JPH02142492A

JPH02142492A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH02142492A
Application number: JP63296306A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakamura; 聡中村; Kaku Katou; 加藤　革; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-11-25
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1990-05-31
Anticipated expiration: 2010-10-25
Also published as: JPH0797999B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）　　産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
ＣｉＵＢ生化学・委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡＩａｌ−アラニンＡｒ（ＩＬ−アルギニンＡｓｎＬ−アスパラギンＡｓｐＬ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＱｌｎ　　Ｌ−グルタミンＱｌｕ　　ｌ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシンＨｌＳ　　Ｌ−ヒスデシン１１ｅｌ−イソロイシン１−ｅｕｌ−ロイシンＬｙｓ　　Ｌ−リジンＭｅｔ［−−−メチオニンＰｈｅＬ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−プロリン３ｅｒ　　ｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐＬ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｌ　　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン〈デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　くデオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２）　　発明の背雨Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｆ
ｍｅｔｔｅＧｕｅｒｉｎ　　（８ＣＧ　）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓ
＋５ＦａｃｔＯｒ　、以下ＴＮＦと略記することもある
）と名づけた［　Ｅ　、　Ａ　、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら
、　ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　ＳＡ　、　７２．３６６６　
（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ、ヒ
ト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しか
も種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期待
されてきた。

最近になッテ、ｐｅｎｎｉＣａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ？ｌｆｉ白
質の一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒ
トＴＮＦ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｔｌｒｅ　、≦３１２
．　７２４（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、
　５ｈｉｒａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎａら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎａ
ら、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９
８５）　］及びＭ　ａｒｌｅｎＯＬＩｔら［Ａ　、　　
Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多聞に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　Ｂｅｕｌｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド邑が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｑａｌｌｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　　１
６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、
　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３
１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他の゛アミノ酸に置換したり、付加したり
、または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質をｆ！ＪＪ製する研究
が、数多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓ〆！及びＣｙｓ”／のいずれか又
は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換（Ｐ
ＣＴ出願公開Ｗ０８Ｂ／　０４６０６号、特願昭６ｌ−
１０６７７２）　、Ｑｌｙ％ｊＪの他のアミノ酸残基へ
の置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２
３８０４８号）　、　Ａ　Ｉａ／Ｊ’の他のアミノ酸残
基への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告され
ている。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失につ
いても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有して
いること（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠
失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１
９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失
ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公ＲＷＯ８
６／　０２３８１号）　、　１０７　ミ／酸欠失ＴＮＦ
が細胞障害活性を有していること（特願昭６１−１１４
７５４＠　）　、及び１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有していること（特願昭６１−１７３８２２号
）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ＞　　Ａｒ（１−ｔ−ｙｓ−Ａｒｌｌｌ　　Ｌ
ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｔ　−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ　−Ｖ
ａｔ　−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒ＋１−　Ｌ
　ｅｕ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒ（１−Ａ　Ｉａ−
Ａｓｎ−Ａ　Ｉａ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａ
ｓｎ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ａ　ｒｏ　−Ａ　ｓｏ−Ａ　ｓｎ　−Ｇｌｎ−Ｌｅ
ｕ　−Ｖａｔ　−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−
Ｇ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−
５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ−Ｌ　
ｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｃ！／Ｓ−Ｐ　
ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−１ｅｕ−１
ｅｕ−Ｔｈｒ−１−（ｉｓ−Ｔｈｒ−ｒ　　１ｅ−３ｅ
ｒ−Ａ　ｒｇ−Ｉ　ｌｅ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−
Ｔｙｒ−Ｇ　１ｎ−Ｔｈｒ−ＬＶＳ−Ｖａｌ−ＡＳｎ−
ＬＪＵ−ＬｅｌＪ−８ｅｒ−Ａ　ｌａ　−１ｌｅ　−Ｌ
ｙｓ　−Ｓｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−ＣＶｓ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ａ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ＩＶ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ−Ａ　
ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｏ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉ
ｕ−Ｐｒｏ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　
Ｉｕ　−Ｌ　’／Ｓ　−Ｇ　＋ｙ−△ｓｐ　−ＡｒＯ−
１ｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　　１ｅ−Ａｓｎ
−Ａ　ｒ（１−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ｔ　Ｖｒ−
Ｌ　ｅｌｌ　−Ａ　Ｓり　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　Ｉａ−Ｇ
　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｙ　−１１ｅ　−１１ｅ−Ａ　ｌａ
　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗Ｉｌ！瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領
域を含む組換えプラスミドを提供することによって達成
され、更にかくして得られた相換えプラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用
いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる
方法及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医
薬組成物を提供することによって達成されることがわか
った。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のり０−ン化；ヒト丁ＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを運び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡΔ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦＩ転子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取（ｑは、上
側の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図
に示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、
それらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結
する方法をどるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの
合成法としてはジエステル法［Ｈ、Ｇ　、　Ｋ　ｈｏｒ
ａｎａ。

”　Ｓ　ｏｎｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　　ｔｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｒ　　Ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｒ３　
＋ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　ｌ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　”　
、　　Ｊ　ｏｈｎ　　　ＶＪ　１ｌｅｙａｎｄ　　　５
ｏｎｓ　　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（
１９６１）　　］　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　３ｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｃ！ｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２ｔ、　
　７１９（１９８０）コがあるが、合成時間、収率、操
作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホ
スファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌ
クレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換りＯマドグ
ラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体ク
ロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用い
ることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦＩ転子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｆ　１ｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９
５（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化
した後、それらの各１０ツクのＤＮＡｌｌ１片を連結す
る方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成
するブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好
ましくはｐＴＮＦｌＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター　Ｐしプロモーター、
　Ｉｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはｐｙ　Ｓ　３１Ｎ　
、又はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発舅効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
Ｉｆ）ｌ）ターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があ
げられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適
であり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミド
として、好ましくはＥＲＡ　Ａ　４１が用いられる。こ
の発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＩ）ＢＲ３２２
由来のベクターにクローン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦｌ転子発現型プラス
ミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＩ）Ｔ
ＮＦ　４０１Ａが用いられる。

（８）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦｌｌ転子発現型プラスミド
を適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定
な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはＩ）ＴＮＦ６２０が用
いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大Ｂ菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮ　Ｆ３！伝子転子型プラ
スミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒ
ｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ト株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができる
。

このようにして得られた粗換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［ＴｌＭａｎｉａｔ
ｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ
ｇ”　　ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　３ｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　　Ｙ
ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に応じ
て、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ましい。

培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば振と
うによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３６時
間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロモー
ターを効率良く機能させる目的で、３−β−インドール
アクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリルＥｆｆｉｌｌナトリウ
ム（１Ｊ、下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリア
クリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲ
ル中の蛋白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライザー１−
を対照として泳動パターンを比較することにより、ヒト
ＴＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
Ｇ、活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移
植したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　
ｖｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、前出）、マ
ウスし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　Ｖｉｔｒ
Ｏ活性測定法［Ｒｕｆｒ　、　Ｊ、　　ｌ１ｌｌＪｎＯ
１，、１２６，２３５（１９８１）　］等により行なえ
る。

ヒトＴＮＦ蛋白質及びＦｒ規抵抗腫瘍活性ポリペプチド
大腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知ら
れている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴ
ＮＦ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カ
ラム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒ
トＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体
を用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィー
がとりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋
白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いるこ
とにより、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作用
に関する検討が可能となる。

ヒトＴ　Ｎ　Ｆ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド
の副作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投与してその
致死量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法
等により行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮ　Ｆｉｆｆ伝子の転子）第１図に示
した塩基配列のヒトＴ　Ｎ　Ｆ　’＞Ｔｌ伝転子設計し
た、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡ△）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には
制限酵素（ＪａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素Ｈ＋ｎｄＩ［による切断部位を設け、
ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２〈オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は金山！７ＪＤＮΔ合成機（アプライ
ド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ）を用いて、ホスファイト法により行な
った。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド・
バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。す
なわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水溶
液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護基
をはずし、セフ？デックスＧ−５０ファイン・ゲル（フ
ァルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の合
成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ尿
素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（グル濃度２
０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パター
ンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を切
出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破砕
した後、２〜５ｄの溶出用バッファ　−［５００ｍＭ　
　ＮＨ４０Ａｃ−１ｉ＋ＭＥＤＴＡ−０，１％５ＤＳ（
ｐＨ７゜５）］を加え、３７℃で一晩振とうした。遠心
分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行なった
。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル濾過
カラム（セファデックスＧ−５０）にかけることにより
、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお、必要
に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰り返し
、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのプロツクに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μＡの５０１
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　＜　１）８９．５）　、　１０１
Ｍ　　Ｍ（ｌ　Ｃ１ｚ　。

５１１Ｍジチオスレイトール、１０１１Ｍ　　ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、　３０分間行なった。反応終了後
、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合
し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌ
クレオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリ・ゴヌクレオチドＴＮＦ−１及び
ＴＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで
徐冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ交の６６　ｍＭ
Ｔ　ｒｔｓ−Ｈｃオ（ＤＨ７，６）　、　　６．６　ｍ
Ｍ　　ＭＣＩ　Ｃ１２゜１０１Ｍジチオスレイトール、
　１　　ｍＭ　　ＡＴＰ＊溶液に溶解させ、３００ユニ
ツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１
℃で１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、
エチジウムブロマイド染色法により泳動パターンの観察
を行なう。目的とする大きさく約２２０ｂｐ　）のバン
ド部分を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリ
ルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μグの大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ４１の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−）Ｉ　Ｃｊ（＋））１７．５＞　、　６０　ｍＭ
　　Ｎａ　（Ｊ、　７１１ＭＭｇＣＲ２水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素ＣｆａＩにューイングラン
ド・パイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反
応を行なった。

制限酵素ＣｆａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ磨の５０−ＭＴｒｉｓ−
ＨＣｆ　（ｐｔ−＋　７．４）　、　　１００　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃ１，１０℃Ｍ　　ＭＯ８Ｏａ水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素９ａｌＩ（宝酒造）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの
観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２２の大部分を含
む約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切
出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　７ｗ
ｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｆ０ｔ水溶液に溶解させた。Ｃｈ
ｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ　ｌ−８ａｌＩ　）をアガロー
スゲルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ３Ｗ伝子の一部を含む約２２０
ｂｔ）のＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端
のリン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２
の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合
する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮ
Ａ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａＣ第２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５−のし培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣ
ｌ、　　ｐＨ７，２＞にエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養液の
６００ｎｍにおける濁度（００，＋−）が０．３に達す
るまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッフ
ァ　−［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ１，５ｍＭ　　ＭＱ　Ｃ
第２゜５１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（＋）Ｈ７，６，
０℃）］中で２回洗い、２ｄの冷したカルシウム・バッ
ファー［１００１１ＭＣａ　Ｃ１２，２５０１１１Ｍ　
　Ｋ（Ｊ、　５　ｍＭＭｇＣＰ２　、５　＋１１Ｍ　　
Ｔｒ！５−ＨＣｆ（ＩＩＨ７，６゜０℃）］中に再懸濁
させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１（ｖｏ
ｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｊ、　　０．０８％グ
ル］−ス、　　ｐｌ−１７，２）を添加し、３７℃で１
時間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリ
ン（シグマ）３０μｇ／Ｉｄを含むし培地プレート］に
　１００μρ／プレートの割合で接種する。プレートを
３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得ら
れたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用
いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、
目的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）
の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１Ｂ
Ｒの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｌｌ＞を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮ−Ｆ３！を転子の一部を含む
プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ
３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設
計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ
、Ｍａｘａｍら、　Ｍ　ｅｔｈｏａｓＥｎｚｙｍｏｌ、
、６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μｑ
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及びＳａ１
■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（ｃｌａ　
ｌ−８ａｌＩ　）　ヲポＩＪ　７　り１，１　／Ｌ。

アミドゲルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
、ｃＢを１００μｆｌの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ＋ｓ−Ｈ
（Ｊ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，
７ｍＭＭｇＣｉｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間
切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じて
制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じ
て、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐのＤＮ
Ａ断片（Ｓａ１丁”ＰＶＬＩＩ［＞をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μｇも１００μＭの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ＋ｓ−ＨＣｊ
（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，７ｍ
ＭＭ（１（Ｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限
酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素）−１ｉｎｄ
ｎＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行
なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕ［ＨＨｉｎｄ　ｍ　）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ（約４，７Ｋｂｌ））　５μびを、上記と同
様に制限酵素（ＪａＩ及び旧ｉｎｄ　Ｉ［Ｉで切断し、
アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実
施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹＳ３１Ｎの大部
分を含む約４．７ＫｂｌｌのＤＮＡ断片（ＣｆａＩＨＨ
ｉｎｄｌｌ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒト１°ＮＦＷ伝子の一部を含む約
２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１ｉｏｂｐの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む
約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＣＣ６００ｒ−＋−
株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドＤＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋｂ
Ｄ）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラ
スミドｐＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μ９を、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕｉで部分分解した後、さらに
制限酵素）１ｉｎｄＩ［［で切断し、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準
じて、ｔｒｐブＯモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤ
ＮＡ断片［Ｐ　ｖｕＩ［（２）”　Ｈｉｎｄ　ＩＩ　１
をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩｔ［２］”Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ
　］　トｍ合シ、ｘり／−ル沈ＲｒＤ後、実施例３の方
法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行
なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリ
ヒア・コリＣ６００ｒ−１１−株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂ
ｐ）を有するりＯ−ンを選択した。このようなプラスミ
ドは、プラスミド１）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制御
領域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクロ
ーニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネー
タ−を付与した形の、多コピー・高効率゛発現ベクター
であり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μ９を、上記と同様に制
限酵素ＣｆａＩ及び）ｌｉｎｄｌｌで切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミド１ｌＡＡ４１の大部分を含む
約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩ−Ｈｉｎｄｌ
［［）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４ｏ１ＮＮ５μグを、上記と同様に制限酵素
ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌ［［で切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０
ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｃｆａ　Ｉ”Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ３
１！伝子全域を含む約４９０ｂｌ）のＤＮＡ断片とを混
合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−＋＋−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミド１）ＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２
Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミド
は、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を
有しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ　４０１Ａ２０μグを、実施例４の方法に準
じて制限酵素（ＪａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌｉで切断し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲルｍ度５％）及び
アガロースゲル電気法ｖＪ（ゲル濃度０．８％）の後、
それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つ
のＤＮＡ断片（約４９０ｂ１１及び約２．７Ｋｂｐ、両
方共（Ｊａ　Ｉ４−４Ｈｉｎｄ　■）をゲ／ｌｚ　ヨリ
Ｄｏ　収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ＤのＤＮＡｌｌｉ片を５０μ＝Ｊｌｌの１０　ｍＭ　　
Ｔ　ｒｉｓ−１−ＩＣｆ（ｐＨ７，４）、　ＩＯＩＩＭ
　　ＭＯ８Ｏ４，１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶
解させ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩ［（宝酒造）
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ　Ｆ
３！伝子の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈ
ａｐＩＩ”Ｈｉｎｄ［［）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μグについて、実流例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ　ｌ
４−ＩＨｉｎｄ　Ｉ［Ｉ）及びヒトＴＮＦ）ＩＩ仏子の
大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＨａｐｌＩ−
１−１ｉｎｄＩ［［）と混合し、エタノール沈澱の後、
実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準
じてエシェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−ｍ−株に導
入し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ４
７１（約３，２Ｋ　ｂｌｌ）を有するクローンを選択し
た。このプラスミドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ）　
　Ａｒ（ｌ　　Ｌ’／Ｓ　　Ａｒ（］　　１−ｙｓＰ　
ｒｏ　−Ｖａｔ　−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−
Ｖａｔ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−ＧＩｎ　−Ｔ　ｒｐ　−１ｅｕ　−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒＱ−Ａ　ｒｇＡ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ−
Ａ　Ｉａ−１ｅｕ−［ｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　５ｎ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ
−Ｇｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ
−Ｇｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ｒ　　
ｌｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｔ−ＬｅＵ−Ｐ
　ｈｅ−Ｌ　ｙＳ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇｌｙ−Ｃｙ
ｓ−ｐ　ｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−ＶａＬ　ｅｕ
　−１ｅｕ−Ｔｈｒ　−１−１ｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈ
Ｉｅ−３ｅｒ　−Ａｒ（１−１ｒｅ−Ａｌａ−Ｖａｔ−
８ｅｒ−”ｒｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌ　ｙＳ−Ｖａｌ
−Ａｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ　ｅｒＡ　Ｉ
ａ−Ｉ　　！ｅ−Ｌｌ／Ｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−ｃｙｓ−
Ｇ　ＩｎＡ　ｒａ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ
　ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　ｌａＧ　ｌｕ−Ａ　ｌａ−Ｌ　
ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ
−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ−
Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｙｓ−
Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａ　
ｌａ−Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒｏ−Ｐ　ｒｏ
−Ａ　ｓｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐ　ｈｅ
−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｎ
−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−Ｉ　　１
ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる抗ｆｉ瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ
末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする
発現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示し
た。

方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＤＴＮＦ　４７１　２０μ９を、実施例４の方法に準じ
て制限酵素１−（ｉｎｄＩ［Ｉで切断した後、５０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ　（ｐＨ７，４）　、　１００
　ｍ　ＭＮａ　Ｃｆ、　１０　ｍＭ　　ＭＯＳＯ４水溶
液中で制限酵素ＮＣ０Ｉ（宝酒造）による切断反応を３
７℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲル電気
泳動くゲル濃度０．７％）及びポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦ３！ｌ仏子の一部を含む約１４０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）をポ
リアクリルアミドゲルより、そして実施例３の方法に準
じて、ｔｌＴＮＦ４７１の大部分を含む約３．０Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片（ＮＣＯＩ＋Ｈｉｎｄ　ｉｌｌ　）をアガ
ロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ−Ｈｉｎｄ　［）を５０μ文の１０　ｍ１ｙｌ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　　（１ｌｌ−１７，４）　　、　　
１０　ｍＭ　　ＭＯ８０４、１＋＋＋Ｍジチオスレイト
ール水溶液に溶解させ、１ｏユニツトの制限酵素Ａｃｃ
Ｉ（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行
なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気法８
（ゲル濃度８％）を行ない、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１ｉｏｂｐのＤＮＡ断
片（Ｎ　ｃ。

■←ＡｃｃＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣ
ＯＩＭｌ−１ｉｎｄ　■）及びヒトＴＮＦ遺伝子の一部
含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃｏ工＋ＡｃｃＩ）
と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＥ）ＴＮＦ６２０（約３．２ＫｂＥｌ）
を有するクローンを選択した。このプラスミドは、次の
アミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　）　−Ａｒ！ＩＩ　　ＬｙＳ−Ａｒｌ）　−
Ｌｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ−
Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｌ−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉ
ｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅＵ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−
Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒＯ−Ａ　ｒＱ−Ａ　Ｉａ　
−Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉａ−１ｅｕ−１ｅｕ　−Ａ　ｌａ
　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ＩＬＩ−Ｌ
　ｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇｌｎ　−Ｌ
ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｇ
ｌｙ　−１ｅｕ−１”ｙｒ　−Ｌｅｕ　−１ｌｅ−’ｒ
ｙｒ−８ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　
−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　Ｖｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｇ　ＩＶ　−ＣｙＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｔ　ｈ
ｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−１ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ｔｈｒ　−＠　ｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　−１１ｅ　−３ｅｒ
　−Ａｒａ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｙｒ
−Ｇｌｎ−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｌ／Ｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ
　Ｓｎ　−Ｌ　ｅＵ　−Ｌ　１３ｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａ
ｌａ−１１ｅ−ＬＶＳ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−ＣｙＳ−Ｇｌ
ｎ−Ａ　ｒＱ−Ｇ　ｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ
−Ｇ　ｌｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　１ａ−Ｌ　ｙ
ｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　ｌｕ
　−Ｐｒｏ　−１１ｅ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｖａｔ　−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　ＩＵ
−ＬＶＳ−Ｇ　ＩＶ−ＡＳｌ）−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓ
ｅｒ、−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ａｓｎ
　−Ａ　ｒｇ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　ＳＤ−ＴＶｒ−Ｌｅｕ−
Ａ　５ｌ）−Ｐｈｅ−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ
　−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｙ　−１ｌｅ　−１１ｅ−Ａ　Ｉａ
　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドｐＴＮＦ　４０１Ａ、実施例５で得られた新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ
６２０を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株
を、３０〜５０μ９／−のアンピシリン。

０．２％のグルコース及び４１１＋９／ｄのカザミノ酸
を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３
％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣ！−０，１％Ｎ８
４Ｃｆ水溶液（ｐＨ７，４）をオートクレーブ滅菌した
後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭｇＳＯ４水溶液
及びＣａＣｊ２水溶液をそれぞれ最終濃度２ｍ１ｙｊ及
び０．１１１ＩＭになるように加える。］　　２５０Ｉ
ｎｌに接種し、ＯＤΔｏｌが０．７に達するまで、３７
℃で振とう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ
／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加
し、さらに３７℃で１２時間撮とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｐ
−（１５０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０１Ｍリン酸バ
ッファー、　　ｌ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄を行
なった。洗浄後の菌体を１０−のＰＢＳバッファーに懸
濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を
用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残漬の除
去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｔｓ−
ＨＣｆバッファ　−（ｐＨ６，８＞　、　ＳＤＳ、　２
−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ最
終濃度６０１Ｍ、２％、４％、１０％になるように加え
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［銘木、遺
伝、　３１．４３　（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１
１図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
８−９３０型）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペ
プチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行
なった。その結果、ヒトＴＮＦ３！ｌ転子発現型プラス
ミドＩ）ＴＮＦ４０１Ａを有する大腸菌においては全細
胞質蛋白質の約１６．２％の新規抗腫瘍活性ポリフペブ
チド遺伝子発現型ブラスミドｐＴＮＦ６２０を有する大
腸菌においては同じく約２６．６％の抗腫瘍活性ポリペ
プチドの産生が、それぞれ認められた。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記ＲｕＨの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μρと、４×１０５個／ｄの濃度のマウスＬ−９
２９１１１１Ｉ芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）懸濁液
１００μ磨を、９６穴の組織培養用マイクロプレート（
コースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終２１度
１μｇ／ｄのアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製
薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖａｔ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたもの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μ旦の０゜５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザ
ー（東洋測温。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。゛そこで、抗腫瘍活性ポリペプチ
ド等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照
の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希
釈倍率をグラフ（たとえば第１２図）によって求め、そ
の希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現
型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＡにコードされるヒトＴ
ＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１００μ旦は４，
２Ｘ　１０’ユニット程度の活性を、そして発現型プラ
スミドｐＴＮＦ６２０にコードされる新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドを含む大腸菌ライゼート　１００μ文は約４
．６Ｘ　１０’ユニット程度の活性を、それぞれ有して
いることが明らかになった。

実施例６で１ｕられた各種大腸菌ライゼート中に含まれ
総蛋白質量は、プロティン・アッセイ・キ　−ット（バ
イオ・ランド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを
用いた検ｍ線より計算した。上記で得られた発現場、活
性の値及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド
等の比活性を計算したところ、表１のような値が得られ
た。表１より、ｐＴＮＦ６２０にコードされる新規抗腫
瘍活性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約７倍の比活
性を有していることがわかる。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活性の比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦｌ転子の部を有するプラスミドｐＴＮ
ＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を、
それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を
、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作成方法を、
そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１）
ＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したもので
ある。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミド１）ＴＮＦ４７１の作成方法を示したものであ
る。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミド１）ＴＮＦ６２０の作成方法を示したもの
である。第１１図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示したものであ
る。第１２図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活性測定結果を示し
たものである。特許出願人　帝　人　株　式　会　社第図ｖｕｌ第図第７図のＡ（１１−一一一一一−−→ （５−）　−ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡ
ＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴ−（３−＞（３＝）−Ａ
ＴＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣ丁ＣＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡ
ＡＡＡ−（５−）（２１−−→ 第図のｐｖｕ　Ｉ＋（１）第図）１ｉｎｄ［Ｉ第図の）１１ｎｄｌｌｌボＢネ１頓ｊハ図面の浄書（内容に変更なし）第１１図 ε ε （ＫＤｏ）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項１記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６２０である
請求項３記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする請求項７記載の微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。