JPH0330693A

JPH0330693A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH0330693A
Application number: JP1165407A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakamura; 聡中村; Kaku Katou; 加藤　革; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1991-02-08

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリベブヂド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗ＩＩＩ瘍活性ポリペブヂドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡｌａＬ−アラニンＡｒ０Ｌ−アルギニンＡｓｎＬ−アスパラギンＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＱｌｎ　　Ｌ−グルタミンＱｌｕｌ−−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシンＨＩＳＬ−ヒスチジン１１ｅＬ−イソロイシンＬｅｕＬ−ロイシンＬｙＳ　Ｌ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンＰｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−プロリン３ｅｒｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｌ）Ｌ−・トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｔ　　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（０００
日）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示ずものであり、〈５′）−及び（３′　
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（′２Ｊ　　発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａ
ｌｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、
　ｌ−）　ｒｏｃＪｌ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　ＳＡ　、　７２．３６６６　
（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、ヒ
ト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しか
も種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待
されてきた。

最近になって、ｐｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の発現について報告した［０．　　Ｐｃｎｎ１
ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４（
１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、３　ｈｉｒａ
ｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ旦、　　８０３＜１９８５）　３　
、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、　１２．　１６０＜
１９８５）　］　、Ｗａｎ（１ら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇら
、　３　ｃｉｃｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８
５）　］　及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ
　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多聞に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌未明や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクブ
ンがＴＮＦに非常に類似シテオリ［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド吊が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への彰’Ｉ！［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｎ１ｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　　１
６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［０，
Ｒ，ＢｅＨｏ１ｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９
．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓ’２及びＣｙＳ／ｌ’／のいずれ
か又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換
（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６
ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　Ｉｙ叫の他のアミノ酸残基
への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−
２３８０４８号）　、　Ａ　Ｉａ／ＬＰの他のアミノ酸
残基への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告さ
れている。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失に
ついても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有し
ていること（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸
欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６
１９００８７号）、　１〜１０アミノ酸欠失ＴＮ　Ｆｔ
ｆｉ細胞障害活性を有しており、その比活性は６〜８ア
ミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＯＴ出願
公開ＷＯ３６／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１１１
４７５４号）、及び１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害
活性を有していること（特願昭６１−１７３８２２号）
が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ　）　−ＡｒｌＪ　−Ｌｙｓ−Ａｒ（＋−Ｌｙ
ｓＰｒｏ−Ｖａｔ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ａｌａ−
ＡＳｎ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕＧ　Ｉｎ　−
Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　
ｒＱ−△１ａ−Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉａ　−１ｅｕ　−Ｌ
　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ＩｙＶａｌ−Ｇ
ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａｒ（１−Ａｓｌ）−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｔ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ＩｙＬｅｕ　−Ｔｙｒ　−
Ｌ　ｅｌｌ　−Ｉ　Ｉｃ　−Ｔｙｒ　−３ｅｒ−Ｑ　Ｉ
ｎＶ　ａｔ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｎ−Ｇ　ｌｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ
　−５ｅｒ−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−
Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　−１’
ｌｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｒ（１−［１ｅ−Ａ　ｌａ　
−Ｖａｌ　−Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔｈｒ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ
−Ａ　ｌａｌ　１ｅ−Ｌｙｓ−ｓｃｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
−ＧＩｎ−ＡｒｇＧ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　ｌａ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒ。

Ｉ　ｌｅ　−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌ
ｙ　−Ｖａｔ　−Ｐｈｅ　−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　
ｌｕ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　５ｌｌ−Ａ　ｒ（ＩＬ
　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒ−Ａ　　ｌａ−Ｇ　　ｌｕ−１ｌｅ
−△　ｓｎ−Ａ　ｒＱ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ｔ
　Ｖｒ　−Ｌ　ｌ　−Ａ　Ｓｐ−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　Ｉａ
　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｖ　ａｔ　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｙ　−１
ｌｅ　−Ｉ　Ｉｃ−Δｌａ　−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ）
で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にがくして１ｑられた組換えプラスミドによって形
質転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用い
て目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生する方
法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬
組成物を提供することによって達成されることがゎかっ
た。

以下本発明について更に詳細に説明する。

＜Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｃｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかの］ト
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦＩ仏子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ま（）い。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を右することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦｌ伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［）−１、Ｇ　、　Ｋ　ｈｏ
ｒａｎａ。

”　３　ｏｎｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　［）　ｅｖｃｌｏ
ｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　
Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆ３　
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　［ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　
Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　　　Ｓ　ｏｎｓ
　　、　　　ｌ　　ｎｃ、、Ｎｅｗ　　　Ｙｏｒｋ　　
　（１９６１）　　］　　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　ＣｈｅＩＩｌ、　　Ｓａｃ、、８９．４８０
１（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉう。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全白ＩＪ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成機を用
いたホスファイト法による合成が好ましい。合成したオ
リゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる＾速
液体クロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せ
て用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水１！基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナー
ゼを用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえ
ば”ｒ　４−　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼを用いて連結する。

合成オリゴヌクレオチドを連結してヒトＴＮＦｌ仏子を
作成する方法としては、合成オリゴヌクレオチドをいく
つかのブロックに分けて連結し、たとえばＩ）ＢＲ３２
２［Ｆ　、　　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　（３ｅｎｅ　
　、　　２．　９５（１９７７）　］のようなベクター
に一度クローン化した後、それらの各ブロックのＤＮＡ
断片を連結する方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ
遺伝子を構成するブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミ
ドとして、好ましくはｐＴＮＦ１１３Ｒ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴ　Ｎ　Ｆ遺伝子
を構成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した復、適当
なプロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガー））配
列の下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすること
かできる。使用可能なプロモーターとして、トリプトフ
ァン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）
。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくは１）ＹＳ３１Ｎ、又
はｌ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦｍ転子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発現
型ヒトＴＮＦＩ仏子を、たとえばＤＢＲ３２２山来のベ
クターにクローン化することにより、発現型プラスミド
が作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドとし
て、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＩ）ＴＮＦ　４
０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦＥｆｉ伝子発現型プラスミ
ドを適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特
定な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オ
リゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かか
る手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能に
なる。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発
現型プラスミドとして、好ましくはＤＴＮＦ４８３が用
いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｎ＋株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、ＭａｎｉａＮ
ｓら編、“Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”　、
　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎａ１−（ａｒ
ｂｏｒ　　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　　、Ｎｅｗ　　’
ｙ’ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能さける目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、得られた菌体中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウ
ム（以下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリ
ルアミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中
の蛋白質を適当な方法を用いて染色する。発現型プラス
ミドを含まない微生物細胞を対照として泳動パターンを
比較することにより、新）Ａ抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子の発現をＦｉｌＨする。

目的とするヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドが、大腸菌菌体内に可溶性蛋白質として産生され
る場合には、培養後の組換え微生物細胞の超音波破壊に
より得られるライゼートより、容易に目的とする蛋白質
を回収できる。目的とするヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗
腫瘍活性ポリペプチドが、大腸菌菌体内に不溶性のイン
クルージヨン・ボディを形成する場合には、たとえばＫ
　ａｗａｑｕｃｈｉらの方法［Ｙ。

Ｋ　ａｗａｇｕｃ旧ら、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ、、　　１　、　３０７（１９８４）　］に準じて
、可溶化・再構成を行なえば良い。一般に、大腸菌の膜
蛋白質の徂はあまり多くはないため、目的とする蛋白質
がインクルージフン・ボディとして産生される場合には
、可溶化の操作のみで比較的高純度の目的物が得られる
ことがある。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｊｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌら、前出）、マ
ウスＬ細胞に対するａ１１１障古性を見るｔｎ　　ｖｔ
ｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、、ユ２６．　２３５（１９１１１１）　１等に
より行なえる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライぜ一トからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。

かくして本発明によれば、従来公知のヒｌ−ＴＮＦ蛋白
質とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可
能になり、この新規抗ｌｌ！瘍活性ポリペプチドを用い
ることによって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提
供することが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎＩＣａら［Ｄ。

Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃｏ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素にょろり所部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には
ｔ、ＩＩ限酵素Ｃ！ａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配
列と翻訳開始］トン間を適切な状態に保った形でのプロ
モーターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止
コドン下流には制限酵素１−１ｉｎｄｎｌによる切断部
位を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるよ
うにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦｍ仏子は、第２図に示したように１
１本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全白１ｎＤＮＡ合成機（アプライド
・バイオシステムズ。

モデル３８ＯＡ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわら、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついＣ１７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きざのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５Ｉ＋！ｉ２の溶出用１＜ッ７７−［５
００１Ｍ　　ＮＨ４０Ａｃ　−１ａ１ＭＥＤＴΔ−０，
１％ＳＤＳ　（ＤＨ７，５＞　１を加え、３７℃で一晩
振とうした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相
の回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含
む溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）に
か１−＋ることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製
品を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度
の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦＷ伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ３１
１伝子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＩ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（ＤＨ９，５）　、　ｔｏ　１Ｍ
　　ＭＯＣ１ｚ　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０１Ｍ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、す
べての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、
フェノール抽出、エーテル抽出によりＩ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱したＩ室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０ｔｌ、Ｑの６６　
ＩＩＩＭＴ　ｒｉｓ−ＨＣオ（１）Ｈ７，６）　、　　
６．６　ｍＭ　　ＭＣＩ　ＣＢ２゜１０園Ｍジチオスレ
イトール、１ａ＋ＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユ
ニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１
１℃で１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気法１ｌｌ（ゲルｍ度５％）を行
ない、エチジウムブロマイド染色法により泳動パターン
のｌＡ察を行なう。目的とする大きさ（約２２０ｂｐ　
）のバンド部分を切出して、実施例２の方法に従ってポ
リアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μ３の大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約
４，４Ｋ　ｂｐ）を３０μ夏の１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣ１（ｏＨ７，５）　　、　　６０　ａ＋Ｍ　　　
Ｎａ　Ｃ１，７ａ＋ＭＭＣ１ｃｊ２水溶液に溶解させ、
１０ユニツトのＩＩＩ限酵素Ｃ１ａＩ＜ニューイングラ
ンド・バイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断
反応を行なった。

制限酵素Ｃ１ａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ磨の５０１ＭＴｒｉｓ−
１−１ｃオ（１）Ｈ７，４）　、　　１００１１Ｍ　　
Ｎａ　Ｃ１，１０ＭＭ　　ＭｇＳＯ４水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない
、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの観
察を行なう。プラスミド１ｌＢＲ３２２の大部分を含む
約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出
し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖａｔ　／ｗｔ
）のＢＭ　　ＮａＣ１０＊水溶液に溶解させた。（：、
　ｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅａ、ユ０１
．　３３９（１９８０）　１により、約３．７Ｋ　ｂｌ
ｌのＤＮＡ１ｌ’ｉ片（Ｃ１８Ｉ　Ｈ８ａｌＩ　）をア
ガロースゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７）（ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのし培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ　
Ｃ１，Ｉ）ｌ−１７，２）にエシェリヒア−ｍｌすＣ６
００ｒ１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む！
８養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｊｐｏ）が０．
３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム
・バッフ７　　［０，ＩＭ　　Ｎａ　ｃＩ、　５　　ｍ
１ＶＩ　　Ｍ（ｌ　ＣＩ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｊ　（ｐＨ７，６，０℃）］中で２回洗い、２−の冷
したカルシウム・バッファー［１００ｍｖｃａ　Ｃｆ２
．　２５０　　ｍＭ　　ＫＣｆ、　　５　　ｍｌｙｌＭ
（Ｉ　Ｃｆ２．　５　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（
ｐＨ７，６゜０℃）〕中に再懸濁させ、０℃で２５分間
放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：ｌ　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）　ｎ合する。この混合物を６０
分間１０℃で保った後、１　ｍｅのＬＢＧ培地（１％ト
リプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ！、　　０
．０８％グルコース、　　Ｉ）８７．２）を添加し、３
７℃で１時間振どう１８養する。培養液を、選択培地［
アンピシリン（シグマ）３０μｇ／Ｉｎ１を含むＬ培地
プレート］に　１００μＵ／プレートの割合で接種する
。プレートを３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育
させる。得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公
知の方法を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気
泳動により、目的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４，
０Ｋｂｌ））の取得を確認した。第３図に、プラスミド
１１ＴＮＦＩＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ　
３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして（ワられたヒトＴ　Ｎ　Ｆ　’ｒＸ１仏子の一
部を含むプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及び
ｐＴＮＦ３の、合成オ“リボヌクレオチド使用部分の塩
基配列が設８１通りであることは、マキサム・ギルバー
ト法［Ａ、　Ｍ、　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈＯｄＳＥ
ｎｚｙｍｏｌ、、６５．　４９９（１９８０）　］によ
って確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μり
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣＩａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　
Ｉ”５ａｌＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｙを１００μＩＩ！の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ＋ｓ−Ｈ
ＣＩ（１）ｌ−１７，５）　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　
Ｃ１，７１ＭｔＶＩｇ（Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユ
ニツトの制限酵素ＰＶｕｌＩ（宝酒造）を添加し、３７
℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方
法に準じて制限酵素５ａｌＩによる切、断、ポリアクリ
ルアミドゲル電気体１１Ｊ（ゲル濃度５％）の後、実施
例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦｍ仏子の一部を含む約
１７０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩ［）をポ
リアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
７Ｂも１００μＭの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ｔ−Ｉ
　ＣＩ（ＤＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１
，７ｍｌｙｌＭ（ｌｃｆｚ水溶液に溶解させ、４０ユニ
ツトの制限酵素ｐｖＪ及び４０ユニツトの制限酵素ト１
ｉｎｄＩ［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断
反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂＦｌのＤＮＡ
断片（ＰｖｕＩｌｌ−４Ｈｉｎｄ　ｍ　）　ヲポリアク
リルアミトゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４．７ＫｂＤ＞　５μ９を、上記と同様
に制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌＩＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドｌ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎの大
部分を含む約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩＨ）
ｌｉｎｄｌＩ［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦＩ伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１ｉｏｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドｐＹ８３１Ｎの大部分を含む約４．
７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈澱の後
、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによ
る連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に
準じてエシェリヒア・コリＱ　６００ｒ−＋ａ−株に導
入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドａＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂｐ）
を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラスミ
ドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎ　５μ９を、上
記の方法に準じて制限酵素ＰｖｕＩＩで部分分解した後
、ざらに制限酵素ｌ−１ｉｎｄ　■で切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋｂ
ｌｌのＤＮＡ断片［Ｐ　ｖｕｌＩ　（２］　−Ｈｉｎｄ
　ＩＩＩ　］　ヲアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載のｊｎ基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得ら
れた２木の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μび
について、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を
行ない、アニーリングの後、先ニ得うレタ約２．７Ｋ　
ｂ＋）（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＩＩ片［ｐＶｕＨ（２１
”　Ｈｉｎｄ　ｍ　Ｅ、ト混合し、工’）／−ル’ｄｓ
１１２（１）ｍ、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実
施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−
ｍ株に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドＤ
ＡＡ４１（約２．７１（ｂｐ）を有するクローンを選択
した。このようなプラスミドは、プラスミドｐＹｓ３１
Ｎからコピー数制御領域を除去し、ｔｒｐプロモーター
下流に存在するクローニング・サイトの下流に大賜菌ｔ
ｒｐ　Ａターミネータ−を付与した形の、多コピー・高
効率発現ベクターであり、第７図にその作成方法を示し
た。

このプラスミドＩ）ＡＡ４１　２μりを、上記と同様に
制限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドｐＡΔ４１の大部分を含む
約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ！ｌｉ片（ＣｆｆｉａＩＨＨ
ｉｎｄｌ［［）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮ　Ｆ　４０１ＮＮ　５μ３を、上記と同様にυ
１限Ｆｆ素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄＩＩ［で切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲルｉｉＩ劇５％）の後
、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含
む約４９０ｂｐ　（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（（Ｊａ　Ｉ
−Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ　）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

こうして得られた、プラスミドルへＡ４１の大部分を含
む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝子全
域を含む約４９０１１ｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタ
ノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、１”　４−
　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｆｆｉ−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２
Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミド
は、ヒトＴＮＦＷ伝子をより効率良く発現させる能力を
有しており、第８図にその作成方法を示　し　ノこ　。

実施例５（新規抗肺瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦｍ伝子発現型プラスミド
ＩＩＴＮＦ　４０１Ａ２０μりを、実施例４の方法に準
じて制限酵素Ｃ１ａＩ及び）−１ｉｎｄｌ［［で切断し
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及
びアガロースゲル電気法ｖＵ＜ゲル濃度Ｑ、８％）の後
、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２
つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｌ）及び約２．７Ｋｂｐ、
両方共Ｃ１ａ　Ｉ　ｅ−＋Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　）をゲル
より回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
１１のＤＮＡ断片を５０ｃｚ　ｕの１０１１１Ｍ　　Ｔ
　ｒｉｓＨＣオ　（ｐト１　　７，４）　　、　　　１
０　１１１Ｍ　　　　Ｍ（１８０４、１ｍＭジチオスレ
イトール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ｌ
−１ａｐ［（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断
反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲルＩ！１度５％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦＥｔ仏子の大部分を含む約３９
０ｂ１１のＤＮＡ断片（ｌ−ｌａｐ■４−Ｉ　Ｈｉｎｄ
　Ｉｌｌ　）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を右するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーげによる連結反応を行なった。

反応終了後、（１られた２重鎖オリゴヌクレオヂドを、
先に１ｑられた約２，７ＫｂｐのＤＮＡ断片（（Ｊａ　
Ｉ　Ｈ）−１ｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦｍ伝子の大
部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（１−１ａｐｌＩ
ＨＩ−ｌ　ｉｎｄ　Ｉ［ｌ　）と混合し、エタノール沈
澱の侵、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ
４８３（約３．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択し
た。このプラスミドは、次のアミノ酸配列（ト（２Ｎ）
　　　−Ａｒｇ　−Ｌ　ｙｓ−Ａｒ（ｌ　　　　　Ｌｙ
ｓＰ　ｒｏ　−Ｖａｌ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ
−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　
Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ
　−ＧＩｎ　−Ｔｒｐ　−１ｅｕ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　
ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｌａ
−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　Ｓｎ−Ｇ　＋ｙ
−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒａ−Ａｓ
ｎ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−しｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｂｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ
−Ｇ　ＩｙＣＶＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔｈｒ　
−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｔ　−１ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ｔｈｒ
−Ｈ１ｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ａｒ（Ｊ−１１ｅ
−Ａｌａ−■ａｌ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ
　ｈｒＬｙｓ−Ｖａｔ−Ａｓｎ−Ｌ　ｃｕ−Ｌ　ｅｕ−
８ｅｒ−Ａ　Ｉａｉ　　ｌｅ−１ｙｓ−Ｓ　ｅｐ−Ｐ　
ｒｏ−Ｃｙｓ−Ｑ　Ｉｎ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈ
ｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉ
ｕ−Ａ　ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙ
ｒ−Ｇ　ｌｕ−Ｐ　ｒ。

１　１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖａ
ｌ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｙｓ
−Ｇ　ｌｙ−Ａ　ｓｐ−Ａ　ｒ（］ｌ　ｅｕ　−３ｅｒ
　−Ａ　Ｉａ　−Ｑ　ｌｕ　−Ｉｌｅ　−Ａ　ｓｎ　−
Ａ　ｒｇ　−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ
−Ａ　ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ
−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐ　ｈｅＧｌ
ｙ−１１ｅ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−（Ｃｏｏｌ−
１）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはその
アミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコー
ドする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドであり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現のｉ認）前記実施例４で得られた発現ベクター　１１Ａ　Ａ　４
１又は実施例５で得られた、新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子発現型プラスミドＥＩＴＮＦ４８３を有するエ
シェリヒア・コリＣＧＯＯｒ−１−株を、３０〜５０μ
ｇ／ｄのアンピシリン、０．２％のグルコース及び４ｒ
ｎｇ／ｄのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　
２　ＨＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％Ｎ
ａ（Ｊ−０，１％ＮＨ４Ｃｊ水溶液（、Ｉ）！−１７，
４）　ヲオートクレープ滅菌した後に、別途にオートク
レーブ滅菌したＭｇＳＯ４水溶液及びＣａＣｌ２水溶液
をそれぞれ最終ｍ度２１Ｍ及び０．１１Ｍになるように
加える。］２５０−に接種し、ＯＤｌ〃が０．７に達す
るまひ、３７℃で振どう培養を行なった。次いで、最終
ｍ度５０μｇ／Ｉｎｌの３−β−インドールアクリル酸
を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間娠とう培
養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、得られた大腸菌
菌体の一部に対して、Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊバッファー（１
）ｌ−１６，８）　、　ＳＯ３，２−メルカプトエタノ
ール、グリセロールを、それぞれ最終濃度６０１１Ｍ、
２％、４％、　１０％になるように加え、５ＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、遺伝、　３１．４
３（１９７７）　］を行なった。分離用ゲルは１２．５
％とし、泳動バッファーはＳＤＳ、Ｔｒｉｓ　−グリシ
ン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｎｕａｌｉ、　Ｎａｔｕｒｅ
　、　　２２７゜６８０　（１９７０）　］を用いた。

電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシープルー　
Ｒ−２５０（バイＡ・ラッド）で染色し、新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なった。ここで
結果は省略するが、１）ＴＮＦ４８３を有する大腸菌の
場合にのみ、分子旧約１７，０００の位置に新規抗腫瘍
活性ポリペプチドのものと思われるバンドが検出された
。

２５０ｄの培地を用いた培養により得られるｐＴＮＦ４
８３を有する大腸菌菌体を、１０ｔｘｆ！のＰＢＳバッ
フｐ　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０１Ｍリ
ン酸バッファー、　　ｌ）Ｈ７，４）に懸濁させ、超音
波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を用いて菌体の
破壊を行なった。遠心により得られるライゼート及び不
溶性の両分について、上記の方法に準じて、Ｓ［）Ｓポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を行なった。

ゲルの染色結果を第１０図に示した。第１０図より、本
発明の新規抗ＩＩ！！瘍活性ポリペプチドは、大腸菌菌
体内で不溶性のインクルージヨン・ボディとして大間に
産生されていることが明らかとなった。

実施例７（新規抗腫瘍性ポリペプチドの可溶化及び再構
成）実施例６で得られた、ｐＴＮＦ４８３を有する大腸菌の
不溶性画分の残漬を、７Ｍ尿素を含む２０ＩＩＩＭリン
酸バッファー（１）Ｈ７，４）　１０ｄに懸濁させ、３
７℃で３０分間保持することにより、不溶性蛋白質の可
溶化を行なった。遠心により、可溶化されなかった残渣
を除去した後、該溶液をＰＢＳバッファーに対して透析
した。透析終了後にもう度遠心を行ない、透析中に析出
してきた蛋白質の凝集物の除去を行なった。

実施例Ｂ　（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗癌活性の評価）ＦＴ５
Ｉ４抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわち、実施例７で得ら
れた再構成後の新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む溶液
を順次培地で希釈した試料１００μ文と、４×１０５個
／威の濃度のマウス上−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ−９２９＞懸濁液１００μ文を、９６穴の組織培養
用マイクロプレート（コースタ−〉内で混合した。なお
この際に、最終濃度１μ９／−のアクチノマイシンＤ（
コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培地としては
、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含むイ
ーグルのミニマム・エッセンシャル培地（白水製薬〉を
用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸ガスを含む
空気中、３１℃で１８〜２０時間培養した後、クリスタ
ル・バイオレット溶液［５％（ｖ０１／ｖｏｌ）メタノ
ール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ＶＯＩ　）のクリスタ
ル・バイオレットを溶解させたしの］を用いて生細胞を
染色した。余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し
乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレットを１００
μ隻の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎ■
における吸光度をＥｉｓＡアナライザー（東洋側器、Ｅ
ＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残った
細胞数に比例する。そこで、新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む溶液の希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０
％の値に相当するサンプル溶液の希釈倍率をグラフによ
って求め、その希釈倍率をユニットと定義する。実施例
７で１ｑられた、再構成後の新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む溶液１００μすは、５０〜１００ユニット程度
の活性を有していることが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図ば、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦｍ転
子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を
、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作成方法を、
そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１）
ＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したものであ
る。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミド１）ＴＮＦｄ８３の作成方法を示したもので
ある。第１０図は１）ＴＮＦ４８３を有する大腸菌の蛋
白質の電気泳動による解析結果を示したものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｖｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｖ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｖ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる、新規生理活性ポリペ
プチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項１記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｌｖｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−ＧＩｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプ
チドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組替えプラスミ
ド。
（４）該ＤＮＡ領域が塩基配列（５’）−ＣＧＴＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣ
ＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧ
ＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧ
ＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧ
ＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＧＡ
ＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ
ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣ
ＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡ
ＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣ
ＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴ
ＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧ
ＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣ
ＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣ
ＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣ
ＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴＧ
ＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧ
ＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＧ− （３’）で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３項記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列（５’）−ＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴ
ＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧＴ
ＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡＡ
ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣＧＴＡＡＧＣＧＣ
ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣ
ＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＧ
ＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧ
ＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＡＧ
ＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＣＡＧＡ
ＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧ
ＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＣ
ＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣＣＣＡ
ＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＴＣＣ
ＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴ
ＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＧ
ＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＣＣ
ＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣ
ＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣ
ＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴＧ
ＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧ
ＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴ−（
３’）で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３項記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４８３である
請求項３項記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列（Ｅ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−ＧＩｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｏ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプ
チドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミ
ドにより形質転換された組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする請求項７項記載微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列（Ｈ＿２Ｎ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＶａＩ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｃ−Ａｓｎ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプ
チドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリ
ペプトチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラス
ミドにより形質転換された組換え微生物細胞を培養し、
培養物中に新規生理活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ
、得られた培養物から新規生理活性ポリペプチドを分離
することを特徴とする、新規生理活性ポリペプチドの製
造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列（Ｈ＿２
Ｎ）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ
ｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓ
ｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ
−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ
ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈ
ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｉ
ｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈ
ｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇ
ｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓ
ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｃ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（
ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまた
はそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド
を含有する医薬組成物。