JPH07110237B2 - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （１） 産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド，該ポリペプチドを
コードするDNA領域を含む組換えプラスミド，該プラス
ミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該微
生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方法
に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポリ
ペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略すこ
ともある），該ポリペプチドをコードするDNA領域を含
む組換えプラスミド，該プラスミドによって形質転換さ
れた組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新規抗
腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸，ポリペプチドはIUPAC−I
UB生化学委員会（CBN）で採用された方法により略記す
るものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ala Ｌ−アラニン Arg Ｌ−アルギニン Asn Ｌ−アスパラギン Asp Ｌ−アスパラギン酸 Cys Ｌ−システイン Gln Ｌ−グルタミン Glu Ｌ−グルタミン酸 Gly グリシン His Ｌ−ヒスチジン Ile Ｌ−イソロイシン Leu Ｌ−ロイシン Lys Ｌ−リジン Met Ｌ−メチオニン Phe Ｌ−フェニルアラニン Pro Ｌ−プロリン Ser Ｌ−セリン Thr Ｌ−スレオニン Trp Ｌ−トリプトファン Tyr Ｌ−チロシン Val Ｌ−バリン また、DNAの配列はそれを構成する各デオキシリボヌク
レオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、た
とえば下記の略号を用いる。

Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。） Ｃ シトシン（デオキシシチジル酸を示す。） Ｇ グアニン（デオキシグアニル酸を示す。） Ｔ チミン（デオキシチミジル酸を示す。） さらに、（H₂N）−及び−（COOH）はそれぞれアミノ酸
配列のアミノ末端側及びカルボキシ末端側を示すもので
あり、（５′）−及び（３′）はそれぞれDNA配列の
５′の末端側及び３′末端側の示すものである。

（２） 発明の背景 Carswellらは、Bacillus Calmette−Guerin（BCG）な
どで前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投
与した後に採取した血清中に、移植したMeth A肉腫によ
る癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出
し、この物質を腫瘍壊死因子（Tumor Necrosis Facto
r,以下TNFと略記することもある）と名づけた［E.A.Car
swellら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72,3666（1975）］。
このTNFはマウス，ウサギ，ヒト等多くの動物中に見ら
れ、腫瘍細胞に特異的に、しかも種を越えて働くことか
ら、制癌剤としての利用が期待されてきた。

最近になって、Pennicaらは、ヒトTNFのcDNAクローニン
グを行ない、ヒトTNF蛋白質の一次構造から明らかにす
ると共に、大腸菌におけるヒトTNF遺伝子の発現につい
て報告した［D.Pennicaら,Nature,312,724（1984）］。
その後、白井ら［T.Shiraiら,Nature,313,803（198
5）］、宗村ら［宗村ら，癌と化学療法，12,160（198
5）］、Wangら［A.M.Wangら,Science,228,149（198
5）］及びMarmenoutら［A.Marmenoutら,Eur.J.Bioche
m.,152,515（1985）］が、ヒトTNF遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトTNF蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、TNFの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らかに
なりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に見
られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチン
がTNFに非常に類似しており［B.Beulterら,Nature,316,
552（1985）］、カケクチンがリポプロテイン・リパー
ゼ阻害活性を有することから、TNFの投与により血中の
トリグリセリド量が増大し、その結果として高脂血症の
ような副作用を引き起こす可能性のあることが示唆され
た。また、それ以外にも、血管内皮細胞への影響［J.R.
Gambleら、J.Exp.Med.,1622163（1985）］ら，骨吸収作
用［D.R.Beltoliniら、Nature,319516（1986）］等が報
告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。このようにして、
天然に存在する蛋白質を改変して、特定の目的にかなっ
た新しい蛋白質を創製する研究が、数多く成されてい
る。

ヒトTNF蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成さ
れており、第１図記載のヒトTNF蛋白質のアミノ酸配列
において、Cys⁶⁹及びCys¹⁰¹のいずれか又は両方のアミ
ノ酸残基のアミノ酸残基への置換（PCT出願公開WO86/04
606号，特願昭61−106772）、Gly¹²²の他のアミノ酸残
基への置換（特願昭61−106772号，特願昭61−238048
号）,Ala¹⁸の他のアミノ酸残基への置換（特願昭61−23
3337号）が報告されている。また、アミノ端末側のアミ
ノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失TNFが細胞
障害活性を有していること（特開昭61−50923号）、７
アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有していることを
（特願昭61−90087号）、１〜10アミノ酸欠失TNFが細胞
障害活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠
失TNFにおいて極大になること（PCT出願公開WO86/02381
号）、10アミノ酸欠失TNFが細胞障害活性を有している
こと（特願昭61−114754号）、11アミノ酸欠失TNFが細
胞障害活性を有していること（特願昭61−173822号）、
及び７アミノ酸欠失TNFを基盤として、Pro⁸Ser⁹Asp¹⁰を
ArgLysArgへ置換を行なうと、その比活性が大きく上昇
することが報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上，安定性の向上，反
応スペクトルの広域化，副作用の低減化等を目的とし
て、ヒトTNF蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３） 発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするDNA領域を含む組換えプラスミドを提供するこ
とにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４） 発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
la−Phe− （COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチド、また上記新
規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするDNA領域を含む
組換えプラスミドを提供することによって達成され、更
にかくして得られた組換えプラスミドによって形質転換
された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて目的
とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生する方法及び
この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物
を提供することによって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトTNF遺伝子のクローン化； ヒトTNF遺伝子は、ヒトTNF蛋白質を構成するアミノ酸
［D.Pennicaら，前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトTNF遺伝子の設計に際しては、用
いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望ま
しく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえる
ように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を設
けることが望ましい。また、ヒトTNF蛋白質をコードす
るDNA領域は、その上流に読みとりフレームを一致させ
た形での翻訳開始コドン（ATG）を有することが好まし
く、その下流方法に読みとりフレームを一致させた形で
の翻訳終止コドン（TGA,TGAまたはTAA）を有することが
好ましい。上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目
的として、２つ以上タンデムに連結することがとりわけ
好ましい。さらに、このヒトTNF遺伝子は、その上流及
び下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることによ
り、適当なベクターへのクローン化が可能になる。この
ようなヒトTNF遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示し
た。

上記のように設計したヒトTNF遺伝子の取得は、上側の
鎖，下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に示
したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、それ
らを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結する
方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合成
法としてはジエステル法［H.G.Khorana,“Some Recent
Developments in Chemistry of Phosphate Este
rs of Biological Interest",John Wiley and So
ns,Inc.,New york（1961）］，トリエステル法［R.L.L
etsingerら,J.Am.Chem.Soc.,89,4801（1967）］及びホ
スファイト法［M.D.Mattucciら,Tetrahedron Lett.,2
1,719（1980）］があるが、合成時間，収率，操作の簡
便さ等の点から、全自動DNA合成機を用いたホスファイ
ト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌクレオチ
ドの精製は、ゲル濾過，イオン交換クロマトグラフィ
ー，ゲル電気泳動，逆相カラムによる高速液体クロマト
グラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いること
ができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばT4−ポリヌクレオチドキナーゼを
用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえばT4
−DNAリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌクレオ
チドを連結してヒトTNF遺伝子を作成する方法として
は、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロックに分
けて連結し、たとえばpBR 322［F.Bolivarら,Gene,２,
95（1977）］のようなベクターに一度クローン化した
後、それらの各ブロックのDNA断片を連結する方法が好
ましい。このようなヒトTNF遺伝子を構成するブロック
のDNA断片を含むプラスミドとして、好ましくはpTNF1B
R,pTNF2NまたはpTNF3が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトTNF遺伝子を構成
する各ブロックのDNA断片を連結した後、適当なプロー
モーター,SD（シャイン・ダルガーノ）配列の下流につ
なぐことにより、発現型遺伝子とすることができる。使
用可能なプロモーターとして、トリプトファン・オペロ
ン・プロモーター（trpプロモーター），ラクトース・
オペロン・プロモーター（lacプロモーター）,tacプロ
モーター,P_Lプロモーター、lppプロモーター等があげら
れるが、とりわけtrpプロモーターが好適である。trpプ
ロモーターを有するプラスミドとして、好ましくはpYS3
1N、又はpAA41が用いられる。さらに、発現効率向上を
目的として、ヒトTNF遺伝子下流に大腸菌で効率良く機
能するターミネーターを付与することができる。このよ
うなターミネーターとして、lppターミネーター,trpタ
ーミネーター等があげられるが、とりわけtrp Aターミ
ネーターが好適であり、trp Aターミネーターを有する
プラスミドとして、好ましくはpAA41が用いられる。こ
の発現型ヒトTNF遺伝子を、たとえばpBR 322由来のベク
ターにクローン化することにより、発現型プラスミドが
作成できる。ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドとして、
好ましくはpTNF 401NN又はpTNF 401Aが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン
化； こうして得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドを適
当な制限酵素で切断し、ヒトTNF遺伝子内の特定な領域
を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴヌク
レオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手法を
用いることにより、ヒトTNF蛋白質中の任意のアミノ酸
を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、または欠失
させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする遺
伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にある。この
ような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはpTNF 616が用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトTNF遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌，枯草
菌，酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）］が好ましい。前記
ヒトTNF遺伝子発現型プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチド遺伝子発現型プラスミドは、たとえば公知の
方法［M.V.Norgardら,Gene,３,279（1978）］を用い
て、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリC 600r−
ｍ−株（ATCC 33525）に導入することができる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むM9倍地［T.Maniatisら編，
“Molecular Cloning",P 440,Cold Spring Harbor
Laboratory,New York（1982）参照］があげられ、必要
に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ま
しい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえ
ば振とうによる通気，攪拌を加えながら、37℃で２〜36
時間を行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離による組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を粉砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以
下、SDSと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。発現型プラスミドを含
まない微生物細胞のライゼートを対照として泳動パター
ンを比較することにより、ヒトTNF遺伝子または新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現を確認する。

このようにして得られたヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍
活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植し
たMeth A肉腫を壊死させる効果を見るin vivo活性測定
法（Carswellら，前出），マウスＬ細胞に対する細胞障
害性を見るin vitro活性測定法［Ruff,J.Immunol.,126,
235（1981）］等により行なえる。

ヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸
菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られて
いる蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトTNF蛋
白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラム・
クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒトTNF
蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を用いた
アフィニティー・カラム・クロマトグラフィーがとりわ
け好適である。こうして得られたヒトTNF蛋白質及び新
規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いることにより、
in vivo抗癌活性（前出）及び副作用に関する検討が可
能となる。

ヒトTNF蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副作
用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるin vitro
法，マウス等の実験動物に投与してその致死量や血圧の
降下程度等を測定するin vivo法等により行なうことが
できる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトTNF蛋白質と
は異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能に
なり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いることに
よって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供するこ
とが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトTNF遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトTNF遺伝子を設計した。
設計に際しては、Pennicaら［D.Pennicaら,Nature,312,
724（1984）］の報告したヒトTNF前駆体cDNAの構造遺伝
子部分の塩基配列を基盤として、適当な制限酵素による
切断部位を適当な位置に設け、５′側に翻訳開始コドン
（ATG）を、そして３′側に２個の翻訳終止コドン（TGA
及びTAA）をそれぞれ付与した。また、５′側翻訳開始
コドン上流には制限酵素Cl a Iによる切断部位を設け、
SD配列と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形での
プロモーターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳
終止コドン下流には制限酵素Hind IIIによる切断部位を
設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるように
した。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成） 実施例１で設計したヒトTNF遺伝子は、第２図に示した
ように17本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オ
リゴヌクレオチドの合成は全自動DNA合成機（アプライ
ド・バイオシステムズ，モデル380A）を用いて、ホスフ
ァイト法により行なった。合成オリゴヌクレオチドの精
製は、アプライド・バイオシステムズ社のマニュアルに
準じて行なった。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを
含むアンモニア水溶液を55℃で一晩保つことにより、DN
A塩基の保護基をはずし、セファデックスＧ−50ファイ
ン・ゲル（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、
高分子量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。つ
いで、7M尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度20％）の後、紫外線シャドウイング法により
泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバン
ド部分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を
細かく破砕した後、２〜5mlの溶出用バッファー［500mM
NH₄OAc−1mM EDTA−0.1％SDS（pH7.5）］を加え、37
℃で一晩振とうした。遠心分離により、目的のDNAを含
む水相の回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチ
ドを含む溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−5
0）にかけることにより、合成オリゴヌクレオチドの精
製品を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を繰り返し、合成ロリゴヌクレオチドの純
度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトTNF遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した17本の合成オリゴヌクレオチド（TN
F−１〜TNF−17）を用いて、ヒトTNF遺伝子を３つのブ
ロックに分けてクローン化した。

0.1〜1.0μｇの合成オリゴヌクレオチドTNF−２〜TNF−
６の５′末端側を、５〜15ユニットのT4−ポリヌクレオ
チドキナーゼ（E.coliBタイプ，宝酒造）を用いて、そ
れぞれ別々にリン酸化する。リン酸化反応は10〜20μ
の50mMTris−ＨCl（pH9.5）,10mM MgCl₂,5mMジチオス
レイトール,10mM ATP水溶液中で、37℃で,30分間行な
った。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド水
溶液をすべて混合し、フェノール抽出，エーテル抽出に
よりT4−ポリヌクレオチドキナーゼを失活，除去する。
この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに0.1〜1.0
μｇ合成オリゴヌクレオチドTNF−１及びTNF−７を加
え、90℃で５分間加熱した後室温まで徐冷して、アニー
リングを行なう。次に、これに減圧乾固した後に、30μ
の66mMTris−ＨCl（pH7.6）,6.6mM MgCl₂,10mMジチ
オスレイトール,1mM ATP水溶液に溶解させ、300ユニッ
トのT4−DNFリガーゼ（宝酒造）を加えて、11℃で15時
間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチジウム
ブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行なう。
目的とする大きさ（約220bp）のバンド部分を切出し
て、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミドゲルよ
りDNAを回収する。

一方、３μｇの大腸菌用プラスミドpBR 322（約4.4Kb
p）を30μの10mM Tris−ＨCl（pH7.5）,60mM NaCl,
7mM MgCl₂水溶液に溶解させ、10ユニットの制限酵素Cl
a I（ニューイングランド・バイオラブズ）を添加し
て、37℃で１時間切断反応を行なった。制限酵素Cl a I
による切断の後、フェノール抽出，エーテル抽出を行な
い、エタノール沈澱によりDNAを回収する。このDNAを30
μの50mM Tris−ＨCl（pH7.4）,100mM NaCl,10mM
MgSo₄水溶液に溶解させ、10ユニットの制限酵素Sil I
（宝酒造）を添加して、37℃で１時間切断反応を行なっ
た。反応終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.
8％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切
断パターンの観察を行なう。プラスミドpBR 322の大部
分を含む約3.7KbpのDNAの部分に相当するバンドを切出
し、そのアガロースゲル断片を３倍量（vol/wt）の8M
NaClO₄水溶液に溶解させた。Chenらのグラスフィルター
法［C.W.Chenら,Anal.Biochem,101,339（1980）］によ
り、約3.7KbpのDNA断片（Cl a ISal I）をアガロース
ゲルより回収した。

先に得られたヒトTNF遺伝子の一部を含む約220bpのDNA
断片について、前記の方法に準じて末端のリン酸化反応
を行なった後，プラスミドpBR322の大部分を含む約3.7K
bpのDNA水溶液と混合する。エタノール沈澱の後、前記
の方法に準じて両DNA断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリC600r−ｍ−株の形質転換は、通常
のCaCl₂法（M.V.Nargardらの方法）の改良法で行なっ
た。すなわち、5mlのＬ培地（１％トリプトン,0.5％酵
母エキス,0.5％NaCl,pH7.5）にエシェリヒア・コリC 60
0r−ｍ−株の18時間培養基を接種し、菌体を含む培養液
の600nmにおける濁度（OD₆₀₀）が0.3に達するまで生育
させる。菌体を冷たいマグネシウム・バッファー［0.1M
NaCl,5mM MgCl₂,5mM Tris−HCl（pH7.6,0℃）］中
で２回洗い、2mlの冷したカルシウム・バッファー［100
mM CaCl₂,250mM ＫCl,5mM MgCl₂,5mM Tris−ＨCl（p
H7.6,0℃）］中に再懸濁させ、０℃で25分間放置する。
次に菌体をこの容量の1/10にカルシウム・バッファーの
中で濃縮し、連結後のDNA水溶液と2:1（vol.:vol.）混
合する。この混合物を60分間,0℃で保った後、1mlのLBG
培地（１％トリプトン,0.5％酵母エキス,1％NaCl,0.08
％グルコース,pH7.2）を添加し、37℃で１時間振とう培
養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（シグマ）
30μg/mlを含むＬ培地プレート］に100μ／プレート
の割合で接種する。プレートを37℃で１晩培養して、形
質転換株を生育させる。得られたアンピシリン耐性のコ
ロニーより、公知の方法を用いてDNAを調製し、アガロ
ースゲル電気泳動により、目的のプラスミドpTNF1BR
（約4.0Kbp）の取得を確認した。第３図に、プラスミド
pTNF1BRの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドTNF
−８〜TNF−13を用いてプラスミドpTNF2N（約3.1Kbp）
を、合成オリゴヌクレオチドTNF−14〜TNF−17を用いて
プラスミドpTNF（約2.4Kbp）を、それぞれ作成した。第
４図及び第５図に、プラスミドpTNF2N及びpTNF3の作成
方法を、それぞれ示す。こうして得られたヒトTNF遺伝
子の一部を含むプラスミドpTNF1BR,pRNF2N及びpTNF3
の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計
通りであることは、マキサム・ギルバート法［A.M.Maxa
mら,Methods Enzymol.,65,499（1980）］によって確認
した。

実施例４（ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドpTNF1BR10μｇを実施例
３と同様にして制限酵素Cl a I及びSal Iで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、
実施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む
約220bpのDNA断片（Cl a ISal I）をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドpTNF2 10μｇを1
00μの10mM Tris−ＨCl（pH7.5）,60mM NaCl,7mM
MgCl₂水溶液に溶解させ、40ユニットの制限酵素Pvu II
（宝酒造）を添加し、37℃で１時間切断反応を行なっ
た。そして、実施例３の方法に準じて制限酵素Sal Iに
よる切断，ポアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の
一部を含む約170pbのDNA断片（Sal IPvu II）をポリ
アクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドpTNF3 10μｇも1
00μの10mM Tris−ＨCl（pH7.5）,60mM NaCl,7mM
MgCl₂水溶液に溶解させ、40ユニットの制限酵素Pvu II
及び40ユニットの制限酵素Hind III（宝酒造）を添加
し、37℃で１時間切断反応を行なった。そして、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施
例２の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約110
bpのDNA断片（Pvu IIHind III）をポリアクリルアミ
ドゲルより回収した。

一方、大腸菌trpプロモーターを有するプラスミドpYS31
N（約4.7Kbp）５μｇを、上記と同様に制限酵素Cl a I
及びHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度0.8％）の後、実施例３の方法に準じて、プラスミ
ドpYS31Nの大部分を含む約4.7KbpのDNA断片（Cl a IH
ind III）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約220b
p,約170bp及び約110bpの３つのDNA断片とプラスミドpYS
31Nの大部分を含む約4.7KbpのDNA断片とを混合し、エタ
ノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、T4−DNAリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリC 600r−ｍ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトTNF遺伝子発現
型プラスミドpTNF 401NN（約5.2Kbp）を有するクローン
を選択した。第６図に、そのプラスミドpTNF 401NNの作
成方法を示した。

また、上記プラスミドpYS3N5μｇを、上記の方法に準じ
て制限酵素Pvu Iで部分分解した後、さらに制限酵素Hin
d IIIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8
％）の後、実施例３の方法に準じて、trpプロモーター
を含む約2.7KbpのDNA断片［Pvu II（２）Hind III］
をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μｇにつ
いて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行な
い、アニーリングの後、先に得られた約2.7KbpのDNA断
片［Pvu II（２）Hind III］と混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、T4−DNAリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法
に準じてエシェルヒア・コリC600r−ｍ−株に導入し、
形質転換株の中より目的のプラスミドpAA41（約2.7Kb
p）を有するクローンを選択した。このようなプラスミ
ドは、プラスミドpYS31Nからコピー数制御領域を除去
し、trpプロモーター下流に存在するクローニング・サ
イトの下流に大腸菌trp Aターミネーターを付与した形
の、多コピー・高効率発現ベクターであり、第７図にそ
の作成方法を示した。

このプラスミドpAA41 ２μｇを、上記と同様に制限酵
素Cl a I及びHind IIIで切断し、アガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度0.8％）の後、実施例３の方法に準じて、
プラスミドpAA41の大部分を含む約2.7KbpのDNA断片（Cl
a IHind III）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTN
F 401NN5μｇを、上記と同様に制限酵素Cl a I及びHind
IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺
伝子全域を含む約490bpのDNA断片（Cl a IHind III）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドpAA41の大部分を含む約
2.7KbpのDNA断片とヒトTNF遺伝子全域を含む約490bpのD
NA断片とを混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方
法に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行なっ
た。反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒ
ア・コリ600r−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドpTNF 401A（約3.2Kbp）を有するクロー
ンを選択した。このプラスミドは、ヒトTNF遺伝子をよ
り効率良く発現させる能力を有しており、第８図にその
作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTN
F 401A20μｇを、実施例４の方法に準じて制限酵素Cl a
I及びHind IIIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）及びアガロースゲレス電気泳動
（ゲル濃度0.8％）の後、それぞれ実施例２及び３の方
法に準じて、生成する２つのDNA断片（約490bp及び約2.
7Kbp,両方共Cl a IHind III）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトTNF遺伝子全域を含む約490bpのDNA
断片を50μの10mM Tris−ＨCl（pH7.4）,10mM MgSO
₄,1mMジチオスレイトール水溶液に溶解させ、10ユニッ
トの制限酵素Hap II（宝酒造）を添加して、37℃で１時
間切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の
方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の大部分を含む約390bpの
DNA断片（Hap IIHind III）をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成，精製した。得ら
れた４本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μｇに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、T4−DNAリガーゼによる連結
反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約2.7KbpのDNA断片（Cl a IHind III）及
びヒトTNF遺伝子の大部分を含む約390bpのDNA断片（Hap
IIHind III）と混合し、エタノール沈澱の後、実施
例３の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリC 600r−ｍ−株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミドpTNF 471（約3.2Kbp）を有する
クローンを選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸
配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
la−Leu− （COOH） で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にMetが結合しているポリペプチドをコードする発現
型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した。

一方、上記で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミドp
TNF 471 20μｇを、実施例４の方法に準じて制限酵素H
ind IIIで切断した後、50mM Tris−ＨCl（pH7.4）,100
mM NaCl,10mM MgSO₄水溶液中で制限酵素Nco I（宝酒
造）による切断反応を37℃で１時間行なう。反応終了
後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.7％）及びポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行な
い、実施例２の方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を
含む約140bpのDNA断片（Nco IHind III）をポリアク
リルアミドゲルより、そして実施例３の方法に準じて、
pTNF 471の大部分を含む約3.0KbpのDNA断片（Nco IHi
nd III）をアガロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約140bpのDNA断片（Nco IHind
III）を50μの10mM Tris−ＨCl（pH7.4）,10mM MgS
O₄,1mMジチオスレイトール水溶液に溶解させ、10ユニッ
トの制限酵素Acc I（宝酒造）を添加して、37℃で１時
間切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度８％）を行ない、実施例２の
方法に準じて、ヒトTNF遺伝子の一部を含む約110bpのDN
A断片（Nco IAcc I）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

また、第10図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成，精製した。得ら
れた２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ0.5μｇに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約3.0KbpのDNA断片（Nco IHind II
I）及びヒトDNF遺伝子の一部含む約110bpのDNA断片（Nc
o IAcc I）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３
の方法に準じて、T4−DNAリガーゼによる連結反応を行
なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリ
ヒア・コリC 600r−ｍ−株に導入し、形質転換株の中よ
り目的のプラスミドpTNF 616（約3.2Kbp）を有するクロ
ーンを選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
la−Phe− （COOH） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードする
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドで
あり、第10図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られたヒトTNF遺伝子発現型プラスミ
ドpTNF 401A、実施例５で得られた発現型プラスミドpTN
F 471又は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドpTNF 616を有するエシェリヒア・コリC 600r−
ｍ−株を、30〜50μg/mlのアンピシリン,0.2％のグリコ
ール及び4mg/mlのカザミノ酸を含むM9培地［0.6％Na₂HP
O₄−0.3％K₂HPO₄−0.05％NaCl−0.1％NH₄Cl水溶液（pH
7.4）をオートクレーブ減菌した後に、別途にオートク
レーブ減菌したMgSO₄水溶液及びCaCl₂水溶液をそれぞれ
最終濃度2mM及び0.1mMになるように加える。］250mlに
接種し、OD₆₀₀が0.7に達するまで、37℃で振とう培養を
行なった。次いで、最終濃度50μg/mlの３−β−インド
ールアクリル酸を培養液中に添加し、さらに37℃で12時
間振とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、RBSバッファー
（150mM NaClを含む20mMリン酸バッファー,pH7.4）を
用いて菌体の洗浄を行なった。洗浄後の菌体を10mlのPB
Sバッファーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田,200M
型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Trsi−ＨCl
バッファー（pH6.8）,SDS,2−メルカプトエタノール，
グリセロールを、それぞれ最終濃度60mM,2％,4％,10％
になるように加え、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動［鈴木，遺伝，31,43（1977）］を行なった。分離
用ゲルは15％とし、泳動バッファーはSDS,Tris−グリシ
ン系［U.K.Laemmli,Nature,227,680（1970）］を用い
た。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシーブル
ー Ｒ−250（バイオ・ラッド）で染色し、ヒトTNF遺伝
子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認
を行なった。結果の一部を複写して、第11図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津,CS
−930型）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペプチ
ドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行なっ
た。その結果、ヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTNF 40
1Aを有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約19.4％
の発現型プラスミドpTNF 471を有する大腸菌においては
全細胞質蛋白質の約20.3％の新規抗腫瘍活性ポリヘプチ
ド遺伝子発現型プラスミドpTNF 616を有する大腸菌にお
いては同じく約24.4％の抗腫瘍活性ポリペプチドの産生
が、それぞれ認められた。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドのin vitro抗癌活性測定
は、前記Ruffの方法に準じて行なった。すなわち、実施
例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸
菌ライゼートを順次培地で希釈した試料100μと、４
×10⁵個/mlの濃度のマウスＬ−929繊維芽細胞（ATCC C
CL−929）懸濁液100μを、96穴の素子培養用マイクロ
プレート（コースター）内で混合した。なおこの際に、
最終濃度１μg/mlのアクチノマイシンＤ（コスメゲン，
萬有製薬）を添加しておく。培地としては、５％（vol/
vol）のウシ胎児血清を含むイーグルのミニウム・エッ
センシャル培地（日水製薬）を用いた。上記マイクロプ
レートを、５％炭酸ガスを含む空気中、37℃で18〜20時
間培養した後、クリスタル・バイオレット溶液［５％
（vol/vol）メタノール水溶液に、0.5％（wt/vol）のク
リスタル・バイオレットを溶解させたもの］を用いて生
細胞を染色した。余分なクリスタル・バイオレットを洗
い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレットを
100μの0.5％SDS水溶液で抽出し、その595nmにおける
吸光度をELISAアナライザー（東洋測器,ETY−96型）で
測定する。この吸光度は、生き残った細胞数に比例す
る。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド等を含む大腸菌ラ
イゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の50％の値
に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグラフ（たと
えば第11図）によって求め、その希釈倍率をユニットと
定義する。第12図より、発現型プラスミドpTNF 401Aに
コードされるヒトTNF蛋白質を含む大腸菌ライゼート100
μは7.6×10⁶ユニット程度の活性を、発現型プラスミ
ドpTNF 471にコードされる抗腫瘍活性ポリペプチドを含
む大腸菌ライゼート100μは約6.9×10⁷ユニット程度
の活性を、そして発現型プラスミドpTNF 616にコードさ
れる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
ト100μは約1.9×10⁸ユニット程度の活性を、それぞ
れ有していることが明らかになった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロテイン・アッセイ・キット（バイオ・
ラッド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。上記で得られた発現量，活性の値
及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の比
活性を計算したところ、表１のような値が得られた。表
１より、pTNF 616にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドはヒトTNF蛋白質の約18培の比活性を、そしてpTN
F 471にコードされる抗腫瘍活性ポリペプチドの約２培
の比活性有していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトTNF遺伝子の塩基配列を、第２図
は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を、
それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５図
は、ヒトTNF遺伝子の一部を有するプラスミドpTNF1BR,p
TNF2N及びpTNF3の作成方法を、それぞれ示したものであ
る。第６図はヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTNF 401N
Nの作成方法を、第７図は発現ベクターpAA41の作成方法
を、そして第８図はヒトTNF遺伝子発現型プラスミドpTN
F 401Aの作成方法を、それぞれ示したものである。第９
図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドpT
NF 471の作成方法を示したものである。第10図は新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドpTNF 616
の作成方法を示したものである。第11図はヒトTNF遺伝
子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結
果を示したものである。第12図はヒトTNF蛋白質及び新
規抗腫瘍活性ポリペプチドのin vitro抗癌活性測定結果
を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 北井 一男 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物工学研究所内 (72)発明者 福岡 政実 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物工学研究所内 (72)発明者 市川 弥太郎 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社生物工学研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Phe− （COOH）で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
2. 【請求項２】アミノ末端にMetが結合していることを特
   徴とする請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Phe− （COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードするD
   NA領域を含む組換えプラスミド。
4. 【請求項４】該DNA領域が次の塩基配列 （５′）−CGTAAGCGCAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTC
   AAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTGCTG
   GCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTACCATCAGAGGG
   CCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCGT
   CGACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTAC
   CAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCGATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGA
   GACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCATGGTATGAGCCCATCTATCTGG
   GAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAAATCAAT
   CGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGAT
   TATTGCCTTC−（３′） で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DNAとか
   ら成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする請求項３記載
   のプラスミド。
5. 【請求項５】該DNA領域が次の塩基配列 （５′）−CATCATAACGGTTCTGGCAAATATTCTGAAATGAGCTGTT
   GACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAG
   GGTATCGATAATGCGTAAGCGCAAGCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACC
   CTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCTG
   CTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTACCATCAGA
   GGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCC
   CGTCGACCCATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCC
   TACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGCGATCAAGAGCCCCTGCCAGAG
   GGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCATGGTATGAGCCCATCTATC
   TGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCTGAAATC
   AATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGG
   GATTATTGCCTTCTGATAAGCTT−（３′） で表わされる一本鎖DNAとそれに相補的な一本鎖DNAとか
   ら成る二本鎖DNAを含むことを特徴とする請求項３記載
   のプラスミド。
6. 【請求項６】該プラスミドがプラスミドpTNF 616である
   請求項３記載のプラスミド。
7. 【請求項７】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Phe− （COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にMetが結合しているポリペプチドをコードするD
   NA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換された組
   換え微生物細胞。
8. 【請求項８】該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Esch
   erichia coli）であることを特徴とする請求項７記載
   の微生物細胞。
9. 【請求項９】次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
   al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
   eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
   eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
   sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
   yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
   ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
   eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
   er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
   la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
   ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
   lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
   eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
   le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
   lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
   la−Phe− （COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にMetが結合しているポリペプトチドをコードす
   るDNA領域を含む組換えプラスミドにより形質転換され
   た組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活性
   ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から新
   規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする、
   新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. 【請求項１０】抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列 （H₂N）−Arg−Lys−Arg−Lys−Pro−Val−Ala−His−V
    al−Val−Ala−Asn−Pro−Gln−Ala−Glu−Gly−Gln−L
    eu−Gln−Trp−Leu−Asn−Arg−Arg−Ala−Asn−Ala−L
    eu−Leu−Ala−Asn−Gly−Val−Glu−Leu−Arg−Asp−A
    sn−Gln−Leu−Val−Val−Pro−Ser−Glu−Gly−Leu−T
    yr−Leu−Ile−Tyr−Ser−Gln−Val−Leu−Phe−Lys−G
    ly−Gln−Gly−Cys−Pro−Ser−Thr−His−Val−Leu−L
    eu−Thr−His−Thr−Ile−Ser−Arg−Ile−Ala−Val−S
    er−Tyr−Gln−Thr−Lys−Val−Asn−Leu−Leu−Ser−A
    la−Ile−Lys−Ser−Pro−Cys−Gln−Arg−Glu−Thr−P
    ro−Glu−Gly−Ala−Glu−Ala−Lys−Pro−Trp−Tyr−G
    lu−Pro−Ile−Tyr−Leu−Gly−Gly−Val−Phe−Gln−L
    eu−Glu−Lys−Gly−Asp−Arg−Leu−Ser−Ala−Glu−I
    le−Asn−Arg−Pro−Asp−Tyr−Leu−Asp−Phe−Ala−G
    lu−Ser−Gly−Gln−Val−Tyr−Phe−Gly−Ile−Ile−A
    la−Phe− （COOH） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にMetが結合しているポリペプチドを含有する医
    薬組成物。