JPH0361495A

JPH0361495A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH0361495A
Application number: JP19670989A
Authority: JP
Inventors: Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Satoshi Nakamura; 聡中村; Kaku Katou; 加藤　革; Kazuo Kitai; 北井　一男; Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-07-31
Filing date: 1989-07-31
Publication date: 1991-03-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡｆＩ４域を含む組換えプラスミド、該
プラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞及
び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製
造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新
規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと
略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｍ域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形
質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用い
た新規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

水田ｉｓにおいて、アミノ酸、ポリペプチドはＩＬＪＰ
ＡＣ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法
により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる
。

ＡＩａＬ−アラニンＡｒ（ＩＬ−アルギニンＡＳｎＬ−アスパラギンＡｓｐＬ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧｉｎ　　Ｌ−グルタミンＧｌｕｍ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシン）−１ｉｓｌ−−ヒスチジン１１ｅ　Ｌ−イソロイシン１−ｅｕｌ−一ロイシンＬｙｓ　　Ｌ−リジンＭｅｔ　し−メチオニンｐｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−−プロリン３ｅｒｌ、−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐＬ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｌ　　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。〉Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。〉Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。〉さらに、（８２Ｎ）−及び−（０００
口）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカルボ
キシ末端側を示すものであり、（５′　〉−及び（３′
）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を
示すものである。

〈発明の背景〉Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓ
ｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもある
）と名づけた［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら、　
Ｐ　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　、このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になッテ、ｐＱｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　ｅ
ｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７
２４（１９８４）　］　、その後、０井ら［Ｔ、　５ｈ
ｉｒａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎ（１ら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎ
ａら、　３ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９
８５）　］及びＭ　ａｒ＋ｕｅｎｏｕｔら［Ａ　、　Ｍ
　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、Ｊ、　３ｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１５
（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌におけ
る発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［３，３ｅｕｌｔｅｒ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　１　、カケクチンが
リボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　ＥｘｐｏＭａｄ、、　　１６２
．２１６３（１９８５）コ、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ，Ｂ
ｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、ユ１９．　５１
６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を６１製する研究が、
数多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓ’！及びｃｙ　ｓ′Ｊ／のいずれ
か又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願公
開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６１１０６７７２
＞　、Ｇ　ｌｙ／−ＬＬの他のアミノ酸残基への置換（
特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４
８号）。

Ａ１ａ１８の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−
２３３３３７号〉が報告されている。また、アミノ末端
側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−５
０９２３号〉、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特願昭６１−９００８７号）、１〜１
０アミノ酸欠失ＴＮＦが１１１ｇ１障害活性を有してお
り、その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極
大になること（ＰＣＴ出願公１ｍ　Ｗ　Ｏ８６／　０２
３８１号〉、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特願昭６１−１１４７５４号）、及び
１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しているこ
と（特願昭６１−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上１反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

〈発明の目的〉本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

〈発明の構成〉本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（口２　Ｎ＞　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ−ＬｙｓＰｒ
ｏ−Ｖａｔ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ
　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｎ−Ａ　Ｉａ　−
Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１ｎ−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｔ　ｒＤ　−Ｌ　ｅｌｌ　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒ
Ｑ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ
　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　
−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ａ　ｒｇ−Ａ　ｓｐ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　
ｅｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅ
ｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｌｅ
ｕ　−Ｉ　１ｅ−Ｔｙｒ−８ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　
ａｌ　−Ｌ　ｅｕ−Ｐ　ｈｅ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ
　Ｉｕ　−Ｇ　ＩＶ　−ＣｙＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ｔ　ｈｒ−口１ｓ−Ｖａｌ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ
　−Ｔ　ｈｒ−口ｉｓ　−Ｔ　ｈｒ　−１ｌｅ　−３ｅ
ｒ　−Ａ　ｒＱ　−１１ｅ　−Ａ　Ｉａ　−Ｖａｔ　−
Ｓｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｑ　Ｉｎ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　
−Ｖａｔ　−Ａｓｎ　−Ｌｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓｅｒ
　−Ａｌａ　−１１ｅ−Ｌｙｓ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−ｃｙ
ｓ−Ｇｌｎ　−Ａ　ｒＱ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ
　Ｉｕ　−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ＶＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ
　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｐｒｏ　−１１ｅ−Ｔｙ
ｒ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｔ　−Ｐ　ｈｅ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ＩＬＩ　−Ｌ　ｙｓ　
−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｓｏ　−Ａ　ｒＱ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ｓ　ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｉ　ｌｅ　−Ａ
　ｓｎ　−Ａ　ｒＣｌ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ｔ
　Ｖｒ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｓｔ）　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　
ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−Ｉ
　Ｉｅ　−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌ　ｅｕ　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを包含する。

また上記新規族１１瘍活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端に１ｙｌｅｔが結合したポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを包含する。

組換えプラスミドとして下記の塩基配列（５’　）−Ｃ
ＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡ
ＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡ
ＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣ
ＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ
ＧＡＧＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＣ
ＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣ
ＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴ
ＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣ
ＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣ
ＴＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡ
ＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧ
ＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴ
ＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡ
ＡＴＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴ
ＴＴＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴ
ＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＧ−（３’）で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本ｌＤＮ
Ａとから成る二本ｌＤＮＡを含むプラスミドが挙げられ
る。

あるいは次の塩基配列（５’　）−ＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣ
ＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧ
ＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡΔＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡ
ＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＧＴＧＡＣ
ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡ
ＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡ
ＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣ
ＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ
ＧＡＧＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＣ
ＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣ
ＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴ
ＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧ（、ＣＧＴ
ＣＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣ
ＣＴＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣ：ＴＧＣ
ＣＡＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧ
ＡＧＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡ　
Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｔ、ＣＴ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ
　Ｇ　Ｔ　ＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＴＧ
ΔＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＡＴＣＧ
ＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧ
ＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡ
ＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴＴ−（３’　　）
で表わされる一本鎖ＤＮＡとすれに相補的な一本１ｉＤ
ＮＡとから成る二本！ｆｉＤＮＡを含むプラスミドが挙
げられる。

さらに具体的にはプラスミドＩ）ＴＮＦ６０７が挙げら
れる。

本発明は上記新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端に１ｖｌｅｔが結合しているポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転
換された組換え微生物細胞を包含する。ここで微生物細
胞はエシェリヒア・コリ（Ｅ　５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
　ｃｏｌ　ｉ　）であることが好適である本発明は上記
１７ｒＭ生理活性ポリペプチドまたはそのアミノ末端に
Ｍｅｔが結合しているポリペプチドをコードするＤＮＡ
ｆＪ域を含む組換えプラスミドにより形質転換された組
換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活性ポリ
ペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培ｆＩＩ物から新
規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする、
新規生理活性ポリペプチドの製造方法を包含する。

本発明は抗腫瘍に有効な量の上記新規生理活性ポリペプ
チドまたはそのアミノ末端にＭｅｔが結合しているポリ
ペプチドを含有する医薬組成物を包含する。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化：ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［Ｄ　、　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコド
ンの中から適当なものを選び、それを化学合成すること
によって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際して
は、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択すること
が望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行
なえるように適当な位置に適当な制限Ｗｌ素による切断
部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ＞を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ＞を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ３！伝子は、その上流及び下流
に作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適
当なベクターへのクローン化が可能になる。このような
ヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステルｒｉ［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎ
ａ。

“Ｓ　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏ＋ｏ
ｎｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆＢ　ｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　
Ｊ　ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　５ｏｎｓ　、　
　Ｉ　ｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　
］　。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら
、Ｊ。

Ａｎｉ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１
（１９Ｂ？＞　１及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍ
ａｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　１−ｅｔｔ、、　２１．　
７１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操
作の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホ
スファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌ
クレオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体ク
ロマトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用い
ることができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐ８Ｒ３２２［Ｆ　、　　
Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５
（１９７７）　］のようなベクターに−度クローン化し
た後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法
が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブ
ロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましく
はｐＴＮＦｌＢＲ。

ｐＴ　Ｎ　Ｆ　２　ＮまたはｐＴＮＦＳが用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬブＯモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはｐＹｓ３１Ｎ、又は
ＤＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｉ）　Ａターミネータ−等が
あげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好
適であり、ｔｒｐＡターミネータ−を有するプラスミド
として、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この
発現型ヒトＴＮ　Ｆ３！を転子を、たとえばＩ）ＢＲ３
２２由来のベクターにクローン化することにより、発現
型プラスミドが作成できる。ヒトＴＮＦ３Ｗ転子発現型
プラス截ドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又は
１１ＴＮＦ４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮ「遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくは１）ＴＮＦ　４１６．　
１）ＴＮＦ４１６Ａ又はＤＴＮＦ４７Ｇが用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（１：５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ
）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦｌ転子発現型プラス
ミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラ
ス旦ドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　■、　Ｎｏｒｇ
ａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地とじては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
口ａｒｂｏｒ　　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ’Ｖ　、　　Ｎ
ｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で
２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−
インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物ｉ胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
　Ｎ’　Ｆ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺
伝子の発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法ＣＣａｒｓｗｅｌ　ｌら。

前出〉、マウスし細胞に対する細胞障害性を見ルｔｎ　
　ｖｉｔｒｏ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

１ｉｍｕｎｏ１．、１２６．　２３５（１９８１）　］
等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便さ
等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評価
が好ましい。

〈発明の効果〉かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫ｇ活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

〈実施例〉以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１〈ヒトＴＮＦ遺伝子の設計〉第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐｅｎｎ１ｃａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　コの報告したヒトＴＮＦ前
駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの＃ｌ造遺伝子部分の塩基配列をＭ盤
として、適当な制限Ｐ￥素による切断部位を適当な位置
に設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして
３′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ＞を
それぞれ付与した。また、５′側翻ｙＲ開始コドン上流
にはＩＩＪ限酵素Ｃ１ａＩによる切断部位を設け、ＳＤ
配列と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプ
ロモーターとの連結を可能にした。更に、３′ｍｍ訳終
止コドン下流には制限ｐ木口ｉｎｄ　ｍによる切断部位
を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結できるよう
にした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全白ｖＪＤＮＡ合ＩＩＩ（アプライ
ド・バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　＞を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわら、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度
２０％〉の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を
切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破
砕した後、２〜５ｄの溶出用ｔ＜ｙｌア−［５００ｍＭ
　　Ｎ口４０Ａｃ−１ｍＭＥＤＴＡ−０，１％５ＤＳ（
ｐ日７．５）　］を加え、３７℃で一晩振とうした。遠
心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を行なっ
た。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル濾
過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけることによ
り、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。なお、必
要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を繰り返
し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ３１伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−４７）を用いて、ヒトＴ　Ｎ　Ｆ
　’ｒＭ伝子転子つのブロックに分けてクローン化した
。

０．１〜１．０μグの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトの１
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
Ｍ　Ｔ　ｒｉｓ−口Ｃｆ（ｐ口　９．５）、１０１Ｍ　
　Ｍ（１（Ｊｚ　　。

５ＩｔｉＭジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ〜７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ旦の６６１ＭＴ
ｒｉｓ−口ＣＩ　（１）口　７．６）、　　６．６１Ｍ
　　ＭｇＣｊｚ　　。

１０１Ｍジチオスレイトール、１ａＭＡＴＰ水溶液に溶
解させ、３００ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった。

反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により
泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく約２
２０ｂｐ）のバンド部分を切出して、実施例２の方法に
従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する。

一方、３μグの大腸菌用プラスミドｐＢＲ３２２（約４
，４Ｋ　ｂｐ）を３０μ文の１０１１１Ｍ１０１ｌ１口
Ｃｊ（ｐ口　７．５）、６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃｊ、７
　　ｍＭＭ（１（Ｊｚ水溶液に溶解させ、１０ユニツト
の制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バイオラブズ
〉を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。

制限酵素ＣｊａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ文の５０１ＭＴ　ｒｉｓ
−口ＣＩ　（ｐＨ７，４）　　、　　１００　ｍＭ　　
Ｎａ　Ｃｊ、　　１０１Ｍ　　Ｍ！；１８０４水溶液に
溶解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造〉
を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応
終了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）
を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パタ
ーンの観察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部
分を含む約３．７１（ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバ
ンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏ
ｌ　／Ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｊＯｔ水溶液に溶解させ
た。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法ＣＣ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、３ｉｏｃｈｅｍ、１０１．
　３３９（１９８０）　］により、約３．７ＫｂｐのＤ
ＮＡ断片＜Ｃ１ａ　Ｉ”５ａｌＩ　）をアガロースゲル
より回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ３！伝子の一部を含む約２２０
ｂｏのＤＮＡ水溶液片について、前記の方法に準じて末
端のリン酸ｊヒ反応を行なった後、プラスミド１）ＢＲ
３２２の大部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液
と混合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて
両ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株の形質転換は、
通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５−のし培地（
１％トリプトン、０．５％Ｉｎエキス、０．５％Ｎａ＋
Ｊ、Ｉ）口　７．２）！、：エシエリヒアーｍｌすＣ６
００ｒ−１−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む
培養液の６００ｒｖにおける濁度（○Ｄｉｎｅ＞が０．
３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム
・バッフ７−　［０，ＩＭ　　Ｎａ　ＣＬ　５　ｍＭ　
　ＭＯＣｊｚ　。

５　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−口ＣＩ　　（１）口　７，６
．　０℃）］中で２回洗い、２Ｉｔｉの冷したカルシウ
ム・バッファー［１００１Ｍｃａ　Ｃ１ｘ　、　２５０
　　ＩＢＭ　　ＫＣｆ、　５　ｍＭＭｌｌｌ　Ｃ１ｚ　
　、　　５　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−口Ｃｊ　（１）Ｉ−
１７，６゜０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放
置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中でｍｍｂ、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分間
。

０℃で保った後、１艷のＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％ｎ母エ生エキス％ＮａＣｆ、　　０．０８％グ
ルコース、　ｐ目　７．２）を添加し、３７℃で１時間
振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン（
シグマ）３０μｇ／ｍｅを含むし培地プレー１−　］に
１００μ旦／プレートの割合で接種する。プレートを３
７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られ
たアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用い
てＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目
的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．０Ｋ　ｂｐ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ
の作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドＤＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作
成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、Ｍ、Ｍａ
ｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６５．
　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドＤＴＮＦＩＢＲ１０μグ
を、実施例３と同様にして制限酵素Ｃ１ａＩ及び５ａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃオａ　
Ｉ＋Ｓａｌ工）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　　’
ｌ０ｕｑを１００μ、Ｈの１０　ＩＢＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−口Ｃ１（０口　７．５）　、　　６０ｎ＋　Ｍ　　Ｎ
ａ　Ｃ１，７ｎＭＭＱＣ１ｚ水溶液に溶解させ、４０ユ
ニツトの制限酵素ＰＶＬＩＩＩ（宝酒造）を添加し、３
７℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の
方法に準じて制限酵素５ａｌＩによる切断、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７
０ｂｐ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ＳａｌＩ４−４ＰＶｔ
ｌＩ［）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
ｕｙも１００μＮの１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１（
０口　７．５）、６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，７ｍＭＭ
（ｌｃｊｚ水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制限酵素
ＰｖｕＩ［及び４０ユニツトの制限酵素１−（ｉｎｄｎ
Ｉ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行な
った。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル
濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ
遺伝子の一部を含む約１１０ｂ１１のＤＮＡ断片（Ｐｖ
ｕＩ［＋口１ｎｄｌ［Ｉ）ｅポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドＩ
）ＹＳ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｌ））　５μ９を、上記と
同様に制限酵素ＣｊａＩ及び日ｉｎｄ　ｍで切断し、ア
ガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大
部分を含む約４．７Ｋ　ｂＤのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ”
　ｌ−１ｉｎｄ　ｌｌ　）をアガロースゲルより回収し
た。

こうして得られた、ヒトＴＮ　Ｆ３！！伝子の一部を含
む約２２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つ
のＤＮＡ断片とプラスミドｐＹｓ３ＩＮの大部分を含む
約４，７Ｋｂρの［）ＮＡＡ断片を混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ、４−　Ｄ　Ｎ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実
施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−
ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ
遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２
Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そ
のプラスミド１）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した
。

また、上記プラスミドｐＹ　Ｓ　３ＩＮ　５μグを、上
記の方法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、
さらに制限酵素臼ｉｎｄ　Ｉ［で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動くゲル濃度０．８％〉の後、実施例３の方法
に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐ
のＤＮＡ断片［ＰｖｕＩ［（２］−口１ｎｄＩ［Ｉ］を
アガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μグに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋ　ｂ
ｐのＤＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２Ｊ−Ｈｉｎｄ　ｍ　］
と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスくドＩ）ＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｐ）を有
するクローンを選択した。このようなプラスミドは、プ
ラスミドρＹ　Ｓ　３１Ｎからコピー数制ｍ＋領域除去
し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニング・
サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネータ−を付与
した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、第７
図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μりを、上記と同様に制
限酵素０１ａＩ及び口ｉｎｄ　［１で切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％〉の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミドＤＡ　Ａ　４１の大部分を含
む約２．γＫｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ−口１ｎｄｎ
［）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵
素ＣｊａＩ及び口ｉｎｄ　ＩＩＩで切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０
ｂｐのＤＮＡＩＦｉ片（Ｃｊａ　Ｉ”Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂＥ）のＤＮＡ断片とを混合し
、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４
−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００「−ト株に導入し、形質転換株の中より目的
のプラスミドＩ）ＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂ
ｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、
ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有し
ており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成〉実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１１ＴＮＦ　４０１ＮＮ２０μ９を、実施例４の方法に
準じて制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル１ｒＩ５％）及
びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、
それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つ
のＤＮＡ断片（約４９０ｂｌ）及び約４．７Ｋ　ｂｐ、
両方共Ｃｆａ　ＩＭＨｉｎｄ　Ｉ［［）をゲルより回収
した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
１１のＤＮＡ断片を５０μ文の１０１１１Ｔｈ、４　　
Ｔ　ｒｉｓ−口　ＣＪ　　（ＤＩ−１７，５）　　、　
　　６０　　ｍＭ　　　　Ｎａ　　Ｃ１，７ｍＭＭ（Ｊ
Ｃｊｚ水溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵′ＡＡ
ｖａＩ（宝酒造〉を添加して、３７℃で１時間切断反応
を行なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気
法ｉｌｌ　（ゲル濃度５％）を行ない、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分ヲ含ム約４６０ｂ
１１（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ＡｖａＩ−口ｉｎｄ厘）
をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌク
レオチドを、実施例２の方法に準じて、上の鎖と下の鎖
とに分けて合成、精製した。得られた２本の合成オリゴ
ヌクレオチドそれぞれ０．５μりについて、実施例３の
方法に準じて、末端のリン酸化を行なった後、アニーリ
ングさせた。

アニーリング後の２本鎖オリゴヌクレオチドを、先に得
られた約４．７）（ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩ−口１
ｎｄｌｌ［）及びヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約４
６０ｂｐのＤＮＡｌｉ片（ＡｖａＩ＋Ｈｉｎｄ　ｌ［）
と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リ（：、　６００ｒ−ｅ−株に導入し、形質転換株の中
より目的のプラスミド１ｌＴＮＦ４１６（約５．２Ｋｂ
ｌ））を有するクローンを選択した。このプラスミドは
ＴＮＦのアミノ末端の７アミノ酸を欠失させた形の新規
抗腫瘍活性ポリペプチドをコードする新規抗腫瘍活性ポ
リペプチド遺伝子発現型プラスミドであり、第９図にそ
の作成方法を示した。

さらに、Ｉ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎから１）ＴＮＦ
４０１Ａを作成した場合と同様な方法により、ＴＮＦの
アミン末端の７アミノ酸が欠失した形の新規抗腫瘍活性
ポリペプチド遺伝子を効率良く発現させる能力を有する
発現型プラスミドＤＴＮ　Ｆ　４１６Ａ　（約３．２Ｋ
ｂ１１）を作成した。第８図その作成方法を示した。

上で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４１６Ａを、実
施例３の方法に準じて制限酵素ＥＣ０ＲＩ及び５ａｌＩ
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）及びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％
）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成
する２つのＤＮＡ断片（約５６０ｂｐ及び約２．６Ｋ　
ｂｐ、両方共３ａｌ■−Ｅ　ｃｏＲＩ　）をゲルより回
収した。

ここで得られた新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の５
′側半分を含む約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を５０μｆｉ
の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣオ　（０日　７．４
）　、　　１０ｍ１ｙｌ　　Ｍｇ８０４　、１　　ｉＭ
　　ジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０ユニツ
トの制限酵素Ｋｌ）ｎＩ（宝酒造）を添加して、３７℃
で１時間切断反応を行なった。反応終了後、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行ない、実施
例２の方法に準じて、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の５′側の部分を含む約５００ｂｐのＤＮＡ断片（Ｅ
ｃｏＲＩ−Ｋｌ）ｎＩ　）をポリアクリルアミドゲルよ
り回収した。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

Ｉ！した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μグについて、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．６Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩＨ
ＥｃｏＲＩ　）及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の５′側の部分を含む約５ｏｏｂｐのＤＮＡ断片（Ｅｃ
ｏＲＩ　４−４ＫｐｎＩ　）と混合し、エタノール沈澱
の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ
による連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方
法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に導
入し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ６
０７（約３．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した
。このプラスミドは、次のアミノ酸配列（口２　Ｎ　）　−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｓｐ　−Ｌｙｓ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖａｔ　−Ａ　！ａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ
ａｌ　−Ｖａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ
　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅＬＩ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ
　ｅｕ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒ（Ｊ−Ａ　ｒ（１−Ａ　Ｉａ
　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｌ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｌ　ｅｌＪ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　３ｐ−Ａ　
Ｓｎ　−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８
ｅｒ−Ｇｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｔｙｒ　−
Ｌｅｕ　−１１ｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｖ　ａｌ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｌ　ｙｓ　−
Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ−Ｃｙｓ　−Ｐ　ｒ
ｏ　−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−口１ｓ−Ｖａｌ−Ｌ　ｅｕ
　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ　−Ｉ　１ｅ−８
ｅｒ　−Ａ　ｒａ−１，Ｉｅ　−Ａ　ｌａ−Ｖａｔ　−
５ｅｒ−Ｔｙｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｈｒ−１ｙｓ　−
Ｖ　ａｔ　−Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ
　−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ｇ
　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　
Ｉｙ　−ＡｌａＧ　Ｉｕ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ＶＳ　−
Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　１７ｒ　−ＧＩｕ　−Ｐ
ｒＯ−１＋ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ　＋ｙ−
Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌ
ｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｓｏ　−Ａ　ｒｏ
　−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−１
１ｅ　−Ａ　５ｎ−Ａ　ｒａ−Ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｓｐ　
−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ
　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ−１
１ｅ−Ａｌａ−１−ｅｕ　−ＣＣＯＯ口〉で表わされる新規抗ｍｓ性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られた発現ベクターＤＡＡ４１゜ｐＴ
ＮＦ　４０１ＮＮ又はＩ）ＴＮＦ４０１Ａ、又は前記実
施例５で得られた、新規抗腫Ｉ！活性ボリベブチド遺転
子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４１６．　　ｐＴＮＦ　
４１１３Ａ又はＩ）ＴＮＦ６０７を有するエシェリヒア
・コリＣ６００ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μり／ｄのア
ンピシリン、０．２％のグルコース及び４Ｉｌ１ｇ／Ｉ
Ｉｄｌのカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａｚロ
ＰＯ４０，３％に２０ＰＯ４−０，０５％ＮａＣｆ−０
，１％ＮＨｉＣ１水溶液（９日　７．４）をオートクレ
ーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭｇ
ＳＯ４水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ最終濃度
２１１１Ｍ及び０，１　ｎ＋Ｍになるように加える。１
２５０ＩＲ１１，：接種し、ＯＤｉｐａカ０．７に：達
スルマチ、３７℃で振とう培養を行なった。次いで、最
終濃度５０μ’Ｊ／ｄの３−β−インドールアクリル酸
を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２ＦＲ間振とう
培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　−（１５０ｎ＋Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０−Ｍリン
酸バッファー、　　Ｉ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０１ｄのＰＢＳバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置く久保田、　　２００Ｍ
型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔ　ｒｉｓ
−ＨＣオバッフ７−（＋）口　６．８）　、　ＳＤＳ、
　　２−メルカプトエタノール、グリセロールを、それ
ぞれ最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、１０％になるよう
に加え、５Ｏ８−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴
木、遺伝、　３１．４３　（１９７７）　］を行なった
。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＤ３
、Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｎ＋ｎ＋
ｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シープルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現の確認を行なっ
た。結果の一部を第１１図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
８−９３（ｌ型）にかけて、産生された新規抗腫瘍活性
ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算
出を行った。その結果、発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ４
１６を有する大腸菌における新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドの産生量は、発現型プラスミドＤＴＮＦ　４１６Ａの
場合の約５０％にすぎず、発現ベクターｐＡ　Ａ　４１
及び発現型プラスミドｐＴＮＦ　４１６Ａの有用性が示
された。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｎ
の方法に準じて行なった。すなわち、実施例６で得られ
た新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート
を順次培地で希釈した試料１００μ文と、４　ｘ　１０
５個／ｌｌ１１の濃度のマウス上−９２９ｍ維芽細胞（
ＡＴＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μ旦を、９６穴
の組織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で混合
した。なおこの際に、ｍｔｓｍ度１μｇ／ｄのアクチノ
マイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。

培地としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８時間培養した後、ク
リスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　
）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）の
クリスタル・バイオレットを溶解させたちの〕を用いて
生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを
洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレット
を１００μ旦の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５
９５ｎａ＋における吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（
東洋測器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は
、生き残った細胞数に比例する。そこで、新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加
えない対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライ
ゼートの希釈倍率をグラフ（たとえば第１２図）によっ
て求め、その希釈倍率をユニットと定義する。第１２図
より、発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ　４０１Ａにコード
されるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１０
０μ旦は２．ｌＸ１０ｇユニット程度の活性を、そして
発現型プラスミドＥ）ＴＮＦ６０７にコードされる新規
抗１１ｆｔｍ活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼート
１００μ旦は約６．４Ｘ　１０８ユニツト程度の活性を
、それぞれ有していることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ６０７にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白賃借は
、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラッド〉を
用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検巳線より
計算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白質
定量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比活性を計算したところ、表１のような値が
得られた。表１より、新規抗腫瘍活性ポリペプチドはヒ
トＴＮＦ蛋白質の約１．３倍の比活性を有していること
がわかる。

表１ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれボしたものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４Ｇ１ＮＮの作成方法を
、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作成方法を、
そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１）
ＴＮＦ４０１Ａ及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミド１）ＴＮＦ　４１６Ａの作成方法を、
それぞれ示したものである。第９図は新規抗Ｉ！Ｉ瘍活
性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４１
６の作成方法を、そして第１０図は新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６０７の作成
方法を、それぞれ示したものである。第１１図は、新規
抗ｌ１１ｍ活性ポリペプチド遺伝子の発現結果を示した
ものである。第１２図は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの
活性測定結果を示したものである。特許出願人　　帝　　人　　株　　式　　会　　社Ｇｌ
ｕ　１）１１ｎｄｌｌ［し第図すＵ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＧＣＴ、ＧＡＧ、ＧＣＣ，ＡＡＧ、
ＯＣＡ、ＴＧＧ、ＴＡＴ、ＧＡＧ、ＣＣＣ−ＧＩｕ−Ｇ
Ｉｙ−ＡＩａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ−Ｔｙｒ−ＧＩｕ−Ｐｒ。、ＴＣ下、ＧＧＧ、ＣＡＧ、ＧＴＣ，ＴＡＣ，ＴＴＴ、
ＧＧＧ、ＡＴＴ、ＡＴＴ、ＧＣＣ，ＣＴＧ−８ｅｒ−Ｇ
　ｌ　ｙ−Ｇｌ　ｎ−Ｖａ　ｌ−１Ｖｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌ
　ｙ−Ｉｌ　ｅ−１１８−Ａ　ｌ　ａ−ＬｅＵ第図ｖｕ　Ｉｆ第図第７ｖ！ＪのＡ（５′） ←−、＋１１ＡＧＣＴＴＡＧＣＣＣＧＣＣＴＡＡＴＧＡＧＣＧＧＧＣ
ＴＴＴＴＴＴＴＴ−（３−）（３”’）　−ＡＴＣＧＧ
ＧＣ，ＧＧＡ丁ＴＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡ
−（５−）＋２１−一→ 第図のｐｖｕ　ＩＩ（１）第図大断片小断片ｉｎｄｕ第図第１０図１０図一。ＣＡＧＧＡ　ＧＡＡ。。。。。。焉二＝払１ζじ図第１２図希釈倍率

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列（Ｈ＿２Ｎ）−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＧＩｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１ｌｅ−Ｉｌｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項１記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列（Ｈ＿２Ｎ）−Ｐｒｏ−ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｖ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｖ−Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列（５′）−ＣＣＧＡＧＴＧＡＣＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡ
ＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡ
ＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣ
ＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ
ＧＡＧＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＣ
ＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣ
ＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴ
ＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣ
ＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣ
ＴＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡ
ＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧ
ＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴ
ＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡ
ＡＴＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴ
ＴＴＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴ
ＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＧ−（３′）で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列（５′）−ＣＡＴＣＡＴＡＡＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＡＡＡＴＧＡＧＣ
ＴＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴＣＧＡＡＣＴＡＧ
ＴＴＡＡＣＴＡＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＧＴＡＡ
ＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＧＣＣＧＡＧＴＧＡＣ
ＡＡＧＣＣＴＧＴＡＧＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＡＧＣＡＡ
ＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＧＧＣＡＧＣＴＣＣＡ
ＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧＣＣ
ＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＣＴＧＡ
ＧＡＧＡＴＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＣ
ＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＡＴＣＴＡＣＴＣＣ
ＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＴ
ＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＡＣ
ＣＣＡＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣ
ＴＣＣＴＡＣＣＡＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＣＣ
ＴＣＴＣＴＧＣＧＡＴＣＡＡＧＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＡ
ＧＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＧＧＧＧＣＴＧＡＧ
ＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＴＧＡＧＣＣＣＡＴＣＴ
ＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＧＧＴＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＡ
ＧＡＡＧＧＧＴＧＡＣＣＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＴＧＡＡ
ＡＴＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＧＡＣＴＡＴＣＴＣＧＡＣＴ
ＴＴＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＴＴ
ＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴＡＡＧＣＴ
Ｔ−（３′）で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６０７である
請求項３記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列（Ｈ＿２Ｎ）−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴
とする請求項７記載の微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列（Ｈ＿２Ｎ）−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａ
ｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ
−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔ
ｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓ
ｅｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａ
ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓ
ｎ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理活
性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物から
新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とする
、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列（Ｈ＿２
Ｎ）−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｎ
−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ
−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ａ
ｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−
Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌ
ｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−
Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。