HU204303B - Process for producing bifunction proteines - Google Patents
Process for producing bifunction proteines Download PDFInfo
- Publication number
- HU204303B HU204303B HU881966A HU196688A HU204303B HU 204303 B HU204303 B HU 204303B HU 881966 A HU881966 A HU 881966A HU 196688 A HU196688 A HU 196688A HU 204303 B HU204303 B HU 204303B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- asp
- thr
- pro
- csf
- plasmid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Description
A találmány-tárgya eljárás bifunkciós fehérjék előállítására.
Azhiterleukin-2, a továbbiakbanIL-2 T-sejt növekedési faktorként hat. Az IL-2 erősíti agyilkos sejtek (Killer sejt), így az NK sejtek (Natural Killer sejt), a citotoxikus T-sejtek és a LAK sejtek (Lymphokine ActivatedKílIer sejtek) aktivitását.
AgranuIorítamakrofág„CoIonyStimuIating”-faktor, a továbiakban GM-CSF, azonban a granulocita és makrofág képződést stimulálja a vérképző elősejtekben. Akétbiológiaihatáskombinálása a tumor kezelésénél jelentős, mind citosztatikum adagolással együt, mind citosztatikum nélkül. Az IL-2 és a GM-CSF azonban különböző stabilitást mutat, amely a két komponens közvetlen adagolása esetén jelent problémákat, és csökkenti a terápiás kezelés sikerét.
Azt találtuk, hogy a különböző stabilitásból eredő problémák kiküszöbölhetők, ha a két fehérjét egy bifunkciósfehérjévékapcsoljuk.
Ismertekaz(ra)vagy(Ib) általános képletű Met-X-Y-Z (Ta)
Met-Z-Y-X (lb) fúziós fehérjék, amelyek az adott esetben módosított GM-CSF géntechnológiai előállításáhozhasználhatók, a képletben
X jelentése az előnyösen humán IL-2 mintegy első 100 aminosavjával lényegében azonos aminosav szekvencia,
Y jelentése közvetlen kötés, ha a kívánt fehérjével szomszédos aminosav vagy aminosav-szekvencia a kívánt fehérje lehasítását lehetővé teszi, vagy olyan egy vagy több genetikailag kódolható aminosavból álló híd, amelyalehasítástlehetővé teszi,
Z jelentése genetikailag kódolható aminosavak szekvenciája, amely a kívánt GM-CSF fehérjénekfelelmeg.
Ennek során azIL-2-tkódolóDNS szekvencia többé vagy kevésbé teljes mértékben felhasználható, és így,.melléktermékként adott esetben módosított, biológiailag aktív IL-2 keletkezik (a bejelentés elsőbbsége utánnyüvánosságra jutottO 228 018 számú európai közrebocsátási irat és 86/9557 számú dél-afrikai szabadalmileírás).
Az ismert eljárásokkal ellentétben a találmány értelmében a fehérjét nem köztitermékként alkalmaz- zuk, hanem az emberi test terápiás kezeléséhez. A találmány tehát ilyen fúziós fehérjék és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerek előállítására vonatkozik, amely rosszindulatú daganatok kezelésére alkalmazható. (
A találmány szerint előállított fúziós fehérje tehát két biológiailag aktív részből, egyrészt egy IL-2 részből, amely önmagában ismert módon módosítva lehet, és másrészt egy GM-CSF részből áll, amely szintén módosítva lehet, amelyek adott esetben egy hídszaka- £ szón keresztül kapcsolódnak, amit a képletben Y jelöl. Akét komponens előnyös elhelyezkedését az (la) képlet mutatja. A találmány szerinti eljárással más, új, bifunkciós fehérjékis előállíthatok.
Az ábra a pB30 plazmid előállítását mutatja, amely a találmány szerinti bifunkciós fehérjét kódolja. Az ábrán belüli zárójelbe tett számok a hivatkozási jeleket jelölik.
Az IL-2 molekulájának módosítása ismert, példa5 szerűen idézhető a 0 091 529,0 109 748,0 118 617, Q136 489 és 0163 249 számú európaiközrebocsátási irat. Az elsőbbség után nyilvánossára juttatott 0219 839 számú európaiközrebocsátási iratban olyan IL-2származékotismertetnek, amelyből kiiktatták az első hét N-terminális aminosavat.
A GM-CSF molekula módosítását a 0 228 018 számú európaiközrebocsátási irat ismerteti.
Akét aktív molekularészen önmagában ismert módon további átalakítások is végrehajthatók, amelyek közül példaszerűen a specifikus mutációt említjük. Yhídszakaszként előnyösen alkalmazható a (Π) általános képletű
-Asp-(AS)X-Pro (H) szakasz, ahol >0 xértéke20 alatti egészszám,
As jelentése risztemtől eltérő, tetszőleges, genetikailagkódolható aminosav.
A (Π) általános képletben a bal oldalon előnyösen az
IL-2 rész, és ennekmegfelelően a jobb oldalon a GMiö Crészhelyezkedikel.
Hídszakaszként különösen alkalmazhatók a következő szekvenciák:
-Asp-Pro-Met-He-Thr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Asp-Provagy
Asp-Pro-Met-He-Ihr-Ihr-Tyr-Leu-Glu-Glu-Leu -Thr-He-Asp-Asp-Pro-, amelyeknél bal oldalon előnyösen az IL-2 rész és jobb oldalona GM-CSF részhelyezkedik el. Az Yhídszakaszként alkalmazott oligonukleotid önmagában 5 ismertmódon,példáulafoszfitmódszerrel (33 27007,
28 793,34 09 066,34 14 831 és 34 19 995 számú NSZK-beliközrebocsátási iratok) előállítható.
A találmány szerint előállított bifunkciós fehérje kifejezése önmagában ismert módon megvalósítható.
) Baktériumban történő kifejezéshez alkalmazható a közvetlen kifejezés módszere. Ennek során bármely ismert gazda-vektor rendszer felhasználható, olyan gazdabaktériumoknál, mint például Streptomyces, B. subtilis, Salmonella typhimurium vagy Serratia mar) cescens,eIőnyösenE.coIi.’
Akívántfehérjét kódoló DNS szekvenciát önmagá,ban ismert módon egy vektorba építjük be, amely a kiválasztott kifejező rendszerben biztosítja a megfelelő kifejezést.
1 Ebből a célból valamely promotert és operátort, előnyösen trp, lac, tac, PL vagy PR a lambda fágból, hsp, omp vagy szintetikus promotert alkalmazunk (például
30 683 számú NSZK-beli közrebocsátási irat és 0173149számúeurópaiközrebocsátásiirat).Előnyösen alkalmazható a kereskedelmi forgalomban lévő tac-promoter-operátor szekvencia (például pKK2233 kifejező vektor, Pharmacia, „Molecular Biologicals, Chemicals andEquipmentfor Molecular Biology”, 63 /1984/).
A találmány szerinti fehérjék kifejezése közben el2
HU 204303 Β ó'nyös lehet, ha az ATG-Start-KÓDON utáni első axninosavak triplettjét megváltoztatva megakadályozzuk az mRNS szintjén lejátszódó bázispárosodást. Az ilyen változtatás, például egyes aminosavak kiiktatása v&gy beépítése, szakember számára közismert.
Élesztőben, előnyösen S. cerevisiae-ben történő kifejezéshez előnyösen valamely kiválasztó rendszert, például α-faktor-rendszeren keresztül történő heterológ kifejezést választunk.
A bifunkciós molekulák élesztőben történő kifejezése esetén előnyös lehet, ha a dibázikus peptidszekvenciákat, és glikoziláló helyeket az egyes aminosavak kicserélésével a bifunkciós fehérjében 'elroncsoljuk. Ennek során olyan kombinációs lehetőségek is adódnak, amelyek a biológiai hatást befolyásolják.
Az IL-2 élesztőben történő kifejezést a 0 142 268 számú európai közrebocsátási irat, a GM-CSF élesztőben történő kifejezését a 0 188 350 számú európai közrebocsátási irat ismerteti.
A találmány szerinti bifunkciós fehérje adagolását a két komponens adagolásával azonos módon végezzük. A javított stabilitás miatt azonban sok esetben alacsonyabb dózis is elegendő, amely kívül eshet az eddig javasolt dózishatárokon.
A találmány szerinti eljárást közelebbről az alábbi példákkal világítjuk meg. A példákban említett műveletek egy részét T. Maniatis, E. F. Fritsch és J. Sambrook „Molecular Cloning, a Laboratory Manual” című könyvében (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, /1982/) részletesen és reprodukálhatóan leírták. Tekintettel arra, hogy a következő példákban e műveletek többszörösen szerepelnek, az alábbiakban hivatkozási listát közlünk, amelyben hivatkozási szám mellett az adott művelet és a fent említett könyv egy-egyx oldalszáma szerepel; a példa vonatkozó részében csak a hivatkozási számot adjuk meg, amelyhez a lista alapján a pontos irodalmi hely nehézség nélkül hozzárendelhető.
1. DNS vágása, plazmid nyitása: 104. oldaltól kezdve, valamint az enzimet előállító cég prospektusa,
2. Exonukleázos kezelés rövidítés céljából: A Bal31 enzimet alkalmaztuk, lásd 135. oldal,
3. DNS-fragmensek izolálása
A DNS-fragmensek szétválasztása gél-elektroforézis útján, agaróz-gél segítségével (150-172, oldal), vagy—rövid, azaz 1 kb-nál kisebb fragmensek esetén —poliakrilamid-gél segítségével (173-181. oldal) történik.
4. Ligálás: 146. oldal
5. DNS-fragmens plazmidba történő bevitele: 390. oldal
6. E. coli sejtek transzformálása: 249-251. oldal.
7. Restrikciós elemzés: 104. oldal.
A hivatkozási számokat szögletes zárójelben tüntetjük fel, hogy a rajzokra való hivatkozásoktól megkülönböztethetők legyenek.
1. példa
Apl59/6 plazmid (1985-ben nyilvánosságra jutott 0163 249 számú európai közrebocsátási irat, 5. ábrája, a jelen bejelentésben az ábrán (1)) egy EcoRI és egy
Sáli hasítóhely között egy szintetikus, IL-2 kódoló gént tartalmaz. A gén DNS szekvenciáját a 0163 249 számú európai közrebocsátási irat, ,1 DNS szekvencia” néven ismerteti. A127 és 128 tripletten belül egy Taqlhasítóhely található. AplazmidbólEcoRI és Taql enzimmel történő hasítással [1] kivágjuk és izoláljuk azIL-2 rész-szekvenciát (2) [3j.
Az 1986-ban nyilvánosságra jutott 0 183 350 számú európai közrebocsátási iratból ismert pHG23 plazmid (3), amely GM-CSF-et kódol. A GM-CSF cDNS-t az idézett irat 2. ábrája ábrázolja. Az idézett irat szerint a pHG23 plazmid előállítható, ha a cDNS szekvenciát önmagában ismert módon beépítjük a pBR322 Psű hasítóhelyére, amelynek során az 5’-végén lévő Psű hasítóhelyet, és a 3’-végre GC-toldalékképzéssel (Tailing) bevitt Psűhelyet alkalmazunk. Ebből a plazmidból SfaNI és Psű enzimmel végzett hasítással [1] izoláljuk (4) DNS szekvenciát [3], amely a GM-CSF génnagy részét tartalmazza.
Az ismert foszfit-eljárások bármelyikével (például 33 27 007 számú NSZK-beli közrebocsátási irat szerint) a következő (5) oligonukleotidot szintetizáljuk: 128 (133)
He He Ser Thr Leu Asp Pro Met He
CG ATC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATC
TAGTAGAGATGGGACCTGGGCTACTAG (tAQi) (5)
2
Thr Thr Tyr Ala Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
ACC ACC TAT GCG GAC GAT CCG GC
TGGTGGATACGC CTGCTAGGC CGT GGG (SfaNI)
Az oligonukleotid (5) az 5’-végen az IL-2 DNS szekvenciát egészíti ki, ahol azonba na 133 helyen Thr helyett Asp áll.
Az oligonuldeotid 3 ’-végén található az a nukleotid, amely az SfaNI enzimmel végzett hasítással [1] a cDNS-bőlváltle.
A pEWlOOO kifejező plazmid (6) előállítását a (1987. július 8-án nyilvánosságra jutott) 0 227 938 számú európai közrebocsátási irat (1. ábra) ismerteti. Ez a plazmid a ptac 11 plazmid (Amman és munkatársai: Gene 25,167-178 /1983/) származéka, amelyben az EcoRI felismerőhelyre egy Sáli hasítóhelyet tartalmazó szintetikus szekvencia van beépítve. így a pKK
177.3 kifejező plazmidot kapjuk, amelyből lac-represszor (Farabaugh: Natúré, 274,765-769/1978/) beépítésével a pJFl 18 plazmidot kapjuk. Ezt az egyetlen Avalhasítóhelyenfelnyitjuk [1], és önmagában ismert módon exonukleáz kezeléssel mintegy 1000 bp szakasszal megrövidítjük [2] és Iigáljuk [4]. így pEWlOOO plazmidto (6) kapunk. A plazmidot a polilinkerben EcoRI és Psű enzimekkel felnyitva [1] a (7) linearizált kifejező plazmidot kapjuk.
AlinearizáltplazmidDSN-t (7) az IL-2 szekvenciát kódoló DNS fragmenssel (2) a szintetikus oligonukleo3
HU 204 303 Β tuddal (5) és a cDNS fragmenssel (4) ligáljuk [5], így pB30 plazmid (8) keletkezik, amelyet E. coli MclOól törzsbe transzformálunk [6j. Az egyes klónokplazmid DNS-étizoláljuk[3J, ésrestrikciós analízissel [7] jellemezzük
2. példa
Az 1. példában leírt módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy az (5) oh'gonukleotid helyett az alábbi szintetikus oligonukleotidot alkalmazzuk 128 (133)
HeEeSerThrLeuAspEroMetlleThrThrTyr
CG ATC ATC TCT ACC CTG GAC CCG ATG ATCACCACCTAT
TAG TAG AGA TGG GAC CTG GGC TAC TAG TGGTGGATA (Taql) (5)
2
Leu Glu GIuLeu ThrBe Asp Asp Pro (Ala) (Pro)
CTA GAA GAG CTC ACG ATC GAC GAT CCG GC
GAT CIT CTC GAG TGC TAG CTG CTA GGC CGTGGG (SfaND ígypB31plazmidotkapunk
3. példa
A W3110 E. coli törzs megfelelő sejtjeit pB30 vagy pB31 plazmiddal transzformáljuk [6]. A törzset egy éjszakán keresztül tenyésztjük majd 50 μg/ml ampicilíínt tartalmazó LB-közeggel (I. EL Miller: Experiments ín Molec. Gén., Cold Spring Harbor Láb., /1972/) mintegy 1:100 arányban hígítjuk és a növekedést OD-méréssel ellenőrizzük OD-0,5 értéknél a tenyészetet 2 mmól/1 izopropil-p-D-tio-galakto-piranozid (DPTG) koncentrációra állítjuk és a baktériumokat 150-180 perc után lecentrífugáljuk A baktériumokat mintegy 5 percen keresztül puffer-elegyben (7 mól/1 karbamid, 0,1 tömeg% SDS, 0,1 mól/1 nátrium-foszfát, pH- 7,0) kezeljük és amíntákatSDS poliakrilamid-gélelektroforézis lemezre visszük A bífunkciősfehérjekifejezésétígy ellenőrizzük A megadott körülmények rázókultűrára vonatkoznak nagyobb fermentációknál megfelelően módosított OD-értéket, tápközeget és IPTG koncentrációt célszerű alkalmazni,
4. példa
Az ndukció után a pB30 vagy pB31 plazmidot tartalmazó E. coli W3110 sejteket lecentrifugáljuk nátrium-foszfát pufferben (pH- 7) ismét szuszpendáljuk és ismét lecentrifugáljuk a baktériumokat a fentipufferben felvesszük és feltárjuk (French Press, Dynomalom). A feltárt sejteket lecentrifugáljuk A felülúszót és az üledéket SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel a 3. példábanleírtmódon analizáljuk Afehérjesávok elszíneződése azt mutatja, hogy a bifunkciós fehérje afeltártsejteküledékében található. Az üledéket kaotrőp pufferrel többször mossuk, vízzel öblítjük, miáltal a kívánt fehérjét feldúsítjuk A vizes fehérjeszuszpenzióban meghatározzuk afehérjekoncentrációt. A szuszpenziót 5 mól/1 guanidinium-hidroklorid és 2 mmól/1 ditiotreitol (DTT) koncentrációéra állítjuk 5 Az elegyet mintegy 30 percen keresztül nitrogén atmoszféra alatt keverjük, majd 50 mmól/1 trisz-pufferrel (pH- 8,5) 100 μξ/ηύ fehérjekoncentrációra hígítjuk Ezután a trisz-pufferrel szemben dializáljuk és kétszeres puffer csere után vízzel szemben dializáljuk 10 Az így kezelt fehérjét sterilen szűrjük és ellenőrizzük biológiai aktivitását. A fehérje mind azInterleukin-2függő CTLL-2-sejtproliferációs vizsgálatban (Taniguichi és munkatársai Natúré 302,305-309 /1983/), mind a humán csontvelő viszgálatban (Watson és 15 munkatársai: Lymphokines 6,95f,/1982/) teljes biológiai hatást mutat. Ennek során egyes granulocita, makrofágtelepekfigyelhetőkmeg.
AbifunkcíósfehérjeIhterleukin-2-respecifikusaffínitás-kromatográfiával tovább tisztítható. Ehhez 20 20 mg monoklonális IL-2 antitestet 15 ml 0,5 mól/1 kálium-foszfátpufferben (pH-7,5) oldunk, és2ghordozón (Eupergit C/6586-76) rögzítjük Ezután az antitest oldatot szűrjük és a hordozón adott esetben jelenlévő funkciós csoportokat 10 tömeg%-os etanola25 min oldattal (pH- 9) 1 óra alatt inaktiváljuk
Afenti előkezelt hordozót 3,1 ml térfogatú affinításoszlopba töltjük, és 88 ml 50 mmól/1 Trisz-HCl pufferrel (pH- 7,5) kiegyensúlyozzuk Ezután 35 perc alatt 22 ml dializált bifunkcionális fehérje oldatot ve30 zetünkaz oszlopra. 20 ml mosóoldattal (1 mól/1 NaCl, 10 mmólÁ Trisz, pH- 7,5) mossuk és a fényelnyelést (OD) 280 mm-nél mérjük 20 ml mosóoldat áteresztése után (1 ml/perc) a fényelnyelés OD- 0 értékre csökken. Ezután 20 ml pufferrel (0,5 vegyes% Nonidet 35 P40,10 mmól/1 Trisz-HCl, pH- 7,5), 45 ml 10 mmól/1 Trisz pufferrel (pH-7,5) és 20 ml vízzel mossuk Végül 5x1 ml 0,2 n ecetsavval eluáljuk A frakciókat 1 mól/l Trisz-HCl pufferrel (pH- 8) semlegesítjük és vizsgáljuk a biológiai aktivitást. A fehérje ezután is mindkét 40 vizsgálatban aktív. Ezzel szemben a transzformálás nélküliE. coliW3110 törzs extraktuma semmilyen aktivitástnemmutat.
A termék ipari előállításához, például a fehérje hasításához és tisztításához más körülmények szüksége45 sek Önmagában ismert tisztító eljárásként alkalmazható ioncsere, adszorpció, gélszűrés és preparatív . HPLC-kromatográfia.
Claims (4)
- 5θ SZABADALMIIGÉNYPONTOK1. Eljárás bifunkciós fehérjék előállítására, amelyek biológiailag aktív lhterleukin-2 (IL-2) és granulocita makrofág „Colony Stimulating” faktor (GM-CSF) részből állnak, ahol a két biológiailag aktívfehérjerész55 egy 1-20 genetikailag kódolható aminosavból álló hídszakaszon keresztül kapcsolódik azzal jellemezve, hogy a fenti fehérjéket kódoló gént állítunk elő, és ezt egygazdasejtbenfejezzükki.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, nzzűZ/'c/Zemezve,60 hogy(D)általánosképletűHU 204303 Β-Asp-(As)x-Pro- (Π) hídszakasztalkalmazunk,aképletben x értéke 1-18 közötti egész szám,As jelentése cisz-től eltérő, genetikailag kódolható aminosav.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy(As)xhelyén-Asp-Pro-Met-Be-Thr-Thr-Tyr-AIa-Asp-Asp-vagy-Pro-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Leu-Glu-Glu-Leu-Thr-Be-Asp-Aspaminosav szekvenciát tartalmazó hídszakaszt alkalmazunk.
- 5 4. A 2. vagy 3. fénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy N-tenninálison elhelyezkedő IL-2 részt és C-terminálison elhelyezkedő GM-CSF részt alkalmazunk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873712985 DE3712985A1 (de) | 1987-04-16 | 1987-04-16 | Bifunktionelle proteine |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT47319A HUT47319A (en) | 1989-02-28 |
| HU204303B true HU204303B (en) | 1991-12-30 |
Family
ID=6325799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU881966A HU204303B (en) | 1987-04-16 | 1988-04-15 | Process for producing bifunction proteines |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0288809B1 (hu) |
| JP (1) | JP2667193B2 (hu) |
| KR (1) | KR970000187B1 (hu) |
| AR (1) | AR242991A1 (hu) |
| AT (1) | ATE79135T1 (hu) |
| AU (1) | AU613022B2 (hu) |
| CA (1) | CA1322157C (hu) |
| DE (2) | DE3712985A1 (hu) |
| DK (1) | DK170741B1 (hu) |
| ES (1) | ES2033981T3 (hu) |
| FI (1) | FI98830C (hu) |
| GR (1) | GR3006141T3 (hu) |
| HU (1) | HU204303B (hu) |
| IE (1) | IE61574B1 (hu) |
| IL (1) | IL86086A (hu) |
| NO (1) | NO176922C (hu) |
| NZ (1) | NZ224247A (hu) |
| PH (1) | PH25327A (hu) |
| PT (1) | PT87237B (hu) |
| ZA (1) | ZA882659B (hu) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5662896A (en) * | 1988-03-21 | 1997-09-02 | Chiron Viagene, Inc. | Compositions and methods for cancer immunotherapy |
| US5225538A (en) * | 1989-02-23 | 1993-07-06 | Genentech, Inc. | Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins |
| US5116964A (en) * | 1989-02-23 | 1992-05-26 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| US6406697B1 (en) | 1989-02-23 | 2002-06-18 | Genentech, Inc. | Hybrid immunoglobulins |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US5108910A (en) * | 1989-08-22 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | DNA sequences encoding fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| US5073627A (en) * | 1989-08-22 | 1991-12-17 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising GM-CSF and IL-3 |
| ATE103932T1 (de) * | 1989-08-22 | 1994-04-15 | Immunex Corp | Fusionsprotein bestehend aus gm-csf und il-3. |
| US5376367A (en) * | 1991-11-22 | 1994-12-27 | Immunex Corporation | Fusion proteins comprising MGF and IL-3 |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| WO1999029732A2 (en) | 1997-12-08 | 1999-06-17 | Lexigen Pharmaceuticals Corporation | Heterodimeric fusion proteins useful for targeted immune therapy and general immune stimulation |
| SK782002A3 (en) | 1999-07-21 | 2003-08-05 | Lexigen Pharm Corp | FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens |
| MXPA02001417A (es) | 1999-08-09 | 2002-08-12 | Lexigen Pharm Corp | Complejos multiples de citosina-anticuerpo. |
| AU1551801A (en) * | 1999-11-30 | 2001-06-12 | Shionogi & Co., Ltd. | Chemokine slc-il2 fused protein and gene thereof |
| EP1252192B1 (en) | 2000-02-11 | 2006-08-16 | MERCK PATENT GmbH | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
| DK1366067T3 (da) | 2001-03-07 | 2012-10-22 | Merck Patent Gmbh | Ekspressionsteknologi for proteiner indeholdende en hybrid isotype-antistof-enhed |
| US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
| BR0209177A (pt) | 2001-05-03 | 2004-10-05 | Merck Patent Gmbh | Anticorpo especìfico a tumor recombinante e uso do mesmo |
| EP2292271A3 (en) | 2001-10-10 | 2011-09-14 | BioGeneriX AG | Remodelling and glycoconjugation of an antibody |
| PT1454138E (pt) | 2001-12-04 | 2012-03-28 | Merck Patent Gmbh | Imunocitoquinas com seletividade modulada |
| CA2510180C (en) | 2002-12-17 | 2012-09-11 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschraenkter Haftung | Humanized antibody (h14.18) of the mouse 14.18 antibody binding to gd2 and its fusion with il-2 |
| ES2359473T3 (es) * | 2003-07-21 | 2011-05-23 | Transgene S.A. | Citoquinas multifuncionales. |
| DE602004031341D1 (de) | 2003-07-21 | 2011-03-24 | Transgene Sa | Multifunktionelle cytokine |
| WO2010001414A1 (en) * | 2008-07-03 | 2010-01-07 | Lupin Limited | Expression of heterologous proteins in bacterial system using a gm-csf fusion tag |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| WO1985004673A1 (en) * | 1984-04-10 | 1985-10-24 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and its use |
| DE3419995A1 (de) * | 1984-05-29 | 1985-12-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Gentechnologisches verfahren zur herstellung von human-interleukin-2 und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens |
| AU588819B2 (en) * | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| JPS61128889A (ja) * | 1984-11-27 | 1986-06-16 | Green Cross Corp:The | 組換えｄｎａ及び該ｄｎａによる形質転換体 |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| JPS63502795A (ja) * | 1985-10-03 | 1988-10-20 | バイオジェン インコーポレイテッド | 顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子‐様ポリペプチド、ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子並びに微生物細胞中でヒト顆粒球−マクロファ−ジコロニ−刺激因子−様ポリペプチドを高収量で生産する方法 |
| DE3541856A1 (de) * | 1985-11-27 | 1987-06-04 | Hoechst Ag | Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
-
1987
- 1987-04-16 DE DE19873712985 patent/DE3712985A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-09 DE DE8888105693T patent/DE3873397D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-09 AT AT88105693T patent/ATE79135T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-09 EP EP88105693A patent/EP0288809B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-09 ES ES198888105693T patent/ES2033981T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-14 FI FI881743A patent/FI98830C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-04-14 PT PT87237A patent/PT87237B/pt active IP Right Grant
- 1988-04-14 NZ NZ224247A patent/NZ224247A/en unknown
- 1988-04-15 NO NO881658A patent/NO176922C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 AR AR88310585A patent/AR242991A1/es active
- 1988-04-15 JP JP63093321A patent/JP2667193B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-15 HU HU881966A patent/HU204303B/hu not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 DK DK209188A patent/DK170741B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 IL IL8608688A patent/IL86086A/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 AU AU14661/88A patent/AU613022B2/en not_active Ceased
- 1988-04-15 IE IE114688A patent/IE61574B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-04-15 CA CA000564322A patent/CA1322157C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-04-15 ZA ZA882659A patent/ZA882659B/xx unknown
- 1988-04-16 KR KR1019880004345A patent/KR970000187B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-04-14 PH PH36799A patent/PH25327A/en unknown
-
1992
- 1992-11-04 GR GR920402185T patent/GR3006141T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI98830B (fi) | 1997-05-15 |
| EP0288809A1 (de) | 1988-11-02 |
| ZA882659B (en) | 1988-10-14 |
| PT87237B (pt) | 1992-07-31 |
| KR970000187B1 (ko) | 1997-01-06 |
| EP0288809B1 (de) | 1992-08-05 |
| DE3873397D1 (de) | 1992-09-10 |
| DE3712985A1 (de) | 1988-11-03 |
| NO176922B (no) | 1995-03-13 |
| FI881743A (fi) | 1988-10-17 |
| FI881743A0 (fi) | 1988-04-14 |
| GR3006141T3 (hu) | 1993-06-21 |
| HUT47319A (en) | 1989-02-28 |
| JP2667193B2 (ja) | 1997-10-27 |
| DK170741B1 (da) | 1996-01-08 |
| NO881658D0 (no) | 1988-04-15 |
| CA1322157C (en) | 1993-09-14 |
| AU1466188A (en) | 1988-10-20 |
| IE61574B1 (en) | 1994-11-16 |
| AR242991A1 (es) | 1993-06-30 |
| DK209188A (da) | 1988-10-17 |
| NO881658L (no) | 1988-10-17 |
| PT87237A (pt) | 1988-05-01 |
| NZ224247A (en) | 1990-04-26 |
| DK209188D0 (da) | 1988-04-15 |
| NO176922C (no) | 1995-06-21 |
| ES2033981T3 (es) | 1993-04-01 |
| KR880012760A (ko) | 1988-11-29 |
| IL86086A (en) | 1995-01-24 |
| FI98830C (fi) | 1997-08-25 |
| IE881146L (en) | 1988-10-16 |
| PH25327A (en) | 1991-04-30 |
| AU613022B2 (en) | 1991-07-25 |
| IL86086A0 (en) | 1988-09-30 |
| JPS63301898A (ja) | 1988-12-08 |
| ATE79135T1 (de) | 1992-08-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU204303B (en) | Process for producing bifunction proteines | |
| US5359035A (en) | Bifunctional proteins including interleukin-2 (IL-2) and granuloctyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) | |
| KR940005585B1 (ko) | 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법 | |
| KR920009505B1 (ko) | 인체 γ－인터페론 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조방법 | |
| PL149079B1 (en) | Method of obtaining polypeptides of ifn-beta type | |
| IE870591L (en) | Hybrid interferons | |
| HU212836B (en) | Method for producing canine and equine interferons | |
| US5180811A (en) | Proteins having a tnf action comprising tnf-fibromectin fusion protein | |
| JPS6229600A (ja) | 融合タンパク質、その生産方法及びその用途 | |
| HU213566B (en) | Process for producing equine interferon-gamma | |
| JP2000060577A (ja) | 成熟ヒトインタ―ロイキン１タンパク質 | |
| KR20000005683A (ko) | 펩타이드항생물질의대량생산방법,그에유용한유전자구조물및발현시스템 | |
| HU205617B (en) | Process for producing neturophyl-activating factor, gene coding this and pharmaceutical composition | |
| EP0256424B1 (en) | Homogeneous recombinant immune interferon fragments and pharmaceutical compositions containing same | |
| AU617999B2 (en) | A genetic engineering process for the preparation of angiogenins | |
| JPH0463595A (ja) | ヒトインターロイキン３誘導体 | |
| EP0207165A1 (en) | Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms | |
| NZ224371A (en) | Method for purifying granulocyte-macrophage colony stimulating factor (gm-csf) | |
| JPH0691832B2 (ja) | ポリペプチドの産生を向上する方法 | |
| CA2225517A1 (en) | Haemopoietic growth factor antagonists and uses therefor | |
| GB2210618A (en) | Synthetic gene | |
| JPH04327599A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド | |
| JPH02119793A (ja) | 新規ポリペプチド | |
| JPS63160598A (ja) | 新規生理活性ポリペプチド | |
| JPH01206994A (ja) | 組換えベクター |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |