JPH04327599A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は新規生理活性ポリペプチ
ド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換
えプラスミド、該プラスミドによって形質転換された組
換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新規生理活性
ポリペプチドの製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫
瘍活性を有する新規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活
性ポリペプチドと略することもある）、該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プ
ラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び
該微生物細胞を用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製
造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）などで
前もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与し
た後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫によ
る癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し
、この物質を腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓ
ｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づけた［Ｅ．Ａ．　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、Ｐ
ｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｅａｄ．　Ｓｃｉ．，　ＵＳ
Ａ，　７２，　３６６６　（１９７５）］。このＴＮＦ
はマウス、ウサギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍
細胞に特異的に、しかも種を越えて働くことから、制癌
剤としての利用が期待されてきた。 【０００３】最近になって、Ｐｅｎｎｉｃａ　らは、ヒ
トＴＮＦのｃＤＮＡクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ
蛋白質の一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけ
るヒトＴＮＦ遺伝子の発現について報告した［Ｄ．Ｐｅ
ｎｎｉｃａら、Ｎａｔｕｒｅ，　３１２，　７２４　（
１９８４）　］。その後、白井ら［Ｔ．Ｓｈｉｒａｉら
、Ｎａｔｕｒｅ，　３１３，　８０３（１９８５）　］
、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、１２，　１６０　（
１９８５）］、Ｗａｎｇら［Ａ．　Ｍ．　Ｗａｎｇら、
Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２２８，　１４９（１９８５）］及
びＭａｒｍｅｎｏｕｔ　ら［Ａ．　Ｍａｒｍｅｎｏｕｔ
ら、Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１５２，　
５１５　（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸
菌における発現について相ついで報告している。 【０００４】このように遺伝し操作技術を用いることに
よって、純粋なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるよ
うになるに及び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理
活性が明らかになりつつある。たとえば、癌末期や重症
感染症患者に見られる悪液質を引き起こす原因の一つで
あるカケクチンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ．　
Ｂｅｕｌｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，　３１６，　５５２
（１９８５）　］、カケクチンがリポプロテイン・リバ
ーゼ阻害活性を有することから、ＴＮＦの投与により血
中のトリグリセリド量が増大し、その結果として高脂血
症のような副作用を引き起こす可能性のあることが示唆
された。また、それ以外にも、血管内皮細胞への影響［
Ｊ．　Ｒ．　Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．
，　１６２，　２１６３　（１９８５）］、骨吸収作用
［Ｄ．　Ｒ．　Ｂｅｌｔｏｌｉｎｉ　ら、Ｎａｔｕｒｅ
，　３１９，　５１６　（１９８６）　］等が報告され
ている。 【０００５】一方、近年の遺伝し操作技術の進歩は、蛋
白質中の任意のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、
付加したり、または欠失せることを可能にした。このよ
うにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特定の目
的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数多く成
されている。 【０００６】ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつ
かの研究が成されており、特開平２−１６３０９４号公
報の第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸配列にお
いて、Ｃｙｓ６９及びＣｙｓ１０１　のいずれかまたは
両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣ
Ｔ出願公開ＷＯ８６／０４６０６号、特願昭６１−１０
６７７２号）、Ｇｌｙ１２２　の他のアミノ酸残基への
置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３
８０４８号）、Ａｌａ１８の他のアミノ酸残基への置換
（特願昭６１−２３３３３７号）が報告されている。ま
た、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失についても、６
アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（
特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが
細胞障害活性を有していること（特願昭６１−９００８
７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦに
おいて極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ８６／０２
３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特願昭６１−１１４７５４号）、１１
アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（
特願昭６１−１７３８２２号）、及び７アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦを基盤として、Ｐｒｏ８　Ｓｅｒ９　Ａｓｐ１０を
ＡｒｇＬｙｓＡｒｇへ置換を行なうと、その比活性が大
きく上昇することが報告されている。 【０００７】そこで、本発明者らは比活性の向上、安定
性の向上、反応スペクトルの広域化、副作用の低減化等
を目的として、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研
究を行ない、本発明を完成するに至った。 【０００８】 【発明の目的】本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを提供することにある。 【０００９】本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミ
ドを提供することにある。 【００１０】本発明の更に他の目的は、上記組換えプラ
スミドによって形質転換された組換え微生物及びその組
換え微生物細胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを
製造する方法を提供することにある。 【００１１】本発明の更に他の目的は、以下の説明から
一層明らかとなるであろう。 【００１２】 【発明の構成】本発明者らの研究によれば、前記本発明
の目的は、特開平２−１６３０９４号公報の第１図に示
されるヒトＴＮＦのアミノ酸配列においてアミノ末端の
７個のアミノ酸を欠失させ、８〜１０番目のＰｒｏＳｅ
ｒＡｓｐをＡｒｇＬｙｓＡｒｇに置換し、１５６番目の
ＡｌａをＰｈｅに置換し、１２９番目のＧｌｙをＳｅｒ
に置換した新規生理活性ポリペプチド（配列番号１で示
される）、または特開平２−１６３０９４号公報の第１
図に示されるヒトＴＮＦのアミノ酸配列においてアミノ
末端の７個のアミノ酸を欠失させ、８〜１０番目のＰｒ
ｏＳｅｒＡｓｐをＡｒｇＬｙｓＡｒｇに置換し、１５６
　番目のＡｌａをＰｈｅに置換し、１３１番目のＡｒｇ
をＬｅｕに置換した新規生理活性ポリペプチド（配列番
号２で示される）により達成される。具体的な配列を示
すと、配列表の配列番号１または配列番号２で表わされ
る新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭ
ｅｔが結合しているポリペプチドによって達成される。 【００１３】また本発明は、上記新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド（配列番号１，２またはそれらのアミノ末端にＭ
ｅｔが結合している）をコードするＤＮＡ領域を含む組
換えプラスミドを包含する。具体的にはｐＴＮＦ６４８
、６５１を包含する。 【００１４】更にかくして得られた組換えプラスミドに
よって形質転換された組換え微生物細胞を包含する。微
生物細胞としてはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）が好適である。その微生物細胞を
用いて目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生す
る方法を包含する。具体的には配列番号１または２で表
わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換された
組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活性ポ
リペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から新規
生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする、新
規生理活性ポリペプチドの製造方法を包含する。 【００１５】さらに本発明は、新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含有する医薬組成物を包含する。 【００１６】以下本発明について更に詳細に説明する。 （Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ．　Ｐ
ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝し改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコー
ドするＤＮＡ領域は、その上流に読みとりフレームを一
致させた形での翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を有すること
が好ましく、その下流方向に読みとりフレームを一致さ
せた形での翻訳終止コドン（ＴＧＡ，ＴＡＧまたはＴＡ
Ａ）を有することが好ましい。上記翻訳終止コドンは、
発現効率の向上を目的として、２つ以上タンデムに連絡
することがとりわけ好ましい。更に、このヒトＴＮＦ遺
伝子は、その上流及び下流に作用する制限酵素の切断部
位を用いることにより、適当なベクターへのクローン化
が可能になる。このようなヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列
の例は、特開平２−１６３０９４号公報の第１図に示さ
れている。 【００１７】上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の
取得は、上側の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たと
えば特開平２−１６３０９４号公報の第２図に示される
何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、それらを化学合
成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結する方法をとる
のが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合成法としては
ジエステル法［Ｈ．　Ｇ．　Ｋｈｏｒａｎａ，　”Ｓｏ
ｍｅ　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ
　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆＰｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｅｓ
ｔｅｒｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅ
ｓｔ”，　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，
　Ｉｎｃ．，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９６１）　］、
トリエステル法［Ｒ．　Ｌ．　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ　ら
、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．，８９，　４８
０１　（１９６７）］及びホスファイト法［Ｍ．　Ｄ．
　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　
Ｌｅｔｔ．，　２１，　７１９　（１９８０）　］があ
るが、合成時間、収率、操作の簡便さ等の点から、全自
動ＤＮＡ合成機を用いたホスファイト法による合成が好
ましい。合成したオリゴヌクレオチドの精製は、ゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、逆
相カラムによる高速液体クロマトグラフィー等を、適宜
単独もしくは組合せて用いることができる。 【００１８】こうして得られた合成オリゴヌクレオチド
の５’　末端側の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼを用いてリン酸化した後、アニーリング
させ、たとえばＴ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する
。 合成オリゴヌクレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を
作成する方法としては、合成オリゴヌクレオチドをいく
つかのブロックに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２
［Ｆ．　Ｂｏｌｉｖｅｒら、Ｇｅｎｅ，　２，　９５　
（１９７７）］のようなベクターに一度クローン化した
後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が
好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロ
ックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは
ｐＴＮＦ１ＢＲ（特開平２−１６３０９４号公報の第３
図に記載）、ｐＴＮＦ２Ｎ（同公報第４図に記載）また
はｐＴＮＦ３（同公報第５図に記載）が用いられる。 【００１９】上記のようにしてクローン化したヒトＴＮ
Ｆ遺伝子を構成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した
後、適当なプロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ
）配列の下流につなぐことにより、発現型遺伝子とする
ことができる。使用可能なプロモーターとして、トリプ
トファン・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモータ
ー）、ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプ
ロモーター）、ｔａｃプロモーター、ＰＬ　プロモータ
ー、ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔ
ｒｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを
有するプラスミドとして、好ましくはｐＹＳ３１Ｎまた
はｐＡＡ４１（両者とも特開平２−１６３０９４号公報
に記載）が用いられる。さらに、発現効率向上を目的と
して、ヒトＴＮＦ遺伝子下流に大腸菌で効率よく機能す
るターミネーターを付与することができる。このような
ターミネーターとして、ｌｐｐターミネーター、ｔｒｐ
ターミネーター等があげられるが、とりわけｔｒｐＡタ
ーミネーターが好適であり、ｔｒｐＡターミネーターを
有するプラスミドとして、好ましくはｐＡＡ４１が用い
られる。この発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｐＢ
Ｒ３２２由来のベクターにクローン化することにより、
発現型プラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮま
たはｐＴＮＦ４０１Ａ（両者とも特開平２−１６３０９
４号公報第８図に記載）が用いられる。 （Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
を適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定
な領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ６４８または
ｐＴＮＦ６５１が用いられる。 （Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子を発現させるための微
生物宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母等があげられ
るが、とりわけ大腸菌［エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）　］が好ましい。前記ヒトＴ
ＮＦ遺伝子発現型プラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド遺伝子発現型プラスミドは、たとえば公知の方法
［Ｍ．　Ｖ．　Ｎｏｒｇａｒｄ　ら、Ｇｅｎｅ，　３，
　２７９　（１９７８）　］を用いて、微生物宿主、た
とえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株（ＡＴＣ
Ｃ３３５５２５）に導入することができる。 【００２０】このようにして得られた組換え微生物細胞
を、それ自体は公知の方法で培養する。培地としては、
たとえばグルコースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ．
　Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら編、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ”，　Ｐ４４０，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　ＮｅｗＹ
ｏｒｋ　（１９８２）　参照］があげられ、必要に応じ
て、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ましい。 培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば振盪
による通気、攪拌を加えながら、３７℃で２〜３６時間
行なう。また、培養開始時または培養中にプロモーター
を効率よく機能させる目的で、３−β−インドールアク
リル酸等の薬剤を加えることもできる。 【００２１】培養後、たとえば遠心分離により組換え微
生物細胞を集め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ
、たとえば超音波処理により組換え微生物細胞を粉砕し
、遠心分離により組換え微生物細胞のライゼートを得る
。得られたライゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナト
リウム（以下、ＳＤＳと略することもある）を含むポリ
アクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、
ゲル中の蛋白質を適当な方法を用いて染色する。発現型
プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを対照と
して泳動パターンを比較することにより、ヒトＴＮＦ遺
伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現を
確認する。 【００２２】このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質
及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、
マウスに移植したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見
るｉｎ　　ｖｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、
前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ｖｉｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ，　Ｊ．　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．，　１２６，　２３５　（１９８１）］等によ
り行なえる。 【００２３】ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの大腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知
の通常知られている蛋白質の分離・精製法に従えばよい
が、ヒトＴＮＦ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニ
ティー・カラム・クロマトグラフィーが有利である。な
かでも、ヒトＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクロ
ーナル抗体を用いたアフィニティー・カラム・クロマト
グラフィーがとりわけ好適である。こうして得られたヒ
トＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品
を用いることにより、ｉｎ　　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出
）及び副作用に関する検討が可能となる。 【００２４】ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの副作用の評価は、カケクチン活性測定に代表
されるｉｎ　　ｖｉｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投
与してその致死量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　
　ｖｉｖｏ法等により行なうことができる。 【００２５】かくして本発明によれば、従来公知のヒト
ＴＮＦ蛋白質とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得
ることが可能になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチド
を用いることによって抗腫瘍のための優れた医薬組成物
を提供することが可能になった。 【００２６】 【実施例】以下、実施例を掲げて本発明について詳細に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。本実施例においてｐＴＮＦ６１９を作成するま
での手順は特開平２−１６３０９４号公報の実施例に記
載の手順に従った。 【００２７】 【実施例１】 実験１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 特開平２−１６３０９４号公報の第１図に示される塩基
配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した。設計に際しては、
Ｐｅｎｎｉｃａ　ら［Ｄ．　Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｎａｔ
ｕｒｅ，　３１２，　７２４（１９８４）　］の報告し
たヒトＴＮＦ前駆体ｃＤＮＡの構造遺伝子部分の塩基配
列を基盤として、適当な制限酵素による切断部位を適当
な位置に設け、５’　側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を
、謗れ３’　側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴ
ＡＡ）をそれぞれ付与した。また、５’　側翻訳開始コ
ドン上流には制限酵素ＣｌａＩによる切断部位を設け、
ＳＤ配列と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形で
のプロモーターとの連結を可能にした。さらに、３’　
側翻訳終止コドン下流には制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩに
よる切断部位を設け、ベクター・プラスミドと容易に連
結できるようにした。 【００２８】実験２（オリゴヌクレオチドの化学合成）
実験１で設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、特開平２−１６
３０９４号公報の第２図に示したように１７本のオリゴ
ヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌクレオチドの
合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・バイオシステ
ムズ、モデル３８０Ａ）を用いて、ホスファイト法によ
り行なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプラ
イド・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なっ
た。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニ
ア水溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の
保護基をはずし、セファデックスＧ−５０ファイン・ゲ
ル（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子
量の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、
７Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度２０％）の後、紫外線シャドウイング法により泳動
パターンの視察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破断した後、２〜５ｍｌの溶出ようバッファー［５０
０ｍＭ　　ＮＨ４　ＯＡｃ−１ｍＭ　　ＥＤＴＡ−０．
１％ＳＤＳ（ｐＨ７．５）］を加え、３７℃で一晩振盪
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。 なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をは
かった。 【００２９】実験３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクロ
ーン化） 実験２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（Ｔ
ＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７、特開平２−１６３０９４号公
報の第２図に記載）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝子を３つ
のブロックに分けてクローン化した。 【００３０】０．１〜１．０μｇの合成オリゴヌクレオ
チドＴＮＦ−２〜ＴＮＦ−６（特開平２−１６３０９４
号公報の第２図に記載）の５’　末端側を、５〜１５ユ
ニットのＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ．　ｃｏ
ｌｉ　Ｂタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々にリ
ン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μｌの５０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ２　、５ｍＭジチオスレイト々ル、１０ｍＭ　　
ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応
終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべ
て混合し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−
ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。この合成
オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜１．０μ
ｇの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１（特開平２−１
６３０９４号公報第２図に記載）及びＴＮＦ−７（同公
報第２図に記載）を加え、９０℃で５分間加熱した後室
温まで徐冷して、アニーリングを行なう。次に、これを
減圧乾固した後に、３０μｌの６６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、
１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　　ＡＴＰ水溶液
に溶解させ、３００ユニットのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法に
より泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ（
約２２０ｂｐ）のバンド部分を切出して、実験２の方法
に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する
。 【００３１】一方、３μｇの大腸菌用プラスミドｐＢＲ
３２２（約４．４Ｋｂｐ）を３０μｌの１０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ　　ＮａＣｌ
、７ｍＭＭｇＣｌ２　水溶液に溶解させ、１０ユニット
の制限酵素ＣｌａＩ（ニューイングランド・バイオラブ
ズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。 制限酵素ＣｌａＩによる切断の後、フェノール抽出、エ
ーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを回
収する。このＤＮＡを３０μｌの５０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ　　ＮａＣｌ、１
０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４　水溶液に溶解させ、１０ユニッ
トの制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造）を添加して、３７℃で
１時間切断反応を行なった。反応終了後、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行ない、エチジウム
ブロマイド染色法により切断パターンの観察を行なう。 プラスミドｐＢＲ３２２の大部分を含む約３．７Ｋｂｐ
のＤＮＡの部分に相当するバンドを切出し、そのアガロ
ースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ／ｗｔ）の８Ｍ　　Ｎａ
ＣｌＯ４　水溶液に溶解させた。Ｃｈｅｎらのグラスフ
ィルター法［Ｃ．　Ｗ．　Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌ．　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．　１０１，　３３９　（１９８０）］　
により、約３．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（ＣｌａＩ−Ｓａ
ｌＩ）をアガロースゲルより回収した。 【００３２】先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含
む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準
じて末端のリン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢ
Ｒ３２２の大部分を含む約３。７ＫｂｐのＤＮＡ水溶液
と混合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて
両ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。 【００３３】エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株の
形質転換は、通常のＣａＣｌ２　法（Ｍ．　Ｖ．　Ｎｏ
ｒｇａｒｄ　らの方法）の改良法で行なった。すなわち
、５ｍｌのＬ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）にエシェリヒア・
コリＣ６００ｒ−ｍ−株の１８時間培養基を接種し、菌
体を含む培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ６００
　）が０．３に達するまで成育させる。菌体を冷たいマ
グネシウム・バッファー［０．１Ｍ　　ＮａＣｌ、５ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２　、５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．６、０℃）］中で２回洗い、２ｍｌの冷やしたカ
ルシウム・バッファー［１００ｍＭ　　ＣａＣｌ２　、
２５０ｍＭ　　ＫＣｌ、５ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、５ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６、０℃）］中に再
懸濁させ、０℃で２５分間放置する。次に菌体をこの容
量の１／１０にカルシウム・バッファーの中で濃縮し、
連結後のＤＮＡ水溶液と２：１（ｖｏｌ．：ｖｏｌ．）
混合する。この混合物を６０分間、０℃で保った後、１
ｍｌのＬＢＧ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキ
ス、１％ＮａＣｌ、０．０８％グルコース、ｐＨ７．２
）を添加し、３７℃で１時間振盪培養する。培養液を、
選択培地［アンピシリン（シグマ）３０μｇ／ｍｌを含
むＬ培地プレート］に１００μｌ／プレートの割合で接
種する。プレートを３７℃で１晩培養して、形質転換株
を成育させる。得られたアンピシリン耐性のコロニーよ
り、公知の方法を用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲ
ル電気泳動により、目的のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（
約４．０Ｋｂｐ）の取得を確認した。 特開平２−１６３０９４号公報の第３図に従い、プラス
ミドｐＴＮＦ１ＢＲを作成した。 【００３４】以上と同様な手法により、合成オリゴヌク
レオチドＴＮＦ−８〜ＴＮＦ−１３（特開平２−１６３
０９４号公報の第２図に記載）を用いてプラスミドｐＴ
ＮＦ２Ｎ（約３．１Ｋｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチ
ドＴＮＦ−１４〜ＴＮＦ−１７（特開平２−１６３０９
４号公報の第２図に記載）を用いてプラスミドｐＴＮＦ
３（約２．４Ｋｂｐ）を、それぞれ作成した。特開平２
−１６３０９４号公報の第４図及び第５図に従いプラス
ミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３を作成した。こうして
得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲ、ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、合成オリ
ゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通りであるこ
とは、マキサム・ギルバート法［Ａ．　Ｍ．　Ｍａｘａ
ｎ　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　６５，
　４９９　（１９８０）］によって確認した。 【００３５】実験４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドの作成） 実験３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μｇを
、実験３と同様にして制限酵素ＣｌａＩ及びＳａｌＩで
切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）の後、実験２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の
一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｌａＩ−Ｓａ
ｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した。 【００３６】次に、実験３で得られたプラスミドｐＴＮ
Ｆ２１０μｇを１００μｌの１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ　　ＮａＣｌ、７ｍＭＭ
ｇＣｌ２　水溶液に溶解させ、４０ユニットの制限酵素
ＰｖｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反
応を行なった。そして、実験３の方法に準じて制限酵素
ＳａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度５％）の後、実験２の方法に準じて、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｓ
ａｌ−ＰｖｕＩＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収
した。 【００３７】また、実験３で得られたプラスミドｐＴＮ
Ｆ３　　１０μｇも１００μｌの１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭ　　ＮａＣｌ、７ｍ
Ｍ　　ＭｇＣｌ２　水溶液に溶解させ、４０ユニットの
制限酵素ＰｖｕＩＩ及び４０ユニットの制限酵素Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反
応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ゲル濃度５％）の後、実験２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（
ＰｖｕＩＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。 【００３８】一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有する
プラスミドｐＹＳ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）５μｇを、
上記と同様に制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで
切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）
の後、実験３の方法に準じて、プラスミドｐＹＳ３１Ｎ
の大部分を含む約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（ＣｌａＩ
−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）をアガロースゲルより回収した。 【００３９】こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一
部を含む約２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐ
の３つのＤＮＡ断片とプラスミドｐＨＳ３１Ｎの大部分
を含む約４．７ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実験３の方法に準じて、Ｔ４−ＮＤＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実験３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋｂｐ）
を有するクローンを選択した。特開平２−１６３０９４
号公報の第６図に、そのプラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ
の作成方法が示されている。 【００４０】また、上記プラスミドｐＹＳ３１Ｎ　　５
μｇを、上記の方法に準じて制限酵素ＰｖｕＩＩで部分
分解した後、さらに制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
実験３の方法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２
．７ＫｂｐのＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２）−Ｈｉｎｄ
　ＩＩＩ］をアガロースゲルより回収した。 【００４１】次に、特開平２−１６３０９４号公報の第
７図に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、
実験２の方法に準じて、合成・精製した。得られた２本
の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μｇについて
、実験３の方法に準じて、末端のリン酸化を行ない、ア
ニーリングの後、先に得られた約２．７ＫｂｐのＤＮＡ
断片［ＰｖｕＩＩ（２）−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ］と混合し
、エタノール沈澱の後、実験３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後
、実験３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミ
ドｐＡＡ４１（約２．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選
択した。このようなプラスミドは、プラスミドｐＹＳ３
１Ｎからコピー数制御領域を除去し、ｔｒｐプロモータ
ー下流に存在するクローニング・サイトの下流に大腸菌
ｔｒｐＡターミネーターを付与した形の、多コピー・高
効率発現ベクターであり、特開平２−１６３０９４号公
報の第７図にその作成方法が示してある。 【００４２】このこのプラスミドｐＡＡ４１　　２μｇ
を、上記と同様に制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩ
Ｉで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８
％）の後、実験３の方法に準じて、プラスミドｐＡＡ４
１の大部分を含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｌａ
Ｉ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）をアガロースゲルより回収した
。 【００４３】また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ５μｇを、上記と同様
に制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、
実験２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約
４９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｌａＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。 【００４４】こうして得られた、プラスミドｐＡＡ４１
の大部分を含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮ
Ｆ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合
し、エタノール沈澱の後、実験３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了
後、実験３の方法に準じて、エシェリヒア・コリ６００
ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目的のプラス
ミドｐＴＮＦ４０１Ａ（約３．２Ｋｂｐ）を有するクロ
ーンを選択した。このプラスミドは、ヒトＴＮＦ遺伝子
をより効率よく発現させる能力を有しており、特開平２
−１６３０９４号公報第８図にその作成方法が開示され
ている。 【００４５】実験５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子発現プラスミドの作成） 実験４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ４０１Ａ　　２０μｇを、実験４の方法に準じて
制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、それぞ
れ実験２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮＡ
断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋｂｐ、両方共Ｃａｌ
Ｉ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）をゲルより回収した。 【００４６】ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含
む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片を５０μｌの１０ｍＭ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ　　ＭｇＳ
Ｏ４　、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、
１０ユニットの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行
ない、実験２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部
分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＨａｐＩＩ−Ｈｉ
ｎｄ　ＩＩＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。 【００４７】また、特開平２−１６３０９４号公報の第
９図のＡ記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを
、実験２の方法に準じて、合成、精製した。得られた４
本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μｇについ
て、実験３の方法に準じて、末端のリン酸を行ない、ア
ニーリングの後、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応
を行なった。 【００４８】反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレ
オチドを、先に得られた約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（
ＣｌａＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）及びヒトＴＮＦ遺伝子の
大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（ＨａｐＩＩ−
Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）と混合し、エタノール沈澱の後、実
験３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結
反応を行なった。反応終了後、実験３の方法に準じてエ
シェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転
換体の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ４７１（約３．
２Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミ
ドは、特開平２−１６３０９４号公報の第１図記載のヒ
トＴＮＦアミノ酸配列においてアミノ末端の７個のアミ
ノ酸が欠失し、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（８〜１０番目
）がＡｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに置換されたポリペプチド
をコードするＤＮＡを含むプラスミドである。特開平２
−１６３０９４号公報の第９図にその作成方法が示され
ている。 【００４９】一方、上記で得られた発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ４７１　　２０μｇを、実験４の方法に準じて制
限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩで切断した後、５０ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１００ｍＭ　　ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４　水溶液中で制限酵素Ｎｃ
ｏＩ（宝酒造）による切断反応を３７℃で１時間行なう
。反応終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．
７％）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）を行ない、実験２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ
−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）をポリアクリルアミドゲルより、
そして実験３の方法に準じて、ｐＴＮＦ４７１の大部分
を含む約３．０ＫｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ−Ｈｉｎ
ｄ　ＩＩＩ）をアガロースゲルより、それぞれ回収した
。 【００５０】さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮ
Ａ断片（ＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）を５０μｌの１
０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ
　　ＭｇＳＯ４　、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に
溶解させ、１０ユニットの制限酵素ＡｃｃＩ（宝酒造）
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度８
％）を行ない、実験２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝
子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ−
ＡｃｃＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した。 【００５１】また、特開平２−１６３０９４号公報の第
１０図のＡ記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実験２の方法に準じて、合成、精製した。得られた
２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μｇにつ
いて、実験３の方法に準じて、末端のリン酸化を行ない
、アニーリングを行なった。 【００５２】アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴ
ヌクレオチドを、先に得られた約３．０ＫｂｐのＤＮＡ
断片（ＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ）及びヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ
−ＡｃｃＩ）と混合し、エタノール沈澱の後、実験３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実験３の方法に準じてシェリヒ
ア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中
より目的のプラスミドｐＴＮＦ６１９（約３．２Ｋｂｐ
）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、特
開平２−１６３０９４号公報の第１図記載のヒトＴＮＦ
アミノ酸配列においてアミノ末端の７個のアミノ酸が欠
失し、Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ（８〜１０番目）がＡｒ
ｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに置換され、さらに１５６番目のＡ
ｌａがＰｈｅに置換された抗腫瘍性ポリペプチドまたは
そのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを
コードする抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドであり、特開平２−１６３０９４号公報の第１０図
にその作成方法が示してある。 【００５３】次に、上記で得られた発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ６１９、２０μｇを、上記の方法に準じて、制限
酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及びＮｃｏＩで切断した。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．７％）及
びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を
行ない、実験３の方法に準じて、ｐＴＮＦ６１９の大部
分を含む約３．０ＫｂｐのＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ　ＩＩ
Ｉ−ＮｃｏＩ）をアガロースゲルより、そして実験２の
方法に準じてヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１４０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−ＮｃｏＩ）をポリ
アクリル電気泳動により回収した。 【００５４】さらに、上記で得られた約１４０ｂｐのＤ
ＮＡ断片（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−ＮｃｏＩ）を５０μｌの
１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍ
Ｍ　　ＭｇＳＯ４　、１ｍＭジチオスレイトール水溶液
に溶解させ、１０ユニットの制限酵素ＨａｅＩＩ（宝酒
造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。 反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない
、実験２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含
む約８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ−ＨａｅＩＩ）を
ポリアクリルアミドゲルより回収した。 【００５５】また、配列表の配列番号３，４に記載の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを、実験２の方法に
準じて、合成、精製した。得られた２本の合成オリゴヌ
クレオチドそれぞれ０．５μｇについて、実験３の方法
に準じて、末端のリン酸化を行ない、アニーリングを行
なった。 【００５６】アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴ
ヌクレオチドを、先に得られた約３．０ＫｂｐのＤＮＡ
断片（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−ＮｃｏＩ）及びヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約８０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ−
ＨａｅＩＩ）と混合し、エタノール沈澱の後、実験３の
方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を
行なった。反応終了後、実験３の方法に準じてエシェリ
ヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミドｐＴＮＦ６４８（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で表わされる
新規高腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅ
ｔが結合しているポリペプチドをコードする新規抗腫瘍
活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、図１
にその作成方法を示した。 【００５７】また、配列表の配列番号３，４記載の塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドのかわりに、配列表の
配列番号５，６記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを用いて、上記と同じ手法を用いることにより、プ
ラスミドｐＴＮＦ６５１を作成した。このプラスミドは
、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表わされ
る抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末端にＭｅｔ
が結合しているポリペプチドをコードする発現型プラス
ミドである。 【００５８】 【実施例２】 （発現の確認）前記実験４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ、実験５で得られた
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ６４８またはｐＴＮＦ６５１を有するエシェリヒ
ア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株を、３０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン、０．２％のグルコース及び４ｍｇ／ｍｌのカ
ザミノ酸を含むＭ９培地［０．６％Ｎａ２　ＨＰＯ４　
−０．３％Ｋ２　ＨＰＯ４　−０．０５％ＮａＣｌ−０
．１％ＮＨ４　Ｃｌ水溶液（ｐＨ７．４）をオートクレ
ーブ滅菌した後に、別途オートクレーブ滅菌したＭｇＳ
Ｏ４　水溶液及びＣａＣｌ２　水溶液をそれぞれ最終濃
度２ｍＭ及び０．１ｍＭになるように加える。］２００
ｍｌに接種し、ＯＤ６００　が０．７に達するまで、３
７℃で振盪培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ
／ｍｌの３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添
加し、さらに３７℃で１２時間振盪培養を続けた。 【００５９】遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、Ｐ
ＢＳバッファー（１５０ｍＭ　　ＮａＣｌを含む２０ｍ
Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０ｍｌのＰＢＳバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、２００Ｍ型）
を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の
除去を行なった。 【００６０】得られた大腸菌ライゼートの一部に対して
、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ６．８）、ＳＤＳ
、２−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞ
れ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように
加え、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木
、遺伝、３１，　４３　（１９７７）　］を行なった。 分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ、Ｔ
ｒｉｓ−グリシン系［Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎ
ａｔｕｒｅ，　２２７，　６８０　（１９７０）］を用
いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシーブ
ルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現
の確認を行なった。結果の一部を複写して、図２に示し
た。 【００６１】なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナ
ー（島津、ＣＳ−９３０型）にかけて、産生された抗腫
瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割
合の算出を行なった。その結果、ヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａを有する大腸菌において
は全細胞質蛋白質の約１０．１％の、発現型プラスミド
ｐＴＮＦ６４８を有する大腸菌においては全細胞質蛋白
質の約３．７％の、発現型プラスミドｐＴＮＦ６５１を
有する大腸菌においては同じく約６．０％の抗腫瘍活性
ポリペプチドの産生が、それぞれ認められた。 【００６２】 【実施例３】 （活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　　
ｖｉｔｒｏ抗癌活性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じ
て行なった。すなわち、実施例２で得られた新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で
希釈した試料１００μｌと、４×１０５　個／ｍｌの濃
度のマウスＬ−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣ　　ＣＣＬ
−９２９）懸濁液１００μｌを、９６穴の組織培養用マ
イクロプレート（コースター）内で混合した。なおこの
際に、最終濃度１μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ（コ
スメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培地としては、
５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清を含むイーグル
のミニマム・エッセンシャル培地（日水製薬）を用いた
。上記マイクロプレートを、５％炭酸ガスを含む空気中
、３７℃で１８〜２０時間培養した後、クリスタル・バ
イオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）メタノール水
溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のクリスタル・バイ
オレットを溶解させたもの］を用いて生細胞を染色した
。余分なクリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥した
後、残ったクリスタル・バイオレットを１００μｌの０
．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎｍにおける
吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋側器、ＥＴＹ−
９６型）で測定する。この吸光度は、生き残った細胞数
に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド等を含む
大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の
５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグ
ラフ（たとえば図３）によって求め、その希釈倍率をユ
ニットと定義する。図３より、発現型プラスミドｐＴＮ
Ｆ４０１ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸
菌ライゼート１００μｌは７．８×１０５　ユニット程
度の活性を、発現型プラスミドｐＴＮＦ６４８にコード
される新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ート１００μｌは約４．０×１０６　ユニット程度の活
性を、そして発現型プラスミドｐＴＮＦ６５１にコード
される新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼ
ート１００μｌは約５．０×１０６　ユニット程度の活
性を、それぞれ有していることが明らかになった。 【００６３】実施例２で得られた各種大腸菌ライゼート
中に含まれ総蛋白質量は、プロテイン・アッセイ・キッ
ト（バイオ・ラッド）を用いて定量し、ウシ血清アルブ
ミンを用いた検量線より計算した。上記で得られた発現
量、活性の値及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペ
プチド等の比活性を計算したところ、表１のような値が
得られた。表１より、ｐＴＮＦ６４８にコードされる新
規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約６倍
の比活性を、そしてｐＴＮＦ６５１にコードされる新規
抗腫瘍活性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約５倍の
非活性を有していることがわかる。 【００６４】 【表１】 【００６５】 【配列表】 【００６６】配列番号：１ 配列の長さ：１５０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａ
ｌａ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒ
ｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　　　
２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｇｌｙ　Ｖａｌ
　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　
Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　３５　　　　　　　
　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４５　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　　　
　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｔｈｒ　
Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　　６５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　
　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０　Ｇ
ｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ｇｌ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　
Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　１
００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　
　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　１１５　　　　　　　
　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　
　　　　　１２５　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　
Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　　　
　　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５
　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｐｈｅ　
Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　１４５　　
　　　　　　　　　　　　　　　１５０　 【００６７】配列番号：２ 配列の長さ：１５０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａ
ｌａ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｐｒ
ｏ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　１　　　　　　　　　
　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１０　　　　　　　　　　　　　　　　　　１５　Ｇｌ
ｙ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ
　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　　　　　　　　　　　　　　
２０　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３０　Ｇｌｙ　Ｖａｌ
　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　
Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　３５　　　　　　　
　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　　　
　　　　　　４５　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　　　
　　　５０　　　　　　　　　　　　　　　　　　５５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０　Ｔｈｒ　
Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｔ
ｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　　６５　　　　　　　　　　　　
　　　　　　７０　　　　　　　　　　　　　　　　　
　７５　　　　　　　　　　　　　　　　　　８０　Ｇ
ｌｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ
　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８５　　　　　　　　　　　　　　　　　　
９０　　　　　　　　　　　　　　　　　　９５　Ｇｌ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ
　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　
Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　　　　　　　　　　　　　１
００　　　　　　　　　　　　　　　　　１０５　　　
　　　　　　　　　　　　　　１１０　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａ
ｌａ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　１１５　　　　　　　
　　　　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　
　　　　　１２５　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　
Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇ
ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　　　
　　１３０　　　　　　　　　　　　　　　　　１３５
　　　　　　　　　　　　　　　　　１４０　Ｐｈｅ　
Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　１４５　　
　　　　　　　　　　　　　　　１５０　 【００６８】配列番号：３ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列： ＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡ　ＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴ　ＣＴＧ
ＧＧＡＧＧＧＧ　ＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴ　ＧＧＡＧＡＡ
ＧＡＧＴ　ＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡ　　　　　６０ＧＣＧ
Ｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６４ 【００６９】配列番号：４ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列： ＴＧＡＧＴＣＧＧＴＣ　ＡＣＴＣＴＴＣＴＣＣ　ＡＧＣ
ＴＧＧＡＡＧＡ　ＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ　ＡＴＡＧＡＴ
ＧＧＧＣ　ＴＣＡＴＡＣ　　　　　　　　　５６ 【００７０】配列番号：５ 配列の長さ：６４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列： ＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡ　ＧＣＣＣＡＴＣＴＡＴ　ＣＴＧ
ＧＧＡＧＧＧＧ　ＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴ　ＧＧＡＧＡＡ
ＧＧＧＴ　ＧＡＣＣＴＡＣＴＣＡ　　　　　６０ＧＣＧ
Ｃ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　６４ 【００７１】配列番号：６ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸、合成ＤＮＡ 配列： ＴＧＡＧＴＡＧＧＴＣ　ＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣ　ＡＧＣ
ＴＧＧＡＡＧＡ　ＣＣＣＣＴＣＣＣＡＧ　ＡＴＡＧＡＴ
ＧＧＧＣ　ＴＣＡＴＡＣ　　　　　　　　　５６

【図面の簡単な説明】

【図１】新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミドｐＴＮＦ６４８の作成方法を示したものである。

【図２】ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプ
チド遺伝子の発現確認結果を示したものである。

【図３】ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドのｉｎ　　ｖｉｔｒｏ抗癌活性測定結果を示したも
のである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　配列番号１に記載のアミノ酸配列で表
   わされる新規生理活性ポリペプチド。
2. 【請求項２】　　配列番号２に記載のアミノ酸配列で表
   わされる新規生理活性ポリペプチド。