JPH02142491A

JPH02142491A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPH02142491A
Application number: JP63296305A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Nakamura; 聡中村; Kaku Katou; 加藤　革; Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Kazuo Kitai; 北井　一男; Masamitsu Fukuoka; 福岡　政実; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-11-25
Filing date: 1988-11-25
Publication date: 1990-05-31
Anticipated expiration: 2010-10-25
Also published as: JPH0797998B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）　　産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド、該プラ
スミドによって形質転換された組換え微生物細胞及び該
微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの製造方
法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する新規ポ
リペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチドと略す
こともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮＡａ域
を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって形質転
換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用いた新
規抗腫瘍活性ポリペプチドの製造方法に関する。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ａｌａｌ、−アラニンＡ−ｒｑ　　Ｌ−アルギニンＡｓｎＬ−アスパラギンＡｓｐＬ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧｌｎ　　Ｌ−グルタミンＱｌｔｌｌ−−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシンＨｉｓｌ−ヒスチジンｌ１ｅＬ−イソロイシンしｅｕ　　Ｌ−ロイシンＬｙｓＬ−リジンＭｅｔ　Ｌ−メチオニンｐｈｅＬ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−−プロリン３ｅｒ　　ｌ−セリンＴｈｒ　Ｌ−スレオニンＴｒｐ　　Ｌ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｌ　　ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示す。）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さラニ、（Ｈ２Ｎ）　−及Ｕ　　（Ｃ
ＯＯＨ）はそれぞれアミノ酸配列のアミン末端側及びカ
ルボキシ末端側を示すものであり、（５′　）−及び（
３′　〉はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末
端側を示すものである。

（２）発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌ　Ｉらは、３ａｃｉｌｌｕｓ　　Ｃａｌ
ｍｅｔｔｅ　−Ｑｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前も
って刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した後
に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による癌
を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、こ
の物質を腫瘍壊死因子（Ｔ　ｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏ
ｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づけた［　Ｅ　、　Ａ、　Ｑａｒｓｗｅｌｌ　
ら、　Ｐ　ｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
かも種を越えて動くことから、制癌剤としての利用が期
待されてきた。

最近になって、ｐｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのＣＤ
ＮＡクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一次構
造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮＦ遺
伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　ｅｎｎ
ｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７２４
（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、　５ｈｉｒ
ａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］、宗村ら［余材ら、癌と化学療法、　１２．　１６０
（１９８５）　］　、Ｗａｎａら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇら
、　５ｃｉｅｎｃｅ、　　２２８．　１４９（１９８５
）　］及びＭ　ａｒｌｅｎｏｕｔら［Ａ　、　　Ｍ　ａ
ｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂ１０Ｃｈｅ１．、１５２．　５１５
（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸菌におけ
る発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こす原因の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［８，８ｅｕｌｔｅｒ
ら、　Ｎａｔｕｒｅ　。

３１６、　５５２（１９８５）　］　、カケクチンがリ
ボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから、Ｔ
ＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し、そ
の結果として高脂血症のような副作用を引き起こす可能
性のあることが示唆された。また、それ以外にも、血管
内皮細胞への影Ｗ［Ｊ、Ｒ。

Ｑａｌｂｌｅら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　、ユ６２
．２１６３（１９８５）　］　、骨吸収作用［Ｄ、　Ｒ
，Ｂｅ１ｔｏｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９
．　５１６（１９８６）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の進歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質をａｌ製する研究が、
数多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ蛋白質のアミノ酸
配列において、Ｃｙ　ｓ　′ｆ及びｃ　ｙｓ′ｓ／のい
ずれか又は両方のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への
置換（ＰＯＴ出願公開Ｗ０８Ｂ／　０４６０６号、特１
ｉ［６１−１０６７７２＞　、ＧＩｙ／ｕ）ｆＬ１７ミ
／酸残基への置換（特願昭６１−１０６７７２号、特願
昭６１−２３８０４８号）、Ａ１ａ’の他のアミノ酸残
基への置換（特願昭６１−２３３３３７号）が報告され
ている。また、アミノ末端側のアミノ酸残基の欠失につ
いても、６アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有して
いること（特開昭６１−５０９２３号）、７アミノ酸欠
失ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特願昭６１
−９００８７号）、１〜１０アミノ酸欠失ＴＮＦがＩ［
胞障害活性を有しており、その比活性は６〜８アミノ酸
欠失ＴＮＦにおいて極大になること（ＰＣＴ出願公開Ｗ
Ｏ３６／　０２３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが
細胞障害活性を有していること（特願昭６１−１１４７
５４号）、１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有
していること（特願昭６１−１７３８２２号）、及び７
アミノ酸欠失ＴＮＦを基盤として、Ｐ「０８３　ｅｒｉ
ｌ　Ａ　３ｐｌＯｅ　Ａ　ｒＯＬ　ｙＳＡ　ｒＱへ置換
を行なうと、その比活性が大きく上昇することが報告さ
れている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上９反
応スペクトルの広域化、　５ｉ１Ｊ作用の低減化等を目
的として、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を
行ない、本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物細
胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する方法
を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）　　発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ　＞　−Ａｒ（］　−Ｌｙｓ−Ａｒ（］　−ｃ
ｙｓＰ　ｒｏ−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｌａ−Ｈｉｓ−Ｖ　ａｌ
−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｌａＡ　ｓｎ　−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ
　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ　−
Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅｌＪ−Ａ　Ｓ
ｎ−Ａ　ｒＯ−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｌａ−Ａ　ｓｎ−Ａ　
ｌａ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｌａ−Ａ　ｓｎＧ　ｌ
ｙ　−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　Ｉｕ−１，ｅＵ　−Ａ　ｒＧ　
−Ａ　Ｓｐ−Ａ　Ｓｎ　−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｖ　ａ
ｌ−Ｖ　ａｔ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｕ　−ＧＩ
ｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−Ｓ　
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｇ　＋ｙ−ＣＶＳ−Ｐ　ｒｏ−Ｓ　ｅｒ−
Ｔ　ｈｒ−ＨｉＳ　−Ｖａｌ−１ｅｕ−１ｅｕ−Ｔ　ｈ
ｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−１１ｅ−３ｅｒ−Ａ　ｒ！７−１
　１ｅ−Ａ　ｌａ−Ｖａｔ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇ　Ｉｎ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
８ｅｒ−Ａ　ｌａ−１１ｅ−Ｌ　ｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　ｒＯ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ
　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　Ｉａ　
−Ｇ　ｌｕ−Ａ　ｌａ−Ｌ　ｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ
−Ｔ　ｙｒ−Ｇ　Ｉｕ−Ｐ　ｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　ｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉ
ｎ−１ｅｕ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　Ｖｓ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ
−Ａｒｌ：ｌ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−１１
ｅ−ＡＳｎ−Ａ　ｒ（＋−Ｐ　ｒｏ−Ａｓｎ　−Ｔ　ｙ
ｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　３＋）　−Ｐ　ｈｅ　−Ａ　ｌ
ａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａ
ｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｉ　　Ｉｅ−１１ｅ−Ａ
ｌａ−Ｔｒｐ　＝（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチド、また上記
新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコードするＤＮＡ領域を
含む組換えプラスミドを提供することによって達成され
、更にかくして得られた組換えプラスミドによって形質
転換された組換え微生物細胞、その微生物細胞を用いて
目的とする新規抗腫瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法
及びこの新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含有する医薬組
成物を提供することによって達成されることがわかった
。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノＭ　［Ｄ、　
Ｐｅｎｎ１ｃａら、前出］を指定するいくつかのコドン
の中から適当なものを選び、それを化学合成することに
よって取得できる。ヒトＴＮＦ遺伝子の設計に際しては
、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択することが
望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易に行な
えるように適当な位置に適当な制限酵素による切断部位
を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮＡ領域は、そ
の上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開始
コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流方
向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コド
ン（ＴＧＡ。

ＴＡＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦＩ伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
トＴＮＦ遺伝子の塩基配列の例を、第１図に示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦｍ伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たとえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法［Ｈ，Ｇ、　Ｋｈｏｒａｎａ
。

“３　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　Ｄ　ｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔｓｌｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　Ｐ　ｈ
ｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　ｏｆ３　ｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　　　ｌ　ｎｔｅｒｅｓｔ　”　、　Ｊ　
ｏｈｎ　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　３ｏｎｓ　、　　Ｉ
ｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１９６１）　］　。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら
１、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．　７
１９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作
の簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成機を用いたホス
ファイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌク
レオチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロ
マトグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いる
ことができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴヌ
クレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成する方法
としては、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロッ
クに分けて連結し、たとえばｐＢ　Ｒ３２２［Ｆ　、　
　Ｂｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．９５（
１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化した
後、それらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方法が
好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成するブロ
ックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好ましくは
ｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＤ　（シャイン・ダルガーノ）配列の
下流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることがで
きる。使用可能なプロモーターとして、トリプトファン
・オペロン・プロモーター（ｔｒｐプロモーター）。

ラクトース・オペロン・プロモーター（ｌａｃプロモー
ター）　、　ｔａｃプロモーター、ＰＬプロモーター　
１１）Ｄプロモーター等があげられるが、とりわけｔｒ
ｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーターを有
するプラスミドとして、好ましくはＩＩＹＳ３１Ｎ、又
はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このようなターミネータ−として、
１ｐｐターミネータ−ｔｒｐターミネータ−等があげら
れるが、とりわけｔｒｉ）　Ａターミネータ−が好適で
あり、ｔｒＤ　Ａターミネータ−を有するプラスミドと
して、好ましくはｐＡ　Ａ　４１が用いられる。この発
現型ヒトＴＮＦ！仏子を、たとえばＩ）ＢＲ３２２由来
のベクターにクローン化することにより、発現型プラス
ミドが作成できる。ヒトＴ　Ｎ　Ｆ　３ｉ伝子発現型プ
ラスミドとして、好ましくはｐＴＮＦ４０１ＮＮ又はｐ
ＴＮＦ４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当な制限酵素で切断し、ヒトＴＮＦ遺伝子内の特定な
領域を除去した後、適当な塩基配列を有する合成オリゴ
ヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行なう。かかる手
法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質中の任意のア
ミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、また
は欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコード
する遺伝子を含む発現型プラスミドの作成が可能になる
。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドとして、好ましくはＩ）ＴＮＦ６１７が用い
られる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝
子を発現させるための微生物宿主としては、大腸菌、枯
草菌０Ｍ母等があげられるが、とりわけ大腸菌［エシェ
リヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）
　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラス
ミドは、たとえば公知の方法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒａａ
ｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１９７８）　］を用イテ
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−ｍ−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することができ
る。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＮ１９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら編、“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ”
　、　ｐ　４４０．　Ｃ，ｏｌｄ　　ＳｐｒａｎｇＨａ
ｒｂｏｒ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅｗ　　Ｙ
ｏｒｋ　　（１９８２）参照］があげられ、必要に応じ
て、たとえばアンピシリン等を添加するのが望ましい。

培養は目的の組換え微生物に適した条件、たとえば振と
うによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で２〜３６時
間行なう。また、培養開始時または培養中に、プロモー
ターを効率良く機能させる目的で、３−β−インドール
アクリル酸等の薬剤を加えることもできる。

培養後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を集
め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば超
音波処理により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分離に
より組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られたラ
イゼート中の蛋白質を、ラウリル硫酸ナトリウム（以下
、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリルアミド
ゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の蛋白質
を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチドの抗癌活性の評価は、マウスに移植
したＭｅｔｈＡ肉腫を壊死させる効果を見るｉｎ　　ｖ
ｉｖｏ活性測定法（Ｃａｒｓｗｅｌ　ｌら、前出）、マ
ウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　　Ｖｉｔｒ
Ｏ活性測定法［Ｒｕｆｒ　、　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、、　１２６．　２３５（１９８１）　］等により行な
える。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大
腸菌ライゼートからの分離・精製は、公知の通常知られ
ている蛋白質の分離・精製法に従えばよいが、ヒトＴＮ
Ｆ蛋白質等に対する抗体を用いたアフィニティー・カラ
ム・クロマトグラフィーが有利である。なかでも、ヒト
ＴＮＦ蛋白質等に対するマウス・モノクローナル抗体を
用いたアフィニティー・カラム・クロマトグラフィーが
とりわけ好適である。こうして得られたヒトＴＮＦ蛋白
質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド精製品を用いること
により、ｎ　ｖｉｖｏ抗癌活性（前出）及び副作用に関
する検討が可能となる。

ヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活性ポリペプチドの副
作用の評価は、カケクチン活性測定に代表されるｉｎ　
ｖｉｔｒｏ法、マウス等の実験動物に投与してその致死
量や血圧の降下程度等を測定するｉｎ　ｖｉｖｏ法等に
より行なうことができる。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍活性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが
、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴ　Ｎ　Ｆ　”＞Ｍ転子
を設計した、設計に際しては、ｐｅｎｎｉｃａら［Ｄ。

Ｐｅｎｎ１ｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．
　７２４（１９８４）　］の報告したヒトＴＮＦ前駆体
ＣＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤として
、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に設け、
５′側に翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を、そして３′側に
２個の翻訳終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＡ）をそれぞれ
付与した。また、５′側翻訳開始コドン上流には一１１
限酵素Ｃ１ａ■による切断部位を設け、ＳＤ配列と翻訳
開始コドン間を適切な状態に保った形でのプロモーター
との連結を可能にした。更に、３′側翻訳終止コドン下
流には制限酵素ＨｉｎｄｌＩ［による切断部位を設け、
ベクター・プラスミドと容易に連結できるようにした。

実ｈ１例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１
で設計したヒトＴＮＦ遺伝子は、第２図に示したように
１７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴ
ヌクレオチドの合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライド
・バイオシステムズ。

モデル３８ＯＡ　＞を用いて、ホスファイト法により行
なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル濾過によ、って、高分子量
の合成オリゴヌクレオチ６画分を分取する。ついで、７
Ｍ尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パ
ターンの観察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５Ｉ１１の溶出用バッファ　−［５０
０ｍＭ　　ＮＨ４０ＡＣ−１１ＭＥＤＴＡ−０，１％Ｓ
ＤＳ　（１）８７．５）　］を加え、３７℃で一晩娠と
うした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含む水相の回
収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチドを含む溶
液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５０）にかけ
ることにより、合成オリゴヌクレオチドの精製品を得た
。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純度の向上を
はかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化）実施例２で作成した１７本の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮＦｉ転
子を３つのブロックに分けてりＯ−ン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＢタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０１！ｌｌの５
０ｉＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ　（＋）Ｈ９，５）　、　１０
１Ｍ　　ＭｇＣ１ｚ　。

５　ｍＭジチオスレイトール、ＩＯＩＩＭ　　ＡＴＰ水
溶液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、
すべての合成オリゴヌクレ、オチド水溶液をすべて混合
し、フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌ
クレオチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μりの合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリングを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ隻の６６１１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ　（Ｅ）Ｈ７，６）　、　　６．６１
Ｍ　　ＭＣＩ　Ｃ１ｚ　。

１０−Ｍジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ水溶液に溶
解させ、３００ユニツトの７４−ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なった。

反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃
度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法により
泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ（約２
２０ｂＤ　）のバンド部分を切出して、実施例２の方法
に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回収する
。

一方、３μ３の大腸菌用プラスミドＤＢＲ３２２（約４
．４ＫｂＥ））を３０μ隻の１０１Ｍ　　Ｔ　ｒｉｓ−
ＨＣ１（ｐＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１
，７ｍＭＭＱＣＩｚ水溶液に溶解させ、１０ユニツトの
制限酵素ＣｆａＩにューイングランド・バイオラブズ）
を添加して、３１℃で１時間切断反応を行なった。

制限酵素ＣｆａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μ旦の５０１ＭＴ　ｒｉｓ
−ＨＣオ（ｐｈ　７，４）　、　　１００　ｌＩＭ　　
Ｎａ　Ｃ１，１０１１１Ｍ　　Ｍ（＋８０４水溶液に溶
解させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ（宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミドＩ）ＢＲ３２２の大部分
を含む約３，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバン
ドを切出し、そのアカ０−スゲル断片を３倍量（ｖｏｌ
　７ｗｔ）の８Ｍ　　ＮａＣｊＯ＊水溶液に溶解させた
。Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０１
．　３３９（１９８０）］により、約３，７Ｋ　ｂｒｊ
のＤＮＡ断片（ＣｊａＩ←５ａｌＩ）を７ガ０−スゲル
より回収した。

先に得られたヒトＴＮＦｍ転子の一部を含む約２２０ｂ
ｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末端のリ
ン酸化反応を行なった後、プラスミドｐＢＲ３２２の大
部分を含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ水溶液と混合する
。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じて両ＤＮＡ断
片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａＣＩｚ法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのし培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％Ｎａ　
Ｃ１，ＤＨ７，２）にエシェリヒア−］すＣ６００ｒ−
ｉ−株の１８時間培養基を接種し、菌体を含む培養液の
６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｌ、、＋）が０．３に達
するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・ハラ
７ｒ　　［０，１Ｍ　　Ｎａ　Ｃ１，５ｆｆ１Ｍ　　Ｍ
Ｑ　Ｃ１２゜５　　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ＤＨ
７，６，０℃）］中で２回洗い、２威の冷したカルシウ
ム・バッファー［１００１１１Ｍｃａ　Ｃｆ２．２５０
　９１Ｍ　　Ｋ（Ｊ、　５　ｍｊｙｌＭＱ　ＣＲ２，５
ｔｌｌＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ７，６゜０℃）
］中に再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの容量の１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）混合する。この混合物を６０分
間。

０℃で保った後、１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン、
０．５％酵母エキス、１％ＮａＣオ、　　０．０８％グ
ルコース、　　Ｉ）Ｈ７，２）を添加し、３７℃で１時
間振どう培養する。培養液を、選択培地［アンピシリン
（シグマ）　３０Ｍｇ／＃ｌ！！を含むし培地プレート
］に１００μ交／プレートの割合で接種する。プレート
を３７℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得
られたアンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を
用いてＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により
、目的のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４，０Ｋｂｐ）
の取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢ
Ｒの作成方法を示す。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．１Ｋ　ｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜Ｔ　Ｎ、、Ｆ　−１７を用いてプラスミドｐ
ＴＮＦ３（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。

第４図及び第５図に、プラスミドＩ）ＴＮＦ２Ｎ及びｐ
ＴＮＦ３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含むプラス
ミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦＳの、
合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配列が設計通り
であることは、マキサム・ギルバート法［Ａ、　Ｍ、　
Ｍａｘａｎら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、、６
５．　４９９（１９８０）　］によって確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドの作成）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ１ＢＲ１０μ９
を、実施例３と同様にして制限酵素Ｃ１ａ丁及び３ａｌ
■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃
度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦＷ
転子の一部を含む約２２０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｃｆａ
　ｌ−８ａｌＩ）をボＩＪ　７　りＩＪ　ルアミドゲル
より回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ２　１０
μｙを１００μｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐＨ７，５）　、　６０　ｎ＋Ｍ　　Ｎａ　Ｃ９，７
ｎ＋ＭＭ（ｌｃＪ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの
制限酵素ＰＶｔｌｌＩ（宝酒造）を添加し、３７℃で１
時間切断反応を行なった。そして、実施例３の方法に準
じて制限酵素５８１１による切断、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に
準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１７０ｂｐの
ＤＮＡ断片（ＳａｌＩ”ＰＶｕＩＩ）をポリアクリルア
ミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
μ９も１００μｍの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−ＨＣ１
（ｐＨ７，５＞、６０　ｍＭ　　　Ｎａ　ＣＬ　　７　
　ｍＭＭｇＣＩ２水溶液に溶解させ、４０ユニツトの制
限酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素ＨｉｎｄＩ
［［（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切断反応を行
なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲ
ル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ
Ｆ遺伝子の一部を含む約１１０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｐ
ｖｕＩＩ←ＨｉｎｄＩ［［）をポリアクリルアミドゲル
より回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミド１
）ＹＳ３１Ｎ（約４．７Ｋｂｐ）　５μ９を、上記と同
様に制限酵素Ｃｆａ工及びＨｉｎｄｌＩ［で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施
例３の方法に準じて、プラスミドＤＹ　Ｓ　３１Ｎの大
部分を含む約４，７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａ工”
Ｈｉｎｄｌｌ）をアガロースゲルより回収した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｌ）の３つのＤ
ＮＡ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎの大部分を含む
約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール
沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３
の方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１１−
株に導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴＮＦ３！
転子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ
　ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、その
プラスミド１）ＴＮＦ４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドＤＹＳ３１Ｎ５μりを、上記の方
法に準じて制限酵素ｐｖｕｌ［で部分分解した後、さら
に制限酵素Ｈｉｎｄｌ［［で切断し、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の方法に準
じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤ
ＮＡ断片［ＰｖｕＩＩ（２］＋Ｈｉｎｄ　Ｉ　］をアガ
ロースゲルより回収した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μびに
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先ニＩＲうｉｎ、り約２．７
ＫｂｐノＤＮＡ断片［ＰｖｕＩｆ　（２１”　Ｈｉｎｄ
　ＤＩ　］　８８ｍ合シ、１り／−／ｌ澱（７）Ｉ、実
施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連
結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に準じ
てエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｎ−株に導入し、形
質転換株の中より目的のプラスミドｐＡＡ４１（約２．
７Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このようなプ
ラスミドは、プラスミドＤＹＳ３１Ｎからコピー数制御
領域を除去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクロ
ーニング・サイトの下流に大腸菌ｔｒＤ　Ａターミネー
タ−を付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターで
あり、第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドｐＡＡ４１　２μ３を、上記と同様に制
限酵素Ｃ！ａＩ及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３の
方法に準じて、プラスミドｐＡ　Ａ　４１の大部分を含
む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣｆａＩＨＨｉｎｄ
Ｉ［［）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵
素ＣｆａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で切断し、ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施例２の
方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｐのＤＮＡＩｇｉ片（Ｃｆａ　Ｉ　”Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ
　）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＥＲＡ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒトＴＮＦ遺
伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、
エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−
ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−１−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドＩ）Ｔ　Ｎ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２
Ｋｂｐ）を有するクローンを選択した。このプラスミド
は、ヒトＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を
有しており、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒトＴＮＦ３１伝子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μシを、実施例４の方法に準
じて制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲルｌＩｒｌＸ５％）
及びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後
、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２
つのＤＮＡ断片、（約４９０ｂＤ及び約２．７Ｋｂり、
両方共Ｃ１ａ　Ｉ＋Ｈｉｎｄ　ＩＩ）をゲルより回収し
た。

ここで得られたヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片を５０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣｆ（ｐ＋　７．４）、　ＩＯＩＭ　　ＭＩＪＳＯ
４、Ｉ　　１１Ｍジチオスレイトール水溶液に溶解させ
、１０ユニツトの制限酵素ＨａｐＩ［（宝酒造）を添加
して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了後
、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）を
行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮ　Ｆ３ｍ１
伝子の大部分を含む約３９０ｂｌ）のＤＮＡ断片（Ｈａ
ｐ■←Ｈｉｎｄｌｌｌ）をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた４本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ７について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−ＤＮ
Ａリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（ＣＩａ　Ｉ
ＭＨｉｎｄ　ｌｌ　）及びヒトＴＮＦ３１！伝子の大部
分を含む約３９０ｂｌ）（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ断片（Ｈａ
ｐＩ［−Ｈｌｎｄｎ［）と混合し、エタノール沈澱の後
、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによ
る連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の方法に
準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｎ＋−株に導入
し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ４７
１（約３．２Ｋ　ｂｐ）を有するクローンを選択した。

このプラスミドは、次のアミノ酸配列（８２Ｎ　）−Ａ
ｒａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｔ−Ａ
　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａ　１ａ−Ａ　ｓｎ
−Ｐ　ｒｏ−Ｇ　Ｉｎ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　ｌｕ−Ｇ　Ｉｙ
−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌｎ−Ｔ　ｒｌ）−Ｌ　ｅ
ｔｌ−Ａ　Ｓｎ−Ａ　ｒ（１−Ａ　ｒ（ＩＡ　Ｉａ　−
Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ
　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−ＧＩｕ−Ｌ　
ｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎＧｌｎ−Ｌｅｕ−
Ｖａｔ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇ　Ｉｙ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒＧ　
Ｉｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｇ　ＩＶ　−ＣＶＳ−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ
　−Ｔ　ｈｒ−ＨｉＳ−Ｖ　ａｌ−Ｌｃｕ　−Ｌｅｕ　
−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ　−Ｉ　Ｉｅ　−Ｓｅｒ
　−Ａｒｖ　−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ−Ｖａｌ−８ｅｒ−Ｔ
Ｖｒ−Ｇｌｎ　−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　ＶＳ−Ｖ　ａｔ−Ａ　
ｓｎ−Ｌ　ｅｕ−１ｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ　−１ｌｅ
　−Ｌｙｓ　−Ｓｅｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｃｙｓ　−Ｇ　
ＩｎＡ　ｒｇ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　
−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌｕ　−
Ａ　ｌａ　−Ｌ　Ｖｓ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ
　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅ
ｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ
　ｅｕ−Ｇ　Ｉｕ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　５ｐ−Ａ
　ｒｌＪ　−ｌｅｕ　−Ｓｅｒ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　ｌ
ｕ　−１ｌｅ　−ＡＳｎ　−Ａ　ｒ（］−Ｐ　ｒＯ−Ａ
　５ｌ）−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅＵ−Ａ　Ｓｐ−ｐ　ｈｅＡ
　ｌａ−Ｇ　ｌｕ−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ
　ａｌ−Ｔ　ｙｒＰｈｅ−ＧＩＶ−１１ｅ−Ｉ　１ｅ−
Ａｌａ−１ｅｕ（ＣＯＯＨ）で表わされる抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミノ末
端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードする発
現型プラスミドであり、第９図にその作成方法を示した
。

一方、上記で得られたヒトＴＮＦ３ｆｉ転子発現型プラ
スミド１）ＴＮＦ　４７１　２０μ９を、実施例４の方
法に準じて制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、５０
１Ｍ　　　　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣｊ　　（１）Ｈ７，４
）　　、　　１００　　ｍ　　ＭＮａ　Ｃ１，１０ｉｌ
Ｍ　　ＭＯ８０４水溶液中で制限酵素ＮＣ０Ｉ（宝酒造
）による切断反応を３７℃で１時間行なう。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．７％）及びポ
リアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）を行な
い、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部
を含む約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩＨＨｉｎｄ
　ｍ　）をポリアクリルアミドゲルより、そして実施例
３の方法に準じて、ｐＴＮＦ４７１の大部分を含む約３
．０ＫｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋Ｈｉｎｄ　■）を
アガロースゲルより、それぞれ回収した。

さらに、上で得られた約１４０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　ｌ［）を５ｅｕ文の１０　ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓＨＣＩ　（ｐ＋−＋　７．４）　、　１０１Ｍ　
　ＭＯＳＯ４、１ｍＭジチオスレイトール水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素ＡｃｃＩ（宝酒造）を添
加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終了
後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度８％）
を行ない、実施例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子
の一部を含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎ　Ｃ０ｌ４
−ＩＡｃｃＩ）をポリアクリルアミドゲルより回収した
。

また、第１０図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオ
チドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。得られた２本の合成オリゴヌクレオチドそれ
ぞれ０．５μ３について、実施例３の方法に準じて、末
端のリン酸化を行ない、アニーリングを行なった。

アニーリングの後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチド
を、先に得られた約３．ＯＫ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｎｃ
ｏＩ＋Ｈｉｎｄ　Ｉ［［）及びヒトＴＮＦｌ転子の一部
含む約１１０ｂｐのＤＮＡ断片（ＮｃｏＩ＋ＡｃｃＩ＞
と混合し、エタノール沈殿の後、実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣ６ＧＯｒ−■−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミド１）ＴＮＦ６１７（約３．２ＫｂＤ）を
有するクローンを選択した。このプラスミドは、次のア
ミノ酸配列（Ｈ２Ｎ　）　　Ａｒｇ−Ｌｙｓ−ＡｒＯ−Ｌｙｓ−Ｐ
　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａ
ｔ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　Ｉａ　−Ａ　ｓｎ−Ｐ　ｒｏ　
−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　Ｉａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−
Ｑ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｌｆ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｔ　ｒｌ）　−
Ｌ　ｅｕ　−Ａ　Ｓｎ　−Ａ　ｒｌｌｌ−Ａ　ｒＱ　−
Ａ　ｌａ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅ
ｕ　−Ａ　ｌａ　−Ａ　５ｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ
　Ｉｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ
　Ｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｔ　−Ｐｒｏ　−
Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ＩＶ　−Ｌｅｕ−’ｒｙｒ
　−Ｌｅｕ−Ｉ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−ＬｙＳ−Ｇ　Ｉｙ　−
Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−ＣＶＳ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　
ｅｒ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｖ　ａｌ　−Ｌｅｕ　
−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｈｉｓ　−Ｔｈｒ−１１ｅ　−
Ｓｅｒ　−ＡｒＯ−１１ｅ−Ａ　１ａ−Ｖａｔ−８ｅｒ
−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｙｓ　−Ｖ　ａ
ｌ　−Ａ　ｓｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ　
−Ａ　ｌａ　−１１ｅ　−Ｌｙｓ　−Ｓａｒ　−Ｐｒｏ
　−Ｃｙｓ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ−Ｔ
　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　
Ｉａ　−Ｇ　１ｕ−Ａ　ｌａ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ
−Ｔｙｒ−Ｇ　１ｕ−Ｐｒｏ　−１１ｅ−Ｔｙｒ　−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−Ｐ　ｈｅ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｌ　Ｖｓ−Ｇ　Ｉｙ　
−Ａ　ＳＤ　−ＡｒＯ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｕ　−１１ｅ−ＡＳｎ　−Ａ　ｒｇ−Ｐ　ｒｏ−Ａ　ｓ
ｐ−Ｔ　ｙｒ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｓｏ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌ
ａ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉｎ
　−Ｖ　ａｌ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ
　−Ｉ　Ｉｅ−Ａｌａ−Ｔｒｉ）　−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第１０図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施例４で得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラス
ミドＩＩＴＮＦ　４０１Ａ、実施例５で得られた発現型
プラスミド１）ＴＮＦ４７１又は新規抗腫瘍活性ポリペ
プチド遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ６１７を有する
エシェリヒア・コリＣ６００ｒ−１株を、３０〜５０μ
ｇ／Ｉｄのアンピシリン、０．２％のグルコース及び４
ｑ／Ｉ！＋１！のカザミノ酸を含むＭ９培地［０，６％
Ｎａ　２　ＨＰＯ４−０，３％に２　ＨＰＯ４０，０５
％ＮａＣｆ−０，１％Ｎ８４Ｃｆ水溶液（ｐＨ７，４）
をオートクレーブ滅菌した後に、別途にオートクレーブ
滅菌したＭ（ｌｓＯ４水溶液及びＧａＣｌ２水溶液をそ
れぞれ最終濃度２　ｍＭ及び０．１　ｍ１ｙｌになるよ
うに加える。］　　２５０ｍに接種し、０Ｄ６Ｄｐが０
．７に達するまで、３７℃で振とう培養を行なった。次
いで、最終濃度５０μｇ／ｒｄの３−β−インドールア
クリル酸を培養液中に添加し、さらに３７℃で１２時時
間上う培養を続けた。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
　−（１５０ｉＭ　　Ｎａ　ｃｐを含む２０　ｉＭリン
酸バッファー、　　ｌ）Ｈ７，４）を用いて菌体の洗浄
を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッファー
に懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００Ｍ型
）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体残渣
の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔｒｉｓ−
ＨＣｆバッファ　−（ｐＨｅ、ａ）　、　ＳＤＳ、　２
−メルカプトエタノール、グリセロールを、それぞれ最
終濃度６０１Ｍ、２％、４％、１０％になるように加え
、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［銘木、遺
伝、　３１．４３（１９７７）　］を行なった。

分離用ゲルは１５％とし、泳動バッファーはＳＤＳ。

Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｌｌ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｎ＋ｌ
ｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　２２７．　６８０（１９７０）　
］を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマ
シーブルーＲ−２５０（バイオ・ラッド）で染色し、ヒ
トＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
の発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１
１図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャナー（島津、Ｃ
３−９３０型）にかけて、産生された抗腫瘍活性ポリペ
プチドの大腸菌細胞質蛋白質中にしめる割合の算出を行
なった。その結果、ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ４０１Ａを有する大腸菌においては全細胞質
蛋白質の約１６．２％の１発現型プラスミドＩ）ＴＮＦ
４７１を有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約２
３．２％の、新規抗腫瘍活性ポリフペブチド遺転子発現
型プラスミド１）ＴＮＦ６１７を有する大腸菌において
は同じく約１８．７％の抗腫瘍活性ポリペプチドの産生
が、それぞれ認められた。

実施例７（活性の評価）新規抗腫瘍活性ポリペプチドのｉｎ　ＶｉｔｒＯ抗癌活
性測定は、前記Ｒｕｆｆの方法に準じて行なった。

すなわち、実施例６で得られた新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドを含む大腸菌ライゼートを順次培地で希釈した試料
１００μ又と、４×１０５個／ｄの濃度のマウスｌ−９
２９繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣ１９２つ）懸濁液１００
μ文を、９６穴の組織培養用マイクロプレート（コース
タ−）内で混合した。なおこの際に、最終濃度１μｇ／
ｒｄのアクチノマイシンＤ（コスメゲン、萬有製薬）を
添加しておく。

培地としては、５％（ｖａｔ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児
血清を含むイーグルのミニマム・エツセンシャル培地（
日永製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭
酸ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した
後、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖｏｌ／ｖ
ｏｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ
　）のクリスタ、ル・バイオレットを溶解させたもの］
を用いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオ
レットを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイ
オレットを１００μ旦の０．５％ＳＯ８水溶液で抽出し
、その５９５μｍにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライ
ザー（東洋側器。

ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光度は、生き残っ
た細胞数に比例する。そこで、抗腫瘍活性ポリペプチド
等を含む大腸菌ライゼートの希釈溶液を加えない対照の
吸光度の５０％の値に相当する大腸菌ライゼートの希釈
倍率をグラフ（たとえば第１２図）によって求め、その
希釈倍率をユニットと定義する。第１２図より、発現型
プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＡにコードされるヒトＴＮ
Ｆ蛋白質を含む大腸菌ライゼート　１００μ文は３．３
Ｘ　１０６ユニツト程度の活性を、発現型プラスミド１
）ＴＮＦ４７１にコードされる抗腫瘍活性ポリペプチド
を含む大腸菌ライゼート　１００μ文は約３．７Ｘ　１
０’ユニット程度の活性を、そして発現型プラスミドｐ
ＴＮＦ６１７にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドを含む大腸菌ライゼート　１００μ文は約４．ＯＸ　
１０’ユニット程度の活性を、それぞれ有していること
が明らかになった。

実施例６で得られた各種大腸菌ライゼート中に含まれ総
蛋白質量は、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・
ランド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた
検量線より計算した。上記で得られた発現量、活性の値
及び蛋白質定量結果より抗腫瘍活性ポリペプチド等の比
活性を計算したところ、表１のような値が得られた。表
１より、１）ＴＮＦ６１７にコードされる新規抗腫瘍活
性ポリペプチドはヒトＴＮＦ蛋白質の約１２倍の比活性
を、そしてＩ）ＴＮＦ４７１にコードされる抗腫瘍活性
ポリペプチドの約１．４倍の比活性を有していることが
わかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ遺伝子の塩基配列を、第２
図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を
、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第５
図は、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を有するプラスミドｐＴ
ＮＦＩＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ　３の作成
方法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮ
Ｆ遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮの作成
方法を、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の作成方
法を、そして第８図はヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミ
ドＥＩＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示したも
のである。第９図は抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現
型プラスミド１）ＴＮＦ４７１の作成方法を示したもの
である。第１０図は新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子
発現型プラスミド１ｌＴＮＦ６１７の作成方法を示した
ものである。第１１図はヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗腫
瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示したもの
である。第１２図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗腫瘍活
性ポリペプチドのＶｉｔｒＯ抗癌活性測定結果を示した
ものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる、新規生理活性ポリペプチド。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する請求項１記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります。】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする請求
項３記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ６１７である
請求項３記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする請求項７記載の微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【遺伝子
配列があります。】で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。