JPS62272991A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域含む組換えプラスミド、該プラス
ミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該微
生物ｌｌｌ胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造
方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規
ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略
すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領
域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＬＪＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

ＡＩａＬ−アラニン ＡｒＱＬ−アルギニン ＡＳｎＬ−アスパラギン ＡＳＩ）Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン ＧｌｎＬ−グルタミン ＧｌｕＬ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン Ｈｉｓｌ−−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン ＬｅｕＬ−ロイシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　ｌ−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン ｐｒｏｌ−−ブＯリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン ＴｒＤ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。〉Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）（２）　　発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌ　Ｉｓらは、３ａｃｉｌ！ｕｓ　　　Ｃ
ａ１ｌｌｅｔｔｅ　−Ｇｕ６ｒｉｎ　　（ＢＣＧ）など
で前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与
した後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫に
よる癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出
し、この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｌｌｏｒ　　Ｎ　
ｅｏｒＯｓｉｓＦａＣｉｔＯｒ　、以下ＴＮＦと略記す
ることもある）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅ
ｌｌら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　１　、　Ｌ：、（７）ＴＮＦはマウス
、ウサギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特
異的に、しかも種を越えて働くことから、制癌剤として
の利用が期待されてきた。

最近になって、ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　
ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　：３ユ２．
　７２４　（１９８４）］。その後、自弁ら［Ｔ、　５
ｈｉｒａｉ　ら、　Ｎａｔｔｌｒｅ　。

３１３、　８０３（１９８５）　］　、宗村ら［余材ら
、癌と化学ｉｌｌ法、　１２．　１６０（１９８５）　
］　、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ。

ｗａｎａら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９
（１９８５）　’］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　
、　　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら、Ｅ、Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１５（１９８５）　
］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌における発現について
相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕ＋
ｔｅ、ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

ユ阻、　　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセライド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。

また、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についても、特開昭６１−４０
２２１明ＩＲ書にその可能性についての記載があるが、
比活性についてはふれていない。また、ヒトＴＮＦ蛋白
質をトリプシンで処理することによって得られる、ヒト
ＴＮＦのアミノ末端の６アミノ酸が欠失した形のポリペ
プチドも生理活性を有しているが（特開昭６１−５０９
２３明細ｍ）、そのポリペプチドの比活性については明
らかにされていない。

そこで、本発明者らは比活性の向上１反応スペクトルの
広域化、　８１作用の低減化等を目的として、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、本発明を完
成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物ｍ
ａを用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ　）　−Ｌｙｓ　　Ｐｒ。

Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　
Ａｌａ　　Ａｓｎｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＬｅｕＧｌｎ　　Ｔｒｉ）
　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　ＡｒｇＡｒｇ　　ＡｈａＡｓ
ｎ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ａｓ
ｎ　　ＧｌｙＶａｔ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ａｒｏ　
　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇ１ｎ１−ｅｕ　　Ｖａｌ　　
ｖａｌ　　ｐｒｏ　　ｓｅｒ　　Ｑｌｕ　　ＧｌｙＬｅ
ｕ　　Ｔｙｒ　　ｌｅｕ　　ｌｌｅ　　Ｔｌ／ｒ　　Ｓ
ｅｒ　　ＧｌｎＶａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　ＬＶＳ
　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＧｌｙＣｙｓ　　Ｐｒｏ　　
３ｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ｖａｌ　　ＬｅｕＬｅ
ｕ　　Ｔｈｒ　　）−１ｉｓ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　
Ｓｅｒ　　Ａｒｇｌｌｅ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｎ　　ＴｈｒＬｙｓ　　Ｖａｔ　
　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａｌ
ｉｅ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　　Ｇ
ｌｎ　　ＡｒｑＧｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ
　　（３１ｙ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＡｌａ　　Ｌｙｓ　
　Ｐｒｏ　　Ｔｒｐ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒ。

１１ｅ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｇ、Ｉｙ　
　Ｖａｌ　　ＰｈｅＱｌｎ　　ｌｅｕ　　Ｇｌｕ、　　
Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ａｓｐ　　Ａｒｃｌ−ｅｕ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｌａ　　Ｑｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ　　Ａ
ｒ（ＩＰｒｏ　　ＡＳＤ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　ＡＳ
Ｄ　　Ｐｈｅ　　ＡｌａＧｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌ’ｌ
　　Ｇｌｎ　　ｖａｔ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅａｌｙ　　
Ｉｌｅ　　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）
で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを提供するこ
とによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを
提供することによって達成され、更にかくして得られた
組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物
細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供することによ
って達成されることがわがった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、　Ｐ
ｅｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡＩ域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素を用いることにより、適当なベクター
のクローン化が可能になる。このようなヒトＴＮＦ遺伝
子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法トシテハシエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“Ｓ　ｏｗｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ
　ｈｏｓｏｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ　ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　
Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ　、　
　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］
。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　ｖａ
ｔｔｅｕｃｃｔら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔ
ｔ、、　２１．　７１９（１９８０）　］があるが、合
成時間、収率、操作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ
合成懺を用いたホスファイト法による合成が好ましい。

合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾過、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラム
による高速液体クロマトグラフィー等を、適宜単独もし
くは組合せて用いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢ　Ｒ３２２［Ｆ、　　
Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５（
１９７７）］のようなベクターに一度クローン化した後
、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が好
ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロッ
クのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくはｐ
ＴＮＦｌＢＲ，ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いら
れる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、５０（シャイン・ダルガーノ）配列の下流
につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる
。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・オ
ペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃブＯモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　Ｉｆ）１１プロモーター等があげられるが、とりわけ
ｔｒＤプロモーターが好適である。この発現型ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子を、たとえばｐＢ　Ｒ３２２のようなベクター
にクローン化することにより、発現型プラスミドが作成
できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドとして、好
ましくは１）ＴＮＦ４０１ＮＮが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
： こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現プラスミドの作成が可能になる。

このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４２１が用いられ
る。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、Ｎｏｒａａｒ
ｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用イテ
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−１−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎａ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉｎＯ
Ｈａｒｂｏｒ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見ルｔｎ　
　ｖｔｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｒｆ　、　Ｊ。

ｌ　ｍｍｕｎｏｌ、、ユ２６．　２３５（１９８１）　
１等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ活性測定法による評
価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ遺伝子
を発現させる場合に比して、より高い発現量で抗腫瘍活
性を有する新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になる。また、得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドは
、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質にくらべて、数倍の比活
性を有しており、従って、この新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを用いることによって抗腫瘍のためのすぐれた医薬
組成物を提供することが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら（Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３ユ２．
　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ前
駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設
け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして３′
側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれ
ぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制
限酵素ＣｊａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳
開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーター
との連結を可能にした。更に、３′１ｌ１１１ｆｌ訳終
止コドン下流には制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［による切断部
位を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるよ
うにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全白１ｊＪＤＮＡ合成機（アプライ
ド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし・、セファデックスＧ　−５０フアイン・ゲ
ル（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子
量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、
７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、２〜５ｍの溶出用バッファー［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１１ＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ
　（１）Ｈ７，５）　］を加え、３７℃で一晩撮とうし
た。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を
行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μｓの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｓ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　　（ＤＨ９，５）　　、　　１０
　　ｍ１ｙｌ　　　Ｍ！Ｊ　　Ｃ１ｚ　　。

５　　ｍＭジチオスレイトール、１０１Ｍ　　ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ３の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後空温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ旦の６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（１）Ｈ７，６）　、　　６．６　
ｍＭ　　Ｍ！Ｉｆ　Ｃｊｚ　。

１０　ａ＋Ｍジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ水溶液
に溶解させ、３００ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法に
より泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく
約２２０ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の
方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収
する。

一方、３μグの大腸菌用プラスミドｐＢＲ３２２（約４
．４Ｋｂｐ）を３０μ旦の１０１１１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＪ（ｐＨ７，５＞　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ！
、　７　ｍＭＭｇＣ１２水溶液に溶解させ、１０ユニツ
トの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バイオラブ
ズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

制限酵素ＣｆａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μすの５０　ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｆ　　（１）Ｈ７，４）、　　１００　ｓＭ　　
　Ｎａ　　Ｃ１，１０■Ｍ　　ＭｇＳＯ４水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行
ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パターン
の観察を行なう。プラスミドｐＢＲ３２２の大部分を含
む約３．７１（ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを
切出し、そのアガロースゲル断片を３倍両（ｙ□ｌ　７
ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣ！０３水溶液に溶解させた。Ｃ
ｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂ１０Ｃｈｅ１．　１０
１．　３３９□　　　。

（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断
片＜Ｃ１ａ　ＩＨ８ａｌ工）をアガロースゲルより回収
した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢ　Ｒ３２２の
大部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＱ　６００ｒ−ｍ−株の形質転換は
、通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄら
の方法）の改良法で行なった。すなわち、５Ｉｉのし培
地（１％トリプトン、０．５％ｌ１ｆｆｌエキス、０．
５％ＮａＣ１，ＤＨ７，２）にニジＸ　ＩＪ　ｔニア　
−ｍｌすＣ６００「１−株の１８時間培養基を接種し、
菌体を含む培養液の６０ｏｎ−における濁度（００６０
０）　　０．３まで生育させる。菌体を冷たいマグネシ
ウム・バッファー（０，ＩＭ　　　ＮａＣ１，５１Ｍ　
　　Ｍ！１ｌｃｆｚ　　、　　５　１ＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｊ　（ｐＨ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｍの冷し
たカルシウム・バッファー［１００１ＭＣａ　Ｃ１ｚ　
、　２５０　１Ｍ　　ＫＣｆ、　５１Ｍ　　ＭｇＣ１ｚ
　。

５１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｆ）Ｈ７，６，０℃）
］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次に菌体
をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファーの中で
濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２　：　１　（ｖｏｌ
、：ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間、０℃
で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン。

０．５％酵母エキス、１％ＮａＣオ、　　Ｏ，Ｏａ％グ
ルコース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間
撮とう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（
シグマ）３０ｇｇ／ｌｌｌ１！を含むし培地プレート］
に１００μ旦／プレートの割合で接種する。プレートを
３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。

得られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法
を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動によ
り、目的のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（約４．ＯＫ　ｂ
ｐ）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ
ＩＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１ＫｂＯ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ＞を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びＩ）ＴＮＦ３の
作成方法を、それぞれ示す。

こうし得られたヒトＴＮＦＩ伝子の一部を含むプラスミ
ドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、合
成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通りで
あることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、　Ｍ
ａｘａａ＋ら、　ｖｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６
５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣＩａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ　
Ｉ＋５ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
ｇｇを１００μＮの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐＨ７，５）　、　６０ｇ　Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，７ｍ
ＭＭｇＣ１ｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵
素ＰｖｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断
反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じて制限
酵素３ａｌ工による切断、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮ　Ｆ３１１伝子の一部を含む約１７０ｂｌ）の
ＤＮＡ断片（ＳａｌＩＳＰｖｕＩ［）をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μ９も１００μｌの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣｊ
（ＤＨ７，５）　、　６０１１１Ｍ　　Ｎａ　ｃｔ、　
７　ｍＭＭ　ＯＣ１２水溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎ
ｄｔ［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応
を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂ１１のＤＮＡ断片
（ＰｖｕｌＩ←Ｈｉｎｄｌｌｌ）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約ａ、７Ｋｂｐ）　５μ３を、上記と同様
に制限酵素ＣｊａＩ及び）−１ｉｎｄｌ［Ｉで切断し、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実
施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの
大部分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ
←Ｈｉｎｄｌｌｌ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドＥ）ＹＳ３１Ｎの大部分を含む約４
．７）（ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈澱
の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｓ−株に導
入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂｐ）
を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラスミ
ド１）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１ＮＮ２０μグを、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びア
ガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、それ
ぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤ
ＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約４．７Ｋ　ｂｐ、両方共
Ｃ１ａ　Ｉ４−４Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）をゲルより回収し
た。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μｌの１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆ　（１）Ｈ７，４）　、　１０１Ｍ　　ＭＯ３０
４、１１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０
ユニツトの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造）を添加して、
３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動 行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の
大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａｐ■←）
−１ｉｎｄＴ［［＞をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

また、第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μりについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２重鎮オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約４．７Ｋｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｃ１ａ　Ｉ
ＨＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を
含む約３９０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＨａｐＩＩｓＨｉｎ
ｄＩ［Ｉ）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェ
リヒア・コリＣ６００ｒ−ト株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４２１（約５，２Ｋ
　ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミド
はＴＮＦのアミノ末端の１０アミノ酸を欠失させた形の
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、第７図
にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確！ｉり 前記実施例４及び５で得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮ及び本発明の新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮ
Ｆ４２１のそれぞれを有するエシェリヒア・コリＣ６Ｇ
Ｏｒ−１−株を、それぞれ３０〜５０μ９／ＩＩｌのア
ンピシリン、０．２％のグルコース及び４Ｍｇ／ＩＩｉ
のカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰ
Ｏ４−０，３％ＫＨ２ＰＯ４−０，０Ｓ％ＮａＣ！−０
，１％ＮＨａＣＩ水溶液（１１Ｈ７，４）をオートクレ
ーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭＯ
８Ｏ４水溶液及びＣａＣｆｚ水溶液をそれぞれ最終濃度
２　ｏ＋Ｍ及び０．１　ｍＭになるように加える。］　
　２００ｄに接種し、０Ｄ６００が０．７に達するまで
、３７℃で撮とう培養を行なった。次いで、最終濃度５
０μｇ／Ｉｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液
中に添加し、さらに３７℃で１２時時間上う培養を続け
た。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッ”）
アー（１５０ｉＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２１１Ｍリン酸
バッファー、　　ｌ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄を
行なった。洗浄後の菌体を１０ａｅのＰＢＳバッフ？−
に懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型
）を用いて菌体を破壊した模、遠心分離により菌体残渣
の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファ　−（ＤＨ６，８）　、　ＳＯ８，２−
メルカブトエタノールル、グリセロールを、それぞれ最
終濃度６０１１Ｍ、２％、４％、１０％になるように加
え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、
遺伝１月−，４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＯ３
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［ＬＪ、　Ｋ、　Ｌａｅａ＋ｍ
ｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０＜１９７０）　］を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
ブルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発
現の確認を行なった。この結果を複写して第８図に示し
た。

染色後のゲルのクロマトスキャナー（島津、Ｃ８−９３
０型）を用いた解析を行なったところ、ヒトＴＮＦ蛋白
質は大腸菌全細胞質蛋白質の８．８％。

新規抗腫瘍活性ポリペプチドは大腸菌全細胞質蛋白質の
９．３％のレベルにまで、それぞれ産生されていた。

実施例７（活性の評価） ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドそれ
ぞれの活性測定は、前記ＲｕＨの方法に準じて行なった
。すなわち、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質又は
新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートを
順次培地で希釈した試料１００μ文と、４　Ｘ　１０５
個／−の濃度のマウス１−−９２９ｔｉＡ雑芽細胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μ旦を、９６穴の
組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合し
た。なおこの際に、最終濃度１μｇ／−のアクチノマイ
シンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培地
としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清
を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（日永
製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸ガ
スを含む空気中、３７℃で２０時間培養した後、クリス
タル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）メ
タノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリ
スタル・バイオレットを溶解させたもの］を用いて生細
胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを洗い
流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレットを１
００μρの０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５
ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋側
器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き
残った細胞数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白質又
は新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート
の希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当
する大腸菌ライゼートの希釈率をグラフ（第９図）によ
って求め、その希釈率を１ユニツトと定義する。第９図
より、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸
菌ライゼート１００μ文は７．３Ｘ　１０’ユニツトの
活性を、同じ〈実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリ
ペブチドを含む大腸菌ライゼート１００μ旦は４．７Ｘ
　１０’ユニツトの活性を、それぞれ有していることが
明らかになった。

実施例６で得られたヒトＴＮＦ遺伝子又は新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋
白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラ
ッド）を用いて定ＩＬ、ウシ血清アルブミンを用いた検
量線より計算した。

実施例６で得られた発現量の値、上記で得られた活性の
値及び蛋白質定量結果を総合し、ヒトＴＮＦ蛋白質及び
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの比活性を計算したところ
、表１のような値が得られた。

表１より、新規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋
白質とほぼ同様の比活性を有していることがわかる。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３ｖＡ、第４図及び第
５図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐ
ＴＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法
を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺
伝子発現型プラスミドＤＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法
を示したものであり、第７因は新規抗腫瘍活性ポリペプ
チド遺伝子発瑛型プラスミドＤＴＮＦ４２１の作成方法
を示したものである。第８図は発現型プラスミドｏＴＮ
Ｆ　４０１ＮＮ及びＩ）ＴＮＦ　４２１（Ｆ）発現確認
結果を示したものである。第９図はヒトＴＮＦ蛋白質及
び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示した
ものである。 特許出願人　帝　人　株　式　会　礼 式　　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純　　博第
４図 第５図 第７図のＢ ′；′・′　Ｊ　′　ｒ　、“、） 紙ぺ閃 η′？　品 ４釈辛 手続補正書 昭和６１年６月ｊＱ日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【塩基配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４２１である
   第３項記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅ　ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを
   特徴とする第７項記載微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。