JPS63198996A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

新規生理活性ポリペプチド

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JPS63198996A
JPS63198996A JP62029811A JP2981187A JPS63198996A JP S63198996 A JPS63198996 A JP S63198996A JP 62029811 A JP62029811 A JP 62029811A JP 2981187 A JP2981187 A JP 2981187A JP S63198996 A JPS63198996 A JP S63198996A
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JP
Japan
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polypeptide
amino acid
acid sequence
plasmid
gene
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Application number
JP62029811A
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English (en)
Inventor
Satoshi Nakamura
聡 中村
Tsukio Sakugi
柵木　津希夫
Kazuo Kitai
北井　一男
Kenji Yone
米　賢二
Kaku Katou
加藤　革
Jun Suzuki
純 鈴木
Yataro Ichikawa
市川　弥太郎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Teijin Ltd
Original Assignee
Teijin Ltd
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
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  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリベプチード、該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プ
ラスミドによって形質転換された組換え微生物１１胞及
び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製
造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新
規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと
略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ
領域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形
質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用い
た新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。
本川１８Ｉにおいて、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰ
ＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。
ＡＩａＬ−アラニン ＡｒｔｌｌＬ−アルギニン ＡＳｎＬ−アスパラギン ＡＳｐ　Ｌ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｇｌｎ　　Ｌ−グルタミン Ｇｌｕ　　Ｌ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン ）１ｉｓｌ−−ヒスチジン １１ｅＬ−イソロイシン １−ｅｕＬ−０イシン ｃｙｓ　　Ｌ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン Ｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニン Ｐｒ０Ｌ−プロリン ｓｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン　　　　Ｔｙｒ　　Ｌ−
チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。
Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）ざらに、（ＨｚＮ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３′）
はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示
すものである。
（２）発明の背景 Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ
Ｆａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもある）と
名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　Ｐ　ｒ
ｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、（Ｊ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６
６　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、
しかも種を越えて働（ことから、制癌剤としての利用が
期待されてきた。
最近になって、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴ
ＮＦ遺伝子の発現について報告した［Ｄ、　　Ｐｅｎｎ
１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４
（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、　Ｂｈｉｒ
ａｉ　ら。
Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗・村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１
６０（１９８５）　］　、ｗａｎａら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎ
ａら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９
８５）　］及びＭ　ａｒｌｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ
　ａｒｍｅｎｏｕｔら。
Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、Ｅ３　ｔｏｃｈｅａ＋、、旦、　　
５１５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌
における発現について相ついで報告している。
このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多層に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［８，Ｂｅｕｌｔｅｒ
ら、　Ｎａｔｕｒ１３　。
３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。
Ｑａｌｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、、　　１６
２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　
Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１
９．　５１６（１９８６）　１等が報告されている。
一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。
このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。
ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ　ｓ　ｌｆ及びＣｙ３／＃／のいず
れか又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願
公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６１＝１０６７
７２）　、Ｇ　１ｙｚＪＪの他のアミノ酸残基への置換
（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０
４８号）。
Ａ１　ａ　ｔｌの他のアミノ酸残塁への置換（特願昭６
１−２３３３３７Ｍ　）が報告されている。また、アミ
ノ末端側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸
欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６
１−５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害
活性を有していること（特願昭６１−９００８７号）、
１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有してお
り、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極
大になること（ＰＣＴ出願公Ｋ　Ｗ　Ｏ８６／　０２３
８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有
していること（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１
１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特願昭６１−１７３８２２号）が報告されている。
そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。
（３）　　発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。
本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。
本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。
本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。
（４）発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ　）　−Ａｒｏ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　
ａｔ　−Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ
　ｅｕ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｒＯ−Ａ　　ｌａ
−Ａ　５ｎ−Ａ　　ｌａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　
　Ｉａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　ＩＶ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　１ｕ−Ｌ
　ｅｔｌ−Ａ　ｒＱ−Ａ　５ｌ）−Ａ　Ｓｎ−〇　Ｉｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−５ｅｒ−Ｇ　
ｌｕ　−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　１ｅ−
Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
ＬＶＳ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　１ｎ−Ｇ　＋ｙ−ＣｙＳ−Ｐ　
ｒＯ−Ｓ　ｅｒ−Ｔｈｒ−ＨｉＳ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　　Ｉｅ−５ｅｒ−
ＡｒＱ−１１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔｌｒ−Ｇ
ｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｉ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−１−ｅｕ−Ｌｅ
ｕ−５ｅｒ−Ａ　ｌａ　−１１ｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒＱ
　−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ
　Ｉｙ　−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｙ
ｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　ｌｕ
　−Ｐ　ｒｏ　−１１ｅ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｖａｌ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ
　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ　−
Ａ　３１）　−Ａ　ｒＱ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ　−Ａ　ｌａ
−Ｇ　Ｉｕ−Ｉ　Ｉｓ−Ａ　５ｎ−Ａ　ｒｑ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ａ　ｓｐ　−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ＳＥ）
　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−５ｅｒ−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌ
ｙ　−Ｉ　ｌｅ　−１１ｅ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　
−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを提供するこ
とによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを
提供することによって達成され、更にかくして得られた
組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物
細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供することによ
って達成されることがわかった。
以下本発明について更に詳細に説明する。
（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ、　Ｐ
ｅｎｎ１Ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドンの
中から適当なものを選び、それを化学合成することによ
って取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては、
用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが望
ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行なえ
るように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位を
設けることが望ましい。
また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。
ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。
上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。
さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。
上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。
”　Ｓ　０１ｌｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅＶｅｌｏ
ｐＨｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｉｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　
Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｆＢ
　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”、
　　Ｊｏｈｎ　　　Ｗｉｌｅｙａｎｄ　　　５ｏｎｓ　
、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）
　　］。
トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ
。
Ａｍ、　　Ｃｈｅｉｌ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１
（１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉら。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７１
９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作の
簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホスフ
ァイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロマ
トグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いるこ
とができる。
こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ３ｍ伝子を作成する方
法としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつか乃ブロ
ックに分けて連結し、たとえば１）ＢＲ３２２［Ｆ　、
　　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　
９５（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン
化した後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する
方法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成す
るブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ま
しくはＥＩＴＮＦＩＢＲ。
ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。
上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＯ＜シャイン・ダルガーノ）配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。
ラクトース・オペロンφプロモーター（Ｉａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　Ｉｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。　ｔｒｐプロモーターを
有するプラスミドとして、好ましくはｐＹ　８３１Ｎ　
、又はＭＡ４１が用いられる。
ざらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−１ｔｒｐターミネータ−等があげ
られるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適で
あり、ｔｒ’ｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミド
として、好ましくはＥＲＡ　Ａ　４１が用いられる。こ
の発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＥＩＢＲ３２２
由来のベクターにクローン化することにより、発現型プ
ラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又ハＤＴＮ
Ｆ　４０１Ａが用いられる。
（８）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗ＩＩ！ｌＷ４活性ポリペプチド遺伝
子発現型プラスミドとして、好ましくはＩ）ＴＮＦＡ６
８が用いられる。
（Ｃ）発現確認及び活性評１ｉｉｉ： ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、ｕ母等があげられるが、とりわけ大腸菌〔エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａ
ｒｄら。
Ｑｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７Ｂ）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−１−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。
このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎａ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照】があげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
撮とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、・プ
ロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−イン
ドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。
培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。
発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。
このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　Ｉら。
前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。
Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、、ユ２６．　２３５　（１９８１）
　１等により行なえるが、測定時間、定量性、測定”の
簡便さ等の点から、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ活性測定法によ
る評価が好ましい。
かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。
以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐｅｎｎ１ｃａら［Ｄ。
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　′７２４　（１９８４）　　］　の報告したヒトＴ
ＮＦ前駆体ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を
基盤として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位
置に設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そし
て３′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ’
）をそれぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上
流にはυ１限酵素Ｃ１ａＩによる切断部位を設け、ＳＤ
配列と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプ
ロモーターとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終
止コドン下流には制限酵素Ｈｉｎｄｎ［による切断部位
を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるよう
にした。
実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦＩ伝子は、第２因に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。
モデル３８０Ａ　）を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。
すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５ｄの溶出用バッファー［５００１Ｍ　
　ＮＨ４０ＡＣ−１ｍｖＥＤＴＡ−０，１％ＳＤＳ　（
ｔ）Ｈ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とうした。
遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行な
った。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル
濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけることに
より、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお、
必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰り
返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかった
。
実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化） 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ３１
伝子を３つのブロックに分けてクローン化した。
０．１〜１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＩ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。
ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（＋）８９．５）　、　１０　ｍ
Ｍ　　Ｍｕ　Ｃ１２゜５　ｍＭジチオスレイトール、１
０１１１Ｍ　　ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、　３０分
間行なった。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオ
チド水溶液をすべて混合し、フェノール抽出、エーテル
抽出によりＩ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除
去する。
この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。
次に、これを減圧乾固した後に、３０μ旦の６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐ＋　７．６）　、　　６．６１
Ｍ　　Ｍ（ｌ　Ｃ１ｚ　。
１０　ｍＭジチオスレイトール、１＋ｅＭＡＴＰ水溶液
に溶解させ、３００ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間Ｍ結反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法に
より泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく
約２２０ｂｐ　）のバンド部分を切出して、実施例２の
方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収
する。
一方、３μりの大腸菌用プラスミド１）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ旦の１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣ１（ＤＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ
１，７ｎ＋ＭＭＱＣ１ｚ水溶液に溶解させ、１０ユニツ
トの制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バイオラブ
ズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。
制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。
エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ旦の５０１１１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ７，４）　、　　１００　ＤＩＭ　
　Ｎａ　Ｃオ、１０℃Ｍ　　ＭＱＳＯ４水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行
ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パターン
の観察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部分を
含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　
、”ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｊＯａ水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。
Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　　
１０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ
　ｂｐのＤＮＡ断片ＣＣ１ａ　ｌ−８ａｌＩ）をアガロ
ースゲルより回収した。
先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ＤのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。
エシェリヒア・コリ０６ＧＯｒ−１−株の形質転換は、
通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｊ１１！のＬ
培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％
ＮａＣｆ、　　ｌ）Ｈ７，２）にエシェリヒア−ｍｌす
Ｃ６００ｒ１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含
む培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｌ−ａ）が０
．３に達するまで生育させる。国体を冷たいマグネシウ
ム・バッフｐ−［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃ１，５１Ｍ　　
ＭＯＣＩ２゜５　ｗＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＥＩＨ
７，６，０℃）］中で２回洗い、２ａｌｌの冷したカル
シウム・バッファー［１００ｓＭｃａ　Ｃ１ｚ　、　２
５０　　ｍＭ　　ＫＣｆ、　５１ＭＭＱ　Ｃ１ｚ　、　
５１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（１）Ｈ７，６゜０℃）
］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。
次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッフ乙
−の中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。
０℃で保った後、１ａｄ！のＬＢＧ培地（１％トリプト
ン、０．５％Ｗ＃母エキス、１％ＮａＣｆ、　　０．０
８％グルコース、　　ｌ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃
で１時間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピ
シリン（シグマ）３０℃ｇ／ｒｄを含むし培地プレート
］に１００μ旦／プレートの割合で接種する。プレート
を３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得
られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を
用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により
、目的のプラスミドＩ）ＴＮＦｌＢＲ（約４．ＯＫ　ｂ
ｐ）の取得を確認した。第３図に、プラスミドＥＩＴＮ
ＦＩＢＲの作成方法を示す。
以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｌ））を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｔｏ＋）を、それぞれ作成した。第４図
及ｑ第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の作成方法を、それぞれ示す。
こうして得られたヒトＴＮＦ３１！伝子の一部を含むプ
ラスミドＩ）ＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ
３の、合成オリゴヌクレオ゛チド使用部分の塩基配列が
設計通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、
Ｍ、Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、
、６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。
実施例４（ヒトＴＮ　ＦｌＩ伝子発子発現型プラスミド
成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ　
Ｉ　Ｈ８ａｌＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。
次に、実施例３で得られたプラスミドＩ）ＴＮＦ２１０
μ９を１００μ旦の１０　ｉ＋Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ
１（ｐＨ７，５）　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　Ｃｆ、　
７１１ＭＭＱＣＩｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰＶｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時
間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準じ
て制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準
じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐのＤ
ＮＡ断片（ＳａｌＩ＋Ｐｖｕ［）　ヲホ’）アクリルア
ミドゲルより回収した。
また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
ｕｇも１００μＭの１０１＋Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐ）ｌ　７，５）　、　ｆ３０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，
７１ＭＭｇＣ１ｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ＰｖｕＩＩ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄ
ｌ［Ｉ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を
行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
ゲルｌＩｒ！１５％）の後、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ
断片（ＰＶＵＩＩ→１−１ｉｎｄｌ［［）をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。
一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドＤ
ＹＳ３１Ｎ（約ａ、７Ｋｂｐ）　５μ９を、上記と同様
に制限酵素ＣＩａＩ及びｈｉｎｄｍで切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３１Ｎの大部分を含む
約４．７Ｋ　ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＣｆａＩ”Ｈｉｎｄ
［ｌ）をアガロースゲルより回収した。
こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂＥｌの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミド１）ＹＳ３１Ｎの大部分を含む約
４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−＋ｅ−株
に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子
発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラ
スミド１）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。
また、上記プラスミドｐＹｓ３１Ｎ５μグを、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕ■で部分分解した模、さらに
制限１素ＨｉｎｄＩ［［で切断し、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準じ
て、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮ
Ａ断片［ＰｖｕＩ［（２］　ＨＨｉｎｄ　ＩＩＩ　］　
’ｊ：アガロースゲルより回収した。
次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕＩＩ［２）ＨＨｉｎｄ　ｍ　］
と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣ６００ｒ−＋ａ−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドＩ）ＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｌ））
を有するクローンを選択した。このようなプラスミドは
、プラスミド１）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制御領域
除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニン
グ・サイトの下流に大腸菌ｔｒｉ）　Ａターミネータ−
を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり
、第７図にその作成方法を示した。
このプラスミドＩ）ＡＡ４１　２μびを、上記と同様に
制限酵素Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｌ［Ｉで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部分
を含む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩＨｌ−
１ｉｎｄｌ［［）をアガロースゲルより回収した。
また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＩＩＴＮＦ　４０１ＮＮ５μグを、上記と同様に制限酵
素Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｎＩで切断し、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐ
のＤＮＡ断片（Ｃａａ　Ｉ　”Ｈｉｎｄ　ｍ　）をポリ
アクリルアミドゲルより回収した。
こうして得られた、プラスミドＤＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝子
全一域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼによるＭ結反路を行なった。
反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。
実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１Ａ２ｏμグを、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、それぞ
れ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤＮ
Ａ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋｂｐ、両方共ｃｌ
ａ　Ｉ＋Ｈｉｎｄ　ｌ１ｌ）をゲルより回収した。
ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ隻の１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆ　　（＋）８　７．４）　　、　　１０１Ｍ　　
　Ｍｌｌ＋　　８０４　　、　１　　　ｆｆ１Ｍジチオ
スレイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵
素Ｈａｔ）ＩＩ（宝酒造）を添加して、３１℃で１時間
切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方
法に準じて、ヒトＴＮＦ３ｉ伝子の大部分を含む約３９
０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａｔ）■−Ｈ１ｎｄｌｌ［）を
ポリアクリルアミドゲルより回収した。
また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。
精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。
反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７）（ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ　Ｉ
　”Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ３Ｈ伝子の大部分
を含む約３９０ｂｐ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ＨａｐＩ
Ｉ＋Ｈｉｎｄｌ［［）と混合し、エタノール沈澱の後、
実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる
連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準
じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１株に導入し、形
質転換株の中より目的のプラスミド１）ＴＮＦ４７５（
約３．２Ｋ　ｂｌ））を有するクローンを選択した。こ
のプラスミドは、次のアミノ酸配列（８２Ｎ）　　　Ａ
ｒＯ５ｅｒ−ＡｒＯｔ−ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　
Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ　１ａ−Ａ　ａｎ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−
Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ
）−Ｌｅｕ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒＱ−Ａ　ｒＱ−Ａ　ｌａ
−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａ
　５ｎ−Ｇ　＋ｙ−Ｖａｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌｅｕ−Ａ　ｒ
ｌＪ−ＡＳｌ）−ＡＳｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＴＶ
ｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｑ　ｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＬＶＳ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ
　＋ｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　
ｌｅ−５ｅｒ−Ａ　ｒＯ−Ｉ　Ｉｅ−Ａ　ｌａ−Ｖａｌ
−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ
−Ａ　ｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ　−Ａ　Ｉａ
　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌｙｓ−８ｅｒ　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−
Ｇｌｎ　−Ａ　ｒＱ−Ｇ　Ｉｕ−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ
　Ｉｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　ｌａ−Ｌ
Ｖｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ
　−１１Ｏ−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｔ　−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌｙｓ−
Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒｏ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａ　
Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｉ　ｌｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒａ−Ｐ　ｒ
ｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐｈｅ−Ａ　
ｌａ−Ｇ　Ｉｕ−５ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ
−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇ＋ｙ−１１ｅ−１１ｅ−ＡＩａ−
Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。
実施例６（発現の確認） 前記実施例４で得られた発現ベクター１）ＡＡ４１゜ヒ
トＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドＥ）ＴＮＦ４０１ＮＮ
又はＩ）ＴＮＦ４０１Ａ、又は実施例５で得られた、新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｐＴ
ＮＦ４７５を有するエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｎ
＋−株を、３０〜５０μｇ　７１１＜のアンピシリン、
０．２％のグルコース及び４＃Ｉ！Ｆ／ｒｄのカザミノ
酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　ｚ　ＨＰＯ４−０，
３％Ｋｚ　ＨＰＯｎ　−０，０５％ＮａＣｆ−０，１％
ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１）Ｈ７，４）をオートクレーブ滅
菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌したｆＶＨ１ｓ
Ｏ４水溶液及びＣａＣｊｚ水溶液をそれぞれ最終濃度２
ＩＭ及び０．１１Ｍになるように加える。１　２００ａ
ａｌｌに接種し、０Ｄｉ−が０．７に達するまで、３７
℃で振どう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μ９
／−の３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加
し、さらに３７℃で１２時時間上う培養を続けた。
遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｐ
　−（１５０１Ｍ　　Ｎａ　Ｃｊを含む２０　ｍＭリン
酸バッファー、　　Ｉ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０−のＰＢＳバッファー
に懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型
）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残漬
の除去を行なった。
得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファ　−（ｐＨ６，８）　、　ＳＤ８．２−
メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ最１
１１２ｆＩ６０１Ｍ、　２％、　４％、　１０％に一ナ
ルにうに加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動［鈴木、遺伝、■、　４３　（１９７７）　］を行な
った。
分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。
Ｔｒｉｓ−グリシン系［ＩＪ、　Ｋ、　ｌ−ａｅｎｉｍ
ｌｉ。
Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０（１９７０）　］を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
プルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発
現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１０図
に示した。
なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナー（島津、
Ｃ８−９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白
質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトＴ
ＮＦ３！ｆｆｉ伝子発現型プラスミドＤＴＮＦ　４０１
Ａを有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１９．
４％のヒトＴＮＦ蛋白質。
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドＥ
ＩＴＮＦ４７５を有する大腸菌においては同じく約１６
．２％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、それぞ
れ認められた。また、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドＩ）ＴＮＦ　４０１ＮＮを有する大腸閑におけるヒト
ＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記、１）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０
１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクターｐＡ　Ａ
　４１の有用性が示された。
実施例７（活性の評価） ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活
性測定は、前記Ｒｕｒｆの方法に準、じて行なった。す
なわち、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質又は新規
抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートを順次
培地で希釈した試料１００μ磨と、４Ｘ１０６個／Ｉｄ
の濃度のマウスＬ−９２９Ｉｌ維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ−９２９）懸濁液１００μ文を、９６穴の組織培養用
マイクロプレート（コースタ−）内で混合した。なおこ
の際に、最終濃度１μ９／ｌｄのアクチノマイシンＤ（
コスメゲン。
萬有製薬）を添加しておく。培地と−しては、５％（ｖ
ｏｌ　／ｖｏｌ　）のつ、シ胎児血清を含むイーグルの
ミニマムφエツセンシャル培地（日永製薬）を用いた。
上記マイクロプレートを、５％炭酸ガスを含む空気中、
３７℃で１８〜２０時間培養した後、クリスタル・バイ
オレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）メタノール水
溶液に、０．５％（Ｗｔ／ＶＯＩ　＞のクリスタル・バ
イオレットを溶解させたもの］を用いて生細胞を染色し
た。余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥し
た後、残ったクリスタル・バイオレットを１００μ磨の
０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５ｎｌにおけ
る吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋調器、ＥＴＹ
−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残った細胞
数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫
瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液
を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌
ライゼートの希釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）に
よって求め、その希釈倍率をユニットと定義する。第１
１図より、発現型プラスミド１）ＴＮＦ４０１Ａにコー
ドされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１
００μ文は１．Ｏｘ　１０Ｇユニット程度の活性を、そ
して発現型プラスミド１）ＴＮＦ４７５にコードされる
新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート１
００μ文は１．８×１０６ユニツトの活性を、それぞれ
有していることが明らかになった。
実施例６で得られた発現型プラスミドｏＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
１）ＴＮＦ４７５にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量は
、プロティンφアッセイ・キット（バイオ・ラッド）を
用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線より
計算した。上記で得られた発現口、活性の値及び蛋白質
定量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比活性を計算したところ、表１のような値が
得られた。表１より、新規抗腫瘍性ポリペプチドはヒト
ＴＮＦ蛋白質の約２．０倍の比活性を有していることが
わかる。
表１１ニドＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗！Ｉ！瘍活性
ポリペプチドの比較
【図面の簡単な説明】
第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドＩ）
ＴＮＦｌＢＲ，ＩＩＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方
法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ　４０１ＮＮの作成
方法を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の作成
方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドＤＴＮＦ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示した
ちのである。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子発現型プラスミドＤＴＮＦ４７５の作成方法を示した
ものである。第１０図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示したもの
である。第１１図はヒトＴＮＦ　　　　■蛋白質及び新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性側　　　１定結果を示
したものである。 鳥、ヰｌ Ｐ／ｕＩ の　り 第１凪のＢ ＰｖｕｌＬ（＋） ＨｉｈＪ　Ｎ− も９巴の８ ＠ｍｄ　Ｌ 拓１０巴 １　ノ／　　ｌ！１ ４　　未罠　イ３８　　鳩≦

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 （ＣＯＯＨ）で表わされる、新規生理活性ポリペプチド
    。 （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
    する第１項記載のポリペプチド。 （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
    るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。 （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
    Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
    項記載のプラスミド。 （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
    Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
    項記載のプラスミド。 （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４６８である
    第３項記載のプラスミド。 （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
    るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
    れた組換え微生物細胞。 （８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
    徴とする第７項記載微生物細胞。 （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
    するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
    された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
    活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
    ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
    る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。 （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。
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