BG60510B2

BG60510B2 - Структурни гени,плазмиди и трансформирани клетки за получаване на бедни на цистеин мутеини на биологично активни протеини

Info

Publication number: BG60510B2
Application number: BG096076A
Authority: BG
Inventors: David Mark; Leo Lin; Shi-Da Lu
Original assignee: Chiron Corporation
Priority date: 1983-10-10
Filing date: 1992-03-16
Publication date: 1995-06-30

Abstract

Мутеините се използват при диагностиката и лечението на бактериални, вирусни, паразитни, протозойни и гъбични инфекции, за възстановяване на имунните функции и при разработване на диагностични изследвания. Те се получават чрез бактериална експресия на мутантни гени, които кодират за мутеини, синтезирани от гените на родителските протеини чрез олигонуклеотидно насочена мутагенеза. В тези мутеини на биологично активни протеини като ifnи il-2 несъществени за биологичната активност цистеинови остатъци се изпускат или заместват с друга аминокиселина за елиминиране на възможни места за образуване на нежелани интермолекулярни и интрамолекулярни връзки. 17 претенции, 17 фигури

Description

Област на техниката.

Изобретението се отнася до рекомбинантни DNA (ДНК) технологии, по-специално до мутационно променени биологично активни протеини, които сс различават от родителските аналози по едно или повече замествания / делеции на цистеинови остатъци.

Предшества що състояние на техниката.

Биологично активни протеини, които са микробно продуцирани,т.е. получени чрез рекомбинантни ДНК (рДНК) технологии, може да съдържат цистеинови остатъци, които не са осъществени за тяхната активност, но са свободни да образуват нежелани интермолекулярни и интрамолекулярни връзки. Такъв протеин е микробиално полученият човешки β-интерферон (IFN-β). При получаване на IFN-β чрез рДНК методи се наблюдава, че в екстракти от E.coli се оформят димери и олигомери на микробно продуциран IFN-β, които съдържат високи концентрации IFN-β. Образуването на мултимери прави пречистването и сепарирането на IFN-β твърде сложно и времеотнемащо и налага включването на няколко допълнителни операции при пречистването и изолирането, например редуциране на протеина по време на пречистването и окисляване за възстановяване на изходната конформация. като с това се повишава възможността за образуване на неправилни дисулфидни връзки. Освен това е установено, че микробиално полученият IFN-β. проявява постоянна слаба специфична активност може би поради образуването на мултимери или на случайни интрамолекулярни мостове. Поради това е желателно да сме в състояние да променим микробиално получените биологично активни протеини като IFN-β по начин, който да не засяга тяхната активност нежелателно, но да намалява или да елиминира способността им да образуват интермолекулярни кръстосани връзки или интрамолекулярни връзки, които са причината протеинът да придобие нежелана третична структура (т.е. една конформация, която понижава активността на протеина).

Настоящето изобретение се отнася до по лучаване чрез насочена мутагенеза на мутационно променени биологично активни протеини (такива протеини се наричат “мутеини”. Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4-th ed, 381. Springer-Vcrlag (1976)), които запазват активността на родителските аналози, но нямат способността да образуват интермолекулярни връзки или нежелани интрамолекулярни дисулфидни връзки. В тази връзка Scpard et al.. Nature, (1981) 294:563-565 описва един мутеин на IFNβ. в който цистеинът в позиция 141 от аминокиселинната последователност (има три цистеина в природния човешки IFN-β в позиции 17, 31 и 141, Gene (1980). 10: 11-15 и Nature (1980). 285: 542-547) е заместен с тирозин. Мутеинът е получен чрез бактериална експресия на един хибриден ген, получен от частичен IFN-β сДНК клон имащ G -> А преминаване в нуклиотида 485 на IFN -β гена. На мутеина липсва биологичната активност на природния IFN-β, което води до извода, че заместеният цистеин е съществен за активността.

Методите за насочена мутагенеза са добре известни и са описани в Lather and Lecoq, Genetic Engineering, Academic Press, 1983, 31-50. Олигонуклеотидно насочената мутагенеза е специално разгледана от Smith and Gillam, Genetic Engineering:Principles and Methods, Plenum Press (1981) 3: 1-32.

Техническа същност на изобретението.

Един аспект на изобретението се отнася до синтетичен мутеин на биологично активен протеин, който има най-малко един пистсинов остатък, който е свободен да образува дисулфидна връзка и не е съществен за биологичната активност, като при мутеина най-малко един от споменатите цистеинови остатъци е отстранен или заместен с друга аминокиселина.

Друг аспект на изобретението се отнася до синтетични структурни гени, имащи ДНК последователности “проектни гени”, които са предназначени специално за кодиране на описания синтетичен мутеин. В тази част са включени и експресионни вектори, които включват описаните структури и проектни гени, клетки-гостоприсмници или ^икр-ор чизми, трансформирани с такива вектори. ' акт'.' и методи за получаване на синтетичен мутеин чрез култивиране на описаните трансформанти или техни прогени и възстановяване на мутеина от културата. При мутеини, имащи терапевтично приложение, терапевтичните средства, ко2 ито съдържат терапевтично ефективни количества мутеини, и терапевтичните методи са друг аспект на изобретението.

Изобретението се отнася и до метод за предотвратяване образуването на нежелана дисулфидна връзка от протеин, които има един или повече цистеинови остатъци, свободни да образуват такава връзка чрез мутационна промяна на протеина чрез делеция на цистеинов остатък (остатъци) или заместването им с други аминокиселини.

Изобретението включва и метод за получаване на описания синтетичен структурен ген чрез олигонуклеотиднонасочена мутагенеза, обхващаща следните етапи:

а) хибридизация на едноверижна ДНК, представляваща една верига от структурния ген, кодиращ родителския протеин с мутантен олигонуклеотиден праймер, който е комплементарен към този участък на веригата, включваща кодона за цистеин, който трябва да бъде отстранен или заместен, или в някои случаи безсмисления триплет сдвоен с кодон, освен при несъвпадане на този кодон или в даден случаи на безсмислената верига, което води до делеция на кодона или триплета, който кодира за другата аминокиселина;

в) разширяване на праймера с ДНК полимераза за образуване на мутантен хетеродуплекс;

с) репликация на мутантния хетеродуплекс.

Мутантният олигонуклеотиден праймер, използван в този процес, също е част от изобретението.

Настоящето изобретение се отнася до мутеини на биологично активни протеини, в които несъществени за биологичната активност цистеинови остатъци целенасочено се отстраняват или заместват с други аминокиселини за елиминиране на места за вътрешномолекулно кръстосано омрежвано свързване или образуване на неправилна интрамолекулярна дисулфидна връзка; мутантни гени, кодиращи за такива мутеини; и методи за получаване на такива мутеини.

Кои протеини могат да бъдат мутационно променяни съгласно изобретението може да се определи от наличната информация за съдържанието на цистеин в биологично активни протеини, както и за значението на тези цистеинови остатъци за активността и тре тичната структура на протеина. Ако има протеини. за които няма такава информация в литературата, тя може да се получи чрез систематично променяне на всеки от цистсиновите остатъци в протеина по методите, описани тук и след това измерване на биологичната активност на резултантните мутеини и определяне способността им да образуват нежелани интермолекулярни или интрамолекулярни дисулфидни връзки. Всъщност, въпреки че в изобретението са описани и илюстрирани с примери по-долу мутеини на IFN-β и 1L-2, трябва да се знае, че описаното тук може да се приложи и към всеки друг биологично активен протеин, съдържащ функционално несъществен цистеинов остатък, който го прави чувствителен към образуването на нежелани дисулфидни връзки. Примери за такива протеини, различни от IFN-β и IL-2, които могат да бъдат мутационно променяни съгласно изобретението, са лимфотоксини ( фактор на туморната некроза), стимулиращ колонии фактор-1 и lFN-α. Кандидатпротеините имат нечетен брой цистеинови остатъци.

За IFN-β в литературата е описано и това, че както гликозилираният, така и негликозилираният IFN показват качествено сходни специфични активности, от което следва, че гликозилните групи не допринасят за биологичната активност на IFN-β. Все пак бактериално продуцираният IFN-β, който е негликозилиран, проявява постоянно количествено но-ниска специфична активност, от природния IFN-β, който е гликозилиран.

За IFN-β е известно, че има три цистеинови остатъка в позиции 17, 31 и 141. Цистеин 141 е определен от Shepard, et al., (виж по-горе) като есенциален за биологичната активност. При IFN-α, който съдържа четири цистеинови остатъка, има две вътрешномолекулни -S-Sвръзки: едната е между cys 29 и evs 138, а другата между cys 1 u cys 98. Ако се основаване на хомоложността между IFN-β и IFN-a, cys 141 от IFN-β би следвало да бъде включен във вътрешно молекулярна -S-S-връзка със cys 31, а cys 17 да остане свободен за интрамолекулярно свързване. Чрез отстраняване на cys 17 или заместването му с друга аминокиселина може да се определи дали той е съществен за биологичната активност и какво значение има за образуване на -SS-връзката. Ако cys 17 не е съществен за биологичната активност, протеинът, в който е отстранен или заместен, може да прояви специфична активност, близка до тази на природния IFN-β и това може да улесни изолирането и пречистването на протеина.

Чрез използването на олигонуклеотиднонасочена метагенеза със синтетичен олигонуклсотиден праймер, комплементарен към участъка на IFN-β гена в кодона за cys 17, но с единична или многократна промяна на бази в този кодон, може да бъде получен ген, който да води до заместване на cys 17 е някоя друга избрана аминокиселина. Ако е желана делеция, в олигонуклеотидния праймер липсва кодон за cys 17. Предпочита се превръщането на cys 17 в неутрална аминокиселина, като глицин, валин, аланин, левцин, изолевцин, тирозин, фенилаланин, хистидин,триптофан, серии,треонини метионин. Най-предпочитаните заместители са серин и треонин, поради химичната им аналогия с цистеина. Когато цистеинът се отстранява, зрелият мутеин е с една аминокиселина по-къс от природния родителски протеин или от микробиално продуцирания IFN-β.

Известно е, че човешкият IL-2 има три цистеинови остатъка, разположени в позиции 58, 105 и 125 на протеина. Подобно на IFN-β, 1L-2 е в агрегатирана олигомерна форма, когато се изолира от бактериални клетки и трябва да бъде редуциран с подходящ редуктор за получаване на добър добив от бактериалните екстракти. Освен това пречистеният редуциран IL-2 протеин е нестабилен и лесно се реокислява до олигомерна неактивна форма при съхранение. Наличието на три цистеина означава, че при реокисляване протеинът може да образува случайно един от трите възможни интрамолекулярни моста, от които само един е правилен, такъв какъвто е в природната молекула. Тъй като дисулфидната структура на природния IL-2 не е известна, е възможно да се използва настоящето изобретение за създаване на мутации при кодоните 58, 105 и 125 на IL-2 гена и да се определи, кои цистеинови остатъци са необходими за активността и поради това е найвероятно да бъдат включени в естественото образуване на дисулфидни мостове. По същия начин цистсиновитс остатъци, които не са съществени за активността, могат да се модифицират така, че да се предотврати образуването на неправилни интрамолекулярни дисулфидни мостове и да се сведе до минимум вероятността за вътрешно молекулните дисулфидни мостове чрез заместване на свободния цистеинов остатък.

Големината на олигонуклеотидния праймер се определя от изискването за стабилна хибридизация на праймера в този участък на гена, в който ще бъде индуцирана мутация, и от ограниченията, налагани от известните методи за синтез на олигонуклеотиди.Факторите, които трябва да се имат предвид при съставянето на олигонуклеотидите, използвани при олигонуклеотиднонасочена мутагенеза (например обща големина, големина на частите, граничещи със сайта на мутация), са описани от Smith and Gillam (виж по-горе). Всъщност дължината на олигонуклеотида трябва да е такава, че да оптимизира стабилна, единствена хибридизация на сайта за мутация, като 5' и 3'-удълженията от сайта на мутацията трябва да са с достатъчна големина, за да се избегне редактирането на мутацията чрез екзонуклеазната активност на ДНК полимеразата. Използваните за мутагенеза олигонуклеотиди съгласно изобретението съдържат обикновено от 12 до 24 бази, за предпочитане от 14 до 20 и в най-предпочитания вариант-от 15 до около 18. Те съдържат обикновено най-малко около три бази 3' от променения или липсващ кодон.

Методът за получаване на модифициран IFN-β ген най-общо включва индуциране на специфична по място мутагенеза в lFN-βгена при кодон 17 (TGT) при използване на синтетичен нуклеотиден праймер, който изпуска кодона или го променя така, че да кодира за друга аминокиселина. Когато треонин замества цистеина и праймерът е хибридизиран към безсмислената верига на IFN-β гена, предпочитаният нуклеотиден праймер е GCAATTTTCAGACTCAG (с подчертаване се означава промененият кодон). Когато се желае делеция на цистеина, предпочитаният праймер е AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG, който изпуска TGT за cys. Когато цистеинът се замества със серин се избира един 1 7-нуклеотиден праймер, GCAATTTTCAGACTCAG, който включва един AGT кодон за серин. Промяната Т А в първа база на cys 1 ' кодона има като резултат заменянето на цистеин със серин. Трябва да се знае, че когато се индуцират делеции, трябва да бъде поддържана правилна четяща рамка за ДНК последователността за експресия на желания протеин.

Праймерът се хибридизира до еднове4 рижен фаг, като Μ13, fd или фХ 174, в който с клонирана една верига от IFN-P-rcua. Фагът може да носи смислената или безсмислената верига на гена. Когато фагът носи безсмислената верига, праймерът е идентичен с този участък от смислената верига, който съдържа кодона, подлежащ на мутация, освен при несъвпадение с този кодон, което води до деления на кодона или до триплет който кодира за друга аминокиселина. Когато фагът носи смислената верига, праймерът е комплементарен към този участък на правилната верига, която съдържа кодона, подлежащ на мутация.освен в случай на несъвпадение с триплета, сдвоен с този кодон, който подлежи на делеция. Условията, при които трябва да бъде проведена хибридизацията, са описани от Smith and Gillam (виж по-горе). Температурата обикновено е в обхвата от 0° до 70°С, по-често от 1° до 50°С. След хибридизирането праймерът се разширява върху фаговата ДНК чрез реакция с ДНК полимераза I, % ДНК полимераза, реверсивна транскриптаза или други подходящи ДНК полимерази. Резултантната dsДHK се преобразува в затворена кръгова ds ДНК чрез третиране с ДНК лигаза, например Т₄ ДНК легаза. ДНК молекулите, имащи едноверижни участъци, може да се разрушат чрез обработка с S, ендотуклеаза.

Олигонуклеотиднонасочената мутагенеза може да бъде по подобен начин използвана за получаване на мутантен IL-2 ген, който кодира елин мутеин. имащ IL-2 активност, но в който cys 125 е променен в ссрин 125.Предпочитаният олигонуклеотиден праймер, използван за получаване на мутантния IL-2 ген, когато фагът носи смислената верига на гена, е GATGATG CTTCTGAGAAAAGGTAATC. При този олигонуклеотид има С —» G преход в средната база на триплета, който е сдвоен с кодон 125 на IL2 гена.

Полученият мутантен хетеродуплекс се използва слсл това за трансформиране на компетентен микроорганизъм или клстка-гостоприемник. Репликацията на хетеродуплскса от гостоприемника дава прогени от двете вериги. След репликацията мутантният ген може да бъде изолиран от прогени на мутантната верига, включени в подходящ експресионен вектор, а векторът да бъде използван за трансформиране на подходящ гостоприемник-микроорганизъм или клетка. Предпочитани вектори са плаз мидите pBR322, pCI^ и техни варианти, синтетични вектори и други подобни. Подходящи микроорганизми са E.coli, Pseudomonas. Bacillus subtilis, Bacillus tliuringiensis, различни ша5 мове дрожди. Bacillus thermophilus, животински клетки като клетки от яйчници на мишки, плъхове и китайски хамстер (СНО), растителни клетки, животински и растителни гостоприсмници и други подобни. Трябва да се отбележи, 10 че когато избрания гостоприемник се трансформира с вектора, се въвеждат и подходящи промотор-операторни последователности за експресия на мутеина. Гостоприемниците може да бъдат прокариоти или сукариоти (методи за ин15 серция на ДНК в еукариотни клетки са описани в РСТ заявка №№ US81/11239 и US81/ 00240, публикувани на 3 септември, 1981). Предпочитаните гостоприемници са E.coli и СНО клетки. Мутеините, получени съгласно 20 изобретението може да бъдат гликозилирани или негликозилирани в зависимост от гликозилирането на природния родителски протеин и използвания за получаване на мутеини гостоприемник. Ако е необходимо, негликозилиран 25 мутеин, получен когато микроорганизмът-гостоприемник е E.coli или Bacillus, може да бъде евентуално гликозилиран ин витро по химически, ензимен и друг начин, известен от нивото на техниката в областта.

При предпочитаното приложение на настоящето изобретение по отношение на IFX-β, цистеиновият остатък в позиция 17 от аминокиселинната последователност, показана на фиг. 1 се променя в серии чрез Т —> А преми35 наване в първата база на кодон 17 от смислената верига на ДНК последователността, която кодира за зрял IFN-β. Индуцира се специфична по място мутагенеза при използване на един синтетичен 17-нуклеотиден праймер GCA

ATTTTCAGAGTCAG, който е идентичен с една последователност от седемнадесет нуклеотида върху смислената верига на IFN-β в участъка на кодон 1“. е изключение на едно единствено несъвпадение в първата база на ко45 дон 17. Това несъвпадение е при нуклеотид 12 в праймера. Трябва да се отчете, че генетичният код може да дегенерира и много от аминокиселините могат да бъдат кодирани от повече от един кодон. Базовият кодон за серин например е шесткратен дегенерат, така че колоните TCT, TCG, TCC, TCA, AGT u ACG кодират за серин. AGT кодонът е избран за предпочитано приложение за удобство. По подобен начин за треонин кодира всеки един от колоните ACT, АСА, АСС u ACG. Приема се, че когато един кодон е специфичен за определена аминокиселина, той включва всички ко- 5 дони дегенерати, които кодират тази аминокиселина. 17-мсрът се хибридизира до едноверижна ДНК на М13 фаг,която носи безсмислената верига на IFN-β гена. След това олигонуклеотидният праймер се удължава върху 10 ДНК, като се използва ДНК полимераза 1 фрагмент на Klenow и получената dsflHK се преобразува до затворена кръгова ДНК с Т₄ лигаза. Репликацията на резултантния мутантен хетеродуплекс дава клонове на ДНК веригата, 15 съдържаща несъвпадението. Мутантни клонове може да бъдат идентифицирани и скринирани по наличието или липсата на специфични рестрикционни сайтове, резистентност или чувствителност към антибиотици или чрез дру- 20 ги методи, известни в тази област. Когато цистеинът се замества със серин, Т —> А преминаването, показано на фигура 2, води до създаването на нов Hinfl рестрикционен сайт в структурния ген. Мутантният клон се иденти- 25 фицира чрез олигонуклеотидния праймер като проба при хибридизационен скрининг на мутиралите фагови плаки. Праймерът има само едно несъвпадение, когато е хибридизиран, е родителския протеин, но съвпада съвсем точно 30 когато е хибридизиран до мутирала фагова ДНК, както е показано на фигура 2. Хибридизационните условия може да се поддържат такива, че олигонуклеотидният праймер да хибридизира предимно до мутантна ДНК, а не до ро- 35 дителска ДНК. Новосъздаденият Hinfl сайт също служи като средство за потвърждаване на мутация на единична база в IFN-β гена.

ДНКнаМ13фаг носеща мутиралия ген се изолира и разделя на подходящи експреси- 40 онни вектори, например плазмид рТгрЗ и E.coli щам ММ294 се трансформира с вектора. Подходящи хранителни среди за култивиране на трансформантите и на техни прогени са известни на специалистите в тази област. Изразеният 45 мутеин на IFN-β се изолира, пречиства и охарактеризира.

Кратко описание на чертежите.

Фигура 1 е диаграма на аминокиселинната последователност на IFN-β. 50

Фигура 2 е схема, показваща получаването на мутантен IFN-β ген чрез олигонуклеотидно насочена мутагенеза.

Фигура 3 е диаграма на плазмид ρβΗτρ.

включващ IFN-β гена.

Фигура 4 е диаграма на клониращия вектор М13 тр8 фаг.

Фигура 5 е рсстрикционна карта на клон М13-Р 1.

Фигура 6 е отпечатък със секвениращ гел на мутантния IFN-β _serl7 ген, показваш промяна на единична база в кодиращия участък.

Фигура 7 е диаграма на експресионния плазмид рТгрЗ.

Фигура 8 показва Hinf I рестрикционната карта на клон pSY 2501, фигура 8 (bi показва получените от него два 169 Ьр и 23 Ьр фрагмента.

Фигура 9 с рсстрикционна карта на клон PSY2501.

Фигура 10 показва кодиращата за мутеин IFN-β_ч. и съответната й аминокиселинна последователност.

Фигури 11 е единична ивица на протеин от 16,000 далтона, .отговаряща на lFN-β^, в екстрактите на клонове pSY2501 и ρβΠτρ.

Фигура 12 е диаграма на плазмида pLM 1, който съдържа гена на човешкия интерлевкин -2 (1L-2) под контрола на E.coli trp промотор.

Фигура 13 е рестрикционна карта на клон на фаг M13-IL-2.

Фигура 14 е рестрикционна карта на плазмида pLW46.

Фигура 15 (а) и 15 (в) показват нуклеотидната последователност на кодиращата верига на клон pLW46 и съответната аминокиселинна последователност на IL-2 мутеин, означен IL-2 ser 1 25

Фигура 16 е диаграма на плазмида pLW32.

Фигура 17 е диаграма на плазмида pLW55.

Примери за изпълнение на изобретението.

Следващите примери поясняват изобретението, но не ограничават неговия обхват. Примери 1 до 11 описват получаването на мутеин на IFN-β, а примери 12 до 20-получавансто на мутеин на IL-2.

Пример 1. Клониране на IFM β ген в М13 вектор.

Използването на М13 фагов вектор като източник на едноверижна ДНК матрица е описано от G.F.Temple et. al, Nature (1982) 296:537540. Плазмидът ρβΠτρ (фигура 3), съдържащ IFN-β гена, под контрола на E.coli trp промо6 тор се смила с рестрикционни ензими Hindlll и Xholl. MI3inp8 (J.Messing. Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA, 1981) репликативната форма (RF) на ДНК (фигура 4) се смила с рестрикционните ензими Hindlll и BamHI и се смесва с ρβΐίτρ ДНК. която предварително е смляна с Hindlll u Xholl. Сместа се лигира с Т₄ ДНК лигаза, лигираната ДНК се трансформира в компетентни клетки на E.coli щам JM103 и се разстила върху Xgal индикаторни плочки (Messing et. al. Nucleic Acids Res. (1981) 9:309-321). Плаките съдържащи рекомбинантен фаг (бели плаки) се отделят, инокулират се в прясна култура на JM 103 и минипрепарати на RF молекули, получени от инфектирани клетки (Bimboim and Dolv, Nucleic Acid Res. (1979) 7:1513-1523). RF молекулите се смилат c различни рестрикционни ензими за идентифициране на клоновете, съдържащи IFN-β инсърта. Рестрикционната карта на един такъв клон (Μ 13-β 1) е показана на фигура 5. Едноверижна (SS)фагова ДНК се получава от клона Μ13-β 1 и служи като матрица за специфична по място мутагенеза при използване на синтетичен олигонуклеотид.

Пример 2. Специфична по място мутагенеза.

Четиридесет пикомола от синтетичния олигонуклеотид GCAATTTTCAGAGTCAG (праймер) се обработват с Т₄ киназа в присъствието на 0,1 тМ аденозинтрифосфат (АТФ), 50 тМ хидроксиметиламинометан хидрохлорид (трие солна киселина) с pH 8.0, 10 шМ магнезиев двухлорид, 5 тМ дитиотреитол (ДТТ) и 9 единици Т₄ киназа, в 50 μΐ при 37°С в продължение на 1 час. Киназираният праймер (12 пикомола) се хибридизира до 5 pg ss Μ13-β 1 ДНК в 50 pl смес, която съдържа 50 тМ натриев хлорид, 10 тМ трие солна киселина с pH 8,0, 10 тМ магнезиев двухлорид и 10 тМ βмеркаптоетанол, при нагряване на 67°С за пет минути и при 42°С за 25 минути. Отгрятата смес се охлажда върху лед и се прибавя към 50 pl реакционна смес, съдържаща по 0,5 шМ от всеки дезоксинуклеозид трифосфат (dNTP), 80 mM трие солна киселина с pH 7,4, 8 тМ магнезиев двухлорид, 9 единици ДНК полимераза 1, фрагмент на Klenow, 0,5 mM АТФ и 2 единици Т₄ ДНК лигаза, инкубира се при 37°С три часа и два часа при 25°С. Реакцията завършва с фенолна екстракция и преципитация с етанол. ДНК се разтваря в 10 тМ трие солна киселина е pH 8,0, 10 тМ етилендиаминтетраоцетна киселина (ЕДТА), 50 % захароза и 0,05 % бромофенил синьо и се подлага на електрофореза върху 0.8 агарозен гел в присъствието на 2 pg/ml етидиум бромид. ДНК ивиците, отговарящи на RF формите на Μ13 βΐ. се слуират от гелните срезове по перхлоратния метод (Davis, et al..Advanced Bacterial Genetics” (1980) стр. 178-179. Елуираната ДНК се използва за трансформиране на компетентни JM103 клетки, култивирани едно денонощие и бкДНК. се изолира от надстоящата течност на култура. Тази ззДНК се използва като матрица при втори цикъл на разширяване на ираймера, гелно пречистените RF форми на ДНК се трансформират в компетентни JM 103 клетки, разстилат се върху агарни плочки и се ннкубират за едно денонощие за получаване на фагови плаки.

Пример 3. Специфична по място мутагенеза.

Експериментът от пример 2 се повтаря, с изключение на това, че използваният синтетичен олигонуклеотиден праймер е GCAATT TTCAGACTCAG. Той променя кодон 17 на IFN-β гена от такъв, който кодира за цистеин в такъв, който кодира за треонин.

Пример 4. Специфична по място делеция.

Повтаря се експериментът от пример 2 с изключение на това, че използваният синтетичен олигонуклеотиден праймер е AGCA ATTTTCAGCAGAAGCTCCTG за делеция на кодон 17 от IFN-β гена.

Пример 5. Скрининг и идентифициране на мутантни плаки.

Блюда, съдържащи мутирали Μ13-β1 плаки (пример 1) и две блюда, съдържащи немутирали Μ13-β1 фагови плаки, се охлаждат до 4°С и плаките от всяко блюдо се пренасят върху два нитроцелулозни кръгови филтъра, чрез поставяне на сух филтър върху агарната плочка за пет минути за първия и 15 минути за втория филтър. След това филтрите се поставят върху дебела филтърна хартия, напоена с 0,2 °₀ натриев хидроксид. 1,5 М натриев хлорид и 0,2 % Triton Х-100. за пет минути и се неутрализират чрез поставяне върху филтърна хартия, напоена с 0,5 М трие солна киселина с pH 7,5 и 0,5 М натриев хлорид за още пет минути. Филтрите се промиват по подобен начин два пъти върху филтри, напоени в 2xSSC (стандартен физиологически цитрат), изсуша7 ват се и след това се изпичат във вакуумна пещ при 80°С за два часа. Двойните филтри се предхибридизират при 55С за четири часа с по 10 ml на филтър ДНК хибридизационен буфер (5 х SSC) pH 7,0, 4 х разтвор на Denhardt (поливинилпиролидин, фикол и говежди серумен албумин, 1 х = 0,02 % от всеки), 0,1 % натриев додецил сулфат (SDS), 50 тМ натриев фосфат буфер с pH 7,0 в 100 pg/ml ДНК от денатурирана сперма на пъстърва. Белязана с ³²Р проба се приготвя чрез киназиране на олигонуклеотидния праймер с белязан с ³²Р АТФ. Филтратите се хибридизират до 3,5x10 cpm/ml от белязания с ³²Р праймер в 5 ml за филтър ДНК хибридизационен буфер при 55°С за 24 часа. Филтрите се промиват при 55°С за 30 минути всеки в промивен буфер, съдържащ 0,1 °_о SDS и намаляващи количества SSC. Първо филтрите се промиват с буфер, съдържащ 2xSSC, и контролните филтри, съдържащи нсмутирали Μ13-β1 плаки, се проверяват за наличност на някаква радиоактивност с гайгеров брояч. Концентрацията на SSC се понижава стъпаловидно и филтрите се промиват, докато не остане откриваема радиоактивност върху контролните филтри с нсмутирали Μ13-β1 плаки. Най-ниската концентрация на SSC, която е била използвана, е O.lxSSC. Филтрите се изсушават на въздуха и се авторадиографират при -70°С за два-три дни. Прави се скрининг с киназиран олигонуклеотиден индикатор на 480 плаки на мутирал М13βΐ и 100 немутирали контролни плаки. Никоя от контролните плаки не хибридизира с индикатора, докато пет мутирали Μ13-β1 плаки хибридизират с него.

Една от петте мутирали Μ13-β1 плаки (M13-SY2501) се взима с игла и се инокулира в култура на JM 103. От надстоящата течност се получава збДНК, а двойноверижна (ds) ДНК се получава от утайката. Тази ssflHK се използва като матрица за дидезокси секвениране на клона, използвайки М13 универсалния праймер. Резултатите от секвенирането са показани на фигура 6, потвърждавайки, че TGT cys кодонът е бил превърнат в AGT ser кодон.

Пример 6. Експресия на мутирал lFN-β в E.coli.

RF ДНК M13-SY2501 се смила с рестрикционните ензими Hindlll и XhoII и включеният 520 Ьр фрагмент се пречиства върху 1 %ен агарозен гел. Плазмидът рТгрЗ, съдържащ Е. coli trp промотор (фигура 7), се смила с ен зимите Hindlll u BamHI, смесва се с пречистен M13-SY2501 ДНК фрагмент и се лигира в присъствие на Т₄ ДНК лигаза. Лшпраната ДНК се трансформира в Е. coli щам ММ294. Резистентни на ампицилин трансформанти се подлагат на скрининг за чувствителност към лекарството тетрациклин. Плазмидна ДНК от пет резистентни на ампицилин, чувствителни към тетрациклин клона, се смилат с Hinfl за скрининг за наличност на M13-SY2501 включване. Фигура 8 (а) показва IllNfl рестрикционни карта на един от клоновете (pSY2501), сравнена с Hinfl картата на оригиналния IFN-β клон, ρβΐίτρ. Както се очаква, има един допълнителен Hinfl сайт в pSY2501, разцепващ 197 Ьр IFN-β вътрешен фрагмент на един 169 Ьр фрагмент и един 28 Ьр фрагмент (фигура 8Ь). Една рестрикционна карта на клон pSY2501 е показана на фигура 9. Цялостната ДНК последователност на мутантния IFN-β ген е показана на фигура 10 заедно с очакваната аминокиселинна последователност.

Плазмидът, означен като клон pSY2501, е депозиран в Колекцията Agricultural Research Culture Collections (NRRL), Fermentation Laboratory, Notrhern Regional Research Center, Science and Education Administration US Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria Ill. 60604 на 30 март 1983 и е получил номера СМСС № 1533 и NRRL № В-15356.

Култури от pSY2501 и ρβΐΐτρ, които включват и техни прогени, се отглеждат до оптическа плътност (OD ) 1.0. Приготвя сс свободен от клетки екстракт и количеството IFN-β антивирусна активност се изследва върху GM2767 клетки с микротитрационен анализ. Екстрактите от клон pSY2501 проявяват три до десет пъти по-висока активност, отколкото pPltrp (таблица 1), което показва че клон pSY2501 е синтезирал повече протеин, проявяващ IFN-β активност или, че получаваният протеин има по-висока специфична активност.

Таблица 1

Екстракт	Антивирусна активност (U/nil)
PSY2501	6 х 10 ^s
ρβΐφρ	I х 10⁵
ptrp³ (контрола)	30

За да се определи дали клон pSY2501 синтезира няколко пъти по активен протеин, екстрактите от двата клона се подлагат на електрофореза върху SDS полиакриламиден гел заедно с контролен екстракт и гелът се оцветява с коомас и синьо за онагледяване на протеините. Както е показано на фигура 11, има само една ивица, отговаряща на един протеин от 18 000 далтона, който се съдържа в екстрактите на клонове pSY2501 и , ρβΗτρ, но не и в контролния екстракт ptrp’. Този протеин, който има молекулно тегло от около 20 000 далтона, но показва гел миграционна картина от 18 000 далтона, за който е установено че е IFN-β чрез пречистване на този протеин от екстракти на ρβΐίτρ. Тъй като в екстрактите от pSY2501 се съдържат по-малко от този протеин, отколкото екстрактите от ρβΐtrp, спе цифичната активност на протеина в екстракти на клон pSY250l е по-висока от тази на клон ρβΗτρ.

Пример 7.

Плазмидът pSY2501 сс трансформира в компетентен субвариант на E.coli щам ММ294, означаван ММ294-1. Проба от получения трансформант е депозирана в Американската колекция типове култури 12301, Parklawn Drive, 10 Rockville, Md 20852 US на 18 ноември 1983 под номер АТСС 39 517.

Пример 8. Продуциране на IFN-β serl7. IFN-β ser 17 се възстановява от Е. coli, които са били трансформирани да продуцират

IFN-β serl7. E.coli се култивират в следната хранителна среда до OD от 10-11 при 680 nm (сухо тегло 8,4 g/Ι).

Съставка	Концентрация
nh₄ci	20 mM
K₂SO₄	16,1 тМ
КН РО.	7,8 тМ
Na₂HPO₄	12,2 тМ
MgSO₄.7H₂O	3 тМ
Na₃ цитрат.2Н₂О	1,5 тМ
MnSO₄.4H_;0	30 μΜ
ZnSO₄.7H₂b	30 μΜ
CuO₄.5H,O	3 μ.Μ
L-триптофан	70 mg/l
FeSO₄.7H₂0	72 μΜ
Тиамин солна киселина	20 mg/l
Глюкоза	40 g/1
15 pH контролирано с NH₄OH

Получените 9,9 1 (9,9 kg) трансформирани E.coli сс охлаждат на 20°С и се концентрират чрез прекарване през филтър с кръстосано протичане при средно налягане от около 110 кра и постоянна скорост на филтрата от 260 ml/min, докато теглото на филтрата достигне 8,8 kg. Концентратът (приблизително 1 1) се отделя в съд и се охлажда до 15°С. След това клетките в концентрата се разрушават чрез про пускането му през хомогенизатор Manton-Gaulin 45 при 5°С, около 69 000 кра. Хомогенизаторът се промива с един литър буфериран с фосфат физиологичен разтвор с pH 7,4 (PBS) и промивната течност се добавя към диеруптата за получаване на краен обем от два литра. Този обем 50 се центрофугира непрекъснато при 12 000 xg и скорост на протичане от 50 ml/min. Утайката се сепарира от надстоящата течност и се сус9 пендира повторно в четири литра PBS, съдържат 2 °„ тегл. SDS. Тази суспензия се разбърква при стайна температура за 15 минути, след което вече няма видимо суспендиран материал. След това разтворът се екстрахира с 2-бутанол в обемно съотношение бутанол:разтвор 1:1. Тази екстракция се извършва в сепаратор течна-течна фаза при скорост на протичане от 200 ml/ min. След това органичната фаза се сепарира и изпарява до сухо, при което добивът е 21,3 g протеин. Той се ресуспсндира в дестилирана вода при обемно съотношение 1:10.

Възстановеният продукт се изследва за активност на човешки IFN-β . като се използва анализ, основаващ се на защита срещу вирусен цитопатичен ефект (СРЕ). Изследването се извършва в микротитрационни плочки. По 50 μΐ минимум есенциална среда се поставя във всяка ямка и в първата ямка се поставят 25 μΐ от пробата, а в следващите ямки се правят серийно 1:3 обемни разреждания. Във всяка плочка има вирус (Vesicular stomatitus), клетки (човешка фибробластна линия GM-2767) и сравнителна IFN-β контрола. Използваният за сравнение IFN-β е 100 единици на милилитър. След това плочките се облъчват с ултравиолетова светлина в продължение на 10 минути. След облъчването към всяка ямка се добавят 100μ1 от клетъчната суспензия (1,2 х 10⁵ клетки/ml) и плочките се инкубират 18-24 часа. Добавя се вирусен разтвор по една плакообразуваща единица за клетка във всяка ямка, освен при контролата. Плочките се инкубират докато вирусната контрола покаже 100 % СРЕ. Това става нормално 18 до 24 часа след добавянето на вирусен разтвор. Резултатите от изследването се интерпретират по отношение на разположението на ямката с 50 % СРЕ спрямо сравнителната IFN-β контрола. Спрямо тях се определя титъра за интерферон на всички проби върху плочката. Определената специфична активност на възстановения продукт е 5 х 10⁷ U/mg.

Пример 9. Кисело преципитиране и хроматографско пречистване.

Процесът от пример 8 се повтаря с изкзю«ение на това, че след екстрахиране и сепариране на водната и органичната фаза и смесване на органичната фаза с PBS в обемно съотношение 3:1, рН на сместа се понижава до около 5 чрез добавяне на ледена оцетна кисе-лина. Полученият преципитат се сепарира чрез центрофугиране при 10 000 до 17 000 g 15 минути и утайката се разтваря повторно в 10 % (тегло/ обем) SI)S, 10 ml ДТТ, 50 ml буфер натриев ацетат рН 5,5 и се загрява до 8()С за пет минути.

След това разтворът се поставя в Brownlee RP-300, 10μΜ, “Aquaporc” колона, при използване на Beckman градиентна система. Буфер А е 0,1 % трифлуорооцетна киселина (TFA) в Н₂О, буфер В е 0,1 % TFA в ацетонитрил. Откриването става по ултравиолетовата абсорбция при 280 пш. Програмата на разтворителя е линеен градиент от 0 % буфер В към 100 % буфер В за три часа. Фракциите, проявяващи най-високите активности на интерферон, се събират на едно място и се определя, че специфичната активност на събрания интерферонов препарат е 9,0 х 10' до 3,8 х 10^s международни единици за mg протиен, в сравнение с тази от около 2x10’ U/mg на природния IFN-β.

Пример 10. Биохимическа характеристика на 1ΕΝ-β_{κΓ 17}.

Аминокиселинният състав се определя след траеща 24 до 72 часа хидролиза на проба от 40 pg в 200 μΐ 5.7-Ν солна киселина. 0.1 % фенол при 108°С. Пролин и цистеин се определят по същия начин след окисляване с пермравчена киселина, като в този случай фенолът се пропуска при хидролизата. Триптофан се анализира след 24 часа хидролиза на пробни образци от 400 μΐ в 5,7-Ν солна киселина, 10 % меркаптооцетна киселина (без фенол). Анализът се извършва на Beckman 121 MB анализатор за аминокиселини при използване на единична колона с ААО смола.

Аминокиселинният състав, изчислен от представителните 24-, 48- и 72-часови хидролизи на пречистен IFN-β^ _]7 съвпада с очаквания според ДНК последователността на клонирания IFN-β ген, минус липсващия N-kpaен метионин.

Аминокиселинната последователност на първите 58 остатъка от аминокиселинния край на пречистен IFN се определя на 0.7 mg проба в Beckman 890°С секвенаторс 0,1 м буфер Quadrol. РТН аминокиселини се определят чрез обратнофазова HPLC върху Алтекс ултрасферна ODS колона (4.6 х 250 mm) при 45°С, елуиране 1,3 минути с 40 % буфер В и 8,4 минути от 40-70 % буфер В, при което буфер А е 0,0115 мола натриев ацетат, 5 % тетрахидрофуран (THF), рН 5,11, а буфер В е 10 % THF в ацетонитрил.

N-крайната аминокиселинна последова10 тслност на IFN-p_{icr ]7} след определяне съвпада с очакваната на база ДНК последователността, с изключение на N-крайния мстионин.

Пример 11. Алтернативен метод за получаване и пречистване на 1ΓΝ-β

Е. coli трансформирани е pSY2501 се култивират в следната среда.

Съставка	Приблизителна начална концентрация
\л, цитрат.2Н,0	1 mM
КН₂РО₄	30 тМ
(NH₄)₂SO₄	74 тМ
MgSO₄.7H,O	3 тМ
MnSO₄.H₂0	46 μΜ
ZnSO₄.7H₂O	46 μΜ
CuSO₄.5H,O	1-2 μ Μ
L-триптофан	350 μΜ
FeSO₄.7H O	74 μΜ
Тиамин-солна киселина	0,002 %
Глюкоза	1,5 %

При нужда се добавя Dow Corning пеногасител-25 процентов разтвор на полипропилен гликол, 50 процентов разтвор на глюкоза и 5-нор.мален калиев хидроксид.

Температурата се поддържа 37±1°С, pH 6,5±0,1 с натриев хидроксид, а разтвореният кислород на 30 % насищане на въздуха. Оптическата плътност и количеството остатъчна глюкоза се измерват след 14 часа и през интервали от приблизително 1 час след това. Материал се събира когато консумацията на глюкоза достигне 40±6 g/1 /OD при 680 наномстра=10-1I).

Събраният материал се концентрира приблизително трикратно чрез преминаване през микропорест филтър с напречно протичане под налягане. Концентрираните клетки се диафилтрират с дейонизирана вола докато събраният материал се концентрира 4-5 пъти. След това клетките сс разкъсват чрез прекарването им през хомогенизатор Manton-Gaulin при около 4,1 до 5.5x10⁴ кра. След първото преминаване се добавя SDS-натриево-фосфатен буфер до крайна концентрация от 2 % SDS, 0,08 М натриев фосфат и хомогенизирането продължава още един час. Тогава се добавя твърд ДТТ до крайна концентрация от 50 mM и хомогенизатът се загрява до 90±5°С за 10 минути. Получената клетъчна суспензия се екстрахира с 2-бутанол при обемно съотношение 1:1 бутанол:суспензия в статичен миксер.

Сместа се центрофугира и се отделя богатата на 2-бутанол фаза.

Богата на бутанол фаза се смесва с 2,5 обема 0.1 % SDS в буфериран с фосфат физиологически разтвор (PBS). Добавя се твърд 35 ДТТ до крайна концентрация от 2 mM. pH на сместа се установява на 6,2±0,1 с ледена оцетна киселина и тази смес се центрофугира. Получената утайка се отделя и се суспендира отново в PBS + 10 % SDS при pH установено на 40 8,5±0,1 с l-Ν натриев хидроксид основа. Добавя се твърд ДТТ до крайна концентрация 100 mM и суспензията се загрява до 90±5“С за 10 минути. След това суспензията се охлажда до около 25С pH се наглася на 5,5±0,1 с леде45 на оцетна киселина и разтворът се филтрира.

След това разтворът се поставя в Sephacryl S-200 колона и фракциите, които проявяват най-високи активности на интраферон, се отделят, след което се концентрират чрез улт50 рафилтрация с разделяне при 10 Kdal молекулно тегло. Концентратът се окислява чрез добавяне на еквимоларни количества протеин и йодособснзосна киселина в реакционен съд. съдържащ 2тМ натриев пирофосфат, 0,1 % SDS и I тМ ЕДТА. рН се поддържа по време на окисляването на 9,0±0,1 с 0,5-нормалсн натриев хидроксид и се установява на 5,5±0,2, когато 5 окисляването е завършено. След окисляването концентратът се пропуска отново през ултрафилтрационната установка при 10 Kdal разделяне на молекулно тегло.

Концентратът се поставя в главна Sephac- 10 ryl S-200 колона и фракциите се анализират чрез SDS-PAGE за откриване на тези, несъдържащи замърсители с високо молекулно тегло. Тези фракции се събират на едно място и се пропускат през ултрафилтрационно устройство. Фил- 15 трираният концентрат се фракционира върху Sephadex G-75 колона. Провежда се SDS-PAGE анализ на фракциите за определяне на тези, които не съдържат замърсители с ниско или високо молекулно тегло. Тези фракции се събират 20 на едно място за обезсолване.

Sephadex G-25 колона, калибрирана с 1 тМ натриев хидроксид се зарежда със събраните фракции от Sephadex G-75 колоната като се използва дестилирана вода с рН нагласено 25 на 10,8-11 с 50 % натриев хидроксид. Пречистеният продукт се събира до празна проба. От този обезсолен, пречистен IFN-β мутеин може да бъдат приготвяни по известни методи състави за терапевтично приложение. 30

Биологични тестове на IFN-β

Антигенно сравняване.

IFN-β се сравнява антигенно с IFNβ, продуциран от диплоидни фибробласти, като се използва тестът за неутрализиране на 35 вируси. Поливалентен антисерум за диплоид фибробластен IFN-β се получава в зайци. Този антисерум блокира антивирусната активност както на диплоиден фибробластен IFN-β, така и на ΙΡΝ-β_κΓ17 при тестовете за неутрализира- 40 не на вируси, което показва че двата протеина са неразличими антигенно.

Антивирусна активност.

Пречистеният iFN-β^ ₁₇ се сравнява по антивирусна активност с природен IFN-β. Инхибирането на репликацията на vesicular stomatitis вирус в диплоидни кожни фибробласти (HS27F) е неразличимо от това на естествената молекула. По същия начин инхибирането на херпес симплекс вирус тип I в HS27F фибробласти от естествен и мутантен протеин е сравнимо.

Антипролиферативна активност.

Антипролиферативна активност на 1FNβ^ ₁₇ за непрекъснати клетъчни линии е сравнима с тази на природния IFN-β. Т24 клетки, получени от преходен клетъчен карцином, се третират с 200 единици/мл от протеините. Клетъчният растеж се инхибира значително (р<0,02) и от двата протеина.

Стимулиране на естествени килърни клетки (ΝΚ>.

Способността на IFN-β ^ ₁₇ да стимулира ΝΚ клетъчна (спонтанна клетъчно опосредствана цитотоксичност) активност се подлага на тест. Сепарирани с Ficoll-hvpaque периферни мононуклеарни клетки (РМС) или обогатени на NK лимофоцитни препарати (лишени от моноцити чрез пластична адхезия и от ОКТЗ-положителни Т клетки чрез третиране с ОКТЗ антитяло плюс комплемент) се инкубират едно денонощие в хранителна среда съдържаща IFN-β _ в различни концентрации. Белязани е ^5; Ст клетки мишени се инкубират с ефекторни клетки (при съотношение ефекторни клеткигмишенни клетки=50:1) за 2-4 часа. NK клетъчната цитотоксичност се определя чрез измерване на количеството белязани клетки в средата. Резултатите от тези тестове са показани в таблица 1 по-долу

Таблица 1

NK клетъчна цитотоксичност при интерферон (специфичен процент на освобождение ⁵ Сг SEM) IFN u/ml

Клеткамишена	Ефекторна клетка	0	10	30	100	300	1000
Т24	РМС	7,23 ± 5,1	23,1 ± 4,4	24,4 ± 1,1	34,1 ± 2,5	50,0 ± 2,0	40,4 ± 4,4
Chang	РМС	4,7 ± 0,5	7,2 ± 0,8	9,5 ± 1,7	15,9 ± 1,3	21,9 ± 1,4	26,9 ± 1,8
Chang	NK Епг	19,2 ± 4,6	39,4 ± 4,1	ND	54,2 ± 6,1	ND	41,7 ± 5,5
К562	NK Епг.	41,0 ± 4,6	48,4 ± 1,6	ND	62,2 ± 3,5	ND	63,2 ± 3,5

Както е посочено клетките мишени сс убиват по-ефективно от третирани с IFN-β^ ₇ клетки, отколкото от нетретираните.

Клинични опити.

Започната е фаза I на клинични опити за потвърждаване безопасността на IFN-β _чза хора. Тези опити включват прилагане на протеина при пациенти мускулно и венозно в дози в обхвата между 1 х 10^s единици (1 pg протеин) до 400 х 10⁶ единици. В началната фаза I на клиничните опити не са наблюдавани никакви неочаквани нежелани ефекти.

Както е посочено, препаратът IFN-β проявява специфична активност, твърде близка или по-висока от тази на природния IFN-β. 1FNβ _ιΓ няма свободни сулфхидрилни групи, а една -S-S- връзка между единствените останали цистеини в позиции 31 и 141. Протеинът не образува лесно олигомери и съществува основно в мономсрна форма. Получаваният съгласно изобретението IFN-β^ ₁₇ може да бъде прилаган както самостоятелно, така и в различни смеси, във фармацевтично приемливи препарати в инертни, нетоксични, непредизвикващи алергии, физиологически поносими носители с клинично и терапевтично приложение при терапия на рак или при състояния, изискващи терапия с интерферон и при вирусни инфекции като вирусен херпес симплекс I и II. вирусен хепатит В, вирусни простуди и риновирус. Носителите включват, без да се ограничават, дестилирана вода, физиологичен разтвор, Рингеров разтвор, разтвор на Ханк и други подобни. Могат да бъдат включвани и други нетоксични стабилизиращи и улесняващи разтварянето добавки, като декстроза, HS А (човешки серумен албумин) и други подобни.Терапевтичните средства могат да се прилагат орално или парентерално, например венозно, мускулно, интраперитонеално и подкожно. Препарати на модифициран IFN-β съгласно изобретението може също да се използват за локално приложение в подходящи носители, използвани нормално за такива пели. IFN-β мутеинът може да се прилага локално или системно, сам или в комбинация с други терапевтични средства, например с ацикловир за терапевтични и профилактични цели съгласно US Ν” 4 355 032. Дозата мутеин, приложен при пациенти-хора, ще зависи от това дали той се прилага непрекъснато (включително интермитиращо) или като болус. Количеството, прилагано непрекъснато, е обикновено по-малко от количеството прилагано ка то болус. Това количество обикновено е в обхвата от 1 х 5⁴ до 4 х 10^s единици, по-често от около I х 10''до I х 10’.

Предимствата на описания мутеин на IFN-β се основават на елиминирането на една свободна сулфхидрилна група в позиция 17 на IFN-β, като с това се подтиква протеина да образува правилни дисулфидни връзки между cys31 u cvsl 41 и да приеме конформацията необходима за проявата на пълна биологическа активност. По-високата специфична активност на IFN-β^ ₁₇ позволява използването на по-малки дози при терапевтично приложение. Благодарение на делецията на свободната -SH група. lFN-β^, протеинът не образува димери и олигомери така лесно, както микробиално продуцирания IF.N-β. Това улеснява пречистването на протеина и повишава неговата стабилност.

Пример 12.

Нуклеотидната последователност на сДНК клона, кодиращ за човешки 1L-2, методите за получаване на IL-2 сДНК банка и скрининг на същите за 1L-2 са описани от Taniguchi et al., Nature (1983) том 24. стр. 305 et seq.

сДНК банки, обогатени с потенциални IL-2 сДНК клонове, се получават от обогатена с IL-2 тРНК фракция, получена от индуцирани периферни кръвни лимфоцити PBL и Jurkat клетки по обикновените методи. Обогатяване на тРНК с информация за 1L-2 се извършва чрез фракциониране на тРНК и идентифициране на фракцията имаща IL-2 тРНК активност чрез инжектиране на фракциите в ооцити на Xenopus laevis и анализ на ооцитните лизати за IL-2 активност върху НТ-2 клетки (Watson J.Exp.Med.(1979) 150:1570-1519 u Gillis et al., J Immun (1978) 120:2027-2032).

Пример 13. Скрининг и идентифициране на 1L-2 сДНК клонове.

IL-2 сДНК банките се скринират при използване на метод за хибридизация на колонии. Всяка микротитрационна плочка се реплицира върху двойна нитроцелулозна филтърна хартия (S<kS тип ВА-85) и колониите се култивират при 37°С в продължение на 14-16 часа върху L агар, съдържащ 50 pg/ml ампицилин. Колониите се лизират и ДНК се фиксира към филтъра чрез последователно третиране за пет минути с 500 тМ натриев хидроксид, 1,5 М натриев хлорид, промиване два пъти за по 5 минути всеки път с 5 х стандартен физиологичен цитрат (SSC). Филтрите се изсушават въздушно и се изпичат при 80°С за два часа. Двойните филтри се прсхибрилизират при 42С за 6-8 часа с 10 ml за филтър ДНК хибридизационен буфер (50 % формамид, 5 х SSC с pH 7,0, 5 х разтвор на Denhardl (поливинилпиролидин, и фикол и говежди серумен албумин; 1 х =-0,2 % от всеки), 50 тМ натриево-фосфатен буфер с pH 7,0, 0,2 % SDS, 20gg/ml Poly U, и 50 pg/ml ДНК от денатурирана сперма на пъстърва.

Белязана с ^,2Р 20-мерна олигонуклеотидна проба се приготвя в основа на последователността на IL-2 гена, описана от Taniguchi et al.(виж по-горе). Нуклеотидната последователност на пробата е GTGGCCTTCTTGGGCATGTA.

Пробите образци се хибридизират при 42°С за 24 до 36 часа с 5 ml/филтър ДНК хибридизационен буфер, съдържащ ³²Р нуклеотидната проба. Филтрите се промиват два пъти по 30 мин всеки път при 50°С с 2 х SSC, 0,1 % SDS, след това се промиват два пъти с 1 х SSC и 0,1 % SDS при 50°С за 90 минути, изсушават се въздушно и се авторадиографират при -70°С за 2 до 3 дни. Идентифицират се положителните клонове и отново се извършва скрининг с пробата. Идентифицират се клоновете с пълна дължина и се потвърждават чрез изготвяне на карти с рестрикционни ензими и се сравняват с последователността на 1L-2 сДНК клона установена от Taniguchi et al.(виж по-горе).

Пример 14. Клониране на IL-2 ген в М13 вектор.

IL-2 генът се клонира в \I13mp9, както в пример 1, при използване на плазмида pLWl (фигура 12), съдържащ IL-2 гена под контрола на E.coli trp промотор. Един пробен образец от pLWl е депозиран в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md, 20852, US на 4 август 1983 и му е даден АТСС номер 39 405. Рестрикционната карта на един клон (означен M13-IL2) съдържащ 1L-2 инсърта е показана на фигура 13. Елноверижна фагова ДНК се получава от клон M13-1L2 и служи като матрица за олигонуклеотидно насочена мутагенеза.

Пример 15. Олигонуклеотидно насочена мутагенеза.

Както е посочено по-рано, 1L-2 съдържа цистеинови остатъци в аминокиселинни позиции 58, 105 и 125. Въз основа на нуклеотидните последователности на частите на 1L-2 гена, които съдържат кодонитс за тези три цистеинови остатъка, три олигонуклеотидни праймсра са проектирани и синтезирани за мутация на кодониге за тези остатъци до кодови за серин. Тези олигонуклеотиди имат следните последователности:

CTTCTAGAGACTGCAGATGГТТС (DM27) за промяна на cys 58;

CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM28) за промяна на cys 105 и

GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM29) за промяна на cys 125.

Четиридесет пикомола от всеки олигонуклеотид се киназират поотделно в присъствието на 0,1 тМ АТФ, 50 тМ трис-солна киселина с pH 8,0, 10 тМ магнезиев двухлорид, 5 тМДТТ и 9 единици Т₄киназа в 50 μΙ при 37°С за 1 час. Всеки от киназираните праймери (10 пикомола) се хибридизира с 2,6 gg от M13-IL2 ДНК в 15 μΙ от една смсс. съдържаща 100 m.M натриев хлорид, 20 тМ трис-солна киселина с pH 7,9, 20 тМ магнезиев двухлорид и 20 тМ β-меркаптоетанол, чрез загряване до 67°С за пет минути и на 42°С за 25 минути. Отгретите смеси се охлаждат върху лед и се нагласят до краен обем с 25 μΐ реакционна смес съдържаща 0,5 m.M от всеки dNTP, 17 mM триссолна киселина, pH 7,9, 17 тМ магнезиев двухлорид, 83 тМ натриев хлорид. 17 тМ βмеркаптоетанол, 5 единици ДНК полимераза 1 фрагмент на Klenow, 0,5 mM аденозинтрифосфат (АТФ) и 2 единици Т₄ ДНК лигаза, инкубирана при 37°С за пет час?.. Реакциите се прекратяват чрез загряване до 80°С и тогава реакционните смеси се използват за трансформиране на компетентни JM103 клетки, разстлани върху агарни плочки и инкубирани едно денонощие за получаване на фагови плаки.

Пример 16, Скрининг и идентифициране на мутирали фагови плаки.

Плочки, съдържащи мутирали M13-1L2 плаки, и две плочки, съдържащи немутирали M13-IL2 фагови плаки, се охлаждат до 4^ПС и фаговите плаки от всяка плочка се пренасят върху два нитроцелулозни филтърни кръга чрез притискане на сух филтър върху агарната плочка за 5 минути за първия филтър и 15 минути за втория филтър. След това филтрите се поставят върху дебела филтърна хартия, напоена с 0,2-N натриев хидроксид, 1,5 М натриев хлорид и 0,2 % Triton за пет минути и се неутрализират чрез разстилане върху филтър14 на хартия, напоена с 0,5 М трис-солна киселина с plI 7,5 и 1,5 М натриев хлорид за още пет минути. Филтрите се промиват по подобен начин два пъти върху филтри, напоени в 2 х SSC, изсушават се във въздушна среда и тогава се изпичат във вакуумна пеш при 80С за два часа. Двойните филтри се прехибридизират при 42°С за четири часа с по 10 ml за филтър ДНК хибридизационен буфер (5 х SSCрН 7,0, 4 х разтвор на Denhardt (поливинилпиролидон, фикол и говежди серумен албумин, 1 х 0,02 % от всеки), 0,1 % SDS, 50 тМ буфер натриев фосфат-рН 7,0 и 100 pg/ml ДНК от денатурирана сперма на пъстърва. Приготвят се индикатори, белязани с ³²Р чрез киназиране на олигонуклеотидни праймери с белязан АТФ. Филтрите се хибридизират с 0,1 х 10⁵ cpm/ml от белязания с ³²Р праймер в пет ml за филтър ДНК хибридизационен буфер при 42°С за осем часа. Филтрите се промиват два пъти при 50 ^!С за 30 минути, всеки в промивен буфер, съдържащ 0,1 % SDS и 2 х SSC и два пъти при 50°С за 30 минути всеки с 0,1 % SDS и 0.2 °₀ SSC. Филтрите се изсушават на въздуха и се авторадиографират при -70°С за два до три дни.

Тъй като олигонуклеотидните праймери DM28 u DM29 са предназначени да създадат нов Ddel рестрикционен сайт в мутиралите клонове (фигура 14), RF-ДНК от известен брой клонове, които са хибридизирани с всеки един от тези киназирани праймери се смилат с рестрикнионен ензим Ddel. Една от мутиралите M13-1L2 плаки, която е хибридизирана с праймер DM28 и има нов Ddel рестрикционен сайт (M13-LW44) се отделя и се инокулира в култура на JM103, като от надстоящата течност на културата се получава ssJHK, а от клетъчната Maca-dsRF-ДНК. По същия начин една плака, която е хибридизирана с праймер DM29 (Μ 13 LW46) се отделя и от нея се получават и ss4HK и RF-ДНК. Олигонуклеотидният праймер DM27 е предназначен да създава нов PstI рестрикционен сайт вместо Ddel сайт. Поради това на плаките, които хибридизират с праймера, се прави скрининг за на личност на нов PstI сайт. Една такава фагова плака сс идентифицира (М I3-IW42) и от нея се получава и ххДНК и RF-ДНК. ДНК от всеки от тези три клона се секвенират за потвърждаване, че TGT кодоните-мишени за цистеин са превърнати в ТСТ колони за серии.

Пример 17. Реклониране на мутантен IL2 ген за експресия в E.coli.

Всяка RF-ДНК от M13-LW42, M13-LW44 u M13-LW46 се смила с рестрикционните ензими Hindlll и Banll и включените фрагменти сс пречистват от 1 % агарозен гел. По същия начин плазмидът рТгрЗ (фигура 7) се смила с Hindlll u Bdnll, големият плазмиден фрагмент, съдържащ trp промотора, се пречиства върху агарозен гел и тогава се лигира с всеки от включените фрагменти, изолирани от M13-LW42, Μ13LW44 u M13-LW46. Лигираните плазмиди се трансформират в компетентни E.coli К12 щам ММ294. П лазмиднитс ДНК от тези трансформанти се анализират, като се изготвя карта с рестрикционни ензими за потвърждаване наличността на плазмидите pLW42, pLW44 u pLW46. Фигура 14 е рестрикционна карта на pI.W46.

Когато всеки един от тези отделни клонове се култивира в отсъствие на триптофан за индуциране на trp промотора и свободните от клетки екстракти се анализират върху SDSполиакриламиден гел, за всичките три клона pLW42, pLW44 u pLW46 се установява, че синтезират 14,5 kd протеин, подобен на този, установен в положителна контрола pLW21, за която е знае, че синтезира 14,4 kd IL-2 протеин. Когато тези екстракти се подложат на изследване за IL-2 активност върху миши НТ-2 клетки, само клоновете pLW21 (положителна контрола) и pLW46 проявяват значителна IL2 активност (таблица II по-долу), което показва че cys 58 и cys 105 са съществени за биологическата активност и промяната им в серини (pLW42 u pLW44 съответно) воли до загуба на биологическата активност. Cys 125, от друга страна, трябва да нс е съществен за биологическата активност, защото промяната му до серии 125 (pL\V46) не оказва влияние върху биологическата активност.

Таблица 2

Клонове	IL-2 активност (μ /nil)
pIL2-7 (отрицателна контрола)	1
pLW21 (положителна контрола)	113,000
pLW42	660
pLW44	1,990
pLW46	123,000

Фигура 15(a) показва нуклеотидната поеледователност на кодиращата верига на клон pI.W46. При сравняване с кодиращата верига на природния човешки 1L-2 ген, клон pLW46 има една единична промяна на база от G -> С при нуклеотид 374. Фигура 15(в) показва съответната аминокиселинна последователност на 1L-2 мутеин, кодиран чрез pLW46. Мутеинът е означен des-аланил (ala) IL-2^^. При сравняване с природния IL-2 мутеинът има серин вместо цистеин в позиция 125, има един начален N-краен метионин (който е сменен) и му липсва началния N-краен аланин на природната молекула.

Образец от E.coli К12 щам ММ294, трансформиран с pLW46 е депозиран в American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md 20852, US на 26 септември 1983 и е означен с АТСС номер 39 452.

Примери 18 и 19 описват получаването на алтернативен и предпочитан вектор за експресия на аланил (ala) IL-2 _jerl2J.

Пример 18. Получаване на Ala-IL-2 експресионен вектор pLW32.

Един кодон (GCG) за аланин е включен непосредствено след началния кодон на 1L-2 гена от pLWl чрез олигонуклеотидна насочена мутагенеза по следния начин. Олигонуклеотидният праймер, 5'-GAAGTAGGCGCCATAAG-3', се киназира. хибридизира се до ssM13-IL2 ДНК и се разширява при използване на общия метод от пример 15, за да образува мутационен хетеродуплекс. Освен инсерцията на GCG кодона, мутагенезата поражда един нов Nar! рестрикционен сайт в гена. Хетеродуплексът се преобразува в затворен кръгов хетеродуплекс и той се използва за трансформиране на компетентни JM103 клетки, които се разстилат върху блюда с агар и се инкубират както в пример 15. Прави се скри нинг на плочките за идентифициране на мутирал M13-IL2 чрез процедурата по пример 16. Един мутантен фаг, идентифициран като М13LW32 се избира за използване при допълнително клониране и от него се получава RF-ДНК. Фигура 16 е диаграма на плазмида pLW32.

Пример 19. Конструиране на Ala-iL-2 _serl2, експресионен клон pLW55.

PF-ДНК от MI3-LW46 (примери 16 и 17) се смила с Xbal и PstI и 530 Ьр фрагментът, съдържащ карбокси, крайният кодиращ участък на IL-2 гена се пречиства от агарозен гел. pLW42 се смила с Xbal и PstI и големия фрагмент, съдържащ плазмидния вектор и alaIL-2 N-крайната кодираща последователност, се пречистват. Двата пречистени ДНК фрагмента се събират на едно място и се лигират за използване на Т₄ ДНК лигаза. Цитираната ДНК се трансформира в компетентни клетки на E.coli К-12 щам М.М294. Резистентните на тетрациклин трансформанти се анализират чрез изготвяне на карта с рестрикционен ензим за присъствие на плазмид, съдържащ ala-lL-2 _и|2}, идентифициран като pLW55, който има един нов Ddel сайт, неустановявано в pLW32. Фигура 17 е диаграма на pLW55. Свободни от клетки екстракти от бактериални култури, съдържащи pLW55, е установено че проявяват повече от 10’ единици II.-2 активност на милилитър чрез изследване с НТ-2 клетки, виж Watson (по-горе) и GilliS (виж по-горе). Ala-IL-2 _.,₅протеинът е идентичен с молекулата на IL-2_Kr|25показана на фигура 18 (в), с изключение на това, че първата включва началния N-краен аланин на природната молекула.

Един образец от E.coli К-12 щам ММ294 транаформиран с pLW55 е депозиран в Американската колекция типове култури на 18 но16 ември 1983 и е означен с АТСС номер 39 516. E.coli трансформирани с pl.W55 се кулПримср 20. Получаване и пречистване тивират във ферментатор, съдържащ следната на Ala-lL-2 среда:

scr 12.5 '

(N11)	150 m.M
кн₂ро₄	21,6 mM
Na₃ цитрат	1,5 mMol
ZnSO₄.7H₂O	30 μΜ
MnSO₄.5H,O	30 μΜ
CuSO₄.5H₂O	1 μΜ

pH, установено на 6,50 е 2.5-N натриев хидроксид, автоклавиран.

Стерилни добавки (след автоклавиране)

MgSO₄.7H₂O	1 тМ
FeSO₄	100 μΜ
L-триптофан	14 mg/ml
Тиамин-солна киселина	20 mg/ml
Глюкоза	5 g/1
Тетрациклин	5 mg/l
Етанол	2 %
Казаминокиселини	2 %

При нужда се добавят Dow Corning пеногасител полипропилен гликол, 20 процентов разтвор, 50 процентов разтвор на глюкоза и 5N калиев хидроксид.

pH във ферментатора се поддържа на 6,8 с 5-N калиев хидроксид. Остатъчната глюкоза се поддържа между 5-10 g/Ι, разтвореният кислород-на 40 %, а температурата на 37±1°С. Казаминокиселините (20 процентен щок разтвор) се добавят до концентрация от 2 %, когато OD_6S0 е около 10. Материал се събира три часа след като OD достигне около 20.

Събраният материал се концентрира и хомогенизира както в пример 11. След ДТТтоплинна обработка материалът се центрофугира и получената утайка се екстрахира с урса до крайна концентрация от 4 М. Суспензията се центофугира и към твърдата фаза се добавя SDS до концентрация от 5 %.

Разтворът се въвежда в Sephacryl S-200 колона и се отделят фракции, съдържащи IL-2 ( по SDS-PAGE). Отделените фракции се поставят в колона Whatman М-40 запълнена с 18 ми крона Vvdac С₄ с размер на порите 300 А и свързана фаза силикагел калибрирана с 0,1 % TFA. 1L-2 мутеинът се елюира с градиент от 40 % до 60 % 2-пропанол, съдържащ 0,1 % TFA, в продължение на 160 минути. Фракциите, имащи най3$ високи 1L-2 активности, се събират на едно място и се установява, че специфичните им активности са сравними с тези на природния IL-2.

Мутеини на IL-2, в които цистеинът в позиция 125 е заместен с друга аминокиселина, например мутеин lL-2^^ запазват IL-2 активността. Поради това те могат да бъдат приготвяни и използвани по същия начин както природния IL-2. В съответствие с това, такива IL2 мутеини се използват за диагностика и лече45 ние (локално или системно) на бактериални, вирусни, паразитни, протозойни и гъбични инфекции, за усилване на клетъчно опосредствана цитотоксичност; за стимулиране лимфокинно активирана активност на килърни клетки;

5θ за опосредстване възстановяването на имунните функции на лимфоцитите; за подсилване на алоантигенната реактивност; за улесняване въз17 становяването на имунните функции при състояния на придобита имунна недостатъчност; за възстановяване на нормалната имунофункция при стари хора и животни; при разработването на диагностични изследвания, като тези използващи ензимно усилване, изотопно маркиране радиография и други методи, известни на специалистите за следене на равнищата на

II.-2 при болестни състояния; за индуциране растеж на Т-клетки ин витро за диагностични и терапевтични цели за блокиране на рецепторни места за лимфокинази и различни други терапевтични, диагностични и изследователски приложения. Различните терапевтични и диагностични приложения на човешки IL-2 са изследвани и описани от Rosenberg, Grimm et al., Ma/iinider et al., Grimm u Rosenberg. IL-2 мутеините могат да се използват самостоятелно или в комбинация с други имунологично подходящи В и Т клетки или с други терапевтични средства. Примери за подходящи клетки са В или Т клетки, естествени природни килърни (NK) клетки и други подобни, а терапевтичните средства, които могат да се използват в комбинация с полипептидите от настоящето изобретение са различните интерферони, специално гама интерферон, клетъчен растежен фактор В, IL-1 и други подобни. За терапевтични или диагностични приложения те могат да се приготвят в нетоксични, непредизвикващи алергии, физиологически поносими носители като дестилирана вода, Рингеров разтвор, разтвор на Hank, физиологичен разтвор и други подобни. Прилагането на 1L-2 мутеини при хора и животни може да става орално, интраперитонеално, мускулно или подкожно, както изглежда найблагоприятно и удобно на лекаря. Количеството прилаган IL-2 мутеин е обикновено в обхвата около 1 х 10⁴ до 2 х 10⁸ единици.

Модификации на описаните начини за използване на изобретението, които са познати на специалистите в областта на генното инженерство, химията на протеините, медицината и сродни области са също включени в обхвата на следващите по-долу претенции.

Claims

Патентни претенции

1. Структурен ген с ДНК последователност, която кодира един синтетичен интерлевкин-2 мутеин, в който цистеиновият остатък в позиция 125, номерирана съгласно природния човешки интерлсвкин-2, е заместен с неутрална аминокиселина.
2. Структурен ген съгласно претенция I, в който неутралната аминокиселина е избрана от групата, състояща се от серин, треонин, глицин, аланин, валин. левцин. изолевцин, хистидин, тирозин, фенилаланин, триптофан и метионин.
3. Структурен ген съгласно претенция 1, където неутралната аминокиселина е серин или треонин.
4. Структурен ген съгласно претенция 1, където неутралната аминокиселина е серии.
5. Структурен ген съгласно претенция 1, 2, 3, 4 с или без начален ATG кодон.
6. Структурен ген, както е представен на фигура 15 (а), с или без началния ATG кодон.
7. Експресионен вектор, който включва структурния ген съгласно претенция 1, 2, 3, 4 и 6.
8. Експресионен вектор съгласно претенция 7, където векторът е pBR322 или pCRl.
9. Плазмид pLW46 с АТСС номер 39 452.
10. Плазмид pLW55 с АТСС номер 39 516.
11. Клетка-гостоприемник, трансформирана с експресионен вектор, включващ структурен ген с ДНК последователност, която кодира синтетичен интерлевкин-2 мутеин, в който цистеиновият остатък в позиция 125, номерирана съгласно природния интерлевкин-2, е заместен с неутрална аминокиселина, а мутеинът проявява биологичната активност на природния човешки интерлевкин-2. където клетката-гостоприемник е подбрана от групата, състояща се от бактерии, дрожди, животни и растения.
12. Клетка-гостоприемник съгласно претенция 11. където клетката-гостоприемник е бактерия.
13. Клетка-гостоприемник, съгласно претенция 12, където бактерията е E.coli.
14. Клетка-гостоприемник, съгласно претенции 11.12 или 13. където неутралната аминокиселина е от групата, състояща се от серин, треонин. глицин, аланин, валин, левцин, изолевцин, хистидин, тирозин, фенилаланин, триптофан и метионин.
15. Клетка-гостоприемник, съгласно претенции 11,12 или 13, където неутралната аминокиселина е серин.
16. E.coli, трансформирани с експресионен вектор, включващ структурния ген, пред18 ставен на фигура 15 (а) с или без началния ATG кодон.
17. E.coli. трансформирани с плазмид от групата, състояща се от pLW46 и pLW55 и техни прогени.