JP2667193B2 - 二機能性タンパク質 - Google Patents

二機能性タンパク質

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Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン２（以下、IL−２という）は、Ｔ細
胞増殖因子として作用する。IL−２は、NK（ナチュラル
キラー）細胞、細胞毒性Ｔ細胞およびLAK（リンホカイ
ン活性化キラー）細胞のようなキラー細胞活性を助け
る。
これに対比して、顆粒球マクロファージ・コロニー刺
激因子（以下、GM−CSFという）は、造血性前駆細胞か
らの顆粒球およびマクロファージの形成を促進する。こ
れら二つの生物学的活性の組合せは、細胞発達阻止剤の
投与および非投与におけるヒトの治療のために興味がも
たれる。しかしながら、IL−２およびGM−CSFの安定性
は異なっており、このことがこれら二成分因子の直接的
投与に問題を生じさせ、治療効果を低減させるものと考
えられる。
安定性の違いの問題は、本発明によって、これら二つ
のタンパク質を二機能性タンパク質に結合させることで
解決することができる。
一般式、 の融合タンパク質は、必要に応じて修飾したGM−CSF
の、遺伝子操作による調製に使用するものとして既に提
示されている。式中、Ｘは、本質的には、IL−２、好ま
しくはヒトのIL−２、のほぼ最初の100個のアミノ酸配
列を表し、Ｙは、所望のタンパク質に隣接したアミノ酸
またはアミノ酸配列によって所望のタンパク質の切り離
しが可能な場合には、直接結合を表し、そうでない場合
には、１個以上の遺伝子的にコード可能なアミノ酸から
なり、かつ、切り離しを可能にするブリッジ部分を表
し、さらに、Ｚは、遺伝子的にコード可能なアミノ酸か
らなり、かつ、所望のGM−CSFタンパク質を表す配列で
ある。この間に、さらに、IL−２をコードするDNA配列
のほぼ最後部までを利用することも可能であって、適宜
に修飾して、生物学的に活性なIL−２を「副産物」とし
て産生させる（公開前の欧州特許（EP−Ａ）出願第0,22
8,018号明細書および南アフリカ共和国特許第86/9557号
明細書）。
従来の提案とは対照的に、本発明は、これらタンパク
質の中間体としての使用に関するものではなく、ヒト生
体の治療法への利用、およびこのタイプの融合タンパク
質を含む、または、このタイプの融合タンパク質からな
る医薬品に関する。さらに、本発明は、これら融合タン
パク質の、悪性腫瘍の治療用の医薬品の調製のための利
用に関する。
本発明で用いられる融合タンパク質は、したがって、
二つの生物学的に活性な構成成分からなる。すなわち、
一つは、既知の方法で修飾できるIL−２であり、他の一
つは、同様に修飾が可能なGM−CSF構成成分である、二
つの構成成分からなり、さらに必要であれば、上記式中
に定義されたＹに対応するブリッジ部分とからなる。二
構成成分の配置は、式I aに対応するものが好ましい。
本発明の原理は、また、他の新規な二機能性タンパク質
の調製にも用いることができる。
第１図は、本発明の二機能性タンパク質をコードする
プラスミドpB30を示す。
IL−２分子の修飾は、開示されているが、ここでは、
例として、EP−Ａ明細書第0,091,539号、第0,109,748
号、第0,118,617号、第0,136,489号および第0,163,249
号のみを引用する。
さらに、公開前のEP−Ａ第0,219,839号明細書は、最
初の７個のＮ−末端アミノ酸を欠失しているIL−２誘導
体を提示している。
GM−CSF分子の修飾は、EP−Ａ第0,228,018号明細書に
提示されている。
二つの活性構成成分分子の他の変換修飾は、既知の方
法にて行うことができるが、ここでは、例として、特異
的な突然変異についてのみを記述した。
ブリッジ部分Ｙは、式IIを有するものが有利である。
−Asp−（aa）Ｘ−Pro− （II） 式中、ｘは約20までの整数を表し、aaは、遺伝子的に
コード可能なシステイン以外の所望のアミノ酸のいずれ
かを表す。
式II中、IL−２構成成分を左方末端に配置し、したが
って、GM−CSF構成成分を右方末端に配置するのが有利
である。とくに好ましい実施態様では、Ｙは、アミノ酸
配列 −Asp−Pro−Met−Ile−Thr−Thr−Tyr−Ala−Asp−Asp
−Pro−または−Asp−Pro−Met−Ile−Thr−Thr−Tyr−
Leu−Glu−Glu−Leu−Thr−Ile−Asp−Asp−Pro− を有する。ここでも、IL−２構成成分を左方末端に配置
し、GM−CSF構成成分を右方末端に配置するのが好まし
い。
本発明による二機能性タンパク質は、既知の方法で発
現させることができる。細菌の発現システムにおいて、
直接発現の経路に続けることが可能である。この目的に
は、既知の全ての宿主−ベクターシステムが適してい
る。宿主としては、例えばストレプトミセス（Streptom
yces）菌種、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネブミチ
フス菌（Salmonella typhimurium）またはセラチア・マ
ルセッセンス（Serratia marcescens）、とくに、大腸
菌（Eucherichia coli）、が適している。
所望のタンパク質をコードするDNA配列を、選んだ発
現システムにおいて充分に発現できるベクターに、既知
の方法にて取り込む。
この目的のためには、例えば、独国特許公開第3,430,
683号明細書およびEP−Ａ第0,173,149号明細書に記載
の、typ、lac、tac、λファージのPLまたはPR、hsp、om
pまたは合成プロモーターからなるグループからのプロ
モーターおよびオペレーター、を選べばよい。
tacプロモーター／オペレーター配列は有利であり、
現在、市販されている（例えば、ファルマシア社製の発
現ベクターpKK223−３、“Molecular Biologicals、Che
micala and Epuipment for Molecular Biology"、198
4、63頁）。
本発明によるタンパク質の発現において、mRNAのレベ
ルでの塩基対合を妨げるために、ATG開始のコードン後
の最初の２、３個のアミノ酸のための各々のトリプレッ
トを修飾することが有利であることが判るであろう。個
々のアミノ酸の欠失および添加などの修飾は、本分野に
おいてよく知られており、本発明もこれに係る。
酵母、好ましくはサッカロミセス・セレビシエ（Sacc
haromyces cerevisiae）、での発現のためには、例え
ば、α因子システムによるヘテロ型発現などの分泌シス
テムを用いるのが有利である。これについては、いくつ
かの記述がある。
酵母における二機能性分子の発現においては、二塩基
ペプチド配列および二機能性タンパク質中のグリコシル
化部位が個々のアミノ酸の適当な交換によって壊されて
いる場合に、有利である。これによって、これもまた生
物学的作用に影響すると思われる可能な組合せが得られ
る。
酵母におけるIL−２の発現は、EP−Ａ第0,142,268号
明細書に、また、GM−CSFの発現は、EP−Ａ第0,188,350
号明細書に開示されている。
本発明による二機能性タンパク質の投与は、二成分の
投与に相当する。しかし、安定性がより大きいので、多
くの場合、より少ない投与量を用いることができる。し
たがって、従来提示されている範囲の少ない方の投与量
が用い得る。
本発明は、次の諸例によって詳細に説明される。とく
に記載がない限り、パーセントおよび比の表示は重量表
示である。
例1: プラスミドp159/6（EP−A2第0,163,249号明細書の第
５図、本発明の第１図中の（１））は、IL−２をコード
する合成遺伝子をEcoR IおよびSal I切断部位の間に含
む。この遺伝子のDNA配列は、該EP−A2中では「DNA配列
Ｉ」と表されている。Taq I切断部位は、トリプレット1
27および128の領域に位置している。IL−２の部分配列
（２）を、EcoR IおよびTaq Iによる切断によってこの
プラスミドから切り出して分離する。
GM−CSFをコードするプラスミドpHG23（３）は、EP−
A2第0,183,350号明細書に開示されている。GM−CSFのcD
NAは、このEP−A2の第２図に示されている。プラスミド
pHG23を、cDNA配列をpBR322のPst I切断部位に取り込ん
で得る。ここで、一方では、５′末端のPst I切断部位
を、他方では、GC尾部形成によって導入された３′末端
のPst I切断部位を利用する。GM−CSF遺伝子のほとんど
を含むDNA配列（４）を、SfaN IおよびPst Iによる切断
によってこのプラスミドから分離する。
次のようなオリゴヌクレオチド（５）をフォスファイ
ト法によって合成する。
オリゴヌクレオチド（５）は、５′末端でIL−２のDN
A配列を伸長する。しかし、Aspが133位置のThrにとって
かわる。このオリゴヌクレオチドの３′英端には、SfaN
Iによる切断によってcDNAから切りだしておいたヌクレ
オチドが位置している。
発現プラスミドpEW1000（６）の調製法は、（公開前
の）EP−Ａ第0,227,938号明細書（第１図）に提示され
ている。このプラスミドは、プラスミドptac11（Amann
ら:Gene25（1983）167−178）の誘導体であって、この
中で、Sal I切断部位を含む合成配列は、EcoR I認識部
位に導入されている。発現プラスミドpKK177.3をこの方
法によって得る。Iacレプレッサー（Farabaugh:Nature2
74（1978）765−769）を挿入して、その結果、プラスミ
ドpJF118を得る。後者を、唯一のAva I切断部位で開環
して、エクソヌクレアーゼ処理による既知の方法で約10
00bp短縮し、連結する。プラスミドpEW1000（６）を得
る。このプラスミドのポリリンカー部分を酵素EcoR Iお
よびPst Iを用いて開環することによって、直鎖状の発
現プラスミド（７）を得る。
最後に、この直鎖状のプラスミドDNA（７）を、IL−
２配列をコードするDNAフラグメント（２）、合成オリ
ゴヌクレオチド（５）およびcDNAフラグメント（４）と
連結させる。その結果、大腸菌株Mc1061を形質転換する
プラスミドpB30（８）が得られる。個々のクローンから
のプラスミドDNAを分離して、制限酵素分析で性質を調
べる。
例2: 例１のオリゴヌクレオチド（５）の代わりに下記の合
成オリゴヌクレオチドを用いることによって、プラスミ
ドpB31を得る。
例3: 大腸菌株W3110のコンピテント細胞を、プラスミドpB3
0またはpB31で形質転換する。菌の一晩培養菌液を50μg
/mlアンピシリンをふくむLB培地（J.H.Miller:Experime
nts in Molec.Gen.、Cold Spring Harbor Lab.、1972）
で約1:100に希釈して、増殖をOD測定によって追う。OD
＝0.5において、培養菌液をイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（IPTG）で濃度2mMに調整する。1
50〜180分の後、細菌を遠心分離する。これら細菌を緩
衝混合液（7M尿素、0.1％SDS、0.1M燐酸ナトリウム、pH
7.0）中で約５分間処理して、試料をSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動プレートに供する。これによって、二
機能性タンパク質の発現が確認される。
以上の条件は、振とう培養にも適用される。より大規
模の培養では、OD値および栄養培地を修飾し、IPTG濃度
を適当に変えることが有利である。
例4: プラスミドpB30またはpB31を含む大腸菌W3110の細胞
を、誘発後、遠心分離して、燐酸ナトリウム緩衝液（pH
7）に再懸濁させ、再び遠心分離する。菌体を同じ緩衝
液に懸濁させて、破壊する（フレンチプレス、Dynomill
（商標））。破壊された細胞を遠心分離する。例３のよ
うにして、上清および沈澱物をSDSポリアクリルアミド
ゲル電気泳動で分析する。タンパク質バンドを染色する
ことによって、二機能性タンパク質は、破壊物からの沈
澱物中に含まれていることが明らかになる。沈澱物をカ
オトロープ（chaotropic）緩衝液で数回洗浄し、最後に
水で数回洗浄する。その結果、所望のタンパク質がより
高濃度で得られる。次いで、タンパク質濃度をタンパク
質の水懸濁液で測定する。この懸濁液を、5M塩化水素グ
アニジウムおよび2mMジチオスレイトール（DTT）の濃度
に調整する。混合液を窒素下で約30分間撹拌して、次い
で、50mMトリス緩衝液（pH8.5）で希釈して、タンパク
質濃度を100μg/mlにする。このトリス緩衝液に対して
透析を行う。この緩衝液を２度交換した後、さらに、水
に対して透析する。このように処理したタンパク質を無
菌的に濾過し、その生物学的活性を調べる。インターロ
イキン２依存型CTLL2細胞増殖アッセイおよびヒト骨髄
アッセイの双方における完全な生物学的作用を示す。顆
粒球およびマクロファージとが混合したコロニーが、こ
れらの中に認められる。
この二機能性タンパク質は、インターロイキン２特異
性アフィニティ・クロマトグラフィーによって、さらに
精製することができる。該タンパク質は、両アッセイ法
において、なお、活性を示す。これとは対照的に、記述
のように処理した非形質転換大腸菌株のW3110の抽出物
は、活性を示さない。
製品製造のための工業的調整のためには、他の条件、
例えば、タンパク質のフォールディング（folding）お
よびその精製なども、便宜的に用いられる。適当な精製
工程は、既知のものであって、イオン交換、吸着、ゲル
濾過および調製用HPLCクロマトグラフィーである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の二機能性タンパク質をコードするプ
ラスミドpB30の構築を図示する、説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】生物学的に活性なインターロイキン２（1L
    −２）構成成分および顆粒球マクロファージ・コロニー
    刺激因子（GM−CSF）構成成分からなる、二機能性タン
    パク質。
  2. 【請求項２】二つの生物学的に活性なタンパク質構成成
    分が、遺伝子的にコード可能な１〜約20個のアミノ酸か
    らなるブリッジによって連結したものである、請求項１
    に記載のタンパク質。
  3. 【請求項３】ブリッジが式（II）に対応するものであ
    る、請求項２に記載タンパク質。 −Asp−（aa）Ｘ−Pro− （II） 式中、ｘは１から18までの整数を表し、aaは、遺伝子的
    にコード可能なシステイン（Cys）以外のアミノ酸を表
    す。
  4. 【請求項４】ブリッジ因子（aa）Ｘが次のアミノ酸配列
    を表す、請求項３に記載のタンパク質。 −Asp−Pro−Met−Ile−Thr−Thr−Tyr−Ala−Asp−Asp
    −Pro−または−Pro−Met−Ile−Thr−Thr−Tyr−Leu−
    Glu−Glu−Leu−Thr−Ile−Asp−Asp−
  5. 【請求項５】IL−２構成成分をＮ末端に配置し、GN−CS
    F構成成分をＣ末端に配置する、先行の請求項の１項ま
    たはそれ以上に記載のタンパク質。
  6. 【請求項６】二機能性タンパク質をコードする遺伝子
    の、構築および宿主細胞中での発現からなる、請求項１
    〜５のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質の製造
    法。
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