BG60238B2 - Човешки тумор- некротизиращ фактор - Google Patents

Abstract

Човешкият туморнекротизиращ фактор (тnf) намира приложение в медицината. Тnf и мутантните белтъци (мутеини) са с n-крайни делеции и с по-висока биологична активност. Тnf се получава чрез рекомбинантни методи, като човешка промиелоцитна левкемична клетъчна линия се индуцира чрез подобрен метод и тnfсе пречиства до хомогенност. Прилагат се методи, вектори и клетки, необходими за получаването на човешки тnf в количества, достатъчни за практическо приложение. 19 претенции, 8 фигури

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до рекомбинантно получаване на човешки белтъчни фактори, по-специално до продуцирането на белтък, който е селективно токсичен за тумори, както и за негови заместители - мутантни белтъци /мутеини/, които са с подобрена специфична активност.

Предшестващо състояние на техниката Факторът, известен като тумор некротизиращ фактор /TNF/, е открит за първи път от Карсвел и сътр., лит.източник /1/. Установено е, че серумите на третирани с ендотоксични мишки, зайци или плъхове, които са били предварително сенсибилизирани с имунопотенциатор, например Bacillus Calmehe-Gurin / BCG/, съдържат вещество, което при инжектиране в мишки с трансплантирани тумори, предизвиква интензивно разрушаване на туморите без нежелани странични ефекти за реципиента. Предполага се, че серумите съдържат вещество, което селективно действа некротично на туморните клетки и е неутрално спрямо нормалната тъкан, поради което е означено като TNF. Способността да предизвиква това селективно разрушаване на туморите при инжектиране в животни е стандарт за анализ in vivo за определяне на TNF.

TNF се продуцира и в клетъчна култура. Матюйс и сътр. /2/ получават TNF активност от среда на мононуклеарни фагоцити, получени от инжектирани с BCG зайци. Манел и сътр. / 3/ получават TNF активност от среда на обогатени с макрофаги перитонелни жлезисти клетки от инжектирани с BCG мишки, след като клетъчната култура е индуцирана с ендотоксин.

Факторът, отговорен за селективната цитотоксичност срещу неоплазмени клетки, се пречиства, но тъй като тези вещества са в незначителни количества в серума на животните или в среда от тъканна култура, пълното пречистване не е осъществено. Също така, белтъкът или белтъците са нестабилни. В два патента на US №4,447,355 и № 4,457,916 са описани методите за стабилизиране активността на препаратите чрез добавянето например на алб^мцн ИД() в^г^ех.идрати. Чрез методите, описани в тези и други патенти, използващи стандартни техники за пречистване, е възможно получаването на TNF препарати със специфична активност средно 1 х 10⁶ единици/мг, като единиците се определят чрез in vitro анализ за цитотоксичност срещу миши L-М клетки /АТСС CCL 1.2/. Не се получава обаче материал, който да е активен при in vivo анализ за туморна некроза / Carswell/ на TNF и да е достатъчно пречистен за определяне на неговата аминокиселинна последователност.

Поради сегашната липса на чист цитотоксичен белтък все още не е ясно колко белтъци предизвикват селективна некроза на ракови клетки. In vivo методът на Carswell се приема за стандарт за определяне на TNF. Поради междувидова активност на тези фактори този анализ отчасти е удобен за диагностика. Обаче по-удобният за изпълнение in vitro анализ за цитотоксичност е използва по-често като индекс за TNF активност въпреки значителните грешки и липсата на корелация между in vitro анализа и теста за определяне на TNF. Получен е белтък от трансформирана В-клетъчна линия, който е активен в in vitro анализ и е означен като “лимфотоксин”, след като е пречистен до хомогенност и частично секвениран /Genenthech, ЕРО патентна публикация 0100641, публикувана 15.02.1984/ . Прието е, че лимфотоксинът е различен белтък от TNF, тъй като той няма макрофагов произход. Също така антисеруми, получени срещу лимфотоксин, не показват кросреакция с цитотоксичния TNF фактор, пречистен от макрофаги /4/.

Намирането на определена белтъчна последователност с цитотоксичен ефект, специфично насочен срещу туморни клетки, би било от несъмнена полза за диагностиката и терапията на злокачествените заболявания. Вероятно е някои от тези фактори да показват и антипаразитна активност. Установено е, че белтък, означен като TNF, получен от серума на инжектирани с BCG мишки, показва цитотоксични ефекти спрямо маларийни паразити /Plasmodium falciparium/ in vivo и in vitro /5/.

Техническа същност на изобретението

Известно е, че човешка промиелоцитна левкемична клетъчна линия /HL-60, АТСС № CCL 240/ при подходяща индукция продуцира

BAD ORIGINAL тумор некротизиращ фактор в значителни количества. Факторът се пречиства, секвенира и продуцира чрез рекомбинантни методи. Така за първи път е получен химично определен фактор, който е избирателно цитотоксичен спрямо човешки туморни клетки. Това дава възможност да бъдат получени значителни количества от този материал за терапия, за направа на програмирани модификации за повишаване на активността и за получаване на подходящи диагностични тестове за откриване на тумори в даден организъм, т.е. наличието на рекомбинантен източник на този белтък представлява възможност за манипулиране на този полезен пептид за целите на терапията и диагностиката. Докато най-малко една форма на TNF се продуцира естествено в човек в отговор на образуването на тумор, но без гъвкавостта, количеството и качеството, които биха се осигурили от неговото рекомбинантно получаване, то без неговото получаване по рекомбинантен път полезните му свойства биха били неизползваеми.

Изобретението се отнася до рекомбинантен човешки TNF и до непрекъсната ДНК последователност, кодираща този белтък, до последователности, позволяващи нейната експресия, до вектори за трансформация, които прехвърлят на трансформираните гостоприемници способността да експресират TNF, до така трансформираните гостоприемници и до методите за получаване на различните състави на изобретението.

Изобретението се отнася до белтък, чиято аминокиселинна последователност се кодира от ДНК последователност, представена на фиг. 1, специфично в гликозилирани и негликозилирани форми.

Изобретението също се отнася до няколко специфични рекомбинантни мутантни форми на TNF /мутеини/, съдържащи промени в първичната структура в сравнение с тази, показана на фиг. 1, и до методите и материалите за тяхното получаване. Тези мутеини са със съпоставима, или по-висока активност по отношение способността селективно (избирателно) да убиват туморни клетки в сравнение с TNF, притежаващ първична структура, представена на фиг.1 /mNTF/. Тези мутеини включват съответни белтъци, съдържащи делеции в 1-10 N-терминалните аминокиселинни остатъци и мутеини без цистеин, при които липсват 1-10 Nтерминалните аминокиселини.

Изобретението се отнася и до белтък с N-терминална последователност: Bal-Arg-SerArg-Tre-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-Val-SerVal-Ala-Asn-Pro-(Gln)-(Ala)-Glu-Gly и за подобрени методи за индуциране продукцията и пречистването на тази аминокиселинна последователност от промиелоцитни левкемични клетки. Изобретението също се отнася до фармацевтични състави, съдържащи TNF, до методи за (лечение) приложение чрез използването на тези състави и до подобрен метод за анализ на TNF.

Описание на приложените фигури.

Изобретението се пояснява с приложените фигури, от които:

фигура 1 представлява нуклеотидна последователност на рЕ4 и съответната аминокиселинна последователност на човешкия TNF;

фигура 2 - рестриктазна карта на инсерта в рЕ4;

фигура 3 - плазмиди за експресия и олигомери за тяхното конструиране за различни TNF мутеини.

фигура 4 - сравнителни специфични активности на няколко TNF мутеини.

фигура 5 - SDS-гелове, съдържащи пречистени рекомбинантни /TNF/pTNF/ мутеини;

фигура 6 - резултатите от локализацията на /pTNF/ мутеини на изоелектрично фокусиращи гелове;

фигура 7а и 76 - резултатите от in vivo тестуване на TNF активност в туморни мишки.

Определения

Изразът “тумор некротизиращ фактор TNF се отнася до аминокиселинна последователност, еквивалентна изцяло на тази от фиг. 1 и притежаваща селективна цитотоксичност срещу туморни клетки. За да отговаря на така представената дефиниция, аминокиселинната последователност трябва да бъде активна при in vitro анализ за цитотоксичност на базата на използването на миша клетъчна линия от съединителна тъкан L-929, както е описано подолу. Очевидно е, че това определяне на TNF активността не е абсолютно същото, както описаното по-горе по Carswell/Supra/. Въпреки това активността, определена чрез in vitro анализ за цитотоксичност срещу човешки oAD ORIGINAL туморни клетки, представлява достатъчно доказателство за откриването на тумор некротизиращ фактор чрез този анализ, Както е показано по-долу. Цитотоксичността срещу L-929 също така се изразява и спрямо други човешки тумори. Подобно припокриване между факторите, които са активни в специфичния анализ за цитотоксичност и in vivo анализа, създаден от Carswell, е очаквано и напълно естествено.

Съгласно изобретението в зависимост от pH на средата, ако TNF белтъкът е суспендиран или е в разтвор, или ако неговата среда е в твърда форма, когато е кристализиран или утаен, той може да бъде във вид на фармацевтично приложими соли или да е в неутрална форма.Свободните аминогрупи на белтъка могат да образуват соли например с неорганични киселини като солна, фосфорна или сярна киселина, или с органични киселини, например оцетна, гликолова, янтарна или бадемова киселина. Свободните карбоксилни групи могат да образуват соли с основи, както неорганични - натриева, калиева или калциева основа, така и органични основи, като пиперидин, глюкозамин, триметиламин, холин и кафеин. Също така протеинът може да бъде модифициран чрез комбиниране с други биологични материали, като липиди и захариди, или чрез модификации на страничните вериги като ацетилиране на аминогрупи, фосфорилиране на хидроксилни остатъци или окисление на сулфидрилни групи. Всички тези модификации се включват в границите на определението, докато се запазва TNF активността.

Съгласно изобретението определени модификации в първичната аминокиселинна последователност могат да доведат до белтъци с еквивалентна или засилена активност спрямо последователността, представена на фиг. 1. Тези модификации могат да бъдат направлявани например чрез сайт насочена мутагенеза, или случайни - чрез мутации в клетките продуценти на TNF. Тъй като не може да се очаква, че дадена модификация ще доведе до белтък с TNF активност, и тъй като не може да се предскаже предварително кои модификации са приемливи, всички тези модификации се включват в определението за TNF, доколкото TNF активността, както погоре бе определена, се Запазва.

л. -Л _I . , U j Λ 4 . .,· , ι>

По-нататък се пояснява, че мутеини, в които липсват, или има промени в първите 10 аминокиселини от N-края на секвенцията от фиг. 1, имат подобна или по-голяма специфична активност в сравнение с тази на TNF, чиято структура е показана. Моделът на специфичната активност следва камбановидна крива с оптимална активност при делецията на 6-8 N-терминални аминокиселини. Съответно дефиницията на TNF специфично включва тези съкратени форми, тъй като делеции от 10 аминокиселини от N-края не разрушават, а обратно-често увеличават биологичната активност.

Следователно дефиницията за TNF тук специфично включва белтъци с аминокиселинна последователност, напълно еднаква с тази от фиг. 1, но при които липсват 1-10 аминокиселините от N-края на посочената секвенция. В лит. източник /6/ Shirai, et al., е описано получаването на рекомбинантен TNF, като се използва експресионен вектор, конструиран от ДНК, получена от човешка геномна банка. В тази конструкция кодираният белтък няма първите две аминокиселини от N-терминалната последователност от фиг. 1. По неясни причини, но вероятно във връзка със структурата на заешкия геномен TNF, Shirai, et, al считат, че истинският N-край започва от позицията, показана в описанието съгласно изобретението като позиция 3, и така конструират и съответния вектор. В следствие на това продуцираният от Shirai TNF има Nтерминална последователност Ser-Sev-Ser-ArgThr и т.н. Продуцираният от Shirai TNF има in vivo активност. Директно сравняване на активността на този белтък с тази на рекомбинантно полученият uTNF и TNF мутеините, представени тук, до сега не е извършвано.

В допълнение, делеции от С-края на TNF от фиг.1 също са безвредни. Направени са конструкции на гени, съдържащи до 17 аминокиселинни делеции.

Патентът на US 4,518,584 показва безцистеинови мутеини на биологично активни белтъци. При TNF неутрални аминокиселинни замени на цистеина от позиция 69 водят до активни TNF белтъци. В даден случай цистеина от позиция 101 също може да отсъства, затова бяха изготвени мутеини, съдържащи редуващи се неутрални амино

BAD ORIGINAL киселини в тази позиция,както и мутеини, при които и двата цистеина 69 и 101 са заменени. Тези мутеини могат също да бъдат модифицирани съгласно представения в изобретението метод за получаване на съкратени форми, които запазват TNF активността и могат да имат увеличена специфична активност in vitro или in vivo. Тези мутеини не съдържат 1-10 аминокиселините на N-края, аминокиселинни последователности на С-края, или и двете заедно. Тези мутеини също се обхващат от определението за TNF

След това се конструират гени на базата на пречистен от естествени източници TNF, като гени, кодиращи мутеини, при които два серинови остатъка от позициите 3 и 4 се делетират, и мутеин, при който his-val двойката от позиции 15 и 16 се заменя с valser.

За да се означи по-ясно, белтъкът с аминокиселинната последователност, номерирана от 1-157 на фиг. 1, се използва за сравнение и се означава, макар и спорно, като mTNF /зрял TNF/. Всички други аминокиселинни последователности, хомоложни на mTNF и показващи TNF биологична активност, се означават като “мутеини” на mTNF и се представят съобразно разликите им спрямо mTNF чрез използване на номерацията на аминокиселинните остатъци, представени на фигурата. Например мутеини, които имат заместен цистеин в позиция 69, ще бъдат означени чрез използване на заменения остатък и позиционния номер т.е. пептиди със серин вместо цистеин в позиция 60 се означават като Ser ₆₉ TNF. Ако даден остатък липсва, се означава като des остатък, например мутеинът, при които серините от позиция 3 и 4 са делетирани , се означава като Des-Ser₃Des-Ser₄ TNF. Мутеини, при които липсват сегменти от аминокиселини от N- или от С-края, се означават съобразно края, който е засегнат. Делеции в N-края ще бъдат представени като след знака Δ се изписва броят на липсващите аминокиселини. Например мутеини, при които липсва една N-терминална аминокиселина в сравнение с белтъка от фиг. 1, се означават като Δ 1TNF. За делеции в С-края знакът Δ е последван от номера на последния останал остатък и знака минус. Например мутеинът, при който 7 аминокиселини са премахнати от С-края, се означавд4щ1ГоА . lSO'-liNF: Когато има комбинации от по-горе споменати промени, означението показва всички пормени н-р Δ 1 Des-Ser₃Des-Ser₄Ser₆₉ Δ 150-TNF.

Не всички мутеини на mTNF са получени нарочно и по рекомбинантен път. Наистина при сравняване на последователността, получена за 22Н-терминалните аминокиселини на секретирания от HL-60 TNF, представен по-долу, със съответния участък от последователността от фиг. 1 се виждат малки модификации в първичната структура, въпреки че и двата белтъка показват TNF активност. Представената на фигурата последователност има допълнителна двойка от серинови остатъци след серина от позиция 3, след което следва хомоложен участък, обхващащ позиции 4-12 от белтъка, получен от HL-60 и позиции 6-14 от последователността от фигурата. В допълнение позициите 13 и 14 при HL-60 получения белтък са Vel-Ser, докато съответните позиции 15 и 16 от последователността от фигурата са His-Val.

“Оперативно свързани” е термин, означаващ такова разположение на компонентите, което осигурява тяхното нормално функциониране. Така контролни секвенции, “оперативно свързани” към кодиращи последователности, са способни да предизвикат експресията на кодиращата последователност.

“Контролни секвенции” означава ДНК последователност или последователности, които, когато са правилно свързани към желаната кодираща секвенция са способни да предизвикат нейната експресия в гостоприемници, съвместими с подобни последователности. Такива контролни последователности включват промотори както в прокариотни, така и в еукариотни гостоприемници, и в прокариотните организми също включват последователности за сайтрибозомно свързване, а при еукариотитетерминални сигнали. Допълнителни фактори, необходими или полезни за изразяване на експресията, също могат да бъдат известни. Както се използва в описанието на изобретението “ контролни последователности” означава всякаква ДНК последователност, необходима за ефективната експресия в съответния гостоприемник.

“Клетки” или “рекомбинантни гостоприемници” или “клетки гостоприемници” са

BAD ORIGINAL взаимнозаменяеми понятия съгласно описанието на изобретението. Тези термини включват както самите третирани клетки, така и тяхното поколение. Естествено не цялото поколение е идентично на родителските клетки, което се 5 дължи на случайни мутации или разлики в средата. Затова такива променени потомства също се включват при използване на горните термини.

Б. Общо описание 10

Описаните по-долу методи за получаване на ДНК последователност, кодираща човешки TNF, са пояснителни и са типични. Възможно е да има и да могат да бъдат използвани и други подходи. Тъй като цялата ДНК после- 15 дователност се получава без интрони и е пояснена в описанието, то не е необходимо да се повтори този процес за получаване на желаната ДНК последователност. Също така не е необходимо да се използват същите системи 20 за експресия, които са пояснени в описанието. Както е пояснено по-долу, съществуват найразлични гостоприемници и контролни последователности, които могат да се използват за ефективна продукция на желания TNF. 25

Съгласно изобретението човешката промиелоцитна левкемична клетъчна линия HL60 се индуцира да секретира TNF чрез подобрена процедура за индуциране, както е описано в точка В. 1 по-долу. Този белтък се 30 пречиства до хомогенност чрез използване на нов метод за пречистване, както е описано в т. В.2., и полученият пречистен белтък се подлага на аминокиселинно секвениране. Конструират се експериментални смеси, които след това се 35 използват за получаване на подходящи кодиращи последователности, както е описано в т. В.З. Кодиращите последователности се използва за експресия чрез лигирането им с вектори, съдържащи подходящи прокариотни 40 контролни системи, както и чрез използване на вирусни промотори за експресия в клетки на бозайници.

В кодиращата последователност се извършват модификации, за да се получат 45 мутеини от ДНК последователностите, получени от сДНК банки. Такива модификации се предизвикват от праймер насочена мутагенеза и най-общо водят до по-къси форми на TNF, показващи нараснала активност. 50

В. 1. Подобрена процедура на индукция. Клетъчната лижи;, подлежаща на ^индуциране

- HL-60 човешка промиелоцитна левкемична клетъчна линия, е относително недиференцирана. Ако й се даде възможност да се диференцира, тя би продуцирала колонии от по-специфично дефинирани клетъчни типове. В зависимост от условията, тя може да “узрее” в гранулоцити или в моноцити, които впоследствие могат да се диференцират в макрофаги. Приема се, че макрофаговата фракция е отговорна за in vivo продукцията на TNF. От друга страна, приема се, че тясно свързаният лимфотоксин се продуцира в В лимфоцитни клетки.

Нивото на продуцирания TNF от съответните клетки може да бъде 10-20 пъти повишено чрез подобряване на процедурата за индуциране. При известната процедура, описана от Gifford /7/, се използва третиране с форболов естер 12-0-тетрадеканоилфорбол13-ацетат /ТРА/ при концентрация 10 мкг/ мл за 30 мин при 37°С в 20% серум. След това клетъчните култури се центрофугират и третират с ендотоксина при концентарция 10 мкг/мл в без серумна среда, съдържаща трансферни и инсулин /по 10 мкг/мл/. След понижаване на концентрацията на форболовия естер до 100 кг/мл при началото на инкубацията с безсерумната среда и след добавяне на 10 мкМ калциев йонофор А23817 при третирането с ендотоксина концентрацията на TNF в супернатантната значително нараства след индукцията с ендотоксин.

В.2. Пречистване на TNF.

Прилага се подобрен метод за пречистване на TNF от индуцирани тъканни култури. Този метод представлява обработка на супернантната, съдържаща TNF анионообменна смола при условия, непозволяващи адсорбцията на TNF, последвано от обработка на TNF съдържащите фракции с калибриращ гел до получаване на активните фракции, които се разделят на SDS-полиакриламидна гел електрофореза /PAGE/. Фракцията, съдържаща TNF от SDS-PAGE, впоследствие се пречиства чрез високо афинитетна течна хроматография /ВАТХ/.

В първия етап супернатантата, съдържаща TNF, по избор може да се концентрира преди използването на анионнообменната смола, като за целта се използва достъпният на пазара концентриращ филтър, като Amicon

BAD ORIGINAL кухи фибри или милипорова мембранна ултрафилтрираща единица. Концентратът се третира с подходяща анионнообменна смола, например DEAE агароза, DEAE целулоза, QAE агароза, като DEAE агарозата се предпочита. 5 Условията на обработка не позволяват TNF активността да се адсорбира от смолата - т.е. pH на разтвора е около 7-9 и общата солева концентрация е приблизително 0,01-0,07 М.

След това несвързаните фракции се пречистват чрез гелфилтрация, като се използват всякакви търговски калибриращи гелове, например Sephadex G-75 Superfine / Pharmacia/, който има пропускливост на молекули с мол. тегло около 70000 далтона. След третиране с гела фракциите, съдържащи TNF, се подлагат на SDS-PAGE при подходящи условия и се изрязва областта от гела, съдържаща TNF активност, SDS-PAGE де извършва по метода на Laemmli /8/ и 20 представлява широко използван метод. Вариации на специфични условия в подходящи граници е естествено да се прилагат в процеса на работа.

Активните фракции от SDS-PAGE се 25 подлагат на обратнофазова ВЕТХ и се елюират с 0-60% градиент на ацетонитрил в 0,1% трифлуороцетна киселина /TFA/. Други градиентни системи, които могат да се използват, са оцетна киселина и н-пропанол. 30

Така полученият човешки TNF е достатъчно чист, за да се подложи на N-крайно аминокиселинно секвениране.

В.З. Изолиране на кодиращата последователност иРНК се изолира от HL-60 клетки и се добавя към стандартна овоцитна система за транслация, като предизвиква синтеза на TNF-фактор, който е активен в L-929 анализа за цитотоксичност. Относителната ефикасност на олигомерни проби се тестува по тяхната 40 способност при преинкубация с иРНК сместа да повлиява негативно на TNF продукцията в тази транслационна система /’’хибриден арест”/. Този критерий може по-задълбочено да се използва чрез радиоавтография на иРНК 45 градиенти, хибридизирани към киназирани проби, където желаната иРНК кодираща за TNF е предварително идентифицирана чрез транслация на фракциите в овоцитната система. Така е възможно да се определи коя 50 от четирите смеси, всяка от които съдържа по шестнадесет 1’4-М1ер111':кбйструИра'нй;’ща да бъдат комплементарни на иРНК, кодираща последователност Asp-Lys-Pro-Vai-Ala в белтъка, съдържа правилната последователност. След като се установи чрез Northern blots-техниката, че и тази смес от шестнадесет олигомери не хибридизира достатъчно специфично с TNF-кодиращата иРНК, тези експерименти на “хибриден арест” бяха повторени чрез използване на осем двойки от 10 14-мери. Една от тези двойки хибридизира специфично с иРНК.

След като се изолира достатъчно специфична проба, тя се използва за скриниране на сДНК /банка/, получена от 15 фракцията на иРНК, кодираща за желания TNF. Изолират се 28 колонии, които показват хибридизация, от тях се изолира плазмидна ДНК и няколко инсерта се секвенират. Плазмиден препарат, съдържащ цялата кодираща последователност и означен като рЕ4, се използва като източник за кодиращата последователност. Друг плазмиден препарат рВ11 се използва за експресия при бозайници.

В.4. Експресия на TNF. Определянето на първичната структура на инсерта на рЕ4 позволява да се локализира кодиращата последователност и наличните в инсерта рестрикционни сайтове. Въпреки, че хомологията не пълна, лесно се осъществява правилното подреждане. За по-лесно манипулиране желателно е да се постави ATG начален кодон в правилна посока за четене, непосредствено преди кодона на N-крайната аминокиселина на зрялата белтъчна 35 последователност, както и да се включи HindHI сайт, непосредствено над ATG кодона. Това се осъществява чрез сайт-насочена мутагенеза, както е описано по-долу. По този начин е възможно изрязването на кодиращата последователност с подходящия стартов сигнал на две части- Hindlll/Pstl фрагмент и PST1/ BamHI фрагент и вмъкването на тези фрагменти експресионни вектори, съдържащи контролни последователности. Алтернативно цялата последователност може да бъде изрязана като HindHI фрагмент. Използваните тук експресионни вектори са pTRP3, съдържащ trp промотор над HindHI сайта и BamHI сайт под HindHI сайта; и pFC54.t и pPLOP, които съдържат P_L промотора в подобно разположение.

BAD ORIGINAL·

Тези експресионни вектори се трансформират в подходящи гостоприемници E.coli, и получените трансформанти се култивират при условия, позволяващи продуктцията на TNF. TNF може да се изолира от клетките след обработка с ултразвук, след като пробата се обработва с хаотропен агент, който разтваря желания TNF, или третираната вече с ултразвук смес може директно да се анализира.

Началната експресия се извършва в E.coli, но, както е описано в С.1 по-долу, кодиращата секвенция от рЕ4 или рВ11 може също да бъде лигирана към контролни последователности, подходящи за експресия в 15 други прокариоти, в дрожди, в тъканни култури, или дори в растителни клетки. Експресията в клетки на бозайници се извършва чрез SV40 промотора на рВ11. Избирането на подходящ гостоприемник зависи от различни 20 фактори, включително способност да секретират, протичане на постранслационен процеси и способност да продуцират голямо количество от желания белтък при подходящи условия на растеж. 25

В.5. Анализи. В.5.а. Анализ за цитотоксичност. L-929 системата за анализ е подобрена, подходяща in vitro, позволяваща бързо определяне на TNF активност. Нейната степен на корелация с тумор некрозис анализа на 30 Carswell in vivo не е известна, но тъй като се използват специфично миши туморни клетки, вероятно корелацията е голяма. Белтъкът, наречен лимфотоксин в ЕРО публикация №0100641 /supra/, също показва активност в 35 този анализ. Анализът е подобен на описания в патент на САЩ 4,457,916, при който се използват L-М клетки и оцветяване с метиленово синьо. Показано е, че L-929 анализа корелира /за TNF, получен от HL-60/ с 40 цитотоксичността на човешката туморна клетъчна линия.

При използвания тук L-929 анализ, L929 клетки се получават за една нощ като монослой в микротитрационни панички. 45 Пробите за изследване се разреждат двукратно в паничката, облъчват се с УВ-лъчи и се добавят в подготвените клетъчни монослоеве. Културалната среда в кладенчетата се довежда до 1 мкг/мл актиномицин D. Паничките се 50 инкубират 18 часа при 37°С и визуално се ₍ преглеждат под микроскогь Въ^^сяко кладенче f се определя и маркира степента на умрелите клетки - 25,50,75 или 100%. Една единица TNF активност се определя като обратно пропорционалната стойност на разреждането, при което 50% от клетките загиват.

Разработена е по-чувствителна версия на този анализ, при която се определя освобождаването на белязани със ³⁵сяра пептиди в предварително белязаните клетки след третиране с тестовата проба и актиномицин D. Тази версия на анализа може да се използва за количествено определяне на активността, т.е. да се определи относителната активност на материала, транслиращ се в овоцитите. Накратко, активнорастящи L-929 клетки се бележат с ³⁵сяра метионин/200 микрокюри/мл/ за 3 ч в свободна от метионин среда, съдържаща 2% диализиран телешки фетален серум. След това клетките се промиват и се разливат на панички с 96 кладенчета, инкубират се за една нощ и след това се третират с двукратно разредени тестови проби и 1 мкг/мл актиномицин D. След това културите се инкубират за 18 ч при 37°С. От всяко кладенче се вземат по 100 мел от суспенатантата и се прехвърлят на друга 96кладенчова паничка, утаяват се с киселина / ТСА/ и се концентрират върху стъклени филтри. След това филтрите се промиват с 95% етанол, изсушават се и се преброяват. ΝΡω детергентен контрол е включен във всеки анализ, за да се измери максималната освободена радиоактивност от клетките. Процентът освободена ³⁵сяра се изчислява от съотношението на разликите при броене на третираните клетки и нетретираните контроли, разделено на разликата между ΝΡ40 третираните клетки и нетретираните контроли, което се пресмята по равенството проба - клетъчна котрола % освободена ³⁵сяра= --------------- х 100

ΝΡ_ω- клетъчна контрола

По високата TNF активност повишава стойностите на това съотношение.

Описаният анализ е модифициран, за да се използва при човешки туморни клетъчни линии. Единиците се определят и % освобождаване се изчислява по същия начин, кактр и за описаните по-горе L-929 клетки. И..4' .·! a I · > ь- ; / : \

BAD ORIGINAL

В.5.в In.vivo анализ. Препаратите могат също така да бъдат тестувани за TNF активност, като се използва свойството на това вещество да убива или репресира растежа на тумори и да предпазва от смърт животното с тумори. Balb/c мишки се инжектират подкожно с различни типове туморни клетки, за да се получи локализиран тумор. Туморните клетъчни линии включват MethA миша фибросаркома, получена като клетъчна суспензия от асцитна течност и MCF-7 човешки карцином на гърдата, която се прилага като 1 мм³ струпване от клетки.

За целите на анализа женски Balb/c мишки /19-22 гр/ се инжектират подкожно с игла №26 или със суспензия, съдържаща 5x10’ фибросаркомни клетки в 0,1 мл среда или с MCF-7 струпване/фибросаркомната суспензия е приготвена от 8 дневна асцитна течност чрез преброяване на клетките и разреждане с без серумна среда/. След 9-10 дни, след като туморът нарастне видимо добре изразен, количества от подлежащ на тестуване TNF / около I мкг на мишка/ се инжектират интравенозно, като по желание през следващите дни инжектирането с TNF се повтаря. Резултатите се анализират чрез измерване размера /обема/ на тумора и степента на преживяване.

В.6. Получаване на TNF мутеини. Изобретението съдържа и известен брой модификации на mTNF, при които се получава белтък с оптимална активност. Направени са някои специфични промени в първичната аминокиселинна последователност, които водят до подобна или повишена специфична активност при анализа за цитотоксичност, представен по-горе в В.5. Някои делеции сред първите 10 аминокиселини от последователността на mTNF вода до получаването на белтъци със специфична активност - равна или няколко пъти по-висока от тази на “нативния” рекомбинантен белтък. Безцистеиновите мутеини на mTNF също показват TNF активност подобно на N-крайно делетираните форми на тези мутеини.

Получаването на всеки от тези мутеини се извършва чрез подлагане на експресионните вектори, съдържащи кодиращата последователност за TNF, на сайт-специфична мутагенеза с използването на праймери, отговарящи на желаната .кодираща·> после дователност. Така се получават модифицирани експресионни вектори с необходимите / подходящите/ промени в кодиращата последователност. Получените модифицирани вектори се трансформират в подходящи гостоприемници, които след това се култивират при условия, подходящи за продуцирането на кодираните мутеини.

След това тези мутеини се пречистват от бактериалната култура подобно на “нативния” mTNF и е установено, че имат ненамалена или увеличена активност.

В даден случай Δ 4 и Δ 6-10 TNF мутеини са определено по-добри от mTNF по два показателя. Те проявяват по-висока специфична активност и се продуцират като “чисти” продукти. При някои от тези предпочитани мутеини, както е описано подолу, активността на пречистения белтък при изследването за цитотоксичност е няколко пъти по-висока от тази, показана от TNF. В допълнение, докато пречистеният рекомбинантен mTNF представлява цяла гама от белтъци с явни модификации на страничната верига, което се вижда чрез изоелектрично фокусиране, където тези мутеини дават единични ивици при подобен анализ.

С. Стандартни методи. Повечето от методите, използвани за трансформиране на клетки, конструиране на вектори, получаване на иРНК, получаване на сДНК банки и др. подобни се използват много и повечето от изследователите са запознати със стандартните източници, описващи специфичните условия и методи. Въпреки това за по-голямо удобство следващите параграфи могат да служат като ръководство.

С.1. Гостоприемници и контролни последователности. Прокариотите често са представени от различни щамове на E.coli, но други микробиални щамове също могат да бъдат използвани като бацили, например Bacillus subtilis, различни видове Pseudomonas с или други бактериални щамове. В такива прокариотни системи се използват плазидни вектори, съдържащи начало на репликация и контролни последователности, производни на видове, които са съвместими с използвания гостоприемник. Например E.coli най-често се трансформира с вектори, производни на pBR322 - плазмид, изолиран от E.coli, щам от Boliar, ,et ιβ|./9/. pBR322 съдържа гени,

BAD ORIGINAL определящи резистентност спрямо ампицилин и тетрациклин, и осигурява допълнителни маркери, които могат да бъдат запазени или разрушени при конструирането на желания вектор. Най-общо използваните прокариотни контролни последователности, включващи промотори за инициация на транскрипцията, по желание с оператор, заедно с последователности за свързване на рибозомите, включват също така често използваните промотори като беталактамазата /пеницилаз-на/ а и лактозната /1ас/ промоторна система /10/ и трипотофановата (trp) промоторна система /11/, както и P_L промотора от фага ламбда и последователността за свързване на рибозомите на Nгена /12/, който се използва като портативна контролна област /касета/, както е представено в заявка per. №578,133, подадена на 8.02.1984 г., и заявена от същия заявите. По принцип, всякаква промоторна система, съвместима с прокариоти, може да се използва.

Освен бактерии, като гостопиемници могат да се използват и еукариотни микроби, като н-р дрожди. Най-често се използват лабораторни щамове на Saccharomyus cerevisiae - хлебните дрожди, въпреки че редица други щамове са на разположение. Освен векторите, използващи 2-микронното начало на репликация /13/, са известни и други плазмидни вектори, подходящи за експресия при дрожди /14,15 и 16/. Контролните последователности на векторите при дрожди включват промотори за синтеза на гликолитични ензими /17,18/. Други известни промотори включват промотора за 3фосфоглицерат киназата /19/ и тези за други гликолитични ензими като глицералдехид-3фосфат дехидрогеназа, хексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триозофосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза и глюкокиназа. Други промотори, при които съществува предимството, траскрипцията да се контролира от условията на растеж, са промоторни области за алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащите ензими, свързани с азотния метаболизъм и ензимните, а отговорни за разграждането на малтозата и галактозата. Счита се, че на 3' края на кодиращите последователности са необходими терминаторнц последователности.. Такива терминатори се откриват в 3' нетранслиращата се област, непосредствено след кодиращите последователности на производните дрождиеви гени. Много от илюстрираните вектори съдържат контролни последователности, получени от плазмида репо46, съдържащ гена на енолазата /20/, или от LEUZ гена, съдържащ УЕр13 /21/, но всякакъв вектор, съдържащ съвместни с дрожди промотор, начало на репликацията и други контролни последователности, може да бъде използван за целта.

Също така е възможна и експресията на гени, кодиращи полипептиди и в еукариотни клетъчни култури-гостоприемници, получени от многоклетъчни организми /22/. Полезни клетъчни линии гостоприемници представляват VERO, Hela клетки и клетки от яйчник на Китайски хомяк /СНО клетки/. Експресионните вектори за такива клетки обикновено съдържат промотори и контролни последователности, съвместими с клетки от бозайници, като н-р често използваните ранни и късни промотори от Simian вирус 40/SV40 /23/ или други вирусни промотори, като тези, получени от полиома, Аденовирус 2, телешки папилома вирус или птичи саркома вируси. Общите аспекти на клетъчните системи гостоприемници при бозайници са описани от Аксел, патент на САЩ № 4,399,216 от 16.08.1983 г. Оказва се, че енхансерните области са от голямо значение за оптимизиране на експресията; това са най-общо последователности, разположени преди или след промоторната област в некодиращите ДНК области. При необходимост източниците на репликация могат да бъдат получени от вирусни източници, но интегрирането в хромозомата е рутинен механизъм за ДНК репликацията при еукариоти. Растителните клетки също са достъпни като гостоприемници сега, както и контролни последователности, съвместими с растителните клетки като промотора на нопалин синтетазата и сигналните последователности за полиаденилиране /24/.

С.2. Трансформации. В зависимост от използваните клетки гостоприемници, трансформацията се извършва чрез стандартни методи, подходящи за съответните клетки. Калциевата обработка чрез калциев хлорид /25/ или чрез метода с използване на 'рубидиев хлорид (RbCl₂) /26/, се използват bad original при прокариоти или други клетки, притежаващи съществени бариерни клетъчни стени. Инфектиране с Agrobacterium tumefaciens /27/ се използва при някои растителни клетки. За клетки на бозайници, несъдържащи клетъчни стени, най-често се използва калциевофосфатният метод на преципитация на Grahan and van der Eb /28/. Трансформации в дрожди се извършват по методите на Van Solingen et al /29/ и Hsiao et al /30/.

C.3. Скриниране на сДНК или геномни банки. Скринират се сДНК или геномни банки чрез метода на колонийна хибридизация. Всяка микротитърна паничка се реплицира върху два нитроцелулозни филтъра /Шлайхер и Шул (S & S) ВА-85/ и колониите се оставят да растат на 37°С за 14-16 часа върху агар, съдържащ 50 мкг/мл ампицилин /Атр/. Колониите се лизират и ДНК се фиксира към филтъра след последователно третиране за 5 мин с 500 мМ натриева основа, 1,5 М натриев хлорид и се промиват двукратно за по 5 мин с 5 х стандартен солев цитрат /SSC/. Филтрите се изсушават на въздух и се пекат за 2 часа на 80°С. Филтрите дубликати се прехибридизират на 42°С за 6-8 часа, като на филтър се прибавят 10 мл ДНК хибридизационен буфер /5xSSC pH 7,0, 5хР-р на Денхард /поливинилпиролидин, Фикол и говежди серумен албумин: 1х=0,02% от всеки/, 50 мМ натриев фосфатен буфер pH 7,0 0,2% SDS, 20 мкг/мл Poly Y и 50 мкг/мл денатурирана ДНК от сперма на пъстърва.

Пробите се хибридизират с киназираната проба при условия, зависещи от строгостта на критерия. Типични средно строги условия представляват температура от 42°С за 24-36 ч с 1-5 мл на филтър с ДНК хибридизационен буфер, съдържащ пробата. За по-строги критерии на хибридизация се използват повисоки температури и по-къси времена на инкубация. Филтрите се измиват 4 пъти по 30 мин всеки, при 37°С с 2xSSC, 0,2% SDS и 50 мМ натриев фосфатен буфер pH 7,0, след което се измиват двукратно с 2х SSC, 0,2% SDS, изсушават се и се авторадиографират при 70°С за 2-3 дни.

С.4. Конструиране на вектори. За конструирането на подходящи вектори, съдържащи желаните кодиращи и контролни последователности, се използват добре познати стандартни методи на лигиране и рестрикция.

Изолирани плазмиди, ДНК последователности или синтезирани олигонуклеотиди се разцепват, добавят им се опашки и се лигират отново до получаване на желаната конструкция.

Сайт-специфично ДНК разграждане се осъществява чрез обработка с подходяща рестриктаза /или рестриктази/ при добре известни условия, особеностите на които са посочени от посочени от производителя на тези рестриктази, достъпни на пазара. За пример виж каталога на New Englang Biflabs. Най общо, около 1 мкг от плазмида или ДНК последователност се разцепва от 1 единица от ензима в около 20 мкл буфер. В приведените в описанието примери често се използват рестриктазите в излишък, за да се осигури пълното смилане на ДНК субстрата. Най-често се използват инкубационни времена от 1-2 часа при 37°С, въпреки че тук са възможни вариации. След всяка инкубация белтъкът се премахва чрез екстракция с фенол/хлороформ и може да бъде последвана от екстракция с естер, а нуклеиновите киселини се извличат от течните фракции след етанолна преципитация, след което се пропуска през Sephadex G-50 въртяща се колона. При нужда накъсаните фрагменти могат да бъдат разделени по размери на полиакриламидна или агарозна гел-електрофореза, по стандартните методи. Подобно разделяне подробно е описано в лит. източник /31/.

Рестриктазните фрагменти могат да се направят с тъпи краища след третиране с големия фрагмент /Кленов фрагмент/ на ДНК полимераза I от E.coli при наличие на четирите дезоксинуклеотид трифосфати dNTP при инкубационно време 15-25 мин при 20-25°С в 50 мМ Трие pH 7,6, 50 мМ натриев хлорид, 6 мМ магнезиев хлорид, 6 мМ DTT и 5-10 мкМ dNTP. Кленовият фрагмент запълва 5' лепливите краища, но смачква 3' стърчащи краища на единичните вериги дори и при наличието на четирите dNTP. В даден случай е възможно да бъде извършено селективно поправяне при наличие на един или някои от dNTF според диктуваните от вида на лепливите краища ограничения. След обработка с Кленовия фрагмент сместа се екстрахира с фенол/хлороформ, утаява се с етанол и се прекарва през въртяща се колона със Sephadex G-50. Обработката с S1 нуклеаза при

BAD ORIGINAL подходящи условия довежда до хидролизата на всеки едноверижен участък.

Синтетични олигонуклеотиди могат да се приготвят по триестерния метод на Matteucci / 32/ или чрез използването на търговски автоматични синтезатори на олигонуклеотиди. Киназиране на единични вериги преди неутрализиране или и бележене се извършва чрез използването на излишък, т.е. около 10 единици от полинуклеотид киназа за 0,1 наномола субстрат при наличието на 50 мМ Трие pH 7,6, 10 мМ магнезиев хлорид, 5мМ дитиотрейтол 1-2 мМ АТФ, 1,7 пикомола ³²рАТФ /2,9 миликюри/милимола/, 0,1 мМ спермидин, 0,1 мМ ЕДТА.

Лигазните реакции се извършват в 1530 мкл обеми при следните стандартни условия и температура: 20 мМ Трис-солна киселина pH 7,5, 10 мМ магнезиев хлорид, 10 мМ DTT, 33 мкг/мл говежди серумен албумин /ГСА/, 1050 мМ натриев хлорид също 40 мкМ АТФ, 0,0ΙΟ,02 Weiss единици Т4 ДНК лигаза пир 0°С / за лигиране на “лепливи” краища/, или 1 мМ АТФ, 0,3-0,6 /Weiss/ единици Т4 ДНК лигаза при 14°С /за лигиране на “тъпи” краища/. Междумолекулни лигирания на “лепливи” краища обикновено се извършват при 33-100 мкг/мл обща концентрация на ДНК /общо 5100 нМ концентрация на краища/. Междумолекулни лигирания на тъпи краища се извършват при концентрация на краища =1мкМ обикновено чрез използването на 1030 пъти моларен излишък на линкери.

При конструирането на вектори чрез използването на “векторни фрагменти” съответният векторен фрагмент обикновено се обработва с бактериална алкална фосфатаза / ВАР/ за премахване на 5' фофата и предпазване от религирането на вектора. Смилането с ВАР се извършва при pH 8 в 150 мМ Трие и при наличието на натриеви и магнезиеви йони, като се използва около 1 единица от ВАР за 1 мкг вектор при 60°С за около 1 час. За получаването на ДНК фрагментите сместа се екстрахира с фенол/хлороформ и се утаява с етанол, след което се обезсолява чрез пропускане през въртяща се колона със Sephacex G-50. По друг начин религирането може да се избегне при вектори, които са били подложени на двойно смилане от две рестриктази, чрез допълнително рестриктазно разграждане на ненужните фрагменти. ,- _λΙ. щ

За части от вектори, извлечени от сДНК или геномна ДНК, които изискват модификации на секвенциите се използва сайтспецифична праймер D насочена мутагенеза. Извличането се постига чрез използването на праймер праймер синтетичен олигонуклеотид, който е комплементарен към участък от едноверижна фагова ДНК с изключение на малки разлики от няколко нуклеотида, представляващи желаната мутация. Накратко, синтетичният олигунуклеотид се използва като праймер за насочената синтезата на верига, комплементарна на фаговата, и получената двойноверижна ДНК се трансформира в подходящ бактериален гостоприемник, поддържащ фаги. Култури от трансформираната бактерия се посяват върху агар, при което се образуват плаки от единични клетки, съдържащи фага.

Теоретично 50% от новите плаки би трябвало да съдържат фаг с мутиралата едноверижна форма, а 50% да съдържат изходната форма. Получените плаки се хибридизират с киназирания синтетичен праймер при температура, позволяваща хибридизацията само на напълно комплементарни вериги, при което наличието на една или няколко нуклеотидни разлики предпазва от хибридизация. Плаките, хибридизиращи с пробата, се отделят, култивират и от тях се получава ДНК. Подробности по сайтспецифичната мутагенеза са описани по нататък в специфичните примери.

С.5. Проверка на конструкцията. При описаните по-нататък конструкции правилното лигиране при образуването на плазмидите се потвърждава отначало при трансформирането на E.coli от щам ММ294, получен от E.coli (Genetic Stock Center,CGSC № 6135, или други подходящи гостоприемници с лигазната смес. Сполучливите трансформанти се селекционират по наличието на ампицилинова, тетрациклинова или друга резистентност спрямо антибиотици, или чрез използването на други маркери, в зависимост от начина на конструиране на плазмида. Плазмиди от трансформантите се изолират по метода на Clewell и сътр., в лит. източник /32/, обикновено след амплифицирането им с хлорамфеникол, лит. източник /33/. Изолираната ДНК се анализира чрез рестриктази и/или се секвенира по дидезокси

BAD ORIGINAL метода на Sanger /34/, описан по-късно от Messing и сътр. в лит. източник /35/, или по метода на Махаш, лит. източник /36/.

С.6. Примерни гостоприемници. За клониране и експресия се използват следните щамове гостоприемници. За клониране и секвениране и за експресия на конструкции под контрол на повечето бактериални промотори като гостоприемник се използва щамът на E.coli ММ 294 /лит. източник /37, 38/. За експресията под контрола на P_LN_RBS промотора се използва щамът на E.coli К12 МС 1000 ламбда лизоген, N₇N₅₃ cI857 SusP80, АТСС 39531 /по-късно известен като МС 100039531/.

За М13 фаговете рекомбинанти се използват щамове на E.coli, чувствителни на фагова инфекция, като E.coli К12 щам DG98. DG98 е депозиран в АТСС на 13.07.1984 г. и има кат. № 1965.

Д. Колониране и експресия на човешки TNF. По-нататък са представени методите, използвани за получаването на кодиращата последователност на човешки TNF-1, за прехвърлянето на тази последователност в експресионни вектори и за получаване на експресия на желания белтък.

Д. 1. Получаване и пречистване на човешки TNF.

Д. 1.а. Индукция на TNF. HL-60 клетки с висока плътност/около 2х10⁶ кл./мл/ се центрофугират, промиват с RpMl 1640 среда без серум и след това се ресуспендират до плътност 1x10’ кл./мл. Клетките се третират с 100 нг/мл форболов естер, 12-0тетрадеканорилфорбол-13-ацетат/ТРА/ за 30 мин при 37°С в суспензия при непрекъснато разбъркване. Културите се центрофугират, суспенатантата се декантира, клетките се ресуспендират до 1x10’ кл./мл в RPMI, съдържаща 10 мкг/мл бактериален липополизахарид /LPS/ и 10 мкМ калциев йонофор /А23817/, за 4 часа при 37°С и при непрекъснато разбъркване. Клетките се центрофугират при 1200 об./мин за 10 мин, а суспернатантите се рецентрофугират при 8000 об./мин за 20 мин. Получената супернатанта се използва в схемата за пречистване, представена в Д.1.6. за получаването на натриев TNF.

Д.1.6. Пречистване на TNF. Около 4-8 л супернатанта; приготйена от HL клетки, както е описано в Д.1.а., се концентрират до около 300 мл чрез Amicon филтър с кухи влакна, пропускащ молекули с м.т. под 10000. Концентрираната културална течност се центрофугира, за да се премахнат клетъчните остатъци, а супернатантата се коригира с 30 мМ амониево бикарбонатен буфер с pH 8,2 до проводимост 6,2 м Син. Понататък разтворът се концентрира чрез ултрафилтрация при използването на РМ10 / Amicon/ мембрана и концентрираната течност се центрофугира /20000 х g за 10 мин./

Супернатантата се пропуска през ДЕАЕ йоннообменна колона, уравновесена с 30 мМ амониев бикарбонат /1 мМ натриев хлорид pH 8,2. Колоната се промива със същия буфер. Събират се фракциите, а белтъчното съдържание се определя на 280 нм. Тези несвързани фракции се изследват чрез L-929 анализа за цитотоксичност и фракциите, показващи TNF активност, се обединяват и концентрират чрез ултрафилтрация.

Концентрираният разтвор се пропуска през Sephadex G75 Superfine Pharmacia колона, уравновесена с 30 мМ амониево-бикарбонатен буфер /рН 7.4/. Несвързаните фракции, получени чрез промиване със същия буфер, се измерват с 280 нм и се изследват за TNF. Фракциите с най-висока TNF активност се лиофилизират.

Лиофилизираният белтък се ресуспендира в буфер за нанасяне на проби по Лемли (Lalmmli) и се разделя чрез електрофореза в SDS полиакриламиден гел. Гелът се нарязва на 2 мм ивици и белтъкът от всяка ивица се елюира чрез потапяне на парченцето гел в 1 мл 30 мМ амониев бикарбонат pH 7,4 и клатене за една нощ на стайна температура.

Пробите, съдържащи TNF биоактивност, се натоварват на Vydac С-4 обратнофазова високоефективна течна хроматография (HPLC) колонка, уравновесена с 0,1 % трифлуороцетна киселина /TFA/ и активните проби се елюират чрез линеен градиент 0-60% на ацетонитрил в 0,1% TFA. Белтъчното съдържание се определя на 280 нм и 214 нм, а фракциите се изследват за биологична активност след лиофилизиране в 30 мМ амониевобикарбонатен буфер на pH 7,4. Фракциите, съдържащи TNF активност се лиофилизират отново.

к . - , . ’

BAD ORIGINAL

Полученият белтък е достатъчно чист за анализ на неговата последователност. Последователността се определя чрез газовофазов секвенатор /Appliec biosystems Inc/. Подолу е представена получената последователност за първите 22 аминокиселини. 1 2 3 4 5 6 7 8

-Vai -Arg -Ser -Arg-The-Pro -Ser -Asp 9 10 11 12 13 14 15 16

-Lys -Pro -Vai -Ala -Val-Ser-Val -Ala 17 18 19 10 21 22

-Asn -Pro -/Gin/ -/Ala/ -Glu -Gly

Пречистеният /от G-75 гела/ белтък се тестува допълнително чрез модификация на L929 анализа за цитотоксичност чрез алтернативното използване на човешки туморни и нормални клетъчни линии, като субстрат. G-75 фракциите, показващи цитотоксичност при този анализ срещу L-929 клетки, са цитотоксични и срещу Hs939T / меланомна линия/ ВТ-20 /гръдна карцинома/ , А427 /карцинома на белия дроб/, НТ-1080 / карцинома на дебелото черво/ и НТ-29 / карцинома на дебелото черво/. Тези фракции не са цитотоксични срещу Hs939 sk /кожни фибробласти/, HaLa клетки /цервикална карцинома/, Н527Р/фибробласти на препуциума/ или COS7 /SV 40трансформирани маймунски клетки/.

Д.2. Приготвяне на кодиращата последователност. По-нататък е описана процедурата за приготвяне на безинтронна ДНК последователност, която е кодираща за човешки TNF. Човешката промиелоцитна левкемична клетъчна линия, продуцираща големи количества от TNF при индукция, HL60 линията, получена от АТСС, кат. № CCL 240, се използва като източник на иРНК за формиране на сДНК банка. Чрез използването на олигомерни проби, конструирани на базата на определената белтъчна последователност на TNF, пречистен от тези клетки, се тестува сДНК банката, за да се получи пълната кодираща последователност на този белтък.

Д.2.а. Получаване на обогатена иРНК. Тотална иРНК се екстрахира и пречиства от HL-60 клетки последния начин, HL-60 клетки се индуцират за TNF продукция, както е описано в Д.1.а, и 4-часовата клетъчна суспензия се утаява чрез центрофугиране. Тотална цитоплазмена рибонуклеинова киселина /РНК/ се изолира по следващия начин. Всички процедури се извършват на 4°С. Клетките се измиват двукратно в ФСБ / фосфатно-солеви буфер/ и ресуспендират в 1НВ /140 мМ натриев хлорид, 10 мМ Трие, 1,5 мМ магнезиев хлорид, pH 8/, съдържащ 10 мМ ванадил аденозинов комплекс лит. източник /39/.

Нейонен детергент от типа на полимер на етиленовия окис /NP40/ се добавя до концентрация 0,3% за лизиране на клетъчните, но не и ядрените мембрани. Ядрата се изолират чрез центрофугиране при iOOOxg за 10 мин. Следядрената суспернатанта се добавя към равен обем от ТЕ /10 мМ Трие, 1 мМ EDTA, pH 7,5 /наситен фенол/ хлороформ /1:1/, съдържащ 0,5% натриев додецил сулфат /SDS/ и 10 мМ EDTA. Супернатантата се реекстрахира 4 пъти и фазите се развалят чрез центрофугиране при 2000 х g за 10 мин. РНК се утаява чрез коригиране на пробите до 0,25 М натриев хлорид, добавяне на 2 обема 100% етанол и съхранение на -20°С. РНК се утаява чрез центрофугиране на 5000 х g за 30 мин, промита с 70% и 100% етанол и се изсушава. Полиаденилирана /Поли А+/ информационна РНК /иРНК/ се получава от тоталната цитоплазмена РНК чрез хроматография на олиго-dT целулоза лит.източник /40/. РНК се разтваря в ETS /10 мМ трие, 1 мМ EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5/ до концентрация 2 мг/мл. Този разтвор се нагрява на 65°С за 5 мин. и след това бързо се охлажда до 4°С. След темпериране на разтвора на РНК до стайна температура, той се коригира с 0,4 М натриев хлорид и бавно се прекарва през олиго-dT целулозна колонка, уравновесена със свързващ буфер /500 мМ натриев хлорид, 10 мМ Трие, 1 мМ EDTA, pH 7,5 /. Преминалият разтвор се прекарва двукратно отново през колонката, след което тя се промива с 10 обема от свързващия буфер. Поли А+ иРНК се елюира чрез аликвоти от ETS, след което се екстрахира еднократно с наситен с ТЕ фенол/хлороформ и се утаява чрез добавяне на натриев хлорид до 0,2 М и 2 обема от 100% етанол. РНК се преутаява двукратно и се промива с 70% и 100% етанол преди изсушаването.

Поли А+ иРНК се фракционира на захарозен градиент в 10 мМ Трис-солна киселина, pH 7,4, 1 мМ EDTA, 10 мМ натриев

BAD ORIGINAL хлорид и 0,1% SDS. След центрофугиране в Beckman SW40 ротор при 38000 об/мин за 17 часа иРНК фракциите се получават от градиента чрез утаяване с етанол. Фракциите, съдържащи TNF иРНК, се идентифицират чрез инжектиране на иРНК в овоцити и анализ на овоцитните екстракти за цитотоксична активност. Фракциите, съдържащи най-висока активност, се обединява и използва за конструирането на сДНК банка.

Д.2.6. Конструиране на сДНК банки. сДНК се изготвя от обогатената на 16С иРНК фракция чрез използването на олиго-dT праймери, комплементарни на поли А опашките и АМВ обратна транскриптаза по метода на Окаяма и сътр. лит. източник /41/ . Чрез този метод се получават значително количество клонове с пълна дължина и при него ефективно се използват като вектори гостоприемници части от два вектора, описани съгласно изобретението - pcDBl и pLI, които могат да се получат от техните автори. Получените вектори съдържат инсерта, разположен между векторни фрагменти, съдържащи проксимални BamHI и Xhol рестриктазни места; векторът съдържа началото на репликация на pBR322 и генът, определящ Amp резистентност.

Известни са разбира се и други методи за приготвяне на сДНК библиотеки. Един от тях, станал вече класически, използва олигоdT праймер, обратна транскриптаза, която прикачва към краищата на двуверижната ДНК на поли-dG и ги свързва към подходящ вектор, като pBR322 и неговите производни, който е отворен в желаното рестриктазно място и са му прикачени поли dC опашки. Подробно описание на този алтернативен метод е направено в патента на САЩ, № 564,224. от 20.12.1983 г.

При използвания съгласно изобретението метод обогатената иРНК /5 мкг/ се денатурира чрез 10 мМ метил живак при 22°С за 5 мин и детоксикира чрез добавяне на 100 мМ 2меркаптоетанол /42/. Плазмидът pcDVI се обработва с ΚρηΙ, добавят се опашки към краищата му с dTTP и се хибридизира към денатурираната РНК. Тази иРНК, съдържаща олиго-dT праймери, се обработва с обратна транскриптаза и новосинтезираната ДНК се обработва за прикачване на олиго dC опашки с dCTP. След това нежеланата част от pcDVI вектора се премахва чрез обработка с Hindll. Отделно pLI се обработва с PstI, добавят му се опашки с dGTP, обработва се след това с Hindlll и се прибавя към поли Т иРНК/сДНК комплекса, съдържащ pcDVI векторния фрагмент. Добавя се E.coli лигаза и сместа се обработва сДНК полимераза I /Klinan, E.coli лигаза и РНК-аза Н. Получените вектори се трансформират в E/coli К12 ММ294, при което клетките стават AmpR.

Д.2.в. Селекция на пробата. Прибавят се олигомери, комплементарни на кодиращата последователност на аминокиселини 8-12 на пречистения TNF белтък. Поради изродеността на кода се приготвят общо 64 14-метра, като възможни варианти за комплементация с тази област на иРНК. 64-те 14-мера се разделят на 4 смеси по шестнадесет. Всяка от тях поотделно се смесва с фракционираната на захарозен градиент и обогатена иРНК, получена, както е описано по-горе, и получената смес се инжектира в овоцитната система за транслация. Използват се контроли чрез необработвана иРНК. Продуцираните в овоцитната система белтъци се подлагат на L929 анализ за цитотоксичност /’’сяра освобождаване/, като белтъците, извлечени от овоцити, инжектирани с контролната иРНК и с три от смесите на иРНК с олигомери, показват активност. При този анализ на “хибриден арест” само овоцитите, инжектирани с иРНК, третирана със олигонуклеотидната смес, съдържаща последователността

АТ

GC(G)AC(C)GGCTTGTC

ТА

СС е неактивна. Специфичността на тази олигомерна смес по-нататък се определя чрез dot blot хибридизация с обогатена иРНК, получена, както е описано по-горе, от индуцирани и неиндуцирани HL-60 клетки, както и със съответната фракция иРНК, получена от клетки продуценти на лимфотоксин. Тази смес се хибридизира добре с индуцираната иРНК, но не се хибридизира със съответните иРНК фракции от неиндуцираните и от лимфотоксинпродуциращите клетки. При това Нодърн блотове с използването на киназираната смес като проба показват, че тя съдържа последователности, които кросхибридизират с 18С /рибозомната/

BAD ORIGINAL

РНК фракция и сДНК на pBR322.

Тази олигомерна смес по-нататък се фракционира, като нейните членове се синтезират като 8 двойки от 14-мери, всяка от които се използва за анализ на “хибриден арест” по описания по-горе начин. Само двойката, притежаваща последователността.

е способна да инхибира синтеза на TNF в овоцитите. Дот блот експерименти с използването на фракционирана иРНК фракция от индуцирани HL-60 клетки, индуцирана тотална поли А+ РНК от HL-60 клетки, неиндуцирана HL-960 поли А+ РНК и ДНК на pBR322, потвърждават специфичността на посочената по-горе 14-мерна двойка и неспособността на останалите двойки да хибридизират към желаната иРНК.

Д.2.г. Получаване на кодиращата последователност. сДНК библиотеката, получена, както е описано по-горе, се тестува с 14-мерната двойка, идентифицирана в Д.2.в. 28 колонии, които се хиблидизират със сонда, се отделят, култивират се и от тях се изолира плазмидна ДНК. Селекционират се плазмиди, съдържащи инсерти с дължина, достатъчна за кодирането на цялата последователност, и някои от тях се тестуват за наличие на правилната последователност чрез хибридна транслация в комбинация с анализа за цитотоксичност на базата на освобождаването на ³³сяра, както е описано по-горе в В.5. Хибридно-транслационните анализи използват тестуваната последователност за извличане на нужната иРНК от нефракционирани препарати и това се доказва чрез анализ на белтъка, получен в овоцитната система за транслация, инжектирана със съответния изолиран иРНК препарат.

Тестуваната плазидна сДНК се свързва към филтри и филтрите се третират с поли А+ РНК, изолирана от индуцирани HL-60 клетки. След това хибридите се елюират от филтрите и се инжектират в овоцитната система за транслация. От овоцитите се екстрахира белтък, който се тестува чрез ^3SS версията на L-929 цитотоксичната проба. Резултатите за някои хибридизиращи клонове, означени като Е2-Е4, Е6 и Е8 са показани в следващата таблица

Проба	Освобождаване на 35сяра, в
El	7
Е2	23
ЕЗ	32 : : < Ί ' ί

Е4	33
Е6	26
Е8	11
pBR322	9
А+	34
В+	24

/А+ и В+ са контроли, съдържащи обогатена иРНК, получена от захарозен градиент; Е1 и pBR322 представляват отрицателни контроли./

Рестриктазен анализ и частично секвениране на инсертите показват, че два плазмида рЕ4 и рВ11 вероятно съдържат пълната TNF кодираща последователност. Резултатите от този анализ за рЕ4 са показани на фиг. 2.

Съгласува се рЕ4 и се определя правилната четяща рамка за THF чрез нанасяне на аминокиселинната последователност на трите възможни четящи рамки върху определената чрез N-терминално секвениране на TNF N-терминална област на нативния зрял TNF от фиг. 1. Аминокиселините на зрелия белтък са номерирани като валинът е под №1. Както е отбелязано по-горе, хомологията не е пълна. Въпреки това, високото ниво на хомология показа, че е избрана правилната сДНК. Направена е и проверка на експериментално определените рестриктазни места от фиг. 2. Hindlll мястото, разположено погоре от 3' PstI мястото на 1,1 PstI фрагмента, е същевременно по-надолу разположено от стопкодона, което позволява изолирането на кодиращата последователност като Hindlll фрагмент след модифициране на участъка, разположен преди него по начин, описан понататък.

Д.З. Характеристика на човешкия TNF на базата на неговата ДНК последователност. Както се вижда от сДНК последователността от фигура 1, зрелият TNF белтък съдържа 157 аминокиселинни остатъци и е с молекулно тегло около 17354 без гликозилиране. Отделно водещата /лидерна/ последователност съдържа около 76 аминокиселини, започваща с първия наличен Met старт кодон. Има два цистеинови остатъка в позиции 69 и 101, поради което се предполага, че активната структура съдържа дисулфиден мост.

bad original

Д.4. Подготовка на експресионни вектори.

Д.4.а. Модифициране на Nтерминалните кодони.

За по-ефикасната експресия на зрелия белтък е удобно да се въведе ATG старт кодона непосредствено преди GTC последователността, кодираща N-крайния валии на зрелия белтък, означен с № 1 във фиг. 1, както и да се осигури HindHI място, непосредствено преди ATG кодона за по-лесното лигиране в подходящи експресионни вектори. Това се извършва чрез сайтнасочена мутагенеза, както е описано в С.4.

По-подробно ДНК фрагментът, съдържащ участъка преди кодиращата последователност, се изрязва от рЕ4 чрез смилане с PstI, изолира се чрез агарозна гел електрофореза и електроелюция и се лигира в PstI мястото на бактериофаг М13 мп18.

Лигираният фаг се трансдуцира в замразени клетки на E.coli К12 щам DG98 / АТСС № 39768/, които се култивират чрез посяването им на среда, съдържаща 5x10 ⁴М изопропил тиогалактозид /PTG/, получен от Сигма Хим. /Св.Луис, МО/ и 40 мкг/мл Xгал. Алфа некомплементиращи бели плаки се отделят и прехвърлят на прясна среда. Скринират се миникултури за съдържание на рекомбинантна едноверижна фагова ДНК, съдържаща инсерти с очакваната /1,1 кб/ дължина. Структурата на желания рекомбинантен фаг, означен като клон 4.1 се потвърждава чрез рестриктазен анализ.

Използва се химично синтезиран и пречистен 33-мерен олигодез оксирибонуклеотид, съдържащ последователността 5' GAAGATCATCTCACTATAAGCTTTXKXTGGGCC3’, за въвеждане на HindiII рестриктазно място преди ATG кодона на инициация и GTC кодона на първата аминокиселина /валии/ на зрелия TNF белтък.

пикомола от олигонуклеотида се хибридизират с 2,6 мкг ДНК от едноверижния клон 4.1 в смес, съдържаща 100 мМ натриев хлорид, 20 мМ Трис-солна киселина, pH 7,9, 20 мМ магнезиев хлорид и 20 мМ бетамеркаптоетанол, при нагряване на 67°С за 5 мин и 42° за 25 мин. Хибридизационните смеси се охлаждат на лед и се довеждат до краен обем 25 мкл в реакционна смес, съдържаща 0,5 мМ от всеки dNTP, 1’7мМ ТриС солна киселина pH 7,9,17 мМ магнезиев хлорид, 83 мМ натриев хлорид, 17 мМ бетамеркаптоетанол, и 5 единици от ДНК полимераза I Klenow фрагмент и инкубирани на 37°С за 1 час. Реакциите се спират чрез нагряване до 80° и реакционните смеси се използват за трансформация на компетентни DG98 клетки, които след това се посяват на агарови петрита и инкубират за една нощ за получаването на фагови плаки.

Петрита, съдържащи мутантни плаки на клон 4.1, и петрита, съдържащи немутантни плаки на клон 4.1, се охлаждат на 4°С и фаговите плаки от всяко пети се прехвърлят върху два кръгли нитроцелулозни филтъра чрез поставяне на сух филтър върху петрито с агар за 5 мин - първия филтър и за 15 мин - втория филтър. След това филтрите се поставят върху дебели филтърни хартии, накиснати в 0,2 Н натриева о-ва, 1,5 М натриев хлорид и 0,2% Тритон Х-200 за 5 мин и неутрализирани чрез поставянето им върху филтърни хартии, накиснати с 0,5 М Трис-солна киселина pH 7,5 и 1,5 М натриев хлорид за 5 мин. Филтрите по подобен начин се промиват двукратно върху филтри, накиснати в 2 х SSC, след което се изсушават и се изпичат във вакуум сушилня за 2 часа на 80°С. Филтрите-дубликати се прехибридизират на 42°С за 4 часа в 10 мл на филтър от ДНК хибридизационен буфер / 5xSSC, pH 7,0, 4хр-р на Денхардт /поливинилпиролидин, фикол и говежди серумен албумин, 1х=0,2% от всеки/, 0,1% SDS, 50 мМ натриево-фосфатен буфер, pH 7,0 и 1000 мкг/ мл денатурирана ДНК от сперма на пъстърва. Приготвят се белязани с ³²Ф проби чрез киназиране на праймера с белязан АТФ. Филтрите се хибридизират с по 5х10‘ имп/мл от белязания с ³²Ф праймер в 1-5 мл на филтър от ДНК хибридизационния буфер за 8 часа при 64°С.

Филтрите се промиват еднократно на стайна температура за 10 мин с 0,1 % SDS, 20 мМ натриев фосфат /буфер/ и 6xSSC; веднъж при 37°С да 20 мин в буфер и 2 х SSC; веднъж на 50°С за 20 мин с буфер и 2 х SSC; и накрая при 60°С за 20 мин в буфер и 1 х SSC. След това филтрите се изсушават на въздух и се авторадиографират на -70°С за 4 часа.

Тъй като олигонуклеотидният праймер е така конструиран, че да създаде ново HindHI

BAD ORIGINAL рестриктазно място в мутантните клонове, изолират се ДНК /репликативна форма -PF/ от известен брой клонове, хибридизирани с праймера и тази НК се смила с Hindlll рестриктазно място /M13-AW701/ се отделя и инкулира в култура от DG98 клетки, а след това се изолира едноверижна ДНК от културалната супернатанта и двойноверижна PF ДНК от клетъчната утайка. Правилната последователност се потвърждава от дидеоксисеквенирането.

Правилно синтезираните вериги се изолират и смилат с PstI и Hindlll /частично/ или само с Hindlll за лигиране в експресионни вектори.

Д.4.6. Конструиране на експресионни вектори. За експресията в прокариоти кодиращата последователност /заедно с няколко 3' нетранслиращи се нуклеотиди/ се изолира от двойноверижен M13-AW701 по два начина.

По първия метод двойноверижната М13AW701 се смила с PstI и след това частично с Hindlll за получаване на Hindlll-PstI кодираща последователност. Частично смилане с Hindlll се налага поради няколко Hindlll места в М13AW701 и може да бъде извършено чрез използване на една десета от количеството рестриктаза, необходимо за пълното смилане на ДНК. Сместа се инкубира на подходящата за ензима температура и се вземат аликвотни части на 10 мин интервали в продължение на 1 час. Тези аликвотни части се натоварват на гел и получените ДНК фрагменти се анализират. Времето на икнубация, осигуряващо най-висок добив на желания фрагмент, се избира за препаративно смилане с рестриктазата, след което фрагментът се пречиства от гела чрез електроелюция.

Pstl/BamHI фрагментът, съдържащ 3' некодиращата последователност на TNF гена /виж Фиг.2/ се пречиства от рЕ4 след смилане на ДНК с ензимите PstI и BamHI.

Общо Himdlll/Pstl и Pstl/BamHI фрагментите образуват кодиращата последователност плюс 600 нд 3'-нетранслиран участък от ДНК. Двата фрагмента се лигират в Hindlll/BamHI разграден гостоприемников вектор pTRP3, както следва:

pTR3 /виж по-долу/ съдържа 50 триптофановия промотор и място на свързване на рибозомите при E.coli. pTRP3 се разгражда с Hindlll и BamHI и векторният фагмент се пречиства на агарозен гел. След това изолираният фрагмент се лигира с по-горе описаните Hindlll/PstI и Pstl/BamHI сегменти 5 чрез тройно лигиране и сместа се използва за трансформация на E.coli mM294 до Амп резистентност като така се получава плазмидът pAW701.

По втория метод двойноверижна М1310 AW701 ДНК се разгражда с Hindlll и фрагментът, съдържащ гена, се изолира чрез агарозен гел. Изолираният фрагмент се лигира с обработен с Hindlll и BAF рТЗЗ и се трансформира E.coli ММ294 до получаване на 15 pAW702.

pFC54.t /АТСС 39789/, съдържащ P_L промотора и позитивната ретрорегулаторна последователност на бацилус, или pPLOP / виж по-долу/ могат също да бъдат използвани 20 като вектори. Тези вектори се смилат с Hindlll и BamHI и големите плазмидни фрагменти, съдържащи контролните последователности, се пречистват на агарозен гел. Hindlll/PstI и PstI/ BamHI фрагментите на TNF гена, получен 25 както е описано по-горе, се лигират чрез тройно лигиране в Hindlll и BamHI местата на тези вектори, при което се получават плазмидите рАВ711 и рАВ712. Алтернативно пречистеният Hindlll фрагмент от рЕ4 може 30 да се лигира в обработен с Hindlll и ВАР pFC54.t или pPLOP до получаването на pAW713 или респективно pAU714.

Д.4.в. Експресия на TNF в прокариотни гостопиемници.

pAW701 и pAW702 се трасформират в

E.coli ММ294 и културите растяха при условия, подтискащи триптофановия /трф/ промотор. Продукцията на TNF се индуцира чрез изчерпване на триптофана. По аналогичен 40 начин се конструира pAW711 и се тнасформира в E.coli МС 1000-39531 клетки, които се индуцират през повишаване на температурата. След няколкочасово култивиране при условия на индукция, клетките се озвучават и 45 озвучените препарати се тестуват за наличие на TNF чрез L-929 анализа за цитотоксичност. Получените\резултати са , както следва.

Плазмид	V/ml
701	1,3 х 104
702	1,3 х 104
711	2 х 10’

BAD ORIGINAL

Единиците за TNF активност се определят, както е показано в В.5.

Д.4.г. Експресия на TNF в еукариотни гостоприемници.

Векторът рВ1 I, изолиран от сДНК банката, както е описано в Д.2.Г., съдържа SY40 промотора, разположен съседно на TNF кодиращата последователност. Всички от 28те позитивно хибридизиращи колонии би трябвало да съдържат тези последователности, включително рЕ4 и рВ 11, и следователно могат да се експресират в подходящи бозайникови гостоприемници. Поради това рВ 11 се използва за трансформация на COS-7 клетки на маймунски бъбрек и клетките се култивират при условия, позволяващи индукцията на SY40 промотора. Тъй като рВ 11 съдържа сигналната последователност, която функционира в клетъчните системи на бозайници, TNF се секретира в средата. TNF се тестува в супернатантата над монослоя от COS-7 клетки чрез измерване на освобождаването на ’’сяра от L-929 клетките и резултатите се представят по-нататък.

Плазмид ³⁵S освободена /срш

ВИ 22,763

Е9 /отрицат.контрола/ 2,739

-ДНК 2,565

Д.5. Характеризиране на рекомбинантния TNF.

Д.5.а. Пречистване. Клетките на E/coli DG95 /ламбдализоген, подобен на МС 100039531/, трансформирани с pAW711, се култивират на 37°С в стандартна хранителна среда до ОД₆₀₀ около 0,5 и след това индуцирани чрез покачване на температурата до 42°С. След 2 часа клетките се озвучават и озвучените клетки се тестуват за TNF активност чрез Л-929 анализа за цитотоксичност /супра/. Озвучената смес след това се натоварва на DEAE сефарозна колона Pharmacia и се промива с буфер /10 мМ Трие, рВ 8,2, 1мМ натриев хлорид/. Чрез стъпаловидно елюиране с 0,02 М, 0,04 М, 0,1 М и 0,8 М натриев хлорид се получават фракции, съдържащи TNF активност.

По-голяма част от TNF активност се елюира с 0,04 М натриев хлорид. Тези фракции се концентрират чрез ултрафилтрация и след това се пречистват чрез HPLC с използване

1.1, <! \ 4 I \ * !!« - t. . ;> J на фенил TSK5PW колона /LKP/. TNF белтъкът се задържа на колоната при наличие на 1,8 М амониев сулфат в 0,1 М натриев фосфат рН7,0 и се елюира при около 0,4 М амониев сулфат в процеса на намаляване на концентрацията на амониевия сулфат в колоната до нула. Фракциите, съдържащи TNF, се концентрират чрез ултрафилтрация и се натоварват на GH75 колона /Амикон/ за получаването на чист TNF.

Д.5.6. Разделяне на TNF мутеини.

Изоелектрофокусирането показа, че TNF, получен, както е описано в предходния параграф, се състои от няколко фракции с различни р! стойности, вариращи между 5,86,5. Показано е, че всичките основни фракции представляват очакваният зрял TNF, но също така се съдържа и контаминантна мутеинна форма 4TNF. Резултатите от изоелектрофокусиращия гел показват наличието на различни модификации на TNF.

За да се раздели Δ mTNF от 4TNF в препаративни количества, DEAE сефарозната колона, описана в Д.5., се елюира с използването на по-висока степен на фракциониране, при което се получава фракция при 0,03 М натриев хлорид, обогатена на Δ 4TNF преди елюирането на главния пик, съдържащ Δ mTNF.

Обогатената на Δ 4TNF фракция се концентрира и натоварва на фенил TSK-5PW колона за HPLC при условията, описани погоре. Хроматография под високо налягане HPLC на обогатената фракция води до получаването на пик, съдър-жащ mTNF при около 0,4 М амониев сулфат, както е описано по-горе, и пречистен Δ 4TNF, който се елюира при прилагане на обратен градиент от 0,1 М фосфат pH 7 до дейонизирана вода към колоната. Пиковите фракции Δ 4TNF се концентрират и по-нататък се пречистват на GH75, както е описано по-горе, до получаването на хомогенен Δ 4TNF с pl 5,8, определено от изоелектрофокусиращи гелове.

Тестува се специфичната активност на фракции от Δ 4TNF пиковете, получени при пречистването на GH75, като се определя и тяхната концентрация по поглъщането на 280 нм и се получават следващите резултати.

' · .14V е : I' · ¹

BAD ORIGINAL

Номер на фракцията	Белтъчна концентрация мг/мл	Биоактивност ед./мл	Специфична активност ед./мг
16	0,043	4,7х10‘	1,1x10’
17	0,091	1,9х107	2,1x10’
18	0,102	1,4х107	1,4x10’
19	0,063	7,0х106	1,1x10’
20	0,035	2,4x106	6,9х107

Средната специфична активност, която съвпада с пика, както е типично за чист белтък, е 1,3 х 10’ ед./мг. Тази стойност е около 10 пъти по-висока от получената за mTNF.

Д.5.в. Потвърждаване на mTNF и Δ 4TNF последователността. Аминокиселинният състав на двата вида TNF се сравнява и резултатите са представени по-нататък.

серинови, 1 валинов и 1 аргининов остатък. Делетирането на тези остатъци от N-крайната последователност се потвърждава чрез секвениране на Δ 4TNF чрез автоматичен 5 белтъчен секвенатор, който дава следната последователност за първите 10 аминокиселини. Ser-Argl-Thr-Pro-Sex-AspLys-Pro-Val-Ala.

При сравняване на тази последова10 телност с изведената аминокиселинна последователност от фиг. 1 се вижда, че при този белтък липсват първите 4 аминокрайни остатъка Val-Arg-Ser-Ser, но че и той има N-терминална последователност, съвпадаща в 15 съответните позиции.

Д.6. Получаване на гена за Δ 4TNF и неговата експресия в E.coli. Химично синтезиран, пречистен 35-мерен олигодезоксирибонуклеотид с последователност 5’20 CACTGGGGGnCGAGACATAAGCTITGCXnXX3GCC3' се използва да бъдат премахнати и следователно делетирани 12-те нуклеотида, кодиращи 4-те N-крайни аминокиселини, разположени след метиониновия иницииращ

Амино-Пред-	TNF	TNF2 Разлика	25 кодон.
кисе- пола-	pl 5,8	pl 5,8 TNF,-	10 пикомола от олигонуклеотида се
лина гаем	-6,5	състав TNF2	хибридизират с 2,6 мкг от едноверижната ДНК
/сДНК/			на клон M13-AW701 в 15 мкл от смес,

съдържаща 100 мМ натриев хлорид, 20 мМ

Трис-солна киселина pH 7,9, 20 мМ магнезиев

Асп	12	12,7	12,4	0,3		хлорид и 20 мМ бетамеркаптоетанол, при
Тре	6	6,2	6,1	0,1		нагряване на 67°С за 5 мин и 42°С за 25 мин.
Сер	13	12,6	10,9	1,7		Реасоцииралите смеси се охлаждат на лед и
Глн	20	20,5	20,2	0,3		довеждат по 25 ml краен обем, като
Про	10	10,1	10,3	-0,2	35	реакционната смес съдържа 0,5 мМ от всеки
Гли	11	11,1	11,1	0,0		dNTP, 17 мМ Трис-солна киселина pH 7,9,17
Ала	13	13,4	13,1	0,3		мМ магнезиев хлорид, 83 мМ натриев хлорид,
Вал	13	10,9	10,2	0,7		17 мМ бетамеркаптоетанол, 5 единици от ДНК
Мет	0	0,2	0	0,2		полимераза I Klenov фрагмент, и се инкубира
Иле	8	6,5	6,6	-0,1	40	на 37°С за 1 час. Реакциите се спират чрез
Лев	17	18,7	18,5	0,2		нагряване на 80°С и реакционните смеси се
Тир	7	6,9	7,0	-0,1		използват за трансформация на компетентни
Фен	4	. 4,0	4,0	0,0		DG 98 клетки, които след това се посяват на
Лиз	6	6,1	6,2	-0,1		агарови петрита и се инкубират една нощ за
Хис	3	3,0	3,0	0,0	45	получаване на фагови плаки.
Apr	9	9,0	8,0	1,0		Петрита, съдържащ и мутантни клонове
н	152	151,9	147,4	4,5		M13-AW701, образували плаки, както и 2 петрита, съдържащи немутирали M13-AW701
						фагови плаки, се охлаждат на 4°С и фаговите
	И двата	белтъка имат	състав,	подобен	50	плаки се прехвърлят върху два /за всяко
много на този, прогнозиран от	сДНК		петри/ кръгови нитроцелулозни филтъра чрез

последователността; но Δ 4TNF не съдържа 2 ‘ полагане на . сухия филтър върху агаровото bad original петри за 5 мин - първия филтър и 15 мин втория филтър. След това филтрите се поставят върху дебели филтърни хартии напоени с 0,2 Н натриева о-ва, 1,5 М натриев хлорид и 0,2% Тритон Н-100 за 5 мин, и се неутрализират чрез поставянето им върху филтърни хартии, напоени с 0,5 М Трис-солна киселина pH 7,5 и 1,5 М натриев хлорид за 5 мин. Филтрите се промиват по подобен начин с 2 х SSC, сушат се и се изпичат във вакуумсушилня на 80°С за 2 часа. Филтрите дубликати се прехибридизират на 42°С за 4 часа с 10 мл на филтър разтвор на ДНК хибридизационен буфер /5xSSC, pH 7,0, 4хр-р на Денхардт / поливинилпиролидин, фикол и говежди серумен албумин, 1х=0,02% от всеки/, 0,1% SDS, 50 мМ натриево-фосфатен буфер, pH 7,0 и 100 мкг/мл денатурирана ДНК от сперма на пъстърва. Приготвят се белязани с ³²Ф проби чрез киназиране на праймера с белязан ATF. Филтрите се хибридизират с по 5x10’ имп/ мин/мл от белязания с ³²Ф праймер в 1-5 мл на филтър ДНК хибридизационен буфер на 64°С за 8 часа.

Филтрите се промиват веднъж на стайна температура за 10 мин с 0,1% SDS, 20 мМ натриев фосфат/буфер/ и 6xSSC, веднъж на 37°С за 20 мин в буфер и 2xSSC; веднъж на 50°С за 20 мин в буфер и 2xSSC; и накрая на 60°С за 20 мин в буфер и 1 xSSC. Филтрите се изсушават на въздух и се авторадиографират на -70°С за 4 часа.

PF-ДНК от колоните, даващи позитивни сигнали, се разграждат с HindiII и фрагментът, съдържащ мутиралата TNF кодираща последователност, се изолира чрез гел електрофореза. Изолираната последователност се лигира в pAW711, обработен с Hindlll и ВАР, при което се получава pAW736. Наличието на 12-нуклеотидна делеция се доказва чрез рестриктазен анализ с Hindlll и Pvull; pAW736 съдържа 134 нд Hindlll/Pvr-II фрагмент в сравнение с 146 нд Hindlll/PvuII фрагмента, съдържащ се в pAW711. pAW736 се депозира с АТСС от 10.04.1985 и има каталожен № 53092.

Клетки на E.coli DG95, трансформирани с pAW736, се култивират и индуцират, както е описано по-горе. Клетките се озвучават по показания по-горе начин и отделни проби се анализират чрез 12,5% SDS-PAGE. A4TNF белтъкът се пречиства по описайия пд-гбре метод и се показва, че е идентичен с получения преди Δ 4TNF чрез изоелекрофокусиране. Изолираният Δ 4TNF се тестува чрез L-929 анализа за цитотоксичност и се показва, че притежава специфична активност приблизително 2x10’ ед./мг.

Д.7. Конструиране и активност на други мутеини на TNF. Д.7.а. Конструиране.

По подобен начин на този, описан в Д.6., се приготвят експресионни вектори за получаване на TNF делеционни мутеини, при които липсват първите 3-11 крайни аминокиселинни остатъци в сравнение с последователността от фиг. 1. На фиг. 3 са представени означенията на получените вектори, както и олигомерите, използвани при сайт специфичната мутагенеза за получаване на съответните делеции. На тази фигура също са представени векторните означения и олигомерите, използвани за конструирането на мутеините Δ 156-, Δ 150-, Δ 140-TNF, както и Des-Ser_}Des-Ser₄ и Val₁₅ser₁₆ мутеини.

Ser₆₉ или Ser_|0| Мутеини

По подобен начин се използва и олигонуклеотид насочената мутагенеза за получаване на мутантен TNF ген, кодиращ мутеин с TNF активност, при който cis₆₉ е заменен с друга аминокиселина или е делетиран и/или цис₁₀₁ остатъкът е заменен или делетиран. Например за превръщането на cis₆₉B ser₆₉ най-подходящ е олигонуклеотидният праймер 5-CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT3’. В този олигонуклеотид има Т-А замяна в триплета, комплементарен на кодон 69 на TNF гена. По подобен начин cis_)0J може да бъде превърнат в ser_10l чрез праймер, съдържащ съответната замяна в триплета, комплементарен на кодон 101.

Клонът 4.1, получен чрез смилане на рЕ4 с pstl, както е описано в Д.4.а., се подлага на сайт-специфична мутагенеза, както е описано в Д.4.а., но чрез използването на праймера 5'CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT-3', който е комплементарен на последоватлеността, съседно разположена на цистеина в позиция 69, но съдържа нуклеотиди, комплементарни на този кодон, които предизвикват промяната от TGC на AGC. Мутантните плаки се откриват и доказват чрез секвениране, както е описано по-горе. Една плака, съдържаща желаната мутация, MB-AW731, се разгражда с Aval и Pstl И по^ученйят фрагмент се легира в Pstl/

BAD ORIGINAL

Aval смления pAW711. Лигазаната смес се използва за трансформация на E.coli МС 100039531 до Amp резистентност и получените трансформанти се скринират с праймера за наличие на правилната последователност. Една колония, означена като pAW731, се използва за експресия на модифицираната последователност. pAW731 се депозира с АТСС от 25.01.1985 г. и има каталожен № 53007.

По аналогичен начин се получава рАЕ741 - експресионен вектор за cep_J01 TNF.

ДНК последователността, кодираща за цистеин-69 и/или цистеин₍₀₁, липсващи TNF мутеини се използва за модификация на Nкрайно или С-крайно делетирали мутеини за получаване на съответните “двойни” мутантни форми. Експресионните вектори за тези мутеини се конструират чрез използването на подходящи рестриктази за прехвърлянето на фрагменти от ДНК кодиращите участъци, съдържащи тези модификации във векторите, приготвени както е описано по-горе. Областите, съдържащи Ser₆₉, Ser_|01 и Ser_MSer₍₀₁ TNF форми се получават от плазмиди pAW731, pAW732 или съответно pAW735. По-подробно плазмидът pAW731 е описан в предходния текст; pAW732 и pAW735 кодират Ser 101 TNF и Ser69Serl01 TNF и са конструирани по аналогичен начин. Така получените експресионни вектори се трансформират в E.coli и клетките се култивират и индуцират, както вече е опоисано, за да продуцират желаните белтъци. Получените TNF мутеини имат подобна активност, като тази на mTNF.

Д.7.6. Експресия на допълнителни мутеини.

Клетки на E.coli МС 1000-39531, съдържащи pAW731, се култивират и индуцират при по-висока температура, както е описано в Д.5.а. Озвучената смес от индуцирани клетки се тестува и е изчислено, че има приблизително същата TNF активност на мл, както тази на pAW711 трансформантите. SDS анализът показа, че количеството на 17 кД TNF белтъка в тези екстракти е около 5 пъти по-малко, което означава, че специфичната активност на Ser₆₉ TNF е повисока от тази на непроменения белтък.

Пречистен /95% / непроменен белтък се редуцира и алкилира чрез обработка с DTT и йодоацетат по метода, описан по-долу. Докато нетретираният белтък е с активност 2,6.х10* ед./мл, то редуцираният, или редуцираният и алкилиран белтък има активности 4,4-4,8х10⁴ ед./мл.

Обработка	Активност
Без ДТТ	2,6x104
0,1 мМ ДТТ	З.ЗхЮ4
1 мМ ДТТ	4,8х104
2 мМ ДТТ	3,9х104
10 мМ ДТТ	1,2х104
20 мМ ДТТ	1,7х104
буфер+2,4 мМ 1АА	1,5х104
1 мМ ДТТ+2,4 мМ IAA 4,4х104

По напълно аналогичен начин на този, описан за pAW711, плазмидите от фиг.З, кодиращи за N-крайни делеционни мутеини на TNF, се трансформират в E.coli и трасформираните клетки се култивират и индуцират за получаване на продукция от желания белтък. Така получените рекомбинантни белтъци се пречистват и тестуват подобно на mTNF и Δ 4TNF. При L-929 анализа за цитотоксичност специфичните активности на тези мутеини описват една камбановидна крива с оптимум при Δ 6-8TNF. Установено е, че специфичните активности на тези мутеини са 5-10 пъти по-високи от тази на mTNF. Тези резултати са представени на фигура 4.

На фиг. 5 и 6 е показано, че мутеините се получават в по-хомогенна форма от mTNF при условията на рекомбинантна продукция, респ. пречистени препарати на mTNF и различни мутеини след SDS полиакриламидна гел електрофореза и изоелектрофокусиране. Всяка фигура показва резултатите от експресионните продукти на pAW711 /mTNF/ и pAW736, pAW739, pAW737, pAW740, pAW741 и pAW742, кодиращи за TNF мутеини, при които липсват респ. 4,6,7,8,9 и 10 Nкрайни аминокиселини.

На фиг. 5 всички белтъци са хомогенни, което означава, че препаратите са чисти по отношение на размера на изолирания белтък. Резултатите от фиг. 6 показват, че продуктът на pAW711 /mTNF представлява смес от белтъци с различни pl стойности, означаващо наличие на различни модификации на веригата. Продуктът на pAW736 съдържа bad ORIGINAL минорни количества от белтъци с модифицирани странични вериги, докато експресионните продукти на останалите плазиди са хомогенни.

Д.8. Резултати от in vivo анализа.

Рекомбинантният MTNF/pTNF е активен в in vivo анализа, описан в параграф В.5.6. на фигурите 7а и 76 е показан ефектът от инжектирането на 0,5, 1,0 и 2,0 мкг от pTNF върху растежа на миша фибросаркома и преживяемостта на гостоприемника. При тези анализи всяка посочена доза на TNF представлява количеството за единична инжекция.

Инжектирането започва 9 дена след имплантирането на тумора и продължава още 6 дена с по една инжекция на ден. На фигура 7а е показан ефектът на TNF върху туморния растеж започвайки инжектирането с TNF. Стрелките под абцисата показват времето на инжектиране. Тези резултати показват, че дори 6x0,5 мкг от pTNF, инжектирани интравенозно, ограничават всяко значително нарастване в туморния обем в сравнение с контролите. На фигура 7б е показана степента на преживяемост, започвайки от време 0, като последният ден от инжектирането с TNF/т.е. 10-тия ден от фиг. 7а/. Резултатите показват, че процентът на преживяемост рязко нараства и при трите използвани дози на инжектиране.

При мишки, имплантирани с MCF-7 тумори, началото на интравенозните инжекции с TNF е на осмия ден след туморната имплантация. Първата инжекция е токсична / 5 от 10 мишки умират/ и последвалите инжекции, правени по една дневно /общо 5/, съдържат 1 мкг на мишка. Мишките също така се инжектират с естрадиол мускулно в дните 0, 2, 4, 9, и 11. За периода от 14 дни туморният обем на инжектираните с TNF мишки нараства от 30 мм’ до около 50 мм’, докато този на контролите - от 30 мм’ да 130 мм’.

Д.9. Конструиране на pPLOP. pPLOP е депозиран в АТСС на 18.12.1984 с каталожен № 39947. Неговото конструиране е описано по-нататък.

Д.9.а. Начало на репликацията. pCS3 има начало на репликация, което осигурява висок брой на копията на вектора гостоприемник pPLOP при високи температури. Неговото конструиране е описано подробно в патент на US № 541,948 от 14.10.1983 г. pCS3 е депозиран на 3.07.1982 г. и означен с АТСС № 39142.

pCS3 е получен от pEW27 и рОР9. pEW27 е описан от Вонг лит. източник 14Ъ1. Той съдържа мутации около неговото начало на репликация, водещи до температурно регулиране на броя на неговите копия. В резултат на тези мутации репликация, водеща до голям брой копия, протича при високи температури, а при по-ниски температури броят на копията е малък.

рОР9 е плазмид с голям брой на копията при всички температури, конструиран чрез инсериране в pBR322 на ecoRI/PruII начало на репликация от плазмида рОРб тип Col El / 44/. Преди инсерцията този фрагмент се модифицира, както следва. Смилат се 50 мкг рОРб напълно с по 20 ед. от BamHI и СстЕ За да бъдат премахнати Сст! 3' стърчащите краища и за да се запълнят 5' BamHI краищата, смляната рОРб ДНК се обработва с ДНК полимераза I /Klenov/ на E.coli в двустепенна реакция - първо при 20°С за елиминиране на Сст1 3' стърчащите краища и след това при 9°С за запълване на 5' края. Полученият фрагмент с тъпи краища се обработва с рестриктаза и 0,02 пикомола от него се използват за трансформация на компетентни DG75 клетки /45/. Трансформанти се отбират на петрита, съдържащи 50 мкг/мл ампицилин и скринирани за 3,3 кб делеция, загуба на Сст1 мястото и наличие на новообразувано BamHI място.

Един от плазмидите, означен като рОР7, се избира и BamHI мястото се премахва чрез смилане на 25 мкг от рОР7 с 20 ед. BamHI, запълват се краищата с E.coli ДНК полимераза I Klenow фрагмент и религиране с Т4 ДНК лигаза. Компетентни DG75 клетки се третират с 0,1 мкг от тази ДНК и трансформантите се отбират на L петрита, съдържащи 50 мкг/мл ампицилин. Колониите се скринират за загуба на BamHI рестриктазното място. Така се селекционира рОР8. За получаването на рОР9 от pBR322 се изолира Aval запълнен /EcoRI Τ_ετρ” фрагмент и се лигира към изолиране PruII частично/ЕсоЯ_ 3560 нд фрагмент от рОР8.

При лигирането на 1,42 кб EcoRI/Avalзапълнен Tef’ /фрагмент А/ и 3,56 кб EcoRI/ PvuII Апр^рез /фрагмент В/ се използва 0,5 мкг от фра/мент В и 4,5 мкг от фрагмент А в

BAD ORIGINAL двустъпална реакция, за да се благоприятства междумолекулното лигиране на EcoRl краищата.

Компетентни DG75 клетки се трансформират с 5 мел от лигазната смес и трансформантите се отбират на ампицилин / 50 мкг/мл/ съдържащи петрита. рОР9, изолиран от Amp^R Tet^R трансформати, показа висок брой на копията, резистентност към колицин и наличие на единични рестриктазни места за EcoRl, BamHl,, PvuII, Hindlll, 2 рестриктазни места за HincCC и подходящо големи фрагменти при смилане с НаеШ.

За получаване на pCS3, 50 мкг pEW27 ДНК се смила напълно с PvuII и EcoRl. По същия начин 50 мкг от рОР9 се разгражда с PvuII и EcoRl и се изолира 3,3 кб фрагментът.

0,36 мкг /0,327 пикол/ от рЕВ27 фрагмента и 0,35 mg /0,16 пикомол/ от рОР фрагмента се лигитират и лигазната смес се използва за трансформация на E.coli ММ294. Отбират се Amp^R Tet^R трансформанти. Тези колонии първоначално се скринират при 30°С и 41 °C на петри за анализ на беталактамазна активност, а след това се изследва и тяхната плазмидна ДНК след растеж на 30°С и 41 °C. Един от клоновете, дал положителни сигнали, се означава като pCS3 и се проверява чрез секвениране.

Д._.б. Получаване на P_LN_R3S инсерта. ДНК последователността, съдържаща P_L фаговия промотор и мястото за свързване на рибозомите за N-гена /N_RBS/, се получава от pFC5, плазмид, производен на рКСЗО, описан от Шиматаке и Розенберг /46/. рКСЗО съдържа 2,34 кб фрагмент от ламбдафага, клониран в Hadlll-BamHI фрагмента на pBR322. P_L промоторът и N_rbs представляват участък в рКСЗО между BgLII и Hpal сойтовете. Производният плазмид на рКСЗО има EcoRl сайт, вместо BgLII сайт.

BgLII сайт, разположено непосредствено преди P_L промотора, се превръща в EcoRl място по следващия начин. рКСЗО се разгражда с BgLII краищата, запълнени с Klenow и dNTP_s и се лигира чрез Т4 лигаза към EcoRl линкер /получени от New England Biolabs / и се трансформира в E.coli К12 щам ММ294 Ламбда*. Плазмиди се изолират от Amp^R Tet^s трансформанти и желаната последователност се потвърждава чрез рестриктазен анализ и секвениране. Полученият плазмид, pFC, е двойноразграден с Pvul и Hpal, при което се изолира около 540 нд фрагмент, който се обработва с Klenow и dATP и S1 нуклеаза до получаването на фрагмент с тъпи краища, притежаващ на 3' края последователността AGGAGAA, където - AGGAGA представлява N_rbs. Този фрагмент се обработва с EcoRl за получаването на 347 на ДНК фрагмент с 5’EcoRI /леплив/ и Hindi/ частично запълване, S1 тъп/-3' краища.

За карйното получаване на pFC5, pBIZI5 се използва за въвеждане на Xindlll място на 3' край на N_RBS. pBI-Z15 се депозира на 13.01.1984 г., АТСС № 39578, и се получава чрез свързване на последователност, съдържаща АТС плюс 140 вр от бетаинтерфероновия ген към lac z гена в pBR322. В pBI-Z15 EcoRl сайта на pBR322 е запазено и инсертът съдържа Hindlll сайта, непосредствено преди АТС иницииращия кодон на интерфероновия ген. pBI-Z15 се обработва с Hindlll краищата, запълнени с Klenow и dNTF и след това се разгражда EcoRl. Полученият EcoRI/Hindlll /запълнен/ векторен фрагмент се лигира с посочения погоре EcoRI/Hindl /запълнен/ фрагмент и лигазната смес се трансформира в МС 100039531. Трансформимантите, съдържащи правилната конструкция, се идентифицират чрез способността им да растат на минимална среда без лактоза при 34°С, но не и при 30°С, но не и при 30°С./ Трансформациите се посяват на x-gal-Amp петрита при 30°С и 34° и на петрита с минимална лактоза среда при 30° и 34°. Трансформантите с правилната конструкция са сини на X-gal-Amp петрита и при двете температури, но на минималната лактозна среда растат само на 34°./ Правилната конструкция е означена с pFC5.

Д.9.в. Завършване на pPLOP.

pCS3 се модифицира, за да осигури P_L и H_RBS контролните последователности. pCS3 се разгражда Hindlll и след това с EcoRl. Векторният фрагмент се лигира към EcoRl/ Hindlll изолира фрагмент от pFC5, съдържащ P_LH_Rgs, и се трансформира в E.coli ММ294. Правилната конструкция от изолираната плазмидна ДНК се потвърждава чрез рестриктазен анализ и секвениране и плазмида се означава pPLOP.

Д.10. Конструиране на pTRP3.

pTRP3 се депозира с АТСС на

18.12.1984 г. и има кат. № 39946. Неговото конструиране е извършено в следващия ред.

За да бъде конструиран вектор, съдържащ trp контролните последователности след Hindlll мястото, се изолира trp промотор/ оператор/място на свързване на рибозомите последователността без атенюаторната област от плазмида pVH153, получен от С.Яновски от Стандфордския Университет. Тгр последователности се съдържат в множество плазмиди, известни в тази област. рУН153 се обработва с Hhal (,който при скъсване дава 3' леплив край в 5’ посока от trp промотор/, краищата се превръщат в слепи след обработка с Klenov, след което се извършва непълно смилане с Tagl. 99 нд фрагментът, съответстващ на този, получен при скъсване в Tagl мястото, разположено 6 нуклеотиди преди ATG старт кодона, се изолира и след това се лигира към обработения с Есо1?1-запълнен/с1а1 плазмид pBR322, при което се получава pTRP3.

Плазмидите, изброени по-нататък, са депозирани в Американската типова колекция за култури, Роквил МД, САЩ /АТСС/. Това депозиране се извършва съгласно условията на Будапещенския договор относно международните споразумения за депозиране на микроорганизми за нуждите на патентните процедури /Будапещенски договор/. Това осигурява поддържането на жизнена култура в продължение на 30 години от датата на депозиране. Организмите могат да се предоставят от АТСС при условията на Будапещенския договор при съответно споразумение между потребителя и АТСС, което осигурява непрекъсната наличност след публикуване на съответния американски патент. Наличността на депозираните щамове не трябва да се тълкува като лиценз, даващ правото да се използва практически изобретението и да се нарушават неговите права под егидата на всяко правителство и в съответствие с неговите патентни закони.

Плазмид	CMCC АТСС Дата на
№	№	депозиране
pE4/E.coli ММ294	2318	39894	15.10.1984
pAW711/E.coli DG95	2162	39918	8.11.1984
pAW736/E.coli DG95	2317	53092	10.04.1985
pAW742/E.coli DG95	2345	53161	21.06.1985
pAW741/E.coli DG95	2344	53162	21.06.1985
pAW739/E.coli DG95	2342	53163	21.06.1985
pAW737/E.coli DG95	2340	53164	21.06.1985
pAW740/E.coli DG95	2343	53165	21.06.1985
pAW731/E.coli DG95		53007	25.01.1985

Claims (46)

1. Патентни претенции

   1. Рекомбинантен човешки тумор некротизиращ фактор /TNF/.
2. 2. Рекомбинантен TNF съгласно претениця 1, характеризиращ се с това, че съдържа аминокиселинната последователност, представена от позициите 17-157 в следващия ред.

   CACACCCTGACAAGCTGCCAGGCAGGTTCTCTTCCTCTCACATACTGACCCACGGCTCCA

   CCCTCTCTCCCCTGGAAAGGACACCATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTGGAGCT

   AETSatThrGluSecMETIlaArgAapValGluLau ggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgtt

   AlaGluGluAlaLeuProLyaLysThrClyGlyProGlnGlySar ArgArgCyaLauPba

   CCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCA

   LauSar LauPheSarPhaLauXlaValAlaGlyAlaThrThrLeuPhaCyaLauLeuBia

   CTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTCCCCCAGGGACCTCTCTCTAATCAGCCC

   PheGlyVall laGlyProGlnArgGluGluSecProArgAapLauSarLauIltSarPro

   TCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCtGTAGCCCATGT LeuAlaGlnAlaValArgSarSarSarArgThrProSarAapLyaProVal AlaHlaVal

   1 6 11 16

   TGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCT ValAl aAanProGlnAlaGluGlyGlnLauGlnTrpLauAanJ^rgArgAl aAanAla^eu CCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTA LauAlaAanGlyValGluLauArgAapAinGlnLeuValValPcoSarGluGlyLauTyr

   41 46 51 56

   CCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTGCTCCT LauIlaTyrSarGlnValLauPheLysGlyGlnGlyCyaProSerThtHiaValLauLau

   CACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGC Thr HlaThr IlaSarArgllaAlaValSacTyrGlnThr LyaValAanLtuLauSar Ala

   81 86 91 96

   CATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGA IlaLyaSer Pt oC^aGlnArgGluThrPr^GluGlyAlaGluAlaLyaProTx GCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACrCAGCGCTGAGAT PeoX leTyx LauGlyGlyValPhaGlnLauGluLyaGlyAapArgLauSar AlaGluIla

   CAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATtGC AtnArgPt oAipTyr LauAspPbaAlaGluSarGlyGlnValTyrPheGly Ilal laAla

   141 '146 151 156

   CCTGTGAGGAGGACGAACATCCAACCTTCCCAAACGCCTCCCCTGCCCCAATCCCTTTAT Lau...

   TACCCCCTCCTTCAGACACCCTCAACCTCTTCTGGCTCAAAAAGAGAATTGGGGGCTTAG

   GGTCGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAGCAACAAGACCACCACTTCGAAACCTGGGATTC

   AGGAATGTGTGGCCTGCACAGTGAAGTGCTGGCAACCACTAAGAATTCAAACTGGGGCCT

   CCAGAACTCACTGGGGCCTACAGCTTTGATCCCTGACATCTGGAATCTGGAGACCAGGGA GCCTTTGGTTCTGGCCAGAATGCTGCAGGACTTGAGAAGACCTCACCTAGAAATTGACAC ААСТССАССТТАааССТТССТСТСТССАйАТСТТХССАСАСТТССТТСАаАСАСССАССС CAGCCCTCCCCATGGAGCCAGCTCCCTCTATTTATGTTTGCACTTGTGATTATTTATTAT TTATTTATTATTTATTTATTrACAGATGAATGTAmATTTGGGAGACCGGGGTATCCTG GGGGACCCAATGTAGGAGCTGCCTTGGCTCAGACATGTTTTCCGTGAAAACGGAGGCTGA АСААТАСаСТаТТСССЛТСТАССССССТССССТСТСТСССТТСТТГГаАТТАТСТТГГТТ aaaatattatctgattaagttgtctaaacaatgctgatttggtgaccaactgtcactcat TGCTGAGGCCTCTGCTCCCCAGGGAGTTGTGTCTGTAATCGGCCTACTATTCAGTGGCGA

   GAAATAAAGGTTGCTTAGGAAAGAA

   BAD ORIGINAL
3. 3. TNF съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че има аминокиселинната последователност от претенция 2.
4. 4. TNF съгласно претенция 1, характерзиращ се с това, че представлява безцистеинов мутеин.
5. 5. TNF съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че същият е селекциониран от групата, състояща се от Δ 1-, Δ 3-, Δ4-, Δ5-, Δ 6-, Δ 8-, Δ 9-и Δ 10-TNF.
6. 6. TNF съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че Н-крайната последователност Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-ThrPro-Ser-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-His-Val.
7. 7. TNF съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че има N-крайната последователност Val-Arg-Ser-Arg-Thr-ProSer-Asp-Lys-Рго-Vai-Ala-Vai-Ser-Val-Ala-AsnPro- (Gin) - (Ala) -Glu-Gly.
8. 8. Рекомбинантна ДНК, кодираща за човешки TNF.
9. 9. ДНК съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че кодираният TNF обхваща аминокиселинната последователност, представена с позиции 17-157 от претенция 2.
10. 10. ДНК съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че кодираният TNF има аминокиселинната последователност от претенция 2.
11. 11. ДНК съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че кодираният TNF представлява безцистеинов мутеин.
12. 12. ДНК съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че кодираният TNF е от групата на Δ 1-, Δ 3-, Δ 4-, Δ 5-, Δ6-, Δ 8-, Δ 9- и Δ 10-TNF.
13. 13. ДНК съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че кодираният TNF има N-крайната последователност Ser-AspLys-Pro.
14. 14. ДНК съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че кодираният TNF има N-терминалната аминокиселинна последователност Val-Arg-Ser-Arg-Thr-ProSer-Asp-Lys-Pro-Val-Ala-Val-Ser-Val-Ala-AsnРго— (Gin) - (Ala) -Gru-Gly.
15. 15. Рекомбинантна ДНК съгласно претенция 8, характеризираща се с това, че съдържа контролни и кодиращи последователности, която ДНК при наличието на подходящи клетки гостоприемници може да предизвика експресия на ДНК съгласно претенциите 8-14.
16. 16. Рекомбинантни клетки гостоприемници, трансформирани с ДНК съгласно претенциите от 8 до 14.
17. 17. Метод за получаване на рекомбинантен тумор некрозиращ фактор / TNF/ характеризиращ се с това, че клетки гостоприемници, трансформирани с TNF ген, съдържащ подходящи регулаторни секвенции, се култивират при подходящи условия, в присъствие на необходими или подходящи за култивирането компоненти.
18. 18. Вещество, предизвикващо туморна некроза при бозайници, в което активната съставка е TNF съгласно претенциите от 1 до

    7.
19. 19. Метод за лекуване на тумори чрез инжектиране в гостоприемника на ефективно антитуморно количество от рекомбинантен човешки тумор некротизиращ фактор съгласно претенциите от 1 до 7.

    Приложение: 8 фигури

    Литература

    1. Carswell et al, Proc.Natl. Acad. Sci. (USA) (1975) 72: 3666.

    2. Matthews et al, Brit. J. Cancer (1981) 44: 418.

    3. Mannel et al, Infect. Immun (1980) 30:523; ibid (1981) 33:156.

    4. Stone-Wolff et al, J.Exp.Med. (1984) 159:828.

    5. Haidans et al, Infect. Immun. (1983) 42:385.

    6. Shirai, T., et al, Nature (1985) 313: 803-806.

    7. Gifford, G., et al, (persons! communication).

    8. Laemmli et al, Nature (1970) 227:680.

    9. Bolivar et al, Gene (1977) 2:95.

    10. Chang et al, Nature (1977) 198:1056.

    11. Geoddel et al,,Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057.

    12. Shimatake et al, Nature (1981) 292:128.

    13. Broach, J.R., Meth. Enz. (1983) 101:307.

    14. Stinchcomb et al, Nature (1979) 282:39.

    15. Tschempe et al, Gene (1980) 10:157.

    16. Clarke, L., et al, Meth. Enz. (1983)

    50 101:300.

    17. Hess et al, J Adv. Enzyme Reg. (1968) 7:149.

    18. Holland et al, Biochemistry (1978) 17:4900.

    19. Hitzeman et al, J. Biol. Chem. (1980) 255:2073.
20. 20. Holland, M.J., et al, J. Biol. Chem. (1981) 256:1385.
21. 21. Broach, J., et al,Gene (1978) 8:121.
22. 22. Tissue Cultures, Academic Press, Cruz and Petterson, eds. (1973).
23. 23. Fiers et al, Nature (1978) 273:113.
24. 24. Depicker, A., et al, J. Mol. Appl. Gen. (1982) 1:561.
25. 25. Cohen S.N., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1972) 69:2110.
26. 26. Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Haring Harbor Press, p254.
27. 27. Shaw, C.H., etal, Gene (1983) 23:315.
28. 28. Graham and van der Eb, Virosology (1978) 52:546.
29. 29. Van Solingen, P., et al, J. Bact. (1977) 130:946.
30. 30. Hsiao, C.L., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1979) 76:3829.
31. 31. Methods in Enzymology _1980) 65:499560.
32. 32. Matteucci et al, J.Am. Chem. Soc.

    (1981) 103:3185.
33. 33. Clewell, D.B., J.Bacteriol (1972) 110:667.
34. 34. Sanger, F., et al, Proc. Natl. Acad.

    5 Sci. (USA) (1977) 74:5463.
35. 35. Messing et al, Nucleic Acids Res. (1981) 9:309.
36. 36. Maxam et al, Methods in Enzymology (1980) 65:499.

    10
37. 37. Talmadge, K., et al., Gene (1980)

    12:235.
38. 38. Meselson, M., et al, Nature (1968) 217:1110.
39. 39. Berger, S.L., et al, Biochem (1979) 15 18:5143.
40. 40. Aviv, J., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1972) 69:1408-1412.
41. 41. Okayama, H., et al, Mol. Cell. Biol. (1983) 3:280.

    20
42. 42. Payvar, F., et al, J. Biol. Chem. (1979)

    254:7636-7642.
43. 43. Wong, Е. M., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:3570.
44. 44. Gelfand, D., et al, Proc. Natl. Acad.

    25 Sci. (USA) (1978) 75:5869.
45. 45. O’Farrell, P., et al, J. Bacteriology (1978) 134: 645-654.
46. 46. Shimatake and Rosenberg, Nature (1981) 292:128.

    Издание на Патентното ведомство на Република България София - 1113, бул. Γ. М. Димитров 52-Б

    Експерт: Д. Мирчанова

    Пор. 36681

    Редактор: В. Алтаванова

    Тираж: 40 СК cacaccctgacaagctgccaggcaggttctcttcctctcacatactgacccacggctcca ccctctctcccctgcaaaggacaccatgagcactgaaagcatgatccggcacgtgcagct

    METSarThcGluSarMETIlaArgAapValGluLau ggccgaggaggcgctccccaagaagacaggggggccccagggctccaggcggtgcttgtt

    AlaGluGluAla(.auProLyBLyBTbrGlyGlyProGlnGlySar ArgArgCyBLauPha

    CCTCAGCCTCrrClCCTTCCTGATCGTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTGCTGCA

    LauSerLauPheSerPh«LBuXl«ValAlaGlyAlaThrTbrLeuPbaCyBLcuLeuBia

    CrrTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGGGAAGAGTCCCCCAGCGACCTCTCTCTAATCAGCCC

    PhaGlyVaillaGlyProGlnArgGluGluSarPcoArgAapLauSarLauIltSarPro

    TCTGGCCCAGGCAGUCAGATCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGT LauAlaGlnAlaValArgSacSarSarArgThrPcoSarAapL^«ProValAl*ai«Val TGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAATGCCCT ValAl aABnProGlnAlaGluGlyGlnLauGlnTrpLauAanA^rgArgAlaAanAlaLeu CCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGCCTGTA LauAlaAanGlyValGluLauArgABpAanGlnLauValValProSarGluGlyLauTyr 41 46 51 56

    CCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGtGCrCCT LeuIlaTyrSarGlnValLauPheLyBClyGlnGlyCyeProBarThrHisValLauLeu 61 66 71 76

    CACCCACACCATCAGCCGCATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTCTCTGC TbrHiBThrIleSarArgIlBAlaValSacTyrGlnThrLyBValAanLeuL»uSarAla 81 66 91 96

    CATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGGTATGA IlaLyBSarProCjsGlnArgGluThrPr^GluGlyAlaGluAlaLytProTrrGlu GCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGAqCGACrCAGCGCTGAGAT PcoXleTyrLauGlyGlyValPhaGlnLeuGluLyaGlyAapArgLauSar AlaGluXle

    CAATCGGCCCGACTATCTCGACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATCATTGC ABnArgProABpTyrLauA8pPhBAl>GluStrGlyGlnValTyrPh«GlyIlaIltAl'a

    141 ‘ 146 151 156

    CCTGTGAGGAGGACGAACATCCAACCTTCCCAAACGCCTCCCCTGCCCCAATCCCTTTAT

    Leu...

    J

    TACCCCCTCCTTCAGACACCCTCAACCTCTTCTGGCTCAAAAAGAGAATTGGGGGCTTAG

    GGTCGGAACCCAAGCTTAGAACTTTAAGCAACAAGACCACCACTTCGAAACCTGGGATTC

    AGGAATGTGTGGCCTGCACAGTGAAGTGCTGGCAACCACTAAGAATTCAAACTGGGGCCT

    CCAGAACTCACTGGGGCCTACAGCTTTGATCCCTGACATCTGGAATCTGGAGACCAGGGA GCCTTTGGTTCTGGCCAGAATGCTGCAGGACTTGAGAAGACCTCACCTAGAAAWGACXC AAGTGGACCTrAGGCCTTCCTCTCTCCAGATGTrtCCAGACTTCCTTGAGACACGGAGCC CAGCCCtCCCCATGGAGCCAGCTCCCTCTATTTATGTTTGCACTTGTGATTATTrATTAT TTATTTATTATTTATTTATTTACAGATGAATGTArTTATTTGGGAGACCGGGGTATCCTG GGGGACCCAATGTAGGAGCTGCCTrGGCTCAGACATGTTTTCCGTGAAAACGGAGGCTGA

    ACAATAGGCTGTTCCCATGTAGCCCCCTGGCCTCTGTGCCTTCTTrTGATTATGTTTTTT

    AAAATATTATCTGATTAAGTTGTCTAAACAATGCTGATTTGGTGACCAACTCTCACTCAT

    TGCTGAGGCCTCCGCTCCCCAGGGAGTWTGTCTGTAATCGGCCTACTATTCAGTGGCGA

    GAAATAAAGGTTGCTTAGGAAAGAA