JPS63279799A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドは■ＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａｌ−アラニン Ａｒ（１１−アルギニン ＡＳｎ　Ｌ−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ’Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨｉｓＬ−ヒスチジン Ｊｌｅｌ−−イソロイシン １−ｅｕｌ−一ロイシン ＬｙＳ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン ｐｒｏＬ−プロリン Ｓｅｒ　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルホ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′）
はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示
すものである。

（２）発明の背蜆 Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓ
ｔｓＦａｏｔＯｒ　、以下ＴＮＦと略記することもある
）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　Ｐ
　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になって、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　
７２４（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、　５
ｈｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａ＋ｖ。

ら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇら、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、ユ２８
．　１４９（１９８５）　　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕ
ｔら［Ａ　、　　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［３、Ｂｅｕｌｔｅｒ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ポプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、ユ６２
．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ
，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９
．　５１６（１９８６）　１等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ　ｓ　ｒｙ及びＣｙｓ／Ｄ／のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願
公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６ｌ−１０６７
７２）　、Ｇ　ｌｙ／ＪＪの他のアミノ酸残基への置換
（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０
４８号）。

Ａ１ａ／ｊ′の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１
−２３３３３７号）が報告されている。また、アミノ末
端側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失
ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特　。

開開６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細
胞障害活性を有していること（特願昭６１−９００８７
号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮ、Ｆが細胞障害活性を
有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦに
おいて極大になること（ＰＣＴ出願公開Ｗ　０８６／　
０２３８１号〉、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活
性を有していること（特願昭６１−１１４７５４号）、
及び１１アミノ酸欠失１７ＮＦが細胞障害活性を有して
いること（特願昭６１−１７３８２２号）が報告されて
いる。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ）　−Ｐ、ｒＯ−８ｅｒ−ＡＳＩ）−Ｌｙｓ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｈｉｓ　−Ｖａ
ｌ　−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　５ｎ−Ｐ　ｒｏ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｑ　ｌｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ　
−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　Ｉａ　−
Ａｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　
ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅ、
ｔｌ−Ａｒ（］−］ＡＳＬ−ＡＳｎ−ＧＩｎ−Ｌ　ｅｕ
　−Ｖａｔ　−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−３ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　
−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙ
ｒ−８ｅｒ　−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙ
ｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　
−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　
−１１ｅ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｒａ　−１１ｅ　−Ａ　Ｉ
ａ　−Ｖａｔ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ
ｈｒ　−ＬＶＳ　−Ｖａｌ　−Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｌａ　−１ｌｅ　−Ｌｙｓ
−８ｅｒ　−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ　−ＡｒＱ−
Ｇ　Ｉｏｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−
Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔ
Ｖｒ−Ｌｅｌｌｌ−ＧＩＶ−ＧＩＶ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−
Ａｓｐ−Ａ　ｒＱ　−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｌａ
　−Ｇ　ＩＬＩ　−Ｉ　ｌｅ　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒｏ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　８Ｄ　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｌ　ｅＵ　
−Ａ　ＳＤ　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｔ　−Ｔ
　ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−ｌ１ｅ−Ａｌａ−
Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを提供するこ
とによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを
提供することによって達成され、更にかくして得られた
組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物
細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供することによ
って達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦｌ転子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、　Ｐ
ｅｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としテハシエステル法［Ｈ，Ｇ’、　Ｋｈｏｒａｒ
ｒａ。

“３　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　［）　ｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　　ｉｎ（：、　ｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ
　　Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏ
ｆＢ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　
”　、　　Ｊ　ｏｈｎ　　　Ｗ　１ｌｅＶａｎｄ　　　
５ｏｎｓ　　、　　Ｉｎｃ、、ＮｅＷ　　Ｙｏｒｋ　　
（１９６１）　　］。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｏｅｒら
、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、８９．４８０１（１９
６７）　］及び−ホスファイト法［Ｍ、　ＤｏＭａｔｔ
ｅｕｃｃｉら。

Ｔ　ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　　Ｌ　ｅｔｔ、、　　２
１．　　７１９　（１９８０）　　コ　があるが、合成
時間、収率、操作のｉ便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合
成機を用いたホス゛ファイト法による合成が好ましい。

合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラム
による高速液体クロマトグラフィー等を、適宜単独もし
くは組合せて用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはｐＹｓ３１Ｎ、又は
ｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
ｌｐｐターミネータ−１ｔｒｐ　Ａターミネータ−等が
あげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好
適であり、ｔｒｐＡターミネータ−を有するプラスミド
として、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この
発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえば１）ＢＲ３２２由
来のベクターにクローン化することにより、発現型プラ
スミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はｐＴＮＦ
４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；　□ こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ　４１６．　　
ｐＴＮＦ４１６Ａ又は１１ＴＮＦ４７７が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮ　Ｆ３！伝子発現型プラ
スミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒ
ｏａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリ（：、　６
００ｒ−１株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することが
できる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［ＴｏＭａｎｉａｔ
ｉｓら編、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｑ”　、
　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎ。

Ｈａｒｂｏｒ　　１−ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ
　　’ｙ’ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で
２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−
インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＯ８と略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウスし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

１ｍｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　］
等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便さ
等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評価
が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　］の報告したヒトＴＮＦ前駆体
ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として
、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、
５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′側に
２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ’）をそれぞ
れ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限
酵素ＣｊａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開
始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターと
の連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下流
には制限酵素ＨｉｎｄＩ［による切断部位を設け、ベク
ター・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライ、
ド・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった
。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア
水溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保
護基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル
（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量
の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７
Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５ｄの溶出用バッフｐ　−［５００１
１１Ｍ　　ＮＨ４ｏＡｃ　−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％
ＳＯ８（ｐＨ７，５）コを加え、３１℃で一晩振とうし
た。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を
行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド＜
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μびの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトの１
４−ポリヌクレオチドキナーゼ＜Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ皇の５０１
１１ＭＴｒｉｓ　ＨＣｆ　（ＤＨ９，５）　、　１０　
ｍＭ　　ＭＯＣＩ２゜５　ｍＭジチオスレイトール、１
０ＩＩｌｖ　　ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、３０分間
行なった。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチ
ド水溶液をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽
出によりＩ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去
する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（＋）Ｈ７，６）　、　　６．６　
ｍＭｖｇＣ１２゜１０　ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
ＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトの７４−Ｄ
ＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連
結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジウムブロ
マイド染色法により泳動パターンの観察を行なう。目的
とする大きさく約２２０ｂＥ））のバンド部分を切出し
て、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミドゲルよ
りＤＮＡを回収する。

一方、３μ９の大賜菌用プラスミドＤＢＲ３２２（約４
．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ磨の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣＲ（＋）８７．５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　
ＣＬ　７１１ＭＭｇＣＲ２水溶液に溶解させ、１０ユニ
ツトの制限酵素Ｃ夕ａＩにューイングランド・バイオラ
ブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった
。

制限酵素（ＪａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μρの５０ＩＩＩＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（＋）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　
　Ｎａ　ＣＬ　１０ｍＭ　　Ｍ＜１８０４水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミドｐＢＲ３２２の大部分を
含む約３．７Ｋｂｌ）のＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　
／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣＲＯａ水溶液に溶解させた。

Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃ，ｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、３　ｉｏｃｈｅｍ、ユ０
１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ←５ａｌＩ）をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端の
リン酸化反応を行なった後、プラスミド１）ＢＲ３２２
の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｌｌのＤＮＡ水溶液と混
合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両Ｄ
ＮＡ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−ｍ−株の形質転換は通
常のＣａＣ９２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの方
法）の改良法で行なった。すなわち、５ＩｄのＬ培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ（
Ｊ、　　ｌ）Ｈ７，２）にエシェリヒア・コリＣ６００
ｒ−ｍ−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養
液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ　ｔｍ）が０．３に
達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バ
ッファー　［０，ＩＭ　　Ｎａ　ＣＬ　５１１１Ｍ　　
Ｍ（］　Ｃｊｚ　。

５　ＩＩＩＭ　　Ｔｒｉｓ−１−ＩＣｆ　（ｐＨ７，６
，０℃）］中で２回洗い、２＃１１！の冷したカルシウ
ム・バッファー［１００ｍＭＣａ　（Ｊｚ　、　２５０
　　ｍＭ　　ＫＣｆ、　５１１１ＭｖｇＣｊ２　、５　
＋１１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ＥＩＨ７，６゜０℃
）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣＢ、　　０．０８％グ
ルコース、　　ｌ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時
間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）３０μｇ／＃ｌｉ！を含むＬ培地プレート］
に１００μＵ／プレートの割合で接種する。プレートを
３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得ら
れたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用
いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、
目的のプラスミドＤＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｌ）
）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１
ＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｌ１ＩＴＮ
Ｆ３（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４
図及び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ
３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ、Ｍａ
ｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙａ＋ｏ１．．６５
．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μグ
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜ＣＪａ　
Ｉ　Ｈ８ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
ｕ９を１００μｕの１０１１１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−）Ｉ
　ＣＲ（ｐ）ｌ　７．５＞　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　
Ｃｆｆ１．７　ｍＭＭ（ｌｃｆｚ水溶液に溶解させ、４
０ユニツトの制限酵素ＰＶｕＩＩ（宝酒造）を添加し、
３７℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３
の方法に準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例
２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ３１伝子の一部を含む約
１７０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩ［）をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３１０μ
９も１００μすの１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１−１（Ｊ（
１）Ｈ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，７ｍ
ＭＭＯＣｆ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵
素ＰｖｕｌＩ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ
（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約１ｉｏｂｐのＤＮＡ断片（ＰＶＬＩ
Ｉ［←ＨｉｎｄＩ［）をポリアクリルアミドゲルより回
収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミド１
）ＹＳ３１Ｎ（約４，７Ｋｂ１１）　５μ９を、上記と
同様に制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄＩ［Ｉで切断し、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実
施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３ＩＮの大部
分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩ←Ｈ
ｉｎｄｎｌ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ３１伝子の一部を含む約
２２０ｂｐ、約ｉ　７ｏｂｐ及び約１１０ｂｐの３つの
ＤＮＡ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含
む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−＋ｎ
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ
　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、その
プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹ８３１Ｎ５μ９を、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、さらに
制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［で切断し、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準じ
て、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ
断片［Ｐ　ｖｕＩ［（２）　＋−１Ｈｉｎｄ　Ｉ［［］
をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＩ　（２Ｊ”　Ｈｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ　］と混合し、エタ／−）Ｌｔ沈澱０）後、実施例
３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反
応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエ
シェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−ｍ−株に導入し、形質転
換株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋ
　ｂｐ）を有するクローンを選択した。このようなプラ
スミドは、プラスミド１）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数
制御領域除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するク
ローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネ
ータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクター
であり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドＩＩＡＡ４１　２μシを、上記と同様に
制限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄｕ［で切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミドｌ）Ａ　Ａ　４１の大８１１
を含ム約２．７ＫｂｐノＤＮＡ断片（ＣｊａＩ−）１ｉ
ｎｄｌｌｌ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＩＩＴＮＦ　４０１ＮＮ５μグを、上記と同様に制限酵
素Ｃ＃ａＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｌ
ｌのＤＮＡ断片（ＣＲａ　Ｉ　ＨＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ）を
ポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｌ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂ１１）を有するクローンを選択した。このプラスミド
は、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を
有しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ３１１伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮ２０μりを、実施例４の方法
に準じて制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌ［［で切断し
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及
びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つ
のＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約４，７Ｋ　ｂｐ、両
方共ＣＲａ　Ｉ”Ｈｉｎｄ　ｌｌ）をゲルより回収した
。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ文の１０１１１Ｍ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５＞　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　
、ＣＬ　７　ｍＭＭ（ｌｃｊｚ水溶液に溶解させ、１０
ユニツトの制限酵素ＡＶａＩ（宝酒造〉を添加して、３
７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、
実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を
含む約４６０ｂｐのＤＮＡ断片（ＡｖａＩ＋Ｈｉｎｄ■
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチドを、実施例２の方法に準じて、上の鎖と下の鎖
とに分けて合成、精製した。得られた２本の合成オリゴ
ヌクレオチドそれぞれ０．５μ９について、実施例３の
方法に準じて、末端のリン酸化を行なった後、アニーリ
ングさせた。

アニーリング後の２本鎖オリゴヌクレオチドを、先１ｃ
　４８うｉｔ　ｔｃ約４．７Ｋ　ｂｐ、（７）　Ｄ　Ｎ
　Ａ断片（（ＪａＩ−１−１ｉｎｄｌＩ［）及びヒトＴ
ＮＦ遺伝子の大部分を含む約ａｅｏｂｐのＤＮＡ断片（
ＡｖａＩＨＨｉｎｄ　［１）と混合し、エタノール沈澱
の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１１−株
に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドＤＴＮ
Ｆ４１６（約５．２Ｋ　ｂｌ））を有するクローンを選
択した。このプラスミドはＴＮＦのアミノ末端の７アミ
ノ酸を欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードする新規抗腫瘍活性ポリペプタド遺伝子発現型プラ
スミドであり、第９図にその作成方法を示した。

さらに、ｐＴＮＦ　４０１ＮＮから１）ＴＮＦ４０１Ａ
を作成した場合と同様な方法により、ＴＮＦのアミノ末
端の７アミノ酸が欠失した形の新規抗腫瘍活性ポリペプ
チド遺伝子を効率良く発現させる能力を有する発現型プ
ラスミドｐＴＮ　Ｆ　４１６Ａ　（約３．２Ｋｂｌ））
を作成した。第８図その作成方法を示した。

上で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ　４１６Ａを、
実施例３の方法に準じて制限酵素ＨｉｎｄＤＩ及び３ａ
ｌ■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）及びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．
８％）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、
生成する２つのＤＮＡ断片（約２７０ｂｐ及び約２．９
Ｋ　ｂｐ、両方共５ａｌＩＨ′Ｈｉｎｄｌ［Ｉ）をゲル
より回収した。

ここで得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の３
′側半分を含む約２７０ｂｐのＤＮＡ断片を５０μρの
１’ＯｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（＋）Ｈ７，４）　
、　１０ｍＭ　　Ｍｇ８０４　、１　　ｍＭ　　ジチオ
スレイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵
素５ａｕ３ＡＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間
切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の３′
側の部分を含む約１９０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｓａｕ３
ＡＩ＋Ｈｉｎｄ　［［）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ　４’−
Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．９Ｋ　ｂｐのＤＮ入断片（ＳａｌＩ→
ＨｉｎｄＩ［［）及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の３′側の部分を含む約１９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｓ
ａｕ３ＡＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）と混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リ（：、　６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中
より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７７（約３．２Ｋｂ
ｌ））を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、次のアミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ　）　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ　−Ｌ　ｙＳ
−Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ　−Ｖａｔ　
−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｎ
−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ＩＶ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅＵ　−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｉＵ−Ａ　
Ｓｎ−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｒＱ−Ａ　Ｉａ−Ａ’５ｎ−Ａ
　１ａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａｓｎ　−
Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｏ−Ａｓｐ−Ａ
’ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｔ　−Ｖａｌ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　＋ｙ　−Ｌ
ｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｙｒ　−
３ｅｒ　−Ｇｌｎ−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ　−Ｇ　＋ｙ　−ＣＶＳ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−ＨｉＳ　−Ｖ　ａｔ
　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈ１ｓ−Ｔｈｒ−１ｌｅ
−５ｅｒ−Ａｒ（１−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔ　ｈｒ−’Ｌ　ＶＳ−Ｖａｌ−Ａ
　ｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ａｌａ−１１ｅ−
Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａ　ｒ（１
−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ
　Ｉｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　
ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　ｌｕ
　−’Ｐｒｏ　−Ｉ　１ｅ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−ＧＩＶ
−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ＡｒＯ−’Ｌｅｕ−８ｅｒ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ　−Ｉ　Ｉｅ−Ａｓｎ　−Ａｒａ−Ｐ
ｒｏ−Ａｓ’ｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ
　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓｅｒ　］Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｖａｔ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ｌ１ｅ−
１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例５で得られた、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミド１ｌＴＮＦ４１６゜＋１ＴＮＦ
４１６Ａ又はｐＴＮＦ４７７を有するエシェリヒア・コ
リ（：、　６００ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／ｄの
アンピシリン、０．２％のグルコース及び４　＃／ｄの
カザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％ＮａｚＨＰ０４−
０．３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣＲ−０，１
％ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１１Ｈ７，４）をオートクレーブ
滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭｇＳＯ
４水溶液及びＣａＣＪ２水溶液をそれぞれ最終濃度２１
１１Ｍ及び０．１　ｍＭになるように加える。］　　２
５０＃ｌｌ！に接種し、ＯＤ、＜、ρが０．７に達する
まで、３７℃で振どう培養を行なった。次いで、最終濃
度５０μｇ／−の３−β−インドールアクリル酸を培養
液中に添加し、さらに３７℃で１２時間振どう培養を続
けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフ７
−　（１５０ｍＭ　　Ｎａ　ＣＲを含む２０　ｎ１ｙｌ
リン酸バツフアー、　　ＩＩＨ７，４）を用いて菌体の
洗浄を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッフ
ァーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００
Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体
残漬の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
Ｈ（ＪバッフＦ　　（ｐｔ−ｔ　ｅ、ａ）　、　ＳＤＳ
、　２−メルカプトエタノール、グリセロールを、それ
ぞれ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるよう
に加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴
木、遺伝、■、　４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｌｌ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なっ
た。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（呂律、　
ＧＳ−９３０型）にかけて、産生された新規抗腫瘍活性
ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算
出を行った。その結果、発現型プラスミド１１ＴＮＦ４
１６を有する大腸菌における新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドの産生量は、発現型プラスミドｐＴＮＦ４１６Ａの場
合の約５０％にすぎず、発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１
及び発現型プラスミドｐＴＮＦ４１６Ａの有用性が示さ
れた。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記ＲｕＮ
の方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得られ
た新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート
を順次培地で希釈した試料ｉｏｏμすと、４　ｘ　ｉｏ
５個／−の濃度のマウスＬ−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣ
ＣＣ０Ｌ−９２９）懸濁液１００μ磨を、９６穴の組織
培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合した。

なおこの際に、最終濃度１μｇ／＃ｌ！！のアクチノマ
イシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培
地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血
清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（日
本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸
ガスを含む空気中、３７℃で１８時間培養した後、クリ
スタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ０１）メ
タノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリ
スタル・バイオレットを溶解させたもの］を用いて生細
胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを洗い
流し乾燥した後、残ったクリスタル中バイオレットを１
００μＡの０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５
ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋測
器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き
残った細胞数に比例する。そこで、新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない
対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼート
の希釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって求め
、その希釈倍率をユニットと定義する。第１１図より、
実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４７７に
コードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート
　１００μρは９０ユニット程度の活性を有しているこ
とが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４７７に
コードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌
ライゼート中に含まれ総蛋白質量は、プロティン・アッ
セイ・キット（バイオ・ランド）を用いて定量し、ウシ
血清アルブミンを用いた検量線より計算した。上記で得
られた活性の値及び蛋白質定量結果より新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの比活性を計算し
たところ、約１３０（ユニット／ＩＦＪ−蛋白質）の比
活性を有していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ３１１仏子の塩基配列を、
第２図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配
列を、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び
第５図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミド
ｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方
法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの
作成方法を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の
作成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プ
ラスミド１）ＴＮＦ　４０１Ａ及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４１６Ａの
作成方法を、それぞれ示したものである。第９図は新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１１１
７ＮＦ４１６の作成方法を、そして第１０図は新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１１７ＮＦ
４７７の作成方法を、それぞれ示したものである。第１
１図は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示
したものである。 特許出願人　帝　人　株　式　会　礼 式　　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純　　博１
　邑 第９図 第１０閏め巳 ）（ｉ抗σ１ 荀払伴ヤ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。 （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。 （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。 （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。 （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。 （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４７７である
   第３項記載のプラスミド。 （７）次のアミノ酸配列 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。 （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする第７項記載微生物細胞。 （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。 （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
   酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
   医薬組成物。