JPS63148995A

JPS63148995A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPS63148995A
Application number: JP61296767A
Authority: JP
Inventors: Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Satoshi Nakamura; 聡中村
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-12-15
Filing date: 1986-12-15
Publication date: 1988-06-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−１ｔＪＢ生化学委員会（ＣＢＮ）″ｃ採用された方
法により略記するものとし、たとえば・下記の略号を用
いる。

ＡｌａＬ−アラニンＡｒａＬ−アルギニンＡｓｎＬ−アスパラギンＡｓｐＬ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧｌｎ　　Ｌ−グルタミンＧｌｕＬ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシント１ｉｓ　　ｌ−ヒスチジンＩｔｅｌ−イソロイシン１−ｅｕｌ−ロイシンＬｌ／Ｓ　　Ｌ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンＰｈｅＬ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−プロリン３ｅｒ　　ｌ−セリン丁ｈｒ　　ｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａＩ　Ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さラニ、（＋−１２Ｎ）　−及Ｕ　　
（ＣＯＯＨ）Ｌ、ｔそれぞれアミノ酸配列のアミン末端
側及びカルボキシ末端側を示すものであり、（５′）−
及び（３′　）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び
３′末端側を示すものである。

（２）　　発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌ　Ｉらは、３ａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌
を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、こ
の物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏ
ｓｉｓＦａｃｔｏｒ、以下ＴＮＦと略記することもある
）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　Ｐ
　ｒｏｃ、Ｎ　ａｔｌ。

Ａ　ｃａｄ、Ｓ　ｃｉ、、ＬＪ　Ｓ　Ａ　、　７２．３
６８６　＜　１９７５）コ。このＴＮＦはマウス、ウサ
ギ、ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に
、しかも種を越えて働くことから、制癌剤としての利用
が期待されてきた。

最近になって、Ｐ　ｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃ
Ｄ　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮ　ＰＩＪ白
質の一次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒ
トＴＮＦ遺伝子の発現について報告したＣ　Ｄ　、　　
Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　ｌ”Ｊａｔｕｒｅ　、　　３
１２．　７２４（１９８４）　］　、その後、白井ら［
Ｔ、　５ｈｉｒａｉ　ら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６
０（１９８５）　］　、Ｗａｎｇら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎ！
＋ら、　３ｃｉｅｎｃｅ、ユ２８．　１４９（１９８５
）　　］及びＭ　ａｒｍｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ　
ａｒｌｌｌｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　３ｉｏｃｈｅｍ、、ユ５２．　５１５
（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌におけ
る発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引ぎ起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［３，Ｂｅｕｔｔｅｒ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｍｂｌｅら、Ｊ、ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　、　　１
６２．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、
　Ｒ，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎ　ａｔｕｒｅ　、　　
３１９．　５１６　（１９８６）コ等が報告されている
。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ　ｓ　Ｉｆ及びＣｙ　３　／Ｐ／の
いずれか又は両方の他のアミノ酸残基への置換（ＰＣＴ
出願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６ｌ−１０
６７７２）　、Ｇ　ＩＶ”の他のアミノ酸残基への置換
（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０
４８号）。

Ａｌａ”の他のアミノ酸残基への置換（特願昭６１−２
３３３３７号）が報告されている。また、アミノ末端側
のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失ＴＮ
Ｆが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−５０
９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有
していることく特願昭６１−９００８７号）、１〜１０
アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、その
比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大になる
こと（ＰＣＴ出願公開ＷＯ３６／　０２３８１号）、１
０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること
（特願昭６１−１１４７５４号）、及び１１アミノ酸欠
失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１
−１７３８２２号）が報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上２反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に池の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）　　発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ）　−１−１ｉｓ−３ｅｒ　−Ｔｈｒ−１ｅｕ
−ＬＶＳ　−ｐ　ｒｏ　−Ａ　ｌａ−Ａ　ｌａ　−Ｈｉ
ｓ−Ｌ　ｅｕ　−（ｌｅ−Ｑ　１ｙ−Ａ　ｓｎ　−Ｐ　
ｒｏ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉ
ｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−１ｅｕ−（３Ｉｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ
　ｅｌＪ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｒ（＋−Ａ　ｌ
ａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　１ａ−１ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−
Ａ　１ａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　ｌｙ　−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　Ｉ
ｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｓｐ　−Ａ　５ｎ
−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ−Ｖａｔ−Ｖａｎ　−Ｐｒｏ−３ｅ
ｐ−Ｇｌｕ　−Ｇ　ＩＶ　−１ｅｕ　−Ｔｙｒ　−Ｌ　
ｅｕ　−１ｌｅ　−Ｔｙｒ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｎ−Ｖ
ａｔ−Ｌ　ｅｕ−ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　Ｉｎ
−Ｇ　ＩＶ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｈｒ−
Ｈｉｓ−Ｖ　ａｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−
Ｔｈｒ−１１ｅ−８ｅｒ−Ａ　ｒｇ−１ｌｅ−Ａ　ｌａ
−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ−丁ｈｒ−１ｙｓ
　−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｓｎ　−１ｅｕ−１ｅｕ−３ｅｒ−
Ａ　ｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−
Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｒ（１−Ｇ　Ｉｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ
−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ−△ｌａ−１
ｙｓ−ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　Ｉｕ　−
Ｐｒｏ−１１ｃｍ　Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｖａｌ−ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｅＵ　−Ｇ　ｌ
ｕ　−１ｙｓ−Ｇ　＋ｙ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ａｒｑ−Ｌ
ｅｕ−３ｅｒ−Ａ　１ａ−Ｇｌｕ　−１１ｅ−Ａｓｎ　
−Ａ　ｒｇ−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ｔ　ｌ／ｒ−Ｌ　
ｅｌｌ−Ａ　５ｌ）−Ｐ　ｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−８ｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ
−１１ｅ−ｆｌｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノＭ　［Ｄ、　
Ｐｅｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドン
の中から適当なものを選び、それを化学合成することに
よって取得で１６゜ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては
、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが
望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行・
なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部
位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦ遺伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成７人としてはジエステル法ＣＨ、Ｇ　、　Ｋ　ｈｏｒ
ａｎａ。

”　３　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅＶｅｌｏｐ
ｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｒ　　Ｐ
　ｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｆＢ　
１ｏｌｏｏｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　”　
、　　Ｊ　ｏｈｎ　　　Ｗ　１ｌｃｙａｎｄ　　　５ｏ
ｎｓ　　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１
９６３）　　］　　。

トリエステル法［Ｒ，Ｌ、　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒう、　
Ｊ　。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｗ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　Ｅがあるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたボス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーぜを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオ千ドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、Ｂ　
ｏｌｉｖａｒら、　　Ｑｅｎｅ　　、　　２．９５（１
９７７）　］のようなベクターに一度クローン化した後
、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が好
ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロッ
クのＤＮＡｆｌｌｌｉ片を含むプラスミドとして、好ま
しくはｐＴＮＦｌＢＲ。

βＴＮＦ２Ｎまたは０丁ＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ）立伝子を
構成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当な
ブロモ−クー、ＳＤ（シャイン・ダルガーノ）配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａＣプロモーター、ＰＬプロモーター、
　１０ρプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとしで、りｆましくはｐＹ　Ｓ　３１Ｎ
、又はρＡＡ４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒｈ　Ｔ　ＮＦ遺
伝子下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を
付与することができる。このようなターミネータ−とし
て、１ｐｐターミネータ−１ｔｒｐターミネータ−等が
あげられるが、とりわけｔｒｐ　Ａターミネータ−が好
適であり、ｔｒｐ　Ａターミネータ−を有するプラスミ
ドとして、好ましくはＩ）ＡＡ４１が用いられる。この
発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、たとえばｌ］ＢＲ３２２山
来のベクターにクローン化することにより、発現型プラ
スミドが作成できる。ヒトＴＮＦｌ転子発現型プラスミ
ド、として、好ましくはＤＴＮＦ４０１ＮＮ又はＤＴＮ
Ｆ４０１△が用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒト丁ＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当なｔ＝ａ配列を有する合成オリ
ゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる
手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意の
アミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、ま
たは欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコー
ドする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能にな
る。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミドとして、好ましくはｐＬＴＮＦ２が用いら
れる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価：とｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子を発現させるための微生物宿主としては、大腸
菌、枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［
エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｉ）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プ
ラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ　、　Ｖ　、　
Ｎ　ｏｒｇａｒｄら。

Ｑｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ〜株（△ＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして１ｑられた組換え微生物細胞を、それ自
体は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグ
ルコースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ　０Ｍ　ａｎ
ｉａｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏｌｅｃｕｌａｒＱｌｏ
ｎｉｎｇ”　、　ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　５ｐｒｉ
ｎｃｌ！−１ａｒｂｏｒ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、
　Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげら
れ、必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加する
のが望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件
、たとえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７
°Ｃで２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培
等中に、プロモーターを効率良く機能させる目的で、３
−β−インドールアクリル酸等の薬剤を加えることもで
きる。

培Ｉ後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。（稈られた
ライゼー１−中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（
以下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルア
ミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋
白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現をＴｉｆ！認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの活性の評価は、マウスに移植した
ＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖｉｖ
ｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌｌ　ら。

前出）、マウスＬｍ胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ｖ：ｔｒｏ活性測定法［ＲｕＨ、、）。

ｌ　ｍｍｕｎｏｌ、、ユ２６．　２３５（１９８１）　
１等により行なえるが、測定時間、定量性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ｖｔｔｒｏ活性測定法による評
価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦ遺伝子を設計した
、設計に際しては、ｐ　ｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　］　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設け、５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３
′側に２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそ
れぞれ付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には
制限酵素ＣＲａＩによる切断部位を設け、ＳＤ配列と翻
訳開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモータ
ーとの連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン
下流には制限酵素）１ｉｎｄｌｎによる切断部位を設け
、ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした
。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴ　Ｎ　Ｆ　遺伝子は、第２図に示したよ
うに１７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オ
リゴヌクレオチドの合成は仝自ＮＪ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成機
（アプライド・バイオシステムズ。

モデル３８０△）を用いて、ホスファイト法により行な
った。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド・
バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。す
なわら、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水溶
液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護基
をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（フ
ァルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量の合
成オリゴヌクレオチド画分を分取する。ついで、７Ｍ尿
素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度２
０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パター
ンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分を切
出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく破砕
した後、２〜５Ｉｄの溶出用バッファ　−［５００ｍＭ
　　ＮＨ４０ＡＣ−１１１１ＭＥＤＴＡ−０゜１％ＳＤ
Ｓ　（ｐｌ−（７，５）　］を加え、３７℃で一晩振と
うした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回
収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶
液をゲル遺過カラム（セファデックスＧ−５０）にか（
プることにより、合成オリゴヌク・レオチドの精製品を
得た。イ５お、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の
向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮ　Ｆｉｆｆ伝子のクローン
化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜Ｔ　Ｎ　Ｆ　−１７＞を用いて、ヒ［・Ｔ
ＮＦ遺伝子を３つのブロックに分けでり１］−ン化した
。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉ３タイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ文の５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（１１Ｈ９，５＞　、　１０　ｍ
Ｍ　　Ｍ（Ｉ　Ｃ１２゜５　ｍＭジチオスレイトール、
１０ｍＭ　　ＡＴＰ水溶液中で、３７℃で、３０分間行
なった。反応終了後、すべての合成オリゴヌクレオチド
水溶液をすべて温合し、フェノール抽出、エーテル抽出
によりＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを失活、除去す
る。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ７の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室渇まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μｌの６６　ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ　（ＤＨ７，６）　、　　６，６１１
１Ｍ　　Ｍｇ　Ｃ１ｚ　。

１０　ｍｊｙｌジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ水溶
液に溶解させ、３００ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行な
った。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動く
ゲル濃度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法
により泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ
く約２２ｏｂＯ）のバンド部分を切出して、実施例２の
方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収
する。

一方、３μグの大ＩＩｉ菌用プラスミドＤＢＲ３２２（
約４．４Ｋ　ｂＤ）を３０Ｈ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ
　Ｃ１，７ｍｌｖｌＭ　ＯＣ１２水溶液に溶解させ、１
０ユニツトの制限酵素Ｃ１ａ丁＜ニューイングランド・
バイオラブズ〉を添加して、３７℃で１時間切断反応を
行なった。

制限酵素Ｃ１ａ工による切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０Ｈ塁の５０１１１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ７，４＞　、　　１００　ｍＭ　　
Ｎａ　Ｃｊ、　１０１１１Ｍ　　Ｍ＜ｌ５ＯＪ水溶液に
溶解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造
）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反
応終了後、アガロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％
）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パ
ターンの観察を行なう。プラスミドｔ）ＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７ＫｂｐのＤＮＡの部分に相当するバ
ンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏ
ｌ　７ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣ１４水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、［３ｉｏｃｈｅｍ、　　１
０１．　３３９（１９８０）　］により、杓３，７Ｋ　
ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ工＜→５ａｌＩ）をアガロー
スゲルより回収した。

先に１９られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２２０
１］ＤのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端
のリン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２
の大部分を含む約３．７ＫｂＤのＤＮＡ水溶液と混合す
る。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ
断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａＣ１ｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｇａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｍｌのし培地
（１％トリプトン、０．５％１ｆｆｌエキス、０．５％
ＮａＣｌ　　ＤＨ７，２）にニジエリｔｌニア−’：］
すＣ６００ｒ−ｍ−株の１８時間培養基を接種し、菌体
を含む培養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｔＩρ）
が０．３に達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネ
シウム・バッファ　−［０，ＩＭ　　Ｎａ　Ｃｓ、　５
　ｍＭ　　〜’Ｉ（ＪＣＲ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ　（１）Ｈ７，６，０℃）］中で２回洗い、２ｄ
の冷したカルシウム・バッファー［１００１１Ｍｃａ　
Ｃ１ｚ　、　２５０　　ｍＭ　　ＫＣｌ、　５　　ｍＭ
Ｍｔ）Ｃ第２　、５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（Ｄ
Ｈ７，６゜０℃）］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放
置する。

次に菌体をこの各日の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で・濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：ｉ　（
ｖｏｌ、：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ｄのＩＢＧ培地（１％１〜リブトン
、０．５％酵母エキス、］％ＮａＣｆ、　　０．０８％
グルコース、、　　ｌ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃で
１時間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシ
リン（シグマ）３０Ｈｇ／Ｆｄを含むし培地プレートコ
に１００μｉ／プレートの割合で接種する。プレートを
３７℃で１晩培養しで、形質転換株を生育させる。得ら
れたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用
いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、
目的のプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ（約１１．０１（ｂｐ
）の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦ１
ＢＲの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドＤＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ
−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３（
約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及び
第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２＼及びｐＴ　Ｎ　Ｆ　
３の作成方法を、それぞれ示す。

こうしてｉｑられたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラ
スミドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の
、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通
りであることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、
　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、
６５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４　（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成
）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ３
を、実施例３と同様にして制限酵素Ｃｊａ工及びＳａ１
工で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦＩ
伝子の一部を含む約２２０ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　
Ｉ（→５ａｌＩ　）をボ’）　７　’）　’）　ルアミ
ドゲルより回収した。

次に、実施例３で１ｑられたプラスミドｐＴＮＦ２１０
μ３を１００Ｌｌ旦の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−１−
１（Ｊ（ｐｌ−１７，５）　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　
Ｃ１，７ｍＭＭ　（ｌ　Ｃ１２水溶液に溶解させ、４０
ユニツトの制限酵素ＰＶｕＩＩ（宝酒造）を添加し、３
７℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の
方法に準じて制限酵素Ｓａｌ工による切断、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の侵、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７
０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩ＋ＰｖｕＩＩ）をポリア
クリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
７１９も１００μｆｉの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−Ｈ
Ｃ１（ＤＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１，
７ｍＭＭｇ（Ｊ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ＰＩＩＩ及び４０ユニツトの制限酵素Ｈｉｎｄ（
［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行
なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）の復、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０１）Ｉ）のｒ）ＮＡ断片
（Ｐｖｕ［＜→Ｈｉｎｄｌｌｌ）をポリアクリルアミド
ゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
Ｙｓ３’ＩＮ（約４．７Ｋｂｐ）　５μ３を、上記と同
様に制限酵素ＣｊａＩ及び）ｌｉｎｄｌｌ［で切断し、
アガ（コースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、
実施例３の方法に準じて、プラスミドｐＹ　Ｓ　３ＩＮ
の大部分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片＜ｃｐａ
Ｔ←Ｈｉｎｄｌｌｌ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｌ）及び約１１０ｂＤの３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む
約４．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ遺伝子発
現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５，２Ｋ　ｂｌ
））を有するクローンを選択した。第６図に、そのプラ
スミド１）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｔ）ＹＳ３ＩＮ５μりを、上記の
方法に準じて制限酵素ｐｖｕ［で部分分解した後、さら
に制限酵素ＨｉｎｄＩ［［で切断し、アガロースゲル電
気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準
じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤ
ＮＡ断片［Ｐ　ｖｕＩＩ　（２１＋　Ｈｉｎｄ　［Ｉ　
Ｊ　ヲアガロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実ＩＪＩ例３の方法に準じて、末端のリン酸化
を行ない、アニーリングの後、先に得られた約２，７Ｋ
　ｂｐのＤＮＡ断片［ｐｖｕ■（２）←１−（ｉｎｄＩ
［Ｉ］と混合し、エタノール沈澱の慢、実施例３の方法
に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行な
った。反応終了１々、実施例３の方法に準じてエシェリ
ヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、形質転換株の
中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．７Ｋ　ｂｐ
）を有するクローンを選択した。このようなプラスミド
は、プラスミドｐＹ　Ｓ　３＋Ｎからコピー数詞（社）
ａｌｆｆ除去し、ｔｒρプロモーター下流に存在するク
ローニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒｐ　Ａターミネ
ータ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクター
であり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μ７１を、上記と同様に
制限酵素ｃＦａＩ及びＨｉｎｄｌｌで切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミドＩＩＡ　Ａ　４１の大部分を
含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ工＋ト１ｉ
ｎｄＩＩＩ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴ　Ｎ　Ｆ遺伝子発現型プラス
ミドルＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ　５μ９を、上記と同
様に制限酵素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動くゲルｉ１１度５％）の
後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を
含む約４９０ｂｌ）のＤＮＡ断片（（Ｊａ　Ｉ　←Ｈｉ
ｎｄ　ＩＩＩ　）をポリアクリルアミドゲルより回収し
た。

こうして得られた、プラスミドＩ）Ａ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７ＫｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮ　Ｆｉ
宵伝子全域を含む約４９０ｂｌ）　０）　Ｄ　Ｎ　Ａ断
片とを混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に
準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なっ
た。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−ｍ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミド１）ＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋ
ｂＤ）を有するクローンを選択した。このプラスミドは
、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有
しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリベブ升ド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
ＩＩＴＮＦ　４０１Ａ２０μりを、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＣＦａｌ及びト１ｉｎｄｌｌ）で切断し、
ポリアクリルアミドゲル゛看気泳Ｕノ（ゲル濃度５％）
及びアガロースゲル電気体＃７１（ゲルｉ１度０．８％
）の後、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成
する２つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｏ及び約２．７Ｋｂ
ｐ、両方共Ｃｊａ　Ｉ（−ｉｔ−（ｉｎｄ　Ｉ［ｌ　＞
　ヲゲルヨリ回収した。

ここで得られたヒｈ　Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子全域を含む約４
９０１）Ｉ）のＤ’ＮＡ所片を５０μｌの１０　ｍＭＴ
　ｒｉｓ−ＨＣｊ　　　（ｐＨ７，４）　　　、　　　
１０ｍＭ　　　　Ｍ（］　　　ＳＯａ　　　、　　　１
　　　ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解させ、１０
ユニツトの制限酵素１−（ａｐＩＩ＜宝酒造）を添加し
て、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了浚、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を行
ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の大
部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａｐ■（→Ｈ
ｉｎｄＴｆｌ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を１１なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｊａ　Ｉ
＋Ｈｉｎｄ　ｍ　）及びヒトＴＮＦ遺伝子仏子の大部分
を含む約３９０ｂｌ）（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉ１５’ｉ
片（ＨａｐＩＩ＋１−１　ｉｎｄ　ｍ　）と混合し、エ
タノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーぜによる連結反応を行なった。反応終了後、
実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｎ＋−株に導入し、形質転換株の中より目的のプラス
ミドＤＬＴＮＦ２（約３．２Ｋ　ｂρ）を有するり（」
−ンを選択した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列
＜１−１２　　Ｎ　）　　−Ｈ１ｓ−３ｅｒ＝Ｔｈｒ　
−１ｅｕ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｐ　　ｒｏ−Ａ　　ｌａ−Ａ
　　ｌａ−トｌ　　ｉｓ　−Ｌ　　ｅｕ　−１１ｅ　−
Ｇ　　ｌｙ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　
Ｉａ　−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１ｎ−Ｌ　ｅｕ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ−Ａ
ｒｇ　−Ａ　ｒｇ　−△１ａ−Ａｓｎ−△ｌａ−Ｌ　ｅ
ｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　５ｎ−Ｇ　ＩＶ−Ｖ　ａ
ｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒＱ−Ａ　５ｌ）−Ａ　
３ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
８ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｙ−１−ｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−３ｅｒ’−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌ
　ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌ
ｙ−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒＯ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｈｔｓ−Ｖａ
ｌ−１−ｅｕ−１ｅ’ｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−１
ｌｅ−３ｅｒ−Ａｒｇ−１ｌｃ−△ｌａ−Ｖ　ａｔ　−
Ｓ　ｅｒ−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　１ｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａ
ｌ−Ａｓｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ　−Ｓｅｒ　−Ａ　
ｌａ−１ｌｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｇ　
１ｎ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　ｒｏ　−
Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　１ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ａ　ｌａ
−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐ
　ｒｏ−１ｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｃｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　１ｙ
−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　ｌｎ−Ｌ　ｅｌＪ−Ｇ　ｌｕ
−Ｌ　ｙＳ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｌ）−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ
−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ｇｌｕ−（ｌｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｒ
！］−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ｔ　’！／ｒ　−Ｌ　ｅ
ｔｌ−Ａ　３１　Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　
ｅｒ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｃ−
Ｇｌｙ　−１ｌｅ−Ｉ　Ｉｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−（ＣＯ
ＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

実Ｍ例６（発現の確認）前記実施例４で１募られた発現ベクターＩＩＡ　Ａ　４
１゜ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドＤＴＮＦ４０１
ＮＮ又はｐＴＮＦ　４０１Ａ、又は実施例５で得られた
、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＬＴＮＦ２を有するエシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ
−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／ｄのアンピシリン、０．
２％のグルコース及び４１１１５Ｆ／ｄのカザミノ酸を
含むＭ９培地［０，６％Ｎａ　２　ＨＰ　Ｏｓ　　　Ｏ
，３％Ｋｚ　ＨＰＯ４−０，０５％Ｎａ（Ｊ−０，１％
ＮＨ４Ｃ２水溶液（ｐＨ７，４）をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭＩＪ　ＳＯ
Ｊ水溶液及びＣａＣｊ２水溶液をそれぞれ最終濃度２ｎ
＋Ｍ及び０．１　ｍＭになるように加える。］　　２５
０ｍに接種し、０Ｄｔｔａが０．７に達するまで、３７
℃で撮どう培養を行なった。次いで、最終濃度５０μｇ
／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中に添加
し、さらに３７℃で１２時間振どう培養を続けた。

遠心分離により大腸菌国体を集めた後、ＰＢＳバッファ
’　　（１５０ｍＭ　　ＮａＣｊを含む２０　ｍＭリン
酸バッファー、　　１）ｌ−１７，４）を用いて菌体の
洗浄を行なった。洗浄後の菌体を１０＃ｌｉ！のＰＢＳ
バッファーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　
２００Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離によ
り菌体残渣の除去を行なった。

１９られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ
−１−Ｉ　ＣＥバッファー　（１）ｌ−１６，ｌ１ｌ）
　、　Ｓ　Ｄ　Ｓ、２−メルカプトエタノールぞれ最終濃度６０ｍＭ，２％，４％，１０％になるよう
に加え、ＳＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［銘
木，遺伝，■，　４３　（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１２．５％とし、泳動バッファーはＳＤ３
、Ｔｒｌｓ−グリシン系［Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌｉ
。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　　６８０（１９７０）
　］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクー
マシーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、
ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第
１０図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナーく島津，
ＣＳ−　９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋
白質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋
白質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒト
ＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１１ＴＮＦ　４０１Ａを
有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１１％のヒ
トＴＮＦ蛋白質，新規抗腫瘍活性ポリフベブチド遺伝子
発現型プラスミドｐＬＴＮＦ２を有する大腸菌において
は同じく約１７％の新規抗腫瘍活性ポリペプチドの産生
が、それぞれ認められた。また、ヒトＴＮＦ遺伝子発現
型プラスミドｔｌＴ　Ｎ　Ｆ　　４０１Ｎ　Ｎを有する
大腸菌におけるヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記ｐＴ
ＮＦ４０１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベクター
１）ＡＡ４１の有用性が示された。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。づなわら、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料１００μ旦と、４　Ｘ　１
０５個／雇の濃度のマウス上−９２９繊紺芽細胞（△Ｔ
ＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μ文を、９６穴の組
織培養用マイクロプレート（コースタ−）内で温合した
。なおこの際に、最終濁度１μｇ／ｍのアクチノマイシ
ンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を添加しておく。培地と
しては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児血清を
含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（日本製
薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸ガス
を含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した後、ク
リスタル・バイオレット溶液［５％（■０１／ＶＯＩ　
）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）の
クリスタル・バイオレットを溶解さけたもの］を用いて
生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレットを
洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレット
を１００μ磨の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、その５
９５ｎｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザー（東
洋測器、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、
生き残った細胞数に比例する。そこで、ヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗１１［活性ポリペプチドを含む大腸菌ライ
ゼートの希釈溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値
に相当する大腸菌ライゼートの希釈倍率をグラフ（たと
えば第１１図）によって求め、その希釈倍率なユニット
と定義する。第１１図より、発現型プラスミド１）ＴＮ
Ｆ４０１△にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸
菌ライゼート　１００ｕｕはＪ、５ｘ　１０５ユニツト
程度の活性を、そして発現型プラスミドｐＬＴＮＦ２に
コードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌
ライぜ一部　１００ｔｌｌは約２、Ｏｘ　１０５ユニツ
ト程度の活性を、それぞれ有していることが明らかにな
った。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
Ｉ）ＬＴＮＦ２にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白質口は、
プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ランド）を用
いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量線より計
算した。上記で１与られた発現舟、活性の値及び蛋白質
定量結果よりヒｌ′−Ｔ　Ｎ　Ｆ蛋白質及び新規抗腫瘍
活性ポリペプチドの比活性を計算したところ、表１のよ
うな値が１９られた。表１より、新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドはヒトＴＮＦ蛋白質とほぼ同様の比活性を有して
いることがわかる。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦｍ伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成方法を
、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮＦ遺伝
子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を
、第７図は発現ベクター１）Ａ　Ａ　４１の作成方法を
、そして第８図はヒトＴＮＦｍ転子発現型プラスミドｐ
Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したち
のである。第９図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミドｐＬＴＮＦ２の作成方法を示したもの
である。第１０図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活
性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示したものであ
る。第１１図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポ
リペプチドの活性開明定結果を示したものである。　　　　　　　　　　　　
　−躍特許出願人　　帝　　人　　株　　式　　会　　社第斗
■ Ｐｖｕ江Ｃ〕　Ｂつ第ｒＴ風のＢＰｖｕ　ｌ［ＣＩ　）第　８　密１ｈｌｉｈ＝ＩＩＩＬ　　　　　↓時制）１ｉｈＪ　Ｉ
Ｌ躬ｑ［２ＸのＢ第１１（￥ｌ赤釈椙牟手続ネｆｔ７正書昭和６２年　２月ｑ日１寺＝’ｒｔ〒良′ぎ殿１、事件の表示特願昭　６１　−　２９６７６７　　号２、発明の名称新規生理活性ポリペプチド＼−−／″ 纂９いのＢ手続ネ…正書昭和６２年Ｊ月−日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する第１項記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二重鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二重鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＬＴＮＦ２である第
３項記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする第７項記載微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
酸配列があります】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。