NO863976L - Cystein-beroevede muteiner av biologisk aktive human tumornekrosefaktorproteiner. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt området rekombinant DNA teknologi. Mere spesielt angår den mutasjonelt endrede biologisk aktive tumornekrosefaktorproteiner som skiller seg fra opphavsanalogene ved en eller flere substituenter eller utelatelser av cysteinrester. Foreliggende søknad tilsvarer EP 109.748, publisert 30. mai 1984.,

Human tumornekrosefaktor (hTNF) har vært kjent i mange år som et antitumorstoff funnet i sera fra bacillus Calmette-Guerin (BCG)-infiserte mus behandlet med endotoksin. TNF ble først rapportert av Carswell et al., Proe. Nat'l. Acad. Sei. (USA) (1975) 72:3666; og er vist å være cytotoksisk selektiv mot neoplastiske celler. TNF er renset fra celle-kultur av Matthews et al., Brit. J. Cancer (1981) 44:418 (fra mononu-kleære fagocytter avledet fra BCG-injiserte kaniner) og av Mannel et al., Infect. Immun. (1980) 30^523; ibid (1981) 33^156 fra kulturer av makrofag-anrikede peritoneale eksudatceller fra BCG-infiserte mus. Det ble angitt i EP 131.789 av 23. januar 1985 i navnet Old et al. at hTNF kunne renses fra TNF-sensitive L-M-celler avledet fra klonede museceller deponert ved ATCC under aksessnummeret L929.

I den senere tid er det rapportert at hTNF cDNA og hTNF-genet er klonet og at rekombinant hTNF er fremstilt ved bruk derav. Det skal henvises til D. Pennica et al., (1984) Nature (London) 312, 724-729;

Shirai et al., (1985) Nature (London), 313, 803-806, A.M. Wang et al.,

(1985) Science 228, 149-154 og M. Yamada et al., (1985), J. Biotechnology, 3_, 141-153. Tilsvarende beskrivelser finnes i patentlittera-turen, f.eks. EP-PS 155.549 av 29. september 1985, EP-PS 158.286 av 16. oktober 1985 og EP-PS 168.214 av 15. januar 1986. Fra disse beskrivelser er hTNF et protein som inneholder to cysteinrester. Antar man at hTNF har 157 aminosyrer (se D. Pennica et al. og A.M. Wang et al., supra), befinner cysteinrestene seg i posisjon 69 og 101. Shirai et al. og M. Yamada et al., supra, rapporterer kloning av et hTNF med 155 aminosyrer, dvs. der de første to aminosyrer Val. og Arg. mangler. For oppfinnelsens formål vil det henvises til hTNF med 157 aminosyrer. Som brukt heri angir uttrykket "hTNF", "cystein-berøvede muteiner av hTNF" og "hTNF muteiner" et protein som er fremstilt av en mikroorganisme som er transformert med en human TNF DNA sekvens eller en modifika-sjon av human TNF DNA sekvensen som koder et protein med: (a) en aminosyresekvens som er i det minste i det vesentlige identisk med aminosyresekvensen for matur nativ human tumornekrosefaktor og (b) har den biologiske aktivitet som er felles med nativ human TNF. Vesentlig identitet av aminosyresekvensene betyr at sekvensene er identiske eller skiller seg fra hverandre ved en eller flere aminosyre-endringer (utelatelser, tilføyelser eller erstatninger) som ikke forårsaker noen ugunstig funksjonell ulikhet mellom det syntetiske protein og det native human TNF. Spesifikke eksempler inkluderer N-terminal utelatelse av hTNF, der en hvilken som helst av en eller flere av de første 1-11 aminosyrer er utelatt og der de i 4-, 7- og 8-posisjon er mest foretrukket. Videre inkludert er hTNF-proteiner hvori aminosyrerestene i posisjonene 35-66, 110-133, 150-157 eller 67-109 er erstattet med andre aminosyrer eller utelatt (se EP-PS 168.214).

Tallrike biologisk aktive proteiner slik som human tumornekrosefaktor som fremstilles mikrobielt via rekombinant DNA-, rDNA-teknologi, inneholder cysteinrester som er ikke vesentlige for aktiviteten, men som er frie og kan danne uønskede intermolekylære bindinger. Et slikt protein er mikrobielt fremstilt human tumornekrosefaktor. I løpet av utviklingen av hTNF- eller rDNA-teknikker er det observert at dimerer og oligomerer av mikrobielt fremstilt hTNF dannes i E. coli-ekstrakter inneholdende høye konsentrasjoner av hTNF. Denne multimere dannelse gjør i rensingen og separeringen av hTNF meget arbeid som og tidkrevende og nødvendiggjør flere ytterligere trinn i rense- og isolasjonsprosedyren slik som å redusere proteinet under rensingen.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremstilling ved rettede mutageneseteknikker av mutasjonelt endrede biologisk aktive tumornekrosefaktorproteiner (slike proteiner kalles "muteiner", "Glossary of Genetics and Cytogenetics", 4. utg. s. 381, Springer-Verlag (1976)), som bibeholder aktiviteten til opphavsanalogene, men mangler evnen til å danne intermolekylære bindinger eller uønskede intramolekylære disulfidbindinger. Se også EP-PS 109-748 av 30. mai 1984.

Rettede mutageneseteknikker er velkjente og er beskrevet av R.F. Lather

og J.P. Lecoq i Genetic Engineering, Academic Press (1983) s. 31.50. Oligonukleotid-rettet mutagenese er spesifikt beskrevet av M. Smith og

S. Gillam i Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press

(1981) 3:1-32.

Et trekk ved oppfinnelsen er et syntetisk mutein av et biologisk aktivt hTNF-protein, idet muteinet har minst en av sine to cysteinrester fjernet eller erstattet med en annen aminosyre.

Et annet trekk ved oppfinnelsen angår syntetiske strukturelle gener med DNA-sekvenser som er spesifikt konstruert ("konstrukøtrgener") for å kode de ovenfor beskrevne syntetiske hTNF-muteiner. Undertrekk av dette trekk er eksprimeringsvektorer som inkluderer de strukturelle konstruktørgener, vertsceller eller organismer transformert med slike vektorer, og prosesser for fremstilling av det syntetiske mutein ved dyrking av slike transformanter eller deres avkom og gjenvinning av muteinet fra kulturen. Når det gjelder hTNF-muteiner som har terapeutisk anvendelse, er terapeutiske preparater som inneholder terapeutisk effektive mengder av muteinene og terapeutiske metoder, andre trekk ved oppfinnelsen.

Ytterligere et trekk ved oppfinnelsen er en fremgangsmåte for fremstilling av det ovenfor beskrevne syntetiske strukturelle gen ved oligonukleotid-rettet mutegenese omfattende følgende trinn: (a) hybridisering av enkeltstrenget DNA omfattende en streng av et strukturelt gen som koder opphavsproteinet med en mutant oligonukleotidprimer som er komplementær til en region av strengen som inkluderer kodonet for cysteinet som skal utelates eller erstattes eller anti-oppfatningstriplettene paret med kodonet, alt ettersom, bortsett fra en mistilpasning med kodonet eller anti-oppfatningstripletten, alt ettersom, som definerer en utelatelse av kodonet eller en triplett som koder nevnte andre aminosyre; (b) å utvide primeren med DNA-polymerase for å danne en mutasjonell

heterodupleks; og

(c) å replikere den mutasjonelle heterodupleks.

De mutante oligonukleotidprimere som brukes i denne prosess er et annet trekk ved oppfinnelsen.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til tegningene, der

Fig. 1 viser den komplette nukleotidsekvens av pE4 og den deduserte

aminosyresekvens; Fig. 2 viser et restriksjonskart av pE4-innskuddet; Fig. 3a og 3b viser den komplette nukleotidsekvens av innskuddet som koder det mature TNF-protein i pAW731 henholdsvis den deduserte aminosyresekvens; og

Fig. 4 viser det enkle 17.000 dalton proteinbånd som tilsvarer

ser 69 TNF i ekstraktene av klon pAW711 og klon pAW731.

Oppfinnelsen tilveiebringer: muteiner av biologisk aktive hTNF-proteiner hvori cysteinrester som er funnet å være ikke-vesentlige for biologisk aktivitet og som med vilje er utelatt eller erstattet med andre aminosyrer for å eliminere seter for intermolekylære kryssbinding; mutante gener som koder for slike muteiner; og midler for å fremstille slike muteiner.

Proteiner som mutasjonelt kan endres i henhold til oppfinnelsen kan identifiseres fra tilgjengelig informasjon méd henblikk på cysteininnholdet av biologisk aktive proteiner og de roller som spilles av cysteinrestene med henblikk på aktivitet og tertiær struktur. For proteiner for hvilke slike informasjoner ikke er tilgjengelige i litteraturen, kan informasjonen bestemmes ved systematisk å endre hver av cysteinrestene av proteinet ved de prosedyrer som her er beskrevet, og å prøve den biologiske aktivitet av de resulterende muteiner og deres tendens til å danne uønskede intermolekylære disulfidbindinger. Mens i henhold til dette oppfinnelsen er spesielt beskrevet og eksemplifisert nedenfor med henblikk på muteiner av human tumornekrosefaktor, vil det være klart at den følgende lære gjelder alle andre biologisk aktive hTNF-proteiner som inneholder funksjonelt ikke-essensielle aminosyrerester, f.eks. som

inneholder andre modifikasjoner for proteinet.

Cysteinrestene blir enten utelatt eller erstattet med aminosyrer som ikke påvirker den biologiske aktivitet for det resulterende hTNF-mutein. Egnede aminosyrerester velges blant serin, treonin, glycin, alanin, valin. leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, fenylalanin, tryptofan og metionin. Foretrukket i denne gruppe er restene av serin, treonin, alanin og valin. Spesielt foretrukket er erstatning med en serin- eller alaninrest.

Som angitt ovenfor er matur human TNF et 157 aminosyreprotein inneholdende to cysteinrester, en i 69- og den andre i 101-posisjon. Sekvensen som koder TNF fremstilt av den humane promyelocytiske leukemicellelinje (HL-60, ATCC #CCL240) er klonet og eksprimert i E. coli og er vist å ha sekvensen som angitt i fig. 1. Det henvises også til A.M. Wang et al., supra.

Slik man skal se nedenfor, synes ingen av cysteinrestene i TNF-sekvensen å være involvert i disulfidbindingene og begge kan erstattes eller utelates i henhold til oppfinnelsens metode for å oppnå et stabilt og biologisk aktivt mutein. Dette er overraskende fordi hTNF kun har de to cysteinrester som vanligvis skulle antas å være nødvendige for retensjonen av biologisk aktivitet.

Ved bruk av den oligonukleotid-rettede mutageneseprdsedyre med en syntetisk oligonukleotidprimer som er komplementær med regionen til hTNF-genet i kodonet for cys 69, men som inneholder enkelte eller flere baseendringer i dette kodon, kan et konstruktørgen fremstilles som resulterer i at cys 69 erstattes med en annen aminosyre etter valg. Når utelatelse er ønsket, mangler oligonukleotidprimeren kodonet for cys 69. Omdanning av cys 69 til nøytrale aminosyrer slik som glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, treonin og metionin er den foretrukne metode. Serin, treonin og alanin er de mest foretrukne erstatninger på grunn av deres kjemiske analogi med cystein. Når cystein utelates, er det mature mutein en aminosyre kortere enn det native opphavsprotein eller det mikrobielt fremstilte hTNF.

Størrelsen på oligonukleotidprimeren bestemmes av kravet til stabil hybridisering av primeren til regionen for genet hvori mutasjonen skal induseres, og av begrensningene på de i dag tilgjengelige metoder for syntetisering av oligonukleotider. Faktorene som må tas med i betrakt-ning ved konstruksjon av oligonukleotider for bruk i oligonukleotid-rettet mutagenese (dvs. totalstørrelse, størrelse på delene som omgir mutasjonssetet) er beskrevet av M. Smith og S. Gillam, supra. Generelt vil den totale mengde av nukleotidet være slik at man optimaliserer stabil unik hybridisering på mutasjonssetet med 5'- og 3'-utvidelser fra mutasjonssetet i tilstrekkelig størrelse til å unngå editering av mutasjonen på grunn av eksonukleaseaktiviteten til DNA-polymerase. Oligonukleotider benyttet for mutagenese ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder vanligvis fra ca. 12 til ca. 24 baser, fortrinnsvis fra ca. 14 til ca. 20 baser, og aller helst fra ca. 15 til ca. 18 baser. De vil vanligvis inneholde minst ca. tre baser 3' av det endrede eller manglende kodon.

Fremgangsmåten for fremstilling av det modifiserte IFN-3-gen involverer generelt indusering av sete-spesifikk mutagenese i hTNF-genet ved kodon 69 (TGT) ved bruk av en syntetisk nukleotidprimer som utelater kodonet eller endrer det slik at det koder for en annen aminosyre. Det skal påpekes at når utelatelse innføres, må den riktige leseramme for DNA-sekvensen opprettholdes for eksprimering av det ønskede protein.

Primeren hybridiseres til enkeltstrenget fag slik som M13, fd eller 0X174 inn i hvilket en streng av hTNF-genet er klonet. Det skal være klart at fagen kan være enten oppfattelsesstrengen eller anti-oppfattelsesstrengen til genet. Når fagen bærer anti-oppfattelsesstrengen, er primeren identisk med regionen i oppfattelsesstrengen som inneholder kodonet som skal muteres bortsett fra en mistilpasning med dette kodon som definerer en utelatelse av kodonet eller en triplett som koder for en annen aminosyre. Når fagen bærer oppfattelsesstrengen, er primeren komplementær med regionen for oppfattelsesstrengen som inneholder kodonet som skal muteres bortsett fra en egnet mistilpasning i tripletten som er paret med kodonet som skal utelates. Betingelser som kan benyttes ved hybridiseringen er beskrevet av M. Smith og S. Gillam, supra. Temperaturen vil vanligvis ligge innen området ca. 0-70° C, og fortrinnsvis ca. 10-50 °C. Etter hybridiseringen blir primeren utvidet på fag-DNA'et ved omsetning med DNA-polymerase I, T4-DNA-polymerase, revers-transkriptase eller andre egnede DNA-polymeraser. Det resulterende dsDNA omdannes til lukket sirkulært dsDNA ved behandling med en DNA-ligase slik som T4-DNA-ligase. DNA-molekyler inneholdende enkeltstrengede regioner kan ødelegges ved Sl-endonukleasebehandling.

Oligonukleotid-rettet mutagenese benyttes for å oppnå en TNF-gen som koder et mutein med TNF-aktivitet, men med cys09endret til en alternativ eller en utelatt aminosyre, og/eller der cysjgi-resten er erstattet eller utelatt. For den eksemplifiserte omdanning av cys09til serQ9, er den fortrukne oli gon uk leo tid pr ime r 5'-CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT-3'. Dette oligonukleotid har en T ...-+ A forandring i tripletten som er paret med kodon 69 i TNF-genet. På samme måte kan cysjQj omdannes til serjølmed en primer CAAGAGCCCCTCTCAGAGGGAG som inneholder en tilsvarende endring i tripletten paret med kodonet ved 101, ved bruk av ssM13 fag-DNA inneholdende den egnede streng av human TNF cDNA-sekvensen.

Den resulterende mutasjonelle heterodupleks benyttes så for å transformere en kompetent vertsorganisme eller celle. Replikasjoner av hetero-dupleksen ved verten gir avkom fra begge strenger. Etter replikering kan det mutante gen isoleres fra avkommet av den mutante streng, skytes inn i en egnet eksprimeringsvektor og vektoren benyttes for å transformere en egnet vertsorganisme eller -celle. Foretrukne vektorer er plasmider pBR322, pCRl og varianter derav, syntetiske vektorer og liknende. Egnede vertsorganismer er E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, forskjellige gjærstammer, Bacillus thermophilus, dyreceller slik som mus-, rotte- eller Kina-hamsterovarie-(CHO)-celler, planteceller, dyre- og planteverter og liknende. Det skal være klart at når en valgt vert transformeres med vektoren, blir egnede promoter-operatorsekvenser også innført for at muteinet skal eksprimeres. Vertene kan være prokaryotiske eller eukaryotiske (fremgangsmåter for innskyting av DNA i eukaryotiske celler er beskrevet i PCT søknad US81/00239 og US81/00240 av 3. september 1981). E. coli og CHO-celler

er de foretrukne verter. Muteinene som oppnås ifølge oppfinnelsen kan være glykosylerte eller ikke-glykosylerte avhengig av den glykosylering som er ønsket i muteinet. Hvis ønskelig kan ikke-glykosylert mutein

oppnådd når E. coli eller en Bacillus er vertsstammen, eventuelt glykosy-leres in vitro ved kjemiske, enzymatiske eller andre modifiseringer av kjent type.

De følgende eksempler skal illustrere oppfinnelsen nærmere. De skal ikke være begrensende. Eksemplene 1-9 beskriver fremstilling av et TNF-mutein og dennes analyse.

Fremstilling og rensing av human TNF:

1. Induksjon av TNF

Høydensitets (> 2 x 10^ celler/ml) stasjonære HL-60-celler ble sentrifugert, vasket med RPMI 1640-medium i fravær av serum og så resuspendert i en densitet på 1 x IO? celler/ml. Cellene ble så behandlet med 100 ng/ml forbolester, 12-0-tetradekanorylforbol-13-acetat (TPA) i 30 minutter ved 37 "C i en suspens jonskultur under konstant omrøring. Kulturene ble sentrifugert, supernatanten dekantert, cellene resuspendert med 1 x 10^ celler/ml i RPMI, inneholden 10 pg/ml bakteriell lipopoly-sakkarid (LPS) og 10 uM Ca ionofor (A23817) i 4 timer ved 37'C under konstant omrøring. Cellene ble spunnet ned ved 1200 omdr./min. i 10 minutter og supernatantene resentrifugert ved 8000 omdr./min. i 20 minutter. De resulterende . supernatanter ble benyttet ved renseskjemaet nedenfor å oppnå nativ TNF.

2. Rensing av TNF

Ca- 4-8 liter supernatant fremstilt fra indusert HL-60 i avsnittet ovenfor ble konsentrert via Amicon-hulfiber (1 f<2>patron; 10.000 molekylvekts-sperregrense) til ca. 300 ml. Det konsentrerte kulturfluid ble sentrifugert for å fjerne cellerester og supernatanten justert med 30 mM ammoniumbikarbonatbuffer (pH 812) til en konduktans på 6,2 mS. Oppløsningen ble ytterligere konsentrert ved ultrasentrifugering ved bruk av PM10 (Amicon)-membran og det konsentrerte fluid klaret ved sentrifugering (20.000 x g i 10 min.).

Supernatanten ble så ført på en DEAE-ionebytte r kolonne ekvilibrert i 30 mM ammoniumbikarbonat/1 mM NaCl pH 8,2, og kolonnen vasket med den samme buffer. Fraksjonene ble samlet og proteinet overvåket ved 280 nm. Disse ikke-bundne fraksjoner ble analysert ved bruk av L-929-cytotoksi sitetsanalysen og de med TNF-aktivitet samlet og konsentrert igjen ved ultrafiltrering.

Konsentratet ble påført på Sephadex G75 Superfine (Pharmacia) ekvilibrert i 30 mM ammoniumbikarbonatbuffer (pH 7,4). Ikke-bundne fraksjoner oppnådd ved vasking med den samme buffer ble overvåket ved 280 nm og analysert for TNF. Fraksjoner inneholdende topp TNF bioaktivitet ble lyofilisert.

Det lyofiliserte protein ble resuspendert i Laemmli SDS-prøvebuffer og elektroforesert på SDS-polyakrylamidgel. Gelen ble skåret til 2 mm snitt og proteinet fra hvert snitt ble eluert ved neddypping i 1 ml 30 mM ammoniumbikarbonatbuffer (pH 7,4) og rystet over natt ved romtemperatur.

Snitt inneholdende TNF-bioaktivitet ble påført på en Vydac C-4 revers-fase HPLC-kolonne ekvilibrert i 0,1% trifluoreddiksyre, TFA, og aktiviteten eluert ved bruk av en lineær gradient på 0-60% acetonitril i 0,1% TFA. Proteinet ble overvåket ved 280 nm og 214 nm og fraksjonene bioanalysert etter lyofilisering og suspendert i 30 mM ammoniumbikarbonatbuffer, pH 7,4.. Fraksjoner inneholdende TNF-aktivitet ble lyofilisert igjen.

Det resulterende protein hadde tilstrekkelig renhet til å kunne benyttes i sekvensanalyse. Sekvensen ble bestemt ved bruk av en gassfasesekvenator (Applied Biosystems Inc.). Sekvensen oppnådd fra de første 22 aminosyrer er vist nedenfor:

I tillegg ble det rensede protein fra G-75-gelen prøvet med en modifika-sjon av L-929-cytotoksisitetsanalysen ved bruk av en annen human tumor og normale cellelinjer som substrat. G-75-fraksjonene som var cytotoksiske i denne analyse mot L-929-celler var også cytotoksiske mot Hs939T (en melanomlinje), BT-20 (brystkarsinom), A427 (lungekarsinom), HT-1080 (kolonkarsinom) og HT-29 (kolonkarsinom). Disse fraksjoner var ikke cytotoksiske mot Hs939sk (hudfibroblaster), HeLa-celler (cervikal-karsinom), Hs27F (fårehudfibroblaster) eller COS7 (SV40-transformerte apeceller).

Eksempel 2

Fremstilling av kodingssekvensen

En intronløs DNA-sekvens som koder human TNF ble fremstilt ved den her beskrevne prosedyre. En human promyelocytisk leukemicelle som produserer store mengder TNF ved indusering, HL-60-linjen, tilgjengelig fra ATCC under nummeret CCL 240, benyttet som mRNA-kilde for å oppnå et cDNA-bibliotek. Ved bruk av oligomere prober konstruert på basis av proteinsekvensen bestemt fra TNF renset fra disse celler, ble dette cDNA-bibliotek probet for å tilveiebringe hele kodingssekvensen for proteinet.

1. Fremstilling av anriket mRNA

Total meddeler-RNA ble ekstrahert og renset fra HL-60-celler som følger: HL-60-celler ble indusert for TNF-produksjon som angitt i avsnitt D.l.a. og 4-timers-cellesuspensjonen høstet ved sentrifugering. Total cyto-plasmisk ribonukleinsyre (RNA) ble isolert som følger: Alle trinnene skjedde ved 4°C. Cellene ble vasket to ganger i PBS (fosfatbufret saltoppløsning) og resuspendert i IHB (140 mM NaCl, 10 mM Tris, 1,5 mM MgCl2, pH 8) inneholdende 10 mM vanadyladenosinkompleks (S.L. Berger et al., Biochem. (1979) 18:5143).

En ikke-ionisk detergens av etylenoksydpolymertypen, NP-40, ble tilsatt til 0,3% for å lysere de cellulære, men ikke nukleære membraner. Kjernene ble fjernet ved sentrifugering ved 1000 x g i 10 minutter. Den post-nukleære supernatant ble tilsatt til et likt volum TE (10 mM Tris, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), pH 7,5) mettet fenol/kloroform (1:1) inneholdende 0,5% natriumdodecylsulfat (SDS) og 10 mM EDTA. Supernatanten ble ekstrahert igjen fire ganger og faseseparert ved sentrifugering ved 2000 x g i 10 minutter. RNA ble felt ut ved justering av prøven til 0,25 M NaCl, tilsetning av 2 volumer 100% etanol og lagring ved -20 °C. RNA ble pelletisert ved 5000 x g i 30 minutter, vasket med 70% og 100% etanol og tørket. Polyadenylert (poly A<+>) meddeler-RNA, mRNA, ble oppnådd fra det totale cytoplasmiske RNA ved kromatografi på oligo-dT-cellulose (J. Aviv et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1972) 69^1408-1412). Dette RNA ble oppløst i ETS (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% SDS, pH 7,5) ved en konsentrasjon på 2 mg/ml. Denne oppløsning ble oppvarmet til 65 °C i 5 minutter, så hurtig avkjølt til 4"C. Etter at RNA-oppløsningen var brakt til romtemperatur ble den justert til 0,4 M NaCl og langsomt ført gjennom en oligo-dT-cellulosekolonne som på forhånd var ekvilibrert med en bindende buffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5). Gjennomløpet ble ført over kolonnen to ganger til, og kolonnen vasket med 10 volumer bindende buffer. Poly A<+>mRNA ble eluert med aliquoter av ETS, ekstrahert en gang med TE-mettet fenolkloroform og felt ut ved tilsetning av NaCl til 0,2 M og 2 volumer 100% etanol. RNA ble felt ut igjen to ganger, vasket en gang i 70% og så i 100% etanol før tørking.

Dette poly A<+>mRNA ble fraksjonert på en sukrosegradient i 10 mM Tris-HC1, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl og 0,1% SDS. Etter sentrifugering i en Beckman SW40-rotor ved 38000 omdr./min. i 17 timer ble mRNA-fraksjonene gjenvunnet fra gradienten ved etanolutf elling. Fraksjonene inneholdende TNF mRNA ble identifisert ved injisering av mRNA i oocytter og analysering av oocyttekstraktene for cytotoksisk aktivitet. Fraksjoner inneholdende toppaktivitet ble samlet for bruk i cDNA-bibliotekskonstruksjoner.

2. Konstruksjon av et cDNA- bibliotek

cDNA ble fremstilt fra en anriket 16 S mRNA-fraksjon ved bruk av oligo-dT-priming av poly A-halene og AMV-revers transkriptase ved bruk av metoden ifølge H. Okayama et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3^280. Denne metode resulterer i en høyere andel fullengdekloner og benytter effektivt som vertsvektor andeler av to vektorer som der beskrives og som lett kan oppnås fra forfatterne, pcDVl og pLl. De resulterende vektorer inneholder innskuddet mellom vektor fragmenter inneholdende proksimale BamHI- og Xhol-restriksjonsseter; vektoren inneholder pBR322 replika-sjonsopprinnelsen og Amp-resistansegenet.

Andre metoder for fremstilling av cDNA-biblioteker er selvfølgelig velkjente. En, nå klassisk metode, bruker oligo-dT-primer, revers transkriptase, haling av den dobbeltstrengede cDNA med poly dG og sammenføyning til en egnet vektor slik som pBR322 eller et derivat derav som er spaltet ved det ønskede restriksjonssete og halet med poly dC. En detaljert beskrivelse av denne alternative metode finnes f.eks. i US-PS 4.578.584.

I den her benyttede metode ble 5 pg anriket mRNA denaturert ved behandling med 10 mM metylkvikksølv ved 22° c i 5 minutter og detoksi-fisert ved tilsetning av 100 mM 2-merkaptoetanol (F. Payvar et al., J. Biol. Chem (1979) 254:7636-7642). Plasmid-pcDVl ble spaltet med Kpnl, halehengt med dTTP og føyet til det denaturerte mRNA. Dette oligo-dT-primede mRNA ble behandlet med revers transskriptase og den ferdig syntetiserte DNA-streng halehengt med dCTP. Til slutt ble den uønskede del av pcDVl-vektoren fjernet ved spalting med Hindlll. Separat ble pLl spaltet med Pstl, halehengt med dGTP, spaltet med Hindlll og så blandet med poly-T-halehengte mRNA/cDNA-kompleks utvidet med pcDVl-vektorfragmentet, ligert med E. coli-ligase og blandingen behandlet med DNA-polymerase I (Klenow) E. coli-ligase og RNase H. De resulterende vektorer transformeres i E.. coli K12 MM294 til Amp^.

3. Seleksjon av probe

Oligomerer komplementære med kodingssekvensen for aminosyrer 8-12 i den rensede TNF-sekvens ble fremstilt. På grunn av kodonrikelighet finnes det tilsammen seksifire 14-merer som kandidater for komplemen-tering til meddeleren som koder denne del. Alle sekstifire 14-merer ble fremstilt og delt i fire grupper av 16. Hver gruppe ble blandet med det sukrosegradientstørrelsesfraksjonerte, anrikede mRNA-preparat, fremstilt som ovenfor, og blandingen ble injisert i oocytt-translateringssystemet. Kontroller ble kjørt ved bruk av ikke-omsatt meddeler-RNA. Proteinene som ble fremstilt i oocyttsystemet ble underkastet L-929-cytotoksisitetsanalysen (^S-frigjøring), og proteinene avledet fra oocyttene injisert med kontroll og med en blanding av mRNA med tre av oligomergruppene viste aktivitet. I denne "hybridarrest"-analyse var kun oocytten injisert med meddeleren som var behandlet med gruppen med sekvensen inaktiv. Spesifisiteten for denne oligomergruppe ble ytterligere bestemt ved "dot blot"-hybridisering med anriket mRNA fremstilt som ovenfor både fra induserte og ikke-induserte HL-60-celler, så vel som den tilsvarende mRNA-fraksjon oppnådd fra celler kjent å være produsenter av lymfotoksin. Denne gruppe hybridiserte godt til det induserte mRNA, men hybridiserte ikke med de tilsvarende fraksjoner fra ikke-induserte eller lymfotoksin-produserende celler. Imidlertid vist Northern-blot-prøver ble bruk av den kinaserte gruppe som probe at den inneholdt sekvenser som krysshybridiserte til den 18S (ribosomale) RNA-fraksjon og til pBR322

DNA.

Den vellykkede gruppe ble derfor ytterligere fraksjonert ved syntese av deltakerne som åtte par 14-merer, hver av hvilke ble benyttet i "hybrid-arrest"-analysen angitt som ovenfor. Kun paret med sekvensen

inhiberte syntesen av TNF i oocyttene. Dot-blot-forsøk ved bruk av den fraksjonerte, induserte HL-60 mRNA-fraksjonen induserte total HL-60 poly A<+>RNA, uindusert HL-60 poly A<+>RNA og pBR322 DNA bekreftet spesifisiteten for det foregående 14-mer-par og den manglende evne for de gjenværende par til hybridisere til den ønskede meddeler.

4. Gjenvinning av kodingssekvensen

cDNA-biblioteket ble probet med 14-mer-paret som identifisert ovenfor.

28 kolonier som hybridiserte med proben ble plukket ut, dyrket og plasmid-DNA isolert. Plasmidet inneholdende innskudd av tilstrekkelig lengde til å kode hele sekvensen ble valgt og flere ble undersøkt for korrekt sekvens ved bruk av hybridtranslatering i kombinasjon med ^S-frigjøringsversjonen av cytotoksisitetsanalysen som beskrevet nedenfor. Hybridtranslateringsanalyser benytter prøvesekvensen for å oppnå den korrekte mRNA fra ikke-fraksjonerte preparater som verifisert ved analysering av proteinet produsert ved oocytt-translateringssystemet injisert med den gjenvunne meddeler.

Plasmid-cDNA som skal behandles bindes til filteret og filteret behandlet med poly A<+>RNA isolert fra induserte HL-60-celler. Filtrene elueres så og eluatene injiseres i oocytt-translateringssystemet. Oocyttene ekstra-heres for protein som så prøves i<35>s_versjonen av L-929-cytotoksisitetsanalysen. Resultatene for flere hybridiserende kloner, kalt E2-E4, E6 og E8, er vist nedenfor:

Restriksjonsanalyse og partiell sekvensering av innskuddene antydet at to kandidatplasmider, pE4 og pBll, sannsynligvis hadde den totale TNF-kodende sekvens. Resultatene av denne analyse for pE4 er vist i fig. 19. pE4 er deponert hos ATCC 15. oktober 1984 under nummeret 39.894.

pE4 ble sekvensert og den korrekte leseramme for TNF identifisert ved tilpasning av aminosyresekvensen dedusert fra translatering av alle tre mulige leserammer med den kjente N-terminalsekvens for det native mature TNF som bestemt ved N-terminalsekvensering av det rensede protein, se fig. 18. Aminosyrene i det mature protein er nummerert ut fra valin i posisjon 1. Som angitt ovenfor var homologien ikke total. Imidlertid antydet den høye homologigrad at det korrekte cDNA var valgt. Verifisering av de eksperimentelt bestemte restriksjonsspaltnings-

seter vist i fig. 19 vises også. Hindlll-setet oppstrøms 3' Pstl-setet i 1,1 kb Pstl-fragmentet er nedstrøms stoppkodonet og tillater således utskjæring av kodingssekvensen som en Hindlll-kassett etter modifisering av oppstrøms regionen som beskrevet nedenfor. 5. Karakteristika for human TNF, bestemt fra DNA- sekvensen Som dedusert fra cDNA-sekvensen som angitt i fig. 18, inneholder det mature TNF-protein 157 aminosyrerester og har en molekylvekt uten glykosylering på ca. 17.354. Ledersekvensen inneholder tilsynelatende grovt regnet 76 aminosyrer ut fra den første tilgjengelige Met-startkodon. Det er to cysteinrester, i posisjonene 69 og 101.

Eksempel 3

Modifisering av de N- terminale kodoner i pE4

Det var hensiktsmessig ved gjennomføring av eksprimeringen av det mature protein, å innføre et ATG-startkodon umiddelbart foran GTC-sekvensen som kodet N-terminal valin i det mature protein (angitt med 1

i fig. 18), så vel som å tilveiebringe et Hindlll-sete umiddelbart oppstrøms ATG for ligering til egnede vertseksprimeringsvektorer. Dette ble gjennomført ved sete-rettet mutagenese på en måte analogt det som er beskrevet i eksemplene 1, 2, og 5 i US-PS 4.578.584.

DNA-fragmentet inneholdende oppstrømsdelen av kodingssekvensen ble skåret ut fra pE4 ved nedbrytning med Pstl, isolert- ved agarosegel-elektroforese, fjernet ved elektroeluering og ligert inn i Pstl-setet av bakteriofag M13mpl8.

Den ligerte fag ble transdusert inn i frossen kompetent E. coli K12-stamme DG 98 (ATCC #39768) og dyrket ved platering på media inneholdende 5 x 10~<4>M isopropyltiogalaktosid (IPTG) oppnådd fra Sigma Chem. (St. Louis, Missouri) og 40 pg/ml X-gal. Ikke a-komplementerende hvite plaquer.ble plukket ut på friskt media. Minikulturer ble undersøkt for rekombinant enkeltstrenget fag-DNA inneholdende innskudd av den 1,1 kb forventede størrelse. Strukturen for den ønskede rekombinante fag,

kalt klon 4,1, ble bekreftet ved restriksjonsanalyse.

En kjemisk syntetisert, renset, 33-mer oligodeoksyribonukleotid med

sekvensen:

5'-GAAGATGATCTGACCATAAGCTTTGCCTGGGCC-3'

for å innføre Hindlll-restriksjonsenzymsetet og et ATG-initieringskodon før GTC-kodonet som koder for den første aminosyre, valin, i det mature TNF-protein.

10 picomol oligonukleotid ble hybridisert til 2,6 Mg ss-klon 4,1 DNA i 15

ul av en blanding bestående av 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9,

20 mM MgCP?og 20 mM e-merkaptoetanol ved oppvarming til 67*C i 5 minutter og 42°C i 25 minutter. De sammenføyde blandinger ble avkjølt på

is og så justert til et sluttvolum på 25 pl med en reaksjonsblanding bestående av 0,5 mM av hver dNTP, 17 mM Tris-HCl, pH 7,9, 17 mM MgCP), 83 mM NaCl, 17 mM p-merkaptoetanol, 5 enheter DNA-polymerase

I Klenow-fragment, inkubert ved 37°C i en time. Reaksjonene ble avsluttet ved oppvarming til 80 °c og reaksjonsblandingen benyttet til å transformere kompetente DG98-celler, platert på agarplater og inkubert over natt for å oppnå fagplaquer.

Plater inneholdende mutageniserte klon 4.1 plaquer så vel som to plater inneholdende ikke-mutagenisert klon 4.1 fagplaquer ble avkjølt til 4°C og fragplaquene fra hver plate ble overført til to nitrocellulosefiltersirkler ved besjiktning av et tørrfilter på agarplaten i 5 minutter for det første filter og 15 minutter for det andre filter. Filtrene ble så anbrakt på tykke filterpapirer dynket i 0,2 N NaOH, 1,5 M NaCl og 0,2% Triton

X-100 i 5 minutter og nøytralisert ved besjiktning på filterpapirer dynket med 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 og 1,5 M NaCl i ytterligere 5 minutter. Filtrene ble vasket på tilsvarende måte to ganger på filtre dynket i 2 x SSC, tørket og så varmebehandlet i en vakuumovn ved 80 °C i 2 timer. Duplikatfiltrene ble pre-hybridisert ved 42 °C i 4 timer med 10 ml pr. filter DNA-hybridiseringsbuffer (5 x SSC, pH 7,0, 4 x Denhardts oppløsning (polyvinylpyrrolidin, ficoll og bovinserumalbumin, lx = 0,02% hver), 0,1% SDS, 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0 og 100 ug/ml denaturert laksesperma DNA. ^p<->meri^e prober ble preparert ved kinasering av primeren med merkedet ATP. Filtrene ble hybridisert til 5

x 10^ cpm/ml med<32p_>merket primer i 1-5 ml pr. filter og DNA-hybridiseringsbuffer ved 64 °C i 8 timer.

Filtrene ble vasket en gang ved romtemperatur i 10 minutter i 0,1% SDS, 20 mM natriumfosfat (buffer) og 6 x SSC; en gang ved 37"C i 20 minutter i buffer og 2 x SSC; en gang ved 50"C i 20 minutter i buffer og 2 x SSC og til slutt ved 60'c i 20 minutter i buffer og 1 x SSC. Filtrene ble lufttørket og autoradiografert ved -70"C i 4 timer.

Fordi oligonukleotidprimeren var konstruert for å danne et nytt Hindlll-restriksjonssete i de mutageniserte kloner, ble RF-DNA fra et antall av klonene som hybridiserte med primeren brutt ned med dette restriksjonsenzym. En av de mutageniserte klon 4.1 plaquer som hadde et nytt Hindlll-restriksjonssete (M13-AW701) ble plukket ut og inokulert til en kultur av DG98, ssDNA ble fremstilt fra kultursupernatanten og dsRF-DNA ble fremstilt fra cellepelleten. Den korrekte sekvens bekreftes ved dideoksysekvensering.

De korrekt syntetiserte strenger ble isolert og spaltet med Pstl og Hindlll (partielt) eller med Hindlll alene for ligering til eksprimeringsvektorer.

Eksempel 4

Eksprimering av TNF

For prokaryotisk eksprimering ble kodingssekvensen (sammen med noe 3' ikke-translaterte nukleotider) skåret ut fra dsM13-AW701 på to måter: Ved den første metode ble dsM13-AW701 brutt ned med Pstl og så brutt ned partielt med Hindlll for å oppnå HindlH-Pstl TNF-kodingssekvensen.

(Partiell Hindlll-nedbrytning er nødvendig fordi det er flere Hindlll-seter i M13-AW701.) Den partielle nedbrytning av DNA-fragmentet kan oppnås ved å benytte en tiendedel av mengden av restriksjonsenzym som er nødvendig for total nedbrytning av DNA. Blandingen ble inkubert ved den riktige temperatur for enzymet og aliquoter av nedbrytningsblandingen ble fjernet i 10 minutters intervaller opptil en time. Aliquotene ble så fylt på en gel og DNA-fragmentene analysert. Tidspunktet som ga det høyeste utbytte for DNA-fragmentet ble valgt som preparativ nedbrytning med restriksjonsenzymet og det egnede fragment ble renset fra gelen ved elektroeluering.

Pstl/BamHI-fragmentet inneholdende 3'-ikke-kodende sekvens av TNF-genet (se fig. 2) ble renset fra pE4 etter nedbrytning av DNA med enzymene Pstl og BamHI.

Sammen omfattet Hindlll/Pstl- og Pstl/BamHI-fragmentene kodingssekvensen pluss en 600 bp 3'-ikke-translatert andel DNA. De to fragmentene ble ligert til Hindlll/BamHI nedbrutt vertsvektor pTRP3 som følger: pTRP3 (ATCC 39.946) inneholder E. coli trp-promoteren og ribosom-bindingssetet. pTRP3 ble brutt ned med Hindlll og BamHI og vektor-fragmentet renset på agarosegel. Det isolerte fragment ble så ligert med de ovenfor angitte Hindlll/Pstl- og Pstl/BamHI-segmenter i en 3-veisligering og blandingen ble benyttet for å transformere E. coli MM294

til Amp<R>, noe som ga pAW701.

I en andre metode ble dsM13-AW701 brutt ned med Hindlll og fragmentet inneholdende genet isolert på agarosegel. Det isolerte fragment ble ligert med Hindlll spaltet BAPped pTRP3 og transformert inn i E.

coli MM294 for å oppnå pAW702.

pFC54.t (ATCC 39.789) eller pPLOP (ATCC 39.947) inneholden PL-promoteren og bacillus-positive retroregulatorisk sekvens kan også benyttes som vertsvektorer. Disse vektorer brytes ned med Hindlll og BamHI og de store plasmidfragmenter inneholdende kontrollsekvensene renset på agarosegel. Hindlll/Pstl- og Pstl/BamHI-porsjoner av TNF-genet, fremstilt som angitt ovenfor, ligeres i en treveisligering inn i Hindlll- og BamHI-seter i disse vektorer, noe som resulterer i plasmidene pAW711 henholdsvis pAW712. Alternativ ligeres renset Hindlll-fragment fra mutagenisert pE4 inn i Hindlll-spaltet BAPped pFC54.t eller pPLOP

for å gi pAW713 henholdsvis pAW714. Plasmid pAW711 er deponert hos ATCC 8. november 1984 under nummeret 39.918.

pAW701 og pAW702 ble overført til E. coli MM294 og kulturene dyrket under betingelser som undertrykket trp-promoteren. Ved induksjon med tryptofan-utarming ble fremstillingen av TNF initiert. På analog måte ble pAW711 konstruert og overført til E. coli MC1000-39531 og cellene ble

indusert ved høy temperatur. Etter flere timers dyrking under induk-sjonsbetingelser ble cellene sonikert og sonikatene verifisert til å inneholde TNF ved L-929-cytotoksisitetsanalysen. Resultatene er:

Enheter av TNF-aktivitetene er som angitt nedenfor i eksempel 9.

Vektor pBll isolert fra cDNA-bibliotek et ovenfor inneholder SV40-promoteren i virksom forbindelse til TNF-kodingssekvensen. Alle de 28 positivt hybridiserende kolonier skulle forventes å inneholde denne binding inkludert spesielt pE4 og pBll, og er således i stand til å eksprimere egnede pattedyrverter. I henhold til dette ble pBll benyttet for å transformere COS-7-apenyreceller og cellene dyrket under betingelser som bevirket induksjon av SV40-promoteren. Da signal-sekvensen fremdeles er tilstede i pBll og virker i pattedyrcellesystemer ble TNF sekretert inn i mediet. TNF ble analysert i supernatanten over de monobesjiktede COS-7-celler ved ^S-frigivelse fra L-929-celler, med de følgende resultater:

Eksempel 5

Fremstilling av kodingssekvens og eksprimeringsvektorer for TNF-muteiner

Klon 4.1, fremstilt ved Pstl-behandling av pE4 som beskrevet i eksempel 23, ble underkasett setespesifikk mutagenese i det vesentlige som beskrevet i eksempel 23, men, ved som primer å benytte

5'-CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT-3' som er komplementær med sekvensen ved siden av cysteinet i posisjon 69, men inneholder nukleotider komplementære til den kodon for å bevirke endring fra TGC til AGC. Mutageni-

serte plaquer ble identifisert og bekreftet ved sekvensering som beskrevet ovenfor. En plaque inneholdende den ønskede mutasjon, MP-AW731, ble brutt ned med Aval og Pstl og fragmentet ligert inn Pstl/Aval nedbrutt pAW711. Ligeringsblandingen ble overført inn i E. coli MC1000-39531 til Amp<R>og transformantene bedømt med primerproben for korrekt sekvens. En koloni kalt pAW731 ble benyttet- for eksprimering av den modifiserte sekvens. pAW731 er deponert ved ATCC 25. januar 1985

og har aksessnummeret 53.007.

På analog måte ble pAW741, en eksprimeringsvektor for serjQj TNF fremstilt ved bruk av primeren CAAGAGCCCCTCTCAGAGGGAG.

Eksempel 6

Eksprimering av kodingssekvensen for og aktiviteten til TNF- muteinet

E. coli MC1000-39531 rommende pAW731 ble dyrket og induset ved høy temperatur som angitt i eksempel 24. Sonikatene fra de induserte celler ble analysert og funnet å ha omtrent den samme TNF-aktiviet pr. ml som pAW711-transformantene. Imidlertid viste SDS-analyse at mengden 17 kD TNF-protein i disse ekstrakter er ca. fem ganger mindre, noe som viser

at den spesifikke aktivitet for Ser0o. TNF er høyere enn den til det naturlige eller vild-type rekombinant TNF-proteinet.

Eksempel 7 Eksprimering av kodingssekvensen for rekombinant Ser^o, human TNF-mutein

Plasmid pAW731 (ser^oj brytes ned med Hindlll og HincII, og det lille Hindlll-HincII-fragment inneholdende ser09~mutasjonen renses på agarosegel. På samme måte blir plasmid pAW732 (serjgi) brutt ned med enzymene HincII og BamHI, og HincII-BamHI-fragment inneholdende ser101 -mutasjonen renses. Det tidligere rensede Hindlll-BanHI-vektor-fragment fra pFC54.t blir så ligert med Hindlll-HincII (ser^)-fragmentet og HincII-BamHI (serjoi)-fragmentet for å danne ser^serjqi TNF-klon, pAW735. Dette dimutein, se^serjoi TNF, dimeriserer mindre sannsynlig ved rensing på grunn av fraværet av fritt cystein.

Eksempel 8

Cysteinrester i nativ- eller vild- type human TNF er ikke nødvendig for biologisk aktivitet

95% ren ikke-endret protein ble redusert og alkylert ved behandling med DTT og jodacetat i henhold til protokollen som angitt nedenfor. Mens det ikke-behandlede protein hadde en aktivitet i enheter/ml på 2,6 x IO<4>, redusert, eller redusert alkylert protein hadde aktiviteter på 4,4-4,8 x IO<4>enheter/ml.

De ovenfor viste data viser at cysteiner i vild-type rekombinant human TNF ikke er nødvendig for biologisk aktivitet og således kan en eller begge cysteiner utelates eller erstattes med en annen aminosyre som angitt innenfor oppfinnelsens ramme.

Eksempel 9

Cytotoksisk analyseprosedyre for TNF

L-929-analysesystemet er en forbedret hensiktsmessig in vitro-analyse som tillater hurtig måling av TNF-aktivitet. Korrelasjonsgraden med in vivo-tumornekroseanalyse ifølge Carswell ovenfor er i dag ukjent; da den imidlertid benytter murine tumorceller spesifikt, antas korrelasjonen å være høy. Proteinet kalt lymfotoksin i EPO publikasjon 0100641 gir også aktivitet i denne analyse. Analysen er i konsept lik det som beskrives i US-PS 4.457.916 som benyttet murine L-M-celler og metylen-blå-flekking. Imidlertid er L-929-analysen heri vist å korrelere (for HL-60-avledet TNF) med human tumorcellelinjecytotoksisiteten.

I L-929-analysesystemet blir L-929-celler prepararert over natt som monosjikt i mikrotiterplater. Testprøvene fortynnes to ganger på kryss av platen, UV bestråles og tilsettes så på de preparerte cellemonosjikt. Kulturmedia i brønnene bringes så til 1 jig/ml aktinomycin D. Platene tillates å inkubere 18 timer ved 37 "C og platene bedømmes visuelt under mikroskopet. Hver brønn gis en 25, 50, 75 eller 100% bedømmelse som antyder graden av celledød i brønnen. En enhet TNF-aktivitet defineres som de resiproke av fortynningen ved hvilken 50% avlivning skjer.

I tillegg ble det utviklet en mere sensitiv versjon av denne analyse som overvåker frigivelsen av 35S -merkede peptider fra på forhånd merkede celler, når de behandles med testprøven og aktinomycin D. Denne analyseversjon kan benyttes for å kvantifisere potensen, dvs. for å bedømme den relative potens av oocytt-translatert materiale. Kort sagt blir aktivt voksne L-929-kulturer merket med<35>s-metionin (200 MCi/ml) i 3 timer i metioninfrie media supplementert med 2% dialyserte fetalt kalveserum. Cellene blir så vasket og platert i 96 brønners plater, inkubert over natt og behandlet den neste dag med to gangers fortyn-ninger av testprøvene og 1 ug/ml aktinomycin D. Kulturene ble så inkubert ved 37°C i 18 timer. 100 pl supernatantaliquoter fra hver brønn ble så transformert til en annen 96 brønners plate, syre (TCA) presipitert og høstet på glassfiberfiltre. Filtrene ble vasket med 95% etanol, tørket og tellet. En NP40detergentkontroll inkluderes i hver analyse for å måle maksimal frigivelse av radioaktivitet fra cellene. Prosentual 35S -frigivelse beregnes så ved forholdet mellom differansen i telling mellom de behandlede celler og ubehandlede kontroller dividert med differansen mellom NP4Qbehandlede celler og ubehandlede celler, dvs. ved forholdet:

Høyere TNF-potens resulterer i høyere verdier for dette forhold.

TNF-muteinene ifølge oppfinnelsen formuleres hensiktsmessig til egnede terapeutiske formuleringer som typisk inkluderer en terapeutisk effektiv mengde av muteinet og en egnet fysiologisk aksepterbar bærer som beskrevet ovenfor med henblikk på IL-2-muteiner. Alternativt kan andre cytotoksiske, antivirale eller anti-cancermidler benyttes i kombinasjon

med TNF-muteinene ifølge oppfinnelsen slik som -y-interferon.

Den 15. oktober 1984 deponerte søkeren det her beskrevne plasmid pE4 hos ATCC under nummeret 39.894. Den 8. november 1984 ble pAW711 deponert hos ATCC under nummeret 39.918. Den 25. januar 1985 ble pAW731 deponert hos ATCC under nummeret 53.007. Disse deponeringer skjedde under Budapest-avtalens regelverk. Dette sikrer 30 års opprett-holdelse av levedyktige kulturer. Organismene gjøres tilgjengelige av ATCC under Budapest-avtalens regelverk og som sikrer ubegrenset tilgjengelig ved utstedelse av det relevante US patentet. Denne til-gjengelighet skal ikke anses som en tillatelse til å praktisere oppfinnelsen mot de rettigheter som garanteres under enhver regjerings regelverk i henhold til dette lands patentlover.

Det skal være klart at variasjoner og modifiseringer kan gjennomføres uten å gå utenfor oppfinnelsens ramme slik den er definert i de ledsagende krav.

Claims (44)

1. Syntetisk mutein av et biologisk aktivt humant tumornekrosefaktor-protein, karakterisert ved at proteinet har minst en cysteinrest som er fri for å danne en disulfidbinding og er ikke essensiell for den biologiske aktivitet, idet muteinet har minst en av de nevnte cysteinrester fjernet eller erstattet av en annen aminosyre.

2. Mutein ifølge krav 1, karakterisert ved at det kun er en av de nevnte cysteinrester.

3. Mutein ifølge krav 1, karakterisert ved at cysteinrestene er erstattet av serin, treonin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, fenylalanin, tryptofan eller metionin.

4. Mutein ifølge krav 1, karakterisert ved at cysteinrestene er erstattet med serin, treonin eller alanin.

5. Mutein ifølge krav 1, karakterisert ved at muteinet er ikke-glykosylert.

6. Mutein ifølgekrav 1, karakterisert ved at cysteinresten i posisjon 69 er erstattet.

7. Mutein ifølge krav 1, karakterisert ved at cysteinresten i posisjon 101 er erstattet.

8. Mutein ifølge krav 1, karakterisert ved at cysteinresten i posisjonene 69 og 101 er erstattet.

9. Mutein ifølge krav 8, karakterisert ved at cysteinrestene er erstattet av rester valgt blant serin, valin, alanin og treonin.

10. Mutein ifølge krav 9, karakterisert ved at cysteinresten er erstattet med en serinrest.

11. Mutein ifølge krav 3, karakterisert ved at proteinet er TNF og at cysteinresten i posisjon 101 er erstattet av en serinrest.

12. Mutein ifølge krav 11, karakterisert ved at cysteinresten er erstattet av rester valgt blant serin, valin, alanin og treonin.

13. Mutein ifølge krav 12, karakterisert ved at cysteinresten er erstattet av en serinrest.

14. Mutein ifølge krav 3, karakterisert ved at proteinet er TNF, og at hver av posisjonene 69 og 101 i TNF uavhengig er erstattet.

15. Mutein ifølge krav 14, karakterisert ved at hver cysteinrest uavhengig ér erstattet av en rest valgt blant serin, valin, alanin og treonin.

16. Mutein ifølge krav 15, karakterisert ved at hver cysteinrest er erstattet av en serinrest.

17. Struturelt gen, karakterisert ved å ha en DNA-sekvens som koder det syntetiske mutein ifølge krav 1,1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller 10.

18. Eksprimeringsvektor, karakterisert ved at den inkluderer det strukturelle gen ifølge krav 17 i en posisjon som tillater eksprimering derav.

19. Vertscelle eller organisme transformert med eksprimeringsvektoren ifølge krav 18 eller avkommet derav.

20. E. coli transformert med eksprimeringsvektoren ifølge krav 18 og avkommet derav.

21. Fremgangsmåte for fremstilling av et syntetisk mutein, karakterisert ved at den omfatter å dyrke verten eller avkommet ifølge krav 19 og å høste det syntetiske mutein fra kulturen.

22. Fremgangsmåte for å forhindre et protein med minst en cysteinrest som er fri til å danne en disulfidbinding fra å danne en slik binding, karakterisert ved at den omfatter mutasjonelt å endre proteinet ved å utelate cysteinresten eller ved å erstatte denne med en annen aminosyre.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at proteinet er biologisk aktivt og cysteinet ikke er vesentlig for den biologiske aktivitet.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 22, karakterisert ved at cysteinresten erstattes med serin eller treonin.

25. Fremgangsmåte for fremstilling av genet ifølge krav 17, karakterisert ved at den omfatter: (a) å hybridisere enkeltstrenget DNA omfattende en streng av et strukturelt gen som koder opphavsproteinet med en mutant oligonukleotidprimer som er komplementær til en region av strengen som inkluderer kodonet for cysteinet som skal utelates eller erstattes eller anti-oppfatningstriplettene paret med kodonet, alt ettersom, bortsett fra en mistilpasning med kodonet eller anti-oppfatningstripletten, alt ettersom, som definerer en utelatelse av kodonet eller en triplett som koder nevnte andre aminosyre; (b) å utvide primeren med DNA-polymerase for å danne en mutasjonell heterodupleks; og (c) å replikere den mutasjonelle heterodupleks.

26. Fremgangsmåte ifølge krav .25, karakterisert ved at mistilpasningen definerer en triplett som koder for serin eller treonin.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at det enkeltstrengede DNA er en enkeltstrenget fag som inkluderer strengen og den mutasjonelle heterodupleks ifølge trinn (b), omdannes til en lukket sirkulær heterodupleks.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at replikeringen gjennomføres med transformering av en kompetent bakteriell vert med den lukkede sirkulære heterodupleks og dyrking av de resulterende transformanter.

29. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at den omfatter videre å isolere avkommet av mutantstrengen av hetero-dupleksen, isolering av DNA fra avkommet og isolering av genet fra DNA fra avkommet. s

30. Fremgangsmåte ifølge krav 25, 26, 27, 28 eller 29, karakterisert ved at proteinet er human TNF, cysteinresten i posisjon 69 og mistilpasningen definerer en kodon for serin.

31. Fremgangsmåte ifølge krav 30, karakterisert ved at strengen er oppfatningsstrengen av TNF og at den mutante oligo-nukleotide primer er 5'-CATGGGTGCTCGGGCTGCCTT-3\

32. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at proteinet er human TNF, at cysteinresten er i posisjon 101 og at mistilpasningen definerer en kodon som koder for serin.

33. Oligonukleotid for anvendelse ved fremstilling av det strukturelle gen ifølge krav 17 ved oligonukleotid-rettet mutagenese, karakterisert ved at det har en nukleotidsekvens som er komplementær til en region av strengen av det strukturelle gen som inkluderer kodonet for cysteinresten eller anti-oppfatningstripletten paret med kodonet alt ettersom, bortsett fra en mistilpasning med nevnte kodon som definerer en utelatelse av kodonet eller en triplett som koder for den andre aminosyre.

34. Terapeutisk preparat med TNF-aktivitet, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av det syntetiske mutein ifølge krav 7, 8 eller 14, blandet med en farmasøytisk akseptabel bærer.

35. Terapeutisk preparat med TNF-aktivitet, karakterisert ved at det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av det syntetiske mutein ifølge krav 14, blandet med en farmasøytisk akseptabel bærer.

36. Plasmid valgt blant gruppen pAW731, pAW741 og pAW735.

37. Bakterie transformert med plasmider ifølge krav 36 og avkom derav.

38. Bakterie ifølge krav 37, karakterisert ved at den er E. coli.

39. Human rekombinant ser69 tumornekrosefaktor (TNF)-mutein.

40. Hman rekombinant serlOl tumorneksorfaktor(TNF)-mutein.

41. Human rekombinant ser69 serlOl tumornekrosefaktor(TNF)-mutein.

42. Fremgangsmåte for behandling av en pasient for en kreftsykdom omfattende å administrere til pasienten en kreftinhiberende mengde av muteinet ifølge kravene 1, 39, 40 eller 41.

43. Terapeutisk formulering, karakterisert ved at den omfatter en effektiv mengde av muteinet ifølge krav 1, 39, 40 eller 41 og minst en annen anti-kreft- eller anti-viral forbindelse.

44. Formulering ifølge krav 43, karakterisert ved at den anti-kreft- eller anti-virale forbindelse er" y-interferon.