BG60506B2 - Човешки рекомбинантни интерлевкин-2 мутеини - Google Patents

Човешки рекомбинантни интерлевкин-2 мутеини Download PDF

Info

Publication number
BG60506B2
BG60506B2 BG096074A BG9607492A BG60506B2 BG 60506 B2 BG60506 B2 BG 60506B2 BG 096074 A BG096074 A BG 096074A BG 9607492 A BG9607492 A BG 9607492A BG 60506 B2 BG60506 B2 BG 60506B2
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
mutein
ifn
interleukin
dna
amino acid
Prior art date
Application number
BG096074A
Other languages
English (en)
Inventor
David Mark
Leo Lin
Shi-Da Lu
Original Assignee
Chiron Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/386,207 external-priority patent/USRE33653E/en
Application filed by Chiron Corporation filed Critical Chiron Corporation
Publication of BG60506B2 publication Critical patent/BG60506B2/bg

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Мутеините се използват при диагностика и лечение на вирусни, бактериални, протозойни и гъбични инфекции. С тях се усилва клетъчно посредстваната цитотоксичност и се подпомага възстановяването на имунните функции, включително и при състояния на придобита имунна недостатъчност. Мутеините се получават при бактериална експресия на мутантни гени, които кодират за мутеини, синтезирани от гените за родителските протеини чрез олигонуклеотидно насочена мутагенеза. Характерно за мутеините на биологично активни протеини като ifn и il-2 е, че цистеинови остатъци, които не са съществени за биологичната им активност, се изпускат или заместват с други аминокиселини, с което се елиминират места за образуване на неправилни дисулфидни връзки в молекулата. 10 претенции, 17 фигури

Description

1. Област на техниката.
Това изобретение е в общата област на рекомбинантната ДНК технология. По-специално, то се отнася до мутационни променени биологично активни протеини, които се различават от техните родителски аналози по едно или повече заместваниу^елеции на цистеинови остатъци.
2. Предшестващо състояние на техниката.
Биологично активните протеини, които са получени микробиологично чрез рекомбинантна ДНК технология, означавана по-нататък като рДНК, могат да съдържат цистеинови остатъци, които са несъществени за тяхната активност, но са свободни да образуват нежелани интермолекулярни или интрамолекулярни връзки. Такъв протеин е микробно продуциран човешки бета интерферон (IFN-/?) В хода на получаване на IFN-/S по метода рДНК се наблюдава, че се образуват димери и олигомери на микробиално продуциран IFN-/3 от екстракти от Е. coli, съдържащи високи концентрации IFN- β . Това образуване на мултимери прави пречистването и сепарирането на IFN-/? твърде трудоемко и отнемащо време. Налагат се няколко допълнителни операции при процеса за пречистване и изолиране като редукция на протеина по време на пречистването и повторно окисляване за възстановяване на неговата изходна конформация, като с това се повишава възможността за образуване на некоректна дисулфидна връзка. Установено е освен това, че микробиално продуцираният IFN-Д проявява трайно ниска специфична активност, което се дължи може би на образуването на мултимери или на случайни интрамолекулярниодисулфидни мостове. Поради това е желателно да може да се променят микробиално продуцираните биологично активни протеини като 1FN- β по начин, който оказва нежелано влияние върху тяхната активност, но намалява или елиминира способността им да причиняват интермолекулярно или интрамолекулярни връзки, при което протеинът придобива нежелана третична структура, (т.е. една конформация, която намалява неговата активност) .
Настоящето изобретение сс отнася до получаване методи на директна мутагенеза на мутационно променени биологично активни протеини (такива протеини се наричат “мутеини-Речник по генетика и цитогенетика, 4то изд.Шпрингер, 1976, които запазват активността на родителските аналози, обаче не притежават способността да образуват интермолекулярни връзки или нежелани интрамолекулярни дисулфидни мостове. В тази връзка Separd et al., Nature (1981) 294:563-565 описват един мутеин на IFN- β , в който цистеинът в позиция 141 от неговата аминокиселинна последователност (има три цистеина в естествения човешки интерферон-бета в позиции 17, 31 и 141, Gene (1980) 10:11-15 и Nature (1980) 285:542-547) е заместен от тирозин. Този мутеин е получен чрез бактериална експресия на хибриден ген, получен от частичен IFN-β сДНК клон, имащ G—> А преминаване при нуклеотид 485 на IFN-/J гена. При мутеина липсва биологичната активност на природния IFN- β , което води до извода, че заместеният цистеин е бил съществен за активността.
Методите за насочена мутагенеза са добре известни и са разгледани от Lather u Lecoq, Genetic Engineering Academic Press (1983) стр.31-50. Олигонуклеотидно насочената мутагенеза е специално разгледана от Smith and Gillam, Genetic Engineering:Principles and Methods, Plenum Press (1981) 3:1-32.
Техническа същност на изобретението
Една страна на изобретениетоо мутеин на биологично активен протеин, който има поне един цистеинов остатък, свободен да образува дисулфидна връзка и несъществен за споменатата биологична активност, като в мутеина най-малко един от споменатите цистеинови остатъци е премахнат или заместен от друга аминокиселина.
Друга страна на изобретението се отнася до синтетични структурни гени, имащи ДНК последователности, които са специално моделирани (гени) за кодиране на описания синтетичен мутеин. Част от този аспект са експресионни вектори, които включват такива структурни гени, гостоприемникови клетки или микроорганизми, трансформирани с такива вектори, и процеси за получаване на синтетичен мутеин чрез култивиране на такива трансформанти или техни прогени и възстановя2 ване на мутеина от културата. В случая с мутеини, които имат терапевтично приложение, терапевтичните средства, съдържащи терапевтично активни количества мутеини и терапевтичните методи, са друга страна на изобретението.
Изобретението се отнася и до метод за предотвратяване на образуването на нежелана дисулфидна връзка в протеин, който има един или повече цистеинови остатъци, свободни да образуват такава връзка, мутационно променяне на протеина чрез делеция на цистеинов остатък (остатъци) или заместването им с други аминокиселини.
Друга една страна на изобретението е метод за получаване на описания синтетичен структурен ген чрез олигонуклеотидно насочена мутагенеза, обхващаща следните етапи:
а) хибридизация на едноверижна ДНК, обхващащ верига от структурен ген, кодиращ родителския протеин, с мутантен олигонуклеотиден праймер, комплементарен към една зона на веригата, включваща кодона за цистеина, които трябва да бъде премахнат или заместен или в някои случаи безсмислен триплет, сдвоен с кодона, освен в случай на несъвпадане на този кодон или безсмислен триплет, което определя делеция на кодона или триплет, кодиращ споменатата друга аминокиселина;
б) разширяване на праймера с ДНК полимераза за образуване на мутационен хетеродуплекс и
в) репликация на мутационния хетеродуплекс.
Мутантният олигонуклеотиден праймер, използван в този процес е друга страна на изобретението.
Описание на приложените фигури
Фигура 1 е диаграма на аминокиселинната последователност на IFN- β.
Фигура 2 е схема, илюстрираща получаването на мутантен на IFN-/5 ген чрез олигонуклеотидно насочена мутагенеза.
Фигура 3 показва диаграма на плазмид р Игр, включващ IFN- β гена.
Фигура 4 е диаграма на клониращия вектор М13тр8 фаг.
Фигура 5 е рестрикционна карта на клон М13-0 1.
Фигура 6 е гелен отпечатък на секвенцията на мутантен IFN-/9 serl7 ген, показващ промяна в единична база в кодиращата зона.
Фигура 7 е диаграма на изразяващия плазмид рТгрЗ.
Фигура 8(a) показва Hinfl ограничен клон pSY2501, а фигура 8 (б)-резултантните две 169 Ьр и 28 Ьр фрагмента на същия.
Фигура 9 е рестрикционна карта на клон PSY2501.
Фигура 10 показва кодиращата ДНК последователност за мутеин IFN-/3 ser|7 със съответната аминокиселинна последователност на същата.
Фигура 11 показва единична протеинова верига 18,000 далтона, отговаряща на IFN-yS ^г17 в частта на клонове pSY2501 и ρ β 1 trp.
Фигура 12 е диаграма на плазмида pLWl, който съдържа човешкия интерлевкин-2 (1L2) ген под контрола на E.coli trp промотор.
Фигура 13 е рестрикционна карта на фагов клон M13-1L2.
Фигура 14 е рестрикционна карта на плазмида pLW46.
Фигури 15(a) и 15(6) показват съответно нуклеотидната последователност на кодиращата верига на клон pLW46 и съответната аминокиселинна последователност на мутеина IL-2, означен IL-2
Фигури 16 е диаграма на плазмида pLW32.
Фигура 17 е диаграма на плазмида pLW55.
Техническа същност на изобретението
Настоящето изобретение се отнася до мутеини на биологично активни протеини, в които несъществени за биологичната активност цистеинови остатъци са умишлено премахнати или заместени с други аминокиселини за премахване възможността за интермолекулярно омрежване или образуване на неправилна интрамолекулярна дисулфидна връзка; мутантни гени, кодиращи за такива мутеини; и начини за получаване на такива мутеини.
Протеини, които могат да бъдат мутационно променяни съгласно изобретението, се идентифицират според наличната информация за цистеиновото съдържание на биологично активни протеиниеини и по ролята на тези цистеинови остатъци по отношение на активността и третичната структура. Протеини, за които няма такава информация в литературата, могат за бъдат определени чрез систематично променяне на всеки от цистеиновите остатъци на протеина по методите, които са описани, и определяне на биологичната активност на резултантните мутеини и тяхната склонност да образуват нежелани интермолекулярни или интрамолекулярни дисулфидни връзки. В съответствие с това, въпреки че в изобретението е специално описано и онагледено с примери подолу получаването на мутеините на IFN- и IL-2, трябва да бъде разбрано, че същите методи могат да се прилагат за всеки друг биологично активен протеин, съдържащ функционално несъществен цистеинов остатък, който прави протеина чувствителен към образуването на нежелани дисулфидни връзки. Примери за протеини, различни от IFN-/? и IL-2, които са кандидати за мутационно променяне според изобретението, са лимфотоксини (фактор на туморната некроза), стимулиращ колонии фактора-1 и 1FN-/? 1. Кандидат протеините имат обикновено нечетен брой цистеинови остатъци.
В случая с IFN-j3 е известно от литературата, че и гликозилирания и негликозилирания интерферон показват качествено сходни специфични активности и това, че гликозилните групи не са включени във и не допринасят за биологичната активност на IFN- β . Но бактериално продуциран IFN-/? , който е негликозилиран, проявява постоянно количествено по-малка специфична активност, отколкото природния IFN-/? , който е гликозилиран. За IFN-/? е известно, че има три цистеинови остатъка в позиции 17, 31 и 141. Цистеин 141 е определен от Shepard et al (виж по-горе), като есенциален за биологическа активност. При IFN-/3 , който съдържа четири цистеинови остатъка, има две интрамолекулярни S-Sвръзки: една между cys 29 u cys 138 и друга между cys 1 u cys 98. Като се основаваме на хомоложността между 1FN- β u IFN- a s cys 141 от 1FN-/3 би могъл да бъде включен в интрамолекулна -S-S- връзка със cys 31, оставяйки cys 17 свободен за интрамолекулярно омрежване. Чрез отстраняване на cys 17 или заместването му с различна аминокиселина може да се определи дали той е съществен за биологичната активност и неговата роля в образуването на -SS-връзка. Ако cys 17 не е съществен за биологичната активност на протеина, резултантният протеин е отстранен или заместен cys 17 може да прояви специфична активност, близка до тази на природния IFN-/3 и би могло също да се улесни изолирането и пречистването на протеина.
Чрез използване на олигонуклеотидно насочена мутагенсза със синтетичен олигонуклеотиден праймер, който е комплементарен към зоната на IFN-/? гена при кодона за evs 17, но който съдържа единична или множествени промени на бази в този кодон, може да бъде получен един ген, което има като резултат заместването на cys 17 с някоя друга аминокиселина по избор. Когато се желае делеция в олигонуклеотидният праймер, липсва кодон за cys 17. Превръщането на cys 17 в неутрална аминокиселина като глицин, валин, аланин, левцин, изолевцин, тирозин, фенилаланин, хистидин, триптофан, серин, треонин и метионин е предпочитаният подход. Серин и треонин са най-предпочитаните заместители поради тяхната химическа аналогия с цистеина. Когато цистеинът е премахнат, зрелият мутеин е една аминокиселина по-къс от природния родитепротеин или микробиално продуцирания IFN-/?
За човешкия IL-2 се съобщава, че има три цистеинови остатъка, разположени в позиции 58, 105 и 125 на протеина. Както в случая с IFN-Д , IL-2 е в агрегатирана олигомерна форма, когато е изолиран от бактериални клетки и трябва да бъде редуциран с редуциращи агенти, за да се получи добър добив от бактериални екстракти. Освен това пречистеният редуциран 1L-2 протеин е нестабилен и лесно се реокислява при съхраняване до една олигомерна неактивна форма. Наличието на три цистеина означава, че след реокисляване, протеинът може случайно да образува един от трите възможни интрамолекулярни дисулфидни моста, като само един от тях е правилният, т.е. какъвто е в природната молекула. Тъй като дисулфидната структура на природния IL-2 протеин не е известна, е възможно да се използва изобретението за създаване на мутации в колоните 58, 105 и 125 на IL-2 гена и да се определи кои цистеинови остатъци са съществени за активността и поради това е най-вероятно да бъдат включени при естественото образуване на дисулфидна връзка (мост). В същата връзка цистеиновияу остатък, който не е съществен за активността, може да бъде модифициран за да се предотврати образуването на неправилни интрамолекулярни дисулфидни мостове и да се сведе до минимум вероятността за образуване на интермолекулярни дисулфидни мостове чрез от4 страняване или заместване на свободен цистеинов остатък.
Големината на олигонуклеотидния праймер се определя от изискването за стабилна хибридизация на праймера до зоната на гена, в която ще бъде индуцирана мутацията, и от ограниченията на известните методи за синтезиране на олигонуклеотиди.Факторите, които трябва да се имат предвид при проектиране на олигонуклеотиди за използване при олигонуклеотидно насочена мутагенеза (например обща големина, големина на частта, граничеща смястото на мутация), са описани от Smith u Gillam. Общата дължина на олигонуклеотида трябва да е такава, че да оптимизира стабилна, уникална хибридизация на мястото на мутация, като 5’ и 3' от мястото на мутацията трябва да са с достатъчна големина за избягване редактиране на мутацията от екзонуклеазната активност на ДНК полимеразата. Използвани за мутагенеза олигонуклеотиди съгласно изобретението съдържат обикновено от 12 до 24 бази, за предпочитане около 14 до 20, и по-добре от 15 до 18 бази. Обикновено те съдържат най-малко около три бази 3' от променения или липсващ кодон.
Методът за получаване на модифициран IFN-/5 ген най-общо включва индуциране на специфична по място мутагенеза в IFN-/1 гена при кодон 17 (TGT), като се използва синтетичен нуклеотиден праймер, който изпуска кодона или го променя така, че той да кодира за друга аминокиселина. Когато треонин замества цистеина и праймерът е хибридизиран до безсмислената верига 1FN-/1 гена, предпочитаният нуклеотиден праймер е GCAATTTTCAGACTCAG (подчертаването означава променения кодон). Когато се желае премахване на цистеина, предпочитаният праймер е
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG, който изпуска TGT кодона за cys. Когато цистеинът се замества със серии, се избира един 17-нуклеотиден праймер, GCAATTTTCAGAGTCAG, включващ AGT кодон за серин. Преминаването Т—> А при първата база в cys 17 кодон резултира в променяне на цистеина до серин. Трябва да се отбележи, че когато се въвеждат делеции, трябва да бъде подържана подходяща рамка за ДНК последователността за експресия на желания протеин.
Праймерът се хибридизира до сдновсрижен фаг, като Μ13, fd, или X174, в който е клонирана една верига на IFN-β гена. Трябва да сс отбележи, че фагьт може да носи смислената или безсмислената верига на гена. Когато фагьт носи безсмислената верига, праймерът е идентичен с тази част на смислената верига, която съдържа кодона, който ще мутира, освен при несъвпадение с кодона, който определя премахването на кодона или триплет който кодира за друга аминокиселина. Когато фагьт носи смислената верига, праймерът е комплементарен към тази част на смислената верига, съдържаща кодона, който мутира, освен при подходящо несъвпадение , в триплета, сдвоен с кодона, който трябва да бъде премахнат. Условията, които трябва да се използват при хибридизирането, са описани от Smith u Gillam. Температурата обикновено е от 0 до 70°С, по-специално от 10 до 50°С. След хибридизирането праймерът се разширява върху фаговата ДНК чрез реакция с ДНК полимераза 1, Т4 ДНК полимераза, обратима транкриптаза или друга подходяща ДНК полимераза. Получената dsДHK се преобразува в затворена кръгова dsflHK чрез третиране с ДНК лигаза, например Т4 ДНК лигаза. ДНК молекулите, съдържащи едноверижни зони, могат да бъдат разрушени чрез S, ендонуклеазно третиране.
Олигонуклеотидно насочената мутагенеза може да се използва за получаване на мутантен 1L-2 ген, който кодира един мутеин имащ IL-2 активност, но в който cys 125 е променен в серин 125. Предпочитаният олигонуклеотиден праймер използва за получаване на мутантния IL-2 ген, когато фагьт носи чувствителната нишка на гена, е GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC. Този олигонуклеотид има С—> G промяна в средната база, върху тройката, която е сдвоена с кодон 125 на IL-2 гена.
Тогава резултиращият мутационен хетеродуплекс се използва за трансформиране на компетентен гостоприемников микроорганизъм или клетка.
Реплицирането на хетеродуплекса чрез гостоприемника дава потомство от двете нишки. След реплициране мутантният ген може да се изолира от прогените на мутантната верига, да се включи в един подходящ експресионен вектор и векторът да се използва за трансформиране на подходящ микроорганизъм или клетка гостоприемник. Предпочитани вектори са плазмидите pBR322, pCRl и техни варианти, синтетични вектори и други подобни. Подходящи микроорганизми - гостоприемници са E.coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis. Bacillus thuringicnsis, различни щамове дрожди, Bacillus thermophius, животински клетки, например от мишка, плъх или от яйчници на китайски хамстер (СНО), растителни клетки и растения гостоприемници, животински и растителни гостоприемници и други. Когато избраният гостоприемник е трансформиран с вектора, се въвеждат също подходящи промотор операторни последователности, за да се изрази мутеинът. Гостоприемниците могат да бъдат прокариотни или еукариотни клетки (методи за инсерция на ДНК в еукариотни клетки са описани в РСТ заявки №№ US 81/00239 и US81/00240, 1981). Предпочитаните гостоприемници са Е. coli и СНО клетки. Получените съгласно изобретението мутеини могат да са гликозилирани или негликозилирани в зависимост от гликозилирането на природния родителски протеин и микроорганизмът гостоприемник, използван за получаване на мутеина. Ако е необходимо, негликозилираният мутеин, получен когато Е. coli или Bacillus са микроорганизми- гостоприемници, може да бъде евентуално гликозилиране ин витро чрез химическо, ензимно или друг вид модифициране, известно на специалистите.
При предпочитаното приложение на изобретението по отношение на IFN-/? цистеиновият остатък в позиция 17 на аминокиселинната последователност на IFN-Д, показана на фигура 1, се променя в серии чрез Т—> А преминаване при първата база на кодон 17 на смислената верига на ДНК последователността, която кодира за зрял IFN-/7. Сайт-специфичната мутагенеза се индуцира чрез използване на синтетичен 17-нуклеотиден праймер GCAATTTTCAGAGTCAG, който е идентичен с една 17-нуклеотидна последователност от смислената верига на IFN-/? в участъка на кодов 17, с изключение на единично несъвпадение на бази при първата база на кодон 17. Несъвпадението е при нуклеотид 12 в праймера. Генетичният код е дегенерирал и много от аминокиселините може да са кодирани от повече от един кодон. Основният код за серин например е шесткратен дегенерат, такъв че кодони те TCT, TCG, TCC, TCA, AGT u ACG кодират за серин. AGT кодонът е избран за удобство. По подобен начин треонин се кодира от всеки един от кодоните ACT, АСА, АСС и ACG. Посочено е, че когато един кодон е специфичен за определена аминокиселина, включва всичките дегенерирали кодони, които кодират тази аминокиселина. 17-мерът е хибридизиран до едноверижна ДНК на фага М13, който носи безсмислената верига на IFNгена. Олигонуклеотидният праймер тогава се разширява върху ДНК чрез ДНК полимераза I-фрагмент на Klenow и получената dsflHK се преобразува в затворена кръгова ДНК с Т4 лигаза. Репликацията на получения мутационен хетеродуплекс дава клонове от ДНК веригата съдържаща несъвпадението. Мутантните клонове могат да бъдат идентифицирани и скринирани по наличието или липсата на специфични рестрикционни сайтове, резистентност или чувствителност към антибиотици, или чрез други методи, известни на специалистите. Когато цистеинът е заместен със серин, Т—> А преминаването, показано на фигура 2, има като резултат създаването на нов Hinfi рестрикционен сайт в структурния ген. Мутантният клон се идентифицира чрез използване на олигонуклеотиден праймер като индикатор при хибридизационния скрининг на мутантните фагови плаки. Праймерът ще има единично несъвпадение, когато хибридизира до родителя, но ще има точно съвпадение, когато хибридизира до мутантната фагова ДНК, както е показано на фигура 2. Условията на хибридизацията могат следователно да са такива, че олигонуклеотидния праймер да хибридизира с предимство до мутантната ДНК, а не до родителската ДНК. Новополученият Hinfl сайт също служи като средство за потвърждаване на мутацията на единичната база в 1FN-/? гена.
М13 фагова ДНК, носеща мутиралия ген, се изолира и разпределя в подходящи експресионни вектори като плазмид рТгрЗ и Е. coli щам ММ294 се трансформира с вектора. Подходящите хранителни среди за култивиране на трансформантите и на техните прогони са известни на специалистите в тази област. Изразеният мутеин на IFN-Д се изолира, пречиства и охарактеризира.
Примери за изпълнение на изобретението поясняват изобретението и го илюстрират.
Те не ограничават неговия обхват. Примери от 1 до 11 описват получаването на мутеин на IFN-/? . Примери от 12 до 20 описват получаването на мутеин на IL-2.
Пример 1. Клониране на IFN-/? ген в М13 вектор.
Използването на М13 фагов вектор като източник на едноверижна ДНК матрица е описано от Temple et al, Nature (1982) 296:537540. Плазмидът ρ β ltrp (фигура 3), съдържащ IFN-/? гена, под контрола на E.coli trp промотор се смила с рестрикционните ензими Hindlll и Xholl. M13mp8 (Messing, Third Cleveland Symposium on Macromolecules:Recombinant DNA 143-153, (1983) репликативната форма (RF) на ДНК (фигура 4) се смила с рестрикционните ензими Hindlll и Bam HI и се смесва с ρ β ltrp ДНК, която е смляна преди това с Hind III и Xho II. Сместа се лигира с Т4 ДНК лигаза и лигираната ДНК се трансформира в компетентни клетки от Е. coli щам JM103 и се разстила върху Xgal индикаторни плочки (Messing, et al., Nucleic Acids Res (1981) 9:309321). Плаките, съдържащи рекомбинантен фаг (бели плаки), се взимат с игла, инокулират се в прясна култура на JM103 и са минипрепарати на RF молекули, получени от инфектираните клетки (H.D.Birnboim and J. Doly, Nucleic Acid Res (1979) 7:1513-1523). RF молекулите се смилат c различни рестрикционни ензими за идентифициране на клоновете, съдържащи IFN-/? инсърт. Рестрикционната карта на един такъв клон (М13- β 1)е показана на фигура
5. Едноверижна (SS) фагова ДНК се получава от клона М13- β 1 да служи като матрица за сайт специфична мутагенеза при използване на синтетичен олигонуклеотид.
Пример 2. Сайт, специфична мутагенеза. Четиридесет пикомола от синтетичния олигонуклеотид GCAATTTTCAGAGTCAG (праймер) се обработва с Т4 киназа в присъствието на 0,1 mM аденозин трифосфат (АТФ), 50 mM хидроксиметиламинометан хидрохлорид (трие солна киселина) pH 8,0, 10 mM магнезиев двухлорид, 5 тМ дитиотреитол (DTT) и 9 единици Т4 киназа в 50 μΐ при 37°С за 1 час. Киназираният праймер (12 пикомола) се хибридизира до 5 μξ, ss М13-/? 1 ДНК в 50 μ\ смес, която съдържа 50 mM натриев хлорид, 10 mM трие солна киселина с pH 8,0, 10 mM магнезиев двухлорид и 10 тМ β -меркаптоетанол, чрез загряване при 67°С за 5 минути и 42°С за 25 минути. Загряната смес се охлажда върху лед и след това се добавят 50 μ 1 реакционна смес, съдържаща по 0,5 тМ от дезоксинуклеотид трифосфат (dNTP), 80 mM трис-солна киселина с pH 7,4, 8 тМ магнезиев двухлорид, 100 тМ натриев хлорид, 9 единици ДНК полимераза 1, на Klenow фрагмент, 0,5 тМ АТФ и 2 единици Т4 ДНК лигаза, инкубиране при 37°С за 3 часа и при 25°С за 2 часа. Реакцията завършва с екстракция с фенол и преципитация с етанол. ДНК се разтваря в 10 тМ трис-солна киселина с pH 8,0, 10 шМ етилендиаминтетраацетна киселина (ЕДТА), 50 % захароза и 0,05 % бромофенил синьо и се подлага на електрофореза върху 0,8 % агарозен гел в присъствието на 2 /zg/ml етидиумбромид. ДНК ивиците, отговарящи на RF формите на Ml3-/3 1, се елуират от гелните срезове по перхлоратния метод (Davis et al., “Advanced Bacterial Genetics” стр. 178-179 (1980). Елуираната ДНК се използва за трансформиране на компетентни JM103 клетки, култивирани едно денонощие, и ssHHK се изолира от настоящата течност на културата. Тази ss4HK се използва като матрица във втори цикъл на разширяване на праймера, гелно пречистените RF форми на ДНК се трансформират в компетентни JM103 клетки, разстилат се върху агарни плочки и се инкубират за едно денонощие за получаване на фагови плаки.
Пример 3. Сайт, специфична мутагенеза. Експериментът от пример 2 се повтаря, с изключение на това, че използваният за променяне на кодон 17 на IFN-/3 гена от такъв, който кодира за цистеин в такъв, който кодира за треонин синтетичен олигонуклеотиден праймер е GCAATTTTCAGACTCAG.
Пример 4. Сайт, специфична делеция.
Експериментът от пример 2 се повтаря, с изключение на това, че използваният за делеция на кодон 17 от IFN-/3 гена олигонуклеотиден праймер е AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG.
Пример 5. Скрининг и идентифициране на мутирали плаки.
Блюда, съдържащи мутирали Ml3-/3 1 плаки (пример 1), и две блюда, съдържащи немутирали Ml3-/3 1 фагови плаки, се охлаждат до 4°С и плаките от всяко блюдо се пренасят върху два нитроцелулозни филтърни кръга чрез поставяне на сух филтър върху агарната плочка за пет минути за първия филтър и 15 минути за втория филтър. След това фил60506 трите сс поставят върху дебели филтърни хартии, напоени в 0,2 нормален натриев хидроксид, 1,5 М натриев хлорид и 0,2 % Triton Х-100 за пет минути и се неутрализират чрез поставяне върху филтърна хартия, напоена с 0,5 М трис-солна киселина с pH 7,5 и 1,5 М натриев хлорид за следващи пет минути. Филтрите се измиват по подобен начин два пъти върху филтри, напоени в 2xSSC (стандартен физиологически цитрат), изсушават се и се изпичат във вакуумна пещ при 80°С за два часа. Двойните филтри се прехибридизират при 55°С за четири часа с 10 ml за филтър ДНК хибридизационен буфер (5xSSC) с pH 7,0, 4 х разтвор на Denhardt (поливинилпиролидин, фикол и говежди серумен албумин, 1 х = 0,02 % от всеки), 0,1 % натриев додецилеулфат (SDS), 50 тМ натриев фосфатен буфер с pH 7,0 и 100 /rg/ml ДНК от денатурирана сперма от пъстърва. Белязан с 32Р индикатор се приготвя чрез киназиране на олигонуклеотидния праймер с белязана с32Р АТФ. Филтрите се хибридизират до 3,5x10 cpm/ml от белязания с32Р праймер в 5 mi за филтър от ДНК хибридизационен буфер при 55°С за 24 часа. Филтрите се промиват при 55°С за 30 минути, всеки в промивен буфер, съдържащ 0,1 % SDS и намаляващи количества от SSC. Филтрите се промиват в началото с буфер, съдържащ 2 х SSC, и контролните филтри, съдържащи немутирали М131 плаки, се проверяват за наличност на някаква радиоактивност с Гайгеров брояч. Концентрацията на SSC се понижава стъпаловидно и филтрите се промиват докато не остане откриваема радиоактивност върху контролните филтри с немутирали М13- β 1 плаки. Най-ниската концентрация на SSC, която е използвана е 0,1 х SSC. Филтрите се изсушават на въздух и се авторадиографират при -70°С за 2-3 дни. 480 плаки на мутирал М13- β 1 и 100 немутирали контролни плаки се скринират с киназираната олигонуклеотидна проба. Никоя от контролните плаки не хибридизира с пробата, докато мутиралите М13- β\ плаки хибридизират с индикатора.
Една от петте мутирали плаки M13-/J 1 (M13-SY2501) се отделя и се инокулира в култура на JM103. От настоящата течност се получава збДНК, а от утайката-двойноверижна (ds)flHK. SSflHK се използва като матрица за дидезокси-секвениране на клона с М13 универсален праймер. Резултатът от анализа на последователността е показан на фигура 6 и потвърждава, че TGT evs кодонът е превърнат в ATG ser кодон.
Пример 6. Експресия на мутирал IFN-/?
в Е. coli.
PF ДНК от Μ13-SY2501 се смила с рестрикционните ензими Hind III и XhoII и 520 bp инсерционен фрагмент се пречиства върху 1 % агарозен гел. Плазмидът рТгрЗ, съдържащ E.coli trp промотора (фигура 7), се смила с ензимите Hind III u BamHI, смесва се с пречистен M13-SY2501 ДНК фрагмент и се лигира в присъствие на Т« лигаза. Лигираната ДНК се трансформира в Е. coli щам ММ294. Резистентните на ампицилинтрансформанти се скринират за чувствителност към тетрациклин. Плазмидни ДНК от пет ампицилинови резистенти, [тетрациклин]тетрациклин чувствителни клона се смилат с Hinfl за скрининг за наличност на M13-SY2501 инсърт. Фигура 8а показва Hinfl рестрикционната карта на един от клоновете (pSY2501) и я сравнява с Hinf I картата на оригиналния IFN- β клон р β trp. Има един допълнителен Hinfl сайт в pSY2501, разделящ 197 bp IFN-/? вътрешния фрагмент на 169 Ьр фрагмент и 28 Ьр фрагмент (фигура 86). Рестрикционната карта на клона pSY2501 е посочена на фигура 9. Цялата ДНК последователност на мутантния 1FN- β ген е показана на фигура 10, заедно с очакваната аминокиселинна последователност.
Плазмидът, означен като клон pSY2501, е депозиран в Колекцията на земеделски изследователски култури (NRRL), Лаборатория по ферментация, Северен регионален изследователски център, Администрация по наука и обучение, М-во на земеделието, 1815 North University St., Peoria, 111.60604 на 30 март 1983 година и е означен с номера СМСС №1533 и NRRL № В-15356.
Култури на pSY2501 и p/?ltrp, които включват техни прогени, се култивират до оптическа гъстота (OD.J от 1,0. Свободен от клетки екстракт се получава и се изследва IFNβ антивирусната активност върху GM2767 клетки чрез микротитрационно изследване. Екстракти от клон pSY2501 проявяват три до четири пъти по-голяма активност отколкото ρβ ltrp (таблица 1), което показва че клонът pSY2501 е или синтезирал повече протеин, проявяващ IFN-/? активност, или че полученият протеин има по-висока специфична
Таблица А
активност. Таблица I
Екстракт Антивируснаактивност(един/мл)
pSY2501 6 х 10'
р/91 trp 1 х 10'
ptrp3 (контрола) 30
С цел да се определи дали клонът pSY2501 синтезира няколко пъти повече активен протеин екстрактите от двата клона се подлагат на електрофореза върху SDS полиакриламиден гел заедно с контролен екстракт, а гелът се оцветява с комази синьо, за да се проявят протеините. Както е показано на фигура 11, има само една протеинова ивица, отговаряща на около 18 000 далтона протеин, който е наличен в екстрактите на клонове pSY2501 и p/Jltrp, но не в контролния екстракт на ptrp3. За този протеин, който има молекулно тегло от около 20 000 далтона, но показва гел-миграционна картина на 18 000 далтона протеин, е доказано по-рано, че е IFN-/3 при пречистване на този протеин от екстракти на ру31 trp. Тъй като в екстрактите на р/?1 trp, се съдържа по-малко от този протеин специфичната активност на протеина в екстракти от клон pSY2501 е по-висока, отколкото тази в клон p/Jltrp.
Пример 7. Плазмидът pSY2501 се трансформира в компетентен субвариант на щам ММ294 на E.coli, означен ММ294-1. Пробен образец от получения трансформант е депозиран в Американската колекция за типове култури 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852 в САЩ на 18 ноември 1983 под АТСС № 39 517.
Пример 8. Продукция на IFN- β scr|7
IFN- β се възстановява от E.coli, които са били трансформирани за продуциране на 1FN- . E.coli се култивират в следната хранителна среда (виж таблицата) до OD от ΙΟΙ! при 600 nm (сухо тегло 8,4 g/1).
Съставка Концентрация
nh4cl 20 mM
K,SO4 16,1 mM
кн2ро4 7,9 mM
Na,HPO4 12,2 mM
MgSO4.7H2O 3 mM
Na3 цитрат.2Н2О 1,5 mM
MnSO,.4H Ο 30 μΜ
ZnSO4.7H2O 30 μΜ
CuSO,.5H Ο 3 μΜ
L-триптофан 70 mg/L
FeSO..7H,O 72 μΜ
Тиамин HCI 20 mg/L
Глюкоза 40 μg/L
Добив от 9.91 (9,9 kg) от трансформирани E.coli се охлажда до 20°С и се концентрира чрез пропускане през филтър с напречно протичане при средно налягане от около 110 кра и постоянна скорост на протичане на филтрата от 260 ml/min при тегло на филтрата 8,8 kg. Концентратът (приблизително 1 I) се източва в съд и се охлажда до 15°С. Клетките в концентрата се разрушават чрез пропускане на концентрата през хомогенизатор MantonGaulin при 5° С и около 69 000 кра. Хомогенизаторът се промива с един литър буфериран с фосфат физиологичен разтвор, pH
7,4 (PBS) и промивната течност се добавя към хомогенизата за получаване на краен обем от два литра. Това количество се подлага на непрекъснато центрофугиране при 12 000 х g и скорост на протичане 50 ml/min. Утайката се сепарира от настоящата течност и се суспендира повторно в четири литра PBS, съдържащ 2 % SDS. Тази суспензия се разбърква при стайна температура за 15 минути, след което вече няма видим суспендиран материал. След това разтворът се екстрахира с 2-бутанол при обемно съотношение бутанол към разтвор 1:1. Това екстрахиране се извършва в сепаратор течна -течна фаза при скорост на протичане от 200 ml/min. След това органичната фаза се сепарира и изпарява до сухо, при което се получават 21,3 g протеин. Той се ресуспендира в дестилирана вода при обемно съотношение 1:10.
Възстановеният продукт се изследва за активност на човешки IFN-/3 чрез изследване за защита срещу вирусен цитопатичен ефект (СРЕ). Изследването се извършва в микротитрационни плочки. Петдесет микролитра минимална есенциална среда е поставена във всяка ямка, като в първата ямка се поставят 25 μΐ от пробния образец, а в следващите ямки се правят серийно 1:3 обемни разреждания. Във всяка плочка се включва вирус (Vesicular stomatitus), клетки (човешка фибробластна линия GM-2767) и сравнителни IFN-β контроли. Използваният за сравняване 1FN-/? е 100 единици на ml. След това плочките се облъчват с ултравиолетови лъчи за 10 минути. След облъчването ΙΟΟμΙ от клетъчната суспензия (1,2 х 10s клетки/ml) се добавя към всяка ямка и плочките се инкубират 18-24 часа. Вирусна суспензия в количество плако-образуваща единица за клетка се добавя към всяка ямка освен контролата. Тогава плочките се инкубират, докато вирусната контрола покаже 100 % СРЕ. Това става нормално 18 до 24 часа след добавянето на вирусен разтвор. Резултатите от изследването се интерпретират по отношение разположението на ямката с 50 % СРЕ спрямо сравнителната IFN-/J контрола. От тази гледна точка се определя титърът за интерферон за всички проби върху плочката. Специфичната активност на възстановения продукт се определя на 5 х 10’ единици/mg.
Пример 9. Кисела преципитация и хроматографско пречистване.
Процесът от пример 8 се повтаря, с изключение на това, че след екстрахиране и сепариране на водната и органичната фаза и смесването на органичната фаза с PBS при обемно съотношение 3:1 pH на сместа се понижава до около 5 чрез добавяне на ледена оцетна киселина. Полученият преципитат се сепарира чрез центрофугиране при 10 000 до 17 000 х g за 15 минути и утайката се разтваря повторно в 10 тегловни %/обем SDS и 10 тМ буфер натриев ацетат, pH 5,5, и се загрява на 80°С за пет минути.
След това разтворът се поставя в Brownlee RP-300, 10 μΜ “Aquapore колона” при използване на система с Бекманов градиент. Буфер А е 0,1 % трифлуорооцетна киселина (TFA) в Н2О; буфер В е 0,1 % TFA в ацетонитрил. Откриването става по ултравиолетовата абсорбция при 280 nm. Програмата за разтваряне е линеен градиент на 0°о буфер В към 100 % буфер В за три часа. Фракциите, съдържащи най-високи активности интерферон, се отделят и специфичната активност на събрания интерферонов препарат се отчита да е 9,0 х 107 до 3,8 х 10’ международни единици за милиграм протеин, сравнено с 2 х 10’ единици/mg за природния IFN-/? .
Пример 10. Биохимическа характеристика на IFN-Й ' ser 17
Аминокиселинният състав се определя след 24-72 часова хидролиза на 40 /zg проби от IFN-/1 в 200 μΐ от 5,7 N солна киселина, 0,1 % фенол при 108°С. Пролин и цистсин се определят по същия начин след окисляване с перформна киселина, в този случай фенолът се отстранява при хидролизата. Триптофанът се анализира след 24 часа хидролиза на 400 pg пробен образец в 5,7 N солна киселина, 10 % меркаптооцетна киселина (без фенол). Анализът се извършва в Beckman 121 MB анализатор на аминокиселини при използване на единична колона с АА10 смола.
Аминокиселинният състав, изчислен от представителните 24-, 48- и 72-часови хидролизи на пречистен 1FN- мг 17, съвпада с този очакван на база ДНК последователността на клониран lFN-ген, с изключение на липсващия N-краен метионин.
Аминокиселинната последователност на първите 58 остатъка от аминокиселинния край на пречистен IFN се определя върху 0,7 mg проба в Beckman 890 С секвенатор с 0,1 М буфер Quadrol.
РТН аминокиселини се определят чрез обратно фазова HPLC върху Altex ultrasphere ODS колона (4,6 х 250 mm) при 45°С, елуиране за 1,3 мин с 40 % буфер А и 8,4 мин с 40 до 70 % буфер В, при което буфер А е 0,0115 М натриев ацетат, 5 % тетрахидрофуран (THF) pH 5,11, а буфер В е 10 % THF в ацетонитрил.
N-крайната аминокиселинна последователност на IFN-/3 иг 17 съвпада с очакваната на база ДНК последователността, с изключение на липсата на N-краен метионин.
Пример 11. Алтернативна продукция на IFN-β иг 17 и метод за пречистване.
E.coli, трансформирани с pSY2501, се култивират в следната среда:
Таблица Б
Съставка Приблиз. изходна концентрация
Na3 цитрат.2Н2О 3 mM
КН2РО4 30 тМ
(NH4)2SO4 14 тМ
MgSO4.7H2O 46 μΜ
ZnSO4.7H2O 46 μ Μ
CuSO..5H,O 1-2 μΜ
L-триптофан 351 μΜ
FeSO4.7H2O 74 Μ
Тиамин 0,002 %
Глюкоза 0,5 %
При нужда се добавят Dow Corning пеногасител- 25% разтвор гликол, 50 % разтвор глюкоза и 5-N калиев хидроксид.
Температурата се поддържа на 37 ± 1°С, pH на 6,5 ± 0,1 с натриев хидроксид и разтвореният кислород-на 30 % насищане на въздуха. Измерванията на оптическата плътност и остатъчната глюкоза се извършват на 14 часа и приблизително през интервали от 1 час след това. Добив се събира, когато консумацията на глюкоза достигне 40 ± 6 g/1 (OD при 680 nm= 10 - 11).
Събраният материал се концентрира приблизително трикратно чрез циркулирането му през микропорест филтър с напречно протичане под налягане. Концентрираните клетки се диафилтрират срещу дейонизирана вода, докато събраният материал се концентрира 4-5 пъти. Тогава клетките се разрушават чрез прекарване през хомогенизатор Manton Gaulin при около 4,1 до 5,5 кра. След началното преминаване се добавя SDS-натриево-фосфатен буфер до крайна концентрация от 2 % SDS, 0,08 м натриев фосфат и хомогенизирането продължава един час. Тогава се добавя твърд DTT до крайна концентрация от 50 mM и хомогенизатът се загрява до 90 ± 5°С за 10 минути. Получената клетъчна суспензия се екстрахира с 2-бутанол при обемно съотношение на 2-бутанол към суспензия 1:1 в статичен миксер. Тогава сместа се центрофугира и се събира богатата на 2-бутанол фаза.
Богата на 2-бутанол фаза се размесва с
2,5 обема от 0,1 % SDS в буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS). Добавя се твърд DTT до крайна концентрация от 2 mM. pH на сместа се наглася на 6,2 ± 0,1 с ледена оцетна киселина и тази смес се центрофугира. Получената утайка се събира и ресуспендира в PBS + 10 % SDS с pH установено на 8,5±0,1 с l-Ν натриев хидроксид. Твърд DTT се добавя до крайна концентрация от 100 mM и суспензията се загрява до 90 ± 5°С за 10 минути. След това суспензията се охлажда до -25°С, pH се наглася на 5,5 ± 0,1 с ледена оцетна киселина и разтворът се филтрира.
Тогава разтворът се поставя в Sephacryl
S-200 предколона и фракциите, проявяващи най-високи активности на интерферон, се събират на едно място и се концентрират чрез ултрафилтрация. Концентратът се окислява чрез добавяне на еквимоларни количества протеин и йодособензоена киселина в реакционен съд, съдържащ 2 ш.М натриев пирофосфат, 0,1 % SDS и 1 mM EDTA. По време на окисляването pH се поддържа на 9,0 ± 0,1 с 0,5-1Чнатриев хидроксид и се наглася на 5,5 ± 0,2, когато окисляването е завършено. След окисляването концентратът се подлага отново на ултрафилтрация с разделяне при 10 Kdal молекулно тегло.
Концентратът се поставя в главната Sephacryl S-200 колона и фракциите се анализират чрез SDS- PAGE за определяне на тези, които не съдържат замърсители с високо молекулно тегло. Тези фракции се отделят и пропускат през ултрафилтрационното устройство. Филтрираният концентрат се фракционира върху Sephadex G-75 колона. Прави се SDSPAGE анализ на фракциите за определяне на тези, които не съдържат замърсители с ниско или високо молекулно тегло. Тези фракции се отделят за обезсолване.
Sephadex G-25 колона, калибрирана с 1 mM натриев хидроксид, се зарежда със събраните от Sephadex G-25 колоната фракции при използване на дестилирана вода, нагласена на pH 10,8-11 с 50 % натриев хидроксид. Пречистеният продукт се събира до празна проба. Този обезсолен, пречистен 1FN- β мутеин, може да бъде приготвен по познати начини за терапевтично приложение.
Биологични тестове на IFN-Й * ser П
Антигснно сравняване.
1FN-/J се сравнява антигснно с IFN-/? продуциран от диплоидни фибробласти при използване на вирусни неутрализационни тестове. Един поливалентен антисерум за IFN-/3 от диплоидни фибробласти се получава в зайци. Този антисерум блокира антивирусната активност както на диблоиден фибробластен IFN-Д така и на 1FN-/J при вирусните неутрализационни тестове, което показва че двата протеина са антигенно неразличими.
Антивирусна активност
Пречистен IFN-/?Kr 17 се сравнява по антивирусна активност с естествено продуцирания IFN-/?. Инхибирането на репликацията на вируса на везикулярния стоматит в диплоидни кожни фибробласти (HS27F) е неразличимо от това на природната молекула. Подобно, инхибирането на вируса херпес симплекс тип I в HS27F фибробласти от естествени и мутантни протеини е сравнимо.
Антипролиферативна активност Антипролиферативната активност на IFN-/?ser |7 за непрекъснати клетъчни линии се сравнява с тази на естествено продуциран 1FN-/? .
Т24 клетки, произхождащи от транзиционален клетъчен карцином, се третират с 200 единици/ml от протеините. Растежът на клетките се инхибира значимо (р<0,02) и от двата 5 протеина.
Стимулиране на естествени килърни (NK) клетки
Способността на IFN-/?scr 17 да стимулира NK клетка (спонтанна клетъчна цитоток10 сичност) се подлага на тест. Сепарирани с Ficoll-hypaque човешки периферни мононуклеарни клетки (РМС) или обогатени с NK лимфоцитни препарати (лишени от моноците чрез пластична адхезия и от ОКТЗ-положителни 15 Т-клетки чрез третиране с ОКТЗ антитяло плюс комплемент) се инкубират едно денонощие в хранителна среда, съдържаща различни концентрации IFN-/?ser р. Белязани с * * * * * * * * * * * 51Сг клетки-мишени се инкубират с ефекторните клетки (при съотношение на ефекторни клетки към мишенни клетки = 50:1) за 2 до 4 часа. NK клетъчната цитотоксичност се определя чрез измерване количеството на маркираното вещество в средата. Резултатите от този тест са показани в следващата таблица:
Таблица В
Клетка Ефекторна NK клетъчна цитотоксичност при интерферон (специфично мишена клетка процентно освобождаване на51 Cr-SFM) 1FN (единици/ml)
0 10 30 100 300
Т24 PMC 7,23 ± 5,1 23,1 ± 4,4 24,4 ±1,1 34,1 ±2,5 50,0 ±2,0
Chang PMC 4,7 ±0,5 7,2 ±0,8 9,5 ±1,7 15,9 ±1,3 21,9 ±1,4
Chang NK Enr 19,2 ±4,6 39,4 ±4,1 ND 54,2 ± 6,1 ND
К562 NK Enr 41,0± 4,6 48,4 ±3,6 ND 62,2 ±3,5 ND
Както е показано клетките-мишени се убиват по-ефективно от третираните с IFN|7 клетки, отколкото от нетретирани клетки.
Клинични опити
Фаза I на клиничните опити е за потвърждаване безопасността на IFN- кг|7 за хора.
Тези резултати включват прилагането на протеин на пациенти мускулно и венозно в дози в обхвата между 1 х 105 единици (1 g протеин) до 400 х 10‘ единици. В началната фаза I на клиничните опити не се появяват никакви нежелани ефекти.
Както е посочено, препаратите на βκί 17 проявяват специфична активност на равнище, твърде близко или по-добро от това на естествения IFN- β . 1FN-/1 ,, няма свободни сулфхидрилни групи, обаче показва една -S-S-връзка между единствените останали цистеини в позиции 31 и 141. Протеинът не образува лесно олигомери и съществува основно в мономерна форма. IFN-/? яг17, получен съгласно изобретението може да бъде използван самостоятелно или като смес от различните форми за приготвяне на фармацевтично приемливи препарати в инертни, нетоксични, непредизвикващи алергии, физиологично поносими носители за клинично и терапевтично приложение при терапия на рака или при състояния, при които е необходима терапия с интерферон и при вирусни инфекции като от херпес симплекс вирус I и II, вирусен хепатит В, вирусни простуди и вирусни ринити. Носителите включват, но не се ограничават, с дестилирана вода, физиологичен разтвор, Рингеров разтвор, разтвор на Ханк и други подобни. Нетоксични стабилизатори и улесняващи разтварянето добавки като декстроза, HSA (човешки серумен албумин) и други подобни могат евентуално да бъдат включени. Терапевтичните състави може да се прилагат орално или парентерално, например венозно, мускулно, интраперитонеално и подкожно. Препарати на модифициран IFN-/3 съгласно изобретението могат също да се използват за локално прилагане в подходящи носители, използвани обикновено за такива цели. 1FN-/3 мутеинът може да се прилага или локално или системно, самостоятелно, смесен или в комбинация с други терапевтични средства като ацикловир за профилактични или лечебни цели. Дозата, в която се прилага мутеинът при хора, ще зависи от това, дали се прилага непрекъснато (включително интермитиращо) или като болус. Когато се прилага непрекъснато, количествата обикновено са пониски, отколкото прилаганите като болус. Дозата обикновено е от около 1 х 10s до 1 х 10’ единици, за предпочитане около 1 χ 106 до 1 х 10’.
Принципните предимства на описания мутеин на IFN-/3 са в елиминирането на една свободна сулфхидрилна група в позиция 17 на IFN-/3 , като с това се принуждава протеинът да образува правилни дисулфидни връзки между cys 31 r cys 141 и да приеме конформация, необходима за пълна биологическа активност. Повишената специфична активност на 1FN-/3 позволява използването на по-малки дози при терапевтично прилагане. Поради делеция на цистеина в позиция 17 и елиминиране на свободната SH-група, 1FN-/3 ser |7 протеинът не образува димери и олигомери така лесно както микробиално продуцираният IFN-/?. Това улеснява пречистването на протеина и повишава стабилността му.
Пример 12. Нуклеотидната последователност за сДНК клон, кодиращ за човешки
1L.-2, методите за получаване на II.-2 сДНК банки и скрининг на същите за IL-2 са описани от Taniguchi et al., Nature, (1983) том 24.
стр. 308.
сДНК банки обогатени с потенциални 1L-2 сДНК клонове, се получават от обогатена с 1L-2 и РНК [фракция], получена от индуцирани периферни кръвни лимфоцити (PBL), и от клетки на Jurkat по обичайните методи. Обогатяването на тРНК с информация за IL2 се извършва чрез фракциониране на тРНК и идентифициране на фракцията, имаща IL-2 тРНК активност, чрез инжектиране на фракциите в ооцити на Xenopus laevis и изследване на ооцитните лизати за IL-2 активност върху НТ-2 клетки (Watson, J. Exp. Med, (1979) 150:1570-1519 u Gillis et al., Immun. (1978) 120:2027-2032.
Пример 13. Скрининг и идентифициране на 1L-2 сДНК клонове
1L-2 сДНК банките се скринират чрез метод за хибридизиране на колонии. Всяка микротитрационна плочка се реплицира в двойна нитроцелулозна филтърна хартия (S S тип ВА85) и колониите се култивират при 37°С за 14-16 часа върху L агар, съдържащ /rg/ml ампицилин. Колониите се лизират и ДНК се фиксира към филтъра чрез последователно третиране 5 минути с 500 тМ натриев хидроксид,
1,5 М натриев хлорид и се промива два пъти по 5 минути с 5 х стандартен физиологичен цитрат (SSC). Филтрите се изсушават с въздух и се изпичат при 80°С за 2 часа. Двойните филтри се прехибридизират при 42°С за 6-8 часа с 10 ml за филтър ДНК хибридизационен буфер (50 % формамид, 5 х SSC. pH 7,0, 5 х разтвор на Denhardt (поливинилпиролидин, фикол и говежди серумен албумин, 1 х = 0,2 % от всеки) 50 тМ натриев фосфатен буфер с pH 7.0, 0,2 % SDS, 20 /zg/ml Poly U и 50 pg ДНК от денатурирана сперма на пъстърва.
Една белязана 32Р 20-мерна олигонуклеотидна проба се получава въз основа на 1L2 генна последователност, описана от Taniguchi et al.(виж по-горе). Нуклеотидната последователност на пробата е
GTGGCCTTCTTGGGCATGTA.
Пробните образци се хибридизират при 42°С за 24 до 36 часа с 5 ml/филтър от ДНК хибридизационен буфер, съдържащ 32Р олигонуклеотидната проба. Филтрите се промиват два пъти по 30 минути всеки път при 50°С с 2 x SSC, 0,1 % SDS и след това два пъти с 1 х SSC и 0,1 % SDS при 50°С за 90 минути, изсушават се въздушно и се авторадиографират при -70°С за 2-3 дни. Положителните клонове се идентифицират и повторно скринират с пробата клонове с пълна дължина и потвърждават чрез изготвяне на карта с рестрикционни ензими и се сравнява с последователността на IL-2 сДНК клона, описан от Taniguchi et al., виж по-горе.
Пример 14. Клониране на IL-2 ген в М13 вектор
1L-2 генът се клонира в М13тр9 по начина, описан в пример 1, при използване на плазмид pLWl (фигура 12), съдържащ 1L-2 гена под контрола на E.coli trp промотор. Един пробен образец от pLWl е депозиран в Американската колекция типове култури през август 1983 и е означен с АТСС номер 39 405. Рестрикционната карта на един клон (означен M13-IL 2), съдържащ IL-2 инсърт е показан на фигура 13. Ендоверижна фагова ДНК се получава от клон M13-1L 2, за да служи като матрица за олигонуклеотидно насочена мутагенеза.
Пример 15. Олигонуклеотидно насочена мутагенеза
Както е посочено, IL-2 съдържа цистеинов остатък в аминокиселинни позиции 58, 105 и 125. Въз основа на нуклеотидната последователност на частите на IL-2 гена, които съдържат кодоните за тези три цистеинови остатъка, три олигонуклеотидни праймера се определят и синтетизират за мутация на кодоните за тези остатъци до кодони за серии. Олигонуклеотидите са с последователностите: CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC (DM27) за промяна на cys 58;
CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM28) за промяна на cys 105 и GATGATGCTCTGAAAAGGTAATC (DM29) за промяна на cys 125.
Четиридесет пикомола от всеки олигонуклеотид се киназират поотделно в присъствието на 0,1 mM АТФ, 50 тМ трис-солна киселина, рН 8,0, 10 mM магнезиев двухлорид, 5 mM DTT и 9 единици от Т4 киназа в 50 μ 1 при 37°С. Всеки от киназираните праймери (10 пикомола) се хибридизира до 2,6μ g на ssM13IL-2 ДНК в 15 μ\ смес, съдържаща 100 mM натриев хлорид, 20 тМ трис-солна киселина, рН 7,9, 20 mM магнезиев двухлорид и 20тМ /Тмеркаптостанол, чрез загряване при 67С за 5 минути и 42®С за 25 минути. Загретите смеси се охлаждат върху лед и тогава се нагласят до краен обем от 25μ 1 на реакционната смес, съдържаща 0,5 mM от всеки dNTP, 17 mM трис-солна киселина, рН 7,9, 17 mM магнезиев двухлорид, 83 тМ натриев хлорид, 17 тМ /?-меркаптоетанол, 5 единици ДНК полимсраза I фрагмент на Klenow, 0,5 mM АТР и 2 единици Т4 ДНК лигаза, инкубирана при 37°С за 5 часа. Реакциите се прекъсват чрез загряване до 80°С и реакционните смеси се използват за трансформиране на компетентни JM103 клетки, разстилани върху агарни плочки и инкубирани едно денонощие за получаване на фагови плаки.
Пример 16. Скрининг и идентифициране на мутантни фагови плаки
Плочки, съдържащи мутирали M13-IL 2 плаки, и две плочки, съдържащи немутирали M13-IL 2 фагови плаки, се охлаждат до 4° и фаговите плаки от всяка плочка се пренасят върху два нитроцелулозни филтърни кръга чрез разстилане на сух филтър върху агарната плочка пет минути за първия филтър и 15 минути за втория филтър. След това филтрите се поставят върху дебела филтърна хартия, напоена в 0,2-N натриев хидроксид, 1,5 М натриев хлорид и 0,2 % Triton за пет минути и се неутрализира чрез разстилане върху филтърна хартия, напоена с 0,5 М трис-солна киселина рН 7,5, 1,5 М натриев хлорид за следващи пет минути. Филтрите се промиват по същия начин два пъти върху филтри, напоени с 2 х SSC, изсушават се и се изпичат във вакуумна пещ при 80°С за 2 часа. Двойните филтри се прехибридизират при 42°С за 4 часа с 10 ml за филтър ДНК хибридизационен буфер (5 х SSC, рН 7,0, 4 х разтвор на Denhardt [поливинилпиролидин] поливинилпиролидон, фикол и говежди серумен албумин, 1х=0,02% от всеки), 0,1 % SDS, 50 тМ буфер натриев фосфат, рН 7,0 и 100^g ДНК от денатурирана сперма на пъстърва. Приготвят се 32Р-белязани индикатори чрез киназиране на олигонуклеотидните праймери в белязана АТФ. Филтрите се хибридизират до 0,1 х 105 срт/ ml на белязаните 32Р праймери в пет милилитра на литър ДНК хибридизационен буфер при 42°С за 8 часа. Филтрите се промиват два пъти при 50°С за 30 минути, всеки в промивен буфер съдържащ 0,1 % SDS и 2 х SSC, и два пъти при 50С за 30 минути, всеки с 0,1 °о SDS и 0.2 х SSC. Филтрите се изсушават на въздух и се авторадиографират при -70С за два до три дни.
Тъй като олигонуклеотидните праймери DM28 и DB29 са предназначени да създават един нов Ddel рестрикционен сайт в мутантните клонове (фигура 14), RF-ДНК от известен брой клонове, които хибридизират с всеки от трите киназирани праймери, се смилат с рестрикционния ензим Ddel. Една от мутантните M13-IL 2 плаки, която хибридизира с праймера DM28 и има нов Ddel рестрикционен сайт (M13-LW44), се взима с игла и се инокулира в култура на JM103, като ssflHK се получава от надстоящата течност на културата, dsRF-ДНК се получава от клетъчната маса. По подобен начин една плака, която хибридизира с праймера DM29, се взима с игла (M13-LW46) и от нея се получава ssflHK и RF-ДНК. Олигонуклеотидният праймер DM27 се смила за създаване на нов PstI рестрикционен сайт вместо Ddel сайта. Поради това плаките, които хибридизират до този праймер, се скринират за наличност на нов PstI сайт. Една такава фагова плака се идентифицира (M13-LW42) и от нея се получават ssflHK и RF-ДНК. ДНК от тези три клона се секвенират за потвърждаване, че мишенният TGT кодон за цистеин е превърнат в ТСТ кодон за серин.
Пример 17. Реклониране на мутантен IL2 ген за експресия на Е. coli
RF-ДНК от M13-LW42, M13-LW44 и M13-LW46 се смила, всяка с рестрикционните ензими Hind III u Ban II и инсерционните фрагменти се пречистват от 1 % агарозен гел. По подобен начин плазмидът рТгрЗ (фигура 7) се смила с Hindlll u Banll, като големият плазмиден фрагмент, съдържащ trp промотора, се пречиства върху агарозен гел и тогава се лигира с всеки от инсерционните фрагменти, изолирани otM13-LW42, M13-LW44u M13-LW46. Лигираните плазмиди се трансформират в компетентни E.coli щам К|2 ММ294. Плазмидните ДНК от тези трансформанти се анализират чрез изготвяне на карти с рестрикционен ензим за потвърждаване наличността на плазмидите pLW42,pLW44 u pLW46. Фигура 14 е рекстрикционна карта на pLW46. Когато всеки от тези отделни клонове се култивира в отсъствие на триптофан за индуциране на trp промотора, и клетки свободни от екстракт, се анализират върху SDS-полиакриламидни гелове, се установява, че и трите клона pLW42, pLW44 u pLW46 синтезират 14,5 kd протеин, сходен с този, установяван в позитивната контрола, pLW21, за която е установено, чс продуцира един 14,4 kd IL-2 протеин. Когато същите екстракти се подложат на изследване за IL-2 активност върху миши НТ-2 клетки, само клоновете pLW21 (положителна контрола) и pLW46 проявяват значителна IL-2 активност (таблица II), което показва, че cys 58 и cys 105 са съществени за биологичната активност и промяната им в серини (pLW42 и pLW44 съответно) води до загуба на биологичната активност. Cys 125, от друга страна, не е съществен за биологичната активност, защото промяната му в ser 125 (pLW46) не оказва влияние върху биологичната активност.
Таблица 2
Клонове ИЛ-2 активност (μ/ml)
pIL2-7 (отрицателна
контрола) I
pLW21 (положителна
контрола) 113 000
pLW42 660
pLW44 1 990
pLW46 123 000
Фигура 15а показва нуклеотидната последователност на кодираща верига на клон pLW46. В сравнение с кодиращата верига на естествения човешки IL-2 ген клон pLW46 има единична промяна на база G—> С при нуклеотид 374. Фигура 156 показва съответната аминокиселинна Последователност на 1L-2 мутеин, кодиран от pLW46. Мутеинът е означен desаланин (ala) IL-2serl2J. При сравняване с природния IL-2 мутеинът съдържа серин вместо цистеин в позиция 125, начален N-краен метионин (който е променен) и му липсва началния N-краен аланин на естествената молекула.
Един пробен образец Е. coli К|2 щам ММ294, трансформиран с pLW46, е депозиран в Американската колекция типове култу ри на 26 септември 1983 и е означен като АТСС номер 39 452.
Примери 18 и 19 описват получаването на един алтернативен и предпочитан вектор за експресия на аланил (ala) IL-2 r ser125
Пример 18. Получаване на AIa-IL-2 експресионен вектор pLW32
Един кодон (GCG) за аланин се включва (инсерция) непосредствено след началния кодон на IL-2 гена на pLWl чрез олигонуклеотидно насочената мутагенеза по следния начин. Олигонуклеотидният праймер 5GAAGTAGGCGCCATAAG-3' се киназира, хибридизира се до ssM13-lL-2 ДНК и се разширява по общия метод, описан в пример 15, за образуване на мутантен хетеродуплекс. В допълнение към инсерцията на GCG кодона мутагенезата поражда един нов Narl рестрикционен сайт в гена. Хетеродуплексът се преобразува в затворен кръгов хетеродуплекс и кръговите хетеродуплекси се използват за трансформиране на компетентни JM103 клетки, разстилат се върху агарни плочки и се инкубират както в пример 15. Плочките се скринират за идентифициране на мутантните M13-IL 2 по метода от пример 16. Един мутантен фаг, идентифициран като M13-LW32, се подбира за допълнително клониране и от него се получава RF-ДНК. Фигура 16 е диаграма на плазмида pLW32.
Пример 19. Получаване на Ala-IL-2serl2J експресионен клон pLW55
RF-ДНК от M13-LW46 (примери 16 и 17) се смила с Xbal и PstI и 530 Ьр фрагмент, съдържащ карбокси-крайния кодиращ участък на IL-2scrl2j гена, се пречиства от агарозен гел. По подобен начин pLW32 се смила с Xbal и PstI и големият фрагмент, състоящ се от плазмидния вектор и ala-IL-2 N-крайната кодираща последователност, се пречиства. Двата пречистени ДНК фрагмента се събират на едно място и се лигират с Т4 ДНК лигаза. Лигираната ДНК се трансформира в компетентни Е. coli К-12 щам ММ294. Тетрациклин резистентните трансформанти се анализират чрез изготвяне на картг с рестрикционен ензим за наличност на плазмид, съдържащ alalL-2scr|2, ген, идентифициран като pLW55, който има нов Ddel сайт, неустановявано в pLW32. Фигура 17 е диаграма на pLW55. Установява се, че свободни от клетки екстракти от бактериални култури, съдържащи pLW55, проявя ват повече от 10’ единици IL-2 активност на милилитър при изследване на НТ-2 клетки. J. Watson (виж по-горе) и S. Gillis (виж по-горе). Ala-IL-2wrl2J протеинът е идентичен с IL2seri25 молекулата, показана на фигура 15(6), с изключение на това, че първата включва началния N-краен аланин на естествената молекула.
Пробен образец от Е. coli К-12 щам ММ294 трансформиран с pLW55 е депозиран в Американската колекция типове култури на 18 ноември 1983 и е означен с АТСС N° 39 516.
Пример 20. Получаване и пречистване на Ala-IL-2 ...
ser125
Е. coli, трансформирани с pLW55, се
култивират във ферментатор, съдържащ след-
ната среда:
Таблица D
(NK4)2SO4 150 тМ
КН2РО4 21,6 тМ
Na3 цитрат 155 тМ
ZnSO4.7H2O 30 μΜ
MnSO4.H2O 30 μΜ
CuSO4.5H2O ΙμΜ
pH, поддържано 6,50 със стерилен 2,5
N натриев хидроксид.
Стерилни добавки (след автоклавиране)
MgSO4.7H2O 3 тМ
FeSO4 100 μΜ
Л-триптофан 14 mg/1
Тиаменсолна киселина 20 mg/1
Глюкоза 5 g/1
Тетрациклин 5 mg/1
Етанол 2 %
Казаминокиселини 2 %
Dow Corning пеногасител, 20 % разтвор на полипропилен гликол, 50 % глюкоза и 5 N калиев хидроксид се добавя при нужда.
pH на ферментатора се поддържа на 6,8 с 5-N калиев хидроксид. Остатъчната глюкоза се поддържа между 5-10 g/Ι, разтвореният кислород на 40 % и температурата на 37±1°С. Казаминокиселините (20 % щок разтвор) до концентрация от 2 % се добавя, когато OD6g0 е около 10. Събиране на материал се прави три часа след като OD е достигнало 20.
Събраният материал се концентрира и хомогенизира както в пример 11. След топ линно третиране е DTT материалът се центрофугира и получената пастообразна утайка се екстрахира с уреа до крайна концентрация 4М. Суспензията се центрофугира и към твърдата утайка се добавя SDS до концентрация 5 О/ о ·
Разтворът се прилага в Sephacryl S-200 колона и се отделят фракциите, съдържащи 1L-2 (според SDS-PAGE). Отделените фракции се прилагат в Whatman М-40 колона, запълнена с 18 микронов Vydac С4 силикагел с големина на порите 300 А, калибрирана с 0,1 % TFA. IL-2-мутеинът се елуира с градиент от 40 % до 60 % 2-пропанол, съдържащ 0,1 % TFA за 160 минути. Фракциите, проявяващи най-високи 1L-2 активности, се събират на едно място и се установява че имат специфични активности, сравними с тези на природния 1L-2.
Мутеини на 1L-2, в които цистеинът в позиция 125, е заместен с друга аминокиселина , като мутеинът lL-2serl2J запазват активността си. Те може поради това да се включват в състави и да се използват по същия начин като естествения IL-2. Съответно на това, такива 1L-2 мутеини се използват за диагностика и лечение (локално или системно) на бактериални, вирусни, паразитни, протозойни и гъбични инфекции, за усилване на клетъчно-опосредствена цитотоксичност, за стимулиране на лимфокиназно активирани активни килърни клетки, за опосредстване възстановяването на имунната функция на лимфоцити, за повишаване на алоантигенната реактивност, за улесняване възстановяването на имунната функция при състояния на придобита имунна недостатъчност, за възстановяване на нормална имунофункция при възрастни хора и животни, за провеждане на диагностични изследвания като тези, използващи ензимно усилване, радиобелязане, радиография и други методи, известни на специалистите в тази област, за следене на равнището на IL-2 при болестни състояния, за иницииране на растеж на Т-клетки ин витро за терапевтични и диагностични цели за блокиране на рецепторни места за лимфокини и при различни други приложения в терапията, диагностиката и изследователската работа. Различните терапевтични и диагностични приложения на човешкия IL-2 са изследвани и описани от Rosenberg et al., Mazumder et al., Grimm et al. IL-2 мутеините може да се използват самостоятелно или в комбинация с други имунологично подходящи В или Т клетки или други терапевтични средства. Примери за подходящи клетки са В или Т клетки, естествени килърни клетки и други подобни, а примерни терапевтични реагенти, които могат да бъдат използвани в комбинация е полипептидите съгласно изобретението, са различни интерферони, по-специално гама интерферон. растежен фактор за В клетки, IL- и други подобни. За терапевтично или диагностично приложение те може да се приготвят с нетоксични, непредизвикващи алергии, физиологично поносими носители като дестилирана вода, Рингеров разтвор, разтвор на Ханк, физиологичен разтвор и други подобни. Прилагането на 1L-2 мутеините при хора или животни може да става перорално или интраперитонеално, мускулно или подкожно, както е подходящо според лекаря. Количеството 1L-2 мутеин, което се прилага, обикновено е между 1 χ 104 и 2 х 10’ единици.
Модификации на описаните начини за приложение на изобретението, които са познати за специалистите в областта на генното инженерство, химията на протеините, медицината и сродни области, също са включени в обхвата на следващите претенции.

Claims (10)

  1. Патентни претенции
    1. Човешки рекомбинантен интерлевкин-
  2. 2 мутеин е изпуснат, в даден случай заместен с неутрална аминокиселина, цистеин в позиция 125, номерирана съгласно природния човешки интерлевкин-2, проявяващ биологичната активност на природния човешки интерлевкин-
    2.
    2. Мутеин съгласно претенция I, където неутралната аминокиселина е серин.
  3. 3. Човешки рекомбинантен аланин-интерлевкин-2-серин 12J мутеин.
  4. 4. Човешки рекомбинантен des-аланииинтерлевкин-2-серин |2J мутеин.
  5. 5. Човешки рекомбинантен интерлевкин-
    2- мутеин, с биологична активност на естествения човешки интерлевкин-2, който има аминокиселинна последователност, показана на фигура 15 (Ь) с или без N-краен метионин.
  6. 6. Мутеин съгласно претенции 1, 2, 3, 4 или 5, който е негликозилиран.
  7. 7. Състав за диагностика или терапевтично лечение (локално или системно) на бактериални, вирусни, паразитни, протозойни и гъбични инфекции, за усилване на клетъчно опосредствана цитотоксичност, за стимулира- 5 не на лимфокинно активирана килърна клетъчна активност, за опосредстване възстановяването на имунната функция на лимфоцити, за усилване алоантигенната реактивност, за улесняване възстановяването на имунната фун- 10 кция при състояния на придобита имунна недостатъчност, за възстановяване на нормална имунофункция при възрастни хора и животни, за разработване на диагностични изследвания като тези, използващи ензимно 15 усилване, радиобелязане, радиография за следене на равнищата на интерлевкин-2 при болестни състояния, за иницииране растежа на Т-клетки in vitro за диагностични и терапевтични цели за блокиране на рецепторни места 20 за лимфокини, характеризиращ се с това, че включва (а) ефективно количество рекомбинантен човешки интерлевкин-2 мутеин, в който цистеиновият остатък в позиция 125, номери- 25 рана съгласно естествения човешки интерлевкин-2, е [отстранен] заместен с неутрална аминокиселина, като споменатият мутеин проявява биологичната активност на природния човешки интерлевкин-2; и (б) инертен, непредизвикващ алергии, фармацевтично приемлив носител.
  8. 8. Състав съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че мутеинът е аланииинтерлевкин-2-(.с[)и|| |2, или des-аланин-интерлевкин-2-.сри11123, а носителят е от групата, състояща се от дестилирана вода, Рингеров разтвор, разтвор на Ханк и физиологичен разтвор.
  9. 9. Състав характеризиращ се с това, че включва (а) рекомбинантен човешки интерлевкин-2 мутеин, в който цистеиновият остатък в позиция 125, номерирана съгласно естествения човешки интерлевкин-2, е [отстранен или]заместен с неутрална аминокиселина и който проявява биологичната активност на природния човешки интерлевкин-2 и (б) един полипептид избран от групата, състояща се от гама интерферон, растежен фактор за В-клетки и IL-1.
  10. 10. Състав съгласно претенция 9, ха- рактеризиращ се с това, че мутеинът е аланин-интерлевкин-2 или des аланим-инг серии 115 терлевкин-2 г серии 125
    Приложение: 17 фигури.
    5 10 1520
    MetSerTyrAsnLeu LeuGlyPheLeuGln ArgSerSerAsnPhe GlnCysGlnLysLeu 25 30 3540
    LeuTrpGlnLeuAsn GlyArgLeuGluTyr CysLeulysAspArg MetAsnPheAspIle 45 50 5560
    ProGluGluIleLys GlnteuGlnGInPhe GlnLysGluAspAla AlaLeuThrlleTyr 65 70 7580
    GluMetLeuGlnAsn IlePheAl allePhe ArgGlnAspSerSer SerThrGlyTrpAsn 85 90 95100
    GluThrlleValGlu AsnLeuLeuAlaAsn YalTyrHIsGlnlle AsnHIsLeuLysThr 105 110 115120
    ValLeuGluGluLys LeuGluLysGluAsp PheThrArgGlyLys LeuMetSerSerLeu 125 130 135140
    HIsleulysArgTyr TyrGlyArglleLeu HisTyrLeuLysAla LysGluTyrSerHIs 145 150 155160
    CysAlaTrpThrlle Vai ArgValGluIle LeuAgAsnPheTyr PhelleAsnArgLeu
    165 170 175180
    ThrGlyTyrLeuArg Asn—
BG096074A 1989-07-26 1992-03-16 Човешки рекомбинантни интерлевкин-2 мутеини BG60506B2 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/386,207 USRE33653E (en) 1983-04-15 1989-07-26 Human recombinant interleukin-2 muteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BG60506B2 true BG60506B2 (bg) 1995-06-30

Family

ID=23524613

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG096074A BG60506B2 (bg) 1989-07-26 1992-03-16 Човешки рекомбинантни интерлевкин-2 мутеини

Country Status (1)

Country Link
BG (1) BG60506B2 (bg)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
USRE33653E (en) Human recombinant interleukin-2 muteins
US4588585A (en) Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4853332A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins
EP0192811B1 (en) Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins, their preparation, formulations containing them, and structural genes, vectors and organisms, and their production, suitable for use in the preparation of said muteins
US4959314A (en) Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
US4737462A (en) Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4914033A (en) Structure and properties of modified interferons
US4753795A (en) Modified (80-113) beta interferons
US5004689A (en) DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
HU202287B (en) Process for producing human immune interferon
EP0098862A1 (en) Interferon-alpha 76
JPH057996B2 (bg)
EP0099389A1 (en) Interferon-alpha 54
EP0098863A1 (en) Interferon-alpha 61
WO1989000582A2 (en) Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor and muteins thereof
EP0098864A1 (en) Interferon-alpha 74
BG60506B2 (bg) Човешки рекомбинантни интерлевкин-2 мутеини
BG60510B2 (bg) Структурни гени,плазмиди и трансформирани клетки за получаване на бедни на цистеин мутеини на биологично активни протеини
FI87233B (fi) Gen vilken kodar en mutein.
NO306951B1 (no) DNA-sekvens som koder for et modifisert human-IFM-(beta) samt fremgangsmåte for fremstilling derav