JPH02255096A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）　　産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードする［）Ｎへ領
域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた
新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡｌａＬ−アラニン Ａｒｇ　Ｌ−アルギニン ＡＳｎ　Ｌ−アスパラギン ＡＳｐ　Ｌ−アスパラギン酸 Ｃ■Ｓ　　Ｌ−システィン Ｑｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　ｌ−−グルタミン酸 ＧＩＶ　　グリシン １−１１３Ｌ−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン １−ｅｕｌ−ロイシン Ｌｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン ＰｈｅＬ−フェニルアラニン Ｐｒｏｌ−−プロリン ３ｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−１−リプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｔ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシデミ
ジル酸を示す。）さらに、（＋−１２Ｎ）−及び−（Ｃ
ＯＯＨ＞はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカ
ルボキシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３
′　）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端
側を示すものである。

（２）　　発明の背景 Ｃａ１”３Ｗｅ　ｌ　＋　らは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　
ＣａｌｍｅｔｔｅＱｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒ
ｏｓ＋ｓ「ａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することも
ある）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら
、　ｐ　ｒｏｃ、　Ｎ　ａｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になッテ、ｐｅｎｎｔｃａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の発視について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　ｅ
ｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７
２４（１９８４）コ。その後、自弁ら［Ｔ、　５ｈｉｒ
ａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｒ＋ｇら［Ａ、Ｍ、　Ｗａ
ｎｇら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１
９８５）　　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　
　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

ＥＬＩｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５
１５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌に
おける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクヂ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ、　Ｂｅｕｔｔｅ
ｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リポプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［１，Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　　１６
２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　
Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１
９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓ’及びＣｖ　ｓ　／Ｉ’／のいず
れか又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置
換（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭
６ｌ−１０６７７２）　、Ｇ　１ｙ”’の他のアミノ酸
残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６
１２３８０４８号）　、　ＡＨａ／／の他のアミノ酸残
基への＠換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告され
ている。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失につ
いても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有して
いること（特開昭６１〜５０９２３号）、７アミノ酸欠
失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１
９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障
害活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸欠失
ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３
６／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞
障害活性を有していること（特願昭６１１１４７５４号
）、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有してい
ること（特願昭６１−１７３８２２号）、及び７アミノ
酸欠失ＴＮＦを基盤として、ｐ　ｒ０８Ｓ　ｅｒ９ＡＳ
ｐｌＯをＡ　ｒｇＬ　Ｖ！ｌ、Ａ　ｒｇへ置換を行なウ
ド、その比活性が大きく上昇することが報告されている
。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを］
−卜するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に伯の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （Ｈ２Ｎ＞　　Ａｒ（１−Ｌｙｓ−Ａｒり　　ＬＶｓ　
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
ＡｌａＡ　ｓｎ　−ｐ　ｒｏ　−Ｑ　Ｉｎ　−Ａ　ｌａ
　−Ｑ　１ｕ−１３ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｌ）　−Ｌ　ｅｌＪ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　
ｒ（１−Ａ　ｒ！］　−Ａ　ｌａ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｌａ
−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　ｓｎＧ　Ｉｙ　
−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒｇ　−
Ａ　３＋１−　Ａ　５ｎＧｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａ
ｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−ＧｌｕＧ　ＩＶ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒＧ　Ｉｎ　−Ｖ　ａ
ｔ　−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　
−Ｇ　ＩｎＧ　１ｙ−Ｃ’／ｓ−Ｐ　ｒｏ−５ｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ｈｉｓ−ＶａＬ　ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ
−Ｔｈｒ−Ｉ　　ｌｅ−５ｅｒＡ　ｒｇ−１ｌｅ−Ａ　
１ａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　ＩｎＴｈｒ−Ｌｙ
ｓ　−Ｖａｌ　−ＡＳｎ−ＬｅＬｌ−Ｌｅｕ−８ｅｒＡ
　ｌａ−Ｉ　　１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｃｙ
ｓ−Ｇ　ＩｎＡ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ
−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　１ａＧｌｕ−Ａｌａ−Ｌ　
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−ＧｌｕｐｒＯ−１１ｅ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｑｌｙ−Ｇｌｙ−ＶａＰ　ｈｅ−Ｇ
　１ｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ
　ｓｐＡｒｇ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔ　
１ｅ−ＡｓｎＡ　ｒ（Ｊ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　ＳＬ−Ｔ　Ｖ
ｒ−Ｌ　ｅｌｌ−Ａ　Ｓｐ−Ｐ　ｈｅＡ　ｌａ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙ
ｒＰ　ｈｅ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｉ　　１ｅ−Ｐ　ｈｅ　−
Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ　−（Ｃ：０ＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ン末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生する方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦＩ伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレムを一致させた形での翻訳終止コドン
（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子は、その上流及び
下流に作用する制限酵素の切断部位を用いることにより
、適当なベクタへのクローン化が可能になる。このよう
なヒトＴＮＦ３１仏子の塩基配列の例を、第１図に示し
た。

上記のように設計したヒトＴＮ　Ｆ３］ｉｆ仏子の取得
は、上側の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば
第２図に示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分
けて、それらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチド
を連結する方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオ
チドの合成法としてはジエステル法［Ｈ、Ｇ　、　Ｋ　
ｈｏｒａｎａ。

“Ｓ　ｏｎｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　［）　ｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　　＋ｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆ［３ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　ｌ　ｎｔｅｒｅｓｔ”、　Ｊｏ
ｈｎ　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　　Ｉｎｃ
、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］　。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、
Ｊ。

Ａ１１．　　Ｃｈｅｌｌｌ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８
０１（１９６７）　］及びホス７フイト法［Ｍ、　Ｄ、
　Ｍａｔｊｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、Ｂ　
ｏｆ　１Ｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５（
１９’７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦＩＢＲ。

１）ＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列の下流
につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができる
。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・オ
ペロン・プロモーターＢｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｏプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター　ＰＬブロモター、　
ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒｐ
プロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有す
るプラスミドとして、好ましくはＤＹ　Ｓ　３１Ｎ　、
又はＩＩＩＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはｌ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえば１）ＢＲ３２２由来
のベクターにクローン化することにより、発現型プラス
ミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
として、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又は１）ＴＮＦ
４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のり〇−ン化
； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはＦＩＴＮＦ６４３が用い
られる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるだめの微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コ’）　Ｃ６０
０ｒ−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することが
できる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ　、　Ｍ　ａｎ
ｉａｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉ
ｎ。

Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸＝２６− 濁させ、たとえば超高波処理により組換え微生物細胞を
破砕し、遠心分離により組換え微生物細胞のライゼート
を得る。得られたライゼート中の蛋白質を、ラウリル硫
酸ナトリウム（以下、ＳＤＳと略ずこともある）を含む
ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分離
し、ゲル中の蛋白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（（：、　ａｒｓｗｅｌｌら、前出）
、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　ｖｔ
ｔｒｏ活性測定法［ＲｕＨ、Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
、　１２６．　２３５（１９８１）　］等により行なえ
る。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマ１〜グラフイーが有利である。なかでも、ヒ
トＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体
を用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィー
がとりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋
白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いるこ
とにより、ｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作用に
関する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ｖｉｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦｌ転子を設計した
、設計に際しては、ｐｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐｅｎｎｌｃａら、　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　
７２４（１９８４）　］の報告したヒトＴＮＦ前駆体Ｃ
Ｄ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、
適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、５
′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして３′側に２
個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれぞれ付
与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限酵素
（ＪａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開始コ
ドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの連
結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下流には
制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［による切断部位を設け、ベクタ
ー・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８ＯＡ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一部保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５Ｉｄ、の溶出用バッファ　　［５００
ｍ１ｙｌ　　ＮＨ４ｏＡｃ　　１　　ｍ１ｙｌＥＤＴＡ
−０，１％Ｓ　Ｄ　Ｓ　（１）ｌ−１７，５）コを加え
、３７°Ｃで一部振とうした。遠心分離により、目的の
ＤＮＡを含む水相の回収を行なった。最後に合成オリゴ
メクレオチドを含む溶液をゲル濾過カラム（セファデッ
クスＧ−５０＞にかけることにより、合成オリゴヌクレ
オチドの精製品を得た。なお、必要に応じて、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレ
オチドの純度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦＩ伝子のクローン化〉 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮｆ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ３の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＩ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ＩＩＨ９，５）　、　１０１１
１Ｍ　　Ｍ（ｌ　ＣＢ２゜５　ｍＭジチオスレイトール
、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、３０分間
行なった。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチ
ド水溶液をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽
出によりＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去
する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴメクレオチドＴＮＦ１及びＴＮ
Ｆ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐冷
して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μρの６６　ｍＭ
Ｔｒ＋５−Ｈ（Ｊ　（ｐＨ７，６）　、　　６．６　ｍ
Ｍ　　Ｍ（］　ＣＪ２゜１０１１１Ｍジチオスレイトー
ル、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツトの
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１°Ｃで
１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチ
ジウムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行
なう。目的とする大きさく約２２０ｂｐ）のバンド部分
を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミ
ドゲルよりＤＮＡを回収する。

方、３μ９の大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約４
．４Ｋ　ｂｐ）を３０μρの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−１−Ｉ　ＣＢ（ＤＨ７，５）　、　６０　ｎ＋Ｍ　　
Ｎａ　ＣＬ　７　ｍＭＭ（ＩＣＢ２水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素（ＪａＩにューイングランド・
バイオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を
行なった。

制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μρの５０１１１ＭＴｒ＋
５−Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　
　Ｎａ　ＣＬ　１０ｍＭ　　Ｍ（１８０４水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素３ａｌＩ　＜宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミドＤＢＲ３２２の大部分を
含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　
／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣＲＯａ水溶液に溶解させた。

Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　３ｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片（（ＪａＩ←５ａｌＩ＞をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦＭ伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて木端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢ　Ｒ３２２の
大部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

■シエリヒア・コリ（：、　６００ｒ−ｍ−株の形質転
換は、通常のＣａＣＲＺ法（Ｍ　、　Ｖ　、　Ｎ　ｏｒ
ｇａｒｄらの方法）の改良法で行なった。すなわち、５
ｄの１−培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、
０．５％ＮａＣｊ、　　Ｉ）Ｈ７，２）にエシェリヒア
−ＤすＣ６００ｒ−＋ｎ−株の１８時間培養基を接種し
、菌体を含む培養液の６０ＯｎＩＩｌにおける濁度（Ｏ
Ｄｚｓ）が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷た
いマグネシウム・バッフＦ　−［０，ＩＭ　　Ｎａ　（
４，５ｍＭｔＶＩＱ　Ｃ９２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆ　（ｐＨ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｄの
冷したカルシウム・バッファ［１００１１１ＭＣａ　Ｃ
Ｒ２，２５０１１１Ｍ　　ＫＣＦ、　５　ｍＭＭｇＣ２
２，５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ７，６゜０℃
）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０°Ｃで保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン
、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｆｆ、　　０．０８
％グルコース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１
時間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリ
ン（シグマ）３０μｇ／ｄを含むＬ培地プレート］に１
００μ旦／プレートの割合で接種する。プレートを３７
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られた
アンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いて
ＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的
のプラスミドＩＩＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｌ））
の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢ
Ｒの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴメクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫ　ｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドａＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ
　３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミド１１ＴＮＦＩＢＲ，ｌ］ＲＮＦ２Ｎ及びＦＴＮＦ３
の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計
通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ、
Ｍａｘａｍら、　Ｍ　ｅｔｈＯｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、
６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素（ＪａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｃ９ａ
　Ｉ　４−ＩＳａｌＩ）をポ１．Ｊ　７クリルアミドゲ
ルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｙを１００μｆｉの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｌｓ−ＨＣ
ｆ（ｐｌ−（７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　ＣＬ
　７　　ｍＭＭｇ（Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ｐｖｕＩ［（宝酒造）を添加し、３７℃で
１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に
準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｌ
）のＤＮＡ断片（３ａｌＩ＋ＰｖｕＩＩ）をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μ９もｉｏｏμｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣＲ
（Ｃ８７，５）　　　、　　　６０　１１１Ｍ　　　　
　Ｎａ　　Ｃ９’、　　　７　　１ＭＭ（ＩＣｊ２水溶
液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵素ｐｖｕ■及び４
０ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄｎＩ（宝酒造）を添加し
、３７℃で１時間切断反応を行なった。そして、ポリア
クリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施
例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約
１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＰＶｕＩＩ←ＨｉｎｄＩ［）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐＹ
ｓ３ＩＮ＜約４．７Ｋｂｌ））　５μ９を、上記と同様
に制限酵素ｃＲａｒ及びｔ−ｌ１ｎｄ■で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、プラスミドｐＹ８３１Ｎの大部分を
含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩ＋ｔ（ｉ
ｎｄｌＩ（）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ″ＸＩＩ伝子の一部を含
む約２２０ｂｐ、約１７０ｂｌ）及び約１１０ｂｐの３
つのＤＮＡ断片とプラスミドｐＹＳ３１Ｎの大部分を含
む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノー
ル沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリ
ガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例
３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ａ＋
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺
伝子発現型プラスミドＩＩＴＮＦ４０１ＮＮ（約５，２
Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そ
のプラスミド１ｌＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した
。

また、上記プラスミドｐＹｓ３ＩＮ５μ３を、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕ：［で部分分解した後、さら
に制限酵素）１ｉｎｄｌｌで切断し、アガロースゲル電
気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準
じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤ
ＮＡ断片［ＰｖｕＩ［（２］−Ｈｌｎｄ　Ｉ［［］　ヲ
アガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。１ｑら
れた２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０，５μ３
について、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を
行ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７１（
ｂｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＩ（２）４−ＩＨｉｎｄ　
ＩＩ［］　ト混合シ、エタ／−ル沈ｔｌｌｌ（７）Ｉ、
実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準
じてエシェリヒア・コリＣＣ６００ｒ−株に導入し、形
質転換株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．
７Ｋ　ｂｐ＞を有するクローンを選択した。このような
プラスミドは、プラスミド１）Ｙｓ３１Ｎからコピー数
制御領域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在する
クローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミ
ネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクタ
ーであり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミド１ｌＡＡ４１　２μ３を、上記と同様に
制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌ［で切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミドｌ）Ａ、Ａ４１の大部分を含
む約２．７１（ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｊａＩＨｌ」ｉｎ
ｄ［［）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵
素ＣβａＩ及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｌ）　１７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（Ｃｊａ　Ｉ”１−ｆｉ
ｎｄ　ｍ　）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＦＩＡ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴ、ＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子弁環型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦｌ伝子発現型プラスミド
ｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ２０μ９を、実施例４の方法に
準じて制限酵素（ＪａＩ及びＨｉｎｄＩＩｌで切断し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及び
アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、そ
れぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つの
ＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋ　ｂｐ、両方
共ｔＪａ　Ｉｆ−１１−１ｉｎｄ　ＩＩ［＞をゲルより
回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ夏の１０　ｍ１ｖｌ　　Ｔｒ＋
５ＨＣｆｆｉ（１）ｌ−１７，４）、　１０ｍＭ　　Ｍ
（ｌｓＯ４、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩ［（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）
を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子
の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（ｔ−１ａｐ
■←Ｈ＋ｎｄＩ［ｌ）をポリアクリルアミドゲルより回
収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＦａ　Ｉ
”Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含
む約３９ｏｂｐ＋７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（Ｈａｐ　］Ｉ
＋−＊Ｈ１ｎｄｌ［［）と混合し、エタノール沈澱の後
、実施例３の方法に準じて、Ｔｌ−ＤＮＡリガーゼによ
る連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に
準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し
、形質転換株の中より目的のプラスミドりＴＮＦ４７１
（約３，２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。こ
のプラスミドは、次のアミノ酸配列ｐｒ。

Ａｓｎ 　　ｅｕ Ａｌａ ｌｙ Ｇｌｎ １ｙ Ｇｌｎ ｌｙ ｅｕ Ａｒ（Ｉ Ｔｈｒ １ａ Ａｒｃ＋ １ｕ Ｐｒ。

ｈｅ Ａｒａ Ａｒａ （Ｈ２ Ｖａ Ｐｒ。

Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａ しｅｕ ｅｕ Ｖａ Ｌｙｓ 　ｅｕ ）ｌｅ Ｌｙｓ １ｅ ｌｕ Ａｌａ １ｅ Ｇｌｎ −ｅｕ Ｐｒ。

Ｎ）−Ａｒａ Ａｌａ−ＨｉＳ Ｇｌｎ−Ａｌａ Ｔ　ｒｐ−１，ｅｌＪ Ａｌａ−Ｌｅｕ （３１ｕ−Ｌｅｕ Ｖ　ａｌ−Ｖ　ａ Ｔｙｒ−１ｅｕ Ｌ　ｅｕ−ｐ　ｈｅ ＰｒＯ−８ｅｒ Ｔｈｒ−１−１ｉｓ １ａ−Ｖａ Ｖａｌ−Ａｓｎ Ｌｙｓ−８ｅｒ Ｔｈｒ−ｐｒ。

Ｌ　ＶＳ　−Ｐ　ｒ。

Ｔｙｒ−１ｅｕ Ｌ　ｅｕ−Ｑ　１ｕ ３ｅｒ−Ａｌａ ＡＳＩ）−Ｔｖｒ Ｌｙｓ Ｖａ ｌｕ Ａｓｎ 　　ｅｕ Ａｒａ ｐｒ。

　ｌｅ Ｌｙｓ １’−ｈｒ Ｔｈｒ ｅｒ ｅｕ ｐｒ。

ｌｕ ｒｐ ＩＶ ＶＳ ｌｕ ｅｕ Ａｒａ い ＩＶ Ａｒａ Ａｌａ Ａｓｎ ｅｒ Ｔｖｒ ｌｙ ｉｓ １ｅ Ｔｖｒ ｅｕ ｙＳ ｌｙ Ｔｖｒ ｌｙ ｌｙ ｌｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｒａ Ｓｎ Ａｓｎ ｌｕ ｅｒ Ｇｌｎ Ｖａ ｅｒ Ｇｌｎ ｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ ｌｕ Ｖａ ＡＳＩ） Ａｓｎ ｈｅ Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−
Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒＰｈｅ−Ｇ　１ｙ−１１ｅ　−１ｌ
ｅ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ（ＣＯＯＨ） で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。

方、上記で得られたヒトＴ　Ｎ　Ｆ　ｍ伝子発現型プラ
スミドｐＴＮＦ　４７１　２０ｕｇを、実施例４の方法
に準じて制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［で切断した後、５０ｍ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−ＨｆＪ　（ｐｉ−１７，４）　、　
１００　ｍ　ＭＮａ　ＣＲ，１０ｍＭ　　ＭｇＳＯ４水
溶液中で制限酵素ＮｃｏＩ（宝酒造）による切断反応を
３７℃で１時間行なう。反応終了後、アガロースゲル電
気泳動くゲル濃度０．７％）及びポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動くゲル１１１５％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１４０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（ＮＣＯＩ＜−）Ｈｉｎｄ　ｌｌ　）を
ポリアクリルアミドゲルより、そして実施例３の方法に
準じて、ｐＴＮＦ４７１の大部分を含む約３．０Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ｌ−１ｉｎｄ　ｌ［［）をア
ガロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で゛得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ
ｃｏ工”１−ｆｉｎｄ　ＩＩ＞を５０μ、Ｑの１０ｍＭ
　　Ｔｒｉｓｌ」ｃｊ　（ＩＩＨ７，４）　、　１０　
ｍＭ　　ＭＵ　ＳＯ４，１１１１Ｍジヂオスレイトール
水溶液に溶解させ、１ｏユニツトの制限酵素Ａｃｃ■（
宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度８％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ断片
（ＮＣＯ工←ＩＡｃｃＩ）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μびについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．０Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣ
ＯＩ←Ｈｉｎｄｌ［［＞及びヒトＴＮＦ遺伝子の部含む
約１１０ｂｌｌのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＜→ＡＣＣＩ＞
と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣ６００ｒ〜ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴＮＦ６４３（約３．２Ｋ　ｂｐ）を
有するクローンを選択した。このプラスミドは、次のア
ミノ酸配列 Ｎ−Ｌ　Ｎ　）　　ＡｒＧ　　Ｌｙｓ−Ａｒ（Ｉ　　ｃ
ｙｓｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−＠　ｉｓ　
−Ｖａｌ−Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｌａＡ　５ｎ−ｐ　ｒｏ　
−Ｑ　Ｉｎ−ＡＩａ　−Ｇ　１１−　Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉ
ｎｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｓｎ　−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇＡ　ｌａ　−Ａｓｎ　
−ＡＩａ−Ｌ　ｅｕ−１ｅｕ−Ａ　ｌａ　−ＡｓｎＧｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａｒｑ−Ａｓｐ　−
ＡｓｎＧＩｎ−１ｅｕ−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−ｐｒｏ−
８ｅｒ−１３１ｕＧ　ｌｙ　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ
−１１ｅ−Ｔｙｒ　−３ｅｒＧｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＧｌｎＧ　ｌｙ　−ＣＶｓ　
−Ｐ　ｒｏ−３ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌＬ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　　１ｅ−
８ｅｒＡ　ｒｑ−１ｌｅ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−
Ｔｙｒ−Ｇ　ＩｎＴｈｒ　−１ｙｓ　−Ｖａｌ　−Ａ　
ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−３ｅｒＡｌａ−Ｉ　　１
ｅ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＧｌｎＡ　ｒｇ
−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　１ｕ−Ｇ
　ｌｙ−八１ａＧｌｕ−△ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−
Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕＰｒｏ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＶａｌＰｂｅ−Ｇｌｎ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ△ｒｇ−Ｌｅｕ
−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−ＡｓｎＡ　ｒ！
ｌＩ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　ＳＤ−Ｔｌ／ｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　
Ｓｐ−Ｐ　ｈｅＡ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　１
ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒＰｈｅ−Ｇｌｙ　−
Ｉ　１ｅ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを］−卜す
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られたヒトＴＮＦｉ伝子弁環型プラス
ミドＩＩＴＮＦ　４０１Ａ、実施例５で得られた新規抗
腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮ
Ｆ６４３を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−
株を、３０〜５０μｇ／ｄのアンピシリン。

０．２％のグルコース及びＡｕｇ／ｄｌのカザミノ酸を
含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％
に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣ１−０，１％Ｎ８４
ＣＦ水溶液（１）Ｈ７，４）をオートクレーブ滅菌した
後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭｇＳＯ４水溶液
及びＣａ（Ｊ２水溶液をそれぞれ最終１１％度２ｎ＋Ｍ
及び０．１１１１Ｍになるように加える。］　　２２５
０ｍに接種し、ＯＤｇρρが０．７に達するまで、３７
℃で振どう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ
／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加
し、さらに３７℃で１２時間振とう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　　（１５０ｍＭ　　ＮａＣＲを含む２０１１Ｍリン酸
バッファー、　　１１Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄を
行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファーに
懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型）
を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣の
除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
１１ｃｊバツフア　−（ｔ）Ｈ６，８）　、　ＳＤＳ、
　　２メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞ
れ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるように
加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し鉛末
、遺伝、　３１．４３　（１９７７）］を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

Ｔ　ｒｉｓ−グリシン系［Ｕ　、　Ｋ、　Ｌ　ａｅｍｍ
ｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の弁用の確認を行なった。結果の一部をスケッチして、
第１１図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
８−９３０型）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペ
プチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行
なった。その結果、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ　４０１Ａを有する大腸菌においては全細胞
質蛋白質の約１３．７％の新規抗腫瘍活性ポリフペプチ
ド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ６４３を有する大
腸菌においては同じく約１３．９％の抗腫瘍活性ポリペ
プチドの産生が、それぞれ認められた。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記Ｒｕｎの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試Ｆ
８１．１００μρと、４　Ｘ　１０”個／ｄの濃度のマ
ウスＬ−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）懸
濁液１００μ」を、９６穴の組織培養用マイクロプレー
ト（コースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃
度１μｇ／ｍのアクヂノマイシンＤ（コスメゲン、萬有
製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７°Ｃで１８〜２０時間培養し
た後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／
ｖｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏ
ｌ　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたちのコ
を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオ
レットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイ
オレットを１００μすの０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し
、その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライ
ザー（東洋側器。

ＥＴ’１−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残
った細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチ
ド等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照
の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希
釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によって求め、そ
の希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現
型プラスミドＩ）ＴＮＦ　４０１Ａにコードされるヒト
ＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１００μすは１
．１×１０６ユニツト程度の活性を、発現型プラスミド
ｐＴＮＦ６４３にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼート　１０Ｏｌ１隻は約２，８
ｘ　１０６ユニツト程度の活性を、それぞれ有している
ことが明らかになった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれる
総蛋白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ
・ラッド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用い
た検量線より計算した。上記で得られた発現量、活性の
値及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の
比活性を計算したところ、表１のような値が得られた。

表１より、ｐＴＮＦ６４３にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約３倍の比活性を
有していることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の部を有するプラスミドｐＴＮ
Ｆ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びＤＴＮＦ３の作成方法を、
それぞれ示し１〔ものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎの作
成方法を、第７図は発現ベクター　ｐＡ　Ａ　４１の作
成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発規型プラ
スミド１）ＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示し
たものである。第９図は抗ｌｌ！瘍活性ポリペプチド遺
伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４７１の作成方法を示
したものである。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ６４３の作成方法
を示したものである。第１１図はヒトＴＮＦ遺伝子及び
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示
したものである。第１２図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規
抗腫瘍活性ポリペプチドのｎ　ｖｉｔｒｏ抗癌活性測定
結果を示したものである。 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 Ｃ）コ ○乙 Ｃ）■ Ｃ）○ μ口 〔ワフ （〕■ −の と−■ す２　　　　（Ｊｆニ （ノー しく ヒ曽 Ｃば） ￥　廿 く−４ンタ２トＴｔｔ「

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリ ペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する請求項１記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６４３である
   請求項３記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする請求項７記載の微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
    配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。