JPH029389A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物［ｌ胞及び
該微生物［１ｎを用いた新規生理活性ポリペプチドの製
造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新
規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと
略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ
領域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形
質転換された組換え微生物４１１胞及び該微生物ｍ胞を
用いた新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する
。

本川Ｉ［ｌ占において、アミノ酸、ポリペプチドはｒＵ
ＰＡｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方
法により略記するものとし、たとえば下記の略号を用い
る。

ＡＩａＬ−アラニン ＡｒａＬ−アルギニン ＡＳｎ　Ｌ−アスパラギン ＡｓｐＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕｍ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ＨｉｓＬ−ヒスチジン ｌ１ｅＬ−イソロイシン １ｅｕｌ−ロイシン ＬｙｓＬ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン ｐｒｏｐ−プロリン ３ｅｒｌ−−セリン １’−ｈｒｌ−スレオニン ＴｒｐＬ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）Ｌｔそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカル
ボキシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３
′）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側
を示すものである。

（２発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂａｃｉ　ｌ　Ｉｕｓ　　Ｃ
ａｌｉｅｔｔｅＱｕａｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌
を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、こ
の物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏ
ｓｉｓｌ”ａｏｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら
、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　７２．３６６６（１９
７５）　］　。コ（１）ＴＮＦはマウス、ウサギ、ヒト
等多くの初物中に見られ、！ｌ！瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてさた。

最近になって、Ｐｅｎｎ１ｃａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ？ｌ白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
Ｎ　Ｆｉｆｆ伝子の公子について報告した［　Ｄ　、　
　Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　≦！
１２．　７２４（＋９８４）　］　。その後、０廿ら［
Ｔ、　５ｈｉｒａｉ　ら。

Ｎａ（Ｏｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、１２．　１６０
（１９８５）　］　、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ、ＷａＨら、
　５ｃｉｃｎｃｃ、ユ２８．　１４９（１９８５）］及
びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ　ａｒ＋＋ｅ
ｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｌｌｌ、、　１５２．　
５１５（１９８５）　］が、ヒヒトＴＮＦ蛋白質の大腸
菌における発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多１に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗１！１１９１活性以外の生理活性
が明らかになりつつある。たとえば、癌未明や重症感染
症患考に見られる悪液質を引き起こす原因の一つである
カケクチンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ
　ｅｕｌｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮ｍ胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、ユ６２．
２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ，
Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９．
　５１６（１９８Ｇ＞　］等が報告されている。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を伯のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失さけることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を６１製する研究が、
数多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、ＣＹＳ”及びＣｙｓ”／のいずれか又は
両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願公開ＷＯ
３６／　０４６０６＠、特願昭６１１０６７７２号）、
Ｇｌｙ”の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−１
０６７７２号、特願昭６１−２３８０４８号）。

Ａｌａ／Ｆの他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１２
３３３３７号）が報告されている。また、アミノ末端側
のアミノ酸残塁の欠失についても、６アミノ酸欠失工Ｎ
Ｆｈ＜細胞障害活性を有していることく特開昭６１−５
０’１２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性
を有していること（特願昭６１−９００８７号）、１〜
１０アミノ酸欠失ＴＮＦがｌＩＩ胞障害活性を有してお
り、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極
大になること（ＰＣＴ出願公間ＷＯ３６／　０２３８１
号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性をイ１し
ていることく特願昭６１−１１４７５４号）、支び１１
アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を右しでいること（
特願昭６１−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新現抗挿瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の伯の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に伯の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）　　発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （１−ｉｚ　Ｎ）　−Ｐｒｏ−３ｅｒ−ＡＳＤ−Ｌｙｓ
Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ
−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｌａ
−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　　ｅｕ−Ｇ　　
Ｉｎ　−Ｔ　　ｒｐ　−Ｌ　　ｅｕ−△　ｓｎ　−△　
ｒｇ−）１ｉｓ−Ａ　ｌａ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｌａ−Ｌ　
８１１−　Ｉ　Ｑｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　ｌｙ−
Ｖ　ａｌ−Ｇ　　ｌｕ−Ｌ　ｅｌｌ−Ａ　ｒ（１−Ａ　
Ｓ＋１−　Ａ　５ｎＧｌｎ　−Ｌ　ｃｕ−Ｖａｔ−Ｖａ
ｌ　−Ｐｒｏ−３ｅｒ−ＧｌｕＱ　Ｉｙ−１ｅｕ−Ｔ　
ｙｒ−Ｌ　ＣＬｌ−＋　　１ｅ−Ｔ　ｙｒ−３ｅｒ−Ｇ
　ｌｎ−Ｖａｌ−１ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　＋ｙ−
Ｇ　１ｎ−Ｑ　ｌｙ−Ｃｙｓ−ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｔｈｒ
−１１ｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ
−Ｔｈｒ−１ｌｅ−５ｅｒ−Ａ　ｒｏ−Ｅ　Ｉｅ−Ａ　
Ｉａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−Ａ　５ｎ−１ｅｕ−１ｅｕ−５ｅｒ−Ａ
　Ｉａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇ
　ＩｎＡ　ｒａ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　
ｌｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ−Ｌｙ
ｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ−
１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ
　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ−１ｅｕ　−Ｇｌｕ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ
　＋ｙ−Ａ　５ｌ）−ＡｒＱ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ
−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ａ　ＳＤ　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｐ　−Ｐ
　ｈｅ　−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−５ｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｖａｔ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−Ｉ　Ｉｅ
　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗１ｌｔａ活性ポリペプチドまたはそ
のアミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを提供す
ることによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡｆｌｉ域を含む組換えプラ
スミドを提供することによって達成され、更にかくして
得られた組換えプラスミドによって形質転換された組換
え微生物細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規
抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗
腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供する
ことによって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［０，Ｐｅ
ｎｎ１ｃａら、前出Ｊを指定するいくつかのコドンの中
から適当なものを選び、それを化学合成することによっ
て取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、用
いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望ま
しく、後にりａ−ン化及び遺伝子改変を容易に行なえる
ように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を設
けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡｍ域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する１１限酵素の切断部位を用いることにより、適
当なベクターへのクローン化が可能になる。このような
ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦｍ信子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

Ｓ　ｏｗｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｒ　　Ｐ　ｈ
ｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｒ３　ｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ　　　ｌ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　″　　Ｊ
　ｏｈｎ　　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　　３ｏｎｓ　　
、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）
］　　。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら
、Ｊ。

Ａｍ、　　ＣｈｅＩＩｌ、　　Ｓａｃ、、８９．４８０
１（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　
Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら。

ＴＯｔｒａｈｅｄｒＯｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水ａＭを、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５＜
１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化した
後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が
好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロ
ックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは
ｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ１片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（Ｉａｃブロモ−
クー）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを右
するプラスミドとして、好ましくはｌ］Ｙｓ３１Ｎ、又
はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することかできる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはｌ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｐＢＲ３２２由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトＴＮＦＭ公子発現型プラスミドと
して、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又は１）ＴＮＦ　
４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
： こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した侵、適当な塩基配列をイｊする合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗Ｉｌｌ　瘍活性ポリペプチド遺伝
子発現型プラスミドとして、好ましくは１）ＴＮＦ４７
９が用いられる。

＜Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリベゾチドｊ１
伝子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、
枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシ
ェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌ
　ｉ　）　］が好ましい。前記ヒ１−　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝
子発現型プラスミド及びＦｒ規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、
　Ｖ、　Ｎｏｒａａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして（ｑられた組換え微生物細胞を、それ自
体は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグ
ルコースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら編、“Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｉｎｇ
”　、　ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇｌ−
１ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
娠とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培舟間始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培１したとえば遠心分離によりＩ換え微生物細胞を集め
、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超音
波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離によ
り組換え微生物細胞のライゼートな１７る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦＩ公子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規生理
活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植したＭ
ｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を児るｉｎ　　ｖｉｖｏ
活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウス１１１１胞に対する細胞障害性を児るｉ
ｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法［ＲｕＨ、Ｊ。

Ｉｎ＋ｎ＋ｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１
）　］等により行なえるが、測定時間、定置性、８１１
定の簡便さ等の点から、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ活性測定法
による評価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗Ｂ瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎ＋ｃａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］の報告したヒトＴＮＦ前
駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤と
して、適当な制限ＷＩｆＸｉによる切断部位を適当な位
置に設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そし
て３′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ＞
をそれぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流
には！１１１限酵素ＣｊａＩによる切断部位を設け、Ｓ
Ｄ配列と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形での
プロモーターとの連結を可能にした。更に、３′側ｌ！
＄！訳終止コドン下流には制限酵素）−１ｉｎｄｌｌｌ
による切断部位を設け、ベクター・プラスミドと容易に
連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分番ノで合成する。オリゴ
ヌクレオチドの合成は全白＋／ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成ｎ（
アプライド・バイオシステムズ。

七デル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子間の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル類１
５１２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動
パターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部
分を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細か
く破砕した後、２〜５−の溶出用バッファー［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１ｆｆｉＭＥＤＴＡ−ｏ、１％Ｓ
ＤＳ　（ｐＨ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を１９だ
。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上を
はかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１ｉ’）を用いて、ヒトＴＮＦｍ
公子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μびの合成オリゴヌクレオヂドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツ１への
Ｉ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
Ｍ　Ｔ　　ｒｉｓ−トＩＣ？　　＜　　　１）Ｈ９，５
）　　　、　　　１０　　ｍＭ　　　　Ｍ　　ｇ　ＣＢ
　　　。

５ｍＭジヂオスレイＩ〜−ル、１０！ｉＭ　　ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべで混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＩ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ１及びＴＮ
Ｆ−７を加え、９０℃で５分間加熱した侵室温まで徐冷
して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０Ｍ文の６６　ｓＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７，６）　、　　６．６１Ｍ
　　Ｍ（ｌ　Ｃ１ｚ　。

１０　ｍＭジチオスレイトール、１１１ＭＡＴＰ水溶液
に溶解させ、３００ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法に
より泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく
約２２０ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の
方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収
する。

方、３μ７の大腸菌用プラスミドｐＢＲ３２２（約４．
４Ｋ　ｂｐ）を３０μ磨の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−
ＨＣ１（ＤＨ７，５）　、　６０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，
７１ＭＭＱＣ１ｚ水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制
限酵素（ＪａＩにューイングランド・バイオラブズ）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

制限酵素Ｃ４ａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０Ｍ文の５０１ＭＴｒｉｓ−
ｌ−１（Ｊ　（１）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃｆ、　１０１Ｍ　　ＭｇＳＯ４水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を
行ない、Ｔ　”ｆ−ジウムブロマイド染色法により切断
パターンイ／＋　　！ｌ！、！　　’−′！　Ｉ＋＜＋
’λ　。　　　　　ｌ　ス　　ミ　Ｉ−＋＋Ｉ口＜　　
　Ｔｈ２２＋７＋　　人　部　分ノ を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍Ｇ（ｖｏｌ
　／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｌ０ａ水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法ＣＣ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、Δｎａｌ　、　１３ｉ０ｃｈｅｌ、　　１
０１．　３３９（１’１８０）　］により、約３，７Ｋ
　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ４ａ　ｌ−８ａｌＩ）をアガロ
ースゲルより回収し軸。

先に１７られたヒｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ　遺伝子の一部を含む
約２２Ｑｌ）ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準
じて末端のリン酸化反応を行なった後、プラスミドＤＢ
　Ｒ３２２の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｌｌのＤＮＡ
水溶液と混合する。エタノール沈澱の後、前記の７’ｊ
　ｔｅａに準じて両ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１−株の形質転換は、
通常のＣ）　ａ　Ｃ１２法（Ｍ　、■、　Ｎｏｒｇａｒ
ｄらの方法）の改良＞Ａ　Ｃｔ’ｒなっ１．：、、すな
わち、５ｉのＬ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％Ｎａ　Ｃ１，ＩＩＨ７，２＞にエシェリ
ヒア−ｍｌすＣ６００ｒ　ｍ　ｌ、ｔ７）　Ｉ　８ｎ４
＋　Ｌ’＋ｌ　’；Ｘン’＋！′ｉＩ＊　ｉ重し、！了
Ｉ（本３ｎむＲ’ｌ　ｎ液の６００ｎｍにおける濁度（
ＯＤ　ｔｅａ）が０．３に達するまで生育させる。菌体
を冷たいマグネシウム・バッファー［０，ＩＭ　　Ｎａ
　Ｃ１，５１Ｍ　　ＭｇＣｌ２．５　１Ｍ　　Ｔｒｉｓ
−１−ＩＣｊ　（１）Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い
、２ｄの冷したカルシウム・バッファー［１００ｍＭｃ
ａ　Ｃ１２，２５０１１Ｍ　　ＫＣＩ、　５１１ＭＭ０
　ＣＩ２．５　ＩＢＭ　　Ｔｒ＋５−ＨＣＦ　（１）Ｈ
７，６゜０℃）］中に再墾濁させ、０℃で２５分間敢装
する。

次に菌体をこの容填の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中でＳ縮し、連結侵のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１１ｔｔのＬＢＧ培地（１％トリプト
ン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１，０，０８％グ
ルコース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間
振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（
シグマ）３０Ｍｇ／−を含むし培地プレート］に１００
μρ／プレートの割合で接種する。プレートを３１℃で
１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたアン
ピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮ
Ａを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のプ
ラスミドｏＴＮＦ１ＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｐ）の取得を
確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲの作成
方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミド１）ＴＮＦ２
Ｎ（約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ３Ｗ伝子の一部を含むプラ
スミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及び１）ＴＮＦ３
の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の３３！Ｉ配列が
設計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、
Ｍ、Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、
、６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦＩ転子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μり
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気法！７１（ゲ
ルｉ１１度５％、）の後、実施例２の方法に準じて、ヒ
トＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片
（Ｃ１ａ　Ｉ　＋ｌ５ａｌＩ＞をポリアクリルアミドゲ
ルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μ９を１００１１１の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
１（ｐＨ７，５＞　　、　　Ｇｏｓ　　Ｍ　　　Ｎａ　
　Ｃｆ、　　７　　ｍＭＭ（ＩＣｆ２水溶液に溶解させ
、４０ユニツトのυ１限酵素ＰＶｕＩＩ（宝酒造）を添
加し、３１℃で１時間切断反応を行なった。そして、実
施例３の方法に準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動くゲルｌ１ｒｘ５％）の
後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部
を含む約１７０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩ
［）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドρＴＮＦ３　１０
ｔｔｔｉも１ｏｏμｕの１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
１（ｐｉ−１７，５）　　　、　　　６０　　ｍＭ　　
　　Ｎａ　　Ｃ１，７ａＭＭＯＣｆ２水溶液に溶解させ
、４０ユニツトの１．ＩＩ限酵素ｐｖｕｎ及び４０ユニ
ツトの制限酵素ＨｉｎｄＤＩ（宝酒造）を添加し、３７
℃で１時間切断反応を行なった。そして、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０
ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｐｖｕｌ←）−１ｉｎｄｌｌ［）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミド１
）ＹＳ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μびを、上記と同
様に制限酵素ＣＩａＩ及びＨｉｎｄｌｌ［で切断し、ア
ガロースゲル電気法ｆＪＪ（ゲル濃度０．８％）の後、
実施例３の方法に準じて、プラスミドＩ）Ｙ　Ｓ　３１
Ｎの大部分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１
ａＩ＋）ｌｉｎｄ［［）をアガロースゲルより回収した
。

こうしてｉｑられた、ヒトＴＮＦｌ公子の一部を含む約
２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約ｊｌｏｂρの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む
約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了模、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂｐ
）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミドＤＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎ　５μ７を、上
記の方法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、
さらに制限酵素１−１ｉｎｄｌで切断し、アガロースゲ
ル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法
に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐ
のＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２１＋Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　
］をアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの３鴫、先に得られた約２，７Ｋｂ
ｐの［）ＮＡ断片［ｐｖｕＩＩ　ｆ２）４−ｔｌ　ｉｎ
ｄ　ｍ　］とｕ合シ、　Ｉ　９　／−ル沈’１２（１）
ｍ、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼに
よる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法
に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ１−株に導入し
、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約
２．７ＫｔＵ）を有するクローンを選択した。このよう
なプラスミドは、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎからコピ
ー数制御領域除去し、ｔｒｐｒロモーター下流に存在す
るクローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａター
ミネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベク
ターであり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μりを、上記と同様にシ
１１限醇素ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌで切断し、アガ
ロースゲル電気ｖＸｖＪ（ゲル濃度０．８％）の後、実
ｊｌｌＡ　Ｖ／４３の方法に準じて、プラスミドＩ）Ａ
　Ａ　４１の大部分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断
片（Ｃ１ａＩＨＨｉｎｄｌ［ｌ）をアガロースゲルより
回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦＩ伝子発現型プラスミド
ｏＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ　５μ９を、上記と同様に
制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施
例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４
９０ｂＤのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　ニー１」ｉｎｄ　Ｉ［
［）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ△４１の大部分を
含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ３宜伝
子全域を含む約４９０ｂｌ）のＤＮＡ断片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリＢｏｏｒ１−株に導入し、形質転換株の中より目的
のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂｌ
））を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有し
ており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（Ｆｒ規規程腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミド作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μりを、実施例４の方法に準じ
てυ１限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）及びア
ガロースゲル電気泳動（ゲル１７３ｒｆ０．８％）の侵
、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２
つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｌ）及び約２．７Ｋ　ｂｐ
、両方共（Ｊａ　工１−ＩＨｉｎｄ　［７）をゲルヨリ
回収した。

ここで１１１られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９
０ｂｐのＤＮＡｖｆＩ片をｓｏμＱの１０　ｍＭ　　王
ｒｉｓ（Ｃ１（ＤＨ７，４）　、　１０　ａ＋Ｍ　　Ｍ
ｇ５ＯＪ　　　１　　ｍＭジヂーオスレイトール水溶液
に溶解させ、１０ユニツトのｉ、ＩＩ限酵素１−１ａｐ
Ｉｒ（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を
行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法に準じて
、ヒｔ”　Ｔ　Ｎ　Ｆ　ｉ盲信子の大部分を含む約３７
０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｂ（ＩＩＩ→Ｈｉｎｄｌ［ｌ）を
ポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、青られた２重鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａ　Ｉ
”Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦｍ転子の大部分を含
む約３７０ｂｌ）のＤＮＡＩｇｉ片（１３ａｌＩ−１ｉ
ｎｄＩ［Ｉ）と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３
の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応
を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシ
ェリヒア・コリＣ６００ｒ−１株に導入し、形質転換株
の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７９（約３．２
Ｋ　ｂｐ＞を有するクローンを選択した。このプラスミ
ドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ）−Ｐｒｏ−８ｅｒ−
ＡＳＩ）　　Ｌｙｓ−Ｐ　　ｒｏ　−Ｖ　　ａｌ−Ａ　
　ｌａ−ト１　　ｉｓ　−Ｖ　　ａｌ　−Ｖ　　ａｌ　
−Ａ　　Ｉａ−Ａｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ
　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ＩＶ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒａ−ｆ−１
ｉｓ−Ａ　ｌａ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ａ　ｌａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　Ｉｕ
−１ｅｕ−Ａ　ｒａ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−Ｓｅｒ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ｒ
ｌｅ−Ｔｖｒ−８ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌ　ｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ＩＶ−ｃｙ
ｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−ＶａｌＬｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１−１ｉｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−５
ｅｒ−Ａ　ｒＱ−１１ｅ−Ａ　ｌａ　−Ｖａｔ　−Ｓｅ
ｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌ
ｖＳ−３ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａ　ｒ（１−
Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ
　Ｉｙ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｙ
ｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　Ｉ（１−
Ｐｒｏ　−Ｉ　ＩＣ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ
　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｏ−Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ−３
ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−１１ｅ−Ａ　５ｎ−Ａ　ｒ
ｏ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａ　ｓｐ−
Ｐｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ
　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔ　ｙｒ−Ｐｈｅ　−Ｇ　ｌｖ　−１
１ｅ　−Ｉ　１ｅ−Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ　−（ＣＯＯ）
−１） で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコード
する新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミ
ドであり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られた発現ベクターＤＡ　Ａ　４１゜
ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４０１Ｎ
Ｎ又はｐＴＮＦ　４０１Ａ、又は実施例５で得られた、
新規抗腫Ｓ活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１
）ＴＮＦ４７９を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−１株を、３０〜５０μｇ／ＩＩｄのアンピシリン、０
．２％のグルコース及び４１１１９／ＩＩＩのカザミノ
酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，
３％Ｋｚ　ＨＰＯａ　−０，０５％ＮａＣｊ−０，１％
Ｎ８４Ｃ！水溶液（ＤＨ７，４）をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭｇ５Ｏ，＋
水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ最終８１度２Ｉ
ｌ１Ｍ及び０．１霜Ｍになるように加える。］　　２５
０ｄに接種し、ＯＤ、ｇ＃ｌが０．７に達するまで、３
７℃で振どう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μ
ｇ／−の３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添
加し、ざらに３１℃で１２時時間上う培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｐ
　−（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０１Ｍリン酸
バッフｐ　−ｐＨ７，４＞を用いて菌体の洗浄を行なっ
た。洗′ｆｐ後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファーに懸
濁させ、川音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）を
用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残潰の除
去を行なった。

１うられた大１！菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｊバッファー　（ｐＨ６，８）　、　ＳＤＳ、
　２−メルカプトエタノール ぞしｒ＆終澹度６０　ｍＭ．　２％．　４％．　１０９
６ニナルにうに加え、ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動［銘木．ｉ！Ｉ伝，　３１．　４３　（１９７
７）　］を行なった。

分離用ゲルは１６％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

Ｔｒｉｓ　−’７１Ｊシフ系［Ｕ．　Ｋ．　ｌ−ａｅ＋
ｕｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７，　　６８０（１９７０）
　］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、
ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第
１０図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナー（島津，
　ＣＳ−　９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ
蛋白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質
蛋白質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒ
トＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドｔｌＴＮＦ４０１Ａを
有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１６％のヒ
トＴＮＦ蛋白質，新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発
現型プラスミドＤＴＮＦ４７９を有する大腸菌において
は同じく約１３％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生
が、それぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦｉ転子発現
型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮを有する大腸菌に４
６けるヒ１〜ＴＮＩ”蛋白質の産生Ｖは、上記ｐＴＮＦ
４０１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクタｒｌＡ
△４１の有用性が示された。

実施例７（活性の評価） 新（す抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕ
ｒｆの方法に準じて行なった。すなわち、実＋１１６で
１９られた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ラ
イゼートを順次培地で希釈した試料１００μ息と、４×
１０５個／−の濃度のマウスＬ９２９繊帷芽＄［胞（Ａ
ＴＣＣＣＣＬ−９２９＞懸濁液１００μ文を、９６穴の
組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合し
た。なおこの際に、最終濃度１μ９．／Ｉｄのアクチノ
マイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖａｔ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地〈
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ＶＯ／ｖｏ
ｌ）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ＶＯＩ　）
のクリスタル・バイオレットを溶解させたちの］を用い
て生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレット
を洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレッ
トを１００μ文の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その
５９５ｎｉにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（
東洋銅器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は
、生き残った細略数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋
白質又は析規抗牲瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライ
ゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値
に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグラフ（たと
えば第１１図）によって求め、その希釈倍率をユニット
と定義する。第１１図より、発現型プラスミドｐＴＮＦ
４０１ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌
ライゼート　１００μすは６，３Ｘ　１０５ユニツト程
度の活性を、そして発現型プラスミド＋）ＴＮＦ４７９
にコードされるＦｌｒ規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む
大腸菌ライゼート１００μ文は１．３×１０４ユニツト
程度の活性を、それぞれ有していることが明らかにイ蒙
った。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮ「４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
１）ＴＮＦ４７９にコードされる新規抗Ｉｌ！！　＋ａ
活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質ｍは、プロティン・アッセイ・キラ］−（バイオ
・ラッド）を用いて定晒し、ウシ血清アルブミンを用い
た検ＩＤｆａより計暮した。上記で（りられた発現追、
活性の値及び蛋白質定に結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び
新規抗ＩＩＩ瘍活性ポリペプチドの比活性を計節したと
ころ１表１のような埴が１１１られた。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ボリ
ベブブ下の比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦｍ伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドＩＩ
ＴＮＦＩＢＲ，１１丁ＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ　３の
作成方法を、それぞれ示したものである。第６図はヒト
ＴＮＦｌ転子発現型プラスミドＤＴＮＦ　４０１ＮＮの
作成方法を、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　ｌの作成
方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミド０ＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示した
ものである。第９図は新規抗１ｆｆｉ瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子発現型プラスミドｐ”ｒＮＦ４７９の作成方法
を示したものである。第１０図はヒトＴＮＦ遺伝子及び
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を認
定したゲル電気泳動の写真を示したものである。第１１
図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗ＩＩ瘍活性ポリペプチ
ドの活性測定結束を示したものである。 特許出願人　帝　人　株　式　会　礼 式　　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純　　博〆
躬５″圓 （つ　αつ ＊ｒｒ凪のＢ Ｐｖｕ　Ｘ（１） 第 邑 ＨｉｈＪ　ＴＬ 孔ｃ１０の８ 某 邑 手 続 補 工Ｅ 書 （方式） １、事件の表示 特願昭 ２、発明の名称 新規生理活性ポリペプチド （１）明細書第５０頁下から第６行〜第５１頁第１３行
に「第１図は設計した・・・・・・ものである。」とあ
るのを 「第４図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第
２図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列
を、それぞれ示したものである。第３図、及び第４図は
、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴＮＦ
ＩＢＲ１及びｐＴＮＦ３の作成方法を、それぞれ示した
ものである。第５図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を、第６図は発現ベ
クターｐＡＡ４１の作成方法を、そして第７図はヒトＴ
　Ｎ　Ｆ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１Ａの
作成方法を、それぞれ示したものである。第８図は新規
抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮ
Ｆ　４７９の作成方法を示したものである。第９図はヒ
トＴＮ１？遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現確認結果を認定したゲル電気泳動の写真を示し
たものである。第１０図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗
腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示したものであ
る。」に訂正する６（２）図面の副番号「第５図」を「
第４図」に訂正する。 （３）図面の副番号「第６図」を「第５図」に訂正する
。 （４）図面の副番号「第７図のＡ」を「第６図のＡ」に
訂正する。 （５）図面の副番号「第７図のＢ」を「第６図のＢ」に
訂正する。 （６）図面の副番号「第８図」を「第７図」に訂正する
。 （７）図面の副番号「第９図のＡ」を「第８図のＡ」に
訂正する。 （８）図面の副番号「第９図のＢ」を「第８図のＢ」に
訂正する。 （９）図面の副番号「第１０図」を「第９図」に訂正す
る。 （ｌＯ）図面の副番号「第１１図」を「第１０図」に訂
正する。　　　　　　　　　　　　　以　上第６ｒＲの
Ａ ｆｉｌ−一−−−−−−→ （５＝）−ＡＧＣ，ＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡ’ｒＧ
ＡＧＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴ−（３−＋（３″）−
ＡＴＣＧＧＧＣＧＧＡ丁ＴＡＣ丁ＣＧＣＣＣＧＡＡＡＡ
ＡΔ八Ａ−（５−））＋へ１−一→ 第 図 の ｐｖｕ　［１（１） 第 ？ 図 Ｈｉｎｄ［ｉ 第 ｇ 図 の 弔 図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。 （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する第１項記載のポリペプチド。（３）次のアミノ酸配
   列 【アミノ酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。 （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。 （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
   項記載のプラスミド。 （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４７９である
   第３項記載のプラスミド。 （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。 （８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴
   とする第７項記載微生物細胞。 （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。 （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
   酸配列があります】 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
   医薬組成物。