JPH0797999B2 - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は、新規生理活性ポリペプチド，該ポリペプチド
をコードするDNA領域を含む組換えプラスミド，該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある），該ポリペプチドをコードするDNA領域を
含む組換えプラスミド，該プラスミドによって形質転換
された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新規
抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸，ポリペプチドはIUPAC−I
UB生化学委員会（CBN）で採用された方法により略記す
るものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ala Ｌ−アラニン Arg Ｌ−アルギニン Asn Ｌ−アスパラギン Asp Ｌ−アスパラギン酸 Cys Ｌ−システイン Gln Ｌ−グルタミン Glu Ｌ−グルタミン酸 Gly グリシン His Ｌ−ヒスチジン Ile Ｌ−イソロイシン Leu Ｌ−ロイシン Lys Ｌ−リジン Met Ｌ−メチオニン Phe Ｌ−フェニルアラニン Pro Ｌ−プロリン Ser Ｌ−セリン Thr Ｌ−スレオニン Trp Ｌ−トリプトファン Tyr Ｌ−チロシン Val Ｌ−バリン また、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌク
レオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、た
とえば下記の略号を用いる。

Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。） Ｃ シトシン（デオキシシチジル酸を示す。） Ｇ グアニン（デオキシグアニル酸を示す。） Ｔ チミン （デオキシチミジル酸を示す。） さらに、（H₂N）−及び−（COOH）はそれぞれアミノ酸
配列のアミノ末端側及びカルボキシ末端側を示すもので
あり、（５′）−及び（３′）はそれぞれDNA配列の
５′末端側及び３′末端側を示すものである。

（２） 発明の背景 Carswellらは、Bacillus Calmette−Guerin（BCG）な
どで前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投
与した後に採取した血清中に、移植したMethA肉腫によ
る癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出
し、この物質を腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Facto
r,以下TNFと略記することもある）と名づけた［E.A.Car
swellら,5Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,72,3666（197
5）］。このTNFはマスス，ウサギ，ヒト等多くの動物中
に見られ、腫瘍細胞に特異的に、しかも種を越えて働く
ことから、制癌剤としての利用が期待されてきた。

最近になって、Pennicaらは、ヒトTNFのcDNAクローニン
グを行ない、ヒトTNF蛋白質の一次構造を明らかにする
と共に、大腸菌におけるヒトTNF遺伝子の発現について
報告した［D.Pennicaら,Nature,312,724（1984）］。そ
の後、白井ら［T.Shiraiら,Nature.313,803（1985）］
宗村や［宗村ら，癌と化学療法，12,160（1985）］、Wa
ngら［A.M.Wangら,Science,228,149（1985）］及びMarm
enoutら［A.Marmenoltら,Eur.J.Biochem.,152,515（198
5）］が、ヒトTNF遺伝子の大腸菌における発現について
相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトTNF蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、TNFの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らかに
なりつつある。たとえば、癌末期重症感染症患者らに見
られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチン
がTNFに非常に類似しており［B.Beulterら,Nature,316,
552（1985）］、カケクチンがリポプロテイン．リパー
ゼ阻害活性を有することから、TNFの投与により血中の
トリグリセリド量が増大し、その結果として高脂血症の
ような副作用を引き起こす可能性のあることが示唆され
た。また、それ以外にも、血管内皮細胞への影響［J.R.
Gambleら、L.Exp.Med.,162,2163（1985）］，骨吸収作
用［D.R.Beltoliniら、Nature,319,516（1986）］等が
報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。このようにして、
天然に存在する蛋白質を改変して、特定の目的にかなっ
た新しい蛋白質を創製する研究が、数多く成されてい
る。

ヒトTNF蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成さ
れており、第１図記載のヒトTNF蛋白質のアミノ酸配列
において、Cys⁶⁹及びCys¹⁰¹のいずれか又は両方のアミ
ノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換（PCT出願公開WO8
6/046065号，特願昭61−106772）、Gly¹²²の他のアミノ
酸残基への置換（特願昭61−106772号，特願昭61−2380
48号）,Ala¹⁸の他のアミノ酸残基への置換（特願昭61−
233337号）が報告されている。また、アミノ末端側のア
ミノ酸残基の失欠についても、６アミノ酸欠失TNFが細
胞障害活性を有していること（特開昭61−50923号）、
７アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有していること
（特願昭61−690087号公報）、１〜10アミノ酸欠失TNF
が細胞障害活性を有しており、その比活性は６〜８アミ
ノ酸欠失TNFにおいて極大になること（PCT出願公開WC86
/02381号）、10アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有し
ていること（特願昭61−5114754号）、及び11アミノ酸
欠失TNFが細胞障害活性を有していること（特願昭61−1
73822号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上，安定性の向上，反
応スペクトルの広域化，副作用の低減化等を目的とし
て、ヒトTNF蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３） 発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするDNA領域を含む組換えプラスミドを提供するこ
とにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形失転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫活性ポリペプチドを製造する方法を
提供とすることにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４） 発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
la−Leu−Phe−（COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチド、また上記新
規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするDNA領域を含む
組換えプラスミドを提供することによって達成され、更
にかくして得られた組換えプラスミドによって形質転換
された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて目的
とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生する方法及び
この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物
を提供することによって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトTNF遺伝子のクローン化； ヒトTNF遺伝子は、ヒトTNF蛋白質を構成するアミノ酸
［D.Pennicaら，前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトTNF遺伝子の設計に際しては、用
いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望ま
しく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえる
ように適当な位置に適当な制御酵素による切断部位を設
けることが望ましい。また、ヒトTNF蛋白質をコードす
るDNA領域は、その上流に読み取りフレームを一致させ
た形での翻訳開始コドン（ATGN）を有することが好まし
く、その下流方向に読みとりフレームを一致させた形で
の翻訳終止コドン（TGA,TAGまたはTAA）を有することが
好ましい。上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目
的として、２つ以上タンデムに連結すことがとりわけ好
ましい。さらに、このヒトTNF遺伝子は、その上流及び
下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることによ
り、適当なベクターへのクローン化が可能になる。この
ようなヒトTNF遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示し
た。

上記のように設計したヒトTNF遺伝子の取得は、上側の
鎖，下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に示
したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、それ
らを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結する
方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合成
法としてはジエステル法［H.G.Khorana,“Some Recent
Developments in Chemistry of Phosphatet Est
ers of Biolgical Interest",John wiley and So
ns,Inc.,Newn York（1961）］，トリエステル法［R.L.
Letsingeら,J.Am.Chem.Soc.,89,4801（1967）］及びホ
スファイト法［M.D.Mattteucciら,Tetrahedron Lett.,
21,719:（1980）］があるが、合成時間，収率，操作の
簡便さ等の点から、全自動DNA合成機を用いたホスファ
イト法により合成が好ましい。合成したオリゴヌクレオ
チドの精製は、ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィ
ー，ゲル電気泳動，逆相カラムによる高速液体クロマト
グラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いること
ができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′未満側
の水酸基を、たとえばT4−ポリヌクレオチドキナーゼを
用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえばT4
−DNAリガーゼを用いて連結する。合成オリヌクレオチ
ドを連結してヒトTNF遺伝子を作成する方法としては、
合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロックに分けて
連結し、たとえばpBRのブロックに分けて連結し、たと
えばpBR322［F.Bolivarら,Gene,２,95（1977）］のよう
なベクターに一度クローン化した後、それらの各ブロッ
クのDNA断片を連結する方法が好ましい。このようなヒ
トTNF遺伝子を構成するブロックのDNA断片を含むプラス
ミドとして、好ましくはpTNF1BR,pTNF2NまＴはpTNF3が
用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトTNF遺伝子を構成
する各ブロックのDNA断片を連結した後、適当なプロモ
ータ,SD（シャイン・ダルガーノ）配列の下流につなぐ
ことにより、発現型遺伝子とすることができる。使用可
能なプロモータとして、トリプトファン・オペロン・プ
ロモーター（trpプロモータ），ラクトース・オペロン
・プロモーター（lacプロモーター）,tacプロモーター,
P_Lプロモーター,lppプロモーター等があげられるが、と
りわけtrpプロモーターが好適である。trpプロモーター
を有するプラスミドとして、好ましくはpYTS31N、又はp
AA41が用いられる。さらに、発現効率向上を目的とし
て、ヒトTNF遺伝子下流に大腸菌で効率良く機能するタ
ーミネーターを付与することができる。このようなター
ミネーターとして、lpptターミネーター,trpターミネー
ター等があげられるが、とりわけtrpAターミネーターが
好適であり、trpAターミネーターを有するプラスミドと
して、好ましくはpAA41が用いられる。この発現型ヒトT
NF遺伝子を、たとえばpBR322由来のベクターにクローン
化することにより、発現型プラスミドが作成できる。ヒ
トTNF遺伝子発現型プラスミドとして、好ましくはpTNF4
01NN又は、pTNF401Aが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン
化； こうして得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドを適
当な制限酵素で切断し、ヒトTNF遺伝子内の特定な領域
を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴヌク
レオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手法を
用いることにより、ヒトTNF蛋白質中の任意のアミノ酸
を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、または欠失
させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする遺
伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる。この
ような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはpTNF620が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトTNF遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌，枯草
菌，酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシュリ
ヒア・コリ（Esherichia coli）］が好ましい。前記ヒ
トTNF遺伝子発現型プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチド遺伝子発現型プラスミドは、たとえば公知の方
法［M.V.Norgardら,Gene,３,279（1978）］を用いて、
微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリC 600r−ｍ−
株（ATCC33525）に導入することができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。倍地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むM9倍地（T.Maniatisら編，
“Molecular Cloning",P440,Cold Spring Harbor L
aboratory,New York（1982）参照］があげられ、必要
に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ま
しい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえ
ば振とうによる通気、撹拌を加えながら、37℃で２〜36
時間行なう。また、培養開始時または培養中にプロモー
ターを効率良く機能させる目的で、３−β−インドール
アクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物のライゼートを得る。得られたライゼ
ート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下、SD
Sと略すこともある）を含むポリアクリルアミドゲルを
用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質を適当
な方法を用いて染色する。発現型プラスミドを含まない
微生物細胞のライゼートを対照として泳動パターンを比
較することにより、ヒトTNF遺伝子または新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子の発現を確認する。

このようにして得られたヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍
活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植し
たMethA肉種を壊死させる効果を見る。in vivo活性測定
法（Cartswellら，前出），マウスＬ細胞に対する細胞
障害性を見るin vivtro活性測定法［Ruff,J.Immunol.,
126,235（1981）］等により行なえる ヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸
菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られて
いる蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトTNF淡
白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラム・
クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒトTNF
蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を用いた
アフィニテイー・カラム・クロマトグラフィーがとりわ
け好適である。こうして得られたヒトTNF淡白質及び新
規抗腫活性ポリペプチド精製品を用いることにより、in
vivo抗癌活性（前出）及び副作用に関する検討が可能
となる。

ヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副作
用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるin vitro
法，マウス等の実験動物に投与しての致死量や血圧の降
下程度等を測定するin vivo法等により行なうことがで
きる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトTNF蛋白質と
は異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能に
なり、この新規抗腫活性ポリペプチドを用いることによ
って抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供すること
が可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトTNF遺伝子の説明） 第１図に示した塩基配列のヒトTNFN遺伝子を設計した、
設計に際しては、Pennicaら［D.Pennicaら,Nature,312,
724（1984）］の報告したヒトTNF前駆体cDNAの構造遺伝
子部分の塩基配列を基盤として、適当な制限酵素による
切断部位を適当な位置に設け、５′側に翻訳開始コドン
（ATG）を、そして、３′側に２個の翻訳終止コドン（T
GA及びTAA）をそれぞれ付与した。また、５′側翻訳開
始コドン上流には制限酵素Cla Iによる切断部位を設
け、SD配列と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形
でのプロモーターとの連結を可能にした。更に、３′側
翻訳終止コドン下流には制限酵素Hind IIIによる切断部
位を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるよ
うにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成） 実施例１で設計したヒトTNF遺伝子は、第２図に示した
ように17本のオルゴヌクレオチドに分けて合成する。オ
リゴヌクレオチドの合成は全自動DNA合成機（アプライ
ド・バイオシステムズ，モデル380A）を用いて、ホスフ
ァイト法により行なった。合成オリゴヌクレオチドの精
製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアルに
準じて行なった。すなわち、合成オチゴヌクレオチドを
含むアンモニア水溶液を55℃で一晩保つことによりDNA
塩基の保護基をはずし、セファデックスＧ−50ファイン
・ゲル（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高
分子量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。つい
で、7M尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度20％）の後、紫外線シャドウイング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜5mlの溶出用バッファー［500mM NH₄O
Ac−1mM EDTAT−0.1％SDS（pH7.5）］を加え、37℃で
一晩振とうした。遠心分離により、目的のDNAを含む水
相の回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを
含む水溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−50）
にかけることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品
を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の
向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトTNF遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した17本の合成オリゴヌクレオチド（TN
F−１〜TNF−17）を用いて、ヒトTNFN遺伝子を３つのブ
ロックに分けてクローン化した。

0.1〜1.0μｇの合成オリゴヌクレオチドTNF−２〜TNF−
６の５′末端側を、５〜15ユニットのT4−ポリヌクレオ
チドキナーゼ（E.coliBタイプ，宝酒造）を用いて、そ
れぞれ別々にリン酸化する。リン酸化反応は10〜20μ
の50mM Tris−HCl（pH9.5）,10mM Mg Cl₂,5mMジチオス
レイトール,10mMT ATP水溶液中で37℃で,30分間行なっ
た反応終了後すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液を
すべて混合し、フェノール抽出，エーテル反応によりT4
−ポリヌクレオチドキナーゼを失活，除去する。この合
成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに0.1〜1.0μｇの
合成オリゴヌクレオチドTNF−１及びTNF−７を加え、90
℃で５分間加熱した後室温まで徐冷して、アニーリング
を行なう。次に、これを減圧乾固した後に、30μの66
mM Tris−HCl（pH7.6）,6.6mM Mg Cl₂,10mMジチオスレ
イトール,1mM ATP水溶液ひ溶解させ、300ユニットのT4
−DNAリガーゼ（宝酒造）を加えて、11℃で15時間連結
反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジウムブロマ
イド染色法により泳動パターンの観察を行なう。目的と
する大きさ（約200bp）のバンド部分を切出して、実施
例２の方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりDNAを
回収する。

一方、３μｇの大腸菌用プラスミドpBR322（約4.4Kbp）
を30μの10mM Tris−HCl（DH7.5）,60mM NaCl,7mM
MgCl₂水溶液に溶解させ、10ユニットの制限酵素ClaI
（ニューイングランド・バイオラブズ）を添加して、37
℃で１時間切断反応を行なった。制限酵素Cla Iによる
切断の後、フェノール抽出，エーテル抽出を行ないエタ
ノール沈澱によりDNAを回収する。このDNAを30μの50
mM Tris−HCl（pH7.4）,100mM NaCl,10mM MgSO₄水溶
液に溶解させ、10ユニットの制限酵素SalI（宝酒造）を
添加して、37℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）を行な
い、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンの
観察を行なう。プラスミドpBR 322の大部分を含む約3.7
KbpのDNAの部分に相当するバンドを切出し、そのアガロ
ースゲル断片を３倍量（vol/wt）の8M NaClO₄水溶液に
溶解させた。Chenらのグラスフィルター法［C.W.Chen
ら,Anal.Biochem.101,329（1980）］により、約3.76Kbp
のDNA断片（Cla ISalIをアガロースゲルより回収し
た。

先に得られたヒトTNF遺伝子の一部を含む220bpのDNA断
片について、前記の方法に準じて末端のリン酸化反応を
行なった後，プラスミドpBRT322の大部分を含む約3.75K
bpのDNA水溶液と混合する。エタノール沈澱の後、前記
の方法に準じて両DNA断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリC600r−ｍ−株の形質転換は、通常
のCaCl₂法（M.V.Norgardらの方法）の改良法で行なっ
た。すなわち、5mlのＬ倍地（１％５トリプトン0.5％酵
母エキス,0.5％NaCl,pH7.2）にシェリヒア・コリC 600r
−ｍ−株の18時間培養基を接種し、菌体を含む培養液の
600nmにおける濁度（OD₆₀₀）が0.3に達するまで生育さ
せる。菌体を冷たいマグネシウム・バッファー［0.1M
NaCl,5 mM MgCl₂,5 mM Tris−HCl（pH 7.6,0℃）］中
で回洗い、2mlの冷したカルシムル・バッファー［100 m
M CaCl₂,250 ｍ KCl,5mM MgCl₂,5mM Tris−HCl（pH
7.6,0℃）］中に再懸濁させ、０℃で25分間放置する。
次に菌体をこの容量の1/10にカルシウム・バッファー中
で濃縮し、連結後のDNA水溶液と2:1（vol.:vol.）混合
する。この混合物を60分間,0℃で保った後、1mlのLBG倍
地（１％トリプトン,0.5％酵母エキス,1％NaCl,0.08％
グルコース,pH7.2）を添加し、37℃で１時間振とう培養
する。培養液を、選択倍地［アンピシリン（シグマ）30
μg/mlを含むＬ倍地プレート］に100μg/プレートの割
合で接種する。プレートを37℃で一晩培養して、形質転
換株を生育させる。得られたアンピシリン耐性のコロニ
ーより、公知の方法を用いてDNAを調整し、アガロース
ゲル電気泳動により、目的のプラスミドpTNF1BR（約4.0
Kbp）の取得を確認した。第３図に、プラスミドpTNF1BR
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドTNF
−８〜TNF−13を用いてプラスミドpTNF2N（約3.1Kbp）
を、合成オリゴヌクレオチドTNF−14〜TNF−17を用いて
プラスミドpTNF3（約2.4Kbp）を、それぞれ作成した。
第４図及び第５図に、プラスミドpTNF2N及びpTNF3の作
成方法を、それぞれ示す。こうして得られたヒトTNF遺
伝子の一部を含むプラスミドpTNF1BR,pRNF2N及びpTNF3
の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設定
通りであることは、マキサム・ギルバート法［A.M.Maxa
mら,Methods Enzymol.,65,49965（1980）］によって確
認した。

実施例４（ヒト）TNF遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドpTNF1BR10μｇを、実施
例３と同様にして制限酵素Cla I及びSalIで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、
実施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む
約220bpのDNA断片（Cla ISalI）をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドpTNF2 10μｇを1
00μの10mM Tris−HCl（pH7.5）,60mM NaCl,7mM M
gCl₂水溶液に溶解させ、40ユニットの制限酵素Pvu II
（宝酒造）を添加し、37℃で１時間切断反応を行なっ
た。そして、実施例３の方法に準じて制限酵素SalIによ
る切断，ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の
一部を含む約170bpのDNA断面（SalIPvu II）をポリア
クリルアミドより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドpTNF3 10μｇも1
00μの10m TRris−HCl（pH7.5）,60mM NaCl,7mM M
gCl₂水溶液に溶解させ、40ユニットの制限酵素Pvu II及
び40ユニットの制限酵素Hind III（宝酒造）を添加し、
37℃で１時間切断反応を行なった。そして、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む110bpのDN
A断片（Pvu IIHindt III）をポリアクリルアミドゲル
より回収した。

一方、大腸菌trpプロモーターを有するプラスミドpYST3
1N（約4.7Kbp）５μｇを、上記と同様に制限酵素Cla I
及びHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度0.8％）の後、実施例３の方法に準じて、プラスミ
ドpYS31Nの大部分を含む約4.7KbpのDNA断片（Cla IHi
nd III）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約200b
p,約170bp及び約1105bpの３つのDNA断片とプラスミドpY
S31Nの大部分を含む約4.7KbpのDNA断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、T4−DNA
リガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施
例３の方法に準じてエシェリヒア・コリC 600r−ｍ−株
に導入し、形質転換株の中より目的のヒトTNF遺伝子発
現型プラスミドpTNF401NN（約5.2bp）を有するクローン
を選択した。第６図に、そのプラスミドpTNF 401NNの作
成方法を示した。

また、上記プラスミドpYS31N5μｇを、上記の方法に準
じて制限酵素PvuIIで部分分解した後、さらに制限酵素H
ind III切断し、アガロースウゲル電気動（ゲル濃度0.8
％）の後、実施例３の方法に準じて、trpプロモーター
を含む約2.7bpのDNA断片［Pvu II（２）Hind III］を
アガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μｇにつ
いて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行な
い、アニーリングの後、先に得られた約2.7KbpのDNA断
片［Pvu II（２）Hind III］と混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、T4−DNAリガーゼに
よる反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準
じてエシェリヒア・コリC600r−ｍ−株に導入し、形質
転換株の中より目的のプラスミドpAA41（約2.7Kbp）を
有するクローンを選択した。このようなプラスミドは、
プラスミドpYS31Nからコピー数制御領域を除去し、trp
プロモーター下流に存在するクローニング・サイトの下
流に大腸菌trp ターミネーターを付与した形の多コピー
・高効率発言ベクターであり、第７図にその作成方法を
示した。

このプラスミドpAA41 ２μｇを、上記と同様に制限酵
素Cla I及びHindt IIIで切断し、アガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度0.8％）の後、実施例３の方法に準じて、
プラスミドpAA41の大部分を含む約2.7bpのDNA断片（Cla
IHind III）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTN
F 401NN5μｇを、上記と同様に制限酵素Cla I及びHind
IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺
伝子全域を含む約490bpのDNA断片（Cla IHindt III）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドpAA41の大部分を含む2.7
KbpのDNAR断片とヒトTNF遺伝子全域を含む約490bpのDNA
断片とを混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法
に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒ
ア・コリ600r−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドpTNF 401A（約3.2Kbp）を有するクロー
ンを選択した。このプラスミドは、ヒトTNF遺伝子をよ
り効率良く発現させる能力を有しており、第８図にその
作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTN
F 401A20μｇを、実施例４の方法に準じて制限酵素Cla
I及びHind IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）及びアガロースゲル電気泳動（ゲ
ル濃度0.8％）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に
準じて、生成する２つのDNAT断片（約490bp及び約2.7Kb
p,両方共Cla IHind III）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトTNF遺伝子全域を含む約490bpのDNA
断片を50μの10mM Tris−HCl（pH7.4）,10mM MgS
O₄,1mMジチオスレイトール水溶液に溶解させ、10ユニッ
トの制限酵素Hap II（宝酒造）を添加して、37℃で１時
間切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の
方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の大部分を含む約390bpの
DNA断片（Hap IIHind III）をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方に準じて、合成，精製した。得られ
た４本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μｇにつ
いて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行な
い、アニーリングの後、T4−DNAリガーゼによる連結反
応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約2.7KbpのDTA断片（Cla IHindnt III）及
びヒトTNF遺伝子を大部分を含む約390bpのDNA断片（Hap
IIHind III）と混合し、エタノール沈澱の後、実施
例３の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリC 600r−ｍ−株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミドpNFT471（約3.2Kbp）を有する
クローンを選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸
配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
la−Leu−−（COOH） 表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末端
にMetが結合しているポリペプチドをコードする発現型
プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した。

一方、上記で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドp
TNF471 20μｇを、実施例４の方法に準じて制限酵素Hin
d IIIで切断した後、50mM Tris−HCl（pH7.4）,100mM
NaCl,10mM MgSO₄水溶液中で制限酵素NcoI（宝酒造）
による切断反応を37℃で１時間行なう。反応終了後、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.7％）及びポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実
施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約1
40bpのDNA断片（Nco IHind III）をポリアクリルアミ
ドゲルより、そして実施例３の方法に準じて、pTNF471
の大部分を含む約3.0KbpのDAN断片（Nco IHind III）
をアガロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約140bpのDNA断片（NcoIHind I
II）を50μの10mM Tris−HCl（pH7.4）,10mM MgS
O₄,1mMジチオスレイトール水溶液に溶解させ、10ユニッ
トの制限酵素AccI（宝酒造）を添加して、37℃で１時間
切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度８％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約110bpのDNA
断片（NcoIAccI）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。

また、第10図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成，精製した。得ら
れた２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μｇに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約3.0KbpのDNA断片（NcoIHind II
I）及びヒトTNF遺伝子の一部含む約110bpのDNA断片（Nc
oIAccI）と混合し、エタノールの沈澱の後、実施例３
の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行
なった。反応終了後実施例３の方法に準じてエシェリヒ
ア・コリC600r−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドpTNF620（約3.2Kbp）を有するクロー
ンを選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
la−Leu−Phe−（COOH） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードする
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドで
あり、第10図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミ
ドpTNF401A,実施例５で得られた新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド遺伝子発現型プラスミドpTNF620を有するエシェ
リヒア・コリC600r−ｍ−株を、30〜50μg/mlのアンピ
シリン,0.2％のグルコース及び4mg/mlのカザミノ酸を含
むM9倍地［0.6％Na₂HPO₄−0.3％K₂HPO₄−0.05％NaCl−
0.1％NH₄Cl水溶液（pH7.4）をオートクレーブ滅菌した
後に、別途にオートクレーブ滅菌したMgSO₄水溶液及びC
aCl₂水溶液をそれぞれ最終濃度2mM及び0.1mMになるよう
に加える。］250mlに接種し、OD₆₀₀が0.7に達するま
で、37℃で振とう培養を行なった。次いで、最終濃度50
μg/mlの３−β−インド−ルアクリル酸を培養液中に添
加し、さらに37℃で12時間振とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌体を集めた後、PBSバッファー（1
50mM NaClを含む20mMリン酸バッファー,pH7.4）を用い
て、菌体の洗浄を行なった。洗浄後の菌体を10mlのPBS
バッファーに懸濁させ、超音発生装置（久保田,200M
型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Tris−HCl
バッファー（pH6.8）,SDS,2−メルカプトエタノール，
グリセロールを、それぞれ最終濃度60mM,2％,4％,10％
になるように加え、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動［鈴木，遺伝，31,45（1977）］を行なった。分離
用ゲルは15％とし、泳動バッファーはSDS,Tris−グリシ
ン系［U.K.Laemmli,nature,227,680（1970）］を用い
た。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシーブル
ーＲ−250（バイオ・ラッド）で染色し、ヒトTNF遺伝子
及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現を行なっ
た。結果を一部を複写して、第11図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津.CS
−930型５）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペプ
チドの大腸菌細胞蛋白質中にしめる割合の算出を行なっ
た。その結果、ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTNF401
Aを有する大腸菌においては全細胞蛋白質の約16.2％の
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドpT
NF620を有する大腸菌においては同じく約26.6％の抗腫
瘍活性ポリペプチドの産生が、それぞれ認められた。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドのin vitro抗癌活性測定
は、前記Ruffの方法に準じて行なった。すなわち、実施
例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸
菌ライゼートを順次倍地で希釈した試料10μと、４×
10⁵個/mlの濃度のマウスＬ−929繊維芽細胞（ATCC CCL
−929）懸濁液10μ、96穴の組織培養用マイクロプレ
ート（コースター）内で混合したなお、この際に、最終
濃度１μg/mlのアクチノマイシンＤ（コスメゲン．萬有
製薬）を添加しておく。倍地としては、５％（vol/vo
l）のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマム・エッセ
ンシャル倍地（日水製薬）を用いた。上記マイクロプレ
ートを、５％炭酸ガスを含む空気中,37℃で18〜20時間
培養した後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（vo
l/vol）メタノール水溶液に、0.5％（wt/vol）のクリス
タル・バイオレットを溶解させたもの］を用いて生細胞
を染色した。余分なクリスタル・バイオレットを洗い流
し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレットを100
μの0.5％SDS水溶液で抽出し、その595nmにおける吸
光度をELISAアナライザー（東洋側器,ETY−96型）で測
定する。この吸光度は、生き残った細胞数に比例する。
そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド等を含む大腸菌ライゼ
ートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の50％の値に相
当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグラフ（たとえば
第12図）によって求め、その希釈倍率をユニットと定義
する。第12図より、発現型プラスミドpTNF401Aにコード
されるヒトTNF蛋白質を含む大腸菌ライゼート100μ
は、4.2×10⁶ユニット程度の活性を、そして発現型プラ
スミドpTNF620にコードされる新規光腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼート100μは約4.6×10⁷ユニ
ット程度の活性を、それぞれ有していることが明らかに
なった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロテイン・アッセイ・キット（バイオ・
ラッド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。上記で得られた発現量，活性の値
及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の比
活性を計算したところ、表１のような値が得られた。表
１より、pTNF620にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドはヒトTNF蛋白質の約７倍の比活性を有してるこ
とがわかる。

【図面の簡単な説明】 第１図は設計したヒトTNF遺伝子の塩基配列を、第２図
は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を、
それぞれ示したものである。第３図，第４図及び第５図
は、ヒトTNF遺伝子の一部を有するプラスミドpTNF1BR,p
TNF2N及びpTNF3の作成方法を、それぞれ示したものであ
る。第６図はヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTNF401NN
の作成方法を、第７図は発現ベクターpAA41の作成方法
を、そして第８図はヒトTNF遺伝子発言型プラスミドpTN
F401Aの作成方法を、それぞれ示したものである。第９
図は抗腫瘍活性ポリペプリド遺伝子発現型プラスミドpT
NFS471の作成方法を示したものである。第10図は新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドpTNF620
の作成方法を示したものである。第11図はヒトTNF遺伝
子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結
果を示したものである。第12図はヒトTNF蛋白質及び新
規抗腫瘍活性ポリペプチドのin vitor抗癌活性測定結果
を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 8828−4Ｂ 15/09 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 北井 一男 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物工学研究所内 (72)発明者 福岡 政実 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物工学研究所内 (72)発明者 市川 弥太郎 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物工学研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Leu−Phe−（COOH）で表わされる、新規生理活性ポ
   リペプチド。
2. 【請求項２】アミノ末端にMetが結合していることを特
   徴とする請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Leu−Phe−（COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードするD
   NA領域を含む組織変えプラスミド。
4. 【請求項４】該DNA領域が次の塩基配列 （５′）−CGTAAGCGCAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTC
   AAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTGCTG
   GCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTACCATCAGAGGG
   CCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCGT
   CGACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTAC
   CAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCGATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGA
   GACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCATGGTATGAGCCCATCTATCTGG
   GAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAAATCAAT
   CGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGAT
   TATTGCCCTGTTC−（３′） で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DNAとか
   ら成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする請求項３記載
   のプラスミド。
5. 【請求項５】該DNAが次の塩基配列 （５′）−CATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTT
   GACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAG
   GGTATCGATAATGCGTAAGCGCAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACC
   CTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTG
   CTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTACCATCAGA
   GGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCC
   CGTCGACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCC
   TACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCGATCAAGAGCCCCTGCCAGAG
   GGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCATGGTATGAGCCCATCTATC
   TGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAAATC
   AATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGG
   GATTATTGCCCTGTTCTGATAAGCTT−（３′） で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DNAとか
   ら成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする請求項３記載
   のプラスミド。
6. 【請求項６】該プラスミドがプラスミドpTNF620である
   請求項３記載のプラスミド。
7. 【請求項７】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Leu−Phe−（COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードするD
   NA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換された組
   換え微生物細胞。
8. 【請求項８】該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Eshe
   richia coli）であることを特徴とする請求項７記載の
   微生物細胞。
9. 【請求項９】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Leu−Phe−（COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードするD
   NA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換された組
   換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活性ポリ
   ペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から新規生
   理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする、新生
   理活性ポリペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
    al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
    eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
    eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
    sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
    yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
    ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
    eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
    er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
    la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
    ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
    lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
    eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
    le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
    lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
    la−Leu−Phe−（COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にMetが結合しているポリペプチドを含有する医
    薬組成物。