JPS6332486A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡＩａｌ−アラニン ＡｒｏＬ−アルギニン Ａｓｎ１−−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨｉｓＬ−ヒスチジン １１ｅｌ−−イソロイシン １−ｅｕｌ−ロイシン Ｌ’／Ｓ　　Ｌ−リジン ｖｅｔ　　Ｌ−メチオニン ｐｈｅｌ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−−ブＯリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン ｖａｌ　　ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　くデオキシチミ
ジル酸を示す。）（２）　　発明の背瑣 Ｃａｒｓｗｅ　ｌ　ｌ　ｓらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　
　Ｃａｌｍｅｔｔｅ　　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）
などで前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを
投与した後に採取した面清中に、移植したＭｅｔｈ△肉
腫による癌を出血壊死させる物質が含まれていることを
見出し、この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ
　ｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記す
ることもある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅ
ｌｌら、　Ｐ　ｒｏｅ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＩＪ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６
６　（１９７５）　］　。コノ。

ＴＮＦはマウス、ウサギ、ヒト等多くの動物中に見られ
、腫瘍細胞に特異的に、しかも種を越えて働くことから
、制癌剤としての利用が期待されてきた。

最近になって、Ｐｅｎｎ１ｃａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　ｅ
ｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　≦＋１２．　７
２４　（１９８４）］。その後、自弁ら［７，３ｈｉｒ
ａｉら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

ユ旦、　　８０３（１９８５）　］　、宗村ら［塞材ら
、癌と化学療法、　１２．　１６０（１９Ｅ１５）コ、
Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ。

ｗ　ａｎｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４
９（１９８５）　］及びＭ　ａｒｌｅｎｏｌＪｔら［Ａ
　、　　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら、　　Ｅｕｒ、Ｊ。

３　ｉｏｃｈｅｍ、、ユ５２．　５１５（１９８５）　
］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌における発現について
相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非、常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕ
ｌｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のようなり１作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。

また、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
ま、たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についても、特開昭６１−４０
２２１明細書にその可能性についての記載があるが、生
理活性について詳細にはふれていない。一方、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質をトリプシンで処理することによって得られる
、ヒトＴＮＦのアミノ末端の６アミノ酸が欠失した形の
ポリペプチドも生理活性を有している（特開昭６１−５
０９２３明細書）。

そこで、本発明者らは比活性の向上１反応スペクトルの
広域化、副作用の低減化等を目的として、ヒトＴＮＦ蛋
白質の改変について鋭意研究を行ない、本発明を完成す
るに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （ｔ−４２Ｎ）　−Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　
Ａｌａ　　ＡｓｎＰｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＬｅｕＧｌｎ　　Ｔｒｌ）
　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ａｒ（ｌ　　Ａｒ（＋　　Ａ
ｌａＡｓｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ
　　Ａｓｎ　　ＧｌｙＶａｔ　　Ｇｌｕ　　１−ｅｕ　
　ＡｒＯＡｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇ１ｎ１ｅｕ　　Ｖａｌ
　　Ｖａｔ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｑｌｙ
Ｌｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｔｙｒ　　
Ｓｅｒ　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＧｌｙＣｙｓ　　Ｐｒｏ　
　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＬ
ｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｒｇｌｌｅ　　Ａｌａ　　　Ｖａｌ　　　Ｓ
ｃｒ　　　Ｔｙｒ　　　Ｇｌｎ　　　ＴｈｒＬｌ／Ｓ　
　Ｖａｔ　　Ａｓｎ　　Ｌｆ！ｕ　　ｌｅｕ　　３ｅｒ
　　Ａｌａｌｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　
Ｃｙｓ　　Ｇｌｎ　　ＡｒｇＧｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒ
ｏ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＡｌａ　
　ｌｙｓ　　ｐｒｏ　　Ｔｒｐ　　Ｔｙｒ　　Ｑｌｕ　
　ｐｒ。

１１ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　
Ｖａｌ　　　ＰｈｅＧｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｒ０Ｌｅｕ　　　Ｓｅ
ｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　　ｌｉｅ　　Ａｓｎ　　Ａ
ｒｇＰｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｐ
　　Ｐｈｅ　　ＡｌａＧｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　
Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＧｌｙ　　　
Ｉ　　Ｉｅ　　　Ｉ　　Ｉｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ−（
ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドま
たはそのアミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを
提供することによって達成され、また上記新規抗腫瘍活
性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプ
ラスミドを提供することによって達成され、更にかくし
て得られた組換えプラスミドによって形質転換された組
換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて目的とするｌ
／ｉ規抗１１ｉ瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及び
この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物
を提供することによって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦＭ仏
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［［）　、
　Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかの］
トンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトＴＮＦｍ伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を右することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

ざらに、このヒトＴＮＦＷ伝子は、その上流及び下流に
作用するυ１限酵素の切断部位を用いることにより、適
当なベクターへのクローン化が可能になる。このような
ヒトＴ　Ｎ　、Ｆ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示
した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［＠　、Ｑ　、　Ｋ　ｈｏｒ
ａｎａ。

“３　ｏ＋ｎｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　□　ｅＶｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ　１
ｏｌｏａｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　
Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ　、　
　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］
　。

トリエステル法［Ｒ３Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｏｅｒら、Ｊ
。

Ａｎ＋、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１
＜１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅ
ｔｔ、、　２１．　７１９（１９８０）　］があるが、
合成時間、収率、操作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮ
Ａ合成機を用いたホスファイト法による合成が好ましい
。合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラ
ムによる高速液体クロマトグラフィー等を、適宜単独も
しくは組合せて用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦｆｆｌ伝子を作成する
方法としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブ
ロックに分けて連結し、たとえばｐＢ　Ｒ３２２［Ｆ　
、　　Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　
９５（１９７７）］のようなベクターに一度クローン化
した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方
法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成する
ブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好まし
くはｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴ　Ｎ　Ｆ
　３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列の下流
につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる
。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・オ
ペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。この発現型ヒトＴＮＦｍ
伝子を、たとえばｏＢ　Ｒ３２２のようなベクターにク
ローン化することにより、発現型プラスミドが作成でき
る。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドとして、好まし
くはｏＴＮＦ４０１ＮＮが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペブヂド道伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦｍ伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオヂドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４２４が用いら
れる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価： ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。

Ｇａｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−＋ｎ−株（ＡＴＣＣ３３５２５＞に導入することがで
きる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［王０Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｑ”　、　Ｐ　　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎｑ
）１ａｒｂｏｒ　　１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ　　（＋９８２）参照］があげられ、必
要に応じて、たとえば７ンビシリン等を添加するのが望
ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たと
えば系とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２
〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、
プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−イ
ンドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は１、マウスに移植し
たＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉ
ｖｏ活性測定法（ＣａｒＳ’１ｌｅｌｌ　ら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見ルｉｎ　
　ｖｉｔｒｏ活性甜定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

■ｒｎｒａｕｎｏ１．．ユ２６．　２３５（１９８１）
］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
価が好ましい。　− かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ遺伝子
を発現させる場合に比して、より高い発現量で抗腫瘍活
性を有する新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になる。また、得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドは
、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質にくらべて、数倍の比活
性を有しており、従って、この新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを用いることによって抗ｆｕｌｌのためのすぐれた
医薬組成物を提供することが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤＮＡの構造項伝子部分の塩基配列を基盤とし
て、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け
、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして３′側
に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及び丁ＡＡ）をそれぞ
れ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流にはｉｉ
ｌ＋限酵素ＣＩａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と
翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモー
ターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コド
ン下流には制限酵素Ｈｉｎｄｌ［Ｉによる切断部位を設
け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにし
た。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦｉ伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自初Ｄ　Ｎ　Ａ合成機〈アプライ
ド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわら、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
ＶＡ素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５ｄの溶出用ハラ７Ｆ　−［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ
　（ｐＨ７，５）　］を加え、３１℃で一晩振とうした
。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行
なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲ
ル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を１９た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のりＯ−ン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦＩ〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦＩ伝子
を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　　（１）Ｈ９，５）　　、　　１
０　　ｍＭ　　　Ｍ（ｌ　　Ｃ１ｚ　　。

５Ｉｌ１Ｍジチオスレイトール、ＩＯＩＩＩＭ　　ＡＴ
Ｐ水溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了
後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混
合し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリ
ヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μｇの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室基まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ交の６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ｔ−（Ｃ１（ａｔ−＋　　７．６）、　　　
６．６　　ｍＭ　　　Ｍｌ）Ｃｊｚ　　。

１０１Ｍジチオスレイトール、１１１ＭＡＴＰ水溶液に
溶解させ、３００ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
ｍ度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法によ
り泳動バクーンの観察を行なう。目的とする大きさく約
２２０ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の方
法に従ってポリアクリルアミドゲルより［）ＮＡを回収
する。

一方、３μ９の大ＩＩＩ菌用プラスミドＤＢＲ３２２（
約４．４Ｋｂｌ））を３０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−ＨＣＲ（１）Ｈ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃｌ　７　ｍＭＭ（ｌｃｆｚ水溶液に溶解させ、１
０ユニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バ
イオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行
なった。

υ１限酊素Ｃｆｆ１ａＩによる切断の後、フェノール抽
出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μすの５０　ｍＭＴｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　
Ｎａ　Ｃ４，１０ｍＭ　ＭｇＳ○４水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）を行ない
、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの観
察を行なう。プラスミドｐＢＲ３２２の大部分を含む約
３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出
し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　７ｗｔ
）の８Ｍ　　Ｎａ（ＪＯａ水溶液に溶解させた。Ｑ　ｈ
ｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃ，ｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋｂ
ｏのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ←５ａｌＩ）をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の
大部分を含む約３．７Ｋ　ｌａｐのＤＮＡ水溶液と混合
する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮ
Ａ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａ（Ｊ２法（Ｍ　、　Ｖ　、　Ｎ　ｏｒｇａｒ
ｄらの方法）の改良法で行なった。すなわら、５　ｍ（
ｌのし培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０
．５％ＮａＣｊ、　　ｐ）−１７，２＞にエシェリヒア
・コリＣ６００ｒ−１−株の１８時間培養基を接種し、
菌体を含む１８養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６
ａ、）が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷たい
マグネシウム・バッフｐ　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　（Ｊ
、　５　　ｍＭ　　ＭＩＪ　（Ｊ２゜５　ｇ＋Ｍ　　Ｔ
ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６，０℃）］中で２回洗い
、２ｄの冷したカルシウム・バッファー［１００ｍＭｃ
ａ　Ｃｊｚ　’、　２５０　　ｍＭ　　ＫＩＪ、　５　
ｍＭＭＣＩ　Ｃｏ２．５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　
（ＩＩＨ７，６゜０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５
分間放置する。

次に菌体をこの容最の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン
、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ、　　０．０８％
グルコース、　　ｐＩ−１７，２＞を添加し、３７℃で
１時間娠とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシ
リン（シグマ）３０μｇ／Ｉｄ、を含むし培地プレート
］に１００μＵ／プレートの割合で接種する。プレート
を３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得
られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を
用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により
、目的のプラスミドｐＴＮＦ１８Ｒ（約４．０Ｋ　ｈ＞
の取１がを確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩ
ＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋ　ｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴ
ＮＦ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ
３（約２．４Ｋ　ｂＤ）を、それぞれ作成した。第４図
及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ−ＮＦ
３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮ　Ｉ”ｍ伝子の一部を含むプ
ラスミドＩ）ＴＮＦｌＢＲ，１）ＲＮＦ２Ｎ及びＤＴＮ
Ｆ３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が
設計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、
　Ｍ、　Ｍａｘａｍら、　Ｍ　ｅｔｈｏｄＳＥｎｚｙｍ
ｏｌ、、６５．　４９９（１９８０）　］によってＷ１
ａした。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｏＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０Ｊ）のＤＮＡ断片（（Ｊａ　
ＩｅＳａｌＩ）をポＩＪ　７　り’Ｊ　／Ｌ／アミドゲ
ルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｇを１００μＮの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｊ
（ｐＨ７，５）　　、　　６０ｓ　　Ｍ　　　Ｎａ　　
Ｃｊ、　　７　　ｍＭＭｇｃｆｆ２水溶液に溶解させ、
４０ユニツトの制限酵素ｐｖｕｎ（宝酒造）を添加し、
３７℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３
の方法に準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例
２の方法に準じて、ヒトＴＮＦＷ伝子の一部を含む約１
７０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩｅｐｖｕ■）をポリア
クリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１ｏ
μ９も１００ｕ１の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ−Ｈ
Ｃｊ（ｐＨ７，５＞　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＬ　
７　ｍＭＭ（ｌｃｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ＰｖｕＩ［及び４０ユニツトの制限酵素）−
１ｉｎｄＩ［［＜宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切
断反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて
、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ
断片（ＰＶｔｌＩ←Ｈｉｎｄｌ［［）をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有、するプラスミド
ｐＹｓ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｌ））　５μ９を、上記と
同様に制限酵素Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｌｌ［で切断し、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実
施例３の方法に準じて、プラスミドｌ）Ｙ　Ｓ　３ＩＮ
の大部分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片＜（Ｊａ
Ｉ←ＨｉｎｄＩ［［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約　１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドＩ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含
む約４．７Ｋ　ｂＯのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−＋ａ
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ３
１伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約ｓ、２
Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そ
のプラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した
。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ２０μりを、実施例４の方法に準
じて制限酵素Ｃ１８工及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、それ
ぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤ
ＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約４，７Ｋ　ｂｐ、両方共
Ｃｊａ　Ｉ＋Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）をケルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ３１伝子全域を含む約４９０
ｂｐのＤＮＡ断片を５０μｍの１０１＋１Ｍ　　Ｔ　ｒ
ｉＳ−Ｈ（Ｊ　（ｐｔ−＋　７．４）　、　１０１１Ｍ
　　Ｍｇ　ＳＯ４、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に
溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造
）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反
応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡＩｇｉ片（
Ｈａｐ■←Ｈｉｎｄｌ）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

また、第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａ　Ｉ
ｅＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ）及びヒトＴＮＦｌ伝子の大部分を
含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＨａｌｌＩＩｅＨｉｎ
ｄＩ［ｌ）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェ
リヒア・コリＣ６００ｒ−ｉ−株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ４２４（約５．２Ｋ
　ｂｐ＞を有するクローンを選択した。このプラスミド
はＴＮＦのアミノ末端の１１アミノ酸を欠失させた形の
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、第７図
にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例５で得ら机だ、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４２４を有するエシェ
リヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株を、３０〜５０ｕ９／
Ｉｄのアンピシリン、０．２％のグルコース及び４η／
ｄのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　Ｈ
ＰＯ４−０，３％ＫＨ２Ｐｏｔ　−０，０５％ＮａＣ１
−０，１％ＮＨｓｃ１水溶液（１］Ｈ７，４）をオート
クレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌した
Ｍ（ｌｓＯ４水溶液及びＣａＣｆ２水溶液をそれぞれ最
終濃度２　ｍＭ及び０．１　ｍＭになるように加える。

］　　２００Ｉｎ１に接種し、ＯＤ　ｉ、ｅが０．７に
達するまで、３７℃で振どう培養を行なった。次いで、
最終濃度５０μｇ／ｍｅの３−β−インドールアクリル
酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間撮どう
培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｊを含む２０１１１Ｍリ
ン酸バッフＦ　＋、　　ｐｌ−１７，４）を用いて菌体
の洗浄を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッ
ファーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２０
０Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌
体残渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊバッフｐ　−（１）Ｈ６，８＞　、　ＳＤＳ、　
２−メルカプトエタノール ぞれ最終濃度６０ｍＭ，２％．４％，　１０％になるよ
うに加え、ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［
鈴木，遺伝，　３１．　４３　（１９７７）　］を行な
った。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ
，Ｔｒｉｓ−グリシン系［ｊＪ，　Ｋ，　ｌａｅｍｍｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ，ユ２７，　　６８０（１９７０）　］を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
ブルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、ＶＩｒ
ｙＡ抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行な
った。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒ　ｕ
ｆｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得
られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ートを順次培地で希釈した試料１００μ旦と、４　Ｘ　
１０５個／蛇の１度のマウス上−９２９繊維芽細胞（Ａ
ＴＣＣ　　ＣＣＬ−　９２９）懸濁液１００μ旦を、９
６穴の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で
混合した。なおこの際に、最終濃度１μシ／戒のアクチ
ノマイシンＤ（コスメゲン，萬有製薬）を添加しておく
。培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎
児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地
（日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％
炭酸ガスを含む空気中．３７℃で２０時間培養した後、
クリスタル・バイオレット溶液［５％（　ｖｏｌ／ｖｏ
ｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　
）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちのコを用
いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレッ
トを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレ
ットを１００μ文の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、そ
の５９５μｍにおける吸光度をＥしＩＳＡアナライザー
（東洋測器．ＥＴＹー９６型）で測定する。この吸光度
は、生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ
蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ラ
イぜ一部の希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の
値に相当する大腸菌ライゼートの希釈率をグラフ（第８
図）によって求め、その希釈率をユニットと定義する。

第８図より、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライゼート　１００μ又は１００〜
３００ユニツトの活性を有していることが咀らかになっ
た。

実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む
大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白％１　ｍは、プロテ
ィン・アッセイ・キット（バイオ・ラッド）を用いて定
量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線より計粋した
。上記で得られた活性の値及び蛋白質定石結果より新規
抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの比活
性を計算したところ、７０〜２１０（ユニット／クー蛋
白質）の比活性を有していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴ　Ｎ　Ｆ遺伝子の塩基配列を、
第２図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配
列を、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び
第５図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミド
ｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方
法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの
作成方法を示したものであり、第７図は新規抗腫瘍活性
ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４２４
の作成方法を示したものである。第８図は新規抗腫瘍活
性ポリペプチドの活性測定結果を示したものである。 高　４　回 ｖｕｆｆ 第７図ＯＢ 手続補正書 昭和６１年ノＯ月７　日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４２４である
   第３項記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする第７項記載微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活
   性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から
   新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする
   、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。