JPS6393799A

JPS6393799A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPS6393799A
Application number: JP61238048A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakamura; 聡中村; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-10-08
Filing date: 1986-10-08
Publication date: 1988-04-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えブラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細偶において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡＩａＬ−アラニンＡｒ！ｌ＋Ｌ−アルギニン、６．５ｎｌ−−アスパラギンＡｓｐ　　Ｌ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＱｌｎ　　Ｌ−グルタミンＧｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸Ｇｌｙ　グリシンＨｉＳ　　Ｌ−ヒスチジン１１ｅＬ−イソロイシンＬｅｕＬ−ロイシンＬｙｓＬ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンＰｈｅＬ−フェニルアラニンＰｒｏＬ−プロリンＳｅｒ　　Ｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシン ■ａＩ　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′）
はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示
すものである。

（２］　　発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌｌｓらは、［３ａｃｉｌｌｕｓ　　　Ｃ
ａｌｍｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉロ　（ＢＣＧ）などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（７ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏ
ｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　
Ｐ　ｒｏｅ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　、　コ（ＤＴＮＦはマウス、ウサ
ギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に
、しかも種を越えて動くことから、制癌剤としての利用
が期待されてきた。

最近になって、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦｉ伝子の発現について報告した（　Ｄ　、　　Ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　ぢ！１１２．
　７２４（１９８４）　］　、その後、０井ら［王、　
３　ｈｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［塞材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８
５）　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　Ｍ　ａ
ｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多１に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。

また、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についても、特開昭６１−４（
１２２１明細書にその可能性についての記載があるが、
生理活性について詳細にはふれていない。

一方、ヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ末端の一部が欠失した
形のポリペプチドも生理活性を有していることが知られ
ている（特開昭６１−５（１５）２３明細書及びＰＣＴ
出願公開Ｗ　０８６／　（１２３８１号）。

そこで、本発明者らは比活性の向上０反応スペクトルの
広域化、副作用の低減化等を目的として、ヒトＴＮＦ蛋
白質の改変について鋭意研究を行ない、本発明を完成す
るに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫Ｉ！活性ポリペプチドを提供
することにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、第１
図に示した１３番目のＶａｌから　１５７５７番目ｅｕ
までで表わされるアミノ酸配列において、１またはそれ
以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入がなされた
配列のうち、少なくとも１２２２２番目ｌｙの他のアミ
ノ酸残基への置換を含むような配列を含有する新規生理
活性ポリペプチドを提供することによって達成され、ま
た上記新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｍ域を含む組換えプラスミドを提供することによって達
成され、更にかくして得られた組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を
用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ず
る方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する
医薬組成物を提供することによって達成されることがわ
かった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ３４
仏子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、
　Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出１を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際し
ては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択するこ
とが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に
行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断
部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質を］−ドするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

ざらに、このヒトＴＮＦＩ伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦＩ伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそ机ぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法ヲトるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ、Ｇ　、Ｋ　ｈｏｒａｎ
ａ。

“Ｓ　Ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅＶｅｌｏｐｌ
ｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ　
ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆ３　ｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　Ｊ
　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　　
Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　’ｙ’ｏｒｋ　　（１９６１）　
］　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎａｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｎ＋、　　５ｏｃ０．８９．４８０１
（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水Ｍ基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばＤＢ　Ｒ３２２［Ｆ　、　
　Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡＩｇｉ片を含むプラスミドとして、好ま
しくはｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。この発現型ヒトＴＮＦＷ
伝子を、たとえばｐＢ　Ｒ３２２のようなベクターにり
Ｏ−ン化することにより、発現型プラスミドが作成でき
る。ヒトＴ　（ＮＦｍＦｍ発子発現型プラスミドて、好
ましくは１）ＴＮＦ４０１ＮＮが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
：こうして得られたヒトＴＮＦｆｆｌ伝予発現型プラスミ
ドを適当な、制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の
特定な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成
オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。か
かる手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任
意のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり
、または欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドを
コードする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能
になる。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４２４．
ｏ　ＴＮＦ４１６、ｐＴＮＦ４１４．ｐＴＮＦ４３１゜
ｐＴＮＦ４３２又はｐＴＮＦ４３３が用いられる。

：Ｃ）発現！Ｖ認及び活性評価：ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリ（：、　６
００ｒ−ｍ−ａ　（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入するこ
とができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地とじては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ　、　Ｍ　ａｎ
ｉａｔｉｓら編、“Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ”、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５Ｄｒｉｎ（ＩＨ
ａｒｂｏｒ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えなから、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見ルｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［ＲｕＨ、Ｊ。

１ｍｍｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　
］等により行なえるが、測定時間、定理性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐｅｎｎｉＣａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、ぢ３１２．
　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ前
駆体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設
け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′
側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれ
ぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流にはる
り限酵素（ＪａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′測翻訳終止コドン
下流には制限酵素）−１ｉｎｄＩＩ［による切断部位を
設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるように
した。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気波ｖＪ（ゲル濃
度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５ｄの溶出用バッファ　−［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ
　（ｐＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩撮とうした
。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行
なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲ
ル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけること
により、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお
、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰
り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかっ
た。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦｍ転子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ３ｉ
伝子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ３の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＱタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ磨の５０Ｉ
Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ−）１　（オ　（１）Ｈ９，５）　　、
　　１０　１Ｍ　　　　ＭＱ　　ＣＬｚ　　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、す
べての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、
フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μｓの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した侵室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ磨の６６　ＩＢ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（１）Ｈ７，６）　、　　６．６
　ａ＋Ｍ　　Ｍ＋Ｊ　Ｃ第２゜１０　ｍＭジチオスレイ
トール、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツ
トの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃
で１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エ
チジウムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を
行なう。目的とする大きさく約２２０ｂｐ　）のバンド
部分を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリル
アミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μ９の大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋｂｌ））を３０μ旦の１０１１１Ｍ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−ＨＣｆ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　、Ｎ
ａ　Ｃｆ、　７　ｎ＋ＭＭ（ＩＣλ２水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド
・バイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応
を行なった。

制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ塁の５０　ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｆ　（＋）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　
Ｎａ　Ｃ１，１０１１１Ｍ　　Ｍ！ＪＳＯａ水溶液に溶
解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミドｐＢＲ３２２の大部分
を含む約３，７ＫｂＤのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍口（ｖｏｌ　
、’ｗｔ）のＳＭ　　ＮａＣｌ０ａ水溶液に溶解させた
。（：、　ｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、３ｉｏｃｈｅｍ、　　１０
１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ←５ａｌＩ）をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦｍ転子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドＤＢＲ３２２の大
部分を含む約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−＋ｎ−株の形質
転換は、通常のＣａＣ第２法（Ｍ　、　Ｖ　、　Ｎ　ｏ
ｒｇａｒｄらの方法）の改良法で行なった。すなわち、
５ｄのし培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、
０．５％Ｎａ　Ｃ１，ＤＨ７，２＞にエシェリヒア−ｍ
ｌすＣ６Ｃ６００ｒ−株の１８時間培養基を接種し、菌
体を含む培養液の６００ｒ＋ａ＋における濁度（ＯＤ　
ｔｏｏ）が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷た
いマグネシウム・バッフ７−　［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ
Ｌ　５　ＲＩＭ　　ＭｇＣｌ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−Ｈ（Ｊ　（ｐ）−１７，６，０℃）］中で２回洗い、
２Ｉｄの冷したカルシウム・バッファー［１００ｍＭｃ
ａ　ＣＲ２，２５０１１１Ｍ　　ＫＣｆｆｉ、　５１Ｍ
ＭｇＣ１ｚ　、　５１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（１）
Ｈ７，６゜０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放
置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１，０，０８％グルコ
ース、　　ｐＨ７，２＞を添加し、３７℃で１時間娠ど
う培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シグ
マ）３０μ９７ｄを含むし培地プレート］に１００μＮ
／プレートの割合で接種する。プレートを３７℃で１晩
培養して、形質転換株を生育させる。得られたアンピシ
リン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡを
調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫｂ＋１）の取得を確認
した。、第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの作成方
法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ
　３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドＤＴＮＦ１ＢＲ，ＤＲＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ　
３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設
計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　
Ｍ、　Ｍａｘａｍら、　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙＩｌ
ｌｏｌ、、６５．　４９９（１９８０）　］によって確
認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミド１）ＴＮＦ１ＢＲ１０μ
３を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及びＳａ
１工で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ
　Ｉ＋５ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

次に、実施例３で得られたプラスミド１）ＴＮＦ２１０
μりを１００μ旦の１０１１１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−）１
ｃオ（ＤＨ７，５）　、　６０１１　Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１
，７１１１ＭｆＶＩｇ（Ｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユ
ニツトの制限酵素ＰＶｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７
℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方
法に準じて制限酵素５ａｌＨによる切断、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７ｏ
ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩＩ）をポリアク
リルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
℃ｇもｉｏｏμＪｌの１ｏ　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−１−
１（Ｊ（ｐＨ７，５）　　　、　　　６０　　ｍＭ　　
　　Ｎａ　　Ｃ１，７ｍＭｔＶＩｇｃｊｚ水溶液に溶解
させ、４０ユニツトの制限酵素ｐｖｕｌ）及び４０ユニ
ツトの制限酵素ＨｉｎｄＩ［［（宝酒造）を添加し、３
７℃で１時間切断反応を行なった。そして、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１
０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ［←ト１ｉｎｄＩ［［
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７ＫｂＤ＞　５μ９を、上記と同様
に制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄＩ［で切断し、アガロ
ースゲル電気泳動くゲル′ｍ度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３１Ｎの大部分を
含む約４．７Ｋ　ｂｌ）のＤＮＡ断片（（Ｊａｌ→）ｌ
ｉｎｄｎＩ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦＷ伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｌ）の３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドＤＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む
約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−ｍ
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ３
ｆｆ伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．
２Ｋ　ｂＤ）を有するクローンを選択した。第６図に、
そのプラスミドＩ）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示し
た。

実施例５く新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型ブーラスミ
ドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ　２０μりを、実施例４
の方法に準じて制限酵素ＣｊａＩ及び）ｌｉｎｄｌ［［
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）及びアガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％
）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成
する２つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｌ）及び約４，７Ｋ
　ｂｐ、両方共Ｃ１ａ　Ｉ＜−＋ｌ−１ｉｎｄ　ｍ　）
をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮ　Ｆ３ｉｔ伝子全域を含む約４
９０ｂｐのＤＮＡ断片を５０μ文の１０　ＩＩＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ　　（１）８　７．４）、１０＋１Ｍ　
　　ＭＩＪ　　ＳＯａ　　、　　１　１１１Ｍジチオス
レイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素
ＨａＤＩ［（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断
反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動くゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約３９０ｂｐ
のＤＮＡ断片（Ｈａｐ■←Ｈ４ｎｄＩ［［）をポリアク
リルアミドゲルより回収した。

また、第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（＋Ｊａ　Ｉ
４＋Ｈｉｎｄ　ＤＩ）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を
含む約３９０ｂｐノＤ　Ｎ　Ａ断片（）−１ａｐＩＩ＋
）−１ｉｎｄｌｌＩ）と混合し、エタノール沈澱の後、
実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準
じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、
形質転換株の中より目的のプラスミドＤＴＮＦ４２４（
約５．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。この
プラスミドはＴＮＦのアミノ末端の１１アミノ酸を欠失
させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであ
り、第７図にその作成方法を示した。

さらに、上記と同様な手法で、第７図記載の塩基配列を
有する合成オリゴヌクレオチドのかわりに第８図又は第
９図記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオチドを
用いることにより、ヒトＴＮＦのアミノ末端の１０又は
８アミノ酸残塁を欠失させた形新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドをコードする新規抗腫瘍活性ポリペプチド発現型プ
ラスミド１）ＴＮＦ４２１又はｐＴＮＦ４２６（共に約
５．２Ｋｂｐ）を、それぞれ作成した。

一方、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９
０ｂｌ）のＤＮＡ断片を５０μ文の１０１ＢＭＴｒｉｓ
−ＨＣｆ　（ｐｔ−＋　７．５）　、　６０　ｍＭ　　
Ｎａ　ＣＬ　７ｍＭＩＶＨ１ｃｊ２水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素ＡＶａＩ（宝酒造）を添加して
、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）を行な
い、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ″３１伝子ノ
大部分を含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断片（ＡＶａＩ←Ｈ
ｉｎｄｌＩ［）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第１０図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌ
クレオチドを、実施例２の方法に準じて、上の鎖と下の
鎖とに分けて合成、精製した。得られた２本の合成オリ
ゴヌクレオチドそれぞれ０．５μびについて、実施例３
の方法に準じて、末端のリン酸化を行なった後、アニー
リングさせた。

アニーリング侵の２本鎖オリゴヌクレオチドを、先に得
られた約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ■＋Ｈｉｎ
ｄｌｌｌ）及びヒトＴＮＦｌ転子の大部分を含む約４６
０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＡｖａＩ←Ｈｉｎｄ　■）と混
合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応
終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ
６００ｒ−ｅ−株に導入し、形質転換株の中より目的の
プラスミドｐＴＮＦ４１６（約５．２Ｋ　ｂＤ）を有す
るクローンを選択した。このプラスミドはＴＮＦのアミ
ノ末端の７アミノ酸を欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドをコードする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミドであり、第１０図にその作成方法
を示した。

さらに、上記と同様な手法で、第１０図記載の塩基配列
を有する合成オリゴヌクレオチドのかわりに第１１図又
は第１２図記載の塩基配列を有する合成オリゴヌクレオ
チドを用いることにより、ヒトＴＮＦのアミノ末端の６
または２アミノ酸残基を欠失させた形の新規抗腫瘍活性
ポリペプチドをコードする新規抗腫瘍活性ポリペプチド
発現型プラスミドｐＴＮＦ４２７又はｏ　ＴＮＦ４２８
　（共に約５．２ＫｂＤ）を、それぞれ作成した。

次に、実施例４で得られたヒトＴＮＦｌ伝子発現型プラ
スミドｏ　ＴＮＦ４０１ＮＮ５μ９を、３０μｐの５０
　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ７，５）　、　１
０　ｍＭＭｇＣｌｚ　、　１　　ｍＭジチオスレイトー
ル、１００ｍＭＮａＣｆ水溶液に溶解させ、１０ユニツ
トの制限酵素ＢｓｔＥＩＩにッポン・ジーン）を添加し
、６０℃で１時間切断反応を行なった後、さらに１０ユ
ニツトの制限酵素ＮｃｏＩにッポン・ジーン）を加えて
、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ア
ガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）を行ない、
実施例３の方法に準じてプラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ
（７）大部分’Ｆｒ：含ム約５．２Ｋｂｐ（７）ＤＮＡ
断片（ＢＳｔＩＩＧ−）ＮＣＯＩ）をアガロースゲルよ
り回収した。

また、第１３図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行なった後、アニーリングさせた。

アニーリング後の２重鎮オリゴヌクレオチドを、先に得
られた約５．２Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＢｓｔＥＩＩ←
ＮｃｏＩ）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェ
リヒア・コリｃ　ｓｏｏｒ−ｍ−株に導入し、形質転換
株の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４１４（約５．
２Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミ
ドはヒトＴＮＦの１２２番目のＧｌｙがＡｌａに置換し
た形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、
第１３図にその作成方法を示した。

さらに、第１３図においてプラスミドＩ）ＴＮＦ４０１
ＮＮのかわりにプラスミドｐＴＮＦ４１６を出発材料と
して用いることにより、ヒトＴＮＦのアミノ末端の７ア
ミノ酸残基の欠失及び１２２番目のＧｌｙのＡｌａへの
置換を有するような新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ４３１（約５，２Ｋ　ｂｐ＞を作成した。

第１４図に、ｐＴＮＦ４３１の作成方法を示した。

また、第１４図において、第１４図記載の塩基配列を有
する合成オリゴヌクレオチドのかわりに、第１５図又は
第１６図記載の合成オリゴヌクレオチドを用いることに
より、ヒトＴＮＦのアミノ末端の７アミノ酸残基の欠失
及び１２２番目のＧｌｙの［ｌｅへの置換を有するよう
な新規抗腫瘍活性ポリペプチド、又はヒトＴＮＦのアミ
ノ末端の７アミノ酸残基の欠失及び１２２番目のＧｌｙ
のＰｒｏへの置換を有するような新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドをコードする、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ４３２又はｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ
　４３３（共に約５．２Ｋ　ｂｐ）をそれぞれ作成した
。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られたヒトＴＮＦＷ転子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ又は実施例５で得られた、各種
の新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株を、３
０〜５０μｇ／ｄの７ンビシリン、０．２％のグルコー
ス及び４Ｒｇ／−のカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６
％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯ４−０，
０５％ＮａＣｊ−０，１％ＮＨａＣｆ水溶液（１）Ｈ７
，４）をオートクレーブ滅菌した後に、別途にオートク
レーブ滅菌したＭＣｌＳＯ４水溶液及びＣａＣｌ２水溶
液をそれぞれ最終濃度２　ｉＭ及び０．１　ｉＭになる
ように加える。１２００ｄ　ニ接種し、ｏＤｊ、、が０
．７ニ達スルマチ、３７℃で撮とう培養を行なった。次
いで、最終濃度５０μ９／ｒｄの３−β−インドールア
クリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間
撮とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　−（１５０１１１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０　ｍＭ
リン酸バッファー、　　ｐＨ７，４）を用いて菌体の洗
浄を行なった。洗浄後の菌体を１０ＩｄのＰＢＳバッフ
ァーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００
Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体
残渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファー　（ＤＨ６，８）　、　ＳＤＳ、　２
−メルカプトエタノール、グリセ０−ｊしを、それぞれ
最終濃度６０ｎ＋Ｍ、２％、４％、１０％になるように
加え、５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［銘木
、遺伝、υ−，４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＣ２
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［ｔＪ、　Ｋ、Ｌａｅｍｍｌｉ
。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なっ
た。結果の一部を複写して、第１７図に示した。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記ＲｕＨ
の方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得られ
た新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート
を順次培地で希釈した試料１００ｕ交と、４　Ｘ　１０
’個／−の濃度のマウスし一９２９１維芽細胞（ＡＴＣ
ＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μ交を、９６穴の組織
培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合した。

なおこの際に、最終濃度１μｇ／−のアクチノマイシン
Ｄ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培地とし
ては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含
むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（日本製薬
）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸ガスを
含む空気中、３７℃で２０時間培養した後、クリスタル
・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ０１）メタノー
ル水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル
・バイオレットを溶解させたちの］を用いて生ＩＱ胞を
染色した。余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し
乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレットを１００
μ旦の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎｍ
における吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋側器、
ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た１１Ｉ胞数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白質又
はＦＴＮＡ抗腫瘍活性ポリペブヂドを含む大腸菌ライゼ
ートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値に
相当する大腸菌ライゼートの希釈率をグラフ（たとえば
第１８図）によって求め、その希釈率をユニットと定義
する。第１８図より、実施例６で得られた発現型プラス
ミドｐＴＮＦ４３１にコードされる新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は約５０
ユニツトの活性を有していることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４３１に
コードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌
ライゼート中に含まれ総蛋白質量は、プロティン・アッ
セイ・キット（バイオ・ランド）を用いて定のし、ウシ
血清アルブミンを用いた検量線より計算した。上記で得
られた活性の値及び蛋白質窓間結果より新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの比活性を計算し
たところ、約１１０（ユニット／ｍ９−蛋白質）の比活
性を有していることがわかる。

また、実施例６で得られた各種発現型プラスミドによっ
てコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸
菌ライゼートについても、それぞれ著量の活性が認めら
れた。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦｍ伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を
示したものであり、第７図〜第１６図は各種新規抗腫瘍
活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドの作成方法を
示したものである。第１７図は新規抗腫瘍活性ポリペプ
チド遺伝子の発現確認結果を示したものである。第１８
図は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示し
たものである。嶌　４　図ト′しｕｆｆ第１０図（５’）−ＣＧＡＴＡＡＴＧＡＣＣ−（３’）（３’　
）−ＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＴ−（５電　）キ１〉氏（５’　）−ＣＧＡＴＡＡＴＧＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＧ
ＡＡＣＣ−（３瞥　）（３’）−ＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡ
ＧＡＡＧＴＧＣＴＴＧＧＧＧＣＴ−（５’）憚Ｂ　ｌ凰
ＯＢ慎１午１’ｌ　ｆｌ　Ｂ拓１ミ薗（Ｓ’）−ＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴ
ＣＴＧＧＧＡＡＴＣＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＣ；
ＡＡＧＧ−（３”１（３審）−ＣＡＴＡＣＴＣＧＧＧＴ
ＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＴＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＴＣＣＡ
ＣＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧ−（Ｓ’）第１＆口（ｓ　１）　−ＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴ
ＡＴＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＧ−（３１）（３１）　−ＣＡＴＡＣＴＣＧＧ
ＧＴＡＧＡＴＡＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＧＴＣ
ＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＧ−（５’　）辱級＋手続補正書（方式）％式％１、事件の表示特願昭　６１　　　　２３８（１４）８　　　号２、発
明の名称新規生理活性ポリペプチド３、補正をする者事件との関係　　特許出願人大阪市東区南本町１丁目１１番地（３００）帝人株式会社１、　明細書第４７頁下から第４行〜下から第２行に「
第１７図は・・・・・・である。」とあるのを「第１７
図は新規抗肩瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現結果を認
定したゲル電気泳動の写真を示したものである。」Ｋ訂
正する。２、　第１７図を別紙の通り訂正する。以　　上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番目
のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
なされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｙの
他のアミノ酸残基への置換を含むような配列を含有する
新規生理活性ポリペプチド。
（２）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番目
のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
なされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｙの
Ａｌａへの置換を含むような配列を含有する第１項記載
のポリペプチド。
（３）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番目
のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
なされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｙの
Ｉｌｅへの置換を含むような配列を含有する第１項記載
のポリペプチド。
（４）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番目
のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１ま
たはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入が
なされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｙの
Ｐｒｏへの置換を含むような配列を含有する第１項記載
のポリペプチド。
（５）少なくとも次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】を含む第１項記載のポリペプチド。
（６）少なくとも次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】を含む第１項記載のポリペプチド。
（７）少なくとも次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】を含む第１項記載のポリペプチド。
（８）アミノ末端にＰｒｏが結合していることを特徴と
する第１項記載のポリペプチド。
（９）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（
ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第１項記載
のポリペプチド。
（１０）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−
Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする
第１項記載のポリペプチド。
（１１）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−
Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特
徴とする第１項記載のポリペプチド。
（１２）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−
Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合している
ことを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
（１３）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合
していることを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
（１４）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ
）が結合していることを特徴とする第１項記載のポリペ
プチド。
（１５）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−
Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（
ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第１項記載
のポリペプチド。
（１６）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第
１項記載のポリペプチド。
（１７）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合していることを特徴
とする第１項記載のポリペプチド。
（１８）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａ
ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合しているこ
とを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
（１９）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｖａｌ−Ａｒｇ−
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｖｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）が結合し
ていることを特徴とする第１項記載のポリペプチド。
（２０）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−
Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（ＣＯＯＨ）
が結合していることを特徴とする第１項記載のポリペプ
チド。
（２１）アミノ末端に（Ｈ＿２Ｎ）−Ｇｌｎ−Ａｌａ−
Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｔ
ｈｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−（Ｃ
ＯＯＨ）が結合していることを特徴とする第１項記載の
ポリペプチド。
（２２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴
とする第８項〜第２１項のいずれかに記載のポリペプチ
ド。
（２３）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
がなされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｙ
の他のアミノ酸残基への置換を含むような配列を含有す
る新規生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミド。
（２４）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
がなされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｖ
の他のアミノ酸残基への置換を含むような配列を含有す
る新規生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドにより形質転換された組換え微生
物細胞。
（２５）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特徴とする第
２４項記載の微生物細胞。
（２６）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
がなされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｖ
の他のアミノ酸残基への置換を含むような配列を含有す
る新規生理活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドにより形質転換された組換え微生
物細胞を培養し、培養物中に新規生理活性ポリペプチド
を生成蓄積せしめ、得られた培養物から新規生理活性ポ
リペプチドを分離することを特徴とする、新規生理活性
ポリペプチドの製造方法。
（２７）第１図に示した１３番目のＶａｌから１５７番
目のＬｅｕまでで表わされるアミノ酸配列において、１
またはそれ以上のアミノ酸残基の置換、欠失または挿入
がなされた配列のうち、少なくとも１２２番目のＧｌｖ
の他のアミノ酸残基への置換を含むような配列を含有す
る新規生理活性ポリペプチドを含有する医薬組成物。