NO306951B1 - DNA-sekvens som koder for et modifisert human-IFM-(beta) samt fremgangsmåte for fremstilling derav - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår generelt rekombinant DNA-teknologi.

Nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse en DNA-sekvens som koder for et modifisert human-IFN-B-protein. Oppfinnelsen angår i tillegg en fremgangsmåte for fremstilling av dette modifiserte human-IFN-B-protein.

Biologisk aktive proteiner som produseres mikrobielt via rekombinant DNA(rDNA)-teknologi kan inneholde cysteinrester som er uvesentlige for aktiviteten men soim er frie til ådanne uønskede intermolekylære eller intramolekylære bindinger. Et slikt protein er mikrobielt fremstilt human B-interferon (IFN-B). Under fremstillingen av IFN-B ved rDNA-teknikker er det observert at diemerer og oligomerer av mikrobielt fremstilte IFN-B dannes i E.-coli-ekstrakter inneholdende høye konsentrasjoner av IFN-B. Denne multimerdannelse gjør rensing og separering av IFN-B meget arbeidskrevende og tids-forbrukende og nødvendiggjør flere ytterligere trinn ved rensing og isolasjon som reduksjon av proteinet under rensingen og reoksydering av dette for ågjenopprette den opprinnelige konformasjon, noe som derved øker muligheten for ukorrekt disulfid-bindingsdannelse. Videre er også mikrobielt fremstilt IFN-8 funnet å vise konsistent lav spesifikk aktivitet, muligens på grunn av dannelse av multimerer eller tilfeldige intramolekylære disulfidbroer. Det ville derfor være ønskelig å være i stand til å endre mikrobielt fremstilte biologisk aktive proteiner som IFN-B på en slik måte at man ikke påvirker aktiviteten ugunstig men reduserer eller eliminerer evnen til å danne intramolekylære kryssbindinger eller intramolekylære bindinger som forårsaker at proteinet opptar en uønsket tertiær struktur (det vil si en konformasjon som reduserer proteinets aktivitet).

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fremstilling ved direkte mutagenese-teknikker av mutasjonelt endrede biologisk aktive proteiner (slike proteiner kalles "muteiner", se "Glossary of Genetic and Cytogenetics", 4. utgave, side 381, Springer Verlag (1976)), som bibeholder aktiviteten av stamanalogene men mangler evnen til å danne intermolekylære bindinger eller uønskede intramolekylære disulfidbindinger. I denne henseende beskriver H.M. Shepard et al. i "Nature" (1981) 294:563-565 et mutein av IFN-B hvori cysteinet i posisjon 141 i aminosyre-sekvensen (det er tre cysteiner i nativt human IFN-B ved posisjonene 17, 31 og 141, se "Gene" (1980) 10:11-15 og "Nature"

(1980) 285:542-547) er erstattet av tyrosin. Dette mutein ble fremstilt ved bakteriell ekspressjon av et hybridgen konstruert fra en partiell IFN-BcDNA-klon med en G->A-transisjon ved nukleotid 485 i IFN-B-genet. Dette mutein manglet den biologiske aktivitet for nativt IFN-B og ledet forfatterne til den konklusjon at det erstattede cystein var vesentlig for aktiviteten.

Rettede mutagenese-teknikker er velkjente og er oppsummert av R.F. Lather og J.P. Lecoq i "Genetic Engineering" Academic Press side 31-50 (1983). Oligonukleotidrettet mutagenese er spesielt nevnt av M. Smith og S. Gillam i "Genetic Engineering: Principles and Methods", Plenum Press, (1981) 3:1-32.

Som angitt ovenfor angår foreliggende opprinnelse en DNA-sekvens som koder for et modifisert human-IFN-B-protein og denne sekvens karakteriseres ved at den består av en nukleotid-kombinasjon der 17-cystein-resten i figur 1 er byttet ut med serin, treonin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, fenylalanin, tryptofan eller metionin.

Oppfinnelsen angår som nevnt ovenfor også en fremgangsmåte for fremstilling av human-IFN-B-muteiner og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at: a) et strukturelt gen fremstilles idet genet koder et syntetisk mutein av et biologisk aktivt protein, hvilket protein har minst en cysteinrest i posisjon som er fri til å danne en disulfidbinding og som er ikke-vesentlig for den biologiske virkning, idet proteinet er human IFN-B, der muteinet har nevnte cysteinrester deletert eller erstattet med en annen nøytral aminosyrerest; b) genet innføres i en vertscelle i en vertsorganisme innsatt i en ekspresjonsvektor, idet vertsorganismen er en bakterie som E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis,

Bacillus thuringiensis eller Bacillus thermophilus, en gjærstamme, en dyrecelle som en muse-, rotte- eller kinahamster-ovarie (CHO)-, eller en plantecelle; og

c) genet eksprimeres.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere ved hjelp av den følgende beskrivelse under

henvisning til de vedlagte figurer der:

Figur 1 er et diagram av aminosyresekvensen i IFN-B.

Figur 2 er en skjematisk illustrasjon som viser fremstilling av et mutant-IFN-B-gen ved oligonukleotid-rettet mutagenese.

Figur 3 viser et diagram av plasmid pBltrp som inkluderer IFN-B-genet.

Figur 4 er et diagram av kloningsvektoren M13mp8-fag.

Figur 5 viser restriksjonskartet for klonen M13-B1.

Figur 6 viser sekvensieringsgelrnønsteret for mutant-IFN-13-serl7-genet som viser en enkelt baseforandring i kodingsregionen.

Figur 7 er diagram av ekspresjonsplasmidet pTrp3.

Figur 8a viser Hinfl restriksjonsmønsteret for klonen pSY2501 og figur 8b viser de resulterende to 169bp- og 28bp-fragmenter derav.

Figur 9 er et restriksjonskart av klonen pSY2501.

Figur 10 viser kodings-DNA-sekvensen for mutein-IFN-Bserl7- med den tilsvarende aminosyresekvens derfor. Figur 11 viser det enkle 18 000 Dalton proteinbånd tilsvarende IFN-6serl7i ekstraktene av klonene pSY2501 og pBltrp.

Proteiner som mutasjonelt kan endres i henhold til oppfinnelsen kan identifiseres fra tilgjengelig informasjon med henblikk på cysteininnholdet av biologisk aktive proteiner og de roller som spilles av cysteinrestene med henblikk på aktivitet og tertiær struktur. For proteiner for hvilke slike informerer ikke er tilgjengelig i litteraturen kan denne informasjon bestemmes ved systematisk å endre hver av cysteinrestene i proteinet ved de prosedyrer som er beskrevet her og å prøve den biologiske aktivitet av de resulterende muteiner og deres tendens til å danne uønskede intermolekylære eller intramolekylære disulfidbindinger. Mens oppfinnelsen i henhold til dette beskrives og eksemplifiseres spesielt nedenfor som angående muteiner av IFN-B og IL-2 skal det være klart at den følgende lære også kan gjelde ethvert annet biologisk aktivt protein som inneholder en funksjonelt ikke-vesentlig cysteinrest som gjør proteinet tilbøyelig til å danne uønskede disulfidbindinger. Eksempler på proteiner andre enn EFN-B og IL-2 som er kandidater for mutasjonell endring i henhold til oppfinnelsen er lymfotoksin

(tumor nekrosefaktor) og koloni-stimulerende faktor-1 samt IFN-ocl. Kandidat-proteinet vil vanligvis ha ulike antall cysteinrester.

Når det gjelder IFN-B er det angitt i litteraturen og at både glycosilert og ikke-glycosilert IFN viser kvalitativt tilsvarende spesifikke aktiviteter og at derfor glycosyldelene ikke er involvert i og ikke bidrar til IFN-B biologiske aktivitet. Imidlertid viser bakterielt produsert IFN-B som ikke er glycosylert over det hele konstant kvantitativt lavere spesifikk aktivitet enn nativt IFN-B som er glycosylert. Men ved at IFN-B har tre cysteinrester i posisjonene 17, 31 og 141. Cystein 141 er av Shepard et al. påvist å være vesentlig for biologisk aktivitet. I IFN-B som inneholder fire cysteinrester er det to intramolekylære -S-S-bindinger: en mellom cys 29 og cys 138 og en annen mellom cys 1 og cys 98. Basert på homologien mellom IFN-B og IFN-as kunne cys 141 i IFN-B være involvert i en intramolekylær -S-S-binding med cys 31, noe som ville gi cys 17 fri til å danne intramolekylære kryssbindinger. Ved enten å utelate cys 17 eller ved å erstatte den med en annen aminosyre kan man bestemme hvorvidt cys 17 er vesentlig for den biologiske aktivitet og dens rolle i -S-S- bindingsdannelse. Hvis cys 17 ikke er vesentlig for den biologiske aktivitet for proteinet kan den resulterende cys 17 manglende eller cys 17 substituerte protein vise spesifikk aktivitet nær den til nativ IFN-6 og ville muligens også lette isolering og rensing av proteinet.

Ved anvendelse av den oligonukleotidorettede mutagenese-prosedyre med en syntetisk oligonukleotid primer som er komplementær til regionen for IFN-B-genet ved codonet for cys 17 som inneholder enkle eller multiple base-endringer i dette codon, kan det produseres et konstruktør-gen som resulterer i at cys 17 erstattes med en hvilken som helst ønsket aminosyre. Når fjerning er ønskelig mangler oligonukleotid-primeren codonet for cys 17. Omdanning av cys 17 til nøytrale aminosyrer som glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, treonin og metionin er den foretrukne tilnærmelse. Serin og trionin er de aller mest foretrukne erstatninger på grunn av deres kjemiske analogi med cystein. Når cysteinet fjernes er det resulterende mutein en aminosyre kortere enn den native stamprotein eller det mikrobielt fremstilte IFN-B.

Størrelsen av oligonukleotid-primeren bestemmes av kravet til stabil hybridisering av primeren til regionen for genet hvori mutasjonen skal induseres og ved begrensninger av de i dag tilgjengelige metoder for syntetisering av oligonukleotider. Faktorene som må tas med i betraktning ved konstruksjon av oligonukleotider for bruk i oligonukleotid-rettet mutagenese (for eksempel total størrelse, størrelsen på de deler som ligger ved siden av mutasjonssetet) beskrives av M. Smith og S. Gillam, supra. Generelt vil den totale lengde av oligonukleotidet være slik at man optimaliserer stabil, unik hybridisering på mutasjonssetet der 5'- og 3'-ekstensjonene fra mutasjonssetet er av til-strekkelig størrelse til å unngå styring av mutasjonen av exonuklease-aktiviteten for DNA-polymerasen. Oligonukleotider som benyttes for mutagenese ifølge oppfinnelsen inneholder vanligvis fra ca. 12 til ca. 24 baser, fortrinnsvis fra ca. 14 til ca. 20 baser og aller helst fra ca. 15 til 18 baser. De vil vanligvis inneholde minst ca. tre baser 3' av det endrede eller manglende codon.

Metoden for fremstilling av det modifiserte IFN-B-gen involverer generelt å indusere en setespesifikk mutagenese i IFN-B-genet ved codon 17 (TGT) ved bruk av en syntetisk nukleotid-primer som utelater codonet eller endrer det slik at det koder for en annen aminosyre. Når treonin erstatter cystein og primeren hybridiseres til antisense-strengen av IFN-8-genet er den foretrukne nukleotid-primer GCAATTTTC ACTCAG (der under-strekningen angir det endrede codon). Når det er ønskelig å utelate cystein er den foretrukne primer AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG, som utelater TGT-codonet for cys. Når cysteinet erstattes av serin velges en 17-nukleotid-primer, GCAATTTTCA GAGTCAG, som inkluderer et AGT-codon for serin. T->A-transisjon av den første base i cys-17-codonet resulterer i endring i cystein til serin. Det skal være klart at når utelatelser innføres må den riktige avlesningsramme for DNA-sekvensen opprettholdes for ekspresjon av det ønskede protein.

Primeren hybridiseres til enkeltstrenget fag som Ml3, fd eller 0X174 inn i hvilken en streng av IFN-B-genet er klonet. Det skal være klart at fagene kan være enten genets sense-streng eller antisense-streng. Når fagene bærer antisense-strengen er primeren identisk med regionen for sense-strengen som inneholder codonet som skal muteres bortsett fra en mistilpasning med dette codon som definerer en utelatelse av codonet eller en triplet som koder for en annen aminosyre. Når fagen bærer sense-strengen er primeren komplementær til regionen for sense-strengen som inneholder codonet som skal muteres bortsett fra en egnet mistilpasning i tripletten som er parret med codonet som skal utelates. Betingelser som skal benyttes ved hydridisering er beskrevet av M. Smith og S. Gillam, supra. Temperaturen vil vanligvis ligge mellom ca. 0°C og 70°C, fortrinnsvis mellom 10°C og 50°C. Efter hybridiseringen blir primeren utvidet på fag-DNA ved omsetning med DNA-polymerase I, T4DNA-polymerase, revers transcriptase eller en annen egnet DNA-polymerase. Den resulterende dsDNA omdannes til lukket sirkulær dsDNA ved behandling med en DNA-ligase som T4DNA-ligase. DNA- molekylet som inneholder enkeltstrengede regioner kan ødelegges ved hjelp av Sl-endonuklease behandling.

Den resulterende mutasjonelle heterodupleks benyttes så for å transformere en kompetent vertsorganisme eller celle. Replikering fra den heterodupleks av verten gir avkom fra begge strenger. Efter replikeringen kan mutantgenet isoleres fra avkommet av mutantstrengen, innføres i en egnet ekspresjonsvektor og vektoren benyttes for å transformere en egnet vertsorganisme eller -celle. Foretrukne vektorer er plasmidene pBR322, pCRl, og varianter derav, syntetiske vektorer og lignende.

Egnede vertsorganismer er E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, forskjellige gjærstammer, Bacillus thermophilius, animalske celler som ovarieceller fra mus, rotter eller kinesisk hamster (CHO) celler, planteceller, animalske og planteverter og lignende. Det skal påpekes at når en valgt vert transformeres med vektoren blir egnede promoter-operator-sekvenser også innført for å uttrykke muteinet. Verter kan være prokaryotiske eller eukariotiske (prosesser for innføring av DNA i eucaryotiske celler er beskrevet i PCT/US 81/00239 og US 81/00240, publisert 3. september 1981). E. Coli- og CHO-celler er de foretrukne verter. Muteinene som oppnås ifølge oppfinnelsen kan være glycosylerte eller ikke-glycosylerte, avhengig av glycosyleringen som opptrer i det native stamprotein og vertsorganismen som benyttes for å produsere muteinet. Hvis ønskelig kan eventuelt ikke-glycosylert mutein oppnådd når E.coli eller en Bacillys er vertsorganisme glycosyleres in vitro ved kjemisk, enzymatisk eller en annen kjent modifisering.

I den foretrukne utførelsesform av oppfinnelsens gjenstand med henblikk på IFN-B blir, som vist i figur 1, cysteinresten i posisjon 17 i aminosyresekvensen av IFN-B omdannet til serin ved en T-»A-transisjon av denne første base i codon 17 i sense-strengen av DNA-sekvensen som koder for det ferdige IFN-B. Den sete-spesifikke mutagenes induseres ved bruk av en syntetisk 17-nukleotid-primer GCAATTTTCA GAGTCAG som er identisk med en 17-nukleotid-sekvens på sense-strengen av IFN-B i regionen for codon 17 bortsett fra en enkelt basemistilpasning ved den første base av codon 17. Mistilpasningen er ved nukleotid 12 i primeren. Det skal erkjennes at den genetiske kode er degenerat og at mange av aminosyrene kan kodes av mer enn en codon. Basekoden for serin er for eksempel seks-veis degenerat slik at codonene TCT, TCG, TCC, TCA, AGT og ACG aller koder for serin. AGT-codonet ble av hensiktsmessig-hetsgrunner valgt som foretrukket utførelsesform. På samme måte kodes treonin av en hvilken som helst av codonene ACT, ACA, ACC og ACG. Det er underforstått at når en codon er spesifisert for en spesiell aminosyre inkluderer den alle degenerat codoner som koder aminosyren. 17-meren hybridiseres til enkeltstrenget M13-fag-DNA som bærer antisense-strengen av IFN-B-genet. Den oligonukleotide primer utvides så på DNA ved bruk av DNA-polymerase I Klenowfragment og det resulterende dsDNA omdannes til lukket sirkulært DNA med T4-ligase. Replikering av den resulterende mutasjonelle heterodupleks gir kloner fra DNA-strengen inneholdende mistilpasningen. Mutant-klonene kan identifiseres og bedømmes ved opptreden eller forsvinnen av spesifikke restriksjonsseter, antibiotisk motstandsevne eller sensitivitet, eller ved andre kjente metoder. Når cystein erstattes med serin resulterer T—>A-transisjonen, vist i figur 2 i dannelse av et nytt Hinfl-restriksjonssete i det strukturelle gen. Mutantklonen identifiseres ved å benytte den oligonukleotide-primer som sonde i en hybridiserings-screening av de muterte fag-plater. Primeren vil ha en enkelt mistilpasning når den hybridiseres til opphavet men vil ha en perfekt tilpasning når den hybridiseres til den muterte fag-DNA som antydet i figur 2. Hybridiseringsbetingelsene kan så anvises hvor oligonukleotid primeren fortrinnsvis hybridiserer til mutert DNA men ikke til stam-DNA. Det nydannede Hinfl-setet tjener også som middel for å bekrefte enkeltbase-muteringen i IFN-B-genet.

M13-fag-DNA som bærer det muterte gen isoleres og spleises inn i en ekspresjonsvektor slik som plasmidet pTrp3, og E. coli-stammen MM294 transformeres med vektoren. Egnede vekstmedia for dyrking av transformanten og avkommet er kjent for fagmannen. Det uttrykte mutein av IFN-8 isoleres, renses og karakteriseres.

De følgende eksempler skal gis for å bidra til en bedre forståelse av oppfinnelsen og er kun illustrerende. De skal ikke ansees som begrensende for oppfinnelsens ramme. Eksemplene 1 til 9 beskriver fremstilling av et mutein av IFN-B. Eksemplene 10 til 15 beskriver fremstilling av et mutein av IL-2.

Således kan, i tillegg til substitusjoner av Cys-17 med Cer-17 (eksempel 2), Thri7og Alaj7(eksempel 3) og delesjon av aminosyren i posisjon 17 (eksempel 4), fagmannen rutinemessig erstatter Cysjy-resten med andre nøytrale aminosyrerester som her beskrevet for derved å oppnå modifiserte IFN-B-molekyler som i det vesentlige bibeholder biologisk aktivitet.

Påvisning av utbyttbarheten av det ikke-essensielle cystein med andre nøytrale aminosyrer er videre vist i tabell II i eksempel 15 der Cys 125 i IL-2 ble erstattet med Val, Met, Ala, Leu, Ile, Pro, Try, Phe, His, Trp, Gly, Thr og Ser, og alle disse IL-2-muteiner viste biologisk aktivitet.

Eksempel 1.

Kloning av IFN- B- genet inn i M13- vektor:

Anvendelsen av M13-fag-vektor som en kilde for enkeltstrenget DNA-templat er vist av G.F. Temple et al. i "Nature" 1982, 296: 537-540. Plasmid pBltrp (figur 3) inneholdende IFN-B-genet under kontroll av E.coli trp-promoter ble spaltet med restriksjonsenzymene Hindlll og XhoII. M13mp8 (J. Messing, "Third Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant DNA," Ed. A. Walton, Elsevier Press, 143-153 (1981)) replikativ form (RF) DNA (figur 4) ble spaltet med restriksjonsenzymene Hindin og BamHI og blandet med pBltrp-DNA som tidligere var spaltet med Hindlll og XhoII. Blandingen ble derefter ligert med T4-DNA-ligase og det legerte DNA transformert til kompetente celler av E.coli-stammen JM 103 og bragt på plate på Xgal-indikatorplater (J. Messing et al, "Nucleic Acids Res." (1981) 9:309-321. Plater inneholdende rekombinant fag (hvite plater) ble plukket ut, inokulert i en frisk kultur av JM 103 og minipreparater av RF-molekyler preparert fra infiserte celler (H.D. Birnboim og J. Doly, "Nucleic Acid Res." (1979) 7:1513-1523). RF-molekylene ble spaltet med forskjellig restriksjonsenzymer for å identifisere klonene inneholdende IFN-B-innskuddet. Restriksjonskartet for en slik klon (M13-B1) er vist i figur 5. Enkelt-strenget (ss) fag-DNA ble fremstilt fra klon M13-61 for å tjene som templat for setespesifikk mutagenese ved bruk av syntetisk oligonukleotid.

Eksempel 2

Setespesifikk mutagenese:

Førti picomol av det syntetiske oligonukleotid GCAATTTTCAGAGTCAG (primer) ble behandlet med T4-kinase i nærvær av 0,1 mM adenosin.trifosfat (ATP), 50 mM hydroksymetylaminometan.hydroklorid (Tris-HCl) pH 8,0,10 mM MgCl2, 5mM ditiotreitol (DTT) og 9 enheter T4-kinase, i 50 (il ved 37°C i ltime. Den kinaserte primer (12 pmol) ble hybridisert til 5 ug ss M13-B DNA i 50 ul av en blanding inneholdende 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0,10 mM MgCl2og 10 mM B-mercaptoetanol ved oppvarming til 67°C i 5 min. og 42°C i 25 min. Blandingen ble så avkjølt på is og derefter satt til 50 ul av en reaksjonsblanding inneholdende 0,5 um hver av deoksynukleosid.trifosfat (dNTP), 80 mM Tris-HCl, pH 7,4, 8 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 9 enheter DNA-polymerase I, Klenow-fragment, 0,5 mM ATP og 2 enheter T4- DNA-ligase, inkubert ved 37°C i 3 timer og ved 25°C i 2 timer. Reaksjonen ble derefter avsluttet ved fenolekstrahering og etanolutfelling. DNA ble oppløst i 10 mM Tris-HCl pH 8,0,10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 50 % sucrose og 0,05 % brom-fenyIblått og elektroforesert på 0,8 % agarosegel i nærvær av 2 ug/ml etidiumbromid. DNA-stripene tilsvarende RF-formene av M13-61 ble eluert fra gel-kutt ved hjelp av perkloratmetoden (R.W. Davis et al., "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., s. 178-179 (1980)). Eluert DNA ble benyttet for å transformere kompetente JM 103-celler, dyrket over natten og SsDNA isolert fra kultursupernatanten. Dette SsDNA ble benyttet som templat i en andre cyklus av primerutvidelse, de gel-remsede RF-former av DNA ble transformert i kompetente JM-103-celler, bragt på agarplater og inkubert over natten for på oppnå fagplater.

Eksempel 3.

Setespesifikk mutagenese:

Forsøket ifølge eksempel 2 ovenfor gjentas bortsett fra at den benyttede syntetiske oligonukleotid-primer er GCAATTTTCAGACTCAG for å forandre codonet 17 i IFN-B-genet fra det som koder for cystein til et som koder for treonin.

Eksempel 4.

Setespesifikk utelatelse:

Forsøket i eksempel 2 ovenfor gjentas bortsett fra at den syntetiske oligonukleotid-primer som ble benyttet var AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG for å utelate codon 17 i IFN-B-genet.

Eksempel 5.

Screening og identifisering av mutageniserte plater:

Plater inneholdende muterte Ml3-61-plater (eksempel 1) såvel som to plater inneholdende ikke-muterte M13-81-fag-plater ble avkjølt til 4°C og plater fra hver plate overført på to nitrocellulosefiltersirkler ved å legge et tørt filter på agarplaten i 5 min. for det første filter og 15 min. for det andre filter. Filtrene ble derefter anbragt på trykt filterpapir som var dynket i 0,2 NaOH, 1,5 NaCl og 0,2 % Triton X-100 i 5 min., og nøytralisert ved legging av filterpapirer dynket med 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 og 1,5 M NaCl i ytterligere 5 min. Filtrene ble vasket på tilsvarende måte to ganger på filteret dynket i to ganger SSC (standard salt citrat), tørket og derefter oppvarmet i en vakuum-ovn til 80°C i to timer. Duplikatfiltrene ble prehydbridisert ved 55°C i 4 timer med 10 ml pr. filter og DNA hybridiseirngsbuffer (5 x SSC) pH 7,0,4 x Denhardfs oppløsning (polyvinylpyrrolidin, Ficoll og storfeserum-albumin, lx = 0,02 % av hver), 0,1 % natrium dodecylsulfat (SDS), 50 mM natrium-fosfat-buffer pH 7,0 og 100 ug/ml denaturert laksesperma-DNA. En<32>P-merket sonde ble fremstilt ved kinasering av oligonukleotid-primeren med<32>P-merket ATP. Filtrene ble hybridisert til 3,5 x IO<5>cpm/ml<32>P-merket primer i 5 ml/filter DNA-hybridiseringsbuffer ved 55°C i 24 timer. Filtrene ble vasket ved 55°C i 30 minutter hver i vaskebuffere inneholdende 0,1 % SDS og synkende mengder SSC. Filtrene ble vasket til å begynne med med buffer inneholdende 2 x SSC og kontrollfilteret inneholdende ikke-muterte M13-J31-plater ble undersøkt med henblikk på nærvær av radioaktivitet ved hjelp av en Geigerteller. Konsentrasjonen av SSC ble senket trinnvis og filtrene vasket inntil det ikke forble noen påvisbar radioaktivitet på kontrollfiltrene med de ikke-muterte Ml 3-131 -plater. Den laveste konsentrasjon av SSC som ble benyttet var 0,1 x SSC. Filtrene ble lufttørket og autoradiografert ved -70°C i 2-3 dager. 480 plater mutert M13-B1 og 100 ikke-muterte kontrollplater ble screenet med kinasert oligonukleotid-sonde. Ingen av kontrollplatene hybridiserte med sonden mens 5 muterte M13-B1-plater hybridiserte med sonden.

En av de fem muterte M13-Bl-plater (M13-SY2501) ble plukket ut og inokulert i en

kultur av JM 103. ssDNA ble fremstilt fra supernatanten og dobbeltstrenget(ds)DNA ble fremstilt fra celle-pelleten. ssDNA ble benyttet som templat for dideoksysekensering av klonen ved bruk av Ml3 universal-primer. Resultatet av sekvens-analysen er vist i figur 6 og bekrefter at TGT-cys-codonet er omdannet til et AGT-ser-codon.

Eksempel 6

Ekspresjon av mutert IFN- B i E. coli:

RF DNA fra M13-SY2501 ble spaltet med restriksjonsenzymene Hindlll og XhoII og 520 bp innskuddsrfagmenter renset på en 1 % agarosegel. Plasmid pTrp3 inneholdende E.coli trp-promoteren (fig. 7) ble spaltet med enzymene Hindlll og BamHI, blandet med renset M13-SY2501 DNA-fragment og legert i nærvær av T4DNA-ligase. Den legerte DNA ble transformert til E.coli-stammen mM294. Ampicillin-resistente transformanter ble screenet med henblikk på sensitiviteten mot medikamentet tetracyklin. Plasmid-DNA fra fem ampicillin-resistente, tetracyklin-sensitive kloner ble spaltet med Hinfi for å screene for nærvær av M13-SY2501-innskuddet. Figur 8a viser Hinfl-restriksjons-mønsteret av en av klonene (pSY2501) og sammenligner dette med Hinfl-mønsteret for den opprinnelige IFN-B-klon, pBltrp. Som forventet var det et ytterligere Hinfi-sete i pSY2501, som spalter 190 bp IFN-B-internfragmentet til 169 bp-fragment og et 28 bp-fragment (fig. 8b). Et restriksjonskart av klonen pSY2501 er vist i fig. 9. Den full-stendige DNA-sekvens av det mutante IFN-B-geb er vist i fig. 10 sammen med den forutsagte aminosyresekvens. Plasmidet som angis som klon pSY2501 er deponert i "Agricultural Research Culture Collection" (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional Research Center, Science and Education Administration, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 60604 og er gitt nr. CMCC 1533 og NRRL B-15356.

Kulturer av pSY2501 og pBltrp som inkluderer avkommet derav, ble dyrket opp til en optisk densitet (OD60o) på 1,0. Cellefrie ekstrakter ble preparert og mengden IFN-B-antiviral virkning prøvet på GM2767-celler i en mikrotiter prøve. Ekstrakter av klon pSY2501 viste 3-10 ganger høyere aktivitet enn pBltrp (tabell 1), noe som antyder at klon pSY2501 enten syntetiserte mere protein som viste IFN-B-aktivitet eller at proteinet hadde en høyere spesifikk aktivitet.

For å bestemme hvorvidt klon pSY2501 syntetiserte flere ganger mere aktivt protein ble ekstraktene av begge kloner elektroforesert på en SDS-polyakrylamidgel sammen med en kontroll-ekstrakt og gelen flekket med coomasie-blått for å synliggjøre proteinene. Som vist i fig. 11 var det kun en proteinstripe tilsvarende et tilsynelatende 18 000 Dalton protein som var tilstede i ekstraktene av klon pSY2501 og pBltr3 men ikke i kontrollekstrakten av ptrp3. Dette protein som hadde en molekylvekt på ca. 20 000 Dalton men viste gelmigreringsmønsteret til et 18 000 Dalton protein, ble tidligere vist å være IFN-6 ved rensing av proteinet fra ekstrakter fra pBltrp. Fordi det er mindre av dette protein i ekstrakter av pSY2501 enn i ekstrakter av pBltrp var den spesifikke aktivitet av proteinet i ekstrakten av klon pSY2501 høyere enn for klon pBltrp.

Eksempel 7.

Rensing av IFN- fi«,CTi 7:

IFN-Bserl7ble gjenvunnet fra E. coli som var transformert for å produsere IFN-Bseri7. E.coli ble dyrket i følgende vekstmedium til en OD på 10-11 ved 680 nm (tørrvekt 8,4 g/l).

pH kontroll med NH4OH.

Et 9,9 1 eller 9,9 kg utbytte av transformert E. coli ble avkjølt til 20°C og konsentrert ved føring gjennom et kryss-strømsfilter med et midlere trykkfall på ca. 110 kpa og en stabiltilstandsfiltratstrømningshastighet på 260 ml/min. inntil filtratvekten var 8,8 kg. Konsentratet på ca. 11 ble helt over i en beholder og avkjølt til 15°C. Cellene i konsentratet ble brutt ned ved å røre konsentratet gjennom en Manton-Gaulin homogenisator ved 5°C, ca. 69 000 kpa. Homogenisatoren ble vasket med 1 1 fosfatbuffret saltoppløsning, pH 7,4 (PBS), og vaskevannet ble satt til det nedbrutte produkt for å gi et sluttvolum på 2 1. Dette volum ble kontinuerlig sentrifugert ved 12 000 g i en strømningshastighet på 50 ml/min. Faststoffet ble separert fra supernatanten og suspendert igjen i 4 1 PBS inneholdende 2 vekt-% SDS. Denne suspensjon ble omrørt ved romtemperatur i 15 min. hvorefter det ikke var noe synlig suspendert materiale. Oppløsningen ble derefter ekstrahert med 1:1 2-butanol: oppløsningsvolum-forhold. Ekstraheringen ble ført i en væske-væskefaseseparator ved bruk av en strømningshastighet på 200 ml/min. Den organiske fase ble derefter separert og fordampet til tørr tilstand og man oppnådde 21,3 protein. Dette ble suspendert igjen i destillert vann i et volumforhold på 1:10.

Det gjenvundne produkt ble prøvet med henblikk på human JJFN-B-akti vitet ved bruk av en prøve basert på beskyttelse mot viral cytopatisk virkning (CPE). Prøven skjedde på mikrotiterplater. 50 ul minimum essensielt medium ble chargert til hver brønn og 25 ul av prøven ble anbragt i den første brønn og 1:3 volum-fortynninger ble gjennomført i en serie til de følgende brønner. Virus (vesiculær stomatit), celle (human fibroblastlinje GM-2767) og referanse-IFN-J3-kontroller ble inkludert på hver plate. Referanse-EFN-B som ble benyttet var 100 enheter/ml. Platene ble derefter bestrålt med ultrafiolett lys i 10 min. Efter bestråling ble 100 ul av cellesuspensjonen (1,2 x IO<5>celle/ml) ble satt til hver brønn og det hele inkuberte i 18-24 timer. En virusoppløsning av en platedannende enhet/celle ble satt til hver brønn bortsett fra cellekontrollen. Det hele ble derefter inkubert inntil viruskontrollen viste 100 % CPE. Dette skjedde vanligvis 18-24 timer efter tilsetning av virusoppløsningen. Prøveresultatene ble tolket i forhold til lokaliseringen av 50 % CPE-brønnen for referanse-IFN-B-kontrollen. Fra dette punkt ble titeren av interferon for alle prøver på platen bestemt. Denne spesifikke aktivitet for det utvunnede produkt ble bestemt til å være 5 x 10' U/mg.

Eksempel 8

Syreutfelling og kromatografisk rensing.

Fremgangsmåten ifølge eksempel 7 ble gjentatt bortsett fra at efter ekstrahering og separering av de vandige og organiske faser og blanding av den organiske fase med PBS i et volumforhold på 3:1 ble pH-verdien i blandingen redusert til ca. 5 ved tilsetning av iseddik. Den resulterende utfelling ble separert ved sentrifugering ved 10 000 til 17 000 g i 15 min. og pelleten ble oppløst igjen i 10 % vekt/volum SDS, 10 mM DTT,

50 mM natriumacetatbuffer, pH 5,5 og oppvarmet til 80°C i 5 minutter.

Oppløsningen ble derefter ført til en Brownlee RP-300,10 uM "Aquapore"-kolonne ved bruk av et Beckman gradientsystem. Buffer A var 0,1 % trifluoreddiksyre (TFA) i H20; buffer B var 0,1 % TFA i acetonitril. Detekteringen skjedde ved ultrafiolett absorbans ved 280 nm. Oppløsningsprogrammet var en lineærgradient av 0 % -> 100 % buffer B i tre timer. Fraksjoner som inneholdt de høyeste interferonaktiviteter ble slått sammen og den spesifikke aktiviteet for det samlede interferon-preparat ble bestemt til 9,0 x 10 7 til 3,8 x 10 8 internasjonale enheter/mg protein sammenlignet med 2x10<8>enheter/mg for nativt IFN-B.

Eksempel 9.

Biokjemisk karakterisering av IFN- fiS(.r17.

Aminosyre-sammensetninger ble bestemt efter 24 til 72 timers styrt hydrolyse av 40 ug prøver av IFN i 200 ul 5,7 N HC1, 0,1 % fenol, ved 108°C. Prolin og cystein ble bestemt på samme måte efter gjennomføring av syreoksydasjonen; i dette tilfelle ble fenol utelatt fra hydrolysen. Tryptofan ble analysert efter 24 timers hydrolyse av 400 ul prøver i 5,7 N HC1, 10 % merkaptoeddiksyre (ingen fenol). Analysen ble gjennomført på en Beckman 121MB aminosyreanalysør ved bruk av en enkelt AA10 harpiks-kolonne.

Aminosyre-sammensetningen beregnet fra representative 24-, 48-, 72-timers sur hydrolyse av renset IFN-B sern stemmer godt overens med det som ble forutsagt ved DNA-sekvensen av klonene IFN-genen minus det manglende terminale metionin.

Aminosyresekvensen for de første 58 rester fra aminosyre-terminus av renset IFN ble bestemt på en 0,7 mg prøve på en Beckman 890C-sequanator med 0,1 M Quadrol buffer. PTH-aminosyrer ble bestemt ved reversfase HPLC på en Altex ultrasfære ODS-kolonne (4,6 x 250 mm) ved 45°C, eluert i 1,3 minutter ved 40 % buffer A og 8,4 minutter 40-»70 % buffer B der buffer A var 0,0115 M natrium acetat, 5 % tetrahydrofuran (THF), pH 5,11 og buffer B var 10 % THF i acetonitril.

Den fastlagte N-terminale aminosyresekvens for IFN-B Ser17passet til den ventede sekvens som ble forutsagt fra DNA-sekvensen bortsett fra fraværet av N-terminalt metionin.

Som antydet ovenfor viste IFN-Bserl7-preparater spesifikke aktivitetsnivåer meget nær de til eller bedre enn de til nativt IFN-B. IFN-Bserl7har ingen frie sulfhydrylgrupper men indikerer en -S-S-binding mellom de eneste gjenværende cysteiner i posisjonene 31 og 141. Proteinet danner ikke lett oligomerer og synes å foreligge i det vesentlige i monomer form. EFN-8serl7som ble oppnådd i henhold til oppfinnelsen kan formuleres enten som et enkelt produkt eller blandinger av de forskjellige former til farmasøytisk aksepterbare preparater i inerte ikke-toksiske, ikke-allergene, fysiologiske kompatible bærermedia for klinisk og terapeutisk bruk i kreft-terapien eller forhold der interferon-terapi er antydet og for virale infeksjoner. Slike medier er ikke begrenset til destillert vann, fysiologisk saltoppløsning, Ringers oppløsning, Hanks oppløsning og lignende. Andre ikke-toksiske stabiliserende og oppløseliggjørende additiver slik som dextrose, HSA (humanserumalbumin) og lignende kan eventuelt innarbeides. De terapeutiske formuleringer kan inngis oralt eller parenteralt, for eksempel intravenøst, intra- muskulært, intraperitonealt og subcutant. Preparater av det modifiserte IFN-B ifølge oppfinnelsen kan også benyttes for topisk anvendelse i egnede medier som vanligvis benyttet for slike formål.

Hovedfordelene ved det ovenfor beskrevne mutein av IFN-B ligger i elimineringen av en fri sulhydrylgruppe i posisjon 17 i IFN-B, noe som derved tvinger proteinet til å danne korrekte fra sulfbindinger mellom cys 31 og cys 141 og å anta den konformasjon som er nødvendig for full biologisk aktivitet. Den ønskede spesifikke aktivitet for IFN-B ser17muliggjør bruken av mindre doseringer i terapeutiske anvendelser. Ved å utelate cysteinet i posisjon 17 og å eliminere den frie SH-gruppen danner IFN-B ser17-proteinet ingen dimerer og oligomerer så lett som det mikrobielt produserte IFN-8. Dette letter rensing av proteinet og øker stabiliteten.

Claims (8)

1. DNA-sekvens som koder for et modifisert human-IFN-B-protein,karakterisert vedat den består av en nukleotidkombinasjon der 17-cysteinresten i figur 1 er byttet ut med serin, treonin, glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, fenylalanin, tryptofan eller metionin.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av human IFN-B-muteiner,karakterisert vedat: a) et strukturelt gen fremstilles idet genet koder et syntetisk mutein av et biologisk aktivt protein, hvilket protein har minst en cysteinrest i pos 1 7 l som er fri til å danne en disulfidbinding og som er ikke-vesentlig for den biologiske virkning, idet proteinet er human JJFN-B, der muteinet har nevnte cysteinrester deletert eller erstattet med en annen nøytral aminosyrerest; b) genet innføres i en vertscelle i en vertsorganisme innsatt i en ekspresjonsvektor, idet vertsorganismen er en bakterie som E. coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis eller Bacillus thermophilus, en gjærstamme, en dyrecelle som en muse-, rotte- eller kinahamster-ovarie (CHO)-, eller en plantecelle; og c) genet eksprimeres.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat cysteinresten erstattes med serin, threonin, glysin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, tyrosin, fenylalanin, tryptofan eller metionin.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat cysteinresten erstattes med serin eller threonin.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 4,karakterisert vedat muteinet er ikke-glykosylert.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 5,karakterisert vedat cysteinresten befinner seg i posisjon 17 på IFN-B og at cysteinresten erstattes med en serinrest.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 6,karakterisert vedat vertscellen er E. coli.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 til 7,karakterisert vedat ekspresjonsvektoren er plasmid pSY2501 med restriksj onskartet