JPS61124392A - 遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法 - Google Patents

遺伝子組換体の産生する生理活性物質の精製法

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JPS61124392A
JPS61124392A JP59246184A JP24618484A JPS61124392A JP S61124392 A JPS61124392 A JP S61124392A JP 59246184 A JP59246184 A JP 59246184A JP 24618484 A JP24618484 A JP 24618484A JP S61124392 A JPS61124392 A JP S61124392A
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sephalose
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Takao Kiyota
清田　隆夫
Hiroshi Hayashi
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は遺伝子組換体より生産される生理活性物質のｎ
製法に関するものである。詳しくは遺伝子組換操作によ
って人工的に作られた微生物（細菌、酵母など）の培養
液、もしくは該培養微生物の破砕抽出液より本発明の生
理活性物質を単離精製する工程において、粗精製状態、
または１裂が進んだ状態で、該生理活性物質の水浴液を
色素結合上７アａ−スカラムクロマトグラフイーに付す
工程を経ることを特徴とする該生理活性物質の精製法に
関する。
（従来技術） と）　ＴＮＦ様物質の精製法としては特開昭５８−１３
８３８３号に限外濾過法、透析法、イオン交換法、アフ
ィニティークロマト法、ゲル濾過法、電気泳動法等を組
み合わせた方法の記載があり、更に効率よく安価に祠裂
するには特異抗体を吸着体としたアフィニティークロマ
ト法を用いることが有効であるとの記載かめる。
（発明が解決しようとする問題点） しかし、前述の種々の方法を組み合わせた場合ＶｃＶｉ
精製操作が繁雑になり、収量の低下を招くことが必至で
あった。また特異抗体を用いたアフィニティークロマト
法を用いる場合には抗体の供給が問題となるばかりか均
一なカラムを作表することが難しく、安定した精製を行
なうことが困難であるという欠点があった。
このような精製法ではヒ）　ＴＮＦ様物質を安定して効
率的に大量供給することは非常に難しい。
（問題点を解決するための手段） そこで本発明者らが鋭意研究を重ねた結果、該生理活性
物質の粗精製物をブルーセファロース、レッドセファロ
ースなどの色素結合セファロースカラムクロマトグラフ
ィーにかけたところ該生理活性物質のみが特異的に吸着
し、塩濃度あるいはｐＨを上げて溶出すると極めて高い
回収率で高純度の該物質を安定して得ることができるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、遺伝子組み換え体により生産され
、Ｌ−Ｍａ胞に対して細胞障害活性を有し、かつＭｅｔ
ｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／Ｃ
マウスに投与した場合にその腫瘍部位に出血性壊死反応
を起こさせる性質を有する生理活性物質の粗精製液を色
素結合セファロースカラムクロマトグラフィーに付す工
程を経ることを特徴とする該生理活性物質の精製法であ
る。
本発明における生理活性物質とは、遺伝子組換体より得
られる蛋白質でろって、後述のようにＬ−Ｍ細胞に対し
て細胞障害活性を有し、マウスＭａｔｈ　Ａ　ｓａｒｃ
ｏｍａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した
場合、腫瘍部位に出血性の壊死反応を起こさせる性質を
有する。また、上記の性質の外に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで
正常細胞にはほとんど有害な作用をおよぼさないという
特徴をもつ。さらに、本文中で示されるように該生理活
性物質は、ヒト遺伝子に由来するものである。詳しくは
ウサギのｍｍ壊死因子（以下ＴＮＦと略す。）のアミノ
酸配列構造をもとにヒト染色体遺伝子より、通常の遺伝
子組換操作の手法を使って取シ出したＤＮＡ　ｔ−用い
て、人工的に新規のＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを組み込
んで作成した遺伝子組換体より産生される蛋白質である
。ヒ）　ＴＮＦ様物質と考えられる該生理活性物質は、
本来ヒトが備えている蛋白質であることから考えて、安
定性があり効果も高い制癌剤として期待のもてる物質で
ある。
さらに詳しくは、本発明に用いられる生理活性物質は少
なくとも下記のアミノ酸配列を含む蛋白質である。
８ａｒ　　８ｅｒ　８ｅｒ　人ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　
８ｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　　Ｐｒｏ　ＭａｌＡｌａ　　
　Ｈｌｓ　　　Ｍａｌ　　　Ｍａｌ　　　Ａｌａ　　　
Ａｓｎ　　　Ｐｒｏ　　　Ｇｉｎ　　　Ａｌａ　　　Ｇ
ｌｕ　　　ＧｌｙＧｌｎ　　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　　
Ｔｒｐ　　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　
　Ａｌａ　　Ａｓｎ　　ＡｌａＬｅｕ　　Ｌｅｕ　Ａｌ
ａ　人ｓｎ　　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　　Ｑｌｕ　　Ｌｅｕ　
Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＡｓｎＧｌｎ　Ｌｅｕ　Ｍａｌ　Ｍａ
ｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ
　Ｌａｕｌｌｅ　Ｔｙｒ　８ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＧｌｙＯｙｓ
　Ｐｒｏ　８ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　ｖａｌ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　ＴｈｒＪｌｅ　８ｅｒ　Ａｒ
ｇ　ＩＩｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ
　Ｔｈｒ　ＬＹＳＶｉｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓ
ｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　８ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃｙ
ｓＧｌｎ、Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　
Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓｐｒｏ　　　
Ｔｒｐ　　　Ｔｙｒ　　　Ｇｌｕ　　　Ｐｒｏ　　　Ｉ
ｌｅ　　　Ｔｙｒ　　　Ｌｅｕ　　　Ｇｌｙ　　　Ｇｌ
ｙ　　　ＭａｌＰｈｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙ
ｓ’Ｇ１ｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　８ｅｒ　Ａｌａ
Ｑｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｔ
ｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　ＡｌａＱｌｕ　　　Ｓ
ｅｒ　　Ｑｌｙ　　Ｇｌｎ　　ｖａ、ｌ　　　Ｔｙｒ　
　　ｐｈｅ　　　Ｇｌｙ　　　Ｉｌｅ　　　Ｉｌｅ　　
ＡｌａＬｅｕ なお、上記配列は下記の略号のＬ−アミノ酸がらなり、
配列の左°から右への方向ｆｌＮ末端がらＣ末端への方
向を示すものである。
Ｏｙｓニジスティン残基 Ｇｉｎ　：グルタミン残基 ＡＳＰ　：アスノぞラギン酸残基 Ｐｒｏ　ニブロリン残基 ’ｌ’ｙｒ　：チロシン残基 Ｖａｌ　　：ノ２リン残基 Ｌｙｓ　：リジン残基 Ｇｌｕ　：グルタミン酸残基 Ａｌａ　ニアラニン残基 ｈｓｎ　：アスノぞラギン残基 Ｌｅｕ　：ロイシン残基 ｐｈｅ　：フェニルアラニン残基 Ｇｌｙニゲリシン残基 Ｈｉｓ：ヒスチジン残基 Ｆ３ｅｒ　：セリン残基 Ｔｈｒ　：スレオニン残基 １１ｅ　：インロイシン残基 Ｔｒｐ　：　）リプトファン残基 Ａｒｇ　：アルギニン残基 本発明に用いられる遺伝子組換体は少なくとも下記のＤ
ＮＡ配列を含むものである。
ＴＯＡ　　ＴＯＴ　　ＴＯＴ　　ＯＧＡ　　ＡＯＯＯＯ
Ｇ　　ＡＧＴ　　ＧＡＯＡＡＧＣＯＴ　　ＧＴＡ　　Ｇ
ＯＯＯＡＴ　　ＧＴＴ　　ＧＴＡ　　ＧＯＡ　　ＡＡＧ
　　０ＯＴＯＡＡ　　ＧＯＴ　　ＧＡ（）　　ＧＧＧ　
　ＯＡＧ　　ＯＴＯＯＡＧ　　ＴＧＧ　　０ＴＧＡＡＯ
ＯＧＯＯＧＧ　　Ｇｏｏ　　ＡＡＴ　　ＧＯＯＣＴＣＯ
ＴＧ　　Ｇｏ。
ＡＡＴ　　ＧＧＯＧＴＧ　　ＧＡＧ　　ＯＴＧ　　ＡＧ
Ａ　　ＧＡＴ　　ＡＡＯ０ＡＧＯＴＧ　　ＧＴ（）　　
ＧＴＧ　　ＯＯＡ　　ＴＯＡ　　ＧＡＧ　　ＧＧＯＯＴ
Ｇ　　ＴＡＯＣＴＣＡＴＯＴＡＯＴｏｏ　　ＯＡＧ　　
ＧＴＯＣＴＣＴＴＯＡＡＧＧＧＯＯＡＡ　　ＧＧＯＴＧ
Ｇ　　Ｃｏｏ　　Ｔｏｏ　　ＡＯＯＯＡＴ　　ＧＴＧＯ
ＴＯＯＴＯＡＯＯＯ人ＯＡＯＯＡＴＧ　　ＡＧＯＯＧＯ
ＡＴＯＧＯＯＧＴＯＴｏｏ　　ＴＡＣ！　　ＯＡＧ　　
ＡＯＯＡＡＧ　　ＧＴＯＡＡＯＣＴＣ！　　ＯＴＯＴＯ
Ｔ　　ＧＯＣＡＴＯＡＡＧ　　ＡＧＯ０００ＴＧＯＯＡ
Ｇ　　ＡＧＧ　　ＧＡＧ　　ＡＯＯＯＯＡ　　ＧＡＧ　
　ＧＧＧ　　ＧＯＴ　　ＧＡＧＧＯＯＡＡＧ　　Ｃｏｏ
　　ＴＧＧ　　ＴＡＴ　　ＧＡＧ　　０００　　ＡＴＣ
ＴＡＴＯＴＧ　　ＧＧＡ　　ＧＧＧ　　ＧＴＯＴＴＯＯ
ＡＧ　　ＯＴＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＧＧＧＴ　　ＧＡＯ
ＯＧＡ　　ＯＴＯＡＧＯＧＯＴ　　ＧＡＧ　　ＡＴＯＡ
人ＴＯＧＧ　　０００　　ＧＡＯＴＡＴ　　ＣＴＣＧＡ
ＯＴＴＴ　　Ｇｏｏ　　ＧＡＧＴＯＴ　　ＧＧＧ　　Ｏ
ＡＧ　　ＧＴＯＴＡＯＴＴＴ　　ＧＧＧ　　ＡＴＯＡＴ
ＴＧｏｏ　　ＯＴＧ なお、上記ＤＮＡ配列は下記の略号を使用し、配列の左
から右への方向は５°から３′への方向を示すものであ
る。
Ａ：２１−デオキシアデニル酸残基 Ｃ：２７−デオキシシチジル酸残基 Ｇ：２７−デオキシグアニル酸残基 Ｔ：チミジル酸残基 次に、該生理活性物質は以下のようにして得ることがで
きる。
１、ノξクテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子ライ
ブラリーとバクテリオファージス／ヒト染色体遺伝子ラ
イブラリーは、バーバード大学生化学および分子生物学
部（７Ｄｉｖｉｎｉｔｙ　Ａｖｅｎｕｅ　。
Ｑａｍｂｒｉｄｇｅ　、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ
　０２１３８　ｌＵ、　Ｓ　、Ａ、　）のＴ。
Ｍａｎｉａｔｉｓ教授より得ることができる。これらの
ライブラリーは次の方法によって作ることができる。（
Ｃｅ１ｌ　、　ｌ　５　、　ｐ、　６８７　（１９７８
）参照〕（１）　　ウサギあるいはヒトの組織、たとえ
ばウサギあるいはヒトのすいｌ１ｆｆｉ凍結粉末にし、
几ＮＡと蛋白成分を分解処理し、沈澱によってウサギあ
るいはヒトの高分子ＤＮＡを得る。
（２）　　この高分子ＤＮＡは遺伝子座位をランダムに
切るために、部分的に分解する。
（３）得られたＤＮＡ断片から分子量分画によって、１
５から２０キロ塩基対（ｋｂ）の大きさの断片を得る。
（４）得られたＤＮＡ断片をλ０ｈａｒｏｎ　３０フア
ージベクターを用いてクローン化スる。
（５）　　得られたベクターを、ｒＤＮＡｔ”含む感染
性の７ア一ジ粒子にｉｎ　ｖｉｔｒｏで組み入れ、上記
のウサギあるいはヒトの染色体遺伝子ライブラリーを得
る。
λ　ウサギＴＮＦのｃＤＮＡは、Ｐ、Ｗ、Ｊ、　Ｒｉｇ
ｄｙらの二ックトランスレーンヨン法（Ｊ、　Ｍｏ１．
　Ｂｉｏｌ、　１１３゜ｐ、　２３７　（１９７？）参
照〕によって、３２ｐでラベル化する。
３、　ノソクテリオファージλ／ウサギ染色体遺伝子う
イゾラリーとノ々゛クテリオファージλ／ヒト染色体遺
伝子ライブラリーのそれぞれを、バクテリアの均一層の
上に密にプラークができるように植えつけ、３２Ｐでラ
ベルしたウサギＴＮＦ’のＣＤＮＡとハイブリダイズさ
せてスクリーニングした。
４、　適当なりローンより、対応するＤＮＡを単離し、
制限酵素地図を作り、３ｏｕｔｈｅｒｎハイブリダイズ
法（Ｂ、Ｍ、８ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、　、　９８＋　　９．５０３（１９５７）参照
〕によって解析する。
ウサギＴＮＦと該生理活性物質の遺伝子を含む制限酵素
分解された断片を、プラスミドベクタ基配列を比較して
、ウサギＴＮＦ遺伝子のエクソ／（ウサギＴＮＦのアミ
ノ酸配列をコードする塩基配列）とイントロン（ウサギ
ＴＮＦのアミノ酸配列をコードしない塩基配列）を決定
する。
＆　そして、ウサギＴＮＦ遺伝子と該生理活性物質の遺
伝子を比較して、該生理活性物質のエクソンとイントロ
ンを決定する。
７、　ウサギＴＮＦ遺伝子のイントロンを削除しエクソ
ンを結合することによって得られた塩基配列より決めら
れるウサギＴＮＦのアミノ酸配列は、ウサギＴＮＦのＣ
ＤＮＡの塩基配列より決められる同アミノ酸配列と一致
することで確認される。
＆　次に、該生理活性物質遺伝子のイントロンを削除し
エクソンを結合することによって得られた塩基配列より
該生理活性物質のアミノ酸配列が決められる。該生理活
性物質のアミノ酸配列は、ウサギＴＮＦのアミノ酸配列
と部分的に一致することで確認される。
９、その後、該生理活性物質をコードするＤＮＡをＩｎ
マロｒＯで修飾し、適当な表現ベヒクルに導入し、その
ＤＮＡ　を含む組換ＤＮＡを作成する。
１０、　　このようにして得られた該生理活性物質はそ
の成熟型で、セリンから始まる１５５個のアミノ酸残基
金持つ。一方、その前配列としてシグナルペプチドを持
つ。
各アミノ酸に対応するコドン（遺伝暗号）の使用頻度が
異る等の理由により、アミ・ノ酸配列を変えることなく
、塩基配列の一部または全部を、有機化学的に合成され
た人工のＤＮＡに置換えることも可能である。
該生理活性物質はまた、細胞内で未成熟形態（ゾレまた
はプレプロペズチド）で産生され成熟過程（プロセシン
グ）により中間体を経由して成熟した該生理活性物質と
なることが推定される。
該生理活性物質のこのような未成熟形態は、該生理活性
物質遺伝子の塩基配列から推定することができる。未成
熟形態及び中間体の該生理活性物質をコードする遺伝子
を含む該生理活性物質遺伝子もまた、天然のまたは人工
的ＤＮＡ全用いて組換全行うことができる。
これらの方法の応用形態の１つは、メチオニンコドン（
ＡＴＣ））を成熟あるいは未成熟あるいは中間体ＴＮＦ
遺伝子の５′端に導入することである。このようにする
ことにより、適当なプロモータによって合成されるｍＲ
ＮＡから成熟あるいは未成熟あるいは中間体の該生理活
性物質が産生される。この様にＮ末端に付加されたメチ
オニン残基は宿主によっては自然に除去される。
また別の形態としては、シグナル配列と呼ばれる疎水性
に富んだ配列を付加することにより、宿主細胞の外また
はダラム陰性細菌においては、ペリプラズムと呼ばれる
部分へ、分泌させることも可能である。
また、開始コドンを組込んであるベクターの場合は、ベ
クターから由来するペプチドと該生理活性物質との融合
ペプチドを形成するが、この場合は化学的または酵素的
に切断するか、もしくは該生理活性物質の主たる活性に
変化がなければ、そのまま用いることができる。
このように得られた該生理活性物質遺伝子を、正しく転
写、翻訳が行われるような配列においてプロモーター等
の５′領域の遺伝子配列に接続し、細菌または高等生物
細胞中で複製可能なベクターと接続した組換遺伝子を得
、この組換遺伝子によって細菌または高等生物細胞を形
質転換し、この形質転換体を増殖せしめ、該生理活性物
質遺伝子を発現せしめることによシ該生理活性物質を得
ることができる。
宿主として大腸菌を用いる場合は好適にはＥ。
ｃｏｌＩＫ　１２株の攬々の変異株、例えばＨＢ　１０
１　（ＡＴＯＯ３３６９４）、０６００Ｋ　（ＡＴＣＯ
３３９５５）、Ｄ１２１０ＸＦＬＲＩ（人Ｔｏｏ３１３
４３）、　ＭＯ１０６１、ＬＢ３９２　（ＡＴＯＯ３３
５７２）、ＪＭＩＯＩ　（ＡＴＯＯ３３８７６）、ＪＭ
８３、ＪＭ１０３、χ１７７６（ＡＴＯＯ３１２４４）
などが用いられる。
大腸菌を宿主とする場合のべ゛フタ−としては、ｐＢＲ
３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＵｏ　８、ｐ
Ｕｏ９、ｐＭＢ９　（ＡＴＯＯ３７０１９）、ｐＪＢ８
　（ＡＴＯＯ３７０７４）、ｐＫＯ？　（ＡＴＯＯ３７
０８４）等のプラミスドあるいはλｇｔｓλＢ１　シャ
ロン４人のようなλファージ、Ｍ１３ファージなどが用
いられる。
大腸菌の菌体中に該生理活性物質全産生させるために、
大腸菌の遺伝子またはファージ遺伝子のプロモーターが
使用される。このようなプロモーターとして、好適には
ラクトース分解酵素（ＬＡＯ）のプロモーター及びその
ＵＶ５変異、ベニ７リナーゼ（ＢＬＡ）　、）’リプト
ファン合成酵素（ＴＲＰ）のプロモーター、λファージ
のｐＬプロモーターおるいはトリプトファン合成＃素と
、ラクトース分解酵素の融合プロモーターであるＴＡＯ
プロモーター等が用いられる。
枯草菌を宿主とする場合にはＢＤ１７０　ａ：　（ＡＴ
ＯＯ３３６０８　）、ＢＲ１５１株（ＡＴＯＯ３３６７
７）、Ｍ１１１２株（ＡＴＯＯ３３７１２）などが用い
られ、ベクターとしてはｐｃ　１９４　（ＡＴＯＯ３７
０３４）、９ＵＢ　１１０　（ＡＴＯＯ３７０１５）、
９８人２１００　（ＡＴ（３０３７０１４）、［）Ｂ１
９４などのプラスミドなどが用いられる。
枯草菌を宿主とする場合のプロモーターとしてハ、クロ
ラムフェニコールアセチル化酵Ｘ　（ＯＡＴ）やベニ／
リナーゼ、エリスロマイシン耐性等の遺伝子のプロモー
ターが用いられる。
酵母全宿主とする場合は、サツカロマイセス・セレビシ
ェ（８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｅａ
ｅ　）のＲＨ２１８株（ＡＴＣ！０４４０７６）、５Ｈ
ＹＩ株（ＡＴ００４４７６９）、８ｌ−ＩＹａ株（ＡＴ
ＯＯ４４７７１）、Ｄ　１３１Ａ株、４８３株、８３０
株などが用いられ、そのベクターとしてはＹＥｐ　１３
　（ＡＴＯ（３３７１１５）、ＹＥｐ６、ＹＥｐ７、Ｘ
Ｉｐ　５などのプラスミドが用いられる。
酵母全宿主とする場合、プロモーターとしては酸性ホス
ファターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨＩ　
）、トリプトファン合成酵素（ＴＲ，Ｐ）、ホスホグリ
セレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ｆトクロームＢ　（ＯＯ
Ｂ）、アクチン等の遺伝子のプロモーターが用いられる
。
以上のようにして作成した遺伝子組換体微生物を通常の
方法で大量に培養した後、目的とする該生理活性物質を
産生させ、次いで目的とする該生理活性物質を抽出単離
精製する。
本発明に用いる該生理活性物質の粗精製液としては微生
物菌体除去後の培養液、もしくは菌体の破砕抽出液、あ
るいは好ましくは硫安分画処理除核酸処理などの前処理
を施したものやイオン交換樹脂などを用いて部分精製を
行なったものが適当である。
また本発明でいう色素結合セファロースとはＢｄｈｍｅ
らのトリアジンカップリング法（Ｊ。
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ。６９　（１９７２）　２０９−
２１４　）などによって種々の色素をセファロースに共
有結合させたものを指し、具体的な色素の代表例として
０ｉｂａｃｒｏｎ　ＢｌｕｅＦ３ＧＡ（＠造式（１））
、Ｐｒｏｃｉｏｎ　Ｒｅｄ　ＨＢ３Ｂ　（８４式（２）
）がある。
Ｍａｔｒｅｘ　　Ｇｅ１ ＭＭｔｒｅｘ　　Ｇｅｌ なお色素結合セファロースとして一般に市販されている
ものとしては、ブルーセファロース０Ｌ−６Ｂ（ファＡ
＝　−ｒ　、７７社製）、Ｄｙｅ　−Ｍａｔｒｅｘ　（
ブルー人セファロース、レッド人セファロース、グリー
ン人セファロース〕（アミコツ社製）などがある。
さらにこれらの色素結合セファロースを用いたクロマト
の一例を次に示す。
まず該樹脂をカラムに詰めた後０．ＩＭ塩化ナトリウム
を含むｐＨ６付近のリン酸緩衝液などで十分に平衡化し
、次いで該生理活性物質を含む粗精製液を該カラムに供
する。その後同緩衝液で十分に洗浄してから塩化ナトリ
ウム濃度を上げるか、ｐＨを８以上に上げると該生理活
性物質のみが特異的に溶出してくる。
この際平衡化に使用する緩衝液及びカラムに供するサン
プルのｐＨは５．５〜６．５の範囲に調整することが好
ましい。
尚、本発明の和製方法によって得られた絹製生理活性物
質の約３００単位は、後述のＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏ
ｍａ坦癌マウスを用いる生理活性評価において（＋）の
活性を示した。更に、マウス結腸癌Ｃｏ１ｏｎ　２６で
担癌させたＢＡＬＢ／Ｃマウスに本生理活性物質の精製
物を投与した場合、対照群（生理食塩水投与群ンに比し
て有意の差を持って、癌増殖抑制および退縮効果が認め
られた。また培養を３７℃で７２時間で行なう以外は、
後述のＬ−Ｍ細胞に対する細胞障害活性評価と同様な実
験方法で、各釉ヒト癌細胞に対する活性の評価をおこな
った。用いた細胞は、ＫＢ細胞（鼻咽喉癌）、ＰＣ−８
細胞（肺癌）、比較対照細胞として正常細胞（ヒト胎児
腎細胞、ヒト胎児包皮細胞）であった。その結果、正常
細胞には、はとんど細胞障害活性が認められなかったに
もかかわらず、癌細胞には強い細胞障害活性が認められ
た。
すなわち本発明の生理活性物質のｎ裂物は、極めて優れ
た制癌活性を持ち、しかも、ヒト由来の蛋白質であるこ
とから、今後有用な制癌剤として期待できるものである
。
次に、本発明を実施するにあたって、行なう評価方法に
ついて以下に詳細を述べる。
１）　　ｉｎ　ｖｉｖｏ活性測定（Ｍｅｔｈ　Ａ　ｓａ
ｒｃｏｍａ坦癌マウスを担癌る活性測定） ｉｎ　ｖｉｖｏ法としては、たとえば、Ｑａｒｓｗｅｌ
ｌ　らの方法、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＵＳＡ、　？２（１９７５）３６６６があげら
れる。
本発明者らが用いている方法は、これを改良したもので
あり、移植したＭｅｔｈ人ｓａｒｃｏｍａによる腫賜を
該生理活性物質が壊死させる効果を測定するものである
。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスの下部皮肉に２　Ｘ　
Ｉ　Ｏ’個のＭｅｔｈ　Ａ　ｓａｒｃｏｍａ細胞を移植
する。
７日後、移植したｇＩＩ瘍の大きさが直径７〜８鴫とな
り、出血性壊死などがなく良好な血行状態にあるマウス
を選び、尾静脈より生理食塩水で希釈した０、５ｄの該
生理活性物質試料を注射し、２４時間後に次の判定基準
により判定を行なう。
（−）：変化なし く＋）：かすかな出血性壊死 （＋）：中程度の出血性壊死（移植ガン表面の真中から
５０％以上にわたって壊死） Ｃ＋＋＋）：顕著な出血性壊死（移植・ガンの中央部が
重度に壊死し、周囲のガン組織がわずかに残った状態） ２）　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ活性測定（Ｌ−Ｍ細胞を用い
る活性測定） ｉｎ　ｖｉｔｒｏ法による該生理活性物質活性測定は、
たとえば、Ｒｕｆｆ　（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　Ｍｏ
１．１１　、　ｅｄ、　ｂｙ　Ｅ。
Ｐｉｃｋ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ
、　（１９８０）２３５　）、あるいは（Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、　、　１２６（１９８１）１２７９　）の方
法があげられる。
本発明者らが用いている方法は、これらを改良したもの
でめジ、該生理活性物質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション、０ＯＬ１．２）を殺
す効果を測定するものである。
すなわち、順次培地で希釈した該生理活性物質試料０．
１　ｄと１０’個／ｄの濃度のり、−Ｍ細胞の培地懸濁
液０．１１を９６穴の組織培養用マイクロプレート（フ
ロー・ラゼラトリー社）に加える。培地は１（Ｎ’／Ｖ
％のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセン
シャル培地（その組成は、たとえば、「組織培養」中井
順之助他編修、朝食書店、１９６７年に記載されている
）を用いる。マイクロプレートｔ−５％の炭酸ガスを含
６空気中、３７℃で４８時間培養する。培養終了後、２
０％グルタルアルデヒド水溶液２０μｔ’ｒ加え細胞を
固定する。
固定後、マイクロプレートを洗浄、乾燥して、Ｏ，ＯＳ
％メチレンゾル−溶液を０．１ｒｘｌ加え、生き残った
細胞＋Ｓ色する。余分なメチン／ブルーを洗い流し乾燥
した後、残ったメチレンブルーｔ−３％塩酸溶液で抽出
し、その６６５ｎｍにおける吸光度をタイターチック・
マルチスキャン（フロー・うぜラトリー社）で測定する
。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。該生理
活性物質試料を加えない対照の吸光度の５０％の値に相
当する該生理活性物質の希釈率を、グラフあるいは計算
によって求め、その希釈率を単位（０１／　ＷＬｔと定
義する。
以下、本発明における該生理活性物質のｉｎ　ｖｉｔｒ
。
活性は、すべてこの単位で表示される。
３）蛋白質定量 蛋白質はＬｏｗｒｙら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｑｈｅｍ、
　、　１９３　ｐ２６５（１９５１）　）の方法に従い
測定し算出した。
なお本発明の実施にあたシ、組換ＤＮＡの作製組換体の
微生物への導入は、特願昭５９−１１５４９７に記載さ
れている方法に従って実施した。
実施例１ ％願昭５９−１１５４９７に記載された方法で調製した
遺伝子組換体ｐＨＴＮＦ−ｉａｃ　　ＵＶ５−１　ｔ−
含有する大腸菌を、通常の方法で培養した後、集菌し、
該菌体を０．０２　Ｍ　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，
８）２　Ｌ中で破砕して該生理活性物質を含む菌体抽出
溶液を得た。この溶液は５．２Ｘ１０’Ｕ／ｍの活性を
示し、比活性は４．２　Ｘ　１０’　Ｕ／■であった。
次いで該抽出液に最終濃度０．７％となるようにストレ
プトマイシンを加え、沈澱してきた核酸類を遠心操作で
除いた後の上清を０．０２Ｍ　）　Ｕスー塩酸緩衝液（
ｐＨ８，０）で平衡化したＤＥＡＲセファロース０Ｌ−
６Ｂ（ファルマシア社）のカラムに添加した。同緩衝液
で洗浄した後０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭＩ
Ｊン酸緩衝液（ＰＨ７，５）で溶出し、比活性３．９０
　Ｘ　１０’　Ｕ／ｑの粗精製液（３）を得た。
上記粗製液（ＡＪｌｒ：塩酸を用いてｐＨ６，０に調整
した後、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含むｌ　ＯｍＭ　Ｉ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，０）で平衡化したブルーセファ
ロースのカラムに添加し、十分洗浄してから０．５　Ｍ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ＋Ｊン酸緩衝液（ｐＨ８
，０）で溶出した。その結果を表１Ｋ示した。
実施例２ 次に実施例１で得た粗精製液囚を実施例１の方法でブル
ーセファロースによってｆｆｇした場合とモノクローナ
ル抗体カラムで精製した場合の比較実験の結果を表２に
示した。
なお抗体カラムは０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０
ｍＭＩＪン醗緩衝液（ｐＨ７，５）で平衡化した後、粗
精製液（Ａｃ′に添加し、十分洗浄してから０．１５Ｍ
塩化ナトリウムを含む０．１　Ｍグリシン−水酸化ナト
リウム（ｐＨ１ｏ、ｏ　）で溶出した。
実施例３ 実施例１．２ではブルーセファロースニよルｆｆ製の結
果を示したが、同じ条件で精製を行なった場合、これは
レッＰセファロース、グリーンセファロースなどでも代
用できることがわかったのでその結果を表３に示した。
表１　ブルーセファロースによる精製例表２　ブルーセ
ファロースとモノクローナル抗体カラムとの比較 表３　ブルーセファロースと他の色素結合セファロース
との比較 （発明の効果） 以上述べたように本発明の精製方法を用いれば、本発明
でいう生理活性物質を極めて高い回収率で高純度の該物
質を安定して得ることができる。更に本発明で用いる色
素結合セファロースはかなり過激な条件下でも繰り返し
の使用が可能であり、大量スケールへの適応も容易であ
るという利点をもつ。
なお本発明者らは該生理活性物質に対するモノクローナ
ル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによ
る精製も試み、良好な結果を得ているが、色素結合セフ
ァロースを用いた場合でもモノクローナル抗体カラムを
用いた時と同等の純度のものが得られることを確認した
。
さらにモノクローナル抗体カラムに比べてノセイロジエ
ンフリー化が容易なこと、及び該生理活性物質に対する
吸着容量が大きいという点で色素結合セファロースの方
が工業的スケールでの精製を行なう上で優れている。
（吸着容量は例えばブルーセファロースの場合には４Ｘ
１０’Ｕ／１ｍ樹脂であるが本発明者らが作成したモノ
クローナル抗体カラムではｌＸ１０’Ｕ／１ｍ樹脂程度
であった。） 特許出願人　旭化成工業株式会社 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　昭和５９年特許順第２４６１８４号２
、発明の名称 遺伝子組換体の産生ずる生理活性物質の精製法３、補正
をする者 事件との関係　　　特許出願人 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号昭和５０年３月
６日（発送日６０．３．６）５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ｆｌ）　　明細書第８頁第１５行ｒ　（Ｃｅ１１，１５
．ｐ、６８７（１９７８）Ｊを［〔セル、１５巻、６８
７頁１９７８年（Ｃｅ１１．１５．　ｐ、６８７（１９
７Ｂ）’）Ｊと訂正する。
（２）　　同第９頁第１２行〜１３行ｒ　（Ｊ、　Ｍｏ
１．　Ｂｉｏｌ、旦ムｐ２３７　（１９７７）　Ｊを「
ジャーナルオフモレキュラーバイオロジー１１３巻２３
７頁工９７７年（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。
１１３、　ｐ２３７（１９７７））Ｊと訂正する。
（３）同第１０頁第４〜５行ｒ　（Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈ
ｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、　、　９Ｂ、　ｐ、５０３　（１９５７））
　Ｊを［〔イー・エム・サザン、ジャーナルオフモレキ
ュラー　バイオロジー　９８巻、５０３頁、　１９５７
年（［！、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ＋Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂ
ｉｏｌ、　、　９Ｂ、　ｐ、５０３　（１９５７））Ｊ
と訂正する。
（４）同第１６頁第１４〜１５行ｒ　（Ｊ、　Ｃｈｒｏ
ｍａｔｏｇｒ、　６９（１９７２）２０９−２１４）　
Ｊを［〔ジャーナル　オフ　クロマトグラフィー６９巻
、　２０９−２１４頁、　１９７２年（Ｊ。
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、　６９　（１９７２）　２０９
−２１４））　Ｊと訂正する。
（５）　　同第２０頁第４行ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ。
７２　（１９７５）　３６６６Ｊを［プロシーデイング
ズ　オフザ　ナショナル　アカデミ−オフ　サイエンス
オプ　ザ　ユナイテソド　ステイク　オプ　アメリカ、
７２巻、　３６６６Ｌ　１９７５年（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔ、　Ａｃａｄ。
Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、７２　（１９７５）　３６６６　）
　Ｊと訂正する。
（６）同第２１頁第６〜７行ｒＲｕｆｆ　（Ｌｙｎ＋ｐ
ｈｏｋｉｎｅｓ　Ｖｏｌ。
１１＋ｅｄ、ｂｙ　Ｅ、　Ｐｉｃｋ、　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎ、Ｙ、（１９８０）２３５）　Ｊ
　、を「ラフ著「リンフォ力インズＪイー・ピック編ア
カデミツク　プレス社刊ニューヨーク１９８０年、２３
５頁（Ｒｕｆｆ、　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　Ｖｏｌ、
　１１．ｅｄ。
ｂｙ　Ｅ、　Ｐｉｃｋ、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
、　Ｎ、Ｙ、（１９８０）２３５）　Ｊ　。
と訂正する。
（７）同第２１頁第８行ｒ　Ｊ、”Ｉｍｍｕｎｏｌ、　
、　１２６　（１９８１）１２７９Ｊを「ジャーナル　
オプ　イムノロジー。
１２６巻（１９８１年）１２７９頁（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、、　１２６　（１９８１）１２７９）　Ｊと訂正
する。
（８）同第２２頁第１９〜２０行ｒＬｏｗｒｙら（Ｊ、
８ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、　。
１９３　ｐ２６５　（１９５１））　Ｊを［ローリ−等
、ジャーナル　オフ　バイオロジカル　ケミストリー、
１９３巻、２６５頁、１９５１年（Ｌｏｗｒｙ　ｅｔ　
ａｌ、＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。
１９３　ｐ２６５　（１９５１）］　Ｊと訂正する。
以上

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 遺伝子組み換え体により生産され、Ｌ−Ｍ細胞に対して
    細胞障害活性を有し、かつＭｅｔｈ　Ａ・ｓａｒｃｏｍ
    ａ癌細胞を移植したＢＡＬＢ／ｃマウスに投与した場合
    にその腫瘍部位に出血性壊死反応を起こさせる性質を有
    する生理活性物質の粗精製液を色素結合セフアロースカ
    ラムクロマトグラフイーに付す工程を経ることを特徴と
    する該生理活性物質の精製法
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