JPS63226298A

JPS63226298A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPS63226298A
Application number: JP62059007A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Kitai; 北井　一男; Satoshi Nakamura; 聡中村; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kenji Yone; 米　賢二; Kaku Katou; 加藤　革; Jun Suzuki; 純鈴木; Noriyuki Tsunekawa; 恒川　典之; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1987-03-16
Filing date: 1987-03-16
Publication date: 1988-09-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＴＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａｌ−−アラニンＡｒ（ＩＬ−アルギニンＡｓｎ１−−アスパラギンＡＳｐ　Ｌ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＱｌｎ　　ｌ−グルタミンＧｌｕＬ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシン１−１ｉｓｌ−−ヒスチジン（Ｉｅｌ−−イソロイシン１ｅｕｌ−一ロイシンＬｙｓＬ−リジンＭｅｔ　　１−メチオニンＰｈｅ　　Ｌ−フェニルアラニンＰｒｏ　し−プロリンＳｅｒ　　ｌ−セリンＴｈｒ　　Ｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−１−リプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａＩ　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さらに、（Ｈ２Ｎ）−及び−（ＣＯＯ
Ｈ）はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及びカルホ
キシ末喘側を示すものであり、（５′）−及び（３′）
はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端側を示
すものである。

（２）発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌｌらは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌｍ
ｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前もっ
て刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後に
採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌を
出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、この
物質を腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏｓｉ
ｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもある）
と名づけだ［Ｅ　、　Ａ　、Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　ｐ
　ｒｏｃＪＪ　ａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、ｓ　ｃｉ、、　Ｕ　ＳＡ、　７２．３６６
６　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ
、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、
しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が
期待されてきた。

最近になッテ、ｐｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
Ｆｉ仏子の発現について報告した［　Ｄ　、ｐ　ｅｎｎ
ｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３旦、７２４（１
９８４）　］　、その後、自社ら［Ｔ、　５ｈｉｒａｉ
ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０＜１９８５）　］　、Ｗａｒ＋ｇら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎ
ｇら、　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１
９８５）　　コ及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　
　Ｍ　ａｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２．　５１
５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ３ｍ伝子の大腸菌に
おける発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクヂ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂ　ｅｕｌ
ｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクチンが
リポプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、
ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、
その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可
能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血
管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　、　　
１６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ
、　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　
３１９．　５１６（１９８６）　］等が報告されている
。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙｓｔ！及びＣｙＳ／Ｄ／のいずれか
又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ出願公開
ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６１−１０６７７２
＞　、Ｇ　ｌｙ”の他のアミノ酸残基への置換（特願昭
６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０４８号）
。

Ａｌａ　　の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−
２３３３３７号）が報告されている。また、アミノ末端
側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失Ｔ
ＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−５
０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していることく特願昭６１−９００８７号）、１〜１
０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、そ
の比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大にな
ること（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０２３８１号）、
１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しているこ
と（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１１アミノ酸
欠失ＴＮＦが細ＰＩｌ障害活性を有していること（特願
昭６１−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上９反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の伯の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　）　　Ｐｒｏ　−ＬｙＳ−ＡｒｇＬｙｓ−Ｐ
　ｒｏ　−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ　−Ｈｉｓ　−Ｖａｌ　−
Ｖａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　
５ｎ−Ａ　ｒ（］−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ
　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌａ　−
Ａ　ｓｎ　−Ｇ　ＩＶ−Ｖ　ａｌ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｌ　
ｅｔｌ−Ａ　ｒ（１−Ａ　ＳＤ　−Ａ　５ｎ−Ｑ　Ｉｎ
　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖ　ａｌ　−Ｖ　ａｔ　−ｐ　ｒｏ−
３ｅｒ　−Ｑ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ−Ｌｅｕ−ＴＶｒ−Ｌ
ｅ’ｕ−１ｌｅ−Ｔｙｒ−８ｅｒ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａｔ
　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＬＶｓ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１ｎ−
Ｇ　Ｉｙ　−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−８ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−Ｈ
ｉｓ−Ｖ　ａｔ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−
Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｔ　Ｉｅ−８ｅｒ−Ａｒ（１−１１ｅ
−Ａｌａ　−Ｖａｌ　−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　１
ｎ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ
　ｅｕ−８ｅｒ−Ａ　ｌａ　−Ｔ　ｌｅ　−ＬＶＳ−５
ｅｒ−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒａ　−Ｇ
　Ｉｕ−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ＩＶ−
Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ　−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ＶＳ−Ｐ　ｒｏ
　−Ｔ　ｒｌ’ｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐｒｏ
−Ｔ　１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　ＩＶ−Ｖ
ａｌ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｕ−Ｌｙｓ−
Ｇ　ＩＶ−ＡＳｐ−Ａｒｃ＋　−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌ
ａ−Ｇｌｕ　−Ｉ　１ｅ−Ａｓｎ−Δｒｇ　−ｐ　ｒｏ
　−Ａ　ｓｐ　−Ｔ　Ｖｒ　−Ｌ　ｅｕ−Δ５ｐ−Ｐｈ
ｅ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　１ｙ−
Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌ
ｙ　−１１ｅ　−Ｉ　　ｌｅ−△１ａ−Ｌｅｕ−（ＣＯ
ＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミノ末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを提供するこ
とによって達成され、また上記新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドをコードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを
提供することによって達成され、更にかくして得られた
組換えプラスミドによって形質転換された組換え微生物
細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍活性
ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供することによ
って達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦＭ伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸［［）　、
　ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出コを指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取得できる。ヒトＴＮＦ３ｕ伝子の設計に際
しては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択する
ことが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易
に行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切
断部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦＩ伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ３ｕ伝子の取得は、上
側の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図
に示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、
それらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結
する方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの
合成法としてはジエステル法［ＨｏＧ、　Ｋｈｏｒａｎ
ａ。

“３　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　［）　ｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　　ｉｎ（：、ｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　
　ｐ　ｈＯ３ｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　”
　　、Ｊ　ｏｈｎ　　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　　５ｏ
ｎｓ　　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１
９６１）］　　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌ　ｅｔｓｉｒ＋ｇｅｒら
、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホホスフィイト［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としでは、合成オリゴヌクレオヂドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、Ｂ　
ｏｆ　１ｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９５（
１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化した
後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が
好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロ
ックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは
ｐＴＮＦｌＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮに遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、
　ｌｐｐプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはｌ］Ｙｓ３１Ｎ、又
はｌ）Ａ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
Ｉｐｐターミネータ−１ｔｒｐターミネータ−等があげ
られるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好適で
あり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミドと
して、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦｉ仏子を、たとえば１）ＢＲ３２２由来
のベクターにクローン化することにより、発現型プラス
ミドが作成できる。ヒトＴＮＦｉ伝子発現型プラスミド
として、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はｐＴＮＦ４
０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクロー・ン
化：こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦＡ６Ｂが用いら
れる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大賜菌、枯
草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（［５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法［Ｍ　、　Ｖ　、Ｎ　ｏｒ
ｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉ
ｎａ”　、　Ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ　　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必
要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが望
ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、たと
えば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２
〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に、
プロモーターを効率良く機能させる目的で、３−β−イ
ンドールアクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により絹換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により粗換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見ルｉｎ　
　Ｖ＋ｔｒＯ活性測定法ＣＲｕｆｆ　、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　
］等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ＶｉｔｒＯ活性測定法による評
゛価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、Ｐｅｎｎ１ｃａらＣＤ。

Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３ｔ２
．　７２４（１９８４）　］の報告したヒトＴＮＦ前駆
体ｃＤＮＡの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として、
適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、５
′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ＞を、そして３′側に２
個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれぞれ付
与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には制限酵素
ｃｐａ■による切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳開始コ
ドン間を適切な状態に保った形でのプロモーターとの連
結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下流には
制限酵素Ｈｉｎｄｌｌによる切断部位を設け、ベクター
・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦｍ仏子は、第２図に示したように１
７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴヌ
クレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド・
バイオシステムズ。

モデル３８０Ａ　＞を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわ゛ち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア
水溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保
護基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル
（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量
の合成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７
Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（グル濃
２８一度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５ｄの溶出用バラａｐ　−［５００ｍ
Ｍ　　ＮＨ４０ＡＣ−１１１１ＭＦＤＴＡ−ｏ、１％Ｓ
ＤＳ　（ｐＨ７，５）コを加え、３７℃で一晩撮とうし
た。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回収を
行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶液を
ゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけるこ
とにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た。な
お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上をはか
った。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦ遺伝
子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μｑの合成オリゴヌクレオヂドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
ｉ−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ旦の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐｚ−＋　９．５）　、　１０
　ｍＭ　　ＭＵ　Ｃａ、。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、　３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し
、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴｉ−ポリヌク
レオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ７の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
　Ｎ　Ｆ　−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温
まで徐冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μρの６６　ｍ１
ｙｌＴｒｉｓ−ＨＣＮ　（１）８７．６）　、　　６．
６　ｍＭ　　ＭＱ　ＣＮ２　。

１０１１１Ｍジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ水溶液
に溶解させ、３００ユニツトのＴｉＤＮＡリガーゼ（宝
酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった
。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法によ
り泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさく約
２２０ｂｌ）　）のバンド部分を切出して、実施例２の
方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収
する。

一方、３μ９の大腸菌用プラスミドＩ）ＢＲ３２２（約
４．４Ｋ　ｂｐ）を３０μ、Ｑの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−Ｉ−Ｉ　ＣＢ（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　
　Ｎａ　Ｃ９，７ｍＭＭＯＣ＃２水溶液に溶解させ、１
０ユニツトの制限酵素Ｃ９ａＩにューイングランド・バ
イオラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行
なった。

制限酵素ＣＲａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ隻の５０　ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｊ　（＋１Ｈ７，４）　、　　１００　ｍＭ　　
Ｎａ　ＣＬ　１０ｍＭ　　Ｍ！］ＳＯ４水溶液に溶解さ
せ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、アガロ一スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を行
ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パターン
の観察を行なう。プラスミド１）ＢＲ３２２の大部分を
含む約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　
／ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣＲＯａ水溶液に溶解させた。

Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法ＣＣ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０１．
　３３９（１９８０）　］により、約３．７Ｋ　ｂｐの
ＤＮＡ断片（ＣＲａ　ＩＨ３ａｌＩ）をアガロースゲル
より回収した。

先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株の形質転換は、
通常のＣａＣＲ２法（Ｍ　、　Ｖ　、　Ｎ　ｏｒｏａｒ
ｄらの方法）の改良法で行なった。すなわち、５ＩｎＩ
ｌのし培地（１％トリプトン、０．５％ｕｆＲエキス、
０．５％Ｎａ　ＣＬ　　ｐｚ−１７，２）にエシェリヒ
ア−ＤすＣ６Ｃ６００ｒ−株の１８時間培養基を接種し
、菌体を含む培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ＋
、ｙ）が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷たい
マグネシウム・バッファ［０，ＩＭ　　Ｎａ　ＣＬ　５
　ｍＭ　　Ｍ（］　Ｃ４２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−１
−１ｃ９（ＤＨ７，６，０℃）コ中で２回洗い、２ｄの
冷したカルシウム・バッファー［１００ｍＭｃａ　Ｃ１
２，２５０ｍＭ　　ＫＣＲ，５ｍＭＭ（Ｉ　Ｃ９２，５
ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐｚ　７．６゜０℃）］
中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２＝１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ９，０，０８％グルコ
ース、　　ｌ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時間振
どう培養する。培養液を、選択培地しアンピシリン（シ
グマ）３０μｇ／ｄを含むＬ培地プレート］に１００μ
磨／プレートの割合で接種する。プレートを３７℃で１
晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたアンピ
シリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてＤＮＡ
を調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のプラ
スミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．０Ｋ　ｂｐ）の取得を確
認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲの作成方
法を示す。

以上ど同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋｂｒｌ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドＩ）ＴＮＦ
３（約２．４Ｋｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドＩ）ＴＮＦＩＢＲ，１）ＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３
の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計
通りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ
、　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、
、６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４〈ヒトＴＮＦ３ｌ転子発現型プラスミドの作成
）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素ＣｊａＩ及びＳａｌ
Ｉで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦｌ
転子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片（ｃｆａ　
ｌ−８ａｌＩ）をポ’Ｊ　７　’）　ＩＪ　ルアミドゲ
ルより回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドＩ）ＴＮＦ２　１
０、ｃＢを１００μＵの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−Ｈ
ＣＲ（ｐＨ７，５）　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　ＣＬ　
７１１１ＭＭＱＣＩ２水溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ＰｖｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１
時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準
じて制限酵素Ｓａ１■による切断、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦｌ転子の一部を含む約１７０１１０
のＤＮＡ断片（ＳａｌＩ−ＰｖｕｌＩ　）　ヲポリアク
リルアミドゲルより回収した。

−３５＝また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μ５Ｊもｉｏｏμ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ｌ−
（ＣＲ（１）Ｈ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ
Ｒ，７ｍＭＭＯＣｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツト
の制限酵素ＰｖｕＩ［及び４０ユニツトの制限酵素１−
１ｉｎｄＩ［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切
断反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて
、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｌ）のＤＮ
Ａ断片（ＰＶＩＪＩ［←Ｈｉｎｄｌ［ｒ）をポリアクリ
ルアミドゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３１Ｎ　（約４．７Ｋｂｌ’ｌ）　５μ９を、上記
と同様に制限酵素ＣＲａ■及びＨｉｎｄＩＩ［で切断し
、アガロースゲル電気泳動（ゲル１１９　ｏ、ａ％）の
後、実施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹｓ３ＩＮ
（ｔ）大部分ヲ含す約４．７ＫｂｐノＤＮＡ断片（ＣＲ
ａＩ４−＋ＨｉｎｄＩ［Ｉ）をアガロースゲルより回収
した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ３１伝子の一部を含む約
２２０ｂｐ、約１７ｏｂｐ及び約１１０ｂ１１の３つの
ＤＮＡ断片とプラスミドｐＹＳ３ＩＮの大部分を含む約
４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリ（：、　６００ｒ−ｍ
−株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ３
ｌ転子発現型プラスミドｐ丁ＮＦ４０１ＮＮ（約５．２
Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そ
のプラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドＩ）ＹＳ３１Ｎ５μグを、上記の
方法に準じて制限酵素ｐｖＪで部分分解した後、さらに
制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｒで切断し、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準じ
て、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｌｌのＤ
ＮＡ断片［Ｐ　ｖｕｌｌ　（２）−Ｈｉｎｄ　ｍ　］を
アガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ３に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２，７Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片［ｐｖｕ■（２）←ＨｉｎｄＩ［［］と混
合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。反応
終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ
６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目的の
プラスミド１１ＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｐ）を有する
クローンを選択した。このようなプラスミドは、プラス
ミドｐＹｓ３１Ｎからコピー数制御領域除去し、ｔｒｐ
プロモーター下流に存在するクローニング・サイトの下
流に大腸菌ｔｒｐＡターミネータ−を付与した形の、多
コピー・高効率発現ベクターであり、第７図にその作成
方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μｑを、上記と同様に制
限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｎＩで切断し、アガロース
ゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方
法に準じて、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分ヲ含ム
約２．７Ｋ　ｂｐ（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（ｃｐａＩ４
−＋ｌ−ｌ　ｉｎｄ　ｍ　）をアガロースゲルより回収
した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＤＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵素
ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法
に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐの
ＤＮＡ断片＜ＣＲａ　Ｉ”Ｈｉｎｄ　ｍ　＞をポリアク
リルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分
を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺伝
子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔｌ−Ｄ
ＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｌ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２
Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミド
は、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を
有しており、第８図にその作成方法を示した。

３９一実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μグを、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ＣＲａ■及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）及びアガ
ロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、それぞ
れ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２つの［）
ＮＡＡ断片約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋ　ｂｐ、両方共
ＣＲａ　Ｉ　＋Ｈｉｎｄ　ｍ　）をゲルより回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を５０μ、Ｑの１０１１１Ｍ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＲ（ｐｚ　７．４）　、　１０　ｍＭ　　ＭＱ
　ＳＯ２、１１１１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩＩ（宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％
）を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝
子の大部分を含む約３’１Ｏｂｌ）のＤＮＡ断片（１−
１ａｐ４Ｏ− ＩＩＨＨｉｎｄｌｌ）をポリアクリルアミドゲルより回
収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＲａ　Ｉ
＋−１Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦＪ仏子の大部分
を含む約３９０ｂｐのＤＮ、Ａ断片（＋−１ａｒｌ　Ｉ
Ｉ　４−＋ｌ−１ｉｎｄＩ［［＞と混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔｌ−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株
に導入し、形質転換株の中より目的のプラスミド＋１Ｔ
ＮＦ４７４（約３．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選
択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列（Ｈ２Ｎ
）　　　Ｐｒｏ−１ｙｓ−Ａｒｇ　１−ｙｓ−Ｐ　ｒｏ
−Ｖａｌ　−Ａ　ｌａ　−Ｈ１ｓ−Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ａ
　１ａ−Ａ　ｓｎ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ
　−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ
　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　Ｅｉｕ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒ（
１−Ａ　ｒｇ−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−
Ｌ’ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇ
　ｌｙ　−Ｖａｔ−Ｇ　Ｉｕ　−１ｅｕ−ＡｒＧ−ＡＳ
Ｄ−Ａｓｎ　−〇　Ｉｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｖａｔ　−Ｖ
ａｌ　−Ｐ　ｒｏ−８ｅｒ−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−
Ｌ　ｅｕ　−Ｔｙｒ−Ｌ　ｅｕ−１１ｅ−ＴＶｒ−５ｅ
ｒ−Ｇ　ｌｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　
Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ＩＶ　−ＣＶＳ−Ｐ　ｒｏ−３ｅ
ｒ　−Ｔ　ｈｒ−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌ
ｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈ１ｓ−Ｔｈｒ　−Ｉ　１ｅ−８ｃｒ　
−Ａ　Ｎｌ　−１１ｅ　−Ａ　ｌａ　−Ｖａｌ−８ｅｒ
　−ＴＩ／ｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ　−Ｖａ
ｌ−ＡＳｎ−１−ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−８ｅｒ　−Ａ　Ｉａ
−１１ｅ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｓｅｒ　−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ
−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒ（１−Ｇ　Ｉｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　
ｒＯ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　
ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　
１ｕ−Ｐ　ｒＯ−Ｉ　Ｉｅ　−ＴＶｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ
Ｖ−Ｇ　＋ｙ−Ｖａｌ−ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇ
　ｌｕ−＋−ｙｓ−Ｇ　ＩＶ−Ａ　５ｌｌ−Ａｒ（＋−
Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１Ｏ−ＡＳｎ−
Ａｒｏ　−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−ＴＶｒ　−Ｌ　ｅｕ−ＡＳ
＋）−Ｐｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　Ｉ
Ｖ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　ｌ
ｙ　−１１ｅ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ａ　１ａ−Ｌ　ｅｕ　−
（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端に１ｙｌｅｔが結合しているポリペプチドをコー
ドする新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドであり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られた発現ベクターＤＡ　Ａ　４１　
。

ヒトＴＮＦｉ伝子発現型プラスミド１ｌＴＮＦ４０１Ｎ
Ｎ又は１ｌＴＮＦ４０１Ａ、又は実施例５で得られた、
新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ４７４を有するエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００
ｒ−株を、３０〜５０１１　ｇ／　ｒｄｌのアンピシリ
ン、０．２％のグルコース及び４　ｍｇ　／　ｄのカザ
ミノ酸を含むＭ９培地［０，６％ｌ’、ｌａ　２１−Ｉ
ＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣＲ
−０，１％ＮＨ４ＣＲ水溶液（１１Ｈ７，４）をオート
クレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ滅菌した
Ｍ（ｌｓＯ４水溶液及びＣａＣＲ２水溶液をそれぞれ最
終濃度２ｍＭ及び０．１ｍＭになるように加える。］　
　２００ｄに接種し、０Ｄｔｏｏが０．７に達するまで
、３７℃で振とう培養を行なった。次いで、最終濃度５
０μｇ／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中
に添加し、さらに３７℃で１２時間振とう培養を続けた
。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　　（１５０ｍＭ　　ＮａＣｊを含む２０　ｍＭリン酸
バッファー、　　Ｉ）Ｉ−１７，４）を用いて菌体の洗
浄を行なった。洗浄後の菌体を１０成のＰＢＳバッファ
ーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ
型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残
渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
１−ＩＣｆバッファ（＋１Ｈ６，８＞　、　ＳＤＳ、　
２−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ
最終濃度６０ｍＭ、２％、４％、　１０％になるように
加え、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴木
、　ａ伝、　３１．４３　（１９７７）　］を行なった
。

分離用ゲルは１６％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ、　Ｋ、　ｌ−ａｅｍｍｌｉ
。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７．　６８０（１９７０）　］を
用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシー
プルーＦ１２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発
現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１０図
に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナ−（島津、
ＱＳ−９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白
質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒトＴ
ＮＦ”Ｂ転子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａを有す
る大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１９％のヒトＴ
ＮＦ蛋白質、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドｐＴＮＦ４７４を有する大腸菌においては同
じく約２０％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生が、
それぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プ
ラスミドｐＴＮＦ　４ｏ１ＮＮを有する大腸菌における
ヒ＋−Ｔ　Ｎ　Ｆ蛋白質の産生量は、上記Ｉ）ＴＮＦ４
０１Ａの場合の約４０％にずぎず、発現ベクター１）Ａ
Ａ４１の有用性が示された。

実施例７（活性の評価）ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活
性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。すな
わち、実施例６で得られたヒトＴＮＦ蛋白質又は新規抗
腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートを順次培
地で希釈した試料１００μρと、４　Ｘ　１０”個／ｄ
の濃度のマウスｌ　−９２９繊紺芽細胞（ＡＴＣＣＣＣ
Ｉ、９２９）懸濁液１００μ夏を、９６穴の組織培養用
マイクロプレート（コースタ−）内で混合した。なおこ
の際に、最終濃度１μｇ／ｄのアクチノマイシンＤ（コ
スメケン。

墓石製薬）を添加しておく。培地としては、５％（ｖｏ
ｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を含むイーグルのミニ
マム・エツセンシャル培地（日本製薬）を用いた。上記
マイクロプレートを、５％炭酸ガスを含む空気中、３７
℃で１８〜２０時間培養した後、クリスタル・バイオレ
ット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）メタノール水溶液
に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）のクリスタル・バイオ
レットを溶解させたちのコを用いて生細胞を染色した。

余分なりリスタル・バイオレットを洗い流し乾燥した後
、残ったクリスタル・バイオレットを１００μ旦の０．
５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５９５μｍにおける吸
光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東洋側器、ＥＴｌ−９
６型）で測定する。この吸光度は、生き残った細胞数に
比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白質又は新規抗腫瘍活
性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加
えない対照の吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライ
ゼートの希釈倍率をグラフ（たとえば第１１図）によっ
て求め、その希釈倍率をユニットと定義する。第１１図
より、発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Δにコードされ
るヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１００μ
川は８．９×１０４ユニツト程度の活性を、そして発現
型プラスミド１’１ＴＮＦ４７４にコードされる新規抗
腫瘍活性ポリペプチドを含む大胆筒ライゼー１〜１００
μ文は１．５×１０５ユニットの活性を、それぞれ有し
ていることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドＩＩＴＮＦ４０１
ＡにコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミ
ドＩ］ＴＮＦ４７４にコードされる新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質量
は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ランド）
を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線よ
り計算した。上記で得られた発現量、活性の値及び蛋白
質定量結果よりヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドの比活性を計算したところ、表１のような値
が得られた。表１より、新規抗腫瘍性ポリペプチドはヒ
トＴＮＦ蛋白質の約１．３倍の比活性を有していること
がわかる。

一４８＝表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遠伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦｌ転子の一部を有するプラスミド１１
ＴＮＦＩＢＲ，Ｉ）ＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方
法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴ　Ｎ
　Ｆ　遺伝子発現型プラスミドｐＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ
　Ｎの作成方法を、第７図は発現ベクター＋）Ａ　Ａ　
４１の作成方法を、そして第８図はヒＩ−Ｔ　Ｎ　Ｆ遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、
それぞれ示したものである。第９図は新規抗腫瘍活性ポ
リペプチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４７４の作
成方法を示したものである。第１０図はヒトＴＮＦ遺伝
子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現結果を
認定したゲル電気泳動の写真を示したものである。第１
１図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍　゛活性ポリペ
プチドの活性測定結果を示したものである。第１Ｏ冒 ←派曳も峰嶌活・匝藺Ｊ〜〕吟し

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する第１項記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４６８である
第３項記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする第７項記載微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
酸配列があります】【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。