｅ １１ｅ：ｌ５ｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｌｙｓ：Ｌｙｓｉｎｅ Ｍｅｔ ：Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ Ｐｈｅ：
ＰｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅＰｒｏ：Ｐｒｏｌｉｎｅ
Ｓｅｒ：５ｅｒｉｎｅＴｈｒ ：Ｔｈｒ
ｅｏｎ ｉｎｅ Ｔｒｐ ： Ｔｒｙｐｔｏ
ｐｈａｎｅＴｙｒ：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｖ
ａｌ ：ＶａｌｉｎｅＡ：Ａｄｅｎｉｎｅ
Ｃ：ＣｙｔｏｓｉｎｅＧ：Ｇｕａｎｉｎｅ
Ｔ：Ｔｈｙｍｉｎｅ第１図（ａ）は、本発明の
ヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦの２１４番目のアミノ酸プロリン
をＣ末端とするＮ末端変異体のアミノ酸配列を示す。式
中ＸはＴｙｒ−Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−、Ｃｙｓ−３
ｅｒ−Ｈｉｓ−、５ｅｒ−Ｈｉｓ−、Ｈｉｓ−あるいは
０個のアミノ酸を示し、ＹはＳｅｒまたはＰｈｅを示す
。ｎ＝ｏまたは１を示す。 第１図（ｂ）は、本発明のヒト尿由来Ｍ−ＣＳＦの２３
８番目のアミノ酸リジンをＣ末端とするＮ末端変異体の
アミノ酸配列を示す。式中ＸはＴｙｒＣｙｓ−３ｅｒ−
Ｈｉｓ−、Ｃｙｓ−３ｅｒ−Ｈｉｓ−、５ｅｒ−Ｈｉｓ
−、Ｈｉｓ−あるいは０個のアミノ酸を示し、ＹはＳｅ
ｒまたはＰｈｅを示す。ｎ＝０または１を示す。 第２図は、発現ベクターｐＰＬＮの構築図を示す示す。 第３図は、ｐ２１４の構築図を示す。 第４図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△５及びｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４
Ｃ△５の構築図を示す。 第５図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△６〜ｐＰＬＮ−ＣＳＦ２１４Ｃ
△８まての構築図を示す。 第６図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２１４△９の構築図を示す第７図は、ｐ
２３８の構築図を示す。 第８図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△５の構築図を示す。 第９図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクターｐ
ＰＬＮ−ＣＳＦ２３８Ｃ△６〜ｐ Ｐ ＬＮ−ＣＳＦ２
３８Ｃ△８までの構築図を示す。 第１０図は、本発明で使用したＭ−ＣＳＦ発現ベクター
ｐ ＰＬＮ−ＣＳＦ ２３８ Ｃ：△９の構築図を図中
、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＡｌｗＮＩ、ＮｒｕＩ
、Ｐｖｕｌ、 ＡｆｌＩ［、ＮｄｅＩ、ＨｐａＩ、
ＰｖｕＩ［、ＨｉｎｄＩ［、ＸｈｏＩ。 Ｘｂａｌ、５ａｌＩ及びＢｓ ｔＸＩは、それぞれ制限
酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＴ１４１．ＡＩｗＮＩ、Ｎｒｕ
Ｉ、ＰｖｕＩ、Ａｆ ＩＩＩ、ＮｄｅＩ。 ＨｐａＩ、ＰｖｕｌＩ、ＨｉｎｄＩ［、ＸｈｏＩ、Ｘｂ
ａＩ、５ａｌＩ及びＢｓｔＸＩの認識部位を示す。また
、ＣＳＦ、Ａｐｒ、Ｔｃｒ、Ｎ、Ｎ’ 。 Ｐｔａｃ、 ＰＬ、 Ｔ ４ Ｐ ｏ １はそれぞれＣ
ＳＦ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリ
ン耐性遺伝子、λファージのＮ蛋白遺伝子、Ｎ蛋白遺伝
子のＮ末端３３アミノ酸相当の遺伝子、 ＴａＣプロモ
ーター、ＰＬプロモーター及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
を示す。また、ＣＳＦの後の３桁の数字はＣ末端アミノ
酸の部位を、△はＮ末端の欠損を意味しその後ろの数字
は欠損のアミノ酸数を表す。 α Ｏｅ Ｑ −−ロ ω 二 α −
ムく■（Ｊ ＋−１ｈトくヘー〇〇ト ０ α コ ｑ ψ −−仁 ｇ ｏ
〕 コ、−２＜ １−１ （Ｃｊ ｌ−＋←くく歯
〇−Ｖ取 Ω ｈ Ω 田 旺 旺
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 （ａ）下記式（ I ）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ
−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド 式（ I ） 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を
示し、ｎ＝０または１を示す。）、または （ｂ）下記式（II）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチド 式（II） 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を
示し、ｎ＝０または１を示す。）、または （ｃ）下記式（III）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ
−ＣＳＦ活性を有するポリペプチド 式（III） 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を
示し、ｎ＝０または１を示す。）、または （ｄ）下記式（IV）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチド 式（IV） 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を
示し、ｎ＝０または１を示す。）、または （ｅ）下記式（Ｖ）のアミノ酸配列で示されるヒトＭ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチド 式（Ｖ） 【遺伝子配列があります】 （式中ＸはＰｈｅまたはＳｅｒを、ＹはＧｌｙ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓで示されるアミノ酸配列を
示し、ｎ＝０または１を示す。） またはそれらのホモダイマー化処理生成物。 ２、式（ I ）乃至式（Ｖ）のアミノ酸配列のいずれか
で示されるヒトＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列を有する分子。 ３、式（ I ）乃至式（Ｖ）のアミノ酸配列のいずれか
で示されるヒトＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ配列及び微生物中で機能するレプリコ
ンを含んで成る複製可能なクローニングベクター。 ４、適切な制御配列に作用可能に連結され、式（ I ）
乃至式（Ｖ）のアミノ酸配列のいずれかで示されるヒト
Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含んで成る発現系。 ５、宿主微生物中で複製可能なベクターに組込まれてい
る請求項４に記載の発現系 ６、ヒトＭ−ＣＳＦモノマー蛋白質の発現が２・シスト
ロン法に基づくものである請求項５に記載の発現系。 ７、適切な制御配列に作用可能に連結され、式（ I ）
乃至式（Ｖ）のアミノ酸配列のいずれかで示されるヒト
Ｍ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列を含んで成る発現系で形質転換された組換え宿主
微生物。 ８、式（ I ）乃至式（Ｖ）のアミノ酸配列のいずれか
で示されるヒトＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡを含み、ヒトＭ−ＣＳＦモノマー蛋白
質を発現可能なプラスミドを保有する形質転換体を培養
し、ヒトＭ−ＣＳＦモノマー蛋白質を生産せしめ、得ら
れたヒトＭ−ＣＳＦモノマー蛋白質を生物学的に活性な
ヒトＭ−ＣＳＦホモダイマーに再構成することを特徴と
するヒトＭ−ＣＳＦの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2196138A JPH0482900A (ja) | 1990-07-26 | 1990-07-26 | 新規ｍ―ｃｓｆ及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2196138A JPH0482900A (ja) | 1990-07-26 | 1990-07-26 | 新規ｍ―ｃｓｆ及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0482900A true JPH0482900A (ja) | 1992-03-16 |
Family
ID=16352864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2196138A Pending JPH0482900A (ja) | 1990-07-26 | 1990-07-26 | 新規ｍ―ｃｓｆ及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0482900A (ja) |
-
1990
- 1990-07-26 JP JP2196138A patent/JPH0482900A/ja active Pending
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