JPS63301898A - 二機能性タンパク質 - Google Patents

二機能性タンパク質

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JPS63301898A JP63093321A JP9332188A JPS63301898A JP S63301898 A JPS63301898 A JP S63301898A JP 63093321 A JP63093321 A JP 63093321A JP 9332188 A JP9332188 A JP 9332188A JP S63301898 A JPS63301898 A JP S63301898A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン２（以下、Ｉ　Ｌ−２という）は、Ｔ
細胞増殖因子として作用する。ＩＬ−２は、ＮＫ（ナチ
ュラルキラー）細胞、細胞毒性Ｔ細胞およびＬＡＫ（リ
ンホカイン活性化キラー）細胞のようなキラー細胞活性
を助ける。
これに対比して、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激
因子（以下、ＧＭ−ＣＳＦという）は、造血性前駆細胞
からの顆粒球およびマクロファージの形成を促進する。
これら二つの生物学的活性の組合せは、細胞発達阻止剤
の投与および非投与におけるヒトの治療のために興味が
もたれる。しかしながら、ＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦ
の安定性は異なっており、このことがこれら二成分因子
の直接的投与に問題を生じさせ、治療効果を低減させる
ものと考えられる。
安定性の違いの問題は、本発明によって、これら二つの
タンパク質を二機能性タンパク質に結合させることで解
決することができる。
一般式、 Ｍ　ｅ　ｔ　−Ｘ　−Ｙ−ＺまたはＭ　ｅ　ｔ、　−Ｚ
　−Ｙ　−Ｘ（Ｉａ）　　　　　　　　　　　　　（Ｉ
ｂ）の融合タンパク質は、必要に応じて修飾したＧＭ−
Ｃ９Ｆの、遺伝子操作による調製が既に提示されている
。式中、Ｘは、本質的には、Ｉ　Ｌ−２、好ましくはヒ
トのＩ　Ｌ−２、のほぼ最初の１００個のアミノ酸配列
を表し、Ｙは、所望のタンパク質に隣接したアミノ酸ま
たはアミノ酸配列によって所望のタンパク質の切り離し
が可能な場合には、直接結合を表し、そうでない場合に
は、１個以上の遺伝子的にコード可能なアミノ酸からな
り、かつ、切り離しを可能にするブリッジ部分を表し、
ざらに、Ｚは、′遺伝子的にコード可能なアミノ酸から
なり、かつ、所望の ＣＭ−ＣＳＦタンパク質を表す配列である。この間に、
さらに、Ｉ　Ｌ−２をコードするＤＮＡ配列のほぼ最後
部までを利用することも可能であって、適宜に修飾して
、生物学的に活性な！Ｌ−２を「副産物」として産生さ
せる（公開前の欧州特許（ＥＰ−Ａ）出願第０．２２８
，０１８号明細書および南アフリカ共和国特許第８８／
９５５７号明細書）。
従来の提案とは対照的に、本発明は、これらタンパク質
の中間体としての使用に関するものではなく、ヒト生体
の治療法への利用、およびこのタイプの融合タンパク質
を含む、または、このタイプの融合タンパク質からなる
医薬品に関する。さらに、本発明は、これら融合タンパ
ク質の、悪性腫瘍の治療用の医薬品の調製のための利用
に関する。
本発明で用いられる融合タンパク質は、したがって、二
つの生物学的に活性な構成成分からなる。
すなわち、一つは、既知の方法で修飾できるＩ　Ｌ−２
であり、他の一つは一同様に修飾が可能なＣＭ−ＣＳＦ
構成成分である、二つの構成成分からなり、さらに必要
であれば、上記式中に定義されたＹに対応するブリッジ
部分とからなる。二構成成分の配置は、式１ａに対応す
るものが好ましい。本発明の原理は、また、他の新規な
二機能性タンパク質の調製にも用いることができる。
第１図は、本発明の二機能性タンパク質をコードするプ
ラスミドｐＢ３０を示す。
ｌ　Ｌ−２分子の修飾は、開示されているが、ここでは
、例として、ＥＰ−Ａ明細書第０．０９１，５３９号、
第０．１０９，７４８号、第０．１１８，６１７号、第
０．１３６，４８９号および第０．１６３，２４９号の
みを引用する。
さらに、公開前のＥＰ−Ａ第０．２１９，８３９号明細
書は、最初の７個のＮ−末端アミノ酸を欠失しているＩ
　Ｌ−２誘導体を提示している。
ＧＭ−ＣＳＦ分子の修飾は、ＥＰ−Ａ第０．２２８，０
１８号明細書に提示されている。
二つの活性構成成分分子の他の変換１１！飾は、既知の
方法にて行うことができるが、ここでは、例として、特
異的な突然変異についてのみを記述した。
ブリッジ部分Ｙは、式■を有するものが有利である。　
。
−Ａｓｐ　−（ａａ）　　　−Ｐｒｏ　−（ＩＩ）式中
、Ｘは約２０までの整数を表し、ａａは、遺伝子的にコ
ード可能なシスティン以外の所望のアミノ酸のいずれか
を表す。
式■中、Ｉ　Ｌ−２構成成分を左方末端に配置し、した
がって、ＧＭ−ＣＳＦ構成成分を右方末端に配置するの
が有利である。とくに好ましい実施態様では、Ｙは、ア
ミノ酸配列 −Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅ　ｔ−ｌ　Ｉｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｙｒ−Ａ　１ａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−また
は−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−ｌ　１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ｔｔ
ｌｒ−ｌ　Ｉｅ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−を有する。
ここでも、ＩＩ、−２構成成分を左方末端に配置し、Ｇ
Ｍ−ＣＳＦ構成成分を右方末端に配置するのが好ましい
。
本発明による二機能性タンパク質は、既知の方法で発現
させることができる。細菌の発現システムにおいて、直
接発現の経路に続けることが可能である。この目的には
、既知の全ての宿主−ベクターシステムが適している。
宿主としては、例えば、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）　８種、枯草ａ　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎ
ｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）またはセラチア・
マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎｓ）、とくに１大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）、が適している。
所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、選んだ発
現システムにおいて充分に発現できるベクターに、既知
の方法にて取り込む。
この目的のためには、例えは、独国特許公開第３．４３
０，６８３号明細書およびＥＰ−Ａ第０．１７３，１４
９号明細書に記載の、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃ。
λファージのＰＬまたはｐＲ，ｂ　ｓ　ｐ、　　ｏｍｐ
または合成プロモーターからなるグループからのプロモ
ーターおよびオペレーター、を選べばよい。
ｔａｃプロモーター／オペレーター配列は有利であり、
現在、市販されている（例えは、ファルマシア社製の発
現ベクターｐ夏（Ｋ　２２３−３、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｂｉｏｔｏ３ｉｃａｌｓ、　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　
ａｎｄＥｑｕｉｐＩＩＩｅｎｔ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”、１９８４．６３頁）。
本発明によるタンパク質の発現において、ｍ　ＲＮ　Ａ
のレベルでの塩基対合を妨げるために、ＡＴＧ開始コー
ドン後の最初の２．３個のアミノ酸のための各々のトリ
プレットを修飾することが有利であることが判るであろ
う。個々のアミノ酸の欠失および添加などの修飾は、本
分野においてよく知られており、本発明もこれに係る。
酵母、好ましくはサツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、での
発現のためには、例えば、α因子システムによるヘテロ
型発現などの分泌システムを用いるのが有利である。
これについては、いくつかの記述がある。
酵母における二機能性分子の発現においては、二塩基ペ
プチド配列および二機能性タンパク質中のグリコジル化
部位が個々のアミノ酸の適当な交換によって壊されてい
る場合に、有利である。これによって、これもまた生物
学的作用に影響すると思オつれる可能な組合せが得られ
る。
酵母におけるＩ　Ｌ　−２の発現は、ＥＰ−Ａ第０．１
４２．２１３８号明細書に、また、ＣＭ−ＣＳＦの発現
は、ＥＰ　　ＡｖＩｏ、１８８，３５０号明ｍ１Ｆニｍ
示さｈＴイス一 本発明による二機能性タンパク質の投与は、二成分の投
与に相当する。しかし、安定性がより大きいので１．多
くの場合、より少ない投与量を用いることができる。し
たがって、従来提示されている範囲の少ない方の投与量
が用い得る。
本発明は、次の諸例によって詳細に説明される。
とく記載がない限り、パーセントおよび比の表示は重量
表示である。
例１ニ プラスミドｐ　１５９／６　（ＥＰ−Ａ２第０．１６３
，２４９号明細書の第５図、本発明の第１図中の（１）
）は、ＩＬ−２をコードする合成遺伝子をＥｃｏＲＩお
よび５ａｌＩ切断部位の間に含む。
この遺伝子のＤＮＡ配列は、該ＥＰ−Ａ２中ではｒＤＮ
ＡＤＮＡ配列表されている。Ｔａｑｌ切断部位は、トリ
ブレラ）１２７および１２８の領域に位置している。ｌ
　Ｌ−２の部分配列（２）を、ＥｃｏＲｒおよびＴａｑ
　１による切断によってこのプラスミドから切り出して
、分離する。
ＣＭ−Ｃ９Ｆをコードするブラスミド ｐＨ０２３（３）は、ＥＰ−Ａ２第０．１８３，３５０
号明細書に開示されている。ＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡは
、このＥ　Ｐ−Ａ２の第２図に示されている。プラスミ
ドＩ）　ＨＧ　２３を、ｃＤＮＡ配列をｐＢＲ３２２の
ＰｓｔＩ切断部位に取り込んで得る。ここで、一方では
、５′末端のＰｓｔＩ切断部位を、他方では、００尾部
形成によって導入された３″末端のＰｓｔｌ切断部１α
を利用する。
ＣＭ−ＣＳＦ遺伝子のほとんどを含むＤＮＡ配列（４）
を、Ｓ　ｆ　ａＮ　ＩおよびＰｓｔｌによる切断によっ
てこのプラスミドから分離する。
次のようなオリゴヌクレオチド（５）をフォスｌｌｅ　
　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｐ
ｒｏ　Ｍｅｔ　　ｌ１ｅＣＧ　　ＡＴＣＡＴＣＴＣＴ　
　ＡＣＣＣＴＧ　　ＧＡＣＣＣＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＣ
ＴＡＧ　　ＴＡＧ　　ＡＧＡ　　ＴＧＧ　　ＧＡＣ（’
：ＴＧ　　ＧＧＣＴＡＣＴＡＧ（Ｔａｑｌ）　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（５）Ｔｔ
＋ｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＡＳＩ）　Ｐ
ｒｏ（Ａｌａ）（Ｐｒｏ）ＡＣＣＡＣＣＴＡＴ　　ＧＣ
Ｇ　　ＧＡＣＧＡＴ　　ＣＣＧ　　ＧＣＴＧＧ　　ＴＧ
Ｇ　　ＡＴＡ　　ＣＧＣＣＴＧ　　ＣＴＡ　　ＧＧＣＣ
ＧＴ　　ＧＧＧ（ＳｆａＮ　Ｉ　） オリゴヌクレオチド（５）は、５゛末端でＩ　Ｌ−２の
ＤＮＡ配列を伸長する。しかし、Ａｓｐが１３３位置の
Ｔ１１ｒにとってかわる。このオリゴヌクレオチドの３
′末端には、５ｆａＮＩによる切断によってｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａから切りだしておいたヌクレオチドが位置している
。
発現プラスミドｐＥＷ１０００　（６）の調製法は、　
（公開前の）ＥＰ−Ａ第０．２２７　、９３８号明細書
（第１図）に提示されている。このプラスミドは、プラ
スミドｌ）　ｔ　ａ　ｃ　１１　（Ａｍａｎｎら：　Ｇ
ｅｎｅ　２５（１９８３）　１６７−１７８）の誘導体
であって、この中で、５ａｌｌ切断部位を含む合成配列
は、ＥｃｏＲＴ認識部位に導入されている。発現プラス
ミドｐＫＫ１７７．３をこの方法によって得る。ｌａｃ
レプレッサー（Ｆａｒａｂａｕｇｈ：　Ｎａｔｕｒｅ　
２７４　（１９７Ｂ）７０５−７６９）を挿入して、そ
の結果、プラスミドｐＪ　Ｆ　１１８を得る。後者を、
唯一のＡｖａｌ切断部位で開環して、エクソヌクレアー
ゼ処理による既知の方法で約１０００ｂｐ短縮し、連結
する。
プラスミドｐＥＷ１０００　（６）を得る。このプラス
ミドのポリリンカ一部分を酵素ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ
ｌを用いて開環することによって、直鎖状の発現プラス
ミド（７）を得る。
最後に、この直鎖状プラスミドＤＮＡ（７）を、Ｉ　Ｌ
−２配列をコードするＤＮＡフラグメント（２）、合成
オリゴヌクレオチド（５）およびｃＤＮＡフラグメント
（４）と連結させる。その結果、大腸菌株Ｍｃ１０６１
を形質転換するプラスミドｐＢ３０　（８）が得られる
。個々のクローンからのプラスミドＤＮＡを分離して、
制限酵素分析で性質を調べる。
例２： 例１のオリゴヌクレオチド（５）の代わりに下記の合成
オリゴヌクレオチドを用いることによって、プラスミド
ｐＢ３１を得る。
１１ｅ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｍｅｔ　ｌ１ｅＣＧ　　ＡＴＣＡＴＣＴＣＴ　　
ＡＣＣＣＴＧ　　ＧＡＣＣＣＧ　　ＡＴＧ　　ＡＴＣＴ
ＡＧ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＴＧＧ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＧＣ
ＴＡＣＴＡＧ（Ｔａｑ　ｌ　） Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｈｒ　１ｌｅＡＣＣＡＣＣＴＡＴ　ＣＴＡ　Ｇ
ＡＡ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＣＧ　ＡＴＣＴＧＧ　ＴＧＧ　
ＡＴＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＡＧ　ＴＧＣＴＡＧ
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ（Ａｌａ）（Ｐｒｏ）ＧＡＣＧ
ＡＴ　　ＣＣＧ　　ＧＣ ＣＴＧ　　ＣＴＡ　　ＧＧＣＣＧＴ　　ＧＧＧ（Ｓｆａ
Ｎ　ｌ　） 例３： 大腸菌株Ｗ３１１０のコンピテント細胞を、プラスミド
ｐＢ３０またはｒ）Ｂ３１で形質転換する。
菌の一晩培養菌液を５０１１ｇ／ｍｌアンピシリンをふ
くむ■、Ｂ培地（Ｊ、　Ｉｌ、　Ｍｉｌｌｅｒ：　Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎＭｏｌｅｃ、　Ｇｅｎ、、Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、、１９
７２）て約１：　　１００に希釈して、増殖をＯＤ測測
定よって追う。０Ｄ＝０．５において、培養菌液をイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ
）で濃度２ｍＭに調整する。１５０〜！８０分の後、細
菌を遠心分離する。これら５ａＩＷを緩衝混合液（７Ｍ
尿素、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍ燐酸ナトリウム、ｐＨ
７，０）中で約５分間処理して、試料をＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動プレートに供する。これによっ
て、二機能性タンパク質の発現が確認される。
以上の条件は、振どう培養にも適用される。より大規模
の培養では、ＯＤ値および栄養培地を修飾し、ＩＰＴＣ
ＩＩ度を適当に変えろことが有利である。
例４ニ プラスミドｐＢ３０またはｐＨ３１を含む大腸菌Ｗ３１
１０の細胞を、誘発後、遠心分離して、燐酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ７）に再懸濁させ、再び遠心分離する。菌
体を同じ緩衝液に懸濁させて、破壊する（フレンチプレ
ス、 Ｄｙｎｏｍｉｌｌ（商標））。破壊された細胞を遠心分
離する。例３のようにして、上清および沈澱物をＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析する。タンパク
質バンドを染色することによって、二機能性タンパク質
は、破壊物からの沈澱物中に含まれていることが明らか
になる。沈澱物をカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ
）緩衝液で数回洗浄し、最後に水で数回洗浄する。その
結果、所望のタンパク質がより高濃度で得られる。次い
で、タンパク８１１４度をタンパク質の水懸濁参αで測
定する。このＷ！濁液を、５Ｍ塩化水素グアニジウムお
よび２ｍＭジチオスレイトール（Ｄ　Ｔ　Ｔ）の濃度に
調整する。混合液を窒素下で約３０分間攪拌して、次イ
テ、５０１１ＩＭトリス緩衝ｔｉ（ｐＨ８，５）で希釈
して、タンパク質澗度を１００７１３／ｍｌにする。こ
のトリス緩衝液に対して透析を行う。この緩衝液を２度
交換した後、さらに、水に対して透析する。
このように処理したタンパク質を無菌的に濾過し、その
生物学的活性を調べる。インターロイキン２依存型ＣＴ
　Ｌ　Ｌ　２！Ｉ胞増殖７ツセイおよびヒト骨髄アッセ
イの双方における完全な生物学的作用を示す。顆粒球お
よびマクロファージとが混合したコロニーが、これらの
中に認められる。
この二機能性タンパク質は、インターロイキン２特異性
アフイニテイ・クロマトグラフィーによって、さらに精
製することカンできる。該タンパク質は１両アッセイ法
において、なお、活性を示す。
これとは対照的に、記述のように処理した非形質転換大
腸菌株のＷ３１１０の抽出物は、活性を示さない。
製品製造のための工業的調製のためには、他の条件、例
えば、タンパク質のフォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ
）およびその精製なども、便宜的に用いられる。適当な
精製工程は、既知のものであって、イオン交換、吸着、
ゲル濾過および調製用ＨＰＬＣクロマトグラフィーであ
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の二機能性タンパク質をコードするプ
ラスミドｐＢ３０の構築を図示する、説明図である。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、生物学的に活性なインターロイキン２ （ＩＬ−２）構成成分および顆粒球マクロファージ・コ
    ロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）構成成分からなる、二
    機能性タンパク質。 ２、二つの生物学的に活性なタンパク質構成成分が、遺
    伝子的にコード可能な１〜約２０個のアミノ酸からなる
    ブリッジによって連結したものである、請求項１に記載
    のタンパク質。 ３、ブリッジが式（II）に対応するものである、請求項
    ２に記載のタンパク質。 −Ａｓｐ−（ａａ）＿ｘ−Ｐｒｏ−（II） 式中、ｘは１から１８までの整数を表し、ａａは、遺伝
    子的にコード可能なシステイン（Ｃｙｓ）以外のアミノ
    酸を表す。 ４、ブリッジ員子（ａａ）＿ｘが次のアミノ酸配列を表
    す、請求項３に記載のタンパク質。 【アミノ酸配列があります】 ５、ＩＬ−２構成成分をＮ末端に配置し、 ＧＭ−ＣＳＦ構成成分をＣ末端に配置する、先行の請求
    項の１項またはそれ以上に記載のタンパク質。 ６、二機能性タンパク質をコードする遺伝子の、構築お
    よび宿主細胞中での発現からなる、請求項１〜５のいず
    れか１項に記載の二機能性タンパク質の製造法。 ７、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質か
    らなり、必要であれば薬理学的に適切な担体を組み合わ
    せた、医薬品。
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