JPH02261393A - 新規生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）産業上の利用分野 本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

木用ＩＩＩにおいて、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰ
ＡＣ−ＩＬＪＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方
法により略記するものとし、たとえば下記の略号を用い
る。

Ａｌａｌ−アラニン ＡｒｏＬ−アルギニン ＡＳｎ　Ｌ−アスパラギン ＡＳＥＩＬ−アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　Ｌ−システィン Ｑｌｎ　　Ｌ−グルタミン ＧｌｕＬ−グルタミン酸 Ｇｌｙ　　グリシン １−１ｔｓｌ、−−ヒスチジン １ｔｅｌ、−イソロイシン ［ｅｕｌ−一ロイシン ＬｙｓＬ−リジン Ｍｅｔ　　Ｌ−メチオニン Ｐｈ１３１−フェニルアラニン ｐｒｏｌ、−プロリン Ｓｅｒ　　Ｌ−セリン Ｔｈｒ　　Ｌ−スレオニン Ｔｒｐ　　Ｌ−トリプトファン Ｔｙｒ　　Ｌ−チロシン Ｖａｌ　　Ｌ−バリン また、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（８２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

（２発明の背景 ＣａｒＳＷｅｌｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａ１ｌ
ｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植した１ｙｌｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕａ＋ｏｒ　　Ｎ　ｅｃ
ｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記すること
もある）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｖｅｌｌら
、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６
６６　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサ
ギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に
、しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用
が期待されてきた。

最近になッテ、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣ
Ｄ　Ｎ　ＡりＯ−ニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の
一次構造を明らかにすると共に、大ｌ！菌におけるヒト
ＴＮＦ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ
　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、　
５ｈｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｆ！　、ユ１３．　８０３　（１９８５）　
］　、宗村ら［宗村ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎａら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｏ
ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８
５）　　］及びＭ　ａｒｌｅｎｏｔｌｔら（Ａ　、　　
Ｍ　ａｒｉｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ＋ｏｃｈｅｓ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌にお
ける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａ１ｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、　　１
６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、
　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３
１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ　ｓ　ｔＰ及びＣｙ　ｓ　／Ｗのい
ずれか又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への
置換（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願
昭６ｌ−１０６７７２）　、　Ｇ　ｌｙ／Ｊ−Ｌの他の
アミノ酸残基への置換（特願昭８１−１０６７７２号、
特願昭６１−２３８０４８号）、Ａｌａ／／の他のアミ
ノ酸残基への置換（特願昭６１−２３３３３７号〉が報
告されている。また、アミン末端側のアミノ酸残基の欠
失についても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特開昭６１−５０９２３号）、７アミ
ノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願
昭６１−９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦ
が細胞障害活性を有しており、その比活性は６〜８アミ
ノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公
開ＷＯ３６／　０２３８１＠）　、　１０アミノ酸欠失
ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１−
１１４７５４号）、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害
活性を有していること（特願昭６１−１７３８２２＠）
　、及び７アミノ酸欠失ＴＮＦを基盤として、Ｐ　ｒｏ
８Ｓ　ｅｒ’　Ａ　３ｐｌ＠をＡ　ｒｇＬ　ＶＳＡ　ｒ
ｌＪへ置換を行なうと、その比活性が大きく上昇するこ
とが報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的 本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）　　発明の構成 本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列 （８２Ｎ）　−ＡｒＱ　　ｔ−ｙｓ−Ａｒ（１−Ｌｙｓ
　−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｌ−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ
　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅＵ−
Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅＵ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒＱ
−Ａ　ｒ’；Ｊ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｌａ−Ｌ　
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｙ　−Ｖ　
ａｌ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒＱ　−Ａ　Ｓ
ｔ）　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｍｅｔ
　−Ｖ　ａｌ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｕ　
−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ　−Ｉ
　Ｉｅ　−Ｔ　ｙｒ−８ｅｒ　−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ−Ｌ
　ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　Ｉ
ｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−）１　ｉｓ−Ｖ
ａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−５ｅｒ−Ａｒａ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｌａ−Ｖａｔ−８ｅ
ｒ−Ｔｙｒ−Ｇｆｎ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓ
ｎ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌｅｕ−８ｅｒ　−Ａ　Ｉａ−Ｉ　ｌ
ｅ−Ｌ　ｙｓ−Ｓ　ｅｒ−Ｐ　ｒｏ−ＣＶｓ−Ｇ　１ｎ
−Ａ　ｒｌｌｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒＯ−Ｇ　
ｌｕ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　Ｉａ　−
Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　
Ｉｕ　−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ−
Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−
Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｙＳ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａｒｏ−Ｌ
ｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ａｓｎ−Ａ　
ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅ
ｌｌ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌ
ｕ−５ｌｌｌｒ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ−ＴＶｒ
−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ
　−（ＣＯＯＨ） で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む相換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ＞ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノＩＩ！ｆｌ　
［Ｄ、　Ｐｅｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつか
のコドンの中から適当なものを選び、それを化学合成す
ることによって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に
際しては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択す
ることが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容
易に行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による
切断部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとり°わけ好ましい
。さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流
に作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適
当なベクターへのクローン化が可能になる。このような
ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“Ｓ　ａｇｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｓ
ａｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　　ｏｆ　　　
Ｐ　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　　ｏ
ｒＢ　ｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　
”　、　Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎ
ｓ　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｃ＞ｒｋ　　（１９
６１）　］　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎａｅｒら、Ｊ
。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９＜１９８０）　Ｊがあるが、合成時間、収率、操作
の簡便Ｃ￥専の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホ
スファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌ
クレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換りＯマドグ
ラフィー、ゲル電気泳動、・逆相カラムによる高速液体
クロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用
いることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦｌＢＲ。

１）ＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＯ＜シャイン・ダルガーノ）配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）、ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、　ｌ
ｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒｐプ
ロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有する
プラスミドとして、好ましくはＩ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎ　、
又はｌ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
＋ｐｐターミネーターｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適であ
り、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドとし
て、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発現
型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばＩ）ＢＲ３２２由来の
ベクターにクローン化することにより、発現型プラスミ
ドが作成できる。ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドと
して、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はＩ）ＴＮＦ　
４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
； こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ６４２が用いら
れる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価； ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性、ポリペプチド遺
伝子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、
枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ
）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
スミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａ
ａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　、Ｌ　　２７９（１９７８）　］を用イ
テ、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００
ｒ−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することがで
きる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ（：、　ｔｏｎｉｎ
ｇ”、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉ−ｎ。

Ｈａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　
　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照Ｊがあげられ、必要に
応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望まし
い。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば
振とうによる通気、撹拌を加えながら、３１℃で２〜３
６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロ
モーターを効率良く機能させる目的で、３−β−インド
ールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培１したとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集め
、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超音
波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離によ
り組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたライ
ゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下、
ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミドゲ
ルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質を
適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規族ａｍ活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭ　ｅｔｈへ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　
ｖｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら、前出）、マ
ウスし細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　ｖｉｔｒ
ｏ活性測定法［Ｒｕｒｒ　、　Ｊ、　　Ｉ　ｍ５ｕｎｏ
１．、１２６．　２３５（１９８１）　）等により行な
える。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティーφカラ
ム中クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗ＩＩＩ瘍活性ポリペプチド精製品を用いる
ことにより、ｉｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作
用に関する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ｖ＋ｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計） 第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　　］の報告したヒトＴＮＦ前駆
体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤とし
て、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け
、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′側
に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれぞ
れ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限
酵素Ｃ１ａ工による切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開
始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターと
の連結を可能にした。更に、３′側１１１ｉＲ終止コド
ン下流には制限ｗ！！素ＨｉｎｄｌｌＩによる切断部位
を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるよう
にした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成＊＜アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　’）を用いて、ホスファイト法により
行なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライ
ド・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった
。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア
水溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保
護基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル
（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量
の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７
Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５ｄの溶出用バッファー［５００１Ｍ
　　ＮＨ４０ＡＣ−１１１１ＭＥＤＴＡ−０，１％ＳＤ
Ｓ　（１）Ｈ７，５）　］を加え、３７℃で一晩振とう
した。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収
を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液
をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかける
ことにより、合成オリゴヌクレオチドのＬｌ　１品を得
た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上
をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化〉 実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＩ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μρの５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ９，５＞　、　１０　ｍＭ
　　ＭＯＣＩ２゜５　　ｍＭジチオスレイトール、１０
ｍＭＡ王Ｐ水溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。

反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液を
すべて混合し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＩ
４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ３の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ文の６６　＋１
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（１）Ｈγ、６）　、　　６．６
１Ｍ　　ＭＯＣＩ２゜１０　ａ＋ｌｙｌジチオスレイト
ール、１１ＭＡＴＰ水溶液に溶解させ、３００ユニツト
の７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）を加えて、１１℃で
１５時間連結反応を行なった。反応終了後、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、エチ
ジウムブロマイド染色法により泳動パターンの観察を行
なう。目的とする大きさ（約２２０ｂｐ）のバンド部分
を切出して、実施例２の方法に従ってポリアクリルアミ
ドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μグの大腸菌用プラスミドＤＢＲ３２２（約４
．４Ｋ　ｂｐ＞を３０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ＋ｓ
−ＨＣｆ（ＤＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　（
Ｊ、　７　ｍＭＭｇＣ１２水溶液に溶解させ、１０ユニ
ツトの制限酵素ＣｊａＩにューイングランド・パイオラ
ブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった
。

制限酵素ＣＪａＩによる切断の優、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μρの５０１ＭＴｒ＋５−
ＨＣｆ　（１）Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　Ｎ
ａ　Ｃｆ、１０ＩＭ　　ＭＯ８Ｏ＊水溶液に溶解させ、
１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後、
アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）を行ない
、エチジウムブロマイド染色法により切断パターンのＢ
察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部分を含む
約３．７）（ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンドを切
出し、そのアガロースゲル断片を３倍聞（ｖｏｌ　／Ｗ
ｔ）　（１）８Ｍ　　Ｎａ　ＣｌＯ４水溶液に溶解させ
た。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１０
１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａＩ←５ａｌＩ）をアガロースゲ
ルより回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

■シエリヒア・コリＣ６００ｒ−１−株の形質転換は、
通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ａｅのし培地
（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ
　Ｃ１，ｌ）Ｈ７，２）にエシェリヒア−］すＣ６００
ｒ１−株の１８時間培養基を接種し、国体を含む培養液
の６００ｎｌにおける濁度（ＯＤｚ−ｐ）が０．３に達
するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・ハラ
７Ｆ−［０，１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，５ｓＭ　　ＭＱ　Ｃ
１ｚ　。

５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ７，６，０℃）
１中で２回洗い、２Ｉ１１の冷したカルシウム・バッフ
？−［１００ｗＭｃａ　　Ｃ１ｚ　　、　　２５０　　
１Ｍ　　　ＫＣｌ、　　５　　ｗＭＭ（ｌ　Ｃ１ｚ　、
　５１Ｍ　　ＴｒｉＳ−ＨＣＩ　（ｆｌＨ７，６゜０℃
）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１７１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ａｔ、：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１−のＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％Ｗ９母エキス、１％ＮａＣｆ、　　０．０８％
グルコース、　　Ｅ）Ｈ７，２）を添加し、３１℃で１
時間振どう培養する。培養液を、選択培地〔７ンビシリ
ン〈シグマ）３０μｇ／−を含むし培地プレート］に１
００μ旦／プレートの割合で接種する。プレートを３７
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られた
アンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いて
［）ＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドＤＴＮＦＩＢＲ（約４．０Ｋ　ｂｐ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミド０ＴＮＦ２Ｎ
＜約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋｂｐ＞　ヲ、ツレツレ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドρＴＮＦＩＢＲ，１）ＴＮＦ２Ｎ及びｏＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、
　Ｍａｘａａ＋ら、　ＭｅｔｈＯｄＳＥｎｚｙｍｏｌ、
、６５．　４９９（ｆ９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成） 実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｆａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル１
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　
ＩＨ８ａｌＩ）をボＩＪ　７　りＩＪ　ルアミドゲルよ
り回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μ９ヲ１ｏｏμｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐＨ７，５）　　、　　６０　　ｍＭ　　　Ｎａ　　
Ｃ１，７１ＭＭ０ＣＩ２水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で
１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に
準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｌ
）のＤＮＡ断片（ＳａｌＩ４−４Ｐｖｕｌｌ）をポリア
クリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μ９も　１００１１１の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｔｓ−Ｈ
Ｃ１（ｐＨ７，５）　　、　　６０　　ｍＭ　　　Ｎａ
　　ｃｘ、　　７　１ＭＭｇＣ１２水溶液に溶解させ、
４０ユニツトの制限酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制
限酵素１−１ｉｎｄＩ［［（宝酒造）を添加し、３７℃
で１時間切断反応を行なった。そして、ボ・リアクリル
アミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０
ｂｐのＤＮＡ断片（ＰｖｕＩ［＋Ｈｉｎｄ　ｍ）ｔｒホ
’）７’ｙ’））Ｉｔ７ミトゲルより回収した。

一方、大１！自ｔｒｐプロモーターを有するプラスミド
ｐＹｓ３１Ｎ（約４．７ＫＩｏ＋）　５μ９を、上記と
同様に制限酵素ＣＪａＩ及びＨｉｎｄｌｌ！で切断し、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実
施例３の方法に準じて、プラスミドＩ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎ
の大部分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ
ｌｍｌ−１ｉｎｄｌ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドＩ）Ｙ　Ｓ　３ＩＮの大部分を含む
約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−一一株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ　ｂｐ
＞を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラス
ミドＩＩＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドＥＩＹＳ３１Ｎ５μ９を、上記の
方法に準じて制限酵素ＰｖｕＩ［で部分分解した優、さ
らに制限酵素）１ｉｎｄｌ［で切断し、アガロースゲル
電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に
準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐの
ＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２）＋Ｈｉｎｄ　ｍ　］をア
ガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２，７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰＶｔｌＴｉ（′２Ｊ−Ｈｉｎｄ　Ｉ
ＩＩ　］　トｍ合り、、、１り／−／Ｌｚ沈澱の後、実
施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連
結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じ
てエシェリヒア◆コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形
質転換株の中より目的のプラスミドＥ）ＡＡ４１（約２
．７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このような
プラスミドは、プラスミドＥ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎからコピ
ー数制御領域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在
するクローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａタ
ーミネータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベ
クターであり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミド１）ＡＡ４１　２μグを、上記と同様に
制限酵素ＣｊａＩ及び）ｌｉｎｄｎｌで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分を
含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃ１ａＩ＊−＋Ｈ
ｉｎｄｌｌ［）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ　４０１ＮＮ５μグを、上記と同様に制限酵
素Ｃ１ａＩ及びＨｉｎｄｍで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ３ｉ伝子全域を含む約４９０ｂｐ
のＤＮＡ断片（Ｃｊａ　Ｉ　ＨＨｉｎｄ　ＩＩＩ　）を
ポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ３１
１伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｇ＋−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成） 実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ　４０１Ａ２０μりを、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌｌｌで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びア
ガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、それ
ぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つのＤ
ＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋｂｐ、両方共Ｃ
１ａ　Ｉ　ＭＨｉｎｄ　Ｍ　）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣオ　（ＩＩ８　７．４）　　、　　１０　　ｓＭ
　　　ＭＯ８０４、１１Ｍジチオスレイトール水溶液に
溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩ［（宝酒造
）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反
応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａ
ｐ■→）−１ｉｎｄｌｌｌ＞をポリアクリルアミドゲル
より回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ　Ｉ”
Ｈｉｎｄ　［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約
３９０ｂ１１のＤＮＡ断片（ＨａｐＩ［−Ｈｌｎｄｌｎ
）と混合し、エタノール沈澱の模、実施例３の方法に準
じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった
。反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・
コリＣ６００ｒ−１−株に導入し、形質転換株の中より
目的のプラスミドＤＴＮＦ４７１（約３．２Ｋ　ｂｐ）
を有するクローンを選択した。このプラスミドは、次の
アミノ酸配列（＋２　　Ｎ　）−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒ
ｃ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｑ　
Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｑ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｔｌ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｌＪ
−Ａ　Ｓｎ−Ａｒｇ−Ａ　ｒＱ−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　
−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ
−Ａ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　Ｉ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ
　ＶＳ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ−ＣＶｓ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖ　ａ
ｔ　−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｔｓ−Ｔｈｒ−１１
ｅ−８ｅｒ−Ａ　ｒＱ−［１ｅ−Ａ　Ｉａ−Ｖａｌ−５
ｅｒ−ｒｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　ｙｓ−Ｖａｌ
−Ａ　ｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−△Ｉａ　−１
１ｅ　−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａ
　ｒｇ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　
Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ−Ａ　Ｉａ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｖｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐｒｏ
　−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ
　−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｙ
ｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒａ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅ
ｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−１１ｅ−Ａ　５ｎ−Ａ　ｒｉ
ｌｌ　−Ｐ　ｒＯ−Ａ　３＋１−　Ｔ　Ｖｒ　−Ｌ　８
１Ｊ−Ａ　ＳＤ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　
ｅｒ−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−
ＧＩｙ　−Ｉ　Ｉｓ　−Ｉ　＋５−Ａ　ｌａ　−Ｌｅｕ
　−（ＣＯＯＨ） で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。

一方、上記で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド１１ＴＮＦ　４７１　２０μ９を、実施例４の方法に
準じて制限酵素Ｈｉｎｄｌで切断した後、５０ｍＭ　　
　　Ｔｒｉｓ　　−Ｈ（Ｊ　　（＋１　■　　７．４）
　　、　　１００　　ｍ　　ＭＮａ　Ｃ１，１０１Ｍ　
　Ｍ（Ｊ　ＳＯｓ水溶液中で制限酵素ＮＣ０Ｉ（宝酒造
）による切断反応を３７℃で１時間行なう。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．７％）及びポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行な
い、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部
を含む約１４０ｂｌ）のＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎ
ｄ　１１）をポリアクリルアミドゲルより、そして実施
例３の方法に準じて、ｐＴＮＦ４７１の大部分を含む約
３．０ＫｂｏのＤＮＡ断片（ＮＯｏ工ＨＨ＋ｎｄ　ＩＩ
Ｉ）を７７ｊ０−スゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣ
ＯＩ　ＭＨｉｎｄ　ｌ［［）を５０μ文の１０１Ｍ　　
Ｔｒｉ３−ＨＣｆ　（ｐｔ−＋　７．４）　、　１０１
Ｍ　　Ｍ（Ｊ　ＳＯｓ　、　１−Ｍジチオスレイトール
水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素ＡＣＣＩ（
宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気法１ｌＩ
（ゲル濃度８％）を行ない、実施例２の方法に準じて、
ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断
片（Ｎ　ｃ。

ＩＭＡＣＣＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。４１られた２本の合成オリゴヌクレオチドそ
れぞれ０．５μりについて、実施例３の方法に準じて、
末端のリン酸化を行ない、アニルリングを行なった。

アニーリングの債、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．０Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＮＣ
ＯＩ”ｌｎｄ　Ｉ［［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の部含む
約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ＡｃｃＩ）と混
合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準じて、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応
終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ
６００ｒ−１−株に導入し、形質転換株の中より目的の
プラスミドｐＴＮＦ６４２（約３．２Ｋｂｐ）を有する
クローンを選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸
配列 （Ｈ２Ｎ　＞　　Ａｒ１１ｌ　　Ｌｙｓ−Ａｒ（ｌ　　
ＬｙＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｈｉｓ
　−Ｖ　ａｔ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　
−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−
Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒ
ｐ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｎ−Ａ　ｒｏ−△「ｇＡ　Ｉａ−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ−Ｇ　Ｉ
ｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　Ｓｔ）　−Ａ　ｓｎ
　−Ｇｌｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ−
８ｅｒ−ＧｌｕＧ　ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ
　ｌｅ　−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｔ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−８ｅｒＡ　
ｒａ−１１ｅ　−Ａ　Ｉａ　−Ｖａｌ　−３ｅｒ　−Ｔ
ｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−工ｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｔ−Ａｓｎ
−Ｌ　ｅｕ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　Ｉａ　−１１ｅ　−
Ｌｙｓ−８ｅｒ　−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＧｉｎＡ　ｒｇ　
−Ｇ　ＩＬＩ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ
　Ｉｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ−Ｌ　ＶＳ−
Ｐ　ｒＯ−Ｔ　ｒＥ）−Ｔ　Ｖｒ　−Ｇ　１ｕＰｒｏ−
１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ＧＩ’Ｖ−ＧＩＶ−Ｖａｌ−
Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ
　ＶＳ　−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａ　ｒｇ　−１ｅｕ　
−Ｓｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｇｌｕ　−１１ｅ　−Ａ　ｓ
ｎ　−Δｒｇ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　５ＥＩ−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ
　ｅｌｌ　−Ａ　Ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ
−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　−Ｉ　Ｉｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（
ＣＯＯＨ） で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ン末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認） 実施例５で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミド１）ＴＮＦ６４２を有するエシェリヒ
ア・コリＣｅｏｏｒ−＋ｅ−株を、３０〜５０μ９／ｌ
ｄのアンピシリン、０．２％のグルコース及び４ＩＲ９
／ｄのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　
ＨＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯ＜　−０，０５％Ｎａ
ＣＪ−０，１％ＮＨ４Ｃｌ水溶液（Ｄ）−１７，４）を
オートクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅
菌したＭＣｌＳＯ４水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれ
ぞれ最終濃度２　ｍＭ及び０．１　ｍＭになるように加
える。］　　２．５０ｍに接種し、０Ｄｉ−ａが０，７
に達するまで、３７℃で振とう培養を行なった。次いで
、最終濃度５０μ９７ａｔの３−β−インドールアクリ
ル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時間撮と
う培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッフｙ
　−（１５０１１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０　ｍＭ　
ＩＪ　ン酸バッファー、　　ＥＩＨ７，４）を用いて菌
体の洗浄を行なった。洗浄模の菌体を１０ｄのＰＢＳバ
ッファーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２
００Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により
菌体残漬の除去を行なった・ 得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッＶｐ　−（ＤＨ６，８）　、　ＳＤＳ、　２
−メルカプトエタノール、グリセ０−ルを、それぞれ最
終濃度６０１ｇＭ、２％、４％、１０％になるように加
え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木、
遺伝、　３１．４３　（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。

Ｔ　ｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｓｌｔ
。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部をスケッチして、
第１１図に示した。

実施例７（活性の評価） 新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記ＲｕＨの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ又と、４　ｘ　１０’個／ｄの濃度のマウスＬ
−９２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ９２９）懸濁液１
００μ文を、９６穴の組織培養用マイクロプレート（コ
ースタ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度１μ
９／ｄのアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）
を添加してお（。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ
　）のクリスタル・バイオレットを溶解させたもの］を
用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレ
ットを洗い流し乾燥した侵、残ったクリスタル・バイオ
レットを１００μρの０．５％ＳＯ８水溶液で抽出し、
その５９５ｎ−における吸光度をＥＬＩＳＡアナライザ
ー（東洋側器。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ（たとえば第１２図）によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現型
プラスミドｐＴＮＦ６４２にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート　１００μ文は
約５，１３　Ｘ１０６ユニツト程度の活性を有している
ことが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮ　Ｆ３！伝子の一部を有するプラスミド
ＤＴＮＦ１ＢＲ，Ｉ）ＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成
方法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮ
Ｆ遺伝子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ
の作成方法を、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１
の作成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型
プラスミドｐｒＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示
したものである。第９図は抗腫層活性ポリペプチド遺伝
子発現型プラスミドｆ）ＴＮＦ４７１の作成方法を示し
たものである。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６４２の作成方法を示
したものである。第１１図は新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子の発現確認結果を示したものである。第１２図
は新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ｖｉｔｒｏ抗癌
活性測定結果を示したものである。 ｌｃ４ｒＭ 特許出願人　帝　人　株　式　会　社 ｖＩＩＩ 第 図 第７図のＡ Ｔ１）−一−−−−−−→ （５−）−ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧ
ＣＧＧＧＣＴＴＴＴＴＴＴＴ−（３″）（３−）−ＡＴ
ＣＧＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡ
ＡＡ−（５＝　）（２）−−→ 第 図 Ｈｔｎｄｌ［Ｉ 第 図 の ｐｖｕｆｆ（１） 第 図 の ｉｎｄｌｌ 第１０図のＡ （１）□ （５’　）−ＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣ
ＣＴＧＴＧＡＴＡ−（３’　）嘔 日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる、新規生理活性ポリ ペプチド。
2. （２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
   する請求項１記載のポリペプチド。
3. （３）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
4. （４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
5. （５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列 【遺伝子配列があります】 で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
   Ａとから成る一本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
   項３記載のプラスミド。
6. （６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６４２である
   請求項３記載のプラスミド。
7. （７）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
   るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
   れた組換え微生物細胞。
8. （８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
   徴とする請求項７記載の微生物細胞。
9. （９）次のアミノ酸配列 【アミノ酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
   ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
   するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
   された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
   活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
   ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
   る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
10. （１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
    酸配列があります】 で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
    ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
    医薬組成物。