FR2701264A1

FR2701264A1 - Mutéines de facteur de nécrose tumorale.

Info

Publication number: FR2701264A1
Application number: FR9401347A
Authority: FR
Inventors: Shin Hang-Cheol; Shin Nam-Kyu; Lee Inkyung; Kang Sungzong
Original assignee: Hanil Synthetic Fiber Co Ltd
Current assignee: Hanil Synthetic Fiber Co Ltd
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-07
Publication date: 1994-08-12
Anticipated expiration: 2014-02-07
Also published as: KR970005043B1; DE4404124C2; US5773582A; JP2837344B2; DE4404124A1; KR940019726A; JPH0770193A; GB9401977D0; GB2275683A; FR2701264B1; KR970005042B1; GB2275683B

Abstract

L'invention concerne des mutéines de facteur de nécrose tumorale, un procédé pour leur production et des ADN encodant ces mutéines. Selon l'invention, la mutéine de TNF polypeptide a une séquence acides aminés représentée par la séquence acides aminés [1] [SEQ ID NO:1] dans laquelle au moins un des 4ième au 10ième, 38ième au 41ième, 52ième au 54ième, du 56ième, des 85ième au 88ième, des 127ième au 129ième, du 156ième et du 157ième acides aminés est remplacé par un autre acide aminé, optionnellement en effaçant un ou plus des 1er au 7ième acides aminés du N-terminus de ceux-ci. Ces mutéines ont une activité anti-tumeur supérieure et une toxicité létale aiguë inférieure en comparaison des facteurs de nécrose tumorale humain de type sauvage et à ce titre peuvent être utilisés dans tous les domaines où l'on a besoin d'une telle activité anti-tumeur.

Description

La présente invention se rapporte à des mutéines de facteur de nécrose

tumorale avec des activités anti-tumeur supérieures, à un procédé pour la préparation de celles-ci,

et à des polynucléotides encodant lesdites mutéines.

Le facteur de nécrose tumorale ("TNF" ou "TNF-a"), qui est une cytokine produite primairement par des monocytes et des macrophages activés, est connu pour induire des nécroses hémorragiques des tumeurs transplantées in vivo et pour être cytotoxiques envers diverses lignes de cellules tumorales in vitro lAggarwal, B B, Drugs of the Future, 891-898 ( 1987)l Le TNF est également connu pour montrer des activités antivirales lMestan, J et al, Nature, 323, 816-819 ( 1986); Wong, G H W & Goeddel, D V, Nature, 323, 819-822 ( 1986)l et pour désactiver certaines espèces de parasites paludéens in

vivo lTaverne, J et al, Clin Exp Immunol, 67, 1 ( 1987)l.

Le TNF est initialement produit en tant que prohormone; cependant, lorsqu'il est sécrété, des résidus des 76 acides aminés sont séparés de sa région amino terminale pour former un TNF humain mature actif et ayant une liaison disulfure intramoléculaire lAggarwal, B B et al, J Biol Chem, 260,

2345-2354 ( 1985)l.

Le gène codant le facteur de nécrose tumorale humain a été cloné et exprimé dans Escherichia coli en 1984 lPennica, D et al, Nature, 312, 724-729 ( 1984); Shirai, T et al,

Nature, 313, 803-806 ( 1985)l.

Cependant, le TNF de type sauvage a échoué à produire un effet anticancer satisfaisant pour le traitement de patients atteints de cancer lorsqu'il était administré seul, particulièrement lorsqu'il était utilisé pour une thérapie systémique lBlick, M et al, Cancer Res, 47, 2986 ( 1987); Creaven, P J et al, Cancer Chemother Pharmacol, 20, 137 ( 1987); Kumura, K et al, Cancer Chemother Pharmacol, , 223 ( 1987)l La raison de cet échec réside dans le fait que le TNF est hautement toxique et provoque des effets secondaires graves et, donc, ne peut pas être administré à

une dose suffisante pour montrer l'effet anti-cancer.

Pour surmonter ce problème, divers essais ont été effectués pour produire des mutéines de TNF avec une activité anti-tumeur plus élevée mais avec des effets secondaires réduits, par exemple, au moyen, de l'élimination de plusieurs acides aminés au terminus amino et/ou en induisant une mutagénèse aléatoire (Mattews et al, Br J Cancer, 42, 416 ( 1980); Ruff et al, J Immunol, 125, 1671 ( 1980); Mannel et al, Infect Immunity, 28, 204 ( 1980); Haranaka et al., Japon J Exp Med, 51, 191 ( 1981); Publication du brevet européen No 90892; publication du brevet européen No 86475; Publication du brevet japonais No 21621/1983; Publication du brevet européen No 155 549 ( 1985); Publication du brevet européen No 168 214 ( 1985); et Publication du brevet européen No 251 037 ( 1987) Cependant, les résultats obtenus à partir de tels mutéines de TNF montrent au mieux une activité anti- tumeur sept fois plus élevée que celle du TNF de type sauvage lNakamura, S et al,

Int J Cancer, 48, 744-748 ( 1991)l.

D'autre part, la structure tridimensionnelle du TNF humain ("h TNF") est connue pour être sous la forme d'une structure en sandwich de feuilles à plis 3 ou anti-parallèle, allongée avec une topologie "gelée- rouleau" et pour exister en tant que trimère avec trois axes de symétrie lJones, E Y. et al, Nature(London), 338, 225-228 ( 1989); Eck, M J et Sprang, S R, J Biol Chem, 264, 17595-17605 ( 1989)l La détermination de la structure tridimensionnelle de h TNF par cristallographie des rayons X lEck, M J et Sprang, S R, J. Biol Chem, 264, 17595-17606 ( 1989)l et les analyses mutationnelles lOstade, X V, EMBO J, 10, 827-836 ( 1991)l ont suggéré que le (s) site (s) actif (s) du TNF pour l'activité anti-tumeur peut être situé sur les régions polypeptides autour de chaque côté des trois rainures qui sont formées par les trois monomères rassemblés à la base de la structure tridimensionnelle. De façon inattendue, les présents inventeurs ont réussi à développer certaines mutéines de TNF ayant une activité anti-tumeur plus élevée que celle du TNF de type sauvage ou de toute mutéine de TNF connue au moyen d'une mutagénèse systémique desdites régions polypeptides Plus spécifiquement, au moins un des acides aminés dans les six régions polypeptides à la base de la molécule trimère de TNF, nommément, la région N-terminal ou région 1 (des ier au ième acides aminés), la région 2 (des 37 ième au 41 ième acides aminés) la région 3 (des 52 ième au 56 ième acides aminés), la région 4 (des 84 ième au 88 ième acides aminés), la région 5 (des 126 ième au 130 ième acides aminés), et la région 6 (des 156 ième au 157 ième acides aminés) est mutagénisé en résidus hydrophobes, charges positivement ou charges négativement. Par conséquent, c'est un objet de la présente invention de fournir une mutéine de TNF ayant une excellente activité anti-tumeur dans laquelle au moins un des acides aminés dans les six régions polypeptides à la base de la molécule trimère

de TNF est remplacé par un autre acide aminé.

C'est un autre objet de la présente invention de

fournir un polynucléotide encodant la mutéine TNF.

C'est un objet supplémentaire de la présente invention de fournir un vecteur comprenant ledit polynucléotide et une

cellule hôte transformée avec le vecteur.

C'est encore un autre objet de la présente invention de fournir un procédé pour produire la mutéine de TNF en

employant le transformant.

C'est encore un objet supplémentaire de la présente invention de fournir une composition pharmaceutique

comprenant la mutéine de TNF en tant qu'ingrédient actif.

Selon un aspect de la présente invention, il est fourni une mutéine TNF dans laquelle au moins un des 4 ième au l Oième, des 38 ième au 41 ième, des 52 ième au 54 ième, le 56 ième, le 85 ième au 88 ième, des 127 ième au 129 ième, des 156 ième et des 157 ième acides aminés du polypeptide de TNF de type sauvage ayant la séquence aminée suivante l 1 l (SEQ ID No. 1) est remplacé par un autre acide aminé, avec ou sans

délétion d'un ou plus des ler au 7 ième acides aminés du N-

terminus: Pro Gly Leu Leu Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu Phe Ala Val Val Gln Leu Val Gln His Val Ile Ala Gly Ser Ala Leu Arg Ala Leu Ala Val Val Val Ser Lys Glu Gly Ala Glu Ser His Gln Asn Pro Leu Leu Tyr Ser Ala Val Glu Ser Ser Val Trp Gly Ser Phe Leu Gln Pro Lys Phe Ile Gly Ser Val Leu Val Glu Lys Thr Thr Cys Pro Gln Asn Gln Arg Ala Asn Glu Gly Gly His Lys Gln Trp Leu Arg Val Thr Asn Arg Leu Leu Gln Thr Val Arg Tyr Glu Pro Tyr Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Ile Asn Glu Glu Lys Asp Phe Ser Gln Ala Asp Leu Cys Ser Leu Thr Pro Gly Tyr Gly Asp Ala Asn Asn Ile Pro Arg Leu Pro Ile Asp Leu Ile Lys Glu Ala Gln Tyr Ser Ile Ser Glu Tyr Arg Asp Ile l 1 l Selon une caractéristique du polypeptide de l'invention au moins un des remplacements d'acides aminés suivants se produit dans la séquence acide aminé l 1 l: 4 ième Sérine par Arginine; ième Sérine par Arginine; 6 ième Arginine par Alanine; 7 ième Thréonine par Histidine ou Lysine; 8 ième Proline par Arginine; 9 ième Sérine par Lysine; ième acide Aspartique par Arginine; 38 ième Alanine par acide Aspartique; 39 ième Aspartique par acide Aspartique, Lysine ou Valine; ième Glycine par acide Aspartique, Lysine ou Valine; 4 lième Valine par Sérine; 52 ième Sérine par Isoleucine, acide Glutamique ou Lysine; 54 ième Glycine par acide Aspartique ou Valine; 56 ième Tyrosine par Phénylalanine ou acide Glutamique; ième Valine par acide Glutamique ou Arginine; 86 ième Sérine par Leucine, Lysine, acide Glutamique ou acide Aspartique; 87 ième Tyrosine par acide glutamique ou Arginine; 88 ième Glutamine par acide Glutamique; 127 ième acide Glutamique par Alanine, Valine ou Lysine; 128 ième Lysine par Alanine; Valine ou acide Glutamique; 129 ième Glycine par acide Glutamique, Lysine ou Valine; 156 ième Alanine par acide Aspartique; et

157 ième Leucine par Phénylalanine.

Dans ce cas, le polypeptide de l'invention a de plus soit: les 4 ième et les 5 ième sérines remplacées par des Arginines, respectivement; et les 3 premiers acides aminés

successifs à partir du N-terminus effacés.

soit: les 7 acides aminés successifs à partir du N-

terminus effacés.

Dans le cas o les 7 acides aminés successifs à partir du N-terminus sont effacés, le polypeptide de l'invention est de plus caractérisé en ce que: soit:la 8 ième Proline, la 9 ième Sérine, le 10 ième acide Aspartique et la 157 ième Leucine sont de plus remplacés par l'Arginine, la Lysine, l'Arginine et la Phénylalanine, respectivement; soit: la 52 ième Sérine et la 56 ième Tyrosine sont de plus remplacées par l'Isoleucine et la Phénylalanine, respectivement; soit: la 52 ième Sérine, la 56 ième Tyrosine, la 156 ième Alanine et la 157 ième Leucine sont de plus remplacées par l'Isoleucine, la Phénylalanine, l'acide Aspartique et la Phénylalanine, respectivement; soit: la 86 ième Sérine est remplacée par la Lysine; soit:la 87 ième Tyrosine est remplacée par l'acide Glutamique; soit: chacune des 86 ième Sérine et des 88 ième

Glutamine est remplacée par l'acide Glutamique.

Selon une autre caractéristique du polypeptide de l'invention, la Méthionine est attachée au N-terminus de la

séquence d'acides aminés.

Un objet de l'invention est aussi un polypeptide ayant une séquence nucléotide encodant le polypeptide selon l'invention. Le vecteur contenant ce polynucléotide fait également

partie de l'invention.

Selon une caractéristique de ce vecteur le fragment d'ADN encodant TNF dans le plasmide p T 7-TNF ou p GHH-TNF est remplacé par un fragment d'ADN encodant une mutéine TNF selon l'invention. Le microorganisme transformé avec le vecteur précédent

entre également dans le cadre de l'invention.

Selon une caractéristique de l'invention, ce

microorganisme est Escherichia coli.

Un autre objet de l'invention est un procédé, pour préparer le polypeptide de l'invention, qui comprend la culture du microorganisme de l'invention et l'isolement du

polypeptide résultant de la culture.

Encore un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique, qui comprend le polypeptide de

l'invention ou un sel pharmaceutiquement acceptable de celui-

ci en tant qu'ingrédient actif.

Les objets et caractéristiques ci-dessus de la présente

invention deviendront apparents à partir de la description

suivante des modes de réalisation préférés donnés en conjonction avec les figures annexées, dans lesquelles la figure 1 est un schéma pour la construction d'un plasmide p GHH-TNF; et la figure 2 représente un schéma pour la construction

d'un plasmide p T 7-TNF.

Une mutéine de TNF de la présente invention a une séquence acide aminé dans laquelle au moins un des remplacements d'acides aminés suivants se produit dans la séquence acide aminé l 1 l: Remplacement de: 4 ième ième 6 ième 7 ième 8 ième 9 ième l Oième 38 ième 39 ième ième 4 lième 52 ième 53 ième 54 ième 56 ième ième 86 ième 87 ième 88 ième 127 ième 128 ième 129 ième 156 ième 157 ième Sérine par Arginine; Sérine par Arginine; Arginine par Alanine; Thréonine par Histidine ou Lysine; Proline par Arginine; Sérine par Lysine; Acide Aspartique par Arginine; Alanine par acide Aspartique Asparagine par acide Aspartique, Lysine ou Valine; Glycine par acide Aspartique, Lysine ou Valine; Valine par Sérine; Sérine par Isoleucine, acide Glutamique ou Lysine; acide Glutamique par Lysine ou Leucine; Glysine par acide Aspartique ou Valine; Tyrosine par Phénylalanine ou acide Glutamique; Valine par acide Glutamique ou Arginine; Sérine par Leucine, Lysine, acide Glutamique ou acide Aspartique; Tyrosine par acide Glutamique ou Arginine; Glutamine par acide Glutamique; Acide Glutamique par Alanine, Valine ou Lysine; Lysine par Alanine, Valine ou acide Glutamique; Glycine par acide Glutamique, Lysine ou Valine; Alanine par acide Aspartique; et

Leucine par Phénylalanine.

optionnellement délétion d'un ou plus des ler au 7 ième acides aminés, de préférence de 3 à 7 parmi les sept acides aminés ci-dessus du N- terminus dans la séquence acide aminé

de la mutéine.

De plus, lorsque la mutéine de TNF est produite dans un microorganisme tel que E coli, il y aura un Met attaché au N-terminus de la séquence acide aminé ci-dessus puisque ATG encodant Met, qui est essentiel pour l'initiation de la

translation, est nécessairement inclu dans le procédé.

Pour l'expression du polynucléotide de la présente invention dans un microorganisme tel que E coli, le codon d'initiation ATG est nécessaire; et il peut être fourni par un vecteur dans lequel le polynucléotide est inséré, ou il peut être ajouté dans la séquence polynucléotide de la

présente invention.

Le polynucléotide encodant une mutéine TNF humain de la présente invention peut être produit par synthèse chimique de la séquence totale; ou par synthèse chimique d'un oligonucléotide contenant la région à remplacer et ensuite son amplification par une réaction en chaîne de polymérase ("PCR") lSaiki, R K et al, Science, 230, 1350-1354 ( 1985)l en utilisant un AD Nc TNF humain comprenant, par exemple, la séquence polynucléotide suivante l 2 l (SEQ ID NO:2) en tant que matrice et

( 5 ')

GAC CCT AAC GGC GTG TCC CCC ATC AAG CCC GAG CTG GAC GAC GTC GTC AAG CAA CGC GTG CCA CAG TCC AGC GTC TGC GCC GGA CGA TAT TAC l'oligonucléotide en tant qu'amorce AGA CCT GCT CGG GAG TCA GTC ACC CGC AAC CAG AAG GGG CTC CTC TTT TCA GTA GAG GCC CTG GAG CTC CAT ATC CTC AGG CCC GTC AGC GAC GGG TCT GCC GGG AAT AGA GGC TTC GTG GCC CTC GAG TGG TTC GCT TTT ATC TCT CAT CAG GCC GAT CTG AAG CTC GTG TCT ACC TAT CAG GAG GCC ATT CGA GTT CTC CTC AAC TAC GGC CTC TCC GCC CCA GAG CTG ATC GAG GCC ACC GTA CAG CTG CAG CTC CAA ACC TAC ATC GAG CCC GAG AAT TCT CTG l 2 l Par exemple, l'ADN encodant une mutéine TNF, dans laquelle les 4 ième et 5 ième acides aminés (sérines) sont remplacés par des arginines et trois acides aminés sont CCG GCA TGG GCC CTG ATC GGC CAC CAG AAG GGG ATC AAG CGG GGG

( 3 ')

AGT AAC CTG AAT GTG TAC TGC ACC ACC AGC GCT TAT GGT CCC CAG enlevés du Nterminus de ceux-ci, peut être produit selon les

procédures suivantes.

Un fragment d'ADN ayant une séquence nucléotide encodant le h TNF-a de type sauvage est préparé en utilisant une méthode PCR de la banque AD Nc de monocyte humain U 937 (Clontech, USA) Une amorce sens avec un site de restriction à l'extrémité 5 ' et une séquence nucléotide modifiée et une amorce anti-sens avec un site de restriction à l'extrémité 5 ' sont chimiquement synthétisées; et, après cela, le PCR est mis en oeuvre en utilisant l'AND encodant le TNF-OE de type sauvage en tant que matrice et les amorces pour préparer

l'ADN encodant la mutéine TNF.

La mutéine h TNF de la présente invention peut être

produite par insertion de 1 'ADN modifié obtenu comme ci-

dessus dans un vecteur d'expression après sa digestion avec des endonucléases de restriction procurant des sites de restriction à chaque extrémité de celle-ci, transformation d'une cellule hôte avec le vecteur résultant et culture du transformant sous une condition qui permet l'expression du

fragment d'ADN modifié.

Plus spécifiquement, un système de vecteurs d'expression pour la production de la mutéine TNF de la présente invention peut être produit en préparant un fragment d'ADN encodant la mutéine TNF qui a aussi un codon d'initiation de translation ATG, à l'extrémité 51 et un codon de terminaison à l'extrémité 3 ', liant le fragment ADN à un promoteur approprié (par exemple, lac, trp, tac, p L, T 3, SP 6, T 7, SV 40, y(p L/p R), et les analogues) et à un site liant de ribosome, et en insérant ensuite le fragment résultant dans un vecteur, par exemple, un plasmide ( par exemple p BR 322), un phage (par exemple, un dérivé de phage lambda d'ADN et un

virus (par exemple, SV 40) d'ADN.

Le transformant peut être obtenu par transformation d'un hôte approprié, par exemple, E coli, avec le vecteur d'expression résultant selon la méthode de, par exemple, Cohen et ai lCohen, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 69,

2110 ( 1972)l.

Ensuite, le transformant est cultivé dans des conditions appropriées pour exprimer le polynucléotide modifié codant la mutéine TNF désirée Les cellules cultivées sont traitées par, par exemple, digestion de lysozyme, congélation-décongélation, traitement aux ultrasons ou presse française, et ensuite sont centrifugées ou filtrées pour

obtenir un extrait contenant la mutéine désirée.

La mutéine désirée peut être isolée de l'extrait par un procédé de purification conventionnel tel qu'une ultrafiltration, une dialyse, une chromatographie d'échange d'ions, une filtration de gel, une électrophorèse, une chromatographie d'affinité et les analogues La concentration de la mutéine TNF purifiée peut être mesurée selon, par exemple, la méthode de Bradford lBradford, M, Anal Biochem.

72, 248 ( 1976)l.

L'activité anti-tumeur in vitro peut être déterminée en tant que l'activité directe de mise à mort des cellules (cytotoxicité) en utilisant une ligne de cellules L-929 de fibrosarcome de murine sensible au TNF (ATCC CCL 1) lRuff, M R & Gifford, G E: Lymphokines, (ed Edgar Pick) 2, 235 ( 1981), Academic Press, New Yorkl comme suit:

3 à 4 x 105 cellules ( 150 pl) par puits de cellules L-

929 sont ensemencées dans une plaque de microtitreur à 96 puits contenant un milieu modifié de Dulbecco avec 2 % de sérum de veau foetal La microplaque est bien agitée et ensuite incubée à 370 C dans un thermostat contenant 5 % de C 02 Après 24 heures, le milieu est enlevé et un nouveau milieu contenant 2 pg/ml d'actinomycine D est ajouté à la microplaque en une quantité de 100 pl par puits Chacun des échantillons de TNF qui sont préparés par une dilution en série de deux fois est traité avec des rayons ultraviolets pendant 30 minutes et placé sur une plaque de microtitreur contenant des cellules L 929 en une quantité de 100 pl par puits Les cellules sont de plus incubées à 370 C dans un thermostat contenant 5 % de C 02 pendant 18 heures, et ensuite colorées pendant 15-20 minutes avec une solution de cristal violet comprenant du cristal violet à 0,5 g/l, de l'éthanol à 112 ml/1, de la formaline à 101 ml/1 (saturée avec Ca CO 3) et de l'eau distillée à 786 ml/l La plaque du microtitreur est

lavée vigoureusement avec de l'eau du robinet et séchée.

L'absorbance de la plaque du microtitreur est mesurée à 540 nm en utilisant un lecteur de microplaque Molecular Devices. La cytoxicité de chaque mutéine est calculée à partir de l'absorbance (Abs) comme suit: Cytotoxicité () Abs du contrôle * à 540 nm-Abs de l'échantillon à 540 nm X 100 Cytotoxlcit 6 (%) = x 100 Abs du contrôle à 540 nm * en tant que contrôle, des cellules L- 929 non traitées

avec un TNF sont utilisées.

Une unité est définie comme la quantité de TNF requise

pour la mise à mort de 50 % des cellules.

Le facteur de nécrose tumorale ou les mutéines du facteur de nécrose tumorale de la présente invention peuvent être formulées, pour administration, sous forme de dose unitaire ou de doses multiples selon une méthode connue, par exemple, en mélangeant avec des porteurs physiologiquement acceptables, c'est-à-dire, l'eau, des tampons, une solution de Ringer, une solution de dextrose ou de l'albumine de sérum humain à 5 % La formulation peut de plus contenir des antioxydants tels que l'acide ascorbique, des polypeptides à bas poids moléculaire, des protéines, des acides aminés ou

des carbohydrates tels que le glucose ou la dextrine.

La composition pharmaceutique peut être administrée de façon intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou intralésionelle, c'est-à-dire, par une injection directe dans les tumeurs solides Si désiré, le TNF ou les mutéines de TNF peuvent être administrées en combinaison avec d'autres agents antinéoplastiques tels que la cysplatine, l'actinomycine-D, l'adriamycine, etc; des modulateurs immunes tels que des immunoglobulines, par exemple, la gamma globuline; ou les interférons Une formulation typique comprend du TNF et un interféron gamma en une quantité telle que le rapport d'activité unitaire de TNF:interféron s'établisse de 0,1:1 à :1 Le niveau de dosage du TNF ou de la mutéine de TNF est de préférence dans l'intervalle de 5 à 20 pg/kg/jour qui peut être changé selon les voies et la fréquence de

l'administration, et l'état du patient sujet.

Les exemples suivants sont entendus exemplifier spécifiquement la présente invention sans limiter l'étendue

de la présente invention.

EXEMPLE 1: Production d'un polypeptide TNF humain.

1-A Construction d'un plasmide contenant un ADN c TNF humain.

Etape 1 Construction d'un plasmide p GHH-TNF.

Un fragment d'ADN comprenant une séquence l 2 l nucleotide encodant le TNF-a de type sauvage humain a été préparé par mise en oeuvre du PCR en utilisant en tant que matrice une banque AD Nc de monocyte humain (Clontech) préparée à partir de la cellule U 937 La séquence nucleotide des amorces utilisées est comme suit: Amorce sens (SEQ ID NO:3):

'-GCACCATGGTCAGATCATCTTCTCGAACC-3 '

Amorce anti-sens (SEQ ID NO:4):

3 '-TGAAACCCTAGTAACGGGACACTATTCCTAGGTGT-5 '.

Les produits préparés par PCR ont été digérés avec les endonucléases de restriction Nco I et Bam HI pour préparer l'ADN à double brin ("fragment 1 ") avec des extrémités cohésives Le p GEMEX-1 (Promega) avec le système d'expression T 7 a été utilisé en tant que système de vecteur d'expression, qui avait été modifié pour avoir un site Nco I à la place du site de restriction Nde I de façon à inhiber le gène TNF d'être exprimé en tant que protéine de fusion contenant la protéine 10 du gène T 7, et avait été digéré avec une endonucléose de restriction Bam HI Le plasmide linéaire résultant a été digéré avec une endonucléase de restriction

Bgl II.

Pendant ce temps, le produit PCR suivant contenant le promoteur T 7 et les sites d'endonucléases de restriction Nco I sur l'extrémité 5 ' et Bgl II sur l'extrémité 3 ' (SEQ ID NO:5) a été préparé par mise en oeuvre du PCR en utilisant le plasmide linéaire préparé par la digestion Bam HI en tant que matrice La séquence nucléotide soulignée indique la région

du promoteur T 7.

'-GCACCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGAGGGAAACCG

TTGTGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGCGGGATCGAGATCTCCC-3 '.

Les amorces suivantes ont été utilisées pour préparer le produit PCR cidessus: Amorce sens (SEQ ID NO:6): 5 '-GCACCATGGTATATCTCCTTCTTAAAG-3 '

Amorce anti-sens (SEQ ID NO:7):3 '-AAAGCGCCCTAGCTCTAGAGGG-5 '.

Après que le produit PCR ait été digéré avec les endonucléases de restriction Bgl II et Nco I, le fragment résultant a été ligaturé au fragment 1 contenant le gène TNF en utilisant une ligase d'ADN T 4 Ensuite, le fragment d'ADN combiné a été inséré dans un vecteur p GEMEX- 1 digéré avec les endonucléases de restriction Bam HI et Bgl II pour préparer un

plasmide d'expression p GHH-TNF.

La procédure est décrite en figure 1.

Etape 2 Construction d'un plasmide p T 7-TNF.

Un fragment d'ADN comprenant une séquence l 2 l nucléotide encodant le TNF-a de type sauvage humain est préparé par mise en oeuvre du PCR en utilisant une banque d'AD Nc de monocytes humains (Clontech) préparée à partir de la cellule U 937 en tant que matrice La séquence nucléotide des amorces utilisées est comme suit: Amorce sens (SEQ ID NO:8):

'-GCCATACATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACC-3 '

Amorce anti-sens (SEQ ID NO:4):

3 '-TGAAACCCTAGTAACGGGACACTATTCCTAGGTGT-5 '.

Le produit PCR résultant a été digéré avec les endonucléases de restriction Nde I et Bam HI pour avoir un site de restriction Nde I à l'extrémité 5 ' et un site de restriction Bam HI à l'extrémité 3 ' ("fragment 2 ") Le vecteur p T 7-7 lStanley Tabor & Charles C Richardson, Proc Natl. Acad Sci U S A, 82, 1074-1078 ( 1985); reçu du Department of Biological Chemistry, Harvard Medical Schooll a été utilisé en tant que système de vecteurs d'expression; et a été digéré avec les endonucléases de restriction Bam HI et Nde I Ensuite, le fragment d'ADN contenant le gène TNF a été inséré dans le vecteur préparé ci-dessus en utilisant une ADN T 4 ligase pour préparer un plasmide d'expression p T 7-TNF La

procédure est décrite en figure 2.

1-B Expression de TNF humain.

E coli JM 109 a été transformé avec chaque plasmide d'expression p GHHTNF et p T 7-TNF par la méthode décrite par Hanahan lHanahan, D, DNA Cloning 1 (Ed D M Glover), 109 ( 1985), IRS Pressl Après cela, une colonie résistante à l'ampicilline sur une plaque LB/ampicilline agar (contenant 50 pg/ml d'ampicilline) a été choisie et ensemencée à 1 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline, respectivement Après que chacune des cultures ait été incubée à 37 C toute une nuit, elle a été centrifugée à 8000 x g pendant 2 minutes pour obtenir les cellules Le plasmide a été isolé et purifié de la plaquette de E coli, en utilisant une méthode de lyse alcaline Après que le plasmide ait été dissous dans 50 p 1 de tampon TE (Tris-Cl 10 m M, p H 8,0, EDTA 1 m M), 0,1 pg de la solution de plasmide a été mélangé avec 2 pl de 10 x tampon one-phor-all (Tris acétate 100 m M, magnésium acétate 100 m M, et potassium acétate 500 m M), 1 unité de Nco I et 5 unités de Bam HI (dans le cas du plasmide p GHH-TNF) ou 1 unité de Nde I et 5 unités de Bam HI (dans le cas du plasmide p T 7-TNF), et de l'eau distillée a été ajoutée à cela pour obtenir un volume final de 10 pi La solution a été incubée à 37 C pendant 2 heures et soumise à une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % pour confirmer que le fragment d'ADN désiré était inséré dans le plasmide Un hôte d'expression E coli JM 109 (DE 3) a été transformé avec le plasmide qui contient l'insert désiré par la même méthode que mentionnée ci-dessus et ensuite, une

colonie résistante à l'ampicilline a été choisie.

Les E coli JM 109 (DE 3) transformés avec p GHH-TNF et p T 7-TNF, respectivement, ont été déposés auprès du Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) le 28 Janvier 1993 (E coli JM 109 (DE 3 + p GHHTNF); numéro d'accès KCCM-10021; E coli JM 109 (DE 3 + p T 7-TNF) numéro d'accès KCCM-10020) Le

dépôt a été fait en vertu du traité de Budapest.

1-C Purification de TNF humain. Les transformants obtenus dans ( 1-B) ci-dessus contenant les plasmides p GHH-TNF et p T 7-TNF, respectivement, ont été ensemencés dans 1 ml de milieu LB et cultivés à 37 C toute une nuit La culture a été inoculée dans 50 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline; et ensuite de l'IPTG (isopropyl thiogalactopyranoside) a été ajouté à une concentration finale de lm M lorsque l'absorbance de la culture a atteint 0,1 à 0,4 à 600 nm Apres que la culture ait été incubée avec agitation à 200 tours par minute pendant 4 heures, elle a été centrifugée à 800 xg pendant 2 minutes pour obtenir des plaquettes de E coli Les cellules ont été mises en suspension dans 5 ml de tampon phosphate de sodium m M (p H 7, 4), et la suspension a été soumise à un

traitement aux ultrasons pour rompre les cellules.

Le surnageant a été séparé par centrifugation de la solution de cellules rompues à 15000 xg et 4 C pendant 30 minutes et soumis à la quantification de la teneur en protéines totales en utilisant la méthode de Bradford Et, ensuite le surnageant a été dilué pour obtenir uneconcentration de protéines de 10 mg/ml et ensuite purifié en utilisant un système FPLC Pharmacia et une colonne d'échange d'ions mono-Q Le polypeptide désiré a été élué avec un gradient de concentration linéaire de O M à 0,5 M de Na Cl dans un tampon phosphate de sodium 10 m M (p H 7, 4) et les fractions contenant le polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 17 kd ont été collectées et rassemblées Chaque quantité de TNF obtenue était d'environ 0,7 à 0,8 mg avec

plus de 95 % de pureté.

EXEMPLE 2: Production de mutéines de TNF humain.

2-A Construction d'un plasmide contenant l'AD Nc de

mutéine de TNF humain.

Etape 1 Construction d'un plasmide de mutéine p GHH-

TNF. Le plasmide p GHH-TNF a été digéré avec l'endonucléase de restriction Nco I et le plasmide linéaire résultant a été digéré avec l'endonucléase de restriction Hind III et isolé le fragment d'ADN encodant TNF ("TNF DNA 1 ") Un fragment d'ADN

comprenant une séquence nucleotide encodant la mutéine TNFR 2-

1 a été préparé comme suit.

Des séries de PCR ont été mises en oeuvre en utilisant le TNF DNA 1 en tant que matrice et les amorces mutantes contenant les séquences nucleotides à muter et les amorces P 1 Les amorces mutantes sont comme suit: R 2-1: amorce sens (SEQ ID NO:9):

'-AATGCCCTCCTGGCCGATGACGTGGAGCTGAGA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO: 10):

3 '-TTACGGGAGGACCGGCTACTGCACCTCGACTCT-5 '.

De plus, les amorces Pl qui sont complémentaires à l'extrémité 5 ' et à l'extrémité 3 ' de TNF DNA 1,

respectivement, sont également utilisées.

Pl: amorce sens (SEQ ID NO:3):

'-GCACCATGGTCAGATCATCTTCTCGAACC-3 '

Amorce anti-sens (SEQ ID NO: 11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '.

D'abord, le PCR a été mis en oeuvre en employant une amorce sens R 2-1 et une amorce anti-sens Pl et le TNF DNA 1 en tant que matrice; un second PCR a été mis en oeuvre en employant une amorce anti-sens R 2-1 et une amorce sens Pl et le TNF DNA 1; et les produits PCR ont été combinés et recuits. Ensuite, un ADN de mutéine TNFR 2-1 ayant les sites endonucléases de restriction de Nco I à l'extrémité 5 ' et Hind III à l'extrémité 3 ' a été amplifié par mise en oeuvre du

PCR en utilisant les amorces (P 1).

Le produit PCR résultant a été digéré avec les endonucléases de restriction Nco I et Hind III pour préparer un fragment d'ADN avec les sites de restriction à chaque extrémité Ensuite, le fragment d'ADN de mutéine TNFR 2-1 a été ligaturé au plasmide linéaire avec les sites de restriction de Nco I et Hind III préparés par digestion du plasmide p GHH-TNF avec les endonucléases Nco I et Hind III en

utilisant une ADN T 4 ligase pour préparer le plasmide p GHH-

TNFR 2-1.

Les plasmides contenant les fragments d'ADN encodant d'autres mutéines TNF ont également été préparés par la même procédure que mentionné ci- dessus, sauf que les amorces R 2-1 ont été substituées par les amorces suivantes Les amorces Pl

ont été utilisées pour amplifier tous les ADN de mutéine.

R 2-2: amorce sens (SEQ ID NO:12):

'-CTCCTGGCCAAGAAAGTGGAGCTGAGA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:13):

3 '-GAGGACCGGTTCTTTCACCTCGACTCT-5 '

R 2-3: amorce sens (SEQ ID NO: 14):

'-CTCCTGGCCGTTGTAGTGGAGCTGAGA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO: 15):

3 '-GAGGACCGGCAACATCACCTCGACTCT-5 '

R 2-4: amorce sens (SEQ ID NO: 16):

'-AATGCCCTCCTGGACAATGGCGTG-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:17)

3 '-TTACGGGAGGACCTGTTACCGCAC-5 '

R 2-5: amorce sens (SEQ ID NO: 18):

'-AATGCCCTCCTGGACAATGGCTCCGAGCTGAGA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO: 19):

3 '-TTACGGGAGGACCTGTTACCGAGGCTCGACTCT-5 '

R 3-1: amorce sens (SEQ ID NO: 20):

'-TCAGAGGGCCTGTTCCTCATCTAC-3 '

amorce anti-sens (SED ID NO:21):

3 '-AGTCTCCCGGACAAGGAGTAGATG-5 '

R 3-2: amorce sens (SEQ ID NO:22):

'-TGGTGCCAATAGAGGGCCTGTACCT-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:23):

3 '-ACCACGGTTATCTCCCGGACATGGA-5 '

R 3-3: amorce sens (SEQ ID NO:24):

'-TGGTGCCAGAAGAGGGCCTGTACCT-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:25):

3 '-ACCACGGTCTTCTCCCGGACATGGA-5 '

R 3-4:amorce sens (SEQ ID NO:26):

'-TGGTGGTGCCAAAAAAGGGCCTGTAC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:27):

3 '-ACCACCACGGTTTTTTCCCGGACATG-5 '

R 3-5: amorce sens (SEQ ID NO:28):

'-TGGTGCCATCACTGGGCCTGTTC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:29):

3 '-ACCACGGTAGTGACCCGGACAAG-5 '

R 3-6: amorce sens (SEQ ID NO:30):

'-CCATCAGAGGACCTGTACCTC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:31):

3 '-GGTAGTCTCCTGGACATGGAG-5 '

R 3-7: amorce sens (SEQ ID NO:32):

'-CCATCAGAGGTCCTGTACCTC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:33):

3 '-GGTAGTCTCCAGGACATGGAG-5 '

R 3-8: amorce sens (SEQ ID NO:34):

'-TCAGAGGGCCTGGAACTCATCTAC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:35):

3 '-AGTCTCCCGGACCTTGAGTAGATG-5 '

R 4-1: amorce sens (SEQ ID NO:36):

'-ATCGCCGTCTTGTACCAGACCAAG-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:37):

3 '-TAGCGGCAGAACATGGTCTGGTTC-5 '

R 4-2: amorce sens (SEQ ID NO/38):

'-CGCATCGCCGAGAAAGAACAGACCAAG-3 '

amorce anti-sens(SEQ ID NO:39);

3 '-GCGTAGCGGCTCTTTCTTGTCTGGTTC-5 '

R 4-3: amorce sens (SEQ ID NO:40):

'-ATCGCCGTCAAATACCAGACCAAG-3 '

amorce anti-sens(SEQ ID NO:41):

3 '-TAGCGGCAGTTTATGGTCTGGTTC-5 '

R 4-4: amorce sens (SEQ ID NO:42):

'-ATCGCCGTCTCCGAACAGACCAAG-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:43):

3 '-TAGCGGCAGAGGCTTGTCTGGTTC-5 '

R 4-5: amorce sens (SEQ ID NO:44):

'-ATCGCCGTCGAGTACGAGACCAAGGTC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:45):

3 '-TAGCGGCAGCTCATGCTCTGGTTCCAG-5 '

R 5-1: amorce sens (SEQ ID NO:46):

'-TCCAGCTGGCTGCTGGTGACCGA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:47)

3 '-AGGTCGACCGACGACCACTGGCT-5 '

R 5-2: amorce sens (SEQ ID NO:48):

'-TCCAGCTGGTTGTTGGTGACCGA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:49)

3 '-AGGTCGACCAACAACCACTGGCT-5 '

R 5-3: amorce sens (SEQ ID NO:50):

'-TTCCAGCTGAAGAAGGGTGACCGA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:51):

3 '-AAGGTCGACTTCTTCCCACTGGCT-5 '

R 5-4: amorce sens (SEQ ID NO:52):

'-AGCTGGAGGAGGGTGACCGACT-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:53):

3 '-TCGACCTCCTCCCACTGGCTGA-5 '

R 5-5: amorce sens (SEQ ID NO:54):

'-AGCTGGAGAAGGAAGACCGACT-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:55):

*3 '-TCGACCTCTTCCTTCTGGCTGA-5 '

R 5-6: amorce sens (SEQ ID NO:56):

'-AGCTGGAGAAGAAGGACCGACT-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:57):

3 '-TCGACCTCTTCTTCCTGGCTGA-5 '

R 5-7: amorce sens (SEQ ID NO:58):

'-AGCTGGAGAAGGTCGACCGACT-3 '

amorce anti-sens(SEQ ID NO:59)

3 '-TCGACCTCTTCCAGCTGGCTGA-5 '

Etape 2 Construction d'un plasmide de mutéine p T 7-TNF Construction de plasmides de mutéine p T 7-TNFR 1-1 à R 1-6 Un plasmide p T 7-TNF a été digéré avec l'endonucléase de restriction Nde I et le plasmide linéaire résultant a été digéré avec l'endonucléase de restriction Hind III et isolé le fragment d'ADN encodant TNF ("TNF DNA 2 ") Un fragment d'ADN

comprenant une séquence nucleotide encodant la mutéine TNFR 1-

1 a été préparé en mettant en oeuvre un PCR en utilisant le TNF DNA 2 en tant que matrice et les amorces mutantes contenant les séquences nucleotides à muter Les amorces mutantes sont comme suit:

21 2701264

Rl-1: amorce sens (SEQ ID NO:60):

'-TATCATATGCGTCGAACCCCGAGTGACAAG-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '.

Le produit PCR résultant a été digéré avec les endonucléases de restriction Nde I et Hind III pour préparer un fragment d'ADN avec des sites de restriction à chaque extrémité Ensuite, le fragment d'ADN de mutéine TNFR 1-1 a été ligaturé au plasmide linéaire p T 7-TNF qui avait été préparé par digestion avec les endonucléases de restriction

de Nde I et Hind III en utilisant une ADN T 4 ligase.

Par la même procédure mentionnée ci-dessus, des plasmides contenant les fragments d'ADN encodant d'autres mutéines TNFR 1 ont également été préparés Les amorces

utilisées sont comme suit.

R 1-2: amorce sens (SEQ ID NO:61):

'-TATCATATGGCTCATCCGAGTGACAAGCCTG-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '

R 1-3 amorce sens (SEQ ID NO:62):

'-TATCATATGGCTCACCGGAAACGCAAGCCTGTA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '

R 1-4: amorce sens (SEQ ID NO: 63):

'-CGCCATATGCGAAAACCGAGTGACAAGCC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '

R 1-5: amorce sens (SEQ ID NO:64):

'-TATCATATGCGTCGTCGAACCCCGAGTGACAA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '

R 1-6: amorce sens (SEQ ID NO:65):

'-ATACATATGCGGAAACGCAAGCCTGTAGCCCAT-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO: 11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '

Construction des plasmides de mutéine p T 7-TNFM 1 et M 2 Un ADN ayant une séquence nucleotide encodant une mutéine TNFM 1 a été préparé en mettant en oeuvre un PCR en utilisant le TNF DNA 2 en tant que matrice et des amorces contenant les séquences nucleotides à muter Les amorces mutantes sont comme suit: M 1: amorce sens (SEQ ID NO: 66):

5 '-GCACATATGCCGAGTGACAAGCCTGTA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:67):

3 '-TGAAACCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '

Le produit PCR résultant a été digéré avec les endonucléases de restriction Nde I et Hind III pour préparer un fragment d'ADN avec les sites de restriction à chaque extrémité Ensuite, le fragment d'ADN de mutéine TNFM 1 a été ligaturé au plasmide linéaire p T 7-TNF préparé par digestion avec les endonucléases de restriction de Nde I et Hind III en

utilisant une ADN T 4 ligase.

Par la même procédure que décrit ci-dessus, le plasmide p T 7-TNFM 2 contenant un fragment d'ADN encodant la mutéine TNFM 2 a été préparé Les amorces mutantes sont comme suit: M 2: amorce sens (SEQ ID NO: 68):

'-ATACATATGCGGAAACGCAAGCCTGTAGCCCA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:69):

3 '-TGAAACCCTAGTAACGGAAGACTATTTTCGAATGT-5 '.

Construction d'un plasmide de mutéine p T 7-TNFM 3 Un fragment d'ADN ayant une séquence nucleotide encodant la mutéine TNFM 3 a été préparé par mise en oeuvre de la procédure décrite à l'étape 1 de l'exemple ( 2- A), sauf que le TNF DNA 2 a utilisé en tant que matrice et que les amorces M 3 suivantes et les amorces P 2 suivantes ont été utilisées à

la place des amorces R 2-1 et Pl respectivement.

M 3:amorce sens (SEQ ID NO: 70):

5 '-GTGGTGCCAATAGAGGGCCTGTTCCTCATCTAC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO: 71):

3 '-CACCACGGTTATCTCCCGGACAAGGAGTAGATG-5 '

P 2:amorce sens (SEQ ID NO:72):

5 '-ATACATATGCCGAGTGACAAGCCTGTA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:67):

3 '-TGAAACCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '

Le produit PCR résultant a été digéré avec les endonucléases de restriction Nde I et Hind III pour préparer un fragment d'ADN avec les sites de restriction à chaque extrémité Ensuite, le fragment d'ADN de mutéine TNFM 3 a été ligaturé au plasmide linéaire p T 7-TNF préparé par digestion avec les endonucléases de restriction de Nde I et Hind III en

utilisant une ADN T 4 ligase.

Par la même procédure que décrit ci-dessus, les plasmides contenant les fragments d'ADN encodant les mutéines TNFM 4, M 5 et M 6 ont été préparés avec les amorces mutantes comme suit: M 4: 1) amorce sens (SEQ ID NO:70):

'-GTGGTGCCAATAGAGGGCCTGTTCCTCATCTAC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:71):

3 '-CACCACGGTTATCTCCCGGACAAGGAGTAGATG-5 '

2) amorce sens (SEQ ID NO:68):

'-ATACATATGCGGAAACGCAAGCCTGTAGCCCA-3 '

24 2701264

amorce anti-sens (SEQ ID N 0:69):

3 '-TGAAACCCTAGTAACGGAAGACTATTTTCGAATGT-5 '

M 5 1) amorce sens (SEQ ID NO:70):

5 '-GTGGTGCCAATAGAGGGCCTGTTCCTCATCTAC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:71):

3 '-CACCACGGTTATCTCCCGGACAAGGAGTAGATG-5 '

2) amorce sens (SEQ ID NO: 72):

5 '-ATACATATGCCGAGTGACAAGCCTGTA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:73):

3 '-TGAAACCCTAGTAACTGAAGACTATTTTCGAATGT-5 '

M 6:1) amorce sens (SEQ ID NO:70):

5 '-GTGGTGCCAATAGAGGGCCTGTTCCTCATCTAC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO: 71):

3 '-CACCACGGTTATCTCCCGGACAAGGAGTAGATG-5 '

2) amorce sens (SEQ ID NO: 68):

5 '-ATACATATGCGGAAACGCAAGCCTGTAGCCCA-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO: 73):

3 '-TGAAACCCTAGTAACTGAAGACTATTTTCGAATGT-5 '.

Construction des plasmides de mutéine p T 7-TNFR.

Les autres plasmides contenant des fragments d'ADN encodant les mutéines TNFR 2 à R 5 sauf le plasmide ci-dessus

mentionné p T 7-TNF Rl ont été construits comme suit.

Un fragment d'ADN ayant une séquence nucleotide encodant une mutéine TNFR 2-1 a été préparé en mettant en

oeuvre selon la méthode décrite à l'étape 1 de l'exemple ( 2-

A), sauf que le TNF DNA 2 a été utilisé en tant que matrice et que les amorces R 2-1 suivantes et les amorces P 3 suivantes ont été utilisées à la place des amorces R 2-1 et P 1,

respectivement.

R 2-1:amorce sens: 5 '-AATGCCCTCCTGGCCGATGACGTGGAGCTGAGA-3 ' amorce antisens:3 '-TTACGGGAGGACCGGCTACTGCACCTCGAC

TCT-5 '

P 3: amorce sens: (SEQ ID NO: 8):

'-GCCATACATATGGTCAGATCATCTTCTCGAACC-3 '

amorce anti-sens (SEQ ID NO:11):

3 '-CCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '.

Le produit PCR résultant a été digéré avec les endonucléases de restriction Nde I et Hind III pour préparer un fragment d'ADN avec les sites de restriction à chaque extrémité Ensuite, le fragment d'ADN de mutéine TNFR 2-1 a été ligaturé au plasmide linéaire p T 7-TNF préparé par digestion avec les endonucléases de restriction de Nde I et

Hind III, en utilisant une ADN T 4 ligase.

Par la même procédure que décrit ci-dessus, les plasmides contenant les fragments d'ADN encodant d'autres mutéines TNFFR 2 à R 5 ont été préparés en utilisant les

amorces mutantes suivantes à la place des amorces R 2-1.

R 2-2: amorce sens:5 '-CTCCTGGCCAAGAAAGTGGAGCTGAGA-3 ' amorce anti- sens:3 '-GAGGACCGGTTCTTTCACCTCGACTCT-5 ' R 2-3: amorce sens:5 'CTCCTGGCCGTTGTAGTGGAGCTGAGA-3 ' amorce anti-sens:3 'GAGGACCGGCAACATCACCTCGACTCT-5 ' R 2-4: amorce sens:5 'AATGCCCTCCTGGACAATGGCGTG-3 ' amorce anti-sens:3 'TTACGGGAGGACCTGTTACCGCAC-5 ' R 2-5: amorce sens:5 'AATGCCCTCCTGGACAATGGCTCCGAGCTGAGA-3 ' amorce anti-sens:3 'TTACGGGAGGACCTGTTACCGAGGCTCGAC

TCT-5 '

R 3-1: amorce sens:5 '-TCAGAGGGCCTGTTCCTCATCTAC-3 ' amorce anti-sens:3 'AGTCTCCCGGACAAGGAGTAGATG-5 '

26 2701264

R 3-2: amorce sens:5 '-TGGTGCCAATAGAGGGCCTGTACCT-3 ' amorce anti-sens:3 '-ACCACGGTTATCTCCCGGACATGGA-5 ' R 3-3: amorce sens:5 'TGGTGCCAGAAGAGGGCCTGTACCT-3 ' amorce anti-sens:3 'ACCACGGTCTTCTCCCGGACATGGA-5 ' R 3-4: amorce sens:5 'TGGTGGTGCCAAAAAAGGGCCTGTAC-3 ' amorce anti-sens:3 'ACCACCACGGTTTTTTCCCGGACATG-5 ' R 3-5: amorce sens:5 'TGGTGCCATCACTGGGCCTGTTC-3 ' amorce anti-sens:3 '-ACCACGGTAGTGACCCGGACAAG5 ' R 3-6: amorce sens:5 '-CCATCAGAGGACCTGTACCTC-3 ' amorce anti-sens:3 ' -GGTAGTCTCCTGGACATGGAG-5 ' R 3-7: amorce sens:5 '- CCATCAGAGGTCCTGTACCTC-3 ' amorce anti-sens:3 '-GGTAGTCTCCAGGACATGGAG-5 ' R 3-8: amorce sens:5 '-TCAGAGGGCCTGGAACTCATCTAC-3 ' amorce anti- sens:3 '-AGTCTCCCGGACCTTGAGTAGATG-5 ' R 4-1: amorce sens:5 'ATCGCCGTCTTGTACCAGACCAAG-3 ' amorce anti-sens:3 ' TAGCGGCAGAACATGGTCTGGTTC-5 ' R 4-2: amorce sens:5 'CGCATCGCCGAGAAAGAACAGACCAAG-3 ' amorce anti-sens:3 'GCGTAGCGGCTCTTTCTTGTCTGGTTC-5 ' R 4-3: amorce sens:5 'ATCGCCGTCAAATACCAGACCAAG-3 ' amorce anti-sens:3 'TAGCGGCAGTTTATGGTCTGGTTC-5 ' R 4-4: amorce sens:5 'ATCGCCGTCTCCGAACAGACCAAG-3 ' amorce anti-sens:3 'TAGCGGCAGAGGCTTGTCTGGTTC-5 ' R 4-5: amorce sens:5 'ATCGCCGTCGAGTACGAGACCAAGGTC-3 ' amorce anti-sens:3 'TAGCGGCAGCTCATGCTCTGGTTCCAG-5 '

27 2701264

R 5-1: amorce sens:5 '-TCCAGCTGGCTGCTGGTGACCGA-3 ' amorce anti-sens:3 'AGGTCGACCGACGACCACTGGCT-5 ' R 5-2: amorce sens:5 'TCCAGCTGGTTGTTGGTGACCGA-3 ' amorce anti-sens:3 'AGGTCGACCAACAACCACTGGCT-5 ' R 5-3: amorce sens:5 'TTCCAGCTGAAGAAGGGTGACCGA-3 ' amorce anti-sens:3 'AAGGTCGACTTCTTCCCACTGGCT-5 ' R 5-4: amorce sens:5 'AGCTGGAGGAGGGTGACCGACT-3 ' amorce anti-sens:3 '-TCGACCTCCTCCCACTGGCTGA-5 ' R 5-5: amorce sens:5 '-AGCTGGAGAAGGAAGACCGACT-3 ' amorce anti-sens:3 'TCGACCTCTTCCTTCTGGCTGA-5 ' R 5-6: amorce sens:5 '-AGCTGGAGAAGAAGGACCGACT3 ' amorce anti-sens:3 '-TCGACCTCTTCTTCCTGGCTGA-5 ' R 5-7: amorce sens:5 '-AGCTGGAGAAGGTCGACCGACT-3 ' amorce anti-sens:3 'TCGACCTCTTCCAGCTGGCTGA-5 '

Construction des plasmides de mutéine p T 7-TNFR(D 7).

Un plasmide p T 7-TNFR 2-5 a été digéré avec une endonucléase de restriction Nde I et le plasmide linéaire résultant a été digéré avec une endonucléase de restriction Hind III et isolé le fragment d'ADN encodant une mutéine TNF R 2-5 ("TNFR 2-5 DNA") Un fragment d'ADN ayant une séquence nucleotide encodant la mutéine TNFR 2-5 (D 7) a été préparé par mise en oeuvre d'un PCR en utilisant le TNFR 2-5 DNA en tant que matrice et des amorces contenant les séquences nucleotides à muter Les amorces M 1 ont été utilisées pour

l'amplification PCR.

M 1: amorce sens:

5 '-GCACATATGCCGAGTGACAAGCCTGTA-3 '

amorce anti-sens:

3 '-TGAAACCCTAGTAACGGGACACTATTTTCGAATGT-5 '.

Le produit PCR résultant a été digéré avec les endonucléases de restriction Nde I et Hind III pour préparer un fragment d'ADN avec des sites de restriction à chaque extrémité Ensuite, le fragment d'ADN de mutéine TNFR 2-5 (D 7) a été ligaturé au plasmide linéaire p T 7-TNFR 2- 5 ou p T 7-TNF qui avait été préparé par digestion avec les endonucléases de restriction de Nde I et Hind III, en utilisant une ADN T 4

ligase d'ADN.

Par la même procédure que décrit ci-dessus, des plasmides contenant les fragments d'ADN encodant d'autres mutéines TNFR(D 7), nommément, TNFR 3- 1 (D 7), TNFR 3-2 (D 7), TNFR 4-(D 7), TNFR 4-4 (D 7) et TNFR 4-5 (D 7) ont été préparés par

mise en oeuvre d'un PCR en utilisant TNFR 3-1, TNFR 3-2, TNFR 4-

3, TNFR 4-4 et TNFR 4-5 DNA en tant que matrice, respectivement Les amorces (M 1) ci-dessus ont été utilisées

pour l'amplification PCR.

2-B Expression et purification de mutéines TNF humain.

E coli JM 109 (DE 3) a été transformé avec chacun des plasmides d'expression contenant un fragment d'ADN encodant une mutéine TNF par la même procédure que décrit à l'exemple ( 1-B) Après cela, une colonie résistante à l'ampicilline a été choisie en tant qu'exemple ( 1-B) et cultviée dans 50 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline, et la plaque de E.

coli a été obtenue par centrifugation.

Apres que les cellules aient été rompues par traitement aux ultrasons, des mutéines TNF avec une taille d'environ 17 KD ont été obtenues par purification par la même procédure que décrit à l'exemple ( 1-C) Chaque quantité de mutéine de TNF a été changée dans l'intervalle de 70 pg à 1 mg, qui

montrait une grande déviation selon la nature de la mutéine.

Les mutéines TNF préparées dans l'exemple sont résumées au

Tableau 1 ci-après.

29 2701264

Tableau 1 Mutéines TNF humain et leur(s) acide(s) amine(s) muté(s).

Région-1 Région Région Région Région Région-

2 3 4 5 6

m TNF: 10 41 56 88 130 157

VRSSSRTPSD LANGV SEGLY AVSYQ LEKGD AL

Rl-1: RRTPSD

R 1-2: AHPSD

R 1-3: AHRKR

R 1-4: RKPSD

R 1-5: RRRTPSD

R 1-6: RKR

R 2-1: LADDV

R 2-2: LAKKV

R 2-3: LAVVV

R 2-4: LDNGV

R 2-5: LDNGS

R 3-1: SEGLF

R 3-2: IEGLY

R 3-3: EEGLY

R 3-4: KKGLY

R 3-5: SLGLF

R 3-6: SEDLY

R 3-7: SEVLY

R 3-8: SEGLE

R 4-1: AVLYQ

R 4-2: AEKEQ

R 4-3: AVKYQ

R 4-4: AVSEQ

R 4-5: AVEYE

R 5-1: LAAGD -

R 5-2: LVVGD -

R 5-3: LKKGD -

R 5-4: LEEGD -

R 5-5: LEKED -

R 5-6: LEKKD -

R 5-7: LEKVD -

M 1:PSD

M 2: RKR AF

M 3: PSD IEGLF

AF DF DF

IEGLF -

LDNGS

SEGLF -

IEGLY -

AVKYQ AVSEQ AVEYE

2-C Test de cytotoxicité.

Les activités cytotoxiques des mutéines ont été évaluées sur des cellules L 929 de fibrosarcome de murine sensibles au TNF (ATCC CCL 1) selon la méthode mentionnée

antérieurement Les résultats sont résumés au Tableau 2.

Tableau 2 Caractérisation

ces mutéines.

du h TNF mature purifié et de Dérivés TNF No d'A A Activité Spécificité spécifique relative (unités/mlg) TNF mature 157 6,24 x 106 1,00 R 1-1 R 1-2 R 1-3 R 1-4 R 1-5 R 1- 6 R 2-1 R 2-2 R 2-3 R 2-4 R 2-5 1,06 x 107 1,12 x 107 3,12 x 106 1,87 x 106 6,36 x 107 7,49 x 108 6,24 x 105 3,74 x 105 2,50 x 105 1,87 x 105 3, 12 x 105 1,70 1,80 0,50 0,30 ,2 1,20 0,10 0,01 0,40 0,03 0,05 : RKR : PSD : RKR : PSD : PSD M 4 M 5 M 6 R 2-5 (D 7) R 3-1 (D 7) R 3-2 (D 7) R 4-3 (D 7) R 4-4 (D 7) R 4-5 (D 7) : PSD : PSD : PSD : PSD R 3-1 157 4,80 x 106 0,77 R 3-2 157 9,98 x 106 1,60 R 3-3 157 5,49 x 106 0,88 R 3-4 157 9,36 x 105 0,15 R 3-5 157 1,06 x 107 1,70 R 3-6 157 7,49 x 106 1,20 R 3-7 157 6,30 x 106 1,01 R 3-8 157 5,80 x 106 0,93 R 4-1 157 6,86 x 106 1,10 R 4-2 157 8,10 x 106 1,30 R 4-3 157 1,56 x 107 2,50 R 4-4 157 2,25 x 107 3,60 R 4-5 157 1,62 x 107 2,60 R 5-1 157 4,56 x 106 0,73 R 5-2 157 4,99 x 106 0,80 R 5-3 157 2,81 x 106 0,45 R 5-4 157 7,68 x 106 1,23 R 5-5 157 6,86 x 106 1,10 R 5-6 157 3,99 x 106 0,64 R 5-7 157 3,74 x 104 0,01 M 1 150 7,49 x 106 1,20 M 2 150 5,24 x 107 8,40 M 3 150 1,85 x 108 29,7 M 4 150 2,50 x 107 4,00 M 5 150 7,99 x 107 12,8 M 6 150 6,86 x 106 1,10 R 2-5 (D 7) 150 1,19 x 107 1,90 R 3-1 (D 7) 150 1,72 x 107 2,75 R 3-2 (D 7) 150 1,86 x 107 2,98 R 4- 3 (D 7) 150 5,30 x 107 8,50 R 4-4 (D 7) 150 5,80 x 107 9,30 R 4-5 (D 7) 150 5,24 x 107 8,40

2-D Toxicité létale aiguë.

Des souris ICR femelles ont été obtenues de Myungjin (Séoul, Corée) Des souris agées de huit semaines avec un poids corporel moyen de 33 g ont été utilisées pour les tests de létalité Plusieurs doses de mutéine de TNF ou de TNF de type sauvage dans 500 p 1 de solution saline contenant 30 mg

32 2701264

de D-galactosamine ont été administrées intrapéritonéalement (i.p). La létalité a été vérifiée 24 heures après l'administration du TNF ou des mutéines TNF, et la toxicité létale a été exprimée comme la dose létale de 50 % (LD 50). Tableau 3: Toxicité létale aiguë du TNF de type sauvage et des mutéines choisies chez les souris ICR

sensibilisées à la D-galactosamine.

TNF LD 50 (Mg/kg) TNF type sauvage 12

M 2 85

M 3 3

M 4 30

M 5 5

M 6 21

R 1-5 42

R 4-3 (D 7) 21

R 4-4 (D 7) 8

R 4-5 (D 7) 3

33 2701264

LISTING DES SEQUENCES

( 1) INFORMATION GENERALE

(i) DEMANDEUR: Hanil Synthetic Fiber Co, Ltd. (ii) TITRE DE L'INVENTION:Mutéines de facteur de nécrose tumorale (iii)NOMBRE DE SEQUENCES: 73 (iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE: (A) ADRESSE: Hanil Synthetic Fiber Co Ltd, (B) RUE: No 222 Yangduck-dong, Hoewon-ku (C) VILLE: Masan-shi (D) ETAT: Kyungsangnam-do (E) PAYS: République de Corée

(F) CODE POSTAL: 630-491

(vii): DONNEES SUR LA DEMANDE ANTERIEURE

(A) NUMERO DE DEMANDE KR:93-1751

(B) DATE DE DEPOT: 9 Février 1993 (viii):REPRESENTANT/INFORMATION SUR L'AGENT: (A) NOM: Cabinet WEINSTEIN

(B) NUMERO D'ENREGISTREMENT:

(C) REFERENCE/NUMERO DE DOSSIER: 47497

(ix): INFORMATION TELECOMMUNICATION:

(A) TELEPHONE: 45 63 22 31

(B) TELEFAX: 45 62 04 23

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:1

(i): CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A): LONGUEUR: 157 acides aminés (B): TYPE: acide aminé (C): NOMBRE DE BRIN: unique (D): TOPOLOGIE: linéaire (ii):TYPE DE MOLECULE: protéine

(xi): DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:1:

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His

10 15

Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

25

Asn Val Phe Thr Leu Ala Phe Pro Ile Ala Val Lys Ile Ser Glu Gln Asp Ile Leu Leu Ala Pro Ser Glu Gly Gln Gly Ser Arg Ile Ala Ile Lys Ala Lys Pro Leu Glu Lys Tyr Leu Asp Ala Leu Asn Gly Cys Ala Ser Trp Gly Phe Gly Leu Pro Val Pro Tyr Asp Ala Val Tyr Ser Ser Cys Glu Arg Glu

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:2

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 471 paires de base (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: double (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:AD Nc

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ Il

GTC AGA TCA TCT TCT CGA ACC CCG A Gr Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Se:

AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AA(

Lys Pro Val Ala His Val Val Ala As Glu Leu Thr Tyr Gln Pro Leu Ser Leu Arg Ile Tyr His Val Gln Thr Arg Glu Ile Tyr Ser Ala Gly Gln

D NO:2

T GAC r Asp C CCT n Pro Arg Asn Gln Leu Val Pro Gly Ile Tyr Arg Gln Val Thr Asn Glu Gly Asn Phe Ala Leu Leu His Leu Gly Val Arg Gly Asp Ser Leu Lys Thr Leu Glu Val

CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC 90

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

30

CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC 120

Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly

40

GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG 150

Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

50

CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC 180

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

60

CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC 210

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro

*70

TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC 240

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

80

AGC CGC ATC GCC GTG TCC TAC CAG ACC AAG 270

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys

90

GTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC 300

Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

100

TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAG 330

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

110

GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG 360

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu

120

GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC 390

Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp

130

CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC 420

Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

140

36 2701264

TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC 450

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val

150

TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG 471

Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:3

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 29 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:3:

GCACCATGGT CAGATCATCT TCTCGAACC 29

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:4

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 35 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:4:

TGAAACCCTA GTAACGGGAC ACTATTCCTA GGTGT 35

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:5

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 109 bases (B) TYPE: acide nucléique

37 2701264

(C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN de la région du promoteur T 7

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:5

GCACCATGGT ATATCTCCTT CTTAAAGTTA AACAAAATTA TTTCTAGAGG 50

GAAACCGTTG TGGTCTCCCT ATAGTGAGTC GTATTAATTT CGCGGGATCG 100

AGATCTCCC 109

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:6

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO:6:

GCACCATGGT ATATCTCCTT CTTAAAG 27

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:7

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22 bases (B) TYPE:acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

AAAGCGCCCT AGCTCTAGAG GG

38 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

GCCATACATA TGGTCAGATC ATCTTCTCGA ACC 33

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:9:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 9:

AATGCCCTCC TGGCCGATGA CGTGGAGCTG AGA 33

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:10:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 10:

TTACGGGAGG ACCGGCTACT GCACCTCGAC TCT 33

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 30 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 11:

CCCTAGTAAC GGGACACTAT TTTCGAATGT 30

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 27 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 12:

CTCCTGGCCA AGAAAGTGGA GCTGAGA 27

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:13:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 13:

GAGGACCGGT TCTTTCACCT CGACTCT

2701264

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:14:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 14:

CTCCTGGCCG TTGTAGTGGA GCTGAGA 27

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:15:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 15:

GAGGACCGGC AACATCACCT CGACTCT 27

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:16:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 24 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 16:

AATGCCCTCC TGGACAATGG CGTG 24

41 2701264

( 2)INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:17:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 17:

TTACGGGAGG ACCTGTTACC GCAC 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:18:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 18:

AATGCCCTCC TGGACAATGG CTCCGAGCTG AGA 33

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:19:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 19:

TTACGGGAGG ACCTGTTACC GAGGCTCGAC TCT 33

42 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:20:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 20:

TCAGAGGGCC TGTTCCTCAT CTAC 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:21:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 21:

AGTCTCCCGG ACAAGGAGTA GATG 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:22:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 25 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 22:

TGGTGCCAAT AGAGGGCCTG TACCT 25

43 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:23:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 23:

ACCACGGTTA TCTCCCGGAC ATGGA 25

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:24:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 24:

TGGTGCCAGA AGAGGGCCTG TACCT 25

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:25:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 25:

ACCACGGTCT TCTCCCGGAC ATGGA 25

44 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:26:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 26:

TGGTGGTGCC AAAAAAGGGCC TGTAC 25

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:27:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 26 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 27:

ACCACCACGG TTTTTTCCCG GACATG 26

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:28:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 23 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 28:

TGGTGCCATC ACTGGGCCTG TTC 23

2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:29:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 29:

ACCACGGTAG TGACCCGGAC AAG 23

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:30:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 30:

CCATCAGAGG ACCTGTACCT C 21

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:31:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 31:

GGTAGTCTCC TGGACATGGA G

46 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:32:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 32:

CCATCAGAGG TCCTGTACCT C 21

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:33:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 33:

GGTAGTCTCC AGGACATGGA G 21

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:34:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 34:

TCAGAGGGCC TGGAACTCAT CTAC 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:35:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 35:

AGTCTCCCGG ACCTTGAGTA GATG 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:36:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 36:

ATCGCCGTCT TGTACCAGAC CAAG 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:37:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 37:

TAGCGGCAGA ACATGGTCTG GTTC 24

48 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:38:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 38:

CGCATCGCCG AGAAAGAACA GACCAAG 27

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:39:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 39:

GCGTAGCGGC TCTTTCTTGT CTGGTTC 27

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:40:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 40:

ATCGCCGTCA AATACCAGAC CAAG 24

49 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:41:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 41:

TAGCGGCAGT TTATGGTCTG GTTC 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:42:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 42:

ATCGCCGTCT CCGAACAGAC CAAG 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:43:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 43:

TAGCGGCAGA GGCTTGTCTG GTTC 24

2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:44:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 44:

ATCGCCGTCG AGTACGAGAC CAAGGTC 27

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:45:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 45:

TAGCGGCAGC TCATGCTCTG GTTCCAG 27

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:46:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 46:

TCCAGCTGGC TGCTGGTGAC CGA 23

51 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:47:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 47:

AGGTCGACCG ACGACCACTG GCT 23

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:48:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 48:

TCCAGCTGGT TGTTGGTGAC CGA 23

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:49:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 49:

AGGTCGACCA ACAACCACTG GCT 23

52 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:50:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 50:

TTCCAGCTGA AGAAGGGTGA CCGA 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:51:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 51:

AAGGTCGACT TCTTCCCACT GGCT 24

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:52:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 22 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 52:

AGCTGGAGGA GGGTGACCGA CT 22

53 2701264

* ( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:53:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 53:

TCGACCTCCT CCCACTGGCT GA 22

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:54:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 54:

AGCTGGAGAA GGAAGACCGA CT 22

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:55:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 55:

TCGACCTCTT CCTTCTGGCT GA 22

54 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:56:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 56:

AGCTGGAGAA GAAGGACCGA CT 22

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:57:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 57:

TCGACCTCTT CTTCCTGGCT GA 22

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:58:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 58:

AGCTGGAGAA GGTCGACCGA CT 22

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:59:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 59:

TCGACCTCTT CCAGCTGGCT GA 22

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:60:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 60:

TATCATATGC GTCGAACCCC GAGTGACAAG 30

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:61:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 31 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 61:

TATCATATGG CTCATCCGAG TGACAAGCCT G 31

56 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:62:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 62:

TATCATATGG CTCACCGGAA ACGCAAGCCT GTA 33

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:63:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 63:

CGCCATATGC GAAAACCGAG TGACAAGCC 29

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:64:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 32 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D) TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 64:

TATCATATGC GTCGTCGAAC CCCGAGTGAC AA 32

57 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:65:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 65:

ATACATATGC GGAAACGCAA GCCTGTAGCC CAT 33

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:66:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 66:

GCACATATGC CGAGTGACAA GCCTGTA 27

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:67:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 67:

TGAAACCCTA GTAACGGGAC ACTATTTTCG AATGT 35

58 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:68:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 68:

ATACATATGC GGAAACGCAA GCCTGTAGCC CA 32

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:69:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 69:

TGAAACCCTA GTAACGGAAG ACTATTTTCG AATGT 35

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:70:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 70:

GTGGTGCCAA TAGAGGGCCT GTTCCTCATC TAC 33

59 2701264

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:71:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 33 bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRIN: unique (D):TOPOLOGIE: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE:amorce ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 71:

CACCACGGTT ATCTCCCGGA CAAGGAGTAG ATG 33

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:72:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 72:

ATACATATGC CGAGTGACAA GCCTGTA 27

( 2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO:73:

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID No 73:

TGAAACCCTA GTAACTGAAG ACTATTTTCG AATGT

Claims

REVENDICATIONS

1 Mutéine TNF polypeptide ayant une séquence acide aminé représentée par la séquence acides aminés lIl lSEQ ID NO:1 l dans laquelle au moins un des 4 ième au 10 ième, des 38 ième au 41 ième, des 52 ième au 54 ième, du 56 ième, des 85 ième au 88 ième, des 127 ième au 129 ième, du 156 ième et du 157 ième acides aminés est remplacé par un autre acide aminé, effaçant optionnellement un ou plus des aminés du N-terminus de ceux-ci: Pro Gly Leu Leu Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu Phe Ala Val Val Gln Leu Val Gln His Val Ile Ala Gly Ser Ala Leu Arg Ala Leu Ala Val Val Val Ser Lys Glu Gly Ala Glu Ser His Gln Asn Pro Leu Leu Tyr Ser Ala Val Glu Ser Ser Val Trp Gly Ser Phe Leu Gln Pro Lys Phe Ile Gly Ser Val Leu Val Glu Lys Thr Thr Cys Pro Gln Asn Gln Arg Ala Asn Glu Gly Gly His Lys Gln Trp Leu Arg Val Thr Asn Arg Leu Leu Gln Thr Val Arg Tyr Glu Pro Tyr ler au 7 ième acides Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Ile Asn Glu Glu Lys Asp Phe Ser Gln Ala Asp Leu Cys Ser Leu Thr Pro Gly Tyr Gly Asp Ala Asn Asn Ile Pro Arg Leu Pro Ile Asp Leu Ile Lys Glu Ala Gln Tyr Ser Ile Ser Glu Tyr Arg Asp Ile l 1 l 2 Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que au moins un des remplacements suivants d'acides aminés se produit dans la séquence acides aminés l 1 l: Sérine par Arginine; Sérine par Arginine; Arginine par Alanine; Thréonine par Histidine ou Lysine; Proline par Arginine; 4 ième ième 6 ième 7 ième 8 ième 9 ième Sérine par Lysine; 0 lième Acide Aspartique par Arginine; 38 ième Alanine par acide Aspartique 39 ième Asparagine par acide Aspartique, Lysine ou Valine; ième Glycine par acide Aspartique, Lysine ou Valine; 4 lième Valine par Sérine; 52 ième Sérine par Isoleucine, acide Glutamique ou Lysine; 53 ième Acide Glutamique par Lysine ou Leucine 54 ième Glycine par acide Aspartique ou Valine; 56 ième Tyrosine par Phénylalanine ou acide Glutamique; ième Valine par acide Glutamique ou Arginine; 86 ième Sérine par Leucine, Lysine, acide Glutamique ou acide Aspartique; 87 ième Tyrosine par acide Glutamique ou Arginine; 88 ième Glutamine par acide Glutamique; 127 ième Acide Glutamique par Alanine, Valine ou Lysine; 128 ième Lysine par Alanine, Valine ou acide Glutamique;

129 ième Glycine par acide Glutamique, Lysine ou Valine; 156 ième Alanine par acide Aspartique; et

157 ième Leucine par Phénylalanine.

3 Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que les 4 ième et les 5 ième sérines sont remplacées par des Arginines, respectivement; et les 3 premiers acides aminés

successifs à partir du N-terminus sont effacés.

4 Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que les 7 acides aminés successifs à partir du N-terminus

sont effacés.

5 Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que la 8 ième Proline, la 9 ième Sérine, le 10 ième acide Aspartique et la 157 ième Leucine sont remplacés par l'Arginine, la Lysine, l'Arginine et la Phénylalanine, respectivement. 6 Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que la 52 ième Sérine et la 56 ième Tyrosine sont remplacées

par l'Isoleucine et la Phénylalanine, respectivement.

7 Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que la 52 ième Sérine, la 56 ième Tyrosine, la 156 ième Alanine et la 157 ième Leucine sont remplacées par l'Isoleucine, la Phénylalanine, l'acide Aspartique et la Phénylalanine, respectivement. 8 polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en

ce que la 86 ième Sérine est remplacée par la Lysine.

9 Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que la 87 ième Tyrosine est remplacée par l'acide

Glutamique.

Polypeptide selon la revendication 4, caractérisé en ce que chacune des 86 ième Sérine et des 88 ième Glutamine

est remplacée par l'acide Glutamique.

11 Polypeptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la Méthionine

est attachée au N-terminus de la séquence d'acides aminés.

12 Polypeptide ayant une séquence nucléotide encodant

le polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à

11. 13 Vecteur contenant le polynucléotide selon la

revendication 12.

14 Vecteur selon la revendication 13, caractérisé en

ce que le fragment d'ADN encodant TNF dans le plasmide p T 7-

TNF ou p GHH-TNF est remplacé par un fragment d'ADN encodant

une mutéine TNF selon l'une quelconque des revendications 1 à

11. Microorganisme transformé avec le vecteur de la

revendication 13.

16 Microorganisme selon la revendication 15,

caractérisé en ce qu'il est Escherichia coli.

17 Procédé pour préparer un polypeptide selon l'une

quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il

comprend la culture du microorganisme de la revendication 15

ou 16 et l'isolement du polypeptide résultant de la culture.

18 Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon l'une quelconque des

revendications 1 à 11 ou un sel pharmaceutiquement acceptable

de celui-ci en tant qu'ingrédient actif.