DESCRIPTION
L'invention est du domaine général de la technologie de l'ADN recombinant. Plus précisément, elle concerne des protéines biologiquement actives, modifiées par mutation, qui diffèrent de leurs analogues parents par une ou plusieurs substitutions/suppressions de reste cystéine.
Des protéines biologiquement actives qui sont produites par voie microbienne selon la technologie de l'ADN recombinant (ADNr), peuvent contenir des restes cystéine qui ne sont pas essentiels à leur activité, mais sont libres de former des liaisons intermoléculaires ou intramoléculaires indésirables.
Une telle protéine est le béta-interféron humain produit par voie microbienne (IFN-ss). Au cours de la préparation de l'IFN-ss par des techniques avec l'ADNr, on a observé la formation de dimères et d'oligomères d'IFN-ss, produit par voie microbienne, dans des extraits de E.coli contenant des concentrations élevées en IFN-B. Cette formation de multimères rend la purification et la séparation de l'IFN-ss très laborieuses et longues et nécessite plusieurs autres opérations dans les procédés de purification et d'isolement, tels que la réduction de la protéine pendant la purification et la ré-oxydation pour lui redonner sa conformation originale, augmentant ainsi la possibilité d'une formation incorrecte de liaison disulfure.
De plus, on a également trouvé que l'IFN-ss produit par voie microbienne montrait une activité spécifique constamment faible, due peut-être à la formation de multimères ou de ponts disulfure intramoléculaires désordonnés. Il serait donc souhaitable de pouvoir modifier les protéines biologiquement actives, produites par voie microbienne, telles que l'IFN-ss, d'une manière qui n'affecte pas leur activité, mais qui réduise ou élimine leur aptitude à former des réticulations intermoléculaires ou des liaisons intramoléculaires qui obligent la protéine à adopter une structure tertiaire indésirable (par exemple, une conformation qui diminue l'activité de la protéine).
L'invention a pour but de produire par des techniques de mutagénèse dirigée des protéines biologiquement actives, modifiées par mutation (ces protéines sont appelées mutéi nes , Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4ème édition, p. 381, Springer-Verlag (1976)), qui conservent l'activité de leurs analogues parents, mais ne sont plus capables de former des liaisons intermoléculaires ou des liaisons disulfure intramoléculaires indésirables. A cet égard, Shepard
H.
M., et al, Nature (1981) 294, 563-563, décrit une mutéine d'IFN-p dans laquelle la cystéine en position 141 de sa séquence d'acides aminés (il y a trois cystéines dans l'IFN-ss humain natif en les positions 17, 31 et 141, Gene (1980) 10, 11-15 et Nature (1980) 285, 542 - 547) est remplacée par la tyrosine. Cette mutéine a été obtenue par expression bactérienne d'un gène hybride construit à partir d'un clone d'ADNc d'IFN-p partiel ayant une transition G e A sur le nucléotide 485 du gène IFN-p. La mutéine ne possédait pas l'activité biologique de l'IFN-p natif, ce qui a autorisé les auteurs à conclure que la cystéine remplacée était essentielle à l'activité.
Les techniques de mutagénèse dirigée sont bien connues et ont été revues par Lather R. F. et Lecoq J. P. dans Genetic
Engineering, Academic Press (1983), pages 31 - 50. La mutagénèse dirigée sur oligonucléotide a fait l'objet d'une revue spécifique par Smith M. et Gillam S. dans Genetic
Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981), 3,1-32.
L'invention fournit des gènes structuraux synthétiques possédant des séquences d'ADN, spécifiquement conçues ( gènes construits ) pour coder pour les mutéines synthétiques d'une protéine biologiquement active ayant au moins un reste cystéine, capable de former une liaison disulfure et qui n'est pas essentiel à l'activité biologique, la mutéine ayant au moins un des restes cystéine remplacé par un autre acide aminé et, dans le cas d'interféron-p, supprimé ou remplacé par un autre acide aminé. L'invention porte également sur des vecteurs d'expression qui comprennent de tels gènes construits structuraux en une position qui permet l'expression.
L'invention fournit aussi un procédé pour la production du gène structural synthétique, décrit ci-dessus, par une mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comporte les opérations suivantes:
(a) hybridation d'un ADN mono-caténaire comprenant une chaîne d'un gène structural qui code pour la protéine parente, avec un primer d'oligonucléotide mutant qui est complémentaire d'une région de la chaîne qui comprend le codon pour la cystéine à supprimer ou à remplacer ou le triplet non-sens apparié avec le codon, selon le cas, à l'exception d'un mauvais assortiment avec le codon ou le triplet non-sens , selon le cas, qui définit une suppression du codon ou triplet qui code pour l'autre acide aminé, ou, s'il s'agit d'interféron-B, qui définit une suppression du codon ou un triplet qui code pour l'autre acide aminé;
;
(b) allongement du primer avec l'ADN polymérase pour former un hétéroduplex de mutation;
(c) réplication de l'hétéroduplex de mutation; et
(d) on isole la descendance de la chaîne mutante de l'hétéroduplex, on isole 1'ADN de ladite descendance, et on isole le gène à partir de l'ADN de la descendance.
Les primers d'oligonucléotides mutants utilisés dans ce procédé sont un autre aspect de l'invention.
Aux dessins annexés, on a représenté:
figure 1, un diagramme de la séquence d'acides aminés de IFN-p;
figure 2, un schéma illustrant la préparation d'un gène IFN-ss mutant par mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide;
figure 3, un diagramme d'un plasmide ppltrp comprenant le gène IFN-P;
figure 4, un diagramme du clonage du phage vecteur
M13mp8;
figure 5, la carte de restriction du clone M 13-p 1;
figure 6, l'image sur gel du gène IFN-Pserl7 mutant, montrant un seul changement de base dans la région codante;
figure 7, un diagramme du plasmide d'expression pTrp3;
figure 8a, le mode de restriction HinfI du clone pSY2501 et figure 8b, les deux fragments résultant 169bp et 28bp;
figure 9, une carte de restriction du clone pSY2501;
;
figure 10, la séquence d'ADN codant pour la mutéine IFN-PserI7 avec la séquence d'acides aminés correspondante;
figure 11, la simple bande de la protéine à 18 000 daltons correspondant à IFN-ssser,7 dans les extraits des clones pSY2501 et pBltrp;
figure 12, un diagramme du plasmide pLW1 qui contient le gène interleukine-2 (IL-2) humaine, sous le contrôle du promoteur E.Coli trp;
figure 13, une carte de restriction du clone du phage M13-IL2;
figure 14, une carte de restriction du plasmide pLW46;
figures 15a et 15b, la séquence de nucléotides de la chaîne codante du clone pLW46 et la séquence des acides aminés correspondants de la mutéine IL-2 appelée IL-2serl2s.
L'invention se rapporte à des mutéines de protéines biologiquement actives dans lesquelles les restes cystéine qui ne sont pas essentiels à l'activité biologique ont été délibérément remplacés par d'autres acides aminés pour éliminer des sites de réticulation intermoléculaire ou de formation incorrecte de liaison disulfure intramoléculaire; des gènes mutants codant pour ces mutéines; et des procédés pour produire ces mutéines.
Des protéines qui peuvent être modifiées par mutation selon l'invention peuvent être identifiées à partir d'une information concernant le teneur en cystéine des protéines biologiquement actives et les rôles joués par les restes cystéine quant à l'activité et à la structure tertiaire. Dans le cas de protéines au sujet desquelles on ne dispose pas d'une telle information dans la littérature, cette information peut être obtenue en modifiant systématiquement chaque reste de cystéine de la protéine par les modes opératoires décrits ici et en déterminant l'activité biologique des mutéines résultantes et leur tendance à former des liaisons disulfure intermoléculaires ou intramoléculaires indésirables.
En conséquence, bien que l'invention soit décrite spécifiquement et illustrée par les exemples ci-dessous concernant des mutéines d'IFNp et de IL-2, il est évident que les enseignements suivants s'appliquent également à toute autre protéine biologiquement active qui contient un reste cystéine fonctionnellement non-essentiel qui rend la protéine capable de former une liaison disulfure indésirable. Comme exemples de protéines autres que IFN-p et IL-2 qui peuvent subir une modification par mutation selon l'invention, on citera la lymphotoxine (facteur de nécrose tumorale) et le facteur-1 stimulant les colonies, et IFN-al. Ces protéines ont normalement un nombre impair de restes cystéine.
Dans le cas de IFN-p, on a rapporté dans la littérature que les IFN glycosylé et non-glycosylé montrent des activités spécifiques qualitativement semblables et qu'en conséquence, les parties glycosyle ne sont pas impliquées dans et ne contribuent pas à l'activité biologique d'IFN-ss. Mais l'IFN-p produit par voie bactérienne, qui ne contient pas d'unités glycosyle, montre constamment une activité spécifique quantitativement inférieure à celle d'IFN- qui est glycosylé. L'IFN-p est connu pour posséder trois restes cystéine en les positions 17, 31 et 141. Shepard et al, ci-dessus, ont démontré que la cystéine 141 est essentielle pour l'activité biologique.
Dans l'IFN-p, qui contient quatre restes cystéine, il y a deux liaisons -S-S-intramoléculaires; l'une entre cys 29 et cys 138 et l'autre entre cys 1 et cys 98. A partir de l'homologie entre IFN-p et IFN-a, cys 141 d'IFN-p pourrait être impliqué dans une liaison -S-S-intramoléculaire avec cys 31, laissant cys 17 capable de former des réticulations intermoléculaires. En supprimant cys 17 ou en le remplaçant par un autre acide aminé, on peut alors déterminer si cys 17 est essentiel à l'activité biologique et quel est son rôle dans la formation de liaison -SS-.
Si cys 17 n'est pas essentiel pour l'activité biologique de la protéine, la protéine sans cys 17 ou dans laquelle on a remplacé cys 17, résultante, pourrait montrer une activité spécifique proche de celle d'IFN-p natif et ceci pourrait faciliter également l'isolement et la purification de la protéine.
En utilisant le procédé de mutagénèse dirigé sur oligonucléotide, avec un primaire oligonucléotide synthétique complémentaire de la région du gène IFN-p au codon pour cys 17, mais qui contient des modifications de base simple ou multiple dans ce codon, il est possible de produire un gène construit en remplaçant cys 17 par un autre acide aminé choisi. Lorsqu'on désire une suppression, le primaire oligonucléotide ne possède pas de codon pour cys 17. La conversion de cys 17 en des acides aminés neutres tels que la glycine, la valine, l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la tyrosine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la sérine, la thréonine et la méthionine constitue l'approche préférée. La sérine et la thréonine sont les acides aminés de remplacement particulièrement préférés en raison de leur analogie chimique avec la cystéine.
Lorsque la cystéine est supprimée, la mutéine mature est plus courte d'un acide aminé que la protéine parente native ou l'IFN-p produit par voie microbienne.
L'IL-2 humaine est connue pour avoir trois restes cystéine en les positions 58, 105 et 125 de la protéine.
Comme dans le cas d'IFN-p, IL-2 se présente sous une forme oligomère agrégée après isolement à partir de cellules bactériennes et doit être réduite par des agents réducteurs pour obtenir un bon rendement à partir des extraits bactériens. De plus, la protéine IL-2 réduite, purifiée, est instable et se réoxyde facilement au stockage en une forme oligomère inactive. La présence de ces trois cystéines signifie que par réoxydation la protéine peut former au hasard l'un des trois ponts disulfure intramoléculaires possibles, l'un seulement d'entre eux étant le pont correct trouvé dans la molécule native.
Etant donné qu'on ne connait pas la structure disulfure de la protéine IL-2 native, il est possible d'utiliser l'invention pour créer des mutations aux codons 58, 105 et 125 du gène IL-2 et identifier les résidus de cystéine qui sont nécessaires pour l'activité, et par conséquent les plus probables à impliquer dans la formation du pont disulfure natif. De la même manière, le reste cystéine qui n'est pas nécessaire pour l'activité, peut être modifié de manière à éviter la formation de ponts disulfure intramoléculaires incorrects et minimiser le risque de ponts disulfure intermoléculaires en éliminant ou en remplaçant le résidu cystéine libre.
La dimension du primer d'oligonucléotide est déterminée par la nécessité d'une hybridation stable du primer dans la région du gène où la mutation doit être induite et par les limites des procédés actuellement disponibles pour synthétiser des oligonucléotides. Les facteurs à considérer dans la constitution d'oligonucléotides utilisables dans la mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide (par exemple dimension globale, dimensions des portions adjacentes au site de mutation) sont décrits par Smith M. et Gillam S., ci-dessus.
De manière générale, la longueur totale de l'oligonucléotide doit permettre d'optimiser une hybridation unique, stable sur le site de mutation, les extensions 5' et 3' à partir du site de mutation ayant une dimension suffisante pour éviter que la mutation ne soit dirigée par l'activité exonucléase de 1'ADN polymérase. Les oligonucléotides utilisés pour la mutagénèse selon l'invention contiennent normalement environ de 12 à 24 bases, de préférence environ de 14 à 20 bases et avantageusement environ de 15 à 18 bases. Ils contiennent normalement au moins environ trois bases 3' du codon modifié ou manquant.
Le procédé pour préparer le gène IFN-p modifié implique de manière générale l'induction d'une mutagénèse spécifique d'un site dans le gène IFN-p au codon 17 (TGT) au moyen d'un primer d'oligonucléotide synthétique qui omet le codon ou le modifie de manière à ce qu'il code pour un autre acide aminé. Lorsque la thréonine remplace la cystéine et que le primer est hybridé avec la chaîne nonsens du gène IFN-p, le primer de nucléotide préféré est
GCAATTTTCACTCAG (la partie soulignée représente le codon modifié). Lorsqu'il est souhaitable de supprimer la cystéine, le primer préféré est
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG qui omet le codon TGT pour cys. Lorsque la cystéine est remplacée par la sérine, on choisit de préférence un primer à 17 nucléotides,
GCAATTTTCAGAGTCAG, qui comprend un codon AGT pour la sérine.
La transition T eA de la première base dans le codon 17 cys se traduit par le remplacement de la cystéine par la sérine. Il faut reconnaître que lorsqu'on introduit des suppressions, le système de lecture convenable pour la séquence d'ADN doit être maintenu pour l'expression de la protéine désirée.
Le primer est hybridé avec un phage mono-caténaire tel que M13, fd ou OX174 dans lequel on a cloné une chaîne du gène IFN-p. Il faut noté que le phage peut porter la chaîne qui a un sens ou la chaîne non-sens du gène. Lorsque le phage porte la chaîne non-sens , le primer est identique à la région de la chaîne qui a un sens , qui contient le codon à muter, si ce n'est un mauvais assortiment avec ce codon, qui définit une suppression du codon ou un triplet qui code pour un autre acide aminé. Lorsque le phage porte la chaîne qui a un sens , le primer est complémentaire de la région de la chaîne qui a un sens , qui contient le codon qui doit être muté, si ce n'est un mauvais assortiment approprié dans le triplet qui est apparié avec le codon à supprimer.
Les conditions utilisables dans l'hybridation sont décrites par
Smith M. et Gillam S., ci-dessus. La température est normalement comprise entre 0 et 70 C, de préférence entre 10 et 50 "C. Après l'hybridation, le primaire est prolongé sur 1'ADN du phage par réaction avec l'ADN polymérase I, la
T4 ADN polymérase, la reverse transcriptase ou d'autres
ADN polymérases appropriées. L'ADN bicaténaire résultant est converti en ADN bicaténaire circulaire fermé, par traitement avec une ADN ligase telle que la T4 ADN ligase.
Les molécules d'ADN contenant des régions mono-caténaires peuvent être détruites par un traitement avec la S1 endonucléase.
Une mutagénèse dirigée sur un oligonucléotide peut être également utilisée pour produire un gène IL-2 mutant qui code pour une mutéine ayant une activité IL-2, mais dont cys 125 est changé en sérine 125. Le primer d'oligonucléotide utilisé dans la production de ce gène IL-2 mutant lorsque le phage porte la chaîne qui a un sens du gène, est
GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC.
Cet oligonucléotide comporte un changement C -,G sur la base centrale sur le triplet qui est apparié avec le codon 125 du gène IL-2.
L'hétéroduplex de mutation résultant est alors utilisé pour transformer un organisme ou une cellule hôte compétent. La réplique de l'hétéroduplex par l'hôte fournit des descendants à partir des deux chaînes. Après la réplique, le gène mutant peut être isolé à partir des descendants de la chaîne mutante, inséré dans un vecteur d'expression approprié, puis le vecteur utilisé pour transformer un organisme ou cellule hôte approprié. Comme vecteurs appropriés, on citera les plasmides pBR322,pCR1 et leurs variantes, des vecteurs synthétiques et autres.
Des organismes hôtes appropriés sont E.coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, différentes souches de levures, Bacillus thermophilus, des cellules animales telles que des cellules de souris, de rat ou d'ovaires d'hamster de Chine (CHO), des cellules végétales, des hôtes animaux et végétaux et similaires. I1 faut noter que lorsqu'un hôte choisi est transformé avec le vecteur, des séquences promoteur-opérateur appropriées sont également introduites de manière à exprimer la mutéine. Les hôtes peuvent être procaryotes ou eucaryotes (des procédés pour l'insertion d'ADN dans des cellules eucaryotes sont décrits dans les PCT applications , nO US81/00239 et US81/00240, publiés le 3 septembre 1981).
Les hôtes préférés sont E.coli et les cellules CHO. Les mutéines obtenues selon l'invention peuvent être glycosylées ou non-glycosylées, selon la glycosylation se produisant dans la protéine parente native et l'organisme hôte utilisé pour produire la mutéine. Si celà s'avère souhaitable, une mutéine non-glycosylée obtenue lorsque l'organisme hôte est E.coli ou un Bacillus. peut être éventuellement glycosylée in vitro par voie chimique, enzymatique ou par d'autres types de modifications connus dans la technique.
Dans le mode de réalisation préférée de l'invention relative à IFN-p, le reste cystéine en position 17 dans la séquence d'acides aminés d'IFN-p, tel que représenté sur la figure 1 des dessins annexés, est changé en sérine par une transition T < A de la première base du codon 17 de la chaîne qui a un sens de la séquence d'ADN qui code pour IFN-ss mature. La mutagénèse spécifique du site est induite au moyen d'un primer à 17 nucléotides GCAATTTTCA
GAGTCAG, identique à la séquence de 17 nucléotides de la chaîne qui a un sens d'IFN-p dans la région du codon 17, si ce n'est un mauvais assortiment d'une simple base sur la première base du codon 17.
Le mauvais assortiment est sur le nucléotide 12 dans le primer. I1 faut noter que le code génétique est dégénéré et que de nombreux acides aminés peuvent être codés par plus d'un codon. Le code de base pour la sérine, par exemple, est dégénéré de 6 manières, et donc les codons TCT, TCG, TCC, TCA, AGT et ACG codent tous pour la sérine. Le codon AGT a été choisi par convenance pour le mode de réalisation préféré. De même, la thréonine est codée par l'un quelconque des codons ACT,
ACA, ACC et ACG. I1 est entendu que lorsqu'un codon est spécifié pour un acide aminé particulier, il comprend tous les codons dégénérés qui codent pour cet acide aminé.
Le merl7 est hybridé avec un ADN provenant d'un phage M13 mono-caténaire qui porte la chaîne non-sens du gène IFN-p. Le primaire oligonucléotide est alors allongé sur l'ADN au moyen d'un fragment Klenow de 1'ADN polymérase I et l'ADN bicaténaire résultant est converti en ADN circulaire fermé avec la T4 ligase. Une réplique de l'hétéroduplex de mutation résultant donne des clones à partir de la chaîne d'ADN contenant le mauvais assortiment. Des clones mutants peuvent être identifiés et sélectionnés par l'apparition ou la disparition de sites de restriction spécifiques, la résistance ou la sensibilité aux antibiotiques ou par d'autres procédés connus dans la technique.
Lorsque la cystéine est remplacée par la sérine, la transition T e A, représentée sur la figure 2 des dessins annexés, se traduit par la création d'un nouveau site de restriction HinfI dans le gène structural. Le clone mutant est identifié en utilisant l'oligonucléotide primaire comme un modèle dans une sélection par hybridation des plaques de phages mutés. Le primaire comporte un seul mauvais assortiment lorsqu'il est hybridé avec le parent, mais montre un assortiment parfait lorsqu'il est hybridé avec 1'ADN du phage muté, tel que représenté sur la figure 2. Les conditions d'hybridation peuvent alors être choisies de telle sorte que le primaire oligonucléotide hybride de préférence avec l'ADN muté, mais pas avec 1'ADN parent.
Le nouveau site engendré HinfI sert également comme moyen de confirmation de la simple mutation de base dans le gène IFN-P.
L'ADN du phage M13 portant le gène muté est isolé etadjoint à un vecteur d'expression approprié tel que le plasmide pTrp3, et la souche MM294 de E.coli est transformée avec le vecteur. Des milieux de développement appropriés pour la culture des produits de transformation et de leur descendance sont connus des spécialistes de la technique. La mutéine de IFN-p exprimée est isolée, purifiée et caractérisée.
Les exemples non-limitatifs suivants sont donnés à titre d'illustration de l'invention. Les exemples 1 à 9 décrivent la préparation d'une mutéine de IFN-p. Les exemples 10 à 15 décrivent la préparation d'une mutéine de IL-2.
Exemple 1
Clonage du gène IFN-p dans le vecteur M13
L'utilisation du vecteur du phage M13 comme source de copie d'ADN mono-caténaire a été démontrée par G. F.
Temple et al, Nature (1982) 296, pages 537-540. On fait digérer le plasmide ppltrp (figure 3) contenant le gène IFN-ss sous contrôle du promoteur trp de E.coli, avec les enzymes de restriction HindIII et XhoII. On fait digérer 1'ADN de la forme répliquée (RF) M13mp8 (figure 4) (J. Messing, Third
Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant
DNA , Ed. A. Walton, Elsevier Press, 143-153 (1981) avec les enzymes de restriction HindIII et BamHI, et on mélange avec 1'ADN pssltrp qu'on a préalablement fait digérer avec
HindIII et XhoII. On relie le mélange avec la T4 ADN ligase et l'ADN lié est transformé dans des cellules compétentes de
E.coli souche JM 103 et appliqué sur des plaques d'indicateur Xgal (J.
Messing et al, Nucleic Acids Res. (1981) 9, pages 309-321). On rassemble les plaques contenant le phage recombinant (plaques blanches), on inocule dans une culture fraîche de JM 103 et à partir des cellules infectées on obtient des mini-préparations de molécules RF (H.D. Birnboim et J. Doly, Nucleic Acid Res (1979) 7, 1513 - 1523). On fait digérer les molécules RF avec différentes enzymes de restriction pour identifier les clones contenant l'insert IFN ss. La carte de restriction d'un tel clone (M13-B1) est reproduite sur la figure 5 des dessins annexés. On prépare 1'ADN mono-caténaire provenant du phage à partir du clone M 13-p 1 pour servir de copie pour une mutagénèse spécifique d'un site en utilisant un oligonucléotide synthétique.
Exemple 2
Mutagénèse spécifique d'un site
On traite 40 picomoles de l'oligonucléotide synthétique
GCAATTTTCAGAGTCAG (primaire) avec la T4 kinase en présence de 0,1 mM d'adénosine triphosphate (ATP), 50 mM de chlorhydrate d'hydroxyméthylaminométhane (Tris-HCl) de pH 8,0, 10 mM de MgC12, 5 mM de dithiothréitol (DTT) et 9 unités de T4 kinase, dans 50 Cll à 37 "C pendant 1 heure.
On hybride le primaire traité avec la kinase (12 pmoles), avec 5 g d'ADN Ml3-pl mono-caténaire dans 50 ,u1 d'un mélange contenant 50 mM de NaCl, 10 mM de Tris-GC1 de pH 8,0, 10 mM de
MgCl2 et 10 mM de p-mercaptoéthanol, en chauffant à 67 "C pendant 5 minutes et à 42 "C pendant 25 minutes.
On refroidit le mélange ainsi traité sur de la glace et on ajoute 50 cl d'un mélange réactionnel contenant 0,5 mM de chacun des désoxynucléoside triphosphates (dNTP), 80 mM de Tris-HCl de pH 7,4, 8 mM de MgC12, 100 mM de NaCl, 9 unités d'ADN polymérase I, fragment Klenow, 0,5 mM d'ATP et 2 unités de T4 ADN ligase, on incube à 37 "C pendant 3 heures et à 25 "C pendant 2 heures. On termine alors la réaction par une extraction au phénol et une précipitation avec de l'éthanol.
On dissout l'ADN dans 10 mM de Tris-HCl de pH 8,0, 10 mM d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA), 50% de sucrose et 0,05% de bleu de bromophénol et on soumet à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 0,8% en présence de 2,ug/ml de bromure d'éthidium. On élue les bandes d'ADN correspondant aux formes RF de M13-pl à partir de découpes de gel par le procédé au perchlorate (R.W. Davis et al, Advanced
Bacterial Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.
pages 178-179 (1980)). On utilise l'ADN élué pour transformer des cellules compétentes de JM 103, on laisse se développer pendant une nuit et on isole 1'ADN mono-caténaire à partir du produit surnageant de la culture. On utilise cet ADN mono-caténaire comme copie dans un second cycle d'extension du primaire, on transforme les formes RF, purifiées sur gel, de l'ADN dans des cellules compétentes JM 103, on dépose sur des plaques de gélose et on incube pendant une nuit pour obtenir des plaques de phage.
Exemple 3
Mutagénèse spécifique d'un site
On répète l'expérience de l'exemple 2 ci-dessus, si ce n'est qu'on utilise comme primaire oligonucléotide synthétique
GCAATTTTCAGACTCAG pour changer le codon 17 du gène IFN-p en partant d'un codon qui code pour la cystéine pour arriver à un codon qui code pour la thréonine.
Exemple 4
Suppression de la spécificité d'un site
On répète l'expérience de l'exemple 2 ci-dessus, si ce n'est que le primaire oligonucléotide synthétique utilisé est AGCAATTT'I'CAGCAGAAGCTCCTG pour supprimer le codon 17 du gène IFN-p.
Exemple 5
Sélection et identification des plaques
obtenues par mutagénèse
On refroidit à 4 "C des lames contenant des plaques de M13-ssl muté (exemple 1) ainsi que deux lames contenant des plaques de phage M13-pl non-muté et on transfère des plaques de chaque lame sur deux ronds de papier-filtre en nitrocellulose en plaçant un filtre sec sur la lame de gélose pendant 5 minutes pour le premier filtre et 15 minutes pour le second filtre. On place alors les filtres sur des papiers filtres épais imbibés dans NaOH 0,2 N, NaCl 1,5 M et 0,2% de Triton X-100 pendant 5 minutes, puis on neutralise en recouvrant avec des papiers filtres imprégnés de 0,5 M de
Tris-HCl de pH 7,5 et 1,5 M de NaC1 pendant 5 autres minutes.
On lave deux fois les filtres de la même manière sur des filtres imprégnés dans SSC x 2 (solution saline de citrate standard, on sèche et on cuit dans une étuve à vide à 80 "C pendant 2 heures. On pré-hybride les filtres en double à 55 "C pendant 4 heures avec 10 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN (SSC x 5) de pH 7,0, une solution de
Denhardt x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine, 1 fois = 0,02% de chacune des substances), 0,1% de dodécyl sulfate de sodium (SDS), 50 mM de tampon de phosphate de sodium de pH 7,0 et 100 pLg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. On prépare un modèle marqué à 2P en traitant par une kinase le primaire oligonucléotide avec ATP marqué à 32p.
On hybride les filtres avec 3,5 x 105 cpm/ml de primaire marqué à 32P dans 5 ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN à 55 "C pendant 24 heures. On lave les filtres à 55 "C pendant 30 minutes chacun dans des tampons de lavage contenant 0,1 % de SDS et des quantités décroissantes de SSC. On lave initialement les filtres avec un tampon contenant du SSC x 2 et on examine les filtres témoins contenant des plaques de M13-pl non-muté, quant à la présence d'une radioactivité quelconque, en utilisant un compteur de Geiger. On abaisse progressivement la concentration en SSC et on lave les filtres jusqu'à disparition de toute radioactivité détectable sur les filtres témoins avec des plaques de M13-pl non-muté.
La plus faible concentration en SSC utilisée est de SSC > < x 0,1. 0,1. On sèche les filtres à l'air et on les soumet à une autoradiographie à -70 "C pendant de 2 à 3 jours. Avec le modèle d'oligonucléotide traité par une kinase, on sélectionne 480 plaques de M13-ssl muté et 100 plaques témoins de M13-pl non-muté. Aucune des plaques témoins n'hybride avec le modèle, alors que 5 plaques de M13-pl muté hybrident avec le modèle.
On recueille une des 5 plaques de M13-pl muté (M13 SY2501) et on inocule dans une culture de JM 103. On prépare un ADN mono-caténaire à partir du liquide surnageant et un ADN bicaténaire à partir du culot de cellules. On utilise l'ADN monocaténaire comme copie pour la séquence didésoxy du clone avec le primaire universel M 13. Le résultat de l'analyse de la séquence est reproduit sur la figure 6, confirmant que le codon cys TGT a bien été converti en un codon ser AGT.
Exemple 6
Expression d'IFN-p muté dans E.coli
On fait digérer l'ADN RF de M13-SY2501 avec les enzymes de restriction HindIII et XhoII et on purifie le fragment d'insert 520 bp sur un gel d'agarose à 1%. On fait digérer le plasmide pTrp3 contenant le promoteur trp E.coli (figure 7) avec les enzymes HindIII et BamHI, on mélange avec le fragment d'ADN M13-SY2501 purifié et on relie en présence de T4 ADN ligase. L'ADN ligaturé est transformé dans une souche MM294 de E.coli. On sélectionne les produits de transformation résistant à l'ampicilline, quant à leur sensibilité au médicament de tétracycline. On fait digérer l'ADN plasmique provenant de 5 clones résistant à l'ampicilline, sensibles à la tétracycline, avec HinfI pour déterminer la présence de l'insert M13-SY2501.
La figure 8a reproduit le mode de restriction par Hindi d'un des clones (pSY2501), le comparant au mode de restriction par Hinfl du clone d'IFN-p original, ppltrp. Comme attendu, on observe un site supplémentaire Hindi dans pSY2501, coupant le fragment interne 197 bp IFN-B en un fragment 169 bp et un fragment 28 bp (figure 8b). Une carte de restriction du clone pSY2501 est reproduite sur la figure 9.
La séquence totale d'ADN du gène IFN-p mutant est reproduite sur la figure 10 avec la séquence des acides aminés prévue.
Le plasmide désigné comme le clone pSY2501 est déposé auprès de l'Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional
Research Center, Science and Education Administration,
U.S. Department of Agriculture, 1815 North University
Street, Peoria, Illinois 60604 et a reçu les numéros d'immatriculation CMCC nO 1533 et NRRL nO B-15356.
Les cultures de pSY2501 et ppltrp, qui comprennent leur descendance, sont poursuivies jusqu'à une densité optique (DO600) de 1,0. On prépare des extraits sans cellules et on détermine l'activité antivirale d'IFN-p sur des cellules de
GM2767 dans un micro-titrage. Les extraits du clone pSY2501 montrent une activité de 3 à 10 fois supérieure à celle de ppltrp (Tableau I), indiquant que le clone pSY2501 a synthétisé plus de protéine montrant une activité IFN-p ou que la protéine obtenue a une activité spécifique supérieure.
Tableau I
Extrait Activité antivirale (U/ml) pSY2501 6x105 ppltrp 1 1x10' x 105 î0 ptrp3 (témoin) 30
Pour déterminer si le clone pSY2501 a synthétisé plusieurs fois une protéine plus active, on soumet les extraits des deux clones à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide SDS avec un extrait témoin et on colore le gel avec du bleu de Coomassie pour visualiser les protéines. Comme montré sur la figure 11, on n'observe qu'une seule bande de protéine correspondant à une protéine apparente à 18 000 daltons, présente dans les extraits des clones pSY2501 et ppltrp, mais non dans l'extrait témoin ptrp3.
Cette protéine qui a une masse moléculaire d'environ 20 000 daltons, mais montre un mode de migration sur gel d'une protéine de 18 000 daltons, s'est montrée au préalable être IFN-p par purification de cette protéine à partir d'extraits de pPltrp.
Etant qu'il y a une moindre quantité de cette protéine dans les extraits de pSY2501 que dans les extraits de ppltrp, l'activité spécifique de la protéine dans des extraits du clone pSY2501 est supérieure à celle du clone ppltrp.
Exemple 7
Purification de IFN-ssserl7
On recueille IFN-Pseri7 à partir de E.coli qu'on a transformé pour produire IFN-PserI7. On cultive E.coli dans le milieu de culture suivant à une DO de 10-11 à 680 nm (poids sec 8,4 g.l).
Ingrédient Concentration NH4Cl 20 mM
K2SO4 16,1 mM
KH2PO4 7,8 mM
Na2HPO4 12,2mM MgSO4 7H20 3 mM
Citrate trisodique, di-hydraté 1,5 mM
MnSO4 4H20 30 pM ZnSO4 7H2O 30 pM
CuSO4 5H20 3 I1M
L-tryptophane 70 mg/l
FeSO4 7HO 72 I1M
Thiamine HCl 20 mg/l
Glucose 40 g/l
Ajustement du pH avec NH40H
On refroidit à 20 "C 9,9 litres (0,9 kg) de culture de E.coli transformé et on concentre en faisant passer la culture sur un filtre à écoulement transversal sous une chute de pression moyenne d'environ 110 kPa et un débit de filtrat constant de 260 ml/mn jusqu'à ce le
filtrat pèse 8,8 kg. On verse le produit concentré (environ un litre) dans une cuve et on refroidit à 15 C. On rompt les cellules dans le produit concentré en le faisant passer sur un homogénéiseur de
Manton-Gaulin à 5 "C, environ 69 000 kPa. On lave l'homogénéiseur avec un litre de solution saline tamponnée au phosphate, de pH 7,4 (PBS) et on ajoute l'eau de lavage au produit de cellules brisées pour obtenir un volume final de 2 litres. On centrifuge ce volume en continu à 12 000 > < x g à un débit de 50 ml/mn. On sépare le solide du produit surnagent et on remet en suspension dans 4 litres de PBS contenant 2% en poids de SDS. On agite cette suspension à la température ambiante pendant 15 minutes, après quoi il n'y plus de matériau visible en suspension.
On extrait alors la solution avec du 2-butanol dans un rapport volumique 2-butanol/ solution de 1:1. On effectue l'extraction dans un séparateur de phases liquide-liquide avec un débit de 200 ml/mn. On sépare alors la phase organique et on évapore à sec pour obtenir 21,3 g de protéine. On remet cette dernière en suspension dans de l'eau distillée dans un rapport volumique de 1:10.
Dans le produit recueilli, on détermine l'activité IFN-p humain au moyen d'un essai basé sur la protection contre l'effet cytopathique viral (CPE). L'essai est effectué sur des plaques de micro-titrage. Dans chaque puits, on introduit 50 Cll de milieu essentiel minimum et dans le premier puits on place 25 Cll de l'échantillon, dans les puits suivants on fait des dilutions en série selon un rapport volumique de 1:3. Sur chaque plaque, on dépose des témoins de virus (stomatite vésiculaire), de cellules (lignée de fibroplastes humains
GM-2767) et d'IFN-B. Le témoin IFN-ss est utilisé à raison de 100 unités par ml. On irradie ensuite les plaques avec une lumière UV pendant 10 minutes.
Après l'irradiation, on ajoute 100 1ll de la suspension de cellules (1,2 x 105 cellules/ ml) dans chaque puits et on incube les plateaux pendant de
18 à 24 heures. Dans chaqùe puits, à l'exception du témoin de cellules, on ajoute une solution de virus à raison d'un unité formant une plaque/cellule. On incube les plateaux jusqu'à ce que le témoin de virus montre un CPE de 100%.
Ceci se produit généralement 18 à 24 heures après avoir ajouté la solution de virus. On interprète les résultats de l'essai quant à l'emplacement du puits à 50% de CPE du témoin IFN-p de référence. On détermine à partir de ce point le titre en interféron pour tous les échantillons sur la plaque. L'activité spécifique du produit recueilli est évaluée à 5 x 107U/mg.
Exemple 8
Précipitation avec un acide et purification
chromatographique
On répète le procédé de l'exemple 7, si ce n'est qu'après l'extraction et la séparation des phases aqueuse et organique et le mélange de la phase organique avec du PBS selon un
rapport volumique de 3:1, on abaisse le pH du mélange vers
5 par addition d'acide acétique glacial. On sépare le précipité résultant par centrifugation à 10 000-17000 x g pendant
15 minutes et on redissout le culot dans du SDS à 10% en poids/volume, 10 mM de DTT, 50 mM de tampon d'acétate
de sodium de pH 5,5 et on chauffe à 80 C pendant 5
minutes.
On verse ensuite la solution sur une colonne Aquapore de Brownlee RP-300, 10 I*M en utilisant un système de gradient de Beckman. Le tampon A est 0,1% d'acide trifluoroacétique (TFA) dans H2O, le tampon B est 0,1% de
TFA dans l'acétonitrile. La détection se fait par absorbance ultraviolette à 280 nm. Le solvant est programmé selon un
gradient linéaire de 0% de tampon B à 100% de tampon B
en 3 heures. On rassemble les fractions contenant les plus
fortes activités en interféron et on détermine l'activité
spécifique de la préparation d'interféron rassemblée comme
étant de 9,0 x 107 à 3,8 x 108 unités internationales/mg de
protéine, comparée à environ 2 x 108 U/mg pour IFN-ss
natif.
Exemple 9
Caractérisation biochimique de IFN-ss Serez
On détermine les compositions en acides aminés après une hydrolyse de 24 à 72 heures d'échantillons de 40 1 d'IFN dans 200 Fu1 de HC1 5,7 N et 0,1% de phénol, à
108 "C. On détermine la proline et la cystéine de la même manière après une oxydation à l'acide performique; dans ce cas, on omet le phénol pour l'hydrolyse. On analyse le tryptophane après une hydrolyse de 24 heures d'échantillons de 400 1 dans HCI 5,7 N et 10% d'acide mercaptoacétique (sans phénol). On effectue l'analyse sur un analyseur pour acides aminés Beckman 121MB en utilisant une simple colonne de résine AA10.
La composition en acides aminés calculée à partir d'hydrolyses acides représentatives de 24, 48 et 72 heures de IFN-p Set17 purifié concorde bien avec celle prédite par la séquence d'ADN des clones du gène IFN, moins la méthionine N-terminale absente.
On détermine la séquence d'acides aminés des 58 premiers résidus de la terminaison acide aminé d'IFN purifié sur un échantillon de 0,7 mg dans un Sequanator Beckman 890C avec un tampon de Quadrol 0,1 M. On détermine les acides aminés de PTH par chromatographie en phase liquide sous haute pression, en phase inversée, sur une colonne d'ultrasphères ODS Altex (4,6 x x 250 250 mm) à 45 C en éluant à 1,3 minute avec 40% de tampon A et à 8,4 minutes avec de 40 à 70% de tampon B, le tampon A étant constitué de 0,0115 M d'acétate de sodium et 5% de tétrahydrofuranne (THF), de pH 5,11, et le tampon B de 10% de THF dans l'acétonitrile.
La séquence d'acides aminés N-terminaux d'IFN-p Set17, déterminée, correspond à la séquence attendue, prédite à partir de la séquence d'ADN, si ce n'est l'absence de méthionine N-terminale.
Tel qu'indiqué ci-dessus, la préparation d'IFN-Pseri7 montre des taux d'activité spécifique très proches de, ou supérieurs à ceux d'IFN-p natif. IFN-PserI7 ne contient pas de groupes sulfhydryle libres, mais montre une liaison -S-Sentre les seules cystéines restantes en les positions 31 et 141.
La protéine ne forme pas facilement d'oligomères et semble être pratiquement sous la forme monomère. IFN-ssserl7 obtenu selon l'invention peut être formulé comme un simple produit ou comme des mélanges de diverses formes, dans des préparations pharmaceutiquement acceptables avec des milieux de véhicules non-toxiques, non-allergisants, physiologiquement acceptables, pour des utilisations cliniques et thérapeutiques dans la thérapie du cancer ou dans des conditions où une théraphie par l'interféron est indiquée, et dans le cas d'infections virales. Comme exemples de ces milieux, on citera sans que la liste en soit exhaustivé, l'eau distillée, une solution saline physiologique, une solution de
Ringer, une solution de Hank et similaires.
D'autres adjuvants de stabilisation et de solubilisation tels que le dextrose, la HSA (albumine sérique humaine) et autres peuvent être incorporés de manière optimale. Les formulations thérapeutiques peuvent être administrées par voie orale ou parentérale, tel que des administrations intraveineuses, intramusculaires, intrapéritonéales ou souscutanées. Les préparations d'IFN-p modifié de l'invention peuvent également être utilisées pour des applications topiques dans des milieux appropriés, normalement utilisés dans ces cas.
Les principaux avantages de la mutéine de IFN-ss décrite ci-dessus résultent de l'élimination d'un groupe sulfhydryle libre en position 17 dans IFN-p, forçant ainsi la protéine à former des liaisons disulfure correctes entre cys 31 et cys 141 et à assumer la conformation ostensiblement requise pour une activité biologique totale. L'activité biologique plus élevée de IFN-Pserl7 permet l'emploi de plus faibles doses dans des administrations thérapeutiques. En supprimant la cystéine en position 17 et en éliminant le groupe -SH libre, la protéine IFN-PserI7 ne forme pas de dimères, ni d'oligomères aussi facilement que l'IFN-p produit par voie microbienne.
Ceci facilite la purification de la protéine et augmente sa stabilité.
Exemple 10
La séquence de nucléotides pour un clone d'ADNc codant pour la IL-2 humaine, des modes opératoires pour préparer des registres d'ADNc de IL-2 et pour leur sélection quant à IL-2 sont décrits par Taniguchi T. et al, Nature (1983) 24, pages 305 et suivantes.
On obtient des registres d'ADNc enrichis en clones d'ADNc de IL-2, potentiels, à partir de fractions d'ARNm enrichies en IL-2 provenant de lymphocytes sanguins périphériques (PBL) et de cellules de Jurkat, par des procédés classiques. On enrichit l'ARNm quant au message
IL-2 par un fractionnement de l'ARNm et une identification de la fraction ayant une activité ARNm de IL-2 par injection des fractions dans des oocytes de Xenopus laevis et en déterminant l'activité en IL-2 des lysats d'oocytes sur des cellules HT-2 (J. Watson, J. Exp. Med. (1979) 150, pages 1570-1579 et S. Gillis et al, J. Immun. (1978) 120, pages 2027 - 2032).
Exemple 1 1
Sélection et identification de clones d'ADNc de IL-2
On sélectionne les registres d'ADNc de IL-2 en utilisant le procédé d'hybridation de colonies. On réplique chaque plaque de micro-titrage sur des papiers filtres en nitrocellulose (S & S type BA-85) (essais en double) et on laisse se développer des colonies à 37 C pendant de 14 à 16 heures sur de la gélose L contenant 50 ,ug/ml d'ampicilline. On lyse les colonies et on fixe l'ADN sur le filtre par un traitement séquentiel pendant 5 minutes avec 500 mM de NaOH, 1,5 M
NaCl, on lave deux fois pendant 5 minutes chaque fois avec la solution saline de citrate standard (SSC) 5 fois concentrée.
On sèche les filtres à l'air et on cuit à 80 "C pendant 2 heures.
On pré-hybride les filtres en double à 42 "C pendant de 6 à 8 heures avec 10 ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN (50% de formamide, SSC x 5, pH de 7,0, solution de
Denhardt x 5 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine; 1 fois = 0,2% de chacune de ces substances), 50 mM de tampon de phosphate de sodium à un pH de 7,0, 0,2% de SDS, 20 ,ug/ml de Poly U et 50 llg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé.
On prépare un modèle d'oligonucléotide 20-mère marqué à 32P d'après la séquence du gène IL-2 rapportée par
Taniguchi T. et al, voir ci-dessus. La séquence de nucléotides du modèle est GTGCCTTCTTGGGCATGTA.
On hybride les échantillons à 42 "C pendant de 24 à 36 heures avec 5 ml par filtre de tampon d'hybridation d'ADN contenant le modèle d'ADNc marqué à 32p. On lave les filtres avec 2 fois SSC x 2 et 0,1% de SDS à 50 "C pendant 30 minutes chaque fois, puis on lave avec deux fois SSC x 1, 0,1% de SDS à 50 C pendant 90 minutes chaque fois, on sèche à l'air et on autoradiographie à -70 "C pendant de 2 à 3 jours. On identifie les clones positifs et on les sélectionne de nouveau avec le modèle. On identifie de pleines longueurs de clones et on confirme en établissant une carte d'enzymes de restriction et par comparaison avec la séquence du clone d'ADNc de IL-2 rapportée par Taniguchi T. et al, ci-dessus.
Exemple 12
Clonage du gène IL-2 dans le vecteur M13
On clone le gène IL-2 dans M13mp9 tel que décrit dans l'exemple 1 en utilisant le plasmide pLWl (figure 12) contenant le gène IL-2 sous le contrôle du promoteur trp
E.Coli. Un échantillon de pLW1 est déposé dans l'American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Mary 20852 US, depuis le 4 août 1983 et a reçu le numéro
ATCC 39 405. La carte de restriction d'un clone (appelé
M13-IL2) contenant l'insert de IL-2 est reproduite sur la figure 13. On prépare un ADN de phage mono-caténaire à partir du clone M13-IL2 pour servir de copie pour la mutagénèse dirigée sur oligonucléotide.
Exemple 13
Mutagénèse dirigée sur oligonucléotide
Tel qu'indiqué précédemment, IL-2 contient des résidus cystéine sur les positions des acides aminés 58, 105 et 125. A partir de ces séquences de nucléotides des portions du gène
IL-2 qui contiennent les codons pour ces trois résidus cystéine, on construit trois oligonucléotides primaires et on les synthétise pour une mutation des codons pour ces résidus en codons pour la sérine. Ces oligonucléotides ont les séquences suivantes:
CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC (DM27)
pour changer cys 58,
CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM 28)
pour changer cys 105 et
GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM 29)
pour changer cys 125.
On traite séparément avec une kinase 40 picomoles de chaque oligonucléotide en présence de 0,1 mM d'ATP, 50 mM de Tris-HCl, de pH 8,0, 10 mM de MgCl2, 5 mM de
DTT et 9 unités de T4 kinase dans 50 1ll à 37 "C pendant 1 heure. On hybride chacun des primaires traités avec une kinase (10 pmoles), avec 2,6 ,ug d'ADN M13-IL2 monocaténaire dans 15 tel d'un mélange contenant 100 mM de NaCI, 20 mM de Tris-HCl de pH 7,9, 20 mM de MgCl2 et 20 mM de ss-mercaptoéthanol, en chauffant à 67 "C pendant 5 minutes et à 42 "C pendant 25 minutes.
On refroidit les mélanges ainsi traités sur de la glace et on ajuste à un volume final de 251l1 d'un mélange de réaction contenant 0,5 mM de chaque dNTP, 17 mM de Tris-HC1 de pH 7,9, 17 mM de
MgCl2, 83 mM de NaC1, 17 mM de p-mercaptoéthanol, 5 unités d'ADN polymérase I, fragment Klenow, 0,5 mM d'ATP et 2 unités de T4 ADN ligase, on incube à 37 "C pendant 5 heures. On termine les réactions en chauffant à 80 "C et on utilise les mélanges réactionnels pour transformer des cellules de JM103 compétentes, on dépose sur des plaques de gélose et on incube pendant une nuit pour obtenir des plaques de phages.
Exemple 14
Sélection et identification des plaques
de phages ayant subi une mutagénèse
On refroidit à 4 "C des lames contenant des plaques de Ml 3-1L2 ayant subi une mutagénèse ainsi que 2 lames contenant des plaques de phages M13-IL2 non-soumis à une mutagénèse et on transfère les plaques de phages de chaque lame sur deux filtres circulaires en nitrocellulose en déposant un filtre sec sur la plaque de gélose pendant 5 minutes pour le premier filtre et pendant 15 minutes pour le second filtre.
On place alors les filtres sur des papiers filtres épais imprégnés dans NaOH 0,2 N, NaCI 1,5 M et 0,2% de Triton pendant 5 minutes, puis on neutralise en déposant sur les filtres des papiers filtres imprégnés avec 0,5 M de Tris-HC1 de pH 7,5 et 1,5 M de NaCI pendant 5 autres minutes. On lave deux fois les filtres d'une manière analogue sur des filtres imprégnés de SCC x 2, on sèche et on cuite dans une étude à vide à 80 "C pendant 2 heures.
On pré-hybride les filtres en double à 42 "C pendant 4 heures avec 10 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN (SSC x 5, pH de 7,0, solution de Denhardt x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll et albumine sérique bovine, 1 fois = 0,02% de chacune de ces substances)), 0,1% de SDS, 50 mM d'un tampon de phosphate de sodium de pH 7,0 et 100 llg/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé. On prépare des modèles marqués à 32P en traitant par une kinase les primaires oligonucléotides avec ATP marqué. On hybride les filtres avec 0,1 x 105 cpm/ml de primaires marqués à 32P dans 5 ml par filtre d'un tampon d'hybridation d'ADN à 42 "C pendant 8 heures.
On lave deux fois les filtres à 50 "C pendant 30 minutes chaque fois dans des tampons de lavage contenant 0,1% de SDS et SSC x 2, et deux fois à 50 "C pendant 30 minutes chaque fois avec 0,1% de SDS et
SSC x 2. On sèche les filtres à l'air et autoradiographie à -70 "C pendant de 2 à 3 jours.
Etant donné qu'on a construit les oligonucléotides primaires DM28 et DM29 pour créer un nouveau site de restriction DdeI dans les clones ayant subi une mutagénèse (figure 14), on a fait digérer ADN-RF de plusieurs clones hybridés avec chacun des primaires traités par une kinase, avec l'enzyme de restriction DdeI. On recueille une des plaques M13-IL2 ayant subi une mutagénèse, hybridée avec le primaire DM28 et ayant un nouveau site de restriction
DdeI (M13-LW44) et on inocule dans une culture de JM103, on prépare un ADN monocaténaire à partir du liquide surnageant dans la culture et on prépare un ADN-RF bicaténaire à partir du culot de cellules. De la même manière, on recueille une plaque hybridée avec le primaire
DM29 (M-13-LW46) et à partir de cette plaque on prépare un ADN monocaténaire et un ADN-RF.
Le primaire oligonucléotide DM27 a été conçu pour créer un nouveau site de restriction au lieu d'un site DdeI. En conséquence, on sélectionne les plaques hybridées avec ce primaire quant à la présence d'un nouveau site PstI. On identifie une telle plaque de phages (M13-LW42) et à partir de cette plaque on prépare un ADN monocaténaire et un ADN-RF. On analyse les séquences d'ADN de ces trois clones pour confirmer que les codons cible TGT pour la cystéine ont bien été convertis en un codon TCT pour la sérine.
Exemple 15
Reclonage du gène Il - 2 ayant subi une
mutagénèse pour l'expression dans E.coli
On fait digérer séparément les ADN-RF de M13-LW42,
M13-LW-44 et M13-LW46 avec des enzymes de restriction
HindIII et BanII et on purifie les fragments d'inserts à partir d'un gel d'agarose à 1%. De la même manière, on fait digérer le plasmide pTrp3 (figure 7) avec HindIII et BanII, on purifie le grand fragment de plasmide contenant le promoteur trp sur un gel d'agarose et on le relie avec chacun des fragments d'inserts isolés à partir de M13-LW42,
M13-LW44 et M13-LW46. On transforme les plasmides liés dans une souche MM294 de E.coli K 12, compétente. On analyse les ADN plasmiques provenant de ces produits de transformation en établissant la carte des enzymes de restriction pour confirmer la présence des plasmides pLW42, pL44 et pLW46.
La figure 14 reproduit une carte de restriction de pLW46. Lorsque chacun des clones individuels est développé en l'absence de tryptophane pour induire le promoteur trp et qu'on analyse les extraits libres de cellules sur des gels de SDS-polyacrylamide, ces trois clones, pLW42, pLW44 et pLW46, s'avèrent capables de synthétiser une protéine 14,5 kd semblable à celle trouvée dans le témoin position, pLW21, qui s'est avéré capable de synthétiser une protéine 14,4 kd IL-2.
Lorsque ces mêmes extraits sont examinés quant à leur activité en I1-2 sur des cellules HT-2 de souris, seuls les clones pLW21 (témoin positif) et pLW46 montrent des quantités significatives d'activité IL-2 (Tableau
II ci-dessous), indiquant que cys 58 et cys 105 sont nécessai
res pour l'activité biologique et que leur changement en
sérines (pLW42 et pLW46 respectivement) se traduit par une
perte de l'activité biologique. Cys 125 d'autre part ne doit
pas être nécessaire pour l'activité biologique car son change
ment en ser 125 (pLW46) n'affecte pas l'activité biologique.
Tableau II
Clones Activité IL-2 (u/ml) pIL2-7 (témoin négatif) 1 pLW21 (témoin positif) 113 000 pLW42 660 pLW44 1 990 pLW46 123 000
La figure 15a reproduit la séquence de nucléotides de la chaîne codante du clone pLW46. Par comparaison avec la chaîne codante du gène IL-2 humain natif, le clone pLW46 montre un simple changement de base de G < C sur le nucléotide 374. La figure 15b reproduit la séquence d'acides aminés correspondante de la mutéine IL-2 codée par pLW46. Cette mutéine est désignée par IL-2serl25. Par comparaison avec I1-2 natif, la mutéine a une sérine au lieu d'une cystéine en position 125.
Un échantillon de la souche MM294 de E.coli K 12, transformé avec pLW46 est déposé dans l'American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, US depuis le 26 septembre 1983 et a reçu le numéro ATCC 39452.
Les mutéines de IL-2 dans lesquelles la cystéine en position 125 a été supprimée ou remplacée par un autre acide aminé, telles que la mutéine Il-2serl25, conservent l'activité I1-2. Elles peuvent donc être formulées et utilisées de la même manière que IL-2 natif. En conséquence, des mutéines IL-2 sont utilisables dans le diagnostic et le traitement des infections bactériennes, virales, parasitaires, protozoaires et fongiques; dans des manifestations de lymphokine ou d'immuno-déficience; pour la reconstitution de fonctions immunes normales chez les êtres humains et les animaux agés; dans le développement de dosages diagnostiques tels que ceux utilisés dans l'amplification des enzymes, le radiomarquage, la radiovisualisation et d'autres procédés connus dans la technique de surveillance des taux de IL-2 chez un malade;
pour la promotion du développement des cellules T in vitro dans des buts thérapeutiques et de diagnostic pour le blocage des sites récepteurs pour les lymphokines; et dans diverses autres applications thérapeutiques, de diagnostic et de recherche. Les diverses applications thérapeutiques et de diagnostic de IL-2 humain ont été étudiées et rapportées par S.A. Rosenberg, E.A. Grimm et al, A. Mazumder et al, et E.A. Grimm et S.A. Rosenberg.
Les mutéines de IL-2 peuvent être utilisées par elles-mêmes ou en association avec d'autres cellules B ou T immunologiquement applicables ou d'autres agents thérapeutiques. Pour des applications thérapeutiques ou de diagnostic, elles peuvent être formulées dans des milieux de véhicules nontoxiques, non-allergisants, physiologiquement acceptables, tels que l'eau distillée, une solution de Ringer, une solution de Hank, une solution saline physiologique et autres. Les administrations des mutéines IL-2 à des hommes ou à des animaux peuvent se faire par voie orale ou intrapéritonéale, intramusculaire ou souscutanée, selon l'avis du médecin.
Comme exemples de cellules applicables, on citera les cellules B ou T, les cellules tueuses naturelles et autres, et comme réactifs thérapeutiques utilisables en association avec les polypeptides de l'invention, on citera à titre d'exemples les divers interférons, en particulier le gamma interféron, le facteur de croissance des cellules B, IL-1 et autres.
DESCRIPTION
The invention is in the general field of recombinant DNA technology. More specifically, it relates to biologically active proteins, modified by mutation, which differ from their parent analogs by one or more substitutions / deletions of cysteine residue.
Biologically active proteins which are produced microbially using recombinant DNA technology (rDNA), may contain cysteine residues which are not essential for their activity, but are free to form undesirable intermolecular or intramolecular bonds.
One such protein is microbial human beta-interferon (IFN-ss). During the preparation of IFN-ss by techniques with rDNA, the formation of dimers and oligomers of microbially produced IFN-ss was observed in extracts of E. coli containing high IFN-B concentrations. This formation of multimers makes the purification and separation of IFN-ss very laborious and time consuming and requires several other operations in the purification and isolation processes, such as the reduction of the protein during the purification and the re-oxidation. to restore it to its original conformation, thereby increasing the possibility of incorrect disulfide bond formation.
In addition, microbially produced IFN-ss has also been found to exhibit consistently low specific activity, possibly due to the formation of disordered intramolecular disulfide multimers or bridges. It would therefore be desirable to be able to modify biologically active proteins produced microbially, such as IFN-ss, in a manner which does not affect their activity, but which reduces or eliminates their ability to form intermolecular crosslinks or intramolecular bonds that force the protein to adopt an undesirable tertiary structure (for example, a conformation that decreases the activity of the protein).
The object of the invention is to produce by mutagenesis techniques biologically active proteins, modified by mutation (these proteins are called mutéi nes, Glossary of Genetics and Cytogenetics, 4th edition, p. 381, Springer-Verlag (1976)) , which retain the activity of their parent analogs, but are no longer able to form intermolecular or undesirable intramolecular disulfide bonds. In this regard, Shepard
H.
M., et al, Nature (1981) 294, 563-563, describes an IFN-p mutein in which cysteine at position 141 of its amino acid sequence (there are three cysteines in IFN-ss native human in positions 17, 31 and 141, Gene (1980) 10, 11-15 and Nature (1980) 285, 542 - 547) is replaced by tyrosine. This mutein was obtained by bacterial expression of a hybrid gene constructed from a partial IFN-p cDNA clone having a G e A transition on nucleotide 485 of the IFN-p gene. The mutein lacked the biological activity of native IFN-p, which allowed the authors to conclude that the replaced cysteine was essential for activity.
Site-directed mutagenesis techniques are well known and have been reviewed by Lather R. F. and Lecoq J. P. in Genetic
Engineering, Academic Press (1983), pages 31 - 50. Mutagenesis directed on oligonucleotide has been the subject of a specific review by Smith M. and Gillam S. in Genetic
Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981), 3,1-32.
The invention provides synthetic structural genes having DNA sequences, specifically designed (constructed genes) to code for the synthetic muteins of a biologically active protein having at least one cysteine residue, capable of forming a disulfide bond and which does not is not essential for biological activity, the mutein having at least one of the cysteine residues replaced by another amino acid and, in the case of interferon-p, deleted or replaced by another amino acid. The invention also provides expression vectors which include such structural constructed genes at a position which allows expression.
The invention also provides a process for the production of the synthetic structural gene, described above, by site-directed mutagenesis on an oligonucleotide, which process is characterized in that it comprises the following operations:
(a) hybridization of a mono-catenary DNA comprising a chain of a structural gene which codes for the parent protein, with a mutant oligonucleotide primer which is complementary to a region of the chain which comprises the codon for cysteine to delete or replace or the nonsense triplet paired with the codon, as the case may be, except for a bad match with the codon or the nonsense triplet, as the case may be, which defines a deletion of the codon or triplet which codes for the other amino acid, or, if it is interferon-B, which defines suppression of the codon or a triplet which codes for the other amino acid;
;
(b) lengthening the primer with DNA polymerase to form a mutation heteroduplex;
(c) replication of the mutation heteroduplex; and
(d) isolating the progeny from the mutant chain of the heteroduplex, isolating DNA from said progeny, and isolating the gene from DNA from the progeny.
Another aspect of the invention is the mutant oligonucleotide primers used in this process.
The accompanying drawings show:
Figure 1 is a diagram of the amino acid sequence of IFN-p;
FIG. 2, a diagram illustrating the preparation of a mutant IFN-ss gene by site-directed mutagenesis on an oligonucleotide;
FIG. 3, a diagram of a ppltrp plasmid comprising the IFN-P gene;
Figure 4, a diagram of the cloning of the vector phage
M13mp8;
FIG. 5, the restriction map of the clone M 13-p 1;
FIG. 6, the gel image of the mutant IFN-Pserl7 gene, showing a single base change in the coding region;
FIG. 7, a diagram of the expression plasmid pTrp3;
FIG. 8a, the HinfI restriction mode of the clone pSY2501 and FIG. 8b, the two fragments resulting 169bp and 28bp;
FIG. 9, a restriction map of the clone pSY2501;
;
FIG. 10, the DNA sequence coding for the mutein IFN-PserI7 with the corresponding amino acid sequence;
FIG. 11, the single band of the protein at 18,000 daltons corresponding to IFN-ssser, 7 in the extracts from clones pSY2501 and pBltrp;
FIG. 12, a diagram of the plasmid pLW1 which contains the human interleukin-2 (IL-2) gene, under the control of the promoter E.Coli trp;
FIG. 13, a restriction map of the phage clone M13-IL2;
Figure 14, a restriction map of plasmid pLW46;
Figures 15a and 15b, the nucleotide sequence of the coding chain of the clone pLW46 and the corresponding amino acid sequence of the mutein IL-2 called IL-2serl2s.
The invention relates to biologically active protein muteins in which cysteine residues which are not essential for biological activity have been deliberately replaced by other amino acids to eliminate sites of intermolecular crosslinking or incorrect binding formation. intramolecular disulfide; mutant genes encoding these muteins; and methods for producing these muteins.
Proteins which can be modified by mutation according to the invention can be identified on the basis of information concerning the cysteine content of the biologically active proteins and the roles played by the cysteine residues with regard to activity and to the tertiary structure. In the case of proteins for which there is no such information in the literature, this information can be obtained by systematically modifying each cysteine residue of the protein by the procedures described here and by determining the biological activity of the resulting muteins and their tendency to form undesirable intermolecular or intramolecular disulfide bonds.
Consequently, although the invention is specifically described and illustrated by the examples below concerning muteins of IFNp and of IL-2, it is obvious that the following teachings also apply to any other biologically active protein which contains a functionally nonessential cysteine residue which makes the protein capable of forming an undesirable disulfide bond. As examples of proteins other than IFN-p and IL-2 which can undergo a modification by mutation according to the invention, mention will be made of lymphotoxin (tumor necrosis factor) and factor-1 stimulating the colonies, and IFN-al. These proteins normally have an odd number of cysteine residues.
In the case of IFN-p, it has been reported in the literature that glycosylated and non-glycosylated IFNs show qualitatively similar specific activities and that consequently the glycosyl parts are not involved in and do not contribute to the activity biological of IFN-ss. But the IFN-p produced by the bacterial route, which does not contain glycosyl units, constantly shows a specific activity quantitatively lower than that of IFN- which is glycosylated. IFN-p is known to have three cysteine residues in positions 17, 31 and 141. Shepard et al, above, have demonstrated that cysteine 141 is essential for biological activity.
In IFN-p, which contains four cysteine residues, there are two -S-S-intramolecular bonds; one between cys 29 and cys 138 and the other between cys 1 and cys 98. From the homology between IFN-p and IFN-a, cys 141 of IFN-p could be involved in a -SS bond -intramolecular with cys 31, leaving cys 17 capable of forming intermolecular crosslinks. By removing cys 17 or replacing it with another amino acid, we can then determine if cys 17 is essential for biological activity and what is its role in the formation of -SS- linkage.
If cys 17 is not essential for the biological activity of the protein, the protein without cys 17 or in which cys 17 has been replaced, resulting, could show a specific activity close to that of native IFN-p and this could also facilitate the isolation and purification of the protein.
Using the oligonucleotide-directed mutagenesis method, with a primary synthetic oligonucleotide complementary to the region of the IFN-p gene at the codon for cys 17, but which contains single or multiple basic modifications in this codon, it is possible to produce a gene constructed by replacing cys 17 with another chosen amino acid. When deletion is desired, the primary oligonucleotide does not have a codon for cys 17. The conversion of cys 17 to neutral amino acids such as glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine, tyrosine , phenylalanine, histidine, tryptophan, serine, threonine and methionine is the preferred approach. Serine and threonine are the particularly preferred replacement amino acids because of their chemical analogy to cysteine.
When cysteine is deleted, the mature mutein is shorter by an amino acid than the native parent protein or microbially produced IFN-p.
Human IL-2 is known to have three cysteine residues at positions 58, 105 and 125 of the protein.
As in the case of IFN-p, IL-2 is in an aggregated oligomeric form after isolation from bacterial cells and must be reduced by reducing agents to obtain a good yield from the bacterial extracts. In addition, the reduced, purified IL-2 protein is unstable and easily re-oxidizes on storage to an inactive oligomeric form. The presence of these three cysteines means that by reoxidation the protein can randomly form one of the three possible intramolecular disulfide bridges, only one of them being the correct bridge found in the native molecule.
Since the disulfide structure of the native IL-2 protein is not known, it is possible to use the invention to create mutations at codons 58, 105 and 125 of the IL-2 gene and to identify the cysteine residues which are necessary for the activity, and therefore most likely to be involved in the formation of the native disulfide bridge. Likewise, the cysteine residue which is not necessary for the activity can be modified so as to avoid the formation of incorrect intramolecular disulfide bridges and minimize the risk of intermolecular disulfide bridges by eliminating or replacing the free cysteine residue. .
The size of the oligonucleotide primer is determined by the need for stable hybridization of the primer in the region of the gene where the mutation is to be induced and by the limitations of the methods currently available for synthesizing oligonucleotides. The factors to be considered in the constitution of oligonucleotides usable in the mutagenesis directed on an oligonucleotide (for example overall dimension, dimensions of the portions adjacent to the mutation site) are described by Smith M. and Gillam S., above.
In general, the total length of the oligonucleotide must make it possible to optimize a single, stable hybridization at the mutation site, the 5 'and 3' extensions from the mutation site having a dimension sufficient to prevent the mutation from either directed by the DNA polymerase exonuclease activity. The oligonucleotides used for mutagenesis according to the invention normally contain approximately from 12 to 24 bases, preferably approximately from 14 to 20 bases and advantageously approximately from 15 to 18 bases. They normally contain at least about three bases 3 'of the modified or missing codon.
The process for preparing the modified IFN-p gene generally involves the induction of site-specific mutagenesis in the IFN-p gene at codon 17 (TGT) using a synthetic oligonucleotide primer which omits the codon or modifies it so that it codes for another amino acid. When threonine replaces cysteine and the primer is hybridized with the nonsens chain of the IFN-p gene, the preferred nucleotide primer is
GCAATTTTCACTCAG (the underlined part represents the modified codon). When it is desirable to remove cysteine, the preferred primer is
AGCAATTTTCAGCAGAAGCTCCTG which omits the TGT codon for cys. When the cysteine is replaced by the serine, a primer with 17 nucleotides is preferably chosen,
GCAATTTTCAGAGTCAG, which includes an AGT codon for serine.
The transition T eA from the first base in codon 17 cys results in the replacement of cysteine by serine. It should be recognized that when deletions are introduced, the proper reading system for the DNA sequence must be maintained for expression of the desired protein.
The primer is hybridized with a mono-catenary phage such as M13, fd or OX174 in which a chain of the IFN-p gene has been cloned. It should be noted that the phage can carry the meaning chain or the nonsense gene chain. When the phage carries the nonsense chain, the primer is identical to the region of the chain which has a sense, which contains the codon to be mutated, if not a bad match with this codon, which defines a suppression of the codon or a triplet that codes for another amino acid. When the phage carries the chain which has a direction, the primer is complementary to the region of the chain which has a direction, which contains the codon which must be mutated, if it is not a bad suitable match in the triplet which is paired with the codon to be deleted.
The conditions usable in hybridization are described by
Smith M. and Gillam S., above. The temperature is normally between 0 and 70 ° C., preferably between 10 and 50 ° C. After the hybridization, the primer is extended on the phage DNA by reaction with DNA polymerase I, the
T4 DNA polymerase, reverse transcriptase or others
Appropriate DNA polymerases. The resulting double-stranded DNA is converted into closed circular double-stranded DNA by treatment with DNA ligase such as T4 DNA ligase.
DNA molecules containing mono-catenary regions can be destroyed by treatment with S1 endonuclease.
Mutagenesis directed on an oligonucleotide can also be used to produce a mutant IL-2 gene which codes for a mutein having an IL-2 activity, but whose cys 125 is changed to serine 125. The oligonucleotide primer used in the production of this mutant IL-2 gene when the phage carries the chain which has a direction of the gene, is
GATGATGCTTCTGAGAAAAGGTAATC.
This oligonucleotide has a change C -, G on the central base on the triplet which is paired with codon 125 of the IL-2 gene.
The resulting mutation heteroduplex is then used to transform a competent organism or host cell. The replication of the heteroduplex by the host provides descendants from the two chains. After replication, the mutant gene can be isolated from the descendants of the mutant chain, inserted into an appropriate expression vector, and then the vector used to transform an appropriate host organism or cell. Suitable vectors include plasmids pBR322, pCR1 and their variants, synthetic vectors and the like.
Suitable host organisms are E.coli, Pseudomonas, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, different strains of yeast, Bacillus thermophilus, animal cells such as mouse, rat or Chinese hamster ovary (CHO) cells, plant cells, animal and plant hosts and the like. It should be noted that when a chosen host is transformed with the vector, appropriate promoter-operator sequences are also introduced so as to express the mutein. Hosts can be prokaryotic or eukaryotic (methods for inserting DNA into eukaryotic cells are described in PCT applications, Nos. US81 / 00239 and US81 / 00240, published September 3, 1981).
Preferred hosts are E.coli and CHO cells. The muteins obtained according to the invention can be glycosylated or non-glycosylated, depending on the glycosylation occurring in the native parent protein and the host organism used to produce the mutein. If this proves desirable, a non-glycosylated mutein obtained when the host organism is E.coli or a Bacillus. may optionally be glycosylated in vitro chemically, enzymatically or by other types of modifications known in the art.
In the preferred embodiment of the invention relating to IFN-p, the cysteine residue at position 17 in the amino acid sequence of IFN-p, as represented in FIG. 1 of the accompanying drawings, is changed to serine by a transition T <A of the first base of the codon 17 of the chain which has a sense of the DNA sequence which codes for mature IFN-ss. Site specific mutagenesis is induced using a 17 nucleotide primer GCAATTTTCA
GAGTCAG, identical to the sequence of 17 nucleotides of the chain which has a sense of IFN-p in the region of codon 17, except a bad assortment of a simple base on the first base of codon 17.
The wrong assortment is on nucleotide 12 in the primer. It should be noted that the genetic code is degenerate and that many amino acids can be encoded by more than one codon. The basic code for serine, for example, is degenerated in 6 ways, and therefore the codons TCT, TCG, TCC, TCA, AGT and ACG all code for serine. The AGT codon was chosen for convenience for the preferred embodiment. Likewise, threonine is encoded by any of the ACT codons,
ACA, ACC and ACG. It is understood that when a codon is specified for a particular amino acid, it includes all of the degenerate codons which code for that amino acid.
Merl7 is hybridized with DNA from a single-catenary phage M13 which carries the nonsense chain of the IFN-p gene. The primary oligonucleotide is then extended on the DNA by means of a Klenow fragment of DNA polymerase I and the resulting double-stranded DNA is converted into closed circular DNA with the T4 ligase. A replica of the resulting mutation heteroduplex yields clones from the DNA chain containing the wrong assortment. Mutant clones can be identified and selected by the appearance or disappearance of specific restriction sites, resistance or sensitivity to antibiotics or by other methods known in the art.
When cysteine is replaced by serine, the transition T e A, represented in FIG. 2 of the appended drawings, results in the creation of a new restriction site HinfI in the structural gene. The mutant clone is identified using the primary oligonucleotide as a model in hybridization selection of mutated phage plaques. The primary has only one poor assortment when it is hybridized with the parent, but shows a perfect assortment when it is hybridized with the DNA of the mutated phage, as shown in FIG. 2. The hybridization conditions can then be chosen so that the primary oligonucleotide hybridizes preferably with the mutated DNA, but not with the parent DNA.
The new site generated HinfI also serves as a means of confirming the simple basic mutation in the IFN-P gene.
The phage M13 DNA carrying the mutated gene is isolated and attached to an appropriate expression vector such as the plasmid pTrp3, and the E. coli strain MM294 is transformed with the vector. Developmental media suitable for the cultivation of transformation products and their progeny are known to those skilled in the art. The expressed IFN-p mutein is isolated, purified and characterized.
The following nonlimiting examples are given by way of illustration of the invention. Examples 1 to 9 describe the preparation of an IFN-p mutein. Examples 10 to 15 describe the preparation of an IL-2 mutein.
Example 1
Cloning of the IFN-p gene in the vector M13
The use of the phage vector M13 as a source of single-catenary DNA copy has been demonstrated by G. F.
Temple et al, Nature (1982) 296, pages 537-540. The plasmid ppltrp (FIG. 3) containing the IFN-ss gene is digested under the control of the E.coli trp promoter, with the restriction enzymes HindIII and XhoII. The replicated form (RF) M13mp8 DNA is digested (Figure 4) (J. Messing, Third
Cleveland Symposium on Macromolecules: Recombinant
DNA, Ed. A. Walton, Elsevier Press, 143-153 (1981) with the restriction enzymes HindIII and BamHI, and mixed with pssltrp DNA which was previously digested with
HindIII and XhoII. The mixture is linked with the T4 DNA ligase and the linked DNA is transformed into competent cells of
E. coli strain JM 103 and applied to Xgal indicator plates (J.
Messing et al, Nucleic Acids Res. (1981) 9, pages 309-321). The plates containing the recombinant phage (white plates) are collected, inoculated in a fresh culture of JM 103 and from the infected cells, mini-preparations of RF molecules are obtained (HD Birnboim and J. Doly, Nucleic Acid Res (1979 ) 7, 1513 - 1523). The RF molecules are digested with different restriction enzymes to identify the clones containing the IFN ss insert. The restriction map of such a clone (M13-B1) is reproduced in Figure 5 of the accompanying drawings. The mono-catenary DNA from the phage is prepared from the clone M 13-p 1 to serve as a copy for site-specific mutagenesis using a synthetic oligonucleotide.
Example 2
Site specific mutagenesis
40 picomoles of the synthetic oligonucleotide are processed
GCAATTTTCAGAGTCAG (primary) with T4 kinase in the presence of 0.1 mM adenosine triphosphate (ATP), 50 mM hydroxymethylaminomethane hydrochloride (Tris-HCl) pH 8.0, 10 mM MgC12, 5 mM dithiothreitol (DTT) and 9 units of T4 kinase, in 50 Cll at 37 "C for 1 hour.
The primary treated with kinase (12 pmol) is hybridized with 5 g of mono-catenary Ml3-p1 DNA in 50 μl of a mixture containing 50 mM NaCl, 10 mM Tris-GC1 of pH 8.0 , 10 mM
MgCl2 and 10 mM p-mercaptoethanol, heating to 67 "C for 5 minutes and to 42" C for 25 minutes.
The mixture thus treated is cooled on ice and 50 cl of a reaction mixture containing 0.5 mM of each of the deoxynucleoside triphosphates (dNTP), 80 mM of Tris-HCl of pH 7.4, 8 mM of MgCl 2 are added. , 100 mM NaCl, 9 units of DNA polymerase I, Klenow fragment, 0.5 mM of ATP and 2 units of T4 DNA ligase, incubated at 37 "C for 3 hours and at 25" C for 2 hours. The reaction is then terminated by extraction with phenol and precipitation with ethanol.
The DNA is dissolved in 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), 50% sucrose and 0.05% bromophenol blue and subjected to electrophoresis on 0.8% agarose gel in the presence of 2, ug / ml of ethidium bromide. The DNA bands corresponding to the RF forms of M13-p1 are eluted from gel sections by the perchlorate method (R.W. Davis et al, Advanced
Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.
pages 178-179 (1980)). The eluted DNA is used to transform competent cells of JM 103, allowed to develop overnight and the single-stranded DNA is isolated from the culture supernatant. We use this mono-catenary DNA as a copy in a second cycle of extension of the primary, we transform the RF forms, purified on gel, of DNA in competent cells JM 103, we deposit on agar plates and we incubate overnight to get phage plates.
Example 3
Site specific mutagenesis
The experiment of example 2 is repeated above, except that a synthetic oligonucleotide is used as the primary.
GCAATTTTCAGACTCAG to change the codon 17 of the IFN-p gene from a codon which codes for cysteine to arrive at a codon which codes for threonine.
Example 4
Removal of the specificity of a site
The experiment of example 2 is repeated above, except that the primary synthetic oligonucleotide used is AGCAATTT'I'CAGCAGAAGCTCCTG to suppress codon 17 of the IFN-p gene.
Example 5
Selection and identification of plates
obtained by mutagenesis
Slides are cooled to 4 "C containing plates of mutated M13-ssl (Example 1) as well as two slides containing non-mutated phage M13-pl plates and plates from each slide are transferred to two rounds of filter paper nitrocellulose by placing a dry filter on the agar slide for 5 minutes for the first filter and 15 minutes for the second filter. The filters are then placed on thick filter papers soaked in 0.2 N NaOH, 1.5 M NaCl and 0.2% Triton X-100 for 5 minutes, then neutralized by covering with filter papers impregnated with 0.5 M of
Tris-HCl pH 7.5 and 1.5 M NaC1 for another 5 minutes.
The filters are washed twice in the same way on filters impregnated in SSC x 2 (standard citrate saline solution, dried and cooked in a vacuum oven at 80 "C for 2 hours. The filters are pre-hybridized double at 55 "C for 4 hours with 10 ml per filter of a DNA hybridization buffer (SSC x 5) of pH 7.0, a solution of
Denhardt x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll and bovine serum albumin, 1 time = 0.02% of each of the substances), 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7, 0 and 100 µL / ml DNA from denatured salmon sperm. A model labeled with 2P is prepared by treating the primary oligonucleotide with kinase with ATP labeled with 32p.
The filters are hybridized with 3.5 x 105 cpm / ml of 32 P labeled primer in 5 ml by filter of DNA hybridization buffer at 55 "C for 24 hours. The filters are washed at 55" C for 30 minutes each in wash buffers containing 0.1% SDS and decreasing amounts of SSC. The filters are initially washed with a buffer containing SSC x 2 and the control filters containing plaques of non-mutated M13-p1 are examined for the presence of any radioactivity, using a Geiger counter. The SSC concentration is gradually lowered and the filters are washed until all detectable radioactivity on the control filters has disappeared with plates of non-mutated M13-p1.
The lowest SSC concentration used is SSC> <x 0.1. 0.1. The filters are air dried and subjected to autoradiography at -70 "C for 2 to 3 days. With the kinase-treated oligonucleotide model, 480 plates of mutated M13-ssl and 100 plates are selected. Control of non-mutated M13-p1 None of the control plates hybridizes with the model, whereas 5 plates of mutated M13-p1 hybridize with the model.
One of the 5 plates of mutated M13-p1 (M13 SY2501) is collected and inoculated into a culture of JM 103. A single-catenary DNA is prepared from the supernatant and a double-stranded DNA from the cell pellet. Single-stranded DNA is used as a copy for the dideoxy sequence of the clone with the universal primary M 13. The result of the analysis of the sequence is reproduced in FIG. 6, confirming that the codon cys TGT has indeed been converted into a codon ser AGT.
Example 6
Expression of mutated IFN-p in E. coli
The RF DNA of M13-SY2501 is digested with the restriction enzymes HindIII and XhoII and the insert fragment 520 bp is purified on a 1% agarose gel. The plasmid pTrp3 containing the trp E.coli promoter (FIG. 7) is digested with the enzymes HindIII and BamHI, mixed with the purified DNA fragment M13-SY2501 and linked in the presence of T4 DNA ligase. The ligated DNA is transformed into a strain MM294 of E. coli. Ampicillin-resistant transformation products are selected for their sensitivity to the drug tetracycline. Plasmid DNA from 5 ampicillin-resistant clones sensitive to tetracycline is digested with HinfI to determine the presence of the insert M13-SY2501.
FIG. 8a reproduces the Hindi restriction mode of one of the clones (pSY2501), comparing it to the Hinfl restriction mode of the original IFN-p clone, ppltrp. As expected, an additional HindI site is observed in pSY2501, cutting the internal 197 bp IFN-B fragment into a 169 bp fragment and a 28 bp fragment (FIG. 8b). A restriction map of the clone pSY2501 is reproduced in FIG. 9.
The full DNA sequence of the mutant IFN-p gene is shown in Figure 10 with the expected amino acid sequence.
The plasmid designated as the clone pSY2501 is deposited with the Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Fermentation Laboratory, Northern Regional
Research Center, Science and Education Administration,
U.S. Department of Agriculture, 1815 North University
Street, Peoria, Illinois 60604 and received registration numbers CMCC # 1533 and NRRL # B-15356.
Cultures of pSY2501 and ppltrp, which include their progeny, are continued to an optical density (OD600) of 1.0. Cell-free extracts are prepared and the antiviral activity of IFN-p on cells of
GM2767 in a micro-titration. The extracts of the clone pSY2501 show an activity of 3 to 10 times higher than that of ppltrp (Table I), indicating that the clone pSY2501 synthesized more protein showing an IFN-p activity or that the protein obtained has a higher specific activity.
Table I
Extract Antiviral activity (U / ml) pSY2501 6x105 ppltrp 1 1x10 'x 105 î0 ptrp3 (control) 30
To determine whether the clone pSY2501 has synthesized a more active protein several times, the extracts of the two clones are subjected to electrophoresis on an SDS polyacrylamide gel with a control extract and the gel is stained with Coomassie blue to visualize the proteins. As shown in FIG. 11, only a single protein band is observed, corresponding to a protein apparent at 18,000 daltons, present in the extracts of the clones pSY2501 and ppltrp, but not in the control extract ptrp3.
This protein which has a molecular mass of approximately 20,000 daltons, but shows a mode of migration on gel of a protein of 18,000 daltons, has previously been shown to be IFN-p by purification of this protein from extracts of pPltrp.
As there is a lesser amount of this protein in the extracts of pSY2501 than in the extracts of ppltrp, the specific activity of the protein in extracts of the clone pSY2501 is greater than that of the clone ppltrp.
Example 7
Purification of IFN-ssserl7
IFN-Pseri7 is collected from E. coli which has been transformed to produce IFN-PserI7. E.coli is cultivated in the following culture medium at an OD of 10-11 at 680 nm (dry weight 8.4 g.l).
Ingredient Concentration NH4Cl 20 mM
K2SO4 16.1 mM
KH2PO4 7.8 mM
Na2HPO4 12.2mM MgSO4 7H20 3 mM
Trisodium citrate, di-hydrated 1.5 mM
MnSO4 4H20 30 pM ZnSO4 7H2O 30 pM
CuSO4 5H20 3 I1M
L-tryptophan 70 mg / l
FeSO4 7HO 72 I1M
Thiamine HCl 20 mg / l
Glucose 40 g / l
PH adjustment with NH40H
Cooled to 20 "C 9.9 liters (0.9 kg) of transformed E. coli culture and concentrated by passing the culture through a cross flow filter under an average pressure drop of about 110 kPa and a constant filtrate flow rate of 260 ml / min until
filtrate weighs 8.8 kg. The concentrated product (about one liter) is poured into a tank and cooled to 15 C. The cells are broken up in the concentrated product by passing it through a homogenizer of
Manton-Gaulin at 5 "C, approximately 69,000 kPa. The homogenizer is washed with one liter of phosphate-buffered saline, pH 7.4 (PBS) and the wash water is added to the broken cell product to a final volume of 2 liters is obtained. This volume is centrifuged continuously at 12,000> <x g at a flow rate of 50 ml / min. The solid is separated from the supernatant and resuspended in 4 liters of PBS containing 2% by weight of SDS. This suspension is stirred at room temperature for 15 minutes, after which there is no longer any visible material in suspension.
The solution is then extracted with 2-butanol in a volume ratio of 2-butanol / solution of 1: 1. The extraction is carried out in a liquid-liquid phase separator with a flow rate of 200 ml / min. The organic phase is then separated and evaporated to dryness to obtain 21.3 g of protein. The latter is resuspended in distilled water in a volume ratio of 1:10.
In the product collected, the human IFN-p activity is determined by means of a test based on protection against the viral cytopathic effect (CPE). The test is carried out on micro-titration plates. In each well, 50 Cll of minimum essential medium are introduced and in the first well 25 Cll of the sample are placed, in the following wells serial dilutions are made at a volume ratio of 1: 3. On each plate, witnesses of virus (vesicular stomatitis), of cells (line of human fibroplasts are placed
GM-2767) and IFN-B. The IFN-ss control is used at the rate of 100 units per ml. The plates are then irradiated with UV light for 10 minutes.
After irradiation, 100 µl of the cell suspension (1.2 x 105 cells / ml) is added to each well and the trays are incubated for
18 to 24 hours. In each well, with the exception of the cell control, a virus solution is added at the rate of one unit forming a plate / cell. The trays are incubated until the virus control shows a 100% CPE.
This usually happens 18 to 24 hours after adding the virus solution. The results of the test are interpreted as to the location of the well at 50% CPE of the reference IFN-p control. From this point, the interferon titer is determined for all the samples on the plate. The specific activity of the product collected is evaluated at 5 × 10 7U / mg.
Example 8
Acid precipitation and purification
chromatographic
The process of Example 7 is repeated, except that after the extraction and separation of the aqueous and organic phases and the mixing of the organic phase with PBS according to a
volume ratio of 3: 1, the pH of the mixture is lowered to
5 by addition of glacial acetic acid. The resulting precipitate is separated by centrifugation at 10,000-17,000 x g for
15 minutes and the pellet is redissolved in 10% w / v SDS, 10 mM DTT, 50 mM acetate buffer
sodium pH 5.5 and heated to 80 C for 5
minutes.
The solution is then poured onto a 10 µm Brownlee RP-300 Aquapore column using a Beckman gradient system. Buffer A is 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in H2O, buffer B is 0.1% of
TFA in acetonitrile. Detection is made by ultraviolet absorbance at 280 nm. The solvent is programmed according to a
linear gradient from 0% buffer B to 100% buffer B
in 3 hours. We gather the fractions containing the most
strong interferon activities and activity is determined
specific of the interferon preparation put together as
being from 9.0 x 107 to 3.8 x 108 international units / mg of
protein, compared to about 2 x 108 U / mg for IFN-ss
native.
Example 9
Biochemical characterization of IFN-ss Serez
Amino acid compositions are determined after 24 to 72 hours hydrolysis of samples of 40 l of IFN in 200 Fu1 of 5.7 N HCl and 0.1% phenol, to
108 "C. Proline and cysteine are determined in the same way after oxidation with performic acid; in this case, phenol is omitted for hydrolysis. Tryptophan is analyzed after 24-hour hydrolysis of samples 400 l in 5.7 N HCI and 10% mercaptoacetic acid (without phenol) The analysis is carried out on a Beckman 121MB amino acid analyzer using a simple column of AA10 resin.
The amino acid composition calculated from acid hydrolyses representative of 24, 48 and 72 hours of purified IFN-p Set17 agrees well with that predicted by the DNA sequence of the clones of the IFN gene, minus the N-terminal methionine absent .
The amino acid sequence of the first 58 residues of the amino acid terminus of purified IFN is determined on a 0.7 mg sample in a Beckman 890C Sequanator with a 0.1M Quadrol buffer. The amino acids of PTH by liquid phase chromatography under high pressure, in reverse phase, on a column of ODS Altex ultrasounds (4.6 xx 250 250 mm) at 45 C eluting at 1.3 minutes with 40% buffer A and at 8 , 4 minutes with 40 to 70% of buffer B, buffer A consisting of 0.0115 M of sodium acetate and 5% of tetrahydrofuran (THF), pH 5.11, and buffer B of 10% of THF in acetonitrile.
The determined N-terminal amino acid sequence of IFN-p Set17 corresponds to the expected sequence predicted from the DNA sequence, except for the absence of N-terminal methionine.
As indicated above, the preparation of IFN-Pseri7 shows specific activity rates very close to, or higher than, those of native IFN-p. IFN-PserI7 does not contain free sulfhydryl groups, but shows an -S-Sentre bond between the only remaining cysteines at positions 31 and 141.
The protein does not readily form oligomers and appears to be practically in the monomeric form. IFN-ssserl7 obtained according to the invention can be formulated as a simple product or as mixtures of various forms, in pharmaceutically acceptable preparations with non-toxic, non-allergenic, physiologically acceptable vehicle media, for clinical and therapeutic uses in cancer therapy or in conditions where interferon therapy is indicated, and in the case of viral infections. As examples of these environments, we will cite without the list being exhaustive, distilled water, physiological saline solution,
Ringer, a solution by Hank and the like.
Other stabilization and solubilization adjuvants such as dextrose, HSA (human serum albumin) and the like can be optimally incorporated. The therapeutic formulations can be administered orally or parenterally, such as intravenous, intramuscular, intraperitoneal or subcutaneous administrations. The modified IFN-p preparations of the invention can also be used for topical applications in suitable media, normally used in these cases.
The main advantages of the mutein of IFN-ss described above result from the elimination of a free sulfhydryl group at position 17 in IFN-p, thus forcing the protein to form correct disulfide bonds between cys 31 and cys 141 and to assume the conspicuous conformation required for total biological activity. The higher biological activity of IFN-Pserl7 allows the use of lower doses in therapeutic administrations. By removing cysteine at position 17 and eliminating the free -SH group, the IFN-PserI7 protein does not form dimers or oligomers as easily as microbially produced IFN-p.
This facilitates the purification of the protein and increases its stability.
Example 10
The nucleotide sequence for a cDNA clone encoding human IL-2, procedures for preparing IL-2 cDNA registers and for their selection for IL-2 are described by Taniguchi T. et al, Nature (1983) 24, pages 305 et seq.
CDNA registers enriched with potential IL-2 cDNA clones are obtained from IL-2 enriched mRNA fractions from peripheral blood lymphocytes (PBL) and Jurkat cells, by conventional methods . We enrich the mRNA with regard to the message
IL-2 by fractionating the mRNA and identifying the fraction having IL-2 mRNA activity by injecting the fractions into Xenopus laevis oocytes and by determining the IL-2 activity of the oocyte lysates on HT-2 cells (J. Watson, J. Exp. Med. (1979) 150, pages 1570-1579 and S. Gillis et al, J. Immun. (1978) 120, pages 2027-2032).
Example 1 1
Selection and identification of IL-2 cDNA clones
IL-2 cDNA registers are selected using the colony hybridization method. Each micro-titration plate is replicated on nitrocellulose filter papers (S & S type BA-85) (duplicate tests) and colonies are left to develop at 37 ° C. for 14 to 16 hours on L agar containing 50 µg / ml ampicillin. The colonies are lysed and the DNA is fixed on the filter by a sequential treatment for 5 minutes with 500 mM of NaOH, 1.5 M
NaCl, washed twice for 5 minutes each time with standard citrate saline solution (SSC) 5 times concentrated.
The filters are air dried and baked at 80 ° C for 2 hours.
The filters are pre-hybridized at 42 ° C for 6 to 8 hours with 10 ml per filter of DNA hybridization buffer (50% formamide, SSC x 5, pH 7.0, solution of
Denhardt x 5 (polyvinylpyrrolidone, ficoll and bovine serum albumin; 1 time = 0.2% of each of these substances), 50 mM sodium phosphate buffer at a pH of 7.0, 0.2% SDS, 20 , ug / ml Poly U and 50 llg / ml denatured salmon sperm DNA.
A 20-mer oligonucleotide model labeled with 32P is prepared according to the sequence of the IL-2 gene reported by
Taniguchi T. et al, see above. The nucleotide sequence of the model is GTGCCTTCTTGGGCATGTA.
The samples are hybridized at 42 "C for 24 to 36 hours with 5 ml per filter of DNA hybridization buffer containing the 32 p labeled cDNA model. The filters are washed with 2 times SSC x 2 and 0, 1% SDS at 50 "C for 30 minutes each time, then washed with twice SSC x 1, 0.1% SDS at 50 C for 90 minutes each, air dried and autoradiographed at - 70 "C for 2 to 3 days. The positive clones are identified and selected again with the model. Full clone lengths are identified and confirmed by mapping restriction enzymes and by comparison with the sequence of the IL-2 cDNA clone reported by Taniguchi T. et al, above.
Example 12
Cloning of the IL-2 gene in the M13 vector
The IL-2 gene is cloned into M13mp9 as described in Example 1 using the plasmid pLW1 (FIG. 12) containing the IL-2 gene under the control of the trp promoter
E.Coli. A sample of pLW1 is deposited in the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Mary 20852 US, since August 4, 1983 and received number
ATCC 39 405. The restriction card of a clone (called
M13-IL2) containing the IL-2 insert is reproduced in FIG. 13. A phage DNA of single-catenary is prepared from the clone M13-IL2 to serve as a copy for the mutagenesis directed on oligonucleotide.
Example 13
Site-directed mutagenesis on oligonucleotide
As indicated previously, IL-2 contains cysteine residues at the positions of amino acids 58, 105 and 125. From these nucleotide sequences of the portions of the gene
IL-2 which contain the codons for these three cysteine residues, three primary oligonucleotides are constructed and synthesized for a mutation of the codons for these residues into codons for serine. These oligonucleotides have the following sequences:
CTTCTAGAGACTGCAGATGTTTC (DM27)
to change cys 58,
CATCAGCATACTCAGACATGAATG (DM 28)
to change cys 105 and
GATGATGCTCTGAGAAAAGGTAATC (DM 29)
to change cys 125.
40 picomoles of each oligonucleotide are treated separately with a kinase in the presence of 0.1 mM ATP, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 5 mM
DTT and 9 units of T4 kinase in 50 μl at 37 "C for 1 hour. Each of the primaries treated with a kinase (10 pmol) is hybridized with 2.6 μg of single-stranded M13-IL2 DNA in 15 such a mixture containing 100 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.9, 20 mM MgCl2 and 20 mM ss-mercaptoethanol, heating at 67 "C for 5 minutes and 42" C for 25 minutes.
The mixtures thus treated are cooled on ice and adjusted to a final volume of 251 l1 of a reaction mixture containing 0.5 mM of each dNTP, 17 mM Tris-HCl of pH 7.9, 17 mM of
MgCl2, 83 mM NaCl, 17 mM p-mercaptoethanol, 5 units of DNA polymerase I, Klenow fragment, 0.5 mM of ATP and 2 units of T4 DNA ligase, are incubated at 37 "C for 5 hours. The reactions are terminated by heating to 80 "C and the reaction mixtures are used to transform competent JM103 cells, deposited on agar plates and incubated overnight to obtain phage plates.
Example 14
Selection and identification of plates
phages that have undergone mutagenesis
Slides containing mutagenized Ml 3-1L2 plates are cooled to 4 "C as well as 2 blades containing M13-IL2 phage plates not subjected to mutagenesis and the phage plates are transferred from each blade to two. nitrocellulose circular filters by placing a dry filter on the agar plate for 5 minutes for the first filter and for 15 minutes for the second filter.
The filters are then placed on thick filter papers impregnated in 0.2 N NaOH, 1.5 M NaCl and 0.2% Triton for 5 minutes, then neutralized by depositing on the filters filter papers impregnated with 0.5 M of Tris-HCl of pH 7.5 and 1.5 M of NaCl for another 5 minutes. The filters are washed twice in a similar manner on filters impregnated with SCC x 2, dried and cooked in a vacuum study at 80 "C for 2 hours.
The filters are pre-hybridized in duplicate at 42 "C for 4 hours with 10 ml per filter of a DNA hybridization buffer (SSC x 5, pH 7.0, Denhardt solution x 4 (polyvinylpyrrolidone, ficoll and bovine serum albumin, 1 time = 0.02% of each of these substances)), 0.1% SDS, 50 mM sodium phosphate buffer of pH 7.0 and 100 μg / ml of DNA denatured salmon semen. Models labeled with 32P are prepared by kinase treating the oligonucleotide primers with labeled ATP. Filters are hybridized with 0.1 x 105 cpm / ml primers labeled with 32P in 5 ml per filter. DNA hybridization buffer at 42 "C for 8 hours.
The filters are washed twice at 50 "C for 30 minutes each in washing buffers containing 0.1% SDS and SSC x 2, and twice at 50" C for 30 minutes each with 0.1% of SDS and
SSC x 2. Filters are air dried and autoradiographed at -70 "C for 2 to 3 days.
Since the primary oligonucleotides DM28 and DM29 were constructed to create a new DdeI restriction site in the clones having undergone mutagenesis (FIG. 14), DNA-RF was digested from several clones hybridized with each of the primaries treated with a kinase, with the restriction enzyme DdeI. We collect one of the M13-IL2 plates which have undergone mutagenesis, hybridized with the primary DM28 and having a new restriction site
DdeI (M13-LW44) and inoculated into a culture of JM103, single-stranded DNA is prepared from the supernatant in the culture and double-stranded RF-DNA is prepared from the cell pellet. In the same way, we collect a plate hybridized with the primary
DM29 (M-13-LW46) and from this plate a single-stranded DNA and a DNA-RF are prepared.
The primary oligonucleotide DM27 was designed to create a new restriction site instead of a DdeI site. Consequently, the plates hybridized with this primer are selected for the presence of a new PstI site. One identifies such a phage plate (M13-LW42) and from this plate prepares a single-stranded DNA and a DNA-RF. The DNA sequences of these three clones are analyzed to confirm that the TGT target codons for cysteine have been converted into a TCT codon for serine.
Example 15
Recloning of the Il - 2 gene that has undergone
mutagenesis for expression in E. coli
The DNA-RF of M13-LW42 is digested separately,
M13-LW-44 and M13-LW46 with restriction enzymes
HindIII and BanII and the insert fragments are purified from a 1% agarose gel. In the same way, the plasmid pTrp3 (FIG. 7) is digested with HindIII and BanII, the large fragment of plasmid containing the trp promoter is purified on an agarose gel and it is connected with each of the fragments of inserts isolated with from M13-LW42,
M13-LW44 and M13-LW46. The linked plasmids are transformed into a competent strain MM294 of E. coli K 12. Plasma DNAs from these transformation products are analyzed by mapping restriction enzymes to confirm the presence of plasmids pLW42, pL44 and pLW46.
Figure 14 shows a restriction map of pLW46. When each of the individual clones is developed in the absence of tryptophan to induce the trp promoter and the free cell extracts are analyzed on SDS-polyacrylamide gels, these three clones, pLW42, pLW44 and pLW46, prove capable. to synthesize a 14.5 kd protein similar to that found in the position control, pLW21, which was found capable of synthesizing a 14.4 kd IL-2 protein.
When these same extracts are examined for their activity in I1-2 on mouse HT-2 cells, only the clones pLW21 (positive control) and pLW46 show significant amounts of IL-2 activity (Table
II below), indicating that cys 58 and cys 105 are required
res for biological activity and that their change into
serines (pLW42 and pLW46 respectively) results in a
loss of biological activity. Cys 125 on the other hand should
not be necessary for biological activity because its changes
ment ser ser 125 (pLW46) does not affect biological activity.
Table II
IL-2 Activity Clones (u / ml) pIL2-7 (negative control) 1 pLW21 (positive control) 113,000 pLW42 660 pLW44 1,990 pLW46 123,000
FIG. 15a reproduces the nucleotide sequence of the coding chain of the clone pLW46. Compared with the coding chain of the native human IL-2 gene, the clone pLW46 shows a simple change of base of G <C on nucleotide 374. FIG. 15b reproduces the corresponding amino acid sequence of the mutein IL-2 coded by pLW46. This mutein is designated by IL-2serl25. In comparison with native I1-2, the mutein has a serine instead of a cysteine in position 125.
A sample of the strain MM294 of E. coli K 12, transformed with pLW46 is deposited in the American Type
Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, US since September 26, 1983 and assigned the ATCC number 39452.
IL-2 muteins in which the cysteine at position 125 has been deleted or replaced by another amino acid, such as the mutein Il-2serl25, retain the activity I1-2. They can therefore be formulated and used in the same way as native IL-2. Consequently, IL-2 muteins can be used in the diagnosis and treatment of bacterial, viral, parasitic, protozoan and fungal infections; in manifestations of lymphokine or immunodeficiency; for restoring normal immune functions in humans and old animals; in the development of diagnostic assays such as those used in enzyme amplification, radiolabelling, radio visualization and other methods known in the art for monitoring IL-2 levels in a patient;
for promoting the development of T cells in vitro for therapeutic and diagnostic purposes for blocking receptor sites for lymphokines; and in various other therapeutic, diagnostic and research applications. The various therapeutic and diagnostic applications of human IL-2 have been studied and reported by S.A. Rosenberg, E.A. Grimm et al, A. Mazumder et al, and E.A. Grimm and S.A. Rosenberg.
The IL-2 muteins can be used by themselves or in combination with other immunologically applicable B or T cells or other therapeutic agents. For therapeutic or diagnostic applications, they can be formulated in physiologically acceptable, non-allergenic, non-allergenic vehicle media, such as distilled water, Ringer's solution, Hank's solution, physiological saline solution and the like. The administration of the IL-2 muteins to humans or animals can be done orally or intraperitoneally, intramuscularly or subcutaneously, depending on the doctor's advice.
As examples of applicable cells, mention will be made of B or T cells, natural killer cells and the like, and as therapeutic reagents which can be used in combination with the polypeptides of the invention, the various interferons, in particular the gamma interferon, B cell growth factor, IL-1 and others.