JPS63160598A

JPS63160598A - 新規生理活性ポリペプチド

Info

Publication number: JPS63160598A
Application number: JP61307889A
Authority: JP
Inventors: Tsukio Sakugi; 柵木　津希夫; Satoshi Nakamura; 聡中村; Kazuo Kitai; 北井　一男; Kenji Yone; 米　賢二; Kaku Katou; 加藤　革; Jun Suzuki; 純鈴木; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1986-12-25
Filing date: 1986-12-25
Publication date: 1988-07-04

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）　　産業上の利用分野本発明は新規生理活性ポリペプチド、該ポリペプチドを
コードするＤＮＡ１ｌｆｉ域を含む組換えプラスミド、
該プラスミドによって形質転換された組換え微生物細胞
及び該微生物細胞を用いた新規生理活性ポリペプチドの
製造方法に関する。更に詳しくは、抗腫瘍活性を有する
新規ポリペプチド（以下、新規抗腫瘍活性ポリペプチド
と略すこともある）、該ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ領域を含む組換えプラスミド、該プラスミドによって
形質転換された組換え微生物細胞及び該微生物細胞を用
いた新規抗Ｍｌ瘍活性ポリベブヂドの製造方法に関する
。

本明細書において、アミノ酸、ポリペプチドはＩＵＰＡ
ｃ−ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用された方法に
より略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

ＡｌａＬ−アラニンＡｒ（ＩＬ−アルギニンＡｓｎ１−アスパラギンＡｓｐＬ−アスパラギン酸Ｃｙｓ　　Ｌ−システィンＧＩＱ　　Ｌ−グルタミンＧＩｕＬ−グルタミン酸Ｇｌｙ　　グリシント１ｉｓ　　Ｌ−ヒスチジン ■１ｅｌ−−イソロイシン１ｅｕＬ−ロイシンＬｙｓ　　Ｌ−リジンＭｅｔ　　Ｌ−メチオニンＰｈｅＬ−フェニルアラニンｐｒｏｌ−プロリン３ｅｒ　　１−セリンＴｈｒ　Ｌ−スレオニンＴｒｐＬ−トリプトファンＴｙｒ　　Ｌ−チロシンＶａｌ　　ｌ−バリンまた、ＤＮＡの配列はそれを構成する各デオキシリボヌ
クレオチドに含まれる塩基の種類で略記するものとし、
たとえば下記の略号を用いる。

Ａ　アデニン（デオキシアデニル酸を示す。）Ｃシトシ
ン（デオキシシチジル酸を示１゜）Ｇ　グアニン（デオ
キシグアニル酸を示す。）Ｔ　チミン　（デオキシチミ
ジル酸を示す。）さラニ、（８２Ｎ）　　ＥＣＵ−（Ｃ
ＯＯＨ）はそれぞれアミノ酸配列のアミノ末端側及びカ
ルボキシ末端側を示すものであり、（５′）−及び（３
′　）はそれぞれＤＮＡ配列の５′末端側及び３′末端
側を示すものである。

（２発明の背景Ｃａｒｓｗｅｌｌ　らは、Ｂ　ａｃｉｌｌｌｊｓ　　Ｃ
ａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ　　（ＢＣＧ）などで前
もって刺激をうけたマウスにエンドトキシンを投与した
後に採取した血清中に、移植したＭｅｔｈＡ肉腫による
癌を出血壊死させる物質が含まれていることを見出し、
この物質を腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎ　ｅｃｒｏ
ｓｉｓＦａｃｔｏｒ　、以下ＴＮＦと略記することもあ
る）と名づけだ［Ｅ、　Ａ、　Ｃａｒｓｗｅｌｌら、　
ｐｒｏｃ、Ｎａ口。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　７２．３６６６
　（１９７５）　］　。このＴＮＦはマウス、ウサギ、
ヒト等多くの動物中に見られ、腫瘍細胞に特異的に、し
か、も種を越えて働くことから、制癌剤としての利用が
期待されてきた。

最近になって、ｐｅｎｎｉｃａらは、ヒトＴＮＦのｃＤ
　Ｎ　Ａクローニングを行ない、ヒトＴＮＦ蛋白質の一
次構造を明らかにすると共に、大腸菌におけるヒトＴＮ
１１伝子の発現について報告した［　Ｄ　、　　Ｐ　ｅ
ｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２．　７
２４（１９８４）　］　、その後、自弁ら［Ｔ、　５ｈ
ｉｒａｉら。

Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１３．　８０３（１９８５）　
］　、宗村ら［宗村ら、ｔと化？療法、　１２．　１６
０（１９８５）　１　、Ｗａｎａら［Ａ、Ｍ、Ｗａｎｇ
ら、　３ｃｉｅｎｃｅ、ユ２Ｂ、　　１４９（１９８５
）　］及びｖ　ａｒｔｉｃｎｏｕｔら［Ａ　、　Ｍ　ａ
ｒｍｅｎｏｕｔら。

Ｅ　Ｌｌｒ、　Ｊ　、　Ｂ　１ｏｃｈｅａ＋、、旦、　
　５１５（１９８５）　］が、ヒトＴＮＦ遺伝子の大腸
菌における発現について相ついで報告している。

このように遺伝子操作技術を用いることによって、純粋
なヒトＴＮＦ蛋白質が多量に入手できるようになるに及
び、ＴＮＦの有する抗腫瘍活性以外の生理活性が明らか
になりつつある。たとえば、癌末期や重症感染症患者に
見られる悪液質を引き起こｔｉ囚の一つであるカケクチ
ンがＴＮＦに非常に類似しており［Ｂ　、　Ｂｅｕｌｔ
ｃｒら、　Ｎａｔｔｉｒｅ　。

３１６、　５５２　（１９８５）　］　、カケクーチン
がリボプロティン・リパーゼ阻害活性を有することから
、ＴＮＦの投与により血中のトリグリセリド量が増大し
、その結果として高脂血症のような副作用を引き起こす
可能性のあることが示唆された。また、それ以外にも、
血管内皮細胞への影響［Ｊ、Ｒ。

Ｇａｐｌｂｌｅ　　ら、　Ｊ、　　ｔ：Ｘｐ、　　Ｍａ
ｄ、　　、　　　１６２．　２１６３（１９８５）　］
　、骨吸収作用［Ｄ　、　Ｒ、Ｂｃｌｔｏｌｉｎｉら、
Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１９’、　　５１６（１９８６
）　］等が報告されている。

一方、近年の遺伝子操作技術の准歩は、蛋白質中の任意
のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加したり、
または欠失させることを可能にした。

このようにして、天然に存在する蛋白質を改変して、特
定の目的にかなった新しい蛋白質を創製する研究が、数
多く成されている。

ヒトＴＮＦ蛋白質の改変についてもいくつかの研究が成
されており、第１図記載のヒトＴＮＦ１Ｍ白質のアミノ
酸配列において、Ｃ゛ｙ　ｓ　Ｉｆ及びＣＶＳ”’のい
ずれか又は両方の他のアミノ酸残塁への置換（ＰＣＴ出
願公開ＷＯ３６／　０４６０６号、特願昭６ｌ−１０６
７７２）　、Ｇ　ｌｙ／”の他のアミノ酸残塁への置換
（特願昭６１−１０６７７２号、特願昭６１−２３８０
４８号）。

Ａｌａ　　の他のアミノ酸残塁への置換（特願昭６１−
２３３３３７＠　）が報告されている。また、アミノ末
端側のアミノ酸残基の欠失についても、６アミノ酸欠失
ＴＮＦが細胞障害活性を有していること（特開昭６１−
５０９２３号）、７アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性
を有していること（特願昭６１−９００８７号）、１〜
１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しており、
その比活性は６〜８アミノ酸欠失ＴＮＦにおいて極大に
なること（ＰＣＴ出顆公ｆｆ１ｌ　Ｗ　０８６／　０２
３８１号）、１０アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を
有していること（特願昭６１−１１４７５４号）、及び
１１アミノ酸欠失ＴＮＦが細胞障害活性を有しＴ　（１
’　ルｃ：　ト（特１１［１６１−１７３８２２号）が
報告されている。

そこで、本発明者らは比活性の向上、安定性の向上０反
応スペクトルの広域化、副作用の低減化等を目的として
、ヒトＴＮＦ蛋白質の改変について鋭意研究を行ない、
本発明を完成するに至った。

（３）発明の目的本発明の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の他の目的は、新規抗腫瘍活性ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドを提供する
ことにある。

本発明の更に他の目的は、上記組換えプラスミドによっ
て形質転換された組換え微生物及びその組換え微生物ｌ
ｌＩ胞を用いて新規抗腫瘍活性ポリペプチドを製造する
方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、以下の説明から一層明らかと
なるであろう。

（４）発明の構成本発明者らの研究によれば、前記本発明の目的は、次の
アミノ酸配列（８２Ｎ　）　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−８ｅｒ−Ａｒｇ　−
１−ｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ｈｉｓ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ａ　Ｉａ−Ａ　ｓｎ　−Ｈｉｓ　−Ｇ　
Ｉｎ　−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔ　ｒｐ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　
ｓｎ−八ｒｉ）−Ａ　ｒ（］−Ａ　Ｉａ−Ａ　Ｓｎ−Ａ
　Ｉａ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　０ＬＩ−Δｌａ−Ａ　５ｎ−Ｇ
　ｔｙ−ｖａｔ−Ｇ　ｌｕ−ＬｅｌＪ−Ａｒ（＋−ＡＳ
Ｉｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｔ−Ｐｒ
ｏ−３ａｒ−Ｇｌｕ　−ｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ　−Ｌｅ
ｕ　−ｒ　Ｉｅ−Ｔｙｒ−８ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖａ
ｔ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈｅ　−Ｌｙｓ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｃｙｓ−Ｐ　ｒｏ　−Ｓ　ｅｒ　−
Ｔｈｒ　−ｔ−１ｉｓ　−Ｖａｔ　−１ｅｕ−Ｌ　ｅｕ
−Ｔ　ｈｒ−１−１１ｓ−Ｔｈｒ−Ｉ　　Ｉｅ−３ｅｒ
−Ａ　ｒｑ−１１ｅ−Ａ　Ｉａ−Ｖａｔ−５ｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｇ　Ｉｎ−Ｔｈｒ−ＬｙＳ−Ｖａｔ−△ｓｎ　−１
ｅｕ−１ｅｕ　−３ｃｒ　−Ａ　ｌａ−Ｉ　１ｅ−Ｌｙ
ｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ　−Ｃｙｓ−Ｇ　Ｉｎ　−Ａ　ｒａ
　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｑ　ｌｕ　
−Ｇ　Ｉｙ　−Ａ　ｌａ　−Ｑｌｕ−Ａｌａ　−Ｌ　ｙ
ｓ　−ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｒｐ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｇ　Ｉｕ
　−ｐｒｏ−１１ｅ−ＴＶｒ−Ｌｃｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｑｌｎ−１ｃｕ−Ｑｌｕ−１ｙｓ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ　−Ａ　ｒｇ−Ｌ　ｅｕ−Ｓ　ｅｒ−八
ｌａ　−Ｇ　Ｉｕ　−１１ｅ　−Ａ　ｓｎ　−Ａ　ｒ（
１−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ｔ　Ｖｒ−Ｌ　ｅｌｌ−Ａ
　５ｌ）−Ｐ　ｈｅ−Ａ　ｌａ−Ｇ　Ｉｕ　−Ｓ　ｅｒ
−Ｇ　ｌｙ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｖ　ａｌ−Ｔ　ｙｒ−Ｐｈｅ
−Ｇｌｙ　−１ｌｅ　−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ−Ｌｃｕ　−
（ＣＯＯｌ−１）で表わされる新規抗腫瘍活性ポリペプチドまたはそのア
ミン末端にＭｅｔが結合したポリペプチドを提供するこ
とによって達成され、また上記新規抗１１１１活性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡＩ域を含む組換えプラスミ
ドを提供することによって達成され、更にかくして得ら
れた組換えプラスミドによって形質転換された粗換え微
生物細胞、その微生物細胞を用いて目的とする新規抗腫
瘍活性ポリペプチドを産生ずる方法及びこの新規抗腫瘍
活性ポリペプチドを含有する医薬組成物を提供すること
によって達成されることがわかった。

以下本発明について更に詳細に説明する。

（Ａ）ヒトＴＮＦ遺伝子のクローン化；ヒトＴＮＦ遺伝
子は、ヒトＴＮＦ蛋白質を構成するアミノ酸（［）　、
　ｐ　ｅｎｎｉｃａら、前出］を指定するいくつかのコ
ドンの中から適当なものを選び、それを化学合成するこ
とによって取１ｑできる。ヒトＴＮＦｉ伝子の設計に際
しては、用いる宿主細胞に最も適したコドンを選択する
ことが望ましく、後にクローン化及び遺伝子改変を容易
に行なえるように適当な位置に適当な制限酵素による切
断部位を設けることが望ましい。

また、ヒトＴＮＦ蛋白質をコードするＤＮ’Ａ領域は、
その上流に読みとりフレームを一致させた形での翻訳開
始コドン（ＡＴＧ）を有することが好ましく、その下流
方向に読みとりフレームを一致させた形での翻訳終止コ
ドン（ＴＧＡ。

Ｔ　Ａ　ＧまたはＴＡＡ）を有することが好ましい。

上記翻訳終止コドンは、発現効率の向上を目的として、
２つ以上タンデムに連結することがとりわけ好ましい。

さらに、このヒトＴＮＦＩ伝子は、その上流及び下流に
作用する制限酵素の切断部位を用いることにより、適当
なベクターへのクローン化が可能になる。このようなヒ
］−Ｔ　Ｎ　Ｆ　３Ｈ伝子の塩基配列の例を、第１図に
示した。

上記のように設計したヒトＴＮＦ遺伝子の取得は、上側
の鎖、下側の鎖のそれぞれについて、たどえば第２図に
示したような何本かのオリゴヌクレオチドに分けて、そ
れらを化学合成し、各々のオリゴヌクレオチドを連結す
る方法をとるのが望ましい。各オリゴヌクレオチドの合
成法としてはジエステル法ＮＣＧ、　Ｋｈｏｒａｎａ。

”　Ｓ　ｏｍｅ　　Ｒｅｃｅｎｔ　　［）　ｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔｓ　　ｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆ　　
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　Ｅ　５ｔｅｒｓ　　　ｏｆＢ　
１ｏｌｏａｉｃａｌ　　　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ　　”　
、　　Ｊ　ｏｈｎ　　　Ｗ　１ｌｅｙａｎｄ　　　５ｏ
ｎｓ　　、　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　”ｙ’ｏｒｋ　　
（１９６１）　　］。

トリエステル法［Ｒ、Ｌ　、　Ｌ　ｅｔｓｉｎｇｅｒら
、Ｊ。

Ａｍ、　　Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、、８９．４８０１（
１９６７）　］及びホスファイト法［Ｍ、　Ｄ、　Ｍａ
ｔｔｅｕｃｃｉら。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ、、　２１．７１
９（１９８０）　］があるが、合成時間、収率、操作の
簡便さ等の点から、全自動ＤＮＡ合成合成用いたホスフ
ァイト法による合成が好ましい。合成したオリゴヌクレ
オチドの精製は、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル電気泳動、逆相カラムによる高速液体クロマ
トグラフィー等を、適宜単独もしくは組合せて用いるこ
とができる。

こうして得られた合成オリゴヌクレオチドの５′末端側
の水酸基を、たとえばＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
を用いてリン酸化した後、アニーリングさせ、たとえば
Ｔ４−１）ＮＡリガーゼを用いて連結する。合成オリゴ
ヌクレオチドを連結してヒトＴＮＦ遺伝子を作成するｈ
法としでは、合成オリゴヌクレオチドをいくつかのブロ
ックに分けて連結し、たとえばｐＢＲ３２２［Ｆ　、　
　Ｂ　ｏｌｉｖａｒら、　　Ｇｅｎｅ　、　　２．　９
５（１９７７）　］のようなベクターに一度クローン化
した後、ぞれらの各ブロックのＤＮＡ断片を連結する方
法が好ましい。このようなヒトＴＮＦ遺伝子を構成する
ブロックのＤＮＡ断片を含むプラスミドとして、好まし
くはｐＴＮＦＩＢＲ。

ｐＴＮＦ２ＮまたはｐＴＮＦ３が用いられる。

上記のようにしてクローン化したヒトＴＮＦ遺伝子を構
成する各ブロックのＤＮＡ断片を連結した後、適当なプ
ロモーター、　ＳＯ＜シャイン・ダルガーノ）配列の下
流につなぐことにより、発現型遺伝子とすることができ
る。使用可能なプロモーターとして、トリプトフアン・
オペロン・プロモーター（ｔｒｐブＯモーター）。

ラクｔ〜−ス・オペロン・プロモーター（ＩａＣプロモ
ーター）　、　ｔａＣプロモーターＩＰＬ−プロモータ
ー、　ｌｐｐブＯモーター等があげられるが、とりわけ
ｔｒｐプロモーターが好適である。ｔｒｐプロモーター
を有するプラスミドとして、好ましくはＩ）Ｙ　Ｓ　３
ＩＮ　、又はｐＡ　Ａ　４１が用いられる。

さらに、発現効率向上を目的として、ヒトＴＮＦ遺伝子
下流に大腸菌で効率良く機能するターミネータ−を付与
することができる。このよう。

なターミネータ−として、１ｐｐターミネータ−１ｔｒ
ｐターミネータ−等があげられるが、とりわけｔｒｐ　
Ａターミネータ−が好適であり、ｔｒｐ　Ａターミネー
タ−を有するプラスミドとして、好ましくはｐＡ　Ａ　
４１が用いられる。この発現型ヒトＴＮＦ遺伝子を、た
とえば１）ＢＲ３２２由来のベクターにクローン化する
ことにより、発現型プラスミドが作成できる。ヒトＴＮ
Ｆ３ｍ伝子発現型プラスミドとして、好ましくはＤＴＮ
Ｆ４０１ＮＮ又はｐＴＮＦ　４０１Ａが用いられる。

（Ｂ）新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子のクローン化
；こうして得られたヒトＴＮＦ遺伝子発現型プラスミドを
適当なＩｔ、ＩＩ限醇素で切断し、ヒトＴＮＦ３！ｉ伝
子内の特定な領域を除去した後、適当な塩基配列を有す
る合成オリゴヌクレオチドを用いた遺伝子の修復を行な
う。かかる手法を用いることにより、ヒトＴＮＦ蛋白質
中の任意のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したり、付加
したり、または欠失させた形の新規抗腫瘍活性ポリペプ
チドをコードする遺伝子を含む発現型プラスミドの作成
が可能になる。このような新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遭伝子発現型プラスミドとして、好ましくはＩ］ＴＮＦ
４６Ｇが用いられる。

（Ｃ）発現確認及び活性評価；ヒトＴＮＦ遺伝子及び新規抗ＩＩＩ！瘍活性ポリペプチ
ド遺伝子を発現させるための微生物宿主としては、大腸
菌、枯草菌、酵母等があげられるが、とりわけ大腸菌［
エシェリヒア・コリ（［５ｃｈａｒｉｃｈｉａ　　ｃｏ
ｌｉ）　］が好ましい。前記ヒトＴＮＦ遺伝子発現型プ
ラスミド及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型
プラスミドは、たとえば公知の方法［Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏ
ｒｇａｒｄら。

Ｇｅｎｅ　、　３．　２７９（１り７８）　］を用いて
、微生物宿主、たとえばエシェリヒア・コリＣ６００ｒ
−１１−株（ＡＴＣＣ３３５２５）に導入することがで
きる。

このようにして得られた組換え微生物細胞を、それ自体
は公知の方法で培養する。培地としては、たとえばグル
コースとカザミノ酸を含むＭ９培地［Ｔ、　Ｍａｎｉａ
ｔｉｓら編、　　”　Ｍ　ｏ＋ｅｃｕ＋ａｒＣｌｏｎｉ
ｎｇ”　、　ｐ　４４０．　Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ
ｌ−１ａｒｂｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ　　（１’１８２）参照］があげられ、
必要に応じて、たとえばアンピシリン等を添加するのが
望ましい。培養は目的の組換え微生物に適した条件、た
とえば振とうによる通気、撹拌を加えながら、３７℃で
２〜３６時間行なう。また、培養開始時または培養中に
、プロモーターを効率良く鍬能させる目的で、３−β−
インドールアクリルＭＷの薬剤を加えることもできる。

培ｌｌ後、たとえば遠心分離により組換え微生物細胞を
集め、たとえばリン酸バッファーに懸濁させ、たとえば
超音波処理、により組換え微生物細胞を破砕し、遠心分
離により組換え微生物細胞のライゼートを得る。得られ
たライゼート中の蛋白質を、ラウリルＴａ酸ナトリウム
（以下、ＳＤＳと略すこともある）を含むポリアクリル
アミドゲルを用いた電気泳動によって分離し、ゲル中の
蛋白質を適当な方法を用いて染色する。

発現型プラスミドを含まない微生物細胞のライゼートを
対照として泳動パターンを比較することにより、ヒトＴ
ＮＦ遺伝子または新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現を確認する。

このようにして得られたヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗１
１ｆｆｌ瘍活性ポリベブヂドの活性の評価は、マウスに
移植したＭｅｔｈ、Ａ、肉腫を壊死させる効果を見るｉ
ｎ　　ｖ；ｖｏ活性測定法（ＣａｒｓｌｌＴｅｌｌら。

前出）、マウスＬ細胞に対する細胞障害性を見るｉｎ　
　ＶｉｔｒＯ活性測定法［Ｒｕｆｆ　、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１２６．　２３５（１９８１）　
１等により行なえるが、測定時間、定Ｈ性、測定の簡便
さ等の点から、ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ活性測定法による評
価が好ましい。

かくして本発明によれば、従来公知のヒトＴＮＦ蛋白質
とは異なる新規生理活性ポリペプチドを得ることが可能
になり、この新規抗腫瘍粘性ポリペプチドを用いること
によって抗腫瘍のためのすぐれた医薬組成物を提供する
ことが可能になった。

以下、実施例を掲げて本発明についてｒｉＴ　％ｍに説
明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものでは
ない。

実施例１（ヒトＴＮＦ遺伝子の設計）第１図に示した塩基配列のヒトＴＮＦｍ転子を設計した
、設計に際しては、Ｐ　ｅｎｎｉｃａら［ｒ）。

Ｐ　ｅｎｎｉｃａら、　　Ｎａｔｕｒｅ　、　　３１２
．　７２４（１９８４）　　ｌ　の報告したヒトＴＮＦ
前駆体ｃＤ　Ｎ　Ａの構造遺伝子部分の塩基配列を基盤
として、適当な制限酵素による切断部位を適当な位置に
設（づ、５′側にｖＡ訳間始コドン（ＡＴＧ）を、そし
て３′側に２１１！ｉｔの１！訳終止コドン（ＴＧＡ及
びＴＡＡ）をそれぞれ付与した。また、５′側翻訳開始
コドン上流には制限酵素ＣｆａＩによる切断部位を設け
、ＳＤ配列と翻訳開始コドン間を適切な状態に保った形
でのプロモーターとの連結を可能にした。更に、３′側
翻訳終止コドン下流には制限酵素１−（ｉｎｄｌｌによ
る切断部位を設け、ベクター・プラスミドと容易に連結
できるようにした。

実施例２（オリゴヌクレオチドの化学合成）実施例１で
設計したヒトＴＮＦｍ転子は、第２図に示しｌこように
１７本のオリゴヌクレオチドに分けて合成する。オリゴ
ヌクレオチドの合成は全自動Ｄ　Ｎ　Ａ合成□〈アプラ
イド・バイオシステムズ。

モデル３８０△）を用いて、ホスファイト法により行な
った。合成オリゴヌクレオチドのｒａｇは、アプライド
・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行なった。

すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモニア水
溶液を５５℃で一晩保つことにより、ＤＮＡ塩基の保護
基をはずし、セファデックスＧ−５０フアイン・ゲル（
ファルマシア）を用いたゲル１過によって、高分子遭の
合成オリゴヌクレオチド画分を分取りる。ついで、７Ｍ
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
２０％）の後、紫外線シャドウィング法により泳動パタ
ーンの観、察を行なう。目的とする大きさのバンド部分
を切出して、そのポリアクリルアミドゲル断片を細かく
破砕した後、２〜５−の溶出用バッファー　［５００ｍ
Ｍ　　Ｎｔ−１４０Ａｃ　−１＋１１ＭＥＤＴＡ−’０
．１％ＳＤＳ　（ｐＩ−（７，５）　］を加え、３７℃
で一晩振とうした。遠心分離により、目的のＤＮＡを含
む水相の回収を行なった。最後に合成オリゴヌクレオチ
ドを含む溶液をゲル濾過カラム（セファデックスＧ−５
０）にかけることにより、合成オリゴヌクレオチドの精
製品を得た。なお、必要に応じて、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌクレオチドの純
度の向上をはかった。

実施例３（化学合成ヒトＴＮ　Ｆｍｍ転子クローン化）実施例２で作成した１７木の合成オリゴヌクレオチド（
ＴＮＦ−１〜ＴＮＦ−１７）を用いて、ヒトＴＮ　Ｆｆ
ｆｌ伝子を３つのブロックに分けてクローン化した。

０．１〜１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−
２〜ＴＮＦ−６の５′末端側を、５〜１５ユニツトのＴ
４−ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｅ。

ｃｏｌｉＱタイプ、宝酒造）を用いて、それぞれ別々に
リン酸化する。リン酸化反応は１０〜２０μ皇の５０＋
１１Ｍ　　Ｔ　　ｒｉｓ−ト１ｃｊ　　　（１）Ｈ９，
５）　　　、　　　１０　１Ｍ　　　　　Ｍ（１（Ｊｚ
　　　。

５　ｍＭジチオスレイトール、１０１Ｍ　　ＡＴＰ水溶
液中で、３７℃で、３０分間行なった。反応終了後、ず
べての合成オリゴヌクレオチド水溶液をすべて混合し、
フェノール抽出、エーテル抽出によりＴ４−ポリヌクレ
オチドキナーゼを失活、除去する。

この合成オリゴヌクレオチド混合液に、新たに０．１〜
１．０μ９の合成オリゴヌクレオチドＴＮＦ−１及びＴ
ＮＦ−７を加え、９０℃で５分間加熱した後室温まで徐
冷して、アニーリン゛グを行なう。

次に、これを減圧乾固した後に、３０μ受の８６　ｍＭ
ＴｒｉＳ−Ｈ（Ｊ　　（ｐｔ−＋　　　７．６）　　　
、　　　　６．６　１Ｍ　　　　ＭＩＪ　　Ｃ１ｚ　　
　。

１０１ＢＭジチオスレイトール、１１１ＭＡＴＰ水溶液
に溶解させ、３００ユニツトのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（
宝酒造）を加えて、１１℃で１５時間連結反応を行なっ
た。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル８１度５％）を行ない、エチジウムブロマイド染色法
により泳動パターンの観察を行なう。目的とする大きさ
く約２２０ｂＤ　）のバンド部分を切出して、実施例２
の方法に従ってポリアクリルアミドゲルよりＤＮＡを回
収する。

一方、３μ９の大腸菌用プラスミドｐＢｆ１３２２（約
４．４ＫｂＤ）を３０μ文の１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ
−１」Ｃオ（ｏＨ７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　
Ｃｊ、　７　ｍＭＭＱＣｊ２水溶液に溶解させ、１０ユ
ニットの制限酵素（ＪａＩにューイングランド・バイオ
ラブズ）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行なっ
た。

制限酵素ＣｆａＩによる切断の後、フェノール抽出。

エーテル抽出を行ない、エタノール沈澱によりＤＮＡを
回収する。このＤＮＡを３０μすの５０１＋１ＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ　（ｐＨ７，４）　、　　１００　ｉ＋Ｍ　
　Ｎａ　Ｃ１，１０１１Ｍ　　ＭＯ８Ｏ４水溶液に溶解
させ、１０ユニツトの制限酵素５ａｌＩ　（宝酒造）を
添加して、３７℃で１時間切断反応を行なった。反応終
了後、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）を
行ない、エチジウムブロマイド染色法により切断パター
ンの観察を行なう。プラスミドＤＢＲ３２２の大部分を
含む約３．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡの部分に相当するバンド
を切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（ｖｏｌ　
７ｗｔ）の８Ｍ　　Ｎａ（ＪＯ４水溶液に溶解させた。

Ｃｈｅｎらのグラスフィルター法［Ｃ，Ｗ。

Ｃｈｅｎら、　Ａｎａｌ　、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　　
１０１．　３３９（１９８０）　］により、約３．７）
（ｂｐのＤＮＡ断片（ｃｆａ　ｌ−８ａｌＩ）をアガロ
ースゲルより回収した。

先に得られたヒｌ−Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子の一部を含む約２
２０ｂｐのＤＮＡ断片について、前記の方法に準じて末
端のリン酸化反応を行なった後、プラスミドＥＩＢ　Ｒ
３２２の大部分を含む約３，７Ｋ　ｂｌ）のＤＮＡ水溶
液と混合する。エタノール沈澱の後、前記の方法に準じ
て両ＤＮＡ断片の連結反応を行なった。

エシェリヒア・コリＣｅｏｏｒ−ｍ−株の形質転換は、
通常のＣａＣｌ２法（Ｍ、　Ｖ、　Ｎｏｒｏａｒｄらの
方法）の改良法で行なった。すなわち、５ｄのし培地（
１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ｐｅａ
　Ｃ１，ＩＩＨ７，２）にエシェリヒア−ｍｌすＣ６０
０ｒ１−株の１８時間培！！基を接種し、菌体を含む培
養液の６００ｎｍにおける濁度（ＯＤｔ−）が０，３に
達するまで生育させる。菌体を冷たいマグネシウム・バ
ッフｐ　−［０，ＩＭ　　Ｎａ　ＣＬ　５　　ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２゜５　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｐＨ７
，６，０℃）］中で２回洗い、２ｓｄ！の冷したカルシ
ウム・バッファー［１００ｍＭｃａ　Ｃ１２、２５０１
１１Ｍ　　ＫＣｊ、　５　ｉＭＭ（Ｉ　Ｃ１２，５ｍＭ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ　（ｒｌＨ７，６゜０℃）〕中に
再懸濁させ、０℃で２５分間放置する。

次に菌体をこの寄りの１／１０にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のＤＮＡ水溶液と２：１　（ｖ
ｏｌ、　：　ｖｏｌ、）　混合する。この混合物を６０
分間。

０℃で保った後、１１ｄのＬＢＧ培地（１％トリプトン
、０．５％酵母エキス、１％Ｎａ（Ｊ、０．０８％グル
コース、　　ｐＨ７，２）を添加し、３７℃で１時間振
どう培養する。培養液を、加択培地［アンピシリン（シ
グマ）３０μｇ／Ｉ１１を含むＬ培地プレート］に１０
０μＪ２／プレートの割合で接種する。プレートを３７
℃で１晩培養して、形質転換株を生育させる。得られた
アンピシリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いて
ＤＮＡを調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的
のプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ（約４．ＯＫ　ｂｒｌ）の
取得を確認した。第３図に、プラスミドｐＴＮＦＩＢＲ
の作成方法を示ず。

以上と同様な手法により、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−８〜ＴＮＦ−１３を用いてプラスミドｐＴＮＦ２Ｎ
（約３．ＩＫ　ｂｐ）を、合成オリゴヌクレオチドＴＮ
Ｆ−１４〜ＴＮＦ−１７を用いてプラスミドｐＴＮＦ３
（約２．４Ｋ　ｂｐ）を、それぞれ作成した。第４図及
び第５図に、プラスミドｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴ　Ｎ　Ｆ
　３の作成方法を、それぞれ示す。

こうして１ツられたヒトＴ　Ｎ　Ｆ　ｉＨ伝子の一部を
含むプラスミドｐＴＮＦＩＢＲ，ｐＲＮＦ２Ｎ及びｐＴ
Ｎｌ”３の、合成オリゴヌクレオチド使用部分の塩基配
列が設計通りであることは、マキサム・ギルバート法［
Ａ、　Ｍ、　Ｍａｘａｍら、　ＭｅｔｈｏｄｓＥ　ｎｚ
ｙｍｏｌ、、６５．　４９９　（１９８０）　］によっ
て確認した。

実施例４（ヒトＴＮＦｉｔ伝子発現型プラスミドの作成
）実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦｉ［３Ｒ１０μ
りを、実施例３と同様にして制限酵素ｃｔａｒ及び３ａ
ｌ■で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気体！ＩＪ　
（ゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて、ヒト
ＴＮＦ遺伝子の一部を含む杓２２０ｂｐのＤＮＡ断片（
Ｃｆａ　ｌ−８ａｌＩ＞をポリアクリルアミドゲルより
回収した。

次に、実施例３で得られたプラスミドρＴＮＦ２　１０
、ｃｚｇを１００μｕの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓ−Ｈ
Ｃ２（ｐｌ−１７，５）　、　６０ｍ　Ｍ　　Ｎａ　ｃ
ｌ、　７　　ｍＭＭｇＩＪ２水溶液に溶解させ、４０ユ
ニットの制限酵素ＰＶＬＩＩＩ（宝酒造）を添加し、３
７℃で１時間切断反応を行なった。そして、実施例３の
方法に準じて１１１１限醇素３ａｌ■による切断、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実
ＩＭ例２の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含
む約１７０ｂｐのＤＮＡ断片（ＳａｌＩＭＰＶＩＩＩＩ
）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

また、実施例３で得られたプラスミドｐＴＮＦ３　１０
ｕｗも１００μｌの１０　ｍＭ　　Ｔ　ｒｉｓｉ−Ｉ　
ＣＩ（Ｄｔ−１７，５）　、　６０　ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ
１，７ｍＭＭり（Ｊ　２水溶液に溶解させ、４０ユニツ
トの制限酵素ｐｖｕ［及び４０ユニツトの制限酵素１−
１ｉｎｄＩ［ｌ（宝酒造）を添加し、３７℃で１時間切
断反応を行なった。そして、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２の方法に準じて
、ヒトＴＮＦ遺伝子の一部を含む約１１０ｂ１１のＤＮ
Ａ断片（ＰｖｕｌＩ＋ｌ−（ｉｎｄ　ＩＩＩ　）　ヲポ
リアクリルアミトゲルより回収した。

一方、大腸菌ｔｒｐプロモーターを有するプラスミドｐ
ＹＳ３ＩＮ（約４．７Ｋｂｐ）　５μ９を、上記と同様
に制限酵素ＣｊａＩ及びＨｉｎｄｌ［［で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の１股、実施
例３の方法に準じて、プラスミドｌ）Ｙ　Ｓ　３１Ｎの
大部分を含む約４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片（Ｃｆａエ
イ→ｌｌ　ｉｎｄ　ｍ　）をアガロースゲルＪ：り回収
した。

こうして得られた、ヒトＴＮＦｍ伝子の一部を含む約２
２０ｂｐ、約１７０ｂｐ及び約１１０ｂｐの３つのＤＮ
Ａ断片とプラスミドｐＹ　Ｓ　３ＩＮの大部分を含む約
４．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とを混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応啓了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６００ｒ−ｍ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のヒトＴ　Ｎ　Ｆ　遺
伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１ＮＮ（約５．２Ｋ
ｂｐ）を有するクローンを選択した。第６図に、そのプ
ラスミド１１ＴＮＦ　４０１ＮＮの作成方法を示した。

また、上記プラスミドｐＹ　Ｓ　３１Ｎ　５μ３を、上
記の方法に準じて制限酵素ＰＶＬＩＩＩで部分分解した
後、さらに制限酵素ｌ−１ｉｎｄＩＩ［で切断し、アガ
ロースゲル電気泳動くゲル濃度０．８％）の後、実施例
３の方法に準じて、ｔｒｐプロモーターを含む約２．７
ＫｂｐのＤＮＡ！ｇｉ片［Ｐ　ｖｕＩ［（２）ｅ−＋　
ト１　ｉｎｄ　　ｌ　］　をアガ【］−スゲルより回収
した。

次に第７図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
を、実施例２の方法に準じて、合成・精製した。得られ
た２本の合成オリゴヌクレオチドそれぞれ０．５μ９に
ついて、実施例３の方法に準じて、末端のリン酸化を行
ない、アニーリングの後、先に得られた約２．７Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片［ｐｖｕＩ［（２）←ｌ−１ｉｎｄｌｌ］
と混合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じ
て、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じてエシェリヒア・コ
リＣ６Ｃ６００ｒ−株に導入し、形質転換株の中より目
的のプラスミドｐＡ　Ａ　４１　（約２．７Ｋ　ｂｐ）
を有するクローンを選択した。このようなプラスミドは
、プラスミド１）ＹＳ３１Ｎからコピー数制ｍ＋領域除
去し、ｔｒｐプロモーター下流に存在するクローニング
・サイトの下流に大腸菌ｔｒｌ）　Ａターミネータ−を
付与した形の、多コピー・高効率発現ベクターであり、
第７図にその作成方法を示した。

このプラスミドＩ）ＡＡ４１　２μりを、上記と同様に
制限酵素ＣｆａＩ及びｌ−１ｉｎｄｌで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後、実施例３
の方法に準じて、プラスミドｐＡＡ４１の大部分を含む
約２，７Ｋ　ｂＤのＤＮＡ断片（Ｃオａ工←）−１ｉｎ
ｄｌｌ）をアガロースゲルより回収した。

また、先に得られたヒトＴＮＦ３ｍ転子発現型プラスミ
ドｐＴＮＦ　４０１ＮＮ５μ９を、上記と同様に制限酵
素ＣｆａＩ及びトｌ１ｎｄｌ［［で切断し、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動くゲル濃度５％）の後、実施例２
の方法に準じて、ヒトＴＮＦ遺伝子全域を含む約４９０
ｂｐのＤＮＡ断片＜Ｃ１ａ　Ｉ　Ｈｔ−１ｉｎｄ　ｌ［
［）をポリアクリルアミドゲルより回収した。

こうして得られた、プラスミドＩＩＡ　Ａ　４１の大部
分を含む約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡ断片とヒｌ−Ｔ　Ｎ
　Ｆ遺伝子全域を含む約４９０ｂｐのＤＮＡ断片とを混
合し、エタノール沈澱の後、実施例３の方法に準じて、
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、実施例３の方法に準じて、エシェリヒア・
コリ６００ｒ−１株に導入し、形質転換株の中より目的
のプラスミドｐＴＮ　Ｆ　４０１Ａ　（約３．２Ｋｂｐ
）を有するクローンを選択した。このプラスミドは、ヒ
トＴＮＦ遺伝子をより効率良く発現させる能力を有して
おり、第８図にその作成方法を示した。

実施例５（新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プ
ラスミドの作成）実施例４で得られたヒｔ−Ｔ　Ｎ　Ｆ遺伝子発現型プラ
スミドｐＴＮＦ　４０１Ａ２０μ３を、実施例４の方法
に準じて制限酵素ＣｊａＩ及びト１ｉｎｄｌｌｌで切断
し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）
及びアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度０．８％）の後
、それぞれ実施例２及び３の方法に準じて、生成する２
つのＤＮＡ断片（約４９０ｂｐ及び約２．７Ｋｂｐ、両
方共Ｃ１ａ　Ｉ　←＋Ｉｌ　ｉｎｄ　ＩＩＩ　）をゲル
より回収した。

ここで得られたヒトＴＮＦｍ転子全域を含む約４９０ｂ
ｌ）のＤＮＡ断片を５０μ文の１０　ＲＩＭ　　Ｔ　ｒ
ｉＳ−ｌ−ＩＣｊ　（１１８７，４）　、　ＩＯＩＭ　
　Ｍ（ｌ　ＳＯａ　、　１　１Ｍジチオスレイトール水
溶液に溶解させ、１０ユニツトの制限酵素１−１ａｐＩ
［（宝酒造）を添加して、３７℃で１時間切断反応を行
なった。反応終了後、ポリアクリルアミドゲル電気法ｅ
（ゲル′ｆＡ度５％）を行ない、実施例２の方法に準じ
て、ヒトＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約３９０ｂＤのＤ
ＮＡ断片（Ｈａｐ■−ト１ｉｎｄｎ［）をポリアクリル
アミドゲルより回収した。

また、第９図記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを、実施例２の方法に準じて、合成。

精製した。１ｑられた４本の合成オリゴヌクレオチドそ
れぞれ０．５μ９について、実施例３の方法に準じて、
末端のリン酸化を行ない、アニーリングの後、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼによる連結反応を行なった。

反応終了後、得られた２本鎖オリゴヌクレオチドを、先
に得られた約２．７Ｋ　ｂｐのＤＮＡＦＪｉ片＜Ｃ１ａ
　ｌ−１−ｆｉｎｄ　ｎ［）及びヒトＴ　Ｎ　Ｆ　’＋
Ｈ伝子０大部分を含む約３９０ｂｐのＤＮＡ断片（Ｈａ
ｐＩ［Ｈｌ−１ｉｎｄ　ｍ　）と混合し、エタノール沈
澱の後、実施例３の方法に準じて、Ｔ４−ＤＮＡリガー
ゼによる連結反応を行なった。反応終了後、実施例３の
方法に準じてエシェリヒア・コリＣ６Ｃ６００ｒ−株に
導入し、形質転換株の中より目的のプラスミドｐＴＮＦ
４６６（約３．２Ｋ　ｂ＋））を有するクローンを選択
した。このプラスミドは、次のアミノ酸配列（ト１２　
　　Ｎ）　　　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ａｒｇ−ｌ
ｙｓ　−Ｐ　ｒｏ−Ｖａｌ−Ａ　ｌａ−ｌ−１ｉｓ−Ｖ
ａｔ−Ｖａｔ−Ａ　ｌａ−Δ５ｎ−１−１ｉｓ−Ｇｌｎ
−Ａｌａ−Ｑｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｒｏ−Ａｒｑ−Ａｌａ−△
ｓｎ−Ａ　Ｉａ−Ｌ　ｅｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　Ｉａ−Ａ　
５ｎ−Ｇ　ｌｙ−Ｖ　ａｌ−Ｇ　ｌｕ−Ｌ　ｅｕ−Ａ　
ｒｏ−Ａ　ｓｐ−Ａ　５ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｖａｔ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｇ　ｌｙ−Ｌｅ
ｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１ｌｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇ　Ｉ
ｎ−Ｖａｌ−１ｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｌ／Ｓ−Ｇ　＋ｙ−Ｇ
　１ｎ−Ｇ　Ｉｙ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−
Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｃｕ−Ｌｅｕ−Ｔｂｒ−Ｈｉｓ−Ｔ
ｈｒ−Ｉ　　１ｅ−３ｃｒ−Ａ　ｒｇ−（ｌｅ−Ａ　ｌ
ａ−ｖａｔ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−ＧＩｎ−Ｔ　ｈｒ−Ｌ　
ｖｓ−Ｖ　ａｌ−Ａ　ｓｎ−Ｌ　ｃｕ−Ｌ　ｃｕ−Ｓ　
ｃｒ−△ｌａ−１１ｅ−Ｌ　ｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃ
ｙｓ−Ｇ　１ｎ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ−Ｐ　
ｒｏ−Ｇ　Ｉｕ−Ｇ　ｌｙ−Ａ　１ａ−Ｇ　ｌｕ−Ａ　
ｌａ−Ｌｙｓ−Ｐ　ｒｏ−Ｔ　ｒｐ−’Ｔｙｒ−Ｇ　１
ｕ−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｙ−Ｇ　
Ｉｙ−ｖａｌ−Ｐ　ｈｅ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ　ｅｕ−Ｇ　ｌ
ｕ−Ｌ　ＶＳ−Ｇ　＋ｙ−Ａ　５ｌ）−Ａ　ｒＱ−Ｌ　
ｅｕ−Ｓ　ｃｒ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　Ｉｕ−Ｉ　　Ｉｅ−Ａ
　５ｎ−Ａ　ｒ（１−Ｐ　ｒＯ−Ａ　５ｌ）−Ｔ　Ｉ／
ｒ−Ｌ　ｅｔｌ−Ａ　Ｓｐ−Ｐ　ｈｅ−Ａ　Ｉａ−Ｇ　
Ｉｔ＋−３ｅｒ−Ｇ　ＩＶ−Ｇ　Ｉｎ−Ｖ　ａｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｇ　Ｉｙ−１１ｅ−Ｉ　　Ｉｅ−ΔＩａ−
Ｌｅｕ−（ＣＯＯＨ）で表わされる新規抗腫瘍性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
る新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
であり、第９図にその作成方法を示した。

実施例６（発現の確認）前記実施ＶＡ４で得られた発現ベクターｐＡΔ４１゜ヒ
トＴＮＦ遺伝子発現型プラスミド１ｌＴＮＦ４０１ＮＮ
又は１）ＴＮＦ４０１△、又は実施例５′Ｃ−得られた
、新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子発現型プラスミド
１）ＴＮＦ４Ｇ６を有するエシェリヒア・コリＣ６００
ｒ−ｍ−株を、３０〜５０μｇ／ｄのアンピシリン、０
．２％のグルコース及び４　＃１４Ｆ　／　ｄのカザミ
ノ酸を含むＭ９培地［０，６％Ｎａ２トＩＰＯＪ　−０
，３％に２　ＨＰＯ４−０，０５％ＮａＣｊ−０，１％
ＮＨ４Ｃｌ水溶液（ｐＨ７，４）をオートクレーブ滅菌
した後に、別途にオートクレーブ滅菌したＭＣｌＳＯ４
水溶液及びＣａＣｌ２水溶液をそれぞれ最終濃度２ｍＭ
及び０．１１１１Ｍになるように加える。］　　２５０
ｄに接種し、ＯＤｔ、−が０．７に達するまで、３７℃
で撮とうｔ８　ｆｆｌを行なった。次いで、最終濃度５
０μｇ／ｄの３−β−インドールアクリル酸を培養液中
に添加し、さらに３７℃で１２時間振どう培養を続けた
。

遠心分離により大腸菌菌体を集めた後、ＰＢＳバッファ
ー　（１５０ｍＭ　　Ｎａ　Ｃ１を含む２０　ｍＭリン
酸バッファー、　　Ｉ）ｌ−１７，４）を用いて菌体の
洗浄を行なった。洗浄後の菌体を１０ｄのＰＢＳバッフ
ァーに懸濁させ、超音波発生装置（久保田、　　２００
Ｍ型）を用いて菌体を破壊した後、遠心分離により菌体
残渣の除去を行なった。

得られた大腸菌ライゼートの一部に対して、Ｔ　ｒｉｓ
−Ｈ（Ｊバッフ−ｐ−（ｐｌ−１６，８）　、　ＳＤＳ
、　２−メルカプトエタノールぞれ最終ｍ度６０１Ｍ，２％，４％，１０％になるよう
に加え、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動［鈴
木，遺伝，　３１．　４３（１９７７）　］を行なった
。

分離用ゲルは１６％とし、泳動バッファーはＳＯＳ。

Ｔｒｉｓ−グリシン系［Ｕ．　Ｋ．　Ｌａｅｍｍｌｉ。

Ｎａｔｕｒｅ　、ユ２７，　　６８０（１９７０）　］
を用いた。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質をクーマシ
ーブルーＲ−２５０（バイオ・ランド）で染色し、ヒト
ＴＮＦｍ仏子及び新規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の
発現の確認を行なった。結果の一部を複写して、第１０
図に示した。

なお、染色後のゲルをクロマト・スキャーナ−（島津，
ＣＳー９３０型）にかけて、産生されたヒトＴＮＦ蛋白
質又は新規抗腫瘍活性ポリペプチドの大腸菌細胞質蛋白
質中にしめる割合の算出を行なった。その結果、ヒｌ−
　Ｔ　Ｎ　Ｆ　ｍ　Ｉ公子発現型プラスミドｐＴＮＦ４
０１Ａを有する大腸菌においては全細胞質蛋白質の約１
１％のヒトＴＮＦ蛋白質，新規抗腫瘍活性ポリペプチド
遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ４６６を有する大腸菌
においては同じく約１７％の新規抗腫瘍活性ポリペプチ
ドの産生が、それぞれ認められた。また、ヒトＴ　Ｎ　
Ｆ　遺伝子発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１ＮＮを有
する大腸菌におけるヒトＴＮＦ蛋白質の産生量は、上記
ｐＴＮＦ４０１Ａの場合の約４０％にすぎず、発現ベク
ターＩ）ＡＡ４１の有用性が示された。

実施例７（活性の計画）新規抗腫瘍活性ポリペプチドの活性測定は、前記Ｒｕｆ
ｆの方法に準じて行なった。すなわら、実施例６で得ら
れた新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
トを順次培地で希釈した試料１００μ文と、４　Ｘ　１
０５個／ｄの濃度のマウスし一９２９繊維芽細胞（△Ｔ
ＣＣＣＣＬ−９２９）懸濁液１００μすを、９６穴の組
織培養用マイクロプレート（コースタ−〉内で混合した
。なおこの際に、最終１度１μ９／ｄのアクチノマイシ
ンＤ（コスメゲン、萬４５製薬）を添加しておく。培地
としては、５％（ｖｏｌ　／ｖｏｌ　）のウシ胎児°血
清を含むイーグルのミニマｌトエッセンシャル培地（日
本製薬）を用いた。上記マイクロプレートを、５％炭酸
ガスを含む空気中、３７℃で１８〜２０時間培養した後
、クリスタル・バイオレット溶液［５％（ｖ０１／ｖｏ
ｌ　）メタノール水溶液に、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ　
）のクリスタル・バイオレットを溶解さけたちの］を用
いて生細胞を染色した。余分なりリスタル・バイオレッ
トを洗い流し乾燥した後、残ったクリスタル・バイオレ
ッ１−を１００μ９の０．５％ＳＤＳ水溶液で抽出し、
その５９５ｎｌにおける吸光度をＥＬＩＳＡアナライザ
ー（東洋測温、ＥＴＹ−９６型）で測定する。この吸光
度は、生ぎ残ったａｌｌｌｌ転数例する。そこで、新規
抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼートの希釈
溶液を加えない対照の吸光度の５０％の値に相当する大
腸菌ライゼートの希釈イ８率をグラフ（たとえば第１１
図）によって求め、その希釈倍率をユニットと定義する
。第１１図より、発現型プラスミドｐＴＮＦ　４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質を含む大腸菌ライゼー
ト　１００μ旦は４．９Ｘ　１０５ユニツト程度の活性
を、そして発現型プラスミドｐＴＮＦ４６６にコードさ
れる新規抗腫瘍活性ポリペプチドを含む大腸菌ライゼー
ト　１００μ立は９，６Ｘ　１０’ユニット程度の活性
を、それぞれ右していることが明らかになった。

実施例６で得られた発現型プラスミドｐＴＮＦ４０１Ａ
にコードされるヒトＴＮＦ蛋白質又は発現型プラスミド
Ｉ）ＴＮＦ４６６にコードされる新規抗腫瘍活性ポリペ
プチドを含む大腸菌ライゼート中に含まれ総蛋白￥ｔｆ
ｆｌは、プロティン・アッセイ・キット（バイオ・ラン
ド）を用いて定量し、ウシ血清アルブミンを用いた検量
線より計口した。上記で１９られた発現邑、活性の値及
び蛋白質定量結果よりヒｉ−Ｔ　Ｎ　Ｆ蛋白質及び新規
抗１！Ｉｍ活性ポリペプチドの比活性を計算したところ
、表１のような値が得られた。表１より、新規抗腫瘍性
ポリペプチドはヒトＴＮＦｆｆｉ白質とほぼ同様の比活
性を有していることがわかる。

表１　ヒトＴＮＦ蛋白質と本発明の新規抗腫瘍活性ポリ
ペプチドの比較

【図面の簡単な説明】

第１図は設計したヒトＴＮＦ３ｕ伝子の塩基配列を、第
２図は化学合成した合成オリゴヌクレオチドの塩基配列
を、それぞれ示したものである。第３図、第４図及び第
５図は、ヒトＴＮＦ１１伝了の一部を有１゛るプラスミ
ドｐＴＮＦ１ＢＲ，ｐＴＮＦ２Ｎ及びｐＴＮＦ３の作成
方法を、それぞれ示したものである。第６図はヒトＴＮ
Ｆ遺伝子発現型プラスミドＤＴ　Ｎ　Ｆ　４０１Ｎ　Ｎ
の作成方法を、第７図は発現ベクターｐＡ　Ａ　４１の
作成方法を、そして第８図はヒトＴＮＦｍ伝子発現型プ
ラスミド１］ＴＮＦ４０１Ａの作成方法を、それぞれ示
したものである。第９図は新規抗腫瘍活性ポリベブヂド
遺伝子発現型プラスミド１）ＴＮＦ４６６の作成方法を
示したものである。第１０図はヒトＴＮＦｌ伝子及び新
規抗腫瘍活性ポリペプチド遺伝子の発現確認結果を示し
たものである。第１１図はヒトＴＮＦ蛋白質及び新規抗
腫瘍活性ポリペプチドの活性測定結果を示したものであ
る。特許出願人　　帝　　人　　株　　式　　会　　礼式　
　理　　人　　弁理士　　前　　１）　純　　博第　２
１ｋｌ拓　４１ｕＩＰｖｕｌＬ（Ｉ）も’８　　諷ｔｙ７Ｌ括９いの８〜晃１０国手続補正書昭和６２年４月、６日

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】（ＣＯＯＨ）で表わされる、新規生理活性ポリペプチド
。
（２）アミノ末端にＭｅｔが結合していることを特徴と
する第１項記載のポリペプチド。
（３）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミド。
（４）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる一本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（５）該ＤＮＡ領域が次の塩基配列【遺伝子配列があります】で表わされる−本鎖ＤＮＡとそれに相補的な一本鎖ＤＮ
Ａとから成る二本鎖ＤＮＡを含むことを特徴とする第３
項記載のプラスミド。
（６）該プラスミドがプラスミドｐＴＮＦ４６６である
第３項記載のプラスミド。
（７）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドをコードす
るＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換さ
れた組換え微生物細胞。
（８）該微生物細胞がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であることを特
徴とする第７項記載微生物細胞。
（９）次のアミノ酸配列【アミノ酸配列があります】（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプトチドをコード
するＤＮＡ領域を含む組換えプラスミドにより形質転換
された組換え微生物細胞を培養し、培養物中に新規生理
活性ポリペプチドを生成蓄積せしめ、得られた培養物か
ら新規生理活性ポリペプチドを分離することを特徴とす
る、新規生理活性ポリペプチドの製造方法。
（１０）抗腫瘍に有効な量の次のアミノ酸配列【アミノ
酸配列があります】（ＣＯＯＨ）で表わされる新規生理活性ポリペプチドまたはそのアミ
ノ末端にＭｅｔが結合しているポリペプチドを含有する
医薬組成物。