DK171681B1 - DNA-sekvens, der koder for et modificeret human-beta-interferonprotein (IFN-beta), hvori 17-cysteinresten er udskiftet med en anden aminosyrerest, ekspressionsvektor indeholdende DNA-sekvensen, værtcelle, der er transpormeret med ekspressionsvektorer samt fremgangsmåde til fremstilling af det modificerede protein - Google Patents

Description

i DK 171681 B1

Opfindelsen angår en DNA-sekvens, der koder for et modificeret human-B-interferonprotein (IFN-B), hvori 17-cystein-resten er udskiftet med en anden aminosyrerest, ekspressionsvektor indeholdende DNA-sekvensen, værtcelle, der er 5 transformeret med ekspressionsvektoren samt fremgangsmåde til fremstilling af det modificerede protein.

Biologisk aktive proteiner, som produceres mikrobielt ved hjælp af rekombinant-DNA-teknologi (rDNA-teknologi) kan 10 indeholde cysteinrester, som ikke er essentielle for deres aktivitet, men som frit kan danne uønskede intermolekylære eller intramolekylære bindinger. Et sådant protein er mikrobiologisk fremstillet human-B-interferon (IFN-B). Under fremstillingen af IFN-B ved rDNA-metoder, er det 15 blevet observeret, at der dannes dimerer og oligomerer af mikrobielt fremstillet IFN-B i E.coli ekstrakter indeholdende høje koncentrationer af IFN-B. Denne dannelse af multimerer gør oprensning og separation af IFN-B meget arbejds- og tidkrævende og nødvendiggør adskillige yderli-20 gere trin ved oprensning og isolering, såsom reduktion af proteinet under oprensning og reoxidation af det til frembringelse af dets oprindelige konformation, hvorved muligheden for dannelse af en ikke-korrekt disulfidbinding forøges. Mikrobielt produceret IFN-B har ydermere vist sig 25 at udvise konstant lav specifik aktivitet, hvilket måske skyldes dannelsen af multimerer eller af tilfældig fordelte intramolekylære disulfidbroer. Det ville derfor være ønskeligt at være i stand til at ændre mikrobielt fremstillet IFN-B på en sådan måde, som ikke påvirker dets 30 aktivitet på ugunstig vis, men som nedsætter eller elimi nerer dets evne til at danne intermolekylære tværbindinger eller intramolekylære bindinger, som får proteinet til at antage en uønsket tertiær struktur (såsom en konformation, der nedsætter proteinets aktivitet).

35

Biologisk aktive proteiner, som er ændret ved mutageni-seringsmetoder, og som bibeholder stamanalogernes aktivitet, men som mangler evnen til at danne intermolekylære DK 171681 B1 2 bindinger eller uønskede intramolekylære disulfidbindinger, kaldes "muteiner", (Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4.udg., s.381, Springer-Verlag (1976)). Således beskriver Shepard, H.M. et al. Nature (1981), bd.294, s.563-565 et 5 mutein af IFN-β, i hvilket cysteinet i position 141 i aminosyresekvensen (der er 3 cysteiner i naturligt human-IFN-β i positionerne 17, 31 og 141, Gene (1980), bd. 10, s.11-15 oa Nature (1980), bd.285, s.542-547) erstattes med tyrosin. Dette mutein fremstilledes ved bakteriel eks-10 pression af et hybridgen konstrueret ud fra en partiel IFN- β-cDNA-klon med et GTA baseskift i nukleotid 485 i IFN-fi-genet. Muteinet manglede det naturligt forekommende IFN-β's biologiske aktivitet, hvilket fik forfatterne til at konkludere, at det udskiftede cystein var essentiel for 15 aktiviteten.

Styrede mutageniseringsmetoder til frembringelse af muteiner er velkendte og en oversigt er givet af Lather, R.F. og Lecoq, J.P. i Genetic Engineering. Academic Press 20 (1983) s. 31-50. 01igonukleotidstyret mutagenisering omtales specifikt af Smith, M. og Gillam, S. i Genetic Engineer in: Principles and Methods. Plenum Press (1981) bd.

3, S. 1-32.

25 Proteiner, som ændres ved mutation, kan identificeres ud fra den tilgængelige information med hensyn til cysteinind-holdet i biologisk aktive proteiner og den rolle, som disse cysteinrester spiller med hensyn til aktivitet og tertiær struktur. For proteiner, for hvilke en sådan information 30 ikke er tilgængelig i litteraturen, kan denne information bestemmes ved systematisk at ændre hver af cysteinresterae i proteinet ved de heri beskrevne fremgangsmåder og undersøge den biologiske aktivitet af de fremkomne muteiner samt deres tilbøjelighed til at danne uønskede intermolekylære 35 eller intramolekylære disulfidbindinger.

Med opfindelsen tilvebringes derfor en DNA-sekvens, som er ejendommelig ved, at den består af en nukleotidkombination, DK 171681 Bl 3 son koder for et modificeret human-IFN-B protein, hvori 17-cysteinresten er udskiftet med serin, threonin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, phenylalanin, tryptophan eller nethionin.

5

Med opfindelsen tilvejebringes også en ekspressionsvektor son angivet i krav 2 og 3, en værtcelle son angivet i krav 4-6 og en fremgangsmåde til fremstilling af modificeret human-IFN-B-protein som angivet i krav 7.

10

Eksempler på andre proteiner end IFN-B, som kan udsættes for ændring ved mutation på samme måde, er lymfotoxin (tumornekrosefaktor), kolonistimulerende faktor 1 og IFN-el. De anvendelige proteiner vil sædvanligvis have et ulige 15 antal cysteinrester.

Med hensyn til IFN-B er det blevet nævnt i litteraturen, at både de glycosylerede og ikke-glycosylerede IFN-typer viser kvalitativt ens specifikke aktiviteter, og at glycosylen-20 hederne derfor ikke er involveret i eller bidrager til IFN- B's biologiske aktivitet. Bakterielt frembragt IFN-B, som er ikke-glycosylerende, udviser imidlertid konstant kvantitativt lavere specifik aktivitet end naturlig IFN-B, som er glycolyseret. IFN-B vides at have tre cysteinrester 25 i positionerne 17, 31 og 141. Shepard et al., se ovenfor, har påvist, at cystein 141 er essentiel for biologisk aktivitet. I IFN-β, som indeholder 4 cysteinrester, er der to intramolekylære -S-S-bindinger: en mellem cys 29 og cys 138 og en anden mellem cys 1 og cys 98. Baseret på homolo-30 gien mellem IFN-B og IFN-a kunne cys 141 i IFN-B være involveret i en intramolekulær -S-S- binding med cys 31, hvilket efterlader cys 17 fri til at danne intermolekylære tværbindinger. Ved enten at fjerne cys 17 eller erstatte den med en anden aminosyre kan man bestemme om cys 17 er 35 væsentlig for biologisk aktivitet samt dens rolle i -S-S- bindingsdannelsen. Hvis cys-17 ikke er væsentlig for proteinets biologiske aktivitet, kan det fremkomne protein, hvor cys 17 er fjernet eller cys 17 er erstattet med andet DK 171681 B1 4 aminosyre, udvise en specifik aktivitet, som er tæt på den aktivitet, der udvises af naturlig IFN-B, og vil muligvis også gøre isolering og oprensning af proteinet lettere.

5 Ved at anvende oligonukleotidstyret mutagenisering med en syntetisk oligonukleotidprimer, som er komplementær til området på IFN-B-genet ved codon for cys 17, men som indeholder en enkelt eller multipel baseskift i denne codon, kan der fremstilles et designergen, som resulterer 10 i, at cys 17 erstattes med en anden valgt aminosyre. Når man ønsker at fjerne cystein mangler oligonukleotidprimeren codon for cys 17. En anden måde er omdannelse af cys 17 til neutrale aminosyrer, såsom glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, phenylalanin, histidin, tryptofan, 15 serin, threonin eller methionin. Serin og threonin er de mest foretrukne udskiftninger på grund af deres kemiske analogi med cystein. Når cystein fjernes, er det modne mutein en aminosyre kortere end det naturlige stamprotein eller mikrobielt frembragt IFN-B.

20

Ud over substitutioner af Cys17 med Ser17 (eksempel 2), Thr17 og Ala17 (eksempel 3) samt deletering af aminosyren i position 17 (eksempel 4) vil en fagmand med almindelig fagkundskab således rutinemæssigt kunne substituere Cys17-25 resten med en anden neutral aminosyrerest som beskrevet heri til tilvejebringelse af modificerede IFN-/J-molekyl er, som i alt væsentligt har bevaret biologisk aktivitet. Påvisning af udskifteligheden af det ikke-essentielle cystein med en anden neutral aminosyre er påvist i tabel II 30 i slutningen af eksempel 9 for det nært beslægtede inter- leukin-2-protein (IL-2), i hvilket Cys125 i IL-2 blev erstattet med Val, Net, Ala, Leu, Ile, Pro, Try, Phe, His,

Trp, Gly, Thr og Ser, og alle disse IL-2-muteiner udviste biologisk aktivitet.

35

Størrelsen af oligonukleotidprimeren er bestemt ud fra kravet om stabil hybridisering af primeren til et område af genet, i hvilket mutation skal induceres samt af begræns- DK 171681 B1 5 ninger vedrørende de for tiden tilgængelige metoder til syntetisering af oligonukleotider. De faktorer, der skal tages i betragtning ved udformningen af oligonukleotider til brug i oligonukleotidstyret mutagenisering (f.eks. den 5 samlede størrelse, størrelsen af de områder, der flankerer mutationsstedet) omtales af Smith, M. og Gillam, S., se ovenfor. Den samlede længde af oligonukleotidet vil almindeligvis være en sådan, at man optimerer stabil, unik hybridisering på mutationsstedet med 5' og 3'-forlængelser 10 fra mutationsstedet med en tilstrækkelig størrelse for at undgå at DNA-polymerasens exonukleaseaktivitet redigerer mutationen. De oligonukleotider, der anvendes ved mutagenisering ifølge den foreliggende opfindelse, indeholder sædvanligvis fra ca. 12 til ca. 24 baser, fortrinsvis fra 15 ca. 14 til ca. 20 baser og mest fortrinsvis fra ca. 15 til ca. 18 baser. De vil sædvanligvis indeholde mindst ca. 3 baser i 3'-enden af den ændrede eller manglende codon.

Fremgangsmåden til fremstilling af det modificerede IFN-B-20 gen involverer i brede termer, at en stedspecifik mutageni sering induceres i IFN-B-genet ved codon 17 (TGT) under anvendelse af en syntetisk nukleotidprimer, som ændrer codon'en, således at den koder for en anden aminosyre. Når threonin erstatter cystein'en og primeren hybridiseres til 25 antisensstrengen af IFN-B-genet er den foretrukne nukleo- tidprimer GCAATTTTC A CTCAG (understregningen angiver den ændrede codon). Når det er ønskeligt at fjerne cystein er den foretrukne primer AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG, som udelader TGT-codon for cys. Når cystein erstattes med serin 30 vælges en 17-nukleotidprimer GCAATTTTCAG A GTCAG. som inkluderer en AGT-codon for serin. TTA baseskiftet i den første base i cys 17 codon resulterer i ændringen fra cystein til serin. Det skal bemærkes, at hvis der indføres deletioner, skal den rigtige læseramme for DNA-sekvensen 35 bevares for at få ekspression af det ønskede protein.

Primeren hybridiseres til en enkeltstrenget fag, såsom M13, fd eller 0X174, i hvilken der er blevet klonet en streng DK 171681 B1 6 af IFN-6-genet. Det vil forstås, at fagen enten kan bære den kodende streng eller den ikke-kodende streng af genet.

Når fagen bærer den ikke-kodende streng er primeren identisk med området på den kodende streng, som indeholder 5 den kode, der skal muteres, med undtagelse af en fejlpar ring med den codon, som definerer en deletion af codon eller en triplet, som koder for en anden aminosyre. Når fagen bærer den kodende streng er primeren komplementær til området på den kodende streng, som indeholder den codon, 10 der skal muteres, med undtagelse af en hensigtsmæssig fejlparring i den triplet, som parres med den codon, der skal fjernes. De betingelser, der kan anvendes under hybridiseringen, beskrives af Smith, M. og Gillam, S., se ovenfor. Temperaturen vil sædvanligvis ligge i området 15 mellem ca. 0°C og 70°C, fortrinsvis mellem ca. 10 og 50°C.

Efter hybridisering forlænges primeren på fag-DNA'et ved omsætning med DNA-polymerase I, T^-DNA polymerase, revers-transciptase eller en anden hensigtsmæssig DNA-polymerase.

Det fremkomne dsDNA omdannes til lukket cirkulært dsDNA ved 20 behandling med en DNA-ligase, såsom T^-DNA ligase. DNA- molekyler indeholdende enkeltstrengede områder kan ødelægges ved behandling med Sl-endonuklease.

Den fremkomne heteroduplex anvendes herefter til at 25 transformere en kompetent værtsorganisme eller -celle.

Værtens replikation af heteroduplexen tilvejebringer kopier af begge strenge. Efter replikation kan mutantgenet isoleres fra kopierne af mutantstrengen, indsættes i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor, og vektoren kan anvendes 30 til at transformere en egnet værtsorganisme eller -celle.

Foretrukne vektorer er plasmiderne pBR322, pCRl samt varianter heraf, syntetiske vektorer og lignende. Egnede værtsorganismer er E.coli. Pseudomonas. Bacillus subtil is. Bacillus thurinaienses. forskellige stammer af gær, 35 Bacillus thermophilus. animalske celler, såsom celler fra mus, rotter eller kinesisk hamster-ovarier (CHO) (fra eng.: Chinese hamster ovary). Det vil forstås, at når den valgte vært transformeres med vektoren, indføres der også DK 171681 B1 7 hensigtsmæssigt promotor-operatorsekvenser for at muteinet kan udtrykkes. Værterne kan være prokaryotiske eller eukaryotiske (fremgangsmåder til indføring af DNA i eukaryotiske celler omtales i beskrivelsen til PCT-an-5 søgningerne nr. US81/00239 og nr. US81/00240 publiceret 3.

sept. 1981, samt af S. Ohno et al. i Nucl. Acids Res. ifi (1982) 967—976, som beskriver ekspression af rekombinant human-IFN-/?-genet i dyrkede museceller). E.coli og CHO-celler er de foretrukne værter. De ved fremgangsmåden 10 ifølge opfindelsen opnåede muteiner kan være glycosylerede eller ikke-glycosylerede afhængig af den glycosylering, der forekommer i det naturlige stamprotein, samt den værtsorganisme, der anvendes til at fremstille muteinet. Om ønsket kan det ikke-glycosylerede mutein, der opnås, når 15 £* coli eller en Bacillus er værtsorganismen, eventuelt glycosyleres in vitro ved kemiske eller enzymatiske modifikationer eller andre kendte modifikationstyper.

På tegningen viser: 20 fig. 1 et diagram over aminosyresekvensen for IFN-B, fig. 2 en skematisk illustration, der viser fremstillingen af et mutant-IFN-B-gen ved oligonukleotidstyret mutageni-25 sering, fig. 3 et diagram af plasmid pfiltrp inkluderende IFN-B-genet, 30 fig. 4 et diagram af kloningsvektoren M13mp8-fag, fig. 5 et restriktionskort af klonen M13-B1, fig. 6 et sekventeringsgelmønster af IFN-Bgerl7-mutant-35 genet, som udviser et enkelt baseskift i det kodende område, fig. 7a Hinfl restriktionsmønsteret af klonen pSY2501, og DK 171681 B1 8 fig. 7b viser de heraf fremkomne to fragmenter på 169bp og 28 bp, fig. 8 et restriktionskort af klonen pSY2501, 5 fig. 9 den kodende DNA-sekvens for muteinet I FN- ®serl7 »ed den hertil svarende aminosyresekvens, og fig. 10 det enkelt 18.000 Dalton proteinbånd, som svarer 10 til IFN_eserl7 i ekstrakter fra klonerne pSY2501 og pBltrp.

Ved den foretrukne udførelsesform for opfindelsen for IFN-B, ændres cysteinresten i position 17 i IFN-B's aminosyresekvens, som vist på fig. 1, til serin ved et T * A 15 baseskift i den første base i codon 17 af den kodende streng af den DNA-sekvens, som koder for det modne IFN-B.

Den stedspecifikke mutagenisering induseres under anvendelse af en syntetisk 17-nukleotidprimer GCAATTTTCA6 A GT-£AG, som er identisk med en 17-nukleotidsekvens på den 20 kodende streng af IFN-B i codon 17 området med undtagelse af en enkelt basefej lparring ved den første base i codon 17. Fejlparringen er i nukleotid 12 i primeren. Det skal bemærkes, at den genetiske kode er degenereret, og at mange af aminosyrerne kan kodes af flere end 1 codon. Basekoden 25 for serin er f.eks. degenereret på 6 måder, således at koderne TCT, TCG, TCC, TCA, AGT og ACG alle koder for serin. AGT-codon'en valgtes af bekvemmelighedsgrunde til den foretrukne udførelsesform. På lignende måde kodes threonin af en hvilken som helst af følgende codon ACT, 30 ACA, ACC og ACG. Det er hensigten, at når én codon er specificeret for en speciel aminosyre indbefatter den alle degenererede codon, som koder for denne aminosyre. Den 17-mere primer hybridiseres til enkeltstrenget M13-fag DNA, som bærer den ikke-kodende streng af IFN-B-genet. Oligonuk-35 leotidprimeren forlænges derefter på DNA'et under an vendelse af DNA-polymerase I Klenow-fragment, og det opnåede dsDNA omdannes til lukket cirkulært DNA med T^-ligase. Replikation af den fremkomne mutantheteroduplex DK 171681 B1 9 giver kloner fra DNA-strengen indeholdende fejlparringen. Mutantkloner kan identificeres og screenes ved hjælp af fremkomst eller bortfald af specifikke restriktionssteder, antibiotikaresistens eller -følsomhed eller ved andre 5 kendte metoder. Når cystein erstattes med serin, resulterer det i fig. 2 viste et T -* A basekift i frembringelsen af et nyt Hinfl restriktionssted i det strukturelle gen. Mutantklonen identificeres under anvendelse af oligonukleotid-primeren som en probe ved en hybridiseringscreening af de 10 muterede fag-plaque. Primeren vil have en enkelt fejlpar ring, når den hybridiseres med stam-DNA'et, men vil have en perfekt parring, når den hybridiseres med muteret fag-DNA, hvilket er indiceret i fig. 2. Der kan herefter udformes hybridiseringsbetingelser, hvor oligonukleotidprimeren 15 fortrinsvis hybridiserer med det muterede DNA men ikke med stam-DNA. Det nyskabte Hinfl sted tjener også som et middel til at bekræfte enkeltbasemutationen i IFN-B-genet.

M13-fag DNA'et, der bærer det muterede gen, isoleres og 20 indsættes i en hensigtsmæssig ekspressionsvektor, såsom plasmid pTrp3, og E.coll stamme MM294 transformeres med vektoren. En fagmand kender hensigtsmæssige vækstmedier til dyrkning af trans formanterne samt deres afkom. Det udtrykte mutein af IFN-β isoleres, renses og karakteriseres.

25

De efterfølgende eksempler anføres for at give en bedre forståelse af opfindelsen og til illustration af denne.

EKSEMPEL 1 30

Kloning af IFN-6-genet i M13-vektor:

Anvendelsen af M13 fagvektor som en kilde for enkeltstren-get DNA-template er vist af G.F.Temple et al., Nature 35 (1982) 296: 537-540. Plasmid pfiltrp (fig.3) indeholdende IFN-fl-genet under kontrol af E.coli trp-promoter fordøjes med restriktionsenzymerne Hindlll og XhoII. Den replikative form (RF) af M13mp8 DNA (fig.4) (J.Messing, "Third Cleve- DK 171681 B1 10 land Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA", ed.

A.Walton, Elsevier Press, 143-153 (1981)) fordøjedes med restriktionsenzymerne Hindlll og BamHI og blandedes med pflltrp-DNA, som tidligere er blevet fordøjet med Hindlll og 5 Xholl. Blandingen legeredes derefter med T4 DNA-ligase, og det ligerede DNA blev transformeret ind i kompetente celler af E.coli stammen JM 103 og udpladet på Xgal-indikatorplader (J.Messing et al. Nucleic Acids Res. (1981) £: 309-321). Plague'er indeholdende rekombinant-fag (hvide 10 plaque'er) opsamledes, inokuleredes i en frisk kultur af JM 103, og der fremstilledes minipræparater af RF-molekyler fra de inficerede celler (H.D.Bimboim og J.Doly, Nucleic -Acid Res. (1979) 7: 1513-1523). RF-molekyleme fordøjedes med forskellige restriktionsenzymer for at identificere de 15 kloner, der indeholdt det indførte IFN-B. Restriktions kortet for en sådan klon (M13-B1) vises på fig. 5. Enkelt-strenget (ss) fag-DNA fremstilledes fra klon M13-B1 til brug som en template for stedspecifik mutagen i sering under anvendelse af en syntetisk oligonukleotid.

20 EKSEMPEL 2

Sted-specifik mutaoeniserincr: 25 4 0 icomol af det syntetiske oligonukleotid CAATTTTCA6A6TCA6 (primer) behandledes med T^-kinase i nærværelse af 0,1 mM adenosintriphosphat (ATP), 50 mM hydroxymethylaminomethan-hydrochlorid (Tris-HCl) pH 8,0, 10 mM MgCl2, 5 mM dithioth-reitol (DTT) og 9 enheder T^-kinase i 50 ml ved 37°C i 1 30 time. Den med kinase behandlede primer (12 picomol) hybridiseredes til 5 mg ss-M13-01-DNA i 50 ml af en blanding indeholdende 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2 og 10 mM b-mercartoethanol ved opvarmning ved 67°C i 5 minutter og ved 42°C i 25 minutter. Blandingen 35 indeholdende smeltet DNA blev derefter afkølet på is og tilsat til 50 ml reaktionsblanding indeholdende 0,5 mM af hver af deoxynukleosidtriphosphat (dNTP), 80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 8 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 9 enheder DNA-polymerase DK 171681 B1 11 I, Klenow-fragment, 0,5 mM ATP og 2 enheder T4 DNA-ligase inkuberet ved 37°C i 3 timer og ved 25°C i 2 timer. Reaktionen afsluttedes derefter ved phenolekstaktion og ethanolpræcipitering. DNA'et opløstes i 10 mM Tris-HCl pH 5 8,0, 10 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 50% sucrose og 0,05% bromphenylblå og blev udsat for elektroforese på 0,8% agarosegel i nærværelse af 2 mg/ml ethidiumbromid. De DNA-bånd, der svarede til RF-formene af M13-B1, elueredes fra gelstykker ved perchloratmetoden (R.W.Davis et al.

10 "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Labora tory, N.Y., s. 178-179 (1980)). Det eluerede DNA anvendtes til at transformere kompetente JM 103 celler, som blev dyrket natten over, og ssDNA isoleredes fra kultursuperna-tanten. Dette ssDNA anvendtes som en template i en anden 15 primerforlængelsescyklus, de gel-oprensede RF-forme af DNA'et transformeredes ind i kompetente JM 103 celler, udpladedes på agarplader og inkuberedes natten over til opnåelse af fagplaques.

EKSEMPEL 3 20

Sted-specifik mutageniserinc:

Det i eksempel 2 beskrevne forsøg gentoges med den undtagelse, at den anvendte syntetiske oligonukleotidprimer er 25 GCAATTTTCAGACTCAG til ændring af codon 17 i IFN-B-genet fra en codon, som koder for cystein, til en codon, som koder for threonin.

Eksperimentet ifølge ovenstående eksempel 2 blev gentaget 30 med undtagelse af, at den benyttede syntetiske oligonukleo tidprimer var én, i hvilken codonen for Cys17 var erstattet med en codon, der koder for alanin, således at codon 17 i IFN-jØ-genet blev ændret fra én, som koder for cystein, til én som koder for alanin.

35 DK 171681 B1 12 EKSEMPEL 4

Sted-specifik deletion: 5 Det i eksempel 2 beskrevne forsøg gentoges med den undta gelse, at den anvendte syntetiske oligonukleotidprimer er AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG til fjernelse af codon 17 i IFN-B-genet.

10 EKSEMPEL 5

Screening og identifikation af mutaaeniserede plaaues

Plader indeholdende mutageniserede M13-B1 plaques (eksempel 15 1), såvel som to plader indeholdende ikke-mutageniserede M13-61 fag-plaques afkøledes til 4°C, og plaques fra hver plade overførtes på to cirkulære nitrocellulosefiltre ved at lægge et tørt filter på agarpladen i 5 minutter for det første filter og 15 minutter for det andet filter. Filtrene 20 blev derefter anbragt på et tykt filterpapir, gennemvædet i 0,2 N NaOH, 1,5 M NaCl og 0,2% Triton X-100 i 5 minutter og neutraliseredes ved at lægge filtrene på filterpapir gennemvædet med 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 og 1,5 M NaCl i 5 minutter. Filtrene vaskedes på lignende måde 2 gange på 25 filtre gennemvædet med 2 x SSC (standard salin citrat), tørredes og opvarmedes derefter i en ovn ved 80°C i 2 timer. Dubletfiltrene præhybridiseredes ved 55°C i 4 timer

med 10 ml pr. filter DNA-hybridiseringsbuffer (5xSSC) pH

7,0, 4xDenhardt/s opløsning (polyvinylpyrrolidin, ficoll og 30 bovinserumalbumin, 1 x * 0,02% af hver), 0,1% natrium- dodecylsulfat (SDS), 50 mM natriumphosphatbuffer pH 7,0 og 32 100 mg/ml denatureret laksesperm-DNA. En P-mærket gensonde (eng: probe) fremstilledes ved kinasebehandling af oligonukleotidprimeren med P-mærket ATP. Filterne 35 hybridiseredes til 3,5 x 10 cpm/ml P-mærket primer i 5 ml pr. filter DNA-hybridiseringsbuffer ved 55°C i 24 timer. Filtrene vaskedes ved 55°c, hver i 30 min. i vaskebuffer indeholdende 0,1% SDS og stigende mængder SSC. Filtrene DK 171681 B1 13 blev 1 begyndelsen vasket med buffer Indeholdende 2 x SSC, og kontrolfiltrene indeholdende ikke-mutageniserede M13-B1 plaques undersøgtes for tilstedeværelsen af radioaktivitet under anvendelse af en Geigertæller. Koncentrationen af SSC 5 blev trinvis formindsket, og filtrene vaskedes indtil der ikke kunne påvises radioaktivitet på kontrolfiltrene med de ikke-muterede M13-B1 plaque. Den lavest anvendte koncentration af SSC var 0,1 x SSC. Filtrene lufttørredes og autoradiograferedes ved -70°C i 2-3 dage. 480 plaques af 10 muteret M13-B1 og 100 ikke-muterede kontrolplaques screene- des med den kinasebehandlede oligonukleotidgensonde. Ingen kontrolplaques hybridiserede med gensonden, mens 5 muterede M13-B1 plaques hybridiserede med gensonden.

15 En af de fem muterede M13-B1 plaques (M13-SY2501) opsam ledes og inokuleredes i en kultur af JM 103. ssDNA fremstilledes ud fra supernatanten og dobbelstrenget (ds) DNA fremstilledes ud fra cellepelleten. ssDNA'et anvendtes som en template for dideoxysekventering af klonen under 20 anvendelse af M13 universalprimer. Resultatet fra sekvensa nalysen vises på fig. 6, hvilket bekræfter, at TGT-codon for cystein blev omdannet til en AGT-codon for serin.

EKSEMPEL 6 25

Ekspression af muteret IFN-6 i E.coli: RF-DNA fra M13-SY2501 fordøjedes med restriktionsenzymerne Hindi 11 og XhoII. og 520 bp indskudfragmentet oprensedes på 30 en 1% agarosegel. Plasmidet pTrp3 indeholdende E.coli trp- promotoren (fig.7) fordøjedes med enzymerne Hindlll og BajnHI, blandedes med det rensede M13-SY2501 DNA-fragment og ligeredes i nærværelse af T4-DNA-ligase. Det ligerede DNA transformeredes ind i E.coli stammen MM294. Ampicillin-35 resistente transformanter screenedes for følsomhed overfor lægemidlet tetracyklin. Plasmid-DNA fra 5 ampicillin-resistente, tetracyklinfølsomme kloner fordøjedes med Hinfl for at screene for tilstedeværelsen af indførelse af M13- DK 171681 B1 14 SY2501. Fig.8a viser Hinfl-restriktionsmønsteret af en af klonerne (pSY2501), sammenligner det med Hinfl-mønsteret af den oprindelige IFN-B-klon, pBltrp. Som ventet er der et yderligere Hinfl-sted i pSY2501, hvorved det 197 bp lange 5 IFN-β interne fragment spaltes til et 169 bp fragment og et 28 bp fragment (f.eks. 8b). Et restriktionskort for klonen pSY2501 vises på fig. 9. Den fuldstændige DNA-sekvens for det muterede IFN-B-gen vises på fig. 10 sammen med den udledte aminosyresekvens.

10

Plasmidet med betegnelsen klon pSY2501 er deponeret hos Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional Research Center, Science and Education Administration, U.S. Department of Agricul-15 ture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 60604 og har fået tildelt accessionsnummeret CMCC no. 1533 og NRRL nr. B-15356.

Kulturer af pSY2501 og pBltrp, som inkluderer afkom heraf, 20 dyrkedes til en optisk densitet (ODg00) i#0· Der fremstilledes cellefrie ekstrakter, og mængden af IFN-B antiviral aktivitet blev analyseret på GM2767-celler i et mikrotiterassay. Ekstrakter fra klon pSY2501 udviste fra 3 til 10 gange højere aktivitet end pBltrp (tabel I), hvilket 25 indicerede, at klon pSY2501 enten syntetiserede mere protein udvisende IFN-B-aktivitet, eller at det producerede protein havde en højere specifik aktivitet.

30

Tabel I

Ekstrakt Antiviral aktivitet 35 PSY2501 6 X 105 pøltrp 1 X 105 ptrp3 (kontrol) 30 DK 171681 B1 15

For at bestemme om klon pSY2501 syntetiserede protein, der var adskillige gange mere aktiv, blev ekstrakterne fra begge kloner udsat for elektroforese på en SDS-polyacryla-midgel sammen med et kontrolekstrakt, og gelen farvedes med 5 coomasie-blåt for at visualisere proteinerne. Som vist på fig. 11 er der kun ét proteinbånd svarende til et tilsyneladende 18000 Dalton protein, som var til stede i ekstrakterne fra klonerne pSY2501 og pBltrp, men ikke i kontrolekstraktet fra ptrp3. Dette protein, som havde en 10 molekylvægt på ca. 20.000 Dalton, men som udviste et gelvandringsmønster som et 18000 Dalton protein, var tidligere blevet vist at være IFN-β ved oprensning af dette protein fra ekstrakter fra pBltrp. Eftersom der er mindre af dette protein i ekstrakter fra pSY2501 end i ekstrakter 15 fra pBltrp er den specifikke aktivitet i proteinet i ekstrakter fra klon pSY2501 højere end den specifikke aktivitet i klon pBltrp.

EKSEMPEL 2 20

Oprensning af IFN-Bgerl7 25 IFN-B___, _ udvandtes fra E.coli, som var blevet transfor- seri/ meret til frembringelse af IFN-Bgerl7. E.coli-celler dyrkedes i følgende vækstmedium til en OD på 10-11 ved 680 nm (tørvægt 8,4 g/1).

Bestanddele Koncentration 30

NH4C1 20 mM

K2S04 16,1 mM

KH2P04 7,8 mM

Na2HP04 12,2 mM

35 MgS04*7H20 3 mM

Na3 citrat · 2H20 1,5 mM

MnSO. · 4H_0 30 mM

4 2

ZnSO. · 7H-0 30 mM

4 2 DK 171681 B1 16

CuSO. · 5 H.O 3 mM

4 2 L-tryptofan 70 mg/1

Feso. · 7H_o 72 mM

4 2

Thiamin · HC1 20 mg/1 5 Glucose 40 g/1 pH indstilledes med NH^OH.

9,9 Liter (9,9 kg) af høstede, transformerede E.coli 10 afkøledes til 20° c og koncentreredes ved at føre de høstede celler gennem tværstrømningsfiltre med et gennemsnitligt trykfald på ca. 110 kPa og en steady-state filtratstrømningshastighed på 260 ml/min, indtil filtratvægten var 8,8 kg. Koncentratet (ca. 1 liter) overførtes 15 til en beholder og afkøledes til 15°C. Cellerne i kon centratet åbnedes ved at føre koncentratet gennem en Manton-Gaulin homogenisator ved 5°C, ca. 69000 kPa. Homogenisatoren vaskedes med 1 liter phosphatbufret salin, pH 7,4 (PBS), og vaskevandet tilsattes til de åbnede celler 20 til et slutvolumen på 2 liter. Dette volumen centrifugere des kontinuerligt ved 12000 x g med en strømhastighed på 50 ml/minut. Det faste materiale separeredes fra supernatanten og resuspenderedes i 4 liter PBS indeholdende 2 vægt% SDS. Denne suspension omrørtes ved stuetemperatur i 15 minutter, 25 hvorefter der ikke var noget synligt suspenderet materiale.

Opløsningen ekstraheredes derefter med 2-butanol ved et forhold mellem 2-butanol og opløsningsvolumen på 1:1. Ekstraktionen udførtes i en væske-væske faseseparator under anvendelse af en strømhastighed på 200 ml pr. minut. Den 30 organiske fase udskiltes derefter og inddampedes til tørhed til frembringelse af 21,3 g protein. Dette resuspenderedes i destilleret vand i et volumenforhold på 1:10.

Det udvundne produkt analyseredes for human IFN-B-aktivitet 35 under anvendelse af et assay baseret på beskyttelse mod viral cytopatisk effekt (CPE). Analysen udførtes i mikroti-terplader. 50 ml af minimalt essentielt medium overførtes til hver brønd, og 25 mikroliter af prøven anbragtes i den DK 171681 B1 17 første brønd, og der blev udført 1:3 volumenfortyndinger i serie i de efterfølgende brønde. Virus (vesikulær stomati-tus), celler (human fibroblast linie GM-2767) og reference IFN-B-kontroller inkluderedes på hver plade. Den anvendte 5 reference-IFN-B var 100 enheder pr. ml. Pladerne bestrå ledes derefter med UV-lys i 10 minutter. Efter bestråling tilsattes 100 ml cellesuspension (1,2 x 10 celler/ml) til hver brønd, og pladerne blev inkuberet i 18-24 timer. En virusopløsning med en plaque-dannende enhed pr. celle 10 tilsattes til hver brønd med undtagelse af cellekontrollen.

Pladerne blev derefter inkuberet indtil viruskontrollen viste 100% CPE. Dette skete normalt 18-24 timer efter tilsætning af virusopløsningen. Analyseresultaterne fortolkedes i relation til lokaliseringen af 50% CPE-15 brønden i reference IFN-B-kontrollen. Ud fra dette punkt bestemtes interferontiteren for alle prøver på pladen. Den specifikke aktivitet af det udvundne produkt bestemtes at 7 være 5 x 10 U/mg.

20 EKSEMPEL 8

Svreudfældning og kromatografisk oprensning

Den i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåde gentoges med den 25 undtagelse, at blandingens pH-værdi blev sænket til ca. 5 ved tilsætning af iseddikesyre efter ekstraktion og separation af den vandige og den organiske fase og blanding af den organiske fase med PBS ved et volumenforhold på 3:1.

Det fremkomne præcipitat separeredes ved centrifugering ved 30 10000-17000 x g i 15 minutter, og pelleten genopløstes i 10% vægt/volumen SDS, 10 mM DTT, 50 mM natriumacetatbuffer, pH 5,5, og opvarmedes til 80°C i 5 minutter.

Opløsningen overførtes derefter på en Brownlee RP-300, 10 35 mM, "Aquapore"-søjle under anvendelse af et Beckman- gradientsystem. Buffer A var 0,1% trifluoreddikesyre (TFA) i H20, buffer B var 0,1% TFA i acetonitril. Påvisning blev udført ved ultraviolet absorbans ved 280 nm. Solventpro- DK 171681 B1 18 grammet var en liniær gradient af 0% buffer B til 100% buffer B på 3 timer. Fraktioner, som indeholdt de højeste interferonaktiviteter, samledes, og den specifikke aktivitet af den samlede interferonpræparation bestemtes til at 5 ligge mellem 9,0 x 10 og 3,8 x 10 internationale enheder

Q

pr. mg protein, sammenlignet med ca. 2 x 10 U/mg for naturlig IFN-B.

EKSEMPEL 9 10

Biokemisk karakterisering af IFN-B£cll7

Aminosyresammensætningen bestemtes efter 24-72 timers hydrolyse af 40 mg prøver af IFN i 200 ml 5,7 N HC1, 0,1% 15 phenol, ved 108°C. Prolin og cystein bestemtes på samme måde efter permyresyreoxidation, i dette tilfælde udeladtes phenol fra hydrolysen. Tryptophan analyseredes efter 24 timers hydrolyse af 400 ml prøver i 5,7 N HC1, 10% mer-captoeddikesyre (ingen phenol). Analysen udførtes på en 20 Beckman 121 MB aminosyreanalysator under anvendelse af en enkelt kolonne af AA10 resin.

Aminosyresammensætningen beregnet ud fra repræsentative 24-, 48-, 72-timers syrehydrolyse af oprenset IFN-B Ser17 25 stemte godt overens med den sekvens, der kan forudsiges ud fra DNA-sekvensen af klonernes IFN-gen, minus den manglende N-terminale methionin.

Aminosyresekvensen af de første 58 af resterne fra amino-30 syreterminus af det rensede I FN bestemtes på en 0,7 mg prøve i en Beckman 890C sequanator med 0,1 M Quadrol buffer. PTH-aminosyrer bestemtes ved omvendt-fase HPLC på en Altex ultrasfære DSO-kolonne (4,6 x 250 mm) ved 45°C elueret ved 1,3 min ved 40% buffer B og 8,4 minutter fra 35 40-70% buffer B, hvor buffer A var 0,0115 M natriumacetat, 5% tetrahydrofuran (THF), pH 5,11, og buffer B var 10% THF i acetonitril.

DK 171681 B1 19

Den fastlagte N-terminale aminosyresekvens af IFM_J5serl7 passede med den forventede sekvens forudsagt ud fra DNA-sekvensen med undtagelse af den manglende N-terminale methionin.

5

Som angivet ovenfor udviste IFNH3serl7-præparationen en specifik aktivitet, der var meget tæt på eller bedre end aktiviteten af naturlig IFN-β. IFN-figerl7 har ingen frie sulfhydrylgrupper, men indicerer en -S-S- binding mellem de 10 resterende cysteiner ved positionerne 31 og 141. Proteinet danner ikke let oligomerer og synes stort set at foreligge i den monomere form. IFNH5serl7 opnået ved den foreliggende opfindelse kan formuleres enten som et enkelt produkt eller en blanding af forskellige former til farmaceutisk accep-15 table præparater i inerte, ikke-toxiske, ikke-allergene, fysiologisk forenelige bæremedier til klinisk eller terapeutisk brug ved kræftbehandling eller ved betingelser, hvor interferonterapi er indiceret samt til virale infektioner. Sådanne medier indbefatter men er ikke begrænset 20 til destilleret vand, fysiologisk salin, Ringers oplosning,

Hanks opløsning og lignende. Andre ikke-toxiske, stabiliserende og opløsende hjælpemidler, såsom dextrose, HSA (human serumalbumin) og lignende kan eventuelt tilsættes.

De terapeutiske formulationer kan indgives oralt eller 25 parenteralt, såsom intravenøst, intramuskulært, intraperi- tonealt og subkutant. Præparater af det modificerede IFN-fl kan også anvendes til topical anvendelse i et hensigtsmæssigt medium, der normalt anvendes til et sådant formål.

30 De vigtigste fordele med det ovenfor beskrevne mutein af IFN-β ligger i elimineringen af en fri sulfhydrylgruppe ved position 17 i IFN-β, hvorved proteinet tvinges til at danne korrekt disul fidbinding mellem cys 31 og cys 141 og antage den konformation, der tilsyneladende kræves for fuld 35 biologisk aktivitet. Den forøgede specifikke aktivitet af IFN-Bgerl7 gør det muligt at anvende mindre doser ved terapeutisk brug. Ved at fjerne cystein ved position 17 og eliminere den frie SH-gruppe, danner IFN-flgerl7-proteinet DK 171681 B1 20 ikke dinerer og oligonerer så let som det mikrobiologisk fremstillede IFN-β. Dette letter oprensningen af proteinet og forøger dets stabilitet.

5 Yderligere eksperimentel sandsynliggørelse, _af_ biologisk aktivitet af IFN-fl. hvori svstein-17 er blevet erstattet med andre neutrale aminosyrer end serin 10 Undersøgelser for biologisk aktivtet svarende til dem, der er omtalt ovenfor for IFN-/J8erl7 i eksempel 7, sidste afsnit, er blevet udført med det nært beslægtede interleukin-2-protein (IL-2-protein), hvori 125-cystein-resten var erstattet med valin, methionin, glycin, leucin, isoleucin, 15 prolyl, tyrosin, phenylalanin, histidin, tryptofan, alanin, threonin og serin.

De opnåede resultater fremgår af nedenstående tabel II.

20 Tabel II

IL-2-aktivitet

Qllgonukleotid til ændring af Cvs125 fu/rol)

Cys-Val 5’...GAT GAT GCT CTG AAC AAA GGT AAT C.. .3’ 9.6x10s 25 Cys-*Mct 5»...GAT GAT GCT CTG CAT AAA GGT AAT C...3’ 6.4 X 10s

Cys-M31y 5 \ .'.GAT GÅT GGT-CTG GGCAAA GGT AAT C...3’ 5.2 x1ο5

Cys-*Leii 5’.. .GAT GAT GCT CTG' CAG ÅAA GGTAATC. J' 8.2 x Ϊ&

Cys-^Ue 5*.. .GATGAT GCT CTG GAT AAA GGT AAT C...3’ 1.2x10* 30 Cys->Pro 5’...GAT GAT GCT CTG CG G AAA GGT AAT C...3* 2.5 x10s

Cys-*Tyr 5’...GATGAT GCT CTG GTA AAA GGT AAT C...3’ 4.3 X 10s

Cys-iPfce 5’.. .GATGAT GCT CTG GAA AAA GGT AAT C...3’ 5.6 x10s

Cys-»His 5’.. .GAT GATGCT CTG.GTG AAA GGT AAT C.. .3 ’ 3.5 X 10s 35 ...

Cy$->Tip S’.. .GATGAT GCT CTG CCA AAA GGT AAT C...3’ 5.1 X 10s

Cys-*Ala 4.3 x 10s

Cys->Thr 3.2 x10s

Cys-Scv 9.8 x 10s DK 171681 B1 21

Da IL-2-proteinet må anses for værende forholdsvis nært beslægtet med INF-/3-proteinet, må ovenstående eksperimentelle resultater anses for med rimelig sikkerhed at sandsynliggøre, at ikke blot erstatningen af 17-cystein-5 resten med serin, threonin eller alanin i IFN-/3-proteinet men også erstatning med ovennævnte neutrale aminosyrer fører til IFN-/J-proteiner med forventet biologisk aktivitet, eftersom biologisk aktivitet er dokumenteret i begge tilfælde, når der er tale om IL-proteinet, og der ikke ses 10 nogen grund til, at aminosyreresterne af valin, methionin, glycin, leucin, isoleucin, prolin, tyrosin, phenylalanin, histidin, tryptofan, alanin, threonin og serin skulle give andet resultat i tilfældet med IFN-/3-proteinet.

Claims (7)

1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den består af en nukleotidkombination, som koder for et modificeret 5 human-IFN-β protein, hvori 17-cysteinresten er udskiftet med serin, threonin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, phenylalanin, tryptophan eller methionin.

2. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at DNA-sekvensen ifølge krav 1 forefindes i vektoren i en position, som tillader ekspression af genet.

3. Ekspressionsvektor ifølge krav 2, kendeteg- 15 net ved, at det er plasmid pSY 2501 som indeholdt i E. coli stamme MM 294, CMCC nr. 1533 og NPRL nr. B-15356.

4. Værtcelle, kendetegnet ved, at den er en bakterie-, gær- eller dyrecelle, som er transformeret med 20 en ekspressionsvektor ifølge et af kravene 2-3.

5. Værtcelle ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den er E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus thermophilus eller en CHO-celle. 25

6. Værtcelle ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den er transformeret E. coli eller et afkom heraf.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et modificeret 30 human-IFN-B protein, hvori 17-cysteinresten er udskiftet med serin, threonin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, phenylalanin, tryptophan eller methionin, kendetegnet ved, at en værtcelle ifølge et af kravene 4-6 dyrkes, og at det synteti-35 serede protein af interesse indvindes fra kulturen.