JPS62248498A

JPS62248498A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPS62248498A
Application number: JP9008786A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakamura; 聡中村; ▲あ▼木　津希夫; Tsukio Sakuki; Kazuo Kitai; 北井　一男; Kenji Yone; 米　賢二; Kaku Katou; 加藤　革; Jun Suzuki; 純鈴木; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-04-21
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1987-10-29

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域含む組換えプラスミド、該プラス
ミドによって形質転換された組換え微生物ｌＩｌ胞及び
該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造
方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規
ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略
すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領
域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩｔＪＰ
ＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

、Ａ、Ｉａｌ−−アラニンＡｒｇ　Ｌ−アルギニンＡＳｎＬ−アスパラギンＡＳＩ）　　Ｌ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧｌｎ　　Ｌ−グルタミンＧｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシンＨｉｓｌ−−ヒスチジン１１ｅＬ−イソロイシン１−ｅｕｌ−一ロイシンしｖｓ　　Ｌ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−−プロリンＳｅｒ　　Ｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｔ　　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）（２）発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌｌｓらは、（３ａｃｉｌｌｕｓ　　　Ｃ
ａ１ｗ＋ｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（８ＣＧ）など
で前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与
した後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫に
よる癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出
し、この物質をＨＩ！壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　
ｅｃｒｏｓｉｓｌ”ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記す
ることもある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅ
ｌｌら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　７２．３６６６（１９
７５）　］　、　（１：（７）ＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、腫ａｍ胞に特異的に、
しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が
期待されてきた。

最近になッテ、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　、　Ｐ
　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、≦１１２．　
７２４　（１９８４）］。その後、自弁ら［Ｔ、　５ｉ
ｒａｉら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１３、　８０３（１９８５）　］　、宗村ら［宗村ら
、癌と化学療法、　１２．　１６０（１９８５）　］　
、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ。

ＷａｎＱら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９
（１９８５）　１及びＭ　ａｒｌｅｎｏｕｔら［Ａ　０
Ｍ　ａｒｓｅｎｏｕｔら、Ｅ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１５（１９８５）　
］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大Ｉ！菌における発現につい
て相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗肢瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクヂ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　Ｂｔ３ＬＩＩ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｔ＋ｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセライド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。

また、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についても、特開昭６１−４０
２２１明細書にその可能性についての記載があるが、比
活性についてはふれていない。また、ヒトＴＮＦ蛋白質
をトリプシンで処理することによって得られる、ヒトＴ
ＮＦのアミノ末端の６アミノ酸が欠失した形のポリペプ
チドも生理活性を有しているが（特開昭６１−５０９２
３明細書）、そのポリペプチドの比活性については明ら
かにされていない。

そこで、本発明者らは比活性の向上１反応スペクトルの
広域化、副作用の低減化等を目的として、ヒトＴＮＦ蛋
白質の改変について鋭意研究を行なった。その結果、ヒ
トＴＮＦ蛋白質の約２．８倍の比活性を有する新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの高効率生産に成功し、本発明を完
成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、比活性の高い新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを提供するにある。

本発明の更に他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
をコードするＤＮＡ１ｔｌ域を含む組換えプラスミドを
提供することにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物ｌ
ＩＩ胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する
方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ）−Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　ＡＳＤ　　Ｌｙｓ　
　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　
Ａｌａ　　ＡｓｎＰｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　ＧＩ
Ｌ＋　　（３１ｙ　　Ｇｌｎ　　１−ｅｕＧｌｎ　　Ｔ
ｒｐ　　Ｌｅｕ　　ＡＳｎ　　ＡｒＣｌ　　Ａｒ１Ｊ　
　ＡｌａＡｓｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａ
ｌａ　　Ａｓｎ　　ＧｌｙＶａｌ　　Ｑｌｕ　　Ｌｅｕ
　　Ａｒ！ＩＩ　　ＡＳＤ　　ＡＳｎ　　ＧｌｎＬｅｕ
　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ
　　ＧｌｙＬｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　
ｒｙｒ　　８ｅｒ　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＧｌｙＣｙｓ　
　Ｐｒｏ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　
　ＬｅｕＬｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｔｈｒ　　Ｉ
ｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇｌｌｅ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ
　　Ｓｅｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　ＴｈｒＬｙＳＶａ
ｔ　　ＡＳｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌ
ａｌｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　ｐｒｏ　　ｃｙｓ　
　Ｑｌｎ　　Ａｒ（ＩＱｌｕ　　Ｔｈｒ　　ｐｒｏ　　
Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＡｌａ　　ＬＶ
Ｓ　　Ｐｒｏ　　Ｔｒｉ）　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐ
ｒ。

［１ｅ　　Ｔｙｒ　　１−ｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　
　Ｖａｔ　　ＰｈｅＧｉｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌ
ｙｓ　　ａｎｙ　　ＡＳＩ）　　Ａｒ（ＪＬｅｕ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ　　
Ａｒ。

ｐｒｏ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　ＡＳＩ）　
　Ｐｈｅ　　ＡｌａＧｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｇ
ｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　　ＰｈｅＧｌｙ　　Ｉ　ｌ
ｅ　　Ｉ　ｌｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ）
で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にｒｖｔｅｔが結合したポリペプチドを提供す
ることによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミ
ドを提供することによって達成され、更にかくして得ら
れた粗換えプラスミドによって形質転換された組換え微
生物細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫
瘍活性ボリベブチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供すること
によって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、侵にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡｆｆ１域は
、その上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳
開始コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下
流方向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止
コドン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦｌ伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素を用いることにより、適当なベクター
のクローン化が可能になる。このようなヒトＴＮＦ遺伝
子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［１−１，０，）（ｈｏｒａ
ｎａ。

”　３　ｏＩＩｃｅ　　Ｒ５ｃｅｎｔ　　Ｑ　ｅｖｅｌ
ｏｐＩｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　
　Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ
　１ｏｌｏｏｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　
、　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ　
、　　■ｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）
　］。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｏｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔ
ｔ、、　２１．　７１９（１９８０）　］があるが、合
成時間、収率、操作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ
合成機を用いたホスファイト法による合成が好ましい。

合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラム
による高速液体クロマトグラフィー等を、適宜単独もし
くは組合せて用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦＭ伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢ　Ｒ３２２［Ｆ、　　
Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．９５（１
９７７）］のようなベクターに一度クローン化した後、
それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が好ま
しい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロック
のＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくはｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴ　Ｎ　Ｆ　３が用
いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒＤプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃブＯモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　Ｉｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。この発現型ヒトＴＮＦ遺
伝子を、たとえばｐＢ　Ｒ３２２のようなベクターにク
ローン化することにより、発現型プラスミドが作成でき
る。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドとして、好まし
くはｐＴＮＦ４０１ＮＮが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で°切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定
な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４１６が用いら
れる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりねり大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ａ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ”、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎａＨ
ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎ＋３Ｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により粗換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウスし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　Ｖｉｔｒｏ活性測定法［ＲｕＨ，Ｊ。

１　ａｓｕｎｏｌ、、ユ２Ｂ、　　２３５　（１９８１
）　］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の
簡便さ等の点から、ｉｎ　　ｖｉｔｒＯ活性測定法によ
る評価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ遺伝子
を発現させる場合に比して、より高い発現量で抗腫瘍活
性を有する新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になる。また、得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドは
、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質にくらべて、数倍の比活
性を有しており、従って、この新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを用いることによって抗腫瘍のためのすぐれた医薬
組成物を提供することが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐｅｎｎｉＣａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、ぢ１１２．　
７２４（１９８４）　　］の報告したヒトＴＮＦ前駆体
ｃＤＮ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、
適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、５
を側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′側に２
個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれぞれ付
与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限酵素
ＣｆａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開始コ
ドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの連
結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下流には
制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによる切断部位を設け、ベクタ
ー・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全白１！ＦＪＤＮＡ合成機（アプラ
イド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡｊＷＷの保
護基をはずし、セファデックスＧ−５０フフイン・ゲル
（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量
の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７
ＭＦ？素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、２〜５ｍの溶出用バッファー［５００１
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１ＩＢＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤ
Ｓ　（ＤＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とうし
た。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を
行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　　　（ｐｈ　　　９．５）　　　
、　　　１０　　１Ｍ　　　　　Ｍり　　　Ｃ１ｚ　　
　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０１１Ｍ　　ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６１ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｊ　　（ＥＩ８　７．６）　　、　　　６
．６　１Ｍ　　　Ｍ（ｌ　　Ｃ１ｚ　　。

１０■Ｍジチオスレイトール、１１ＭＡＴＰ水溶液に溶
解させ、３０ＧユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった。

反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により
泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく約２
２０ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の方法
に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する
。

一方、３μ３の大腸菌用プラスミドｐＢＲ３２２（約４
．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ皇の１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−
ＨＣｆ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１
，７ｍＭＭｇＣ１２水溶液に溶解させ、１０ユニツトの
制限酵素Ｃｆｆ１ａＩにューイングランド・バイオラプ
ズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

！１１限醇素ｃｊａＩによる切断の侵、フェノール抽出
。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ文の５０１ＭＴｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃ１，１０１Ｍ　　Ｍ（＋８０４水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）を行ない
、エチジウムブロマイド染色法により切断バターシの観
察を行なう。プラスミドｐＢＲ３２２の大部分を含む約
３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切出
し、そのアガロースゲル断片を３倍両（ｖｏｌ　／Ｗｔ
）の８Ｍ　　ＮａＣ！０３水溶液に溶解させた。Ｃｈｅ
ｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

（：、　ｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ
、ユ０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７
Ｋｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｃ１ａＩ−＝４ＳａＩＩ）をア
ガロースゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７１（ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１株の形質転換は、通
常のＣａＣＩｚ法（Ｍ、　Ｖ、Ｎｏｒｏａｒｄらの方法
）の改良法で行なった。すなわち、５ＩＩＩＮのＬ培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
　Ｃ１，ｌ）８７．２）にエシェリヒア−ｍｌすＣ６０
０ｒ１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養
液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ　６０Ｇ）　　０．
３まで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッフ
ァー　　［０，１Ｍ　　　ＮａＣｊ、　　５　１Ｍ　　
　Ｍ（Ｉ　　Ｃ１ｚ　　、　　５　１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｆ　（ＤＨ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｓｅの冷
したカルシウム・バッファー［１００ＩＢＭＣａ　Ｃ１
ｚ　、　２５０　１Ｍ　　ＫＣｆ、　５１Ｍ　　Ｍ（Ｉ
　Ｃ１ｚ　。

５　１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐｔ−＋　７．６．
０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次
に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファー
の中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２　：　１　（
ｖｏｌ、：ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
、０℃で保った後、１１１１のＬＢＧ培地（１％トリプ
トン。

０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、０．０８％グルコ
ース、　　ＥＩＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間撮
とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シ
グマ）３０μｇ／ｄを含むし培地プレート１に１００μ
皇／プレートの割合で接種する。プレートを３７℃で１
晩培養して、形質転換株を生育させる。

得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法
を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動によ
り、目的のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（約４．ＯＫ　ｂ
ｐ）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ
ＩＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドＥＩＴＮＦ２
Ｎ（約３、ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２，４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴ’ＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。

こうし得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラスミ
ドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、合
成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通りで
あることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、　Ｍ
ａｘａ−ら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６５
．　４９９（１９８Ｇ）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣＩａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　
ＩＭＳａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｙを１００μＵの１０　ｇ＋Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
ｊ（ｐＨ７，５）　、　６０ｓ　Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，７
ｍＭＭ（ｌｃｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ＰｖｕＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間
切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じて
制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じ
て、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐのＤＮ
Ａ断片（ＳａｌＩ＠ＰｖｕＩ［）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３１０μ
９も１００μ隻の１０　ｍＭ　　”Ｔ−ｒｉｓ−）１　
（Ｊ（ｐＨ７，５）　、　６０　ａ＋Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１
，７ｉＭＭＱＣＩ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰｖｕＩＩ及び４０ユニツトの制限酵素１−１
−１ｉｎｄ宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（
ＰｖｕＩＩ←ｌ−１ｉｎｄｎＩ）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミド１
）ＹＳ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μ３を、上記と同
様に制限酵素ＣＩａＩ及びＨｉｎｄｎＩで切断し、アガ
ロースゲル電気泳８（ゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３１Ｎの大部分を
含む約４．７’ＫｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩ→Ｈｉｎ
ｄｌｌ［）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂＤ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む約
４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＱ　６００ｒ−１−株
に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドＥＩＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　
ｂｌ））を有するクローンを選択した。第６図に、その
プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ　４０１ＮＮ２０μグを、実施例４の方法に
準じて制限酵素ＣｊａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌで切断し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及び
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、そ
れぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つの
ＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約４．７Ｋ　ｂｐ、両方
共Ｃ１ａ　ＩＨＨｉｎｄ　ＩＩ）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｌ）のＤＮＡｌｌ１片を５０ｕｌの１０　＋１Ｍ　　Ｔ
　ｒｉＳ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃ１，７ｍＭＭＯＣｊｚ水溶液に溶解させ、１
０ユニツトの制限酵素ＡＶａＩ（宝酒造）を添加して、
３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない
、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分
を含む約４６０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＡｖａＩｅ）ｆｉ
ｎｄ■）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第７図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチドを、実施例２の方法に準じて、上の鎖と下の鎖
とに分けて合成、精製した。得られた２本の合成オリゴ
ヌクレオチドそれぞれ０．５μ９について、実施例３の
方法に準じて、末端のリン酸化を行なった後、アニーリ
ングさせた。

アニーリング後の２本鎖オリゴヌクレオチドを、先ニ１
１１３　ｔ’Ｌ　ｔｃ約４．７Ｋ　ｂｐノＤ　Ｎ　Ａ断
片（ＣｆａＩ←Ｈｉｎｄｎ［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の
大部分を含む約４６０ｂ（ｌのＤＮＡ断片（ＡｖａＩＨ
Ｈｉｎｄ　ｎ［）と混合し、エタノール沈澱の後、実施
例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結
反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じて
エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１−株に導入し、形質
転換株の中より目的のプラスミドＩ）ＴＮＦ４１６（約
ｓ、２Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラ
スミドはＴＮＦのアミノ末端の７アミノ酸を欠失させた
形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、第
７図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４及び５で得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ及び本発明の
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドＩ
）ＴＮＦ４１６のそれぞれを有するエシェリヒア・コリ
Ｃ６００ｒ−ｍ−株を、それぞれ３０〜５０μｇ／ｆｆ
！ｉ！のアンピシリン、０．２％のグルコース及び４■
／戒のカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　
ＨＰＯａ　−０，３％ＫＨ２ＰＯ４−０，０５％ＮａＣ
ｆ−０，１％ＮＨｔ（Ｊ水溶液（＋）８７．４）をオー
トクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌し
たＭ（１８０４水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ
最終濃度２　ｍＭ及び０．Ｉ　ｎ＋Ｍになるように加え
る。］　　２００ｄに接種し、Ｑ［）６００が０．７に
達するまで、３７℃で撮とう培養を行なった。次いで、
最終濃度５０μｇ／ｒｄの３−β−インドールアクリル
酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間振どう
培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｐ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｆを含む２　ｍＭリン酸
バッファー、’ｐＨ７，４＞を用いて菌体の洗浄を行な
った。洗浄後の菌体を１０−のＰＢＳバッファーに懸濁
させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を用
いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残漬の除去
を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｊバッフｐ　−（１）Ｈ，６，８）　、　ＳＤＳ、
　２−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞ
れ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように
加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木
、遺伝、　３１．４３　（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＯ８
，Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｎａ＋ｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０（１９７０）　］を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
プルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒトＴ
ＮＦ３ｍ伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現の確認を行なった。この結果を複写して第８図に示
した。

染色後のゲルのクロマトスキャナー（島津、Ｃ５−９３
０型）を用いた解析を行なったところ、ヒトＴＮＦ蛋白
質は大腸菌全細胞質蛋白質の９．０％。

新規抗腫瘍活性ポリペプチドは大腸菌全細胞質蛋白質の
１５．５％のレベルにまで、それぞれ産生されていた。

実施例７（活性の評価）ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドそれ
ぞれの活性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なっ
た。すなわち、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質又
は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート
を順次培地で希釈した試料１００μ旦と、４　ｘ　ｉｏ
’個／Ｉｄの濃度のマウス１−−９２９ｉ１１ｉ芽細胞
（ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μすを、９６
穴の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混
合した。なおこの際に、最終濃度１μ９／１ａｌｌのア
クチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加して
おく。培地としでは、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウ
シ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル
培地（日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、
５％炭酸ガスを含む空気中、３７℃で２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ＶＯＩ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μｍの０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５ｔｖにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザ
ー（東洋側器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光
度は、生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌
ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％
の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈率をグラフ（第
９図）によって求め、その希釈率を１ユニツトと定義す
る。第９図より、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質
を含む大腸菌ライゼート１００μ旦は１，７Ｘ　１０５
ユニツトの活性を、同じ〈実施例６で得られた新規抗腫
瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート　１００μ
磨は６．ＯＸ　１０５ユニツトの活性を、それぞれ有し
ていることが明らかになった。

実施例６で得られたヒトＴＮＦ遺伝子又は新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋
白質省は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラ
ッド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検
量線より計算した。

実施例６で得られた発現盪の値、上記で得られた活性の
値及び蛋白質定量結果を総合し、ヒトＴＮＦ蛋白質及び
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの比活性を計算したところ
、表１のような値が得られた。

表１より、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現り
はヒトＴＮＦｍ伝子の約１．７倍にも及んでおり、また
、新規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約
２．８倍の比活性を有していることがわかる。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白！ｌと本発明の新規抗腫瘍活Ｈポ
リベブブ下の比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩Ｍ配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を右するプラスミドＤＴ
ＮＦＩＢ＋１．０ＴＮＦ２Ｎ及びｔｌＴＮＦ３の作成方
法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方
法を示したものであり、第７図は新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４１６の作成
方法を示したものである。第８図は発現型プラスミドｐ
Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ及びＥＩＴＮＦ４１６の発現
確認結果を示したものである。第９図はヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示
したものである。第４図 ↓５（ＬＩＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　↓キナービピＶｕＩｒ第５図第７図情８図へ呵呂

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する第１項記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【塩基配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【塩基配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４１６である
第３項記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする第７項記載微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。