KR870000511B1 - 발현 비히클의 제조방법 - Google Patents

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발현 비히클의 제조방법

제1도는 인체의 백혈구로부터 분리시켜 균질하게 정제된 모든 인터페론에 공통적인 T-1 및 T-13으로 표시되는 두 개의 아미노산 서열.

제2도는 잠재적 LeIF 플라스미드와³²P-표지된 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 나타내는 방사선도.

제3도는 각기 "A" 내지 "H"로 표시되는 백혈구 인터페론의 발현에 사용되는 분리된 8개의 유전자 단편의 뉴클레오타이드 서열(코드화 나선).

제4도는 뉴클레오타이드 서열로부터 추정된 8개의 LeIF 단백질 서열의 비교도시.

제5도는 8종의 LeIF 클론화_CDNA(A 내지 H)의 제한 엔도뉴클레아제 지도.

제6도는 성숙 LeIF A의 직접적 미생물적 합성을 코드화하는 유전자의 구성도식.

제7도는 성숙 백혈구 인터페론 LeIF B 발현에 사용되는 두개의 유전자단편의 제한 지도.

제8 및 9도는 타입 I 및 J를 포함하여 5개의 LeIF 단백질의 DNA 및 아미노산 서열.

본 발명은 발현 비히클의 제조 방법에 관한 것이다.

더 상세히 말하면, 본 발명은 폴리펩타이드, 특히 성숙 인체 백혈구 인터페론, 이들을 함유하는 약제학적 조성물 및 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 복제성 미생물 발현 비히클(vehicle)에 의해 형질전환된 미생물을 배양하여 성장시켜 폴리펩타이드를 발현시킴을 특징으로 하는 상기 인터페론의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 제조방법에 사용된 발현 비이클 및 이들 발현 비이클을 함유하는 신규의 미생물 뿐만아니라 이들의 제조방법도 포함한다. 결국 본 발명은 성숙 인체 백혈구 인터페론의 아미노산 서열을 코드화하는 서열로 구성되는 DNA 서열에 관한 것이다.

인체 백혈구 인터페론(LeIF)은 이삭과 린덴만에 의해 최초로 발견되어 매우 조잡한 침전물의 형태로 제조되었다(참조 : Proc. R. Soc. B 147, 258~267(1957) ; 미합중국 특허 제3699222호). 그 때 이래 이 물질을 정제하고 특징지우는 노력이 진전되어 정상 백혈구 또는 백혈병을 일으키는 백혈구로부터 유도된 비교적 균질한 백혈구 인터페론을 제조하기에까지 이르렀다(참조 : 독일 연방공화국 공개공보 제2947134호). 이들 인터페론은 이들의 표적 세포에 바이러스 내성을 제공하는 능력을 지닌 것으로 알려진 단백질 균이다. 또한 인터페론은 세포 증식을 억제하고 면역 반응을 조절할 수 있다. 이러한 작용에 의해서 바이러스 감염증 및 악성종양 치료제로서 백혈구 인터페론을 임상적으로 사용하도록 촉구되어 왔다.

백혈구 인터페론은 본질적인 형질 동종성에 따라 정제시키며(참조 :⁹

백혈병을 일으키는 백혈구로부터 분리되는 균질한 백혈구 인터페론으로는 부분적 특징화 및 제한된 임상 시험을 제공하므로, 대규모의 임상시험 후에 광범위한 예방적 및 또는 치료적 용도에 필요한 인터페론을 공급하기에는 매우 불충분하다. 실제로 현재 항종양제 및 항바이러스제 시험에 인체의 백혈구로 부터 유도된 인터페론을 사용하여 수행하는 임상 연구는 주로 조물질(

1% 순도) 제제로 국한되며, 충분량의 제조에는 오랜 시간 및 비현실적인 가격이 요구되므로 연구는 현저히 지연되고 있다.

그러나 재조합 DNA 기술의 발전에 따라서 매우 다양한 유용한 폴리펩타이드

더욱 최근에는, 재조합 DNA 기술을 사용하여 프로인슐린 및 티모신 알파 1의 박테리아 제조가 가능하게 되었으며, 여러 문헌에 인체의 백혈구 인터페론을 코드화하는 DNA의 제조 및 이로부터 수득되는 백혈구 인터페론 활성을 지닌 단백질이 보고되었다(참조 : Nagata et al., Nature 284, 316~320 (1980) ; Mantei et al., Gene 10, 1~10(1980) ; Taniguchi et al., Nature 285, 547~549(1980)).

재조합 DNA 기술의 주작용인자는 플라스미드, 박테리아에서 발견되는 이중나선 DNA의 비염색체성 루우프 및 흔히 세포당 수회 복사에 관하여는 기타의 미생물이다. 플라스미드 DNA 내에 코드화된 정보에 의해서 자세포(즉, 복제물질 "레플리콘")에서 이 플라스미드를 재생시킬 수 있어야 하고, 통상 하나 이상의 선택적 특징, 예를 들어 박테리아의 경우 항생제에 대한 내성을 지녀 흥미있는 플라스미드를 함유하는 숙주세포의 클론을 인지하여 선택적 매질 중에서 바람직하게 성장시킬 수 있어야 한다.

플라스미드는 플라스미드 DNA상의 다른 부위를 인지하는 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 또는 "제한효소"에 의해서 특히 분해될 수 있다는데 그 효용이 있다. 이어서 이종 유전자 또는 유전자 단편을 분해부위 또는 분해 분위에 인접한 """"

발현은 RNA 폴리머라제에 의해 인지 및 결합되는 프로모터로 알려진 영역에서 개시된다. 본 발명의 수행에서는 트립토판 또는 "trp" 프로모터에서 개시되는 것이 바람직하기 때문에 몇몇 경우에 프로모터 영역과 "오퍼레이터" 영역이 중복되어 결합된 프로모터-오퍼레이터가 형성된다. 오퍼레이터는 특정 프로모터 영역에서 개시되는 전사 빈도를 조절하는 소위 리프레서(repressor)단백질에 의해 인지되는 DNA 서열이다. 폴리머라제는 DNA를 따라 진행하며 코드화 나선에 들어 있는 정보를 이의 5' 말단에서 3' 말단으로 mRNA에 전사시키고, 또한 mRNA는 DNA를 코드화하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로 번역된다.

각 아미노산은 "구조 유전자"라 지칭되는 3개의 뉴클레오타이드 또는 "코돈"에 의해 코드화 되며 상기 구조 유전자는 발현된 생성물의 아미노산 서열을 코드화한 부위이다. 프로모터에 결합한 후 RNA 폴리머라제는 우선 리보솜 결합 부위를 코드화하는 뉴클레오타이드를 전사시키고 번역 개시 또는 "출발" 시그날(통상 ATG, 생성된 mRNA에서 AUG로 됨)을 전사시킨 후 구조 유전자 자체 내의 뉴클레오타이드

mRNA가 형성됨에 따라 통상 박테리아내에서 리보솜이 mRNA상의 결합 부위에 결합한 후, 이로부터 번역 출발 시그날에서 시작하여 상기한 정지 시그날에서 종료되면서 코드화 폴리펩타이드가 제조된다. 바람직한 생성물은 리보솜 결합 부위를 코드화하는 서열이 AUG 개시 코돈에 대하여 적절히 위치하고 모든 잔류코돈이 상기한 개시 코돈에 따라 차례로 위치할 경우에 제조된다. 생성물은 숙주 세포를 용해시키고 다른 박테리아 단백질로부터 적절히 정제하여 생성물을 회수함으로써 수득할 수 있다.

본 발명자들은 재조합 DNA 기술(즉, 미생물 발현 비히클에 인터페론 유전자를 삽입시키고 미생물 유전자 조절원소의 통제하에 발현시키는 방법)이 백혈구 인터페론을 다량 수득할 수 있는 가장 효과적인 방법이며, 따라서 인체에서 유도된 물질을 글리코실화하여 생성된 물질과는 달리 광범위한 바이러스성 및 종양질환 치료에 임상적으로 사용할 수 있다는 점을 간파했다.

본 발명에 따른 백혈구 유전자를 수득하기 위해서는 다음 단계들을 실시한다 :

(1) 균질하게 정제시킨 인체 백혈구 인터페론의 부분적 아미노산 서열을 사용하여 합성 DNA 프로우브(probe) 세트를 작제하고 이의 코돈을 종합하여 부분적 아미노산 서열을 코드화할 수 있는 모든 가능한 뉴클레오타이드 조합을 표시한다.

(2) 유도된 mRNA로부터 상보성 DNA(_CDNA)를 함유하는 박테리아 콜로니 뱅크를 제조한다. 이들 중에서 방사선 표지된 기타의 유도 mRNA를 하이브리드화시켜 플라스미드_CDNA를 제조한다. 하이브리드화 mRNA를 용출시키고 난모세포 분석법에 의해서 인터페론으로 번역되었는가를 시험한다. 이러한 방법에 의해서 인터페론 활성을 나타내는 콜로니에서 얻은 플라스미드 DNA를 시험하여 상기(1)에서 기술된 바와 같이 제조된 프로우브로 하이브리드화에 대하여 시험한다.

(3) 상기(2)와 병행하여 플라스미드 중의 유도된 mRNA-유도_CDNA를 사용하여 형질 전환체 콜로니의 독립 뱅크를 제조한다. (1), 프로우브를 사용하여 방사선 표지된 단일나선_CCDA를 합성하고 이를 하이브리드화 프로우브로 사용한다. 상기 합성 프로우브를 템플레이트(template)인 유도된 mRNA와 하이브리드화시키고 역전사시켜 신장시킴으로써 유도된 방사선 표지된 cDNA를 제조한다. 이러한 방법에 의해 수득된 방사선 표지된 cDNA로 하이브리드화된 콜로니 뱅크 중의 클론을 더욱 조사하여 유전자를 코드화하는 인터페론 전장이 존재하는가를 확인한다. (1) 또는 (2)에서 수득된 부분적 유전자단편 어느 것도 전장의 유전자 추정을 위한 프로우브로 사용할 수 있다.

(4) 상기 수득된 전장의 유전자를 합성 DNA를 사용하여 맞추면 성숙 폴리펩타이드의 미생물 발현을 억제할 수 있는 어떤 리더(leader) 서열도 제거되고 발현 비히클 중 출발 시그날 및 미생물 프로모터의 리보솜 결합 부위를 적절히 위치 지울 수 있다. 발현된 인터페론을 이의 특성 및 활성도가 확인될 때까지 정제한다.

(5) 상기 방법에 따라서 제조된 인터페론 유전자 단편 자체를 하이브리드화시켜 기타의 부분적 동종 백혈구 인터페론종의 프로우빙(probing)에 사용할 수 있다.

상기한 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하면, 상응하는 전서열 또는 그의 일부를 거의 수반하지 않는 성숙 폴리펩타이드로서 동종의 백혈구 인터페론(글리코실화 되지 않은)이 고수율 및 고순도로 미생물적으로 제조된다. 이러한 인터페론은 동물 및 인체의 바이러스성 및 악성종양 질환치료에 사용하기에 적합한 정도로 직접 발현, 회수 및 정제시킬 수 있다. 그렇게 표현된 인터페론들은 시험관내 및 생체내 시험에서 효과적임이 증명되었으며, 후자의 시험에서는 미생물적으로 제조된 최초의 성숙 백혈구 인터페론임이 증명되었다.

본 명세서에 사용된 "성숙 백혈구 인터페론"이란 용어는 미생물적으로(박테리아에 의해) 제조된 인터페론 분자로서 글리코실 그룹이 없는 인터페론으로 정의된다. 본 발명에 따른 성숙 백혈구 인터페론은 천연생성물의 첫째 아미노산 코돈 직전의 번역 시그날(ATG)로부터 즉시 발현된다. 따라서 "성숙" 폴리펩타이드는 이의 서열 중 첫째 아미노산으로서 메티오닌(ATG 코드에 따라)을 이의 특성을 본질적으로 변화시킴이 없이 함유할 수 있다. 한편 미생물 숙주는 번역 생성물에서 개시 메티오닌을 제거할 수도 있다. 성숙 백혈구 인터페론은 통상의 리더 이외에 접합 단백질과 함께 발현될 수 있고, 상기 접합체는 세포내 또는 세포외에서 특히 분해될 수 있다(참조 : 영국 특허 공보 제2007676A호).

결국 성숙 인터페론은 상기 접합체를 세포벽에 전달시키는 미생물 "시그날" ""

특정의 백혈구 인터페론 단백질은 결정된 DNA 유전자(제3 및 8도)와 추론된 아미노산 서열화(제4 및 9도)를 사용하여 정의되었다. 이들 특정 인터페론에서는 실로 모든 백혈구 인터페론 단백질군이 포함되어 있으며, 개개마다 상이한 천연의 대립형질이 존재할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 차이는 서열 전반에 걸친 아미노산 차이를 나타내거나, 동일 서열 중 아미노산의 삭제, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가를 나타낸다. 각 백혈구 인터페론 단백질에 있어서, 표지된 LeIF A에서 LeIF J까지 대립형질에 차이가 있으며 이는 본 발명의 범위내에 포함된다.

제1도에서 펩타이드를 코드화하는 모든 잠재적 mRNA서열이 표시되고 상응하는 DNA 서열도 표시되어 있다. A,T,G,C 및 U는 각기 염기로서 아데닌, 티민, 구아닌, 사이토신 및 우라실을 함유하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. N은 뉴클레오타이드 A,G,C 및 U 중 어느 하나를 나타낸다. 폴리뉴클레오타이드는 5'(좌측)에서 3'(우측) 방향으로 판독하도록 표시되고, 여기서 이 중 나선("d.s.") DNA는 하단 또는 비코드화 나선에 대해 역으로 일치하도록 표시된다.

제3도에서 각 LeIF에 대한 ATG 번역 개시 코돈 및 종료 트리플렛(triplet)에는 밑줄이 그어져 있다. 정지 코돈 또는 종료 트리플렛 뒤에는 3' 비번역 영역이 있다. LeIF A의 전장 유전자에는 다른 유전자에서 발견되는 하나의 코돈이 빠져 있

제4도에서 약어는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회에서 추천된 것을 사용하며, 다음과 같다 :

A, 알라닌 ; C, 시스테인 ; D, 아스파르트산 ; E, 글루탐산 ; F, 페닐알라닌 ; G, 글리신 ; H, 히스티딘 ; I, 이소로이신 ; K, 라이신 ; L, 로이신 ; M, 메티오닌 ; N, 아스파라긴 ; P, 프롤린 ; Q, 글루타민 ; R, 아르기닌 ; S, 세린 ; T, 트레오닌 ; V, 발린 ; W, 트립토판 ; 및 Y, 티로신.

수치는 아미노산 위치를 나타낸다(S는 시그날 펩타이드).

165 아미노산 LeIF A 서열 중 위치 44에서의 대시는 상기 LeIF A 서열을 기타 LeIF의 166 아미노산 서열과 일렬로 정돈시킨다. 상기 LeIF E 서열은 이의 코드화 영역에 존재하는 여분 뉴클레오타이드(제3도의 위치 187)를 무시하여 결정된다. 별표는 등위상 종료 코돈을 나타낸다. 모든 LeIF(슈도진 LeIF E 제외)에 공통적인 아미노산도 표시되어 있다. 밑줄 그은 잔기는 인체의 섬유아세포 인터페론에도 존재하는 아미노산이다.

제5도에서 하이브리드 플라스미드는 dC : dG 테일링(tailing)법에 의해서 제조된다(참조 : Goeddel, D.V. et al, Nature 287, 411~416(1980)). 따라서 cDNA 삽입은 Pst Ⅰ 을 사용하여 이루어질 수 있다. 각 cDNA 삽입물의 말단에서 라인은 측

제6도에서는 제한 부위 및 잔기가 표시되어 있다("Pst Ⅰ", 등). "b.p."는 "염기쌍(base pair)"을 나타낸다.

제7도에서 두 가지 경우에서 지적된 코돈 서열은 제한효소 Sau 3a로 소화시켜 수득되는 종료 코드화 나선이다.

제8및 9도에서 약어는 제4도에 나타낸 바와 같다. 제9도에서 별표는 상응하는 DNA 서열 중 종료 코돈을 나타내고, 하이픈은 서열중 삭제 또는 갭(gap)을 나타낸다.

A. 사용 미생물

두가지 미생물이 사용된다. 이 콜리×1776(참조 : 미합중국 특허 제4190495호) 및 이 콜리 K-12균주 294(말단 A, thi^-, hsr^-, hsm k⁺)(참조 : 영국 특허 공보 제2055382A호). 모두 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있다(ATCC 기탁번호는 각기 31537 및 31446). 모든 재조합 DNA법은 국립 보건원의 지침에 따라 수행한다.

본 발명의 최선 실시 양태에서는 상기 정의된 균주 이 콜리×1776 및 이 콜리 K-12 균주 249뿐만 아니라 이 콜리 B와 같은 기타 공지된 이 콜리 균주를 포함하는 이 콜리, 또는 기타의 미생물 균주로 수행하며, 이들중 대부분이 ATCC와 같이

B. LeIF mRNA의 공급원 및 정제

LeIF mRNA는 인체 백혈구로부터 통상 예를 들어 독일연방공화국 공개공보 제2947134호에 기술된 바와같이 센다이 또는 뉴캐슬 질환 바이러스에 의해서 인터페론을 생성시키는 만성 골수 백혈병환자의 백혈구로부터 수득할 수 있다. 특히 바람직한 공급 원인, 본 발명의 방법에 사용된 공급원은 급성 골수 백혈병 환자로부터 유도된 KG-1로 명명되는 셀라인(cell line)이다. 상기 셀라인(참조 : Koeffler, H.P and Golde, D.W.,Science 200, 1153(1978))을 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute) 1640+열불활성화된 10% FCS(송아지 태아 혈청), 25mM HEPES 완충제(N-2-하이드록시에틸-피페라진-N'-2-에탄설폰산) 및 50㎍/ml의 겐타마이신으로 이루어진 배지중에서 신속히 성장시키고, 1 내지 3개로 분할하여 주 2회 계대 배양시킨다. 상기 성장배지÷10% 디메틸설폭사이드 중에서 세포를 동결시킬 수 있다. KG-1은 ATCC(ATCC 기탁번호 CRL 8031)에 기탁되어 있다.

루빈스타인 등의 방법(참조 : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 640~644(1979))에 따라서 센다이 또는 뉴캐슬 질환 바이러스로 KG-1 세포를 유도하여 백혈구 인터페론 mRNA를 제조한다. 유도한지 5시간 후에 세포를 모아 구아니딘 티오시아네이트-구아니딘 하이드로클로라이드 공정에 의해 RNA를 제조한다(참조 : Chirgwin et al., Biochemistry 18. 5294~5299(1979)). 동일한 방법에 의해 비유도 세포로부터 RNA를 분리시킨다. 올리고 데옥시티미딘(dT)-셀룰로즈 크로마토그라피 및 슈크 즈 구배 초원심 분리법을 사용하여 하기 방법에 따라 폴리(A) mRNA의 12S 분획을 수득한다(참조 : Green et al., Arch. Biochim. Biophys., 172, 74~89(1976) 및 Okuyuma et al. Arch. Biochem. Biophys. 188, 98~104 (1978)).

이 mRNA는 크세노푸스 레비스(Xenopus laevis) 난모세포 분석 결과 8000~10,000 단위/mcg의 인터페른 역가를 지닌다(참조 : Cavalieri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3287~3291(1977)).

C. LeIF cDNA 서열을 함유하는 콜로니 뱅크의 제조

5㎍ mRNA를 사용하여 표준 방법에 의해 이중나선 cDNA를 제조한다(참조 : Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483~2495 (1978) 및 Goeddel et al., Nature 281, 544~548 (1979)). 이 cDNA를 6% 폴리아크아릴미드겔상에서 전기 영등하여 크기에 따라 분획을 얻고 이를 전기 용출시켜 500 내지 1500b.p. 크기범위의 물질 230ng을 회수한다. cDNA 100ng에 데옥시시티딘(dC) 잔기를 말단에 붙이고(참조 : Chang et al., Nature 275, 617~624(1978)), PstⅠ부위에 데옥시구아노신(dG) 잔기가 부착된 플라스미드 pBR322 470ng과 가열 냉각시킨 후 (참조 : Bolivar et

상기한 바와 같은 두번째의 실험에서는 cDNA ng당 약 1000의 테트라사이클린 내성, 암피실린 감수성 이콜리 K-12 균주 294 형질 전환체를 수득하였다. 이 경우에 dC 말단 부착하고 전기 용출시킴으로써 600 내지 1300b.p. 크기 범위의 cDNA 물질 분획이 회수된다.

D. 합성 올리고뉴클레오타이드의 제조 및 이의 용도

인체 백혈구 인터페론의 여러 개의 트립신 분해단편의 아미노산 서열을 알게 되면, LeIF mRNA의 여러 영역에 상보성인 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드의 설계가 가능해진다. 두개의 트립신 분해 펩타이드 T1 및 T13을 선택하는데, 이들은 각기 단지 12개 및 4개의 운데카머 합성에 요구되는 아미노산 서열을 지니고 있어서, 모든 가능한 코드화 서열을 설명할 수 있기 때문이다(제1도 참조). 데옥시올리고-뉴클레오타이드 프로우브 4세트를, 각 서열마다 각기 3개(T-1A,B,C,D) 또는 1개(T13A,B,C,D), 올리고뉴클레오타이드를 함유하도록 합성한다. 지적된 상보성 데옥시올리고 뉴클레오타이드 11 염기 길이는 포스포-트리에스테르법에 의해 화학적으로 합성한다(참조 : Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 5765~5769(1978)). 4개의 개개 프로우브는 T-13 계열에서 제조한다. 12개의 T-1 프로우브는 제1도에 나타낸 바와같은 프로우브 3개의 풀(pool) 4개로 제조한다.

T-13 계열의 4개의 개개 프로우브 및 프라이머 3개의 풀 4개로 제조된 12개의 T-1 프로우브를 사용하여 하이브리드화 프로우브로 사용되는 방사선 표지된 단<³² ₂""^{32 R}

하기한 방법에 따라 하이브리드화를 수행한다(참조 : Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552(1979)).

E. 클론 PLi-PL 30의 동정

하기한 바의 신속한 플라스미드 분리 방법을 사용하여 각기 500의 이·콜리 K-12 294형질전환체(C 참조)로부터 플라스미드 DNA 1㎍을 제조한다(참조 : Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513~1523(1979)). 각 DNA 시(르)를 변질시키고 상기한 카파르스 등의 방법에 따라서 3회 니트로 셀룰로즈 여과시킨다.

500 플라스미드 시료를 함유하는 니트로셀룰로즈 여과물 3세트를 하기 a,b 및 c와 하이브리드화시킨다 : a) 프라이머의 T-1 세트로 개시된 유도 cDNA, b) T-13 개시된 유도 cDNA 및 c) 프라이머 양세트를 사용하여 제조한 비유도 cCNA 클론은 비유도 총 프로우브보다 하나 또는 두 개의 유도 cDNA 프로우브와 더 강하게 하이브리드화시킬 경우 양성화 되는 것으로 생각된다. 또 다른 분석용으로 500클론 중 30개의 "양성" 클론(PLi-PL30)을 선택한다.

F. 클론 PL31~PL 39의 동정 LeIF 유전자 단편을 함유하는 플라스미드(No. 104)의 분리

이·콜리×1776의 형질 전환체를³²p-표지된 유도 mRNA를 프로우브로 사용하여(참조 : Lillehaug et al., Biochemistry, 15, 1858~1865(1976)) 그룬스타인 및 호그네스의 콜로니 하이브리드화 공정에 의해 선별한다(참조 : Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 72, 3961~3965(1975)). 비유도 세포에서 얻은 표지 안 된 mRNA를 상기 프로우브와 200:1의 비율로 혼합하여³²p-표지된 제제 중에서 비유도 mRNA가 경쟁적으로 작용되도록 한다. 표지된 mRNA의 하이브리드화는 유도 서열을 함유하는 콜로니에서 바람직하게 일어나야 한다. 3종의 형질전환체가 수득된다 :

(1) 콜로니 중 2 내지 3%는³²p-RNA에 매우 강하게 하이브리드화 함.

(2) 콜로니 중 10%는 (1)에 비해 약하게 하이브리드화 됨.

(3) 나머지는 검출할만한 하이브리드화 시그날을 제공 안함.

양성콜로니(1) 및 (2)에 대하여 인터페론 mRNA의 특히 플라스미드 DNA에의_{2 4 2 4 4 4 2}

상기 시험에 의해, 6개 풀 모두가 음성이었다. 59의 약한 양성 콜로니(2)로부터 10콜로니의 5풀과 9콜로니의 1풀을 제조한 후 상기 풀로부터 플라스미드를 제조하여 상기한 바와 같이 시험한다. 시험한 6풀 중 매회 상기 수준보다 특이적으로 강하게 인터페론 mRNA와 하이브리드화 되는 것 1개(K10)를 시험하였다. 특정 인터페론을 동정하기 위해 풀 K10의 9콜로니로부터 cDNA 클론 플라스미드 DNA를 제조하여 각기 시험하였다. 9 플라스미드 중 둘(No. 104 및 No. 104)은 상기 수준보다 강하게 인터페론 mRNA에 결합하였다. 플라스미드 No. 104로부터 260b.p.를 함유하는 유일한 BglⅡ 제한단편을 분리시키고 테일러의 방법을 사용하여³²P로 표지시킨 후(

또한 표지된 260b.p.단편을 사용하여 상기한 바와 동일한 방법에 의해 4000이·콜리 294 형질 전환체를 각기 선별한다. 50콜로니를 이 프로우브와의 하이브리드화 상이도에 따라 동정한다. 1개는 LeIF G 단편을 함유하고 1개는 LeIF H 단편을 함유하며, 1개는 LeIF H의 대립형질인 LeIF Hl로 표시되는 단편을 함유한다. 수득되는 하이브리드화 플라스드는 "PLeIF H" 등으로 표시된다.

G. 첫째 전장 LeIF 유전자의 분리 및 서열화

모든 39의 잠재적 LeIF cDNA 클론으로 부터 플라스미드 DNA를 제조하고 카파토스 중의 하이브리드화 공정(상기 참조)을 사용하여 동일한 260b.p. DNA 프로우브로 재선별한다. 3개의 플라스미드(PL4, PL31, PL34)는 매우 강한 하이브리드화 시그날을 나타내며, 4개(PL13, PL30, PL32, PL36)는 중간 정도로 하이브리드화 되고 3개(PL6, PL8, PL14)는 프로우브와 약하게 하이브리드화 된다.

또한 하이브리드화 프로우브로서³²P-표지된 합성 운데카머(개개 T-1 프라이머 플 또는 개개 T-1 프라이머)를 직접 사용하여 39의 잠재적 LeIF cDNA 재조합 플라스미드를 선별한다. 하이브리드화 시그날 검출에 염기쌍이 완전히 이용되도록 하

개개 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프라이머풀을 다음과 같이 (r³²P) ATP로 포스포릴화시킨다 : 올리고뉴클레오타이드 50pmole 및 (r³²P) ATP 100pmole (New England Nuclear, 2500Ci/mmole)을 50mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂및 15mM β-머캅토에탄올 30μl 중에서 혼합한다. T₄폴리뉴클레오타이드 키나제 2단위를 가하고 37℃에서 30분 후에³²P-표지된 프라이머를 세파덱스

G-50컬럼 10ml상에서 크로마토그라피로 정제한다. 프라이머 T-13C 10⁶cpm 또는 프라이머 풀 T-1C 3×10⁶cpm을 사용하여 하이브리드화를 수행한다. 하이브리드화는 6×SSC[1×SSC=0.15M NaCl, 0.015M 나트륨 시트레이트, pH7.2], 10×덴하르트 용액[0.2% 소혈청 알부민, 0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 피콜(Ficoll)] 중에서 월라스 등의 방법(상기 참조)에 의해 15℃에서 14시간 동안 수행한다. 여과물을 0℃에서 6χSSC 중에서 5분간 세척하고(3회), 건조시키고 X선 필름에 노출시킨다.³²P-

클론 104에서 얻은 플라스미드 DNA는 프라이머 풀 T-1C 및 프라이머 T-13C와 상당히 하이브리드화되나, 기타 나타낸 운데카머와의 하이브리드화는 검출되지 않았다. 제2도에 나타낸 바와 같이, 39의 잠재적 LeIF 플라스미드 중 몇몇(PL2,4,13,17,20,30,31,34)은 상기 프로우브와 하이브리드화 된다. 그러나 제한 분석 결과 상기 플라스미드 중 단지 1개(PL31)만이 260b.p. 내부 BglⅡ 단편을 함유하는 것으로 밝혀졌다. PL31을 PstⅠ소화시킨 결과, cDNA 삽입물 크기는 대략 1000b.p.로 나타났다.

M13 벡터에 Sau3a 단편을 서브클로닝시킨 후, PL31의 전체 PstⅠ삽입물을 맥샴-길버트의 화학적 방법(참조 : Methods Enzymol. 65, 499~560(1980)) 및 디데옥시쇄 말단화공정(참조 : Smith, Methods Enzymol. 65, 560~580(198))에 의해 서열화시킨다. DNA 서열은 제3도에 표시되어 있다("A").

적절한 번역판독 프레임은 단백질 서열정보, 기지의 LeIF 분자량 범위 및 3개의 기능판독 프레임 중 정지 트리플렛의 상대 출현으로부터 예측할 수 있으며, 또한 프리(pre)-또는 시그날 펩타이드를 포함하는 전체 LeIF 아미노산 서열도 예측할 수 있다. 첫째 ATG 번역 개시 코돈이 서열의 5' 말단에서부터 60번째 뉴클레오타이드에 나타나고 이로부터 188번째 후의 코돈에서 TGA 종료 트리플렛이 나타나며 ; 3' 말단에는 342개의 번역안된 뉴클레오타이드가 존재하고 이에 이어서 폴리(A) 서열이 위치한다. 추정되는 시그날 펩타이드(아마도 백혈구로부터의 성숙 LeIF 분비시 포함되는)는 아미노산 23개의 길이를 갖는다. 성숙 LeIF를 구성하는 165개의 """"

상기 두 개의 영역에서 발견된 실제 DNA 코드화 서열은 프라이머 풀 T1-C 및 프라이머 T13-C로 표시된다(제8도 참조).

H. 성숙 백혈구 인터페론 A(LeIF A)의 직접 발현

1. 개 요

LeIF A를 성숙 인터페론 폴리펩타이드로서 직접 발현시키는 하기 방법은 인체 성장 호르몬에 일찌기 사용된 방법(참조 : Goeddel et al., Nature 281, 544~548(1979))의 변형법으로 여기에는 합성(N-말단) 및 상보성 DNA의 조합이 포함된다.

제6도에서 밝혀진 바와 같이, Sau 3a 제한 엔도뉴클레아제 부위는 통상 LeIF A의 코돈 1과 3 사이에 위치한다. 두 개의 합성 데옥시올리고뉴클레오타이드를 설계하여 여기에 ATG 번역 개시 코돈을 편입시키고 아미노산 1(시스테인)의 코돈을 넣고 EcoRI 점착성 말단을 만든다. 이들 올리고머를 PL 31의 34b.p. Sau 3a-AvaⅡ 단편과 연결시킨다. 수득되는 45b.p. 생성물을 2개의 추가 DNA 단편과 연결시켜 865b.p. 합성-천연 하이브리드 유전자를 구성하고 이는 LeIF A를 코드화하고 EcoRI 및 PstⅠ제한 부위와 결합된다. 이 유전자를 EcoRI과 PstⅠ부위 사이의 pBR 322에 삽입시켜 플라스미드 pLeIF A1을 수득한다.

2. 트립토판 조절 원소의 작제(이·콜리 trp 프로모터, 오퍼레이터 및 trp 리더 리보솜 결합 부위를 함유하나 번역을 개시하는 ATG 서열을 결여)

플라스미드 pGMI은 삭제

LE 1413을 함유하는 이·콜리 트립토판 오퍼론을 수반하고(참조 : Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457~1466(1978)), 따라서 trp 프로모터-오퍼레이터 시스템 통제하에 trp 리더의 첫째 6 아미노산 및 trp E 폴리펩타이드(이하 LE'로 지칭)의 최후 3번째 아미노산)은 물론 trp D 폴리펩타이드 전부로 구성되는 융합 단백질을 발현시킨다. 플라스미드 20㎍을 제한 효소 PvuⅡ로 소화시켜 플라스미드의 5부위를 분해시킨다. 이어서 상기 유전자 단편을 EcoRI 링커(pCATCAATTCATG 서열의 자기 상보성 올리고뉴클레오타이드로 구성된)와 결합하여 EcoRI 부위를 함유하는 플라스미드내에 이후의 클론화 EcoRI 분해 부위를 제공한다. pGM 1에서 수득된 DNA 단편 20㎍을 5'-포스포릴화 합성 올리고뉴클레오-타이드 pCATGAATTCATG 200pmole 존재하에 20㎕의 T₄DNA 리가제 완충제(20mM 트리스, pH7.6, 0.5mM ATP, 10mM Mgcl₂, 5mM 디티오트레이톨) 중에서 10단위의 T₄DNA 리가제로 4℃에서 발새 처리한다. 이어서 용액을 70℃에서 10분간 가열한 후 리게이션을 중지시킨다. 링커를 EcoRI 소화에 의해 분해시키고 EcoRI 말단이 부착된 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법(이하 PAGE라 함)으로 분리시키고, 3개의 가장 큰 단편을 에티디움 브로마이드로 일차 염색시키고 좌의선을 조사시킨 후 겔로부터 목적하는 부분을 절단시킴으로써 겔에서 분리시킨다. 300마이크로리터 0.1×TBE와 함께 각 겔 단편을 투석백에 넣고, 0.1×TBE 완충제(TBE 완충제는 10.8g의_{2 2}

플라스미드 pBRHI(참조 : Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267~3287(1979))는 암피실린 내성을 나타내고 테트라사이클린 내성인 유전자를 함유하나, 프로모터와 무관할 경우에는 내성을 나타내지 않는다. 따라서 플라스미드는 테트라-사이클린 감수성이다. EcoRI 부위에 프로모터-오퍼레이터 시스템을 도입시키면 플라스미드가 테트라사이클린 내성으로 될 수 있다.

pBRHI은 EcoRI로 소화시키고 페놀 추출 및 클로로포름 추출로 효소를 제거시킨 후 에탄올 침전시켜 물중에서 회수한다. 수득되는 DNA 분자는 각 반응혼합물 중에서 상기 수득된 3개의 DNA 단편과 각기 결합시키고 상기한 바와 같이 T₄DNA 리가제로 리게이션시킨다. 반응 혼합물에 존재하는 DNA는 표준 기술에 의해 경쟁적 이·콜리 K-12 균주 294를 형질 전환시키는데 사용하고(참조 : Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 3455~3459(1974)), 이 박테리아는 2㎍/ml의 암피실린 및 5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 판상에 둔다. 여러 개의 테트라사이클린-내성 콜로니를 선택하여 플라스미드 DNA를 분리시키고,

간염 B의 바이러스 제놈의 EcoRI 및 BamHI 소화 생성물은 통상적 방법에 의해 수득하고 플라스미드 pGH6의 EcoRI 및 BamHI 부위에 클론화시켜(참조 : Goeddel et al, Nature 281, 544(1979)) 플라스미드 pHS 32를 형성시킨다. 플라스미드 pHS32를 XbaⅠ로 분해시키고 페놀추출 및 클로로포름 추출 후에 에탄올로 침전시킨다. 이어서 0.1mM dTTP 및 0.1mM dTTP를 함유하는 30㎕의 폴리머라제 완충제(50mM 인산칼륨 pH7.4, 7mM MgCl₂, 1mM β-머캅토에탄올) 중에서 1㎕의 이·콜리 DNA 폴리머라제 Ⅰ, 클레나우(klenow) 단면(Boehringer-Mannheim)으로 0℃에서 30분간 처리한 후 37℃에서 2시간 동안 처리한다.

상기 처리에 의해서 XbaⅠ분해 부위의 5' 돌출말단에 상보성인 4개의 뉴클레오타이드 중 2개가 다음과 같이 채워진다 :

5' CTAGA- 5' CTAGA-

3' T- 3' TCT-

두 개의 뉴클레오타이드 dC 및 dT는 결합되어 두개의 5' 돌출 뉴클레오타이드 말단을 갖게 된다. 이러한 선형 플라스미드 pHS 32잔기(페놀 및 클로로포름 추출하고 에탄올 침전 후에 물 중에서 회수)는 EcoRI로 분해시킨다. 대형 플라스미드 단편을 PAGE에 의해 소형 EcoRI-XbaⅠ단편으로부터 분리하고 전기 용출시킨 후 분리시킨다. pHS 32(0.2㎍)로부터 수득된 DNA 단편은 상기한 바와 동일한 조건하에 리게

pHS 32에서 얻은 단편을 리게이션시켜 EcoRI-TaqⅠ단편을 얻는 방법은, 상기한 바와 같이 비록 완전한 와트슨-크리크(Watson-Crick) 염기쌍을 지니지는 않았어도 TaqⅠ돌출 말단을 XbaⅠ잔류 돌출말단과 리게이션시키는 것이다.

-T CATGA- → -TCTAGA-

-AGC⁺TCT- → -AGATCT-

이러한 리게이션 반응 혼합물의 일부를 이·콜리 294 세포로 형질전환시키고 가열 처리한 후 암피실린을 함유하는 LB 판상에 둔다. 24개의 콜로니를 선택하여 3ml LB(Luria-Bertani) 매질 중에 성장시켜 플라스미드를 분리한다. 이들 중 6개는 이·콜리 촉매화된 DNA 회복 및 복제로 재생된 XbaⅠ부위를 갖는것으로 밝혀졌다 :

-TCTAGA- → -TCTAGA-

-AGCTCT- → -AGATCT-

이들 플라스미드는 또한 EcoRI 및 HpaⅠ모두에 의해 분해되어 목적한 제한 단편을 생성시키는 것으로 밝혀졌다. pTrp 14로 명명된 1개의 플라스미드는 이하에 논의되는 바와 같이 이종 폴리펩타이드의 발현에 사용된다.

플라스미드 pHGH 107(참조 : Goeddel et al., Nature 281, 544,(1979))은 합성 DNA 단편에서 수득된 23개의 아미노산 코돈과 인체 성장 호르몬 mRNA를 역 전사시켜 제조된 상보성 DNA로부터 수득된 163개의 아미노산 코돈으로 이루어진 인체 ""

인체 성장 호르몬(HGH) 유전자 함유 단편은 PAGE후에 전기 용출시켜 분리시킨다. 또한 수득되는 DNA단편도 테트라사이클린 내성 구조 유전자의 첫째 350 뉴클레오타이드를 함유하나 테트라사이클린 프로모터 오퍼레이터 시스템을 결여하므로 발현 플라스미드에 후속 클론화시킬 경우 이 삽입물을 함유하는 플라스미드가 테트라사이클린 내성을 회복할 수 있다. 상기 단편의 EcoRI 말단은 클레나우 폴리머라제 Ⅰ공정에 의해 채워지므로 이 단편은 발현 플라스미드에 삽입시 적절한 방향으로 1개의 평활말단 및 1개의 점착성 말단을 갖게 된다.

이어서 발현 플라스미드 pTrp 14를 상기 제조된 HGH 유전자-함유 단편이 함유되도록 제조한다. 즉, pTrp 14를 XbaⅠ 소화시키고 수득되는 점착성 말단을 클레나우 폴리머라제 Ⅰ 공정에 의해 dATP, dCTP, dTTP 및 dGTP를 사용하여 채운다. 페놀 및 클로로포름 추출과 에탄올 침전 후에 수득되는 DNA를 BamHI로 처리하고 수득되는 대형 플라스미드 단편을 PAGE 및 전기 용출로 분리시킨다. pTrp 14-유도 단편은 1개의 평활말단 및 1개의 점착성 말단을 함유하므로 상기한 HGH 유전자-함유 단편을 적절한 방향으로 재조합시킬 수 있다.

HGH 유전자단편과 pTrp14

Xba-BamHI 단편을 상기한 바와 동일한 조건하에

채워진 XbaⅠ 채워진 EcoRI HGH 유전자 개시

-TCTAG + AATTCTATG- → -TCTAGAATTCTATG-

-AGATC + TTAAGATAC- → -AGATCTTAAGATAC-XXXbaI, EcoRI

상기 구조는 또한 테트라사이클린 내성 유전자를 재생시킨다. 플라스미드 pHGH 107은 HGH 유전자의 상류에 위치하는 프로모터(1ac 프로모터)로부터 테트라사이클린 내성을 나타내므로 pHGH 207로 명명된 이 구조는 트립토판 프로모터-오퍼레이터 통제하에 테트라사이클린 내성 유전자를 발현시킬 수 있다. 따라서 리게이션 혼합물을 이·콜리 294로 형질전환시키고 선택된 콜로니를 5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 LB 판상에 둔다.

플라스미드 pHGH 207을 소화시키고, EcoRI 프로모터, 오퍼레이터 및 trp 리더 리보솜 결합 부위는 함유하나 번역 개시 ATG 서열은 결여하는 300b.p. 단편을 pAGE 후에 전기 용출시켜 회수한다. 이 DNA 단편을 pLEIF A의 EcoRI 부위에 클론화 한다. 상기 변형된 trp 레귤론(발현도를 제어 가능하게 높이기 위해 감퇴 서열을 삭제한 이·콜리 trp 오퍼론)을 함유하는 발현 플라스미드는, 프로모터-오퍼레이터 시스템을 충분히 억제시킬 수 있는 양의 트립트판을 추가로 함유하는 영양 배지 중에서 예정한 정도까지 성장시킨 후 시스템 및 목적 생성물의 발현을 억제하지 않도록 트립토판을 제거한다.

더욱 특히, 제6도에서는 플라스미드 pL31 250㎍을 PstⅠ로 소화시키고³² _{4 2 2 4 4}

Ⅰ. LeIF A의 시험관내 및 생체내 활성도

IF 분석용 추출물을 다음과 같이 제조한다 : 1ml의 배양물을 5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 L 육즙에서 A₅₅₀치가 약 1.0이 될 때까지 성장시킨 후 5㎍/ml의 테트라사이클린을 함유하는 M9 배지 25ml에 희석시킨다. A₅₅₀이 1.0이 되면⁸

표 1에 밝혀진 바와 같이 trp 프로모터가 목적한 방향으로 삽입된 클론 pLeIF A trp 25는 고활성도(2.5×10⁸단위/ℓ)를 나타낸다. 표 2에 밝혀진 바와 같이 이·콜리 K-12 균주 294/pLeIF A trp 25에 의해 제조된 IF는 실제의 인체 LeIF처럼 작용하고 ; 이는 pH2에서 처리시 안정하고 토끼의 항-인체백혈구 항체로 중화시킨다. 인터페론은 약 20,000의 겉보기 분자량을 갖는다.

인터페론이 생체내에서 활성화되기 위해서는 거대세포와 천연식(natural killer : NK) 세포가 존재해야하고 생체내 작용 기전이 이들 세포를 자극시키도록 나타나야 한다. 따라서 이·콜리 294/pLeIF A 25에 의해 생성된 인터페론이 세포 배양 분석법에서는 항바이러스 활성을 지니나 감염 동물에서는 활성을 나타내지 않을 수 있다. 또한 박테리아에 의해 제조된 비-글리코실화 LeIF A의 생체내 항바이러스 활성은 인체 "연막(buffy coat)" 백혈구에서 유도된 글리코실화 LeIF와는 상이할 수 있다. 따라서 박테리아에 의해 합성된 LeIF A (2% 순도)의 생물학적 활성은 스퀴럴(squirrel) 원숭이의 치명적 뇌심근염(EMC) 바이러스 감염 중에서 연막

[표 1]

이·콜리 추출물의 인터페론 활성도

[표 2]

이·콜리 294/pLeIF A 25에서의 추출물과 표준 LeIF*의 비교 활성도

*표 1에 기술된 이·콜리 294/pLeIF A trp 25의 추출물 250,000단위/ml를, 500단위/ml의 비활성도를 제공하는 최소 필수 배지로 500배 희석시킨다. NIH 백혈구 인터페론 표준물에 대해 미리 적정시킨 백혈구 인터페론 표준물(Wadley Institute)을 희석시켜 최종 농도를 500U/ml로 만든다. 1ml 분취량을 1NHCl로 pH2로 조정하고 4℃에서 52시간 동안 배양하고 NaOH를 가하여 중화시킨 후 표준 CPE 억제 분석법에 의해 IF 활성도를 측정한다. 500단위/ml 시료(비처리된)의 25㎕ 분취량을 토끼의 항-인체 백혈구 인터페론 25㎕와 37℃에서 60분간 배양하고 12,000×g 속도로 5분간 원심분리시킨 후 상등액을 분석한다.

[표 3]

스퀴럴 원숭이의 EMC 바이러스 감염증에 대한 여러 LeIF 제제의 항 바이러스효과

모든 원숭이는 수컷(평균 체중 713g)이고 감염전에 EMC 바이러스 항체를 갖지 않은 것이다. 원숭이를 100×LD₅₀EMC 바이러스(마우스에서 측정된)로 근육내 감염시킨다. 대조군 원숭이는 감염 후 134, 158 및 164시간에 사망하였다. 16⁶단위의 인터페론 처리는 감염시키기 4시간 전 및 감염시키기 2,23,29,48,72,168 및 240시간에 정맥내 투여로 수행한다. 박테리아 백혈구 인터페론은 7.4×10⁶단위/㎎ 단백질의 비활성도에서 이·콜리 294/pLeIF A 25 용해물로부터의 컬럼크로마토그라피 분획물이다. 대조군 박테리아 단백질은 2배의 총 단백질 농도에서 이·콜리 294/pBR 322 용해물로부터의 컬럼 분획물이다. 백혈구 인터페론 표준물은 정상인체 "연막" 세포로부터의 센다이 바이러스 유도 인터페론으로 32×10⁶단위/㎎ 단백질의 비활성도를 갖도록 크로마토그라피로 정제시킨다.

대조군 원숭이는 사망전 8시간 경에 점차적으로 기면, 평형감각상실, 뒷다리의 이완성 마비 및 안루 등을 나타낸다. 인터페론 처리된 원숭이는 이들 비정상적

J. 추가의 백혈구 인터페론 제조용 cDNA의 분리

완전히 특징지워진 LeIF A cDNA-함유 플라스미드로부터 얻어진 DNA를 PstⅠ로 절단하고 전기영동으로 분리시킨 후 32P로 표지시킨다. 수득되는 방사선-표지된 DNA를 프로우브로 사용하여, 상기 C에서와 같이 제조된 추가의 이·콜리 294 형질전환체를 그룬스타인 및 호그네스의 동일 반응계내 콜로니 선별 공정(상기 참조)에 의해 선별한다. 프로우브와 여러 변화량으로 하이브리드화된 콜로니를 분리시킨다. 이들 콜로니로부터 수득한 플라스미드 DNA와 상기 G에서 명명된 10개의 하이브리드화 콜로니를 PstⅠ절단으로 분리시키고 3가지의 상이한 방법에 의해 특징지운다. 첫째, 이들 PstⅠ단편을 BglⅡ, PvuⅡ 및 EcoRI 효소에 의한 제한 엔도뉴클레아제 소화 패턴으로 특징지운다. 상기 분석법으로 제5도에 나타낸 적어도 8개의 상이한 타입(LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G 및 LeIF H)으로 분류되며, 이는 LeIF A의 공지된 전서열(presequence) 및 코드화 서열에 대한 여러

둘째, 하기 문헌에 기술된 하이브리드화 선별 분석법에 의해 특정의 DNA가 폴리-A 함유 KG-1 세포 DNA로부터 LeIF mRNA를 선택적으로 제거시킬 수 있는가를 시험한다.(참조 : Cleveland et al., Cell 20, 95-105(1980)). LeIF A,B,C 및 F는 상기 시험 결과 양성이었다.

셋째, Pst 단편을 발현 플라스미드내에 삽입시키고 이·콜리 294를 플라스미드로 형질환시킨 후 상기 단편들을 발현시킨다. 프리(pre)-인터페론으로 여겨지는 발현 생성물은 인터페론 활성에 대한 CPE분석 결과 모두 양성을 나타냈으나, LeIF F 단편의 경우에는 활성이 제한적이었다. 상기한 바 이외에 기술된 LeIF 타입 모두를 서열화했다.

K. 2차 성숙 백혈구 인터페론(LeIF B)의 직접 발현

성숙 LeIF B 유전자를 함유하는 분리 단편의 서열은 타입 A와 B의 전반 14의 뉴클레오타이드가 동일함을 나타냈다. 따라서 trp-프로모터-오퍼레이터, 리보솜 결합 부위 및 LeIF A(=B) 개시 유전자를 함유하는 pLeIF A 25로부터 수득된 단편을 분리시키고, 발현된 플라스미드의 B 서열 중 잔류 부분과 결합시킨다. pL 4(제5도에 표시된 LeIF B Pst-말단 유전자를 함유하는 플라스미드) 및 pLeIF A 25의 Pst 단편에 대한 돌출 제한지도를 각기 제7a 및 7b도에 표시하였다.

제7a도에 표시된 서열로부터 약 950b.p.의 Sau 3a 내지 PstⅠ단편을 얻기 위해서는 1개 이상의 인터비닝(intervening) Sau 3a 제한 부위가 존재하므로 하기 한

1. 하기 단편을 분리시킨다 :

a) Sau 3a에서 EcoRI까지의 110b.p.

b) EcoRI에서 Xba까지의 132b.p.

c) Xba에서 Pst까지의

700b.p.

2. 단편(1a)와 (1b)를 리게이션시키고 Xba 및 BglⅡ로 절단하여 Sau 3a 및 Xba 말단을 통한 자기 중합을 배제시킨다(관련 Sau 3a 부위는 BglⅡ 부위내에 존재하고 ; BglⅡ를 절단하여 Sau 3a 점착성 말단을 남긴다). 242b.p. 단편을 분리시킨다.

3. (2) 및 (1c)의 생성물을 리게이션시키고 재차 자기 중합을 방지하기 위해서 Pst 및 BglⅡ로 절단한다. 제7a도에서의 Sau 3a에서 PstⅠ까지의 약 950b.p.를 분리시킨다. 이 단편은 LeIF A과 공통되지 않는 LeIF B 유전자 부분으로 구성된다.

4. LeIF A의 trp 프로모터-오퍼레이터, 리보솜 결합 부위, ATG 출발 시그날 및 시스테인 코돈으로 구성되는 약 300b.p. 단편(HindⅢ에서 Sau 3a까지)을 pLeIF 25로부터 분리시킨다.

5. PstⅠ에서 HindⅢ까지의 약 3,600b.p. 단편을 pBR322로부터 분리시킨다. 이는 레플리콘 및 코드화 테트라사이클린으로 구성되나 암피실린 내성은 아니다.

6. 단계 3,4 및 5에서 수득된 단편을 3중 리게이션시키고 수득되는 플라스미드를 이·콜리 K-12 균주 294로 형질전환시킨다.

형질전환체를 최소 선별하고(참조 : Birnboim et al., Nucleic Acids Res.7,

CPE분석법에 따르면, 클론으로부터의 박테리아 추출물은 상기 대표적 분석법으로 A₅₅₀=1에서 ℓ당 약 10×10⁶단위의 인터페론 활성을 나타냈다. 상기 방법에 의해 제조된 1개의 대표적 클론은 이·콜리 294/pLeIF B trp 7이다.

L. 또 다른 성숙 백혈구 인터페론 (LeIF C,D,F,H,I 및 J)의 직접 발현

기타의 LeIF 타입으로 구성되는 추가의 전장 유전자단편을 LeIF A의 경우에서와 같이 테일링시키고 발현 비히클증에 들 수 있다. 통상적 방법에 의한 완전 서열화로부터, 상기 H에서 사용된 방법에 의해 성숙 LeIF A를 발현할 수 있도록 제한 부위가 성숙 인터페론의 첫째 아미노산 코돈에 충분히 가까이 있는지를 알 수 있고, 이는 즉, 제한 절단으로 전서열을 제거시키고 합성 DNA 단편을 리게이션시켜 소실된 N-말단 아미노산 코돈으로 대치하는 것이다. 이와 달리 다음 방법을 사용할 수 있다. 즉, 성숙 폴리펩타이드의 첫째 아미노산 코돈이 시작하는 지점 직전에서 전서열 함유 단편을 다음과 같이 분해시킨다.

1. 상기 지점 주위의 영역에서 이중 나선 DNA를 단일 나선 DNA로 환전시키고 ;

2. 단계(a)에서 형성된 단일 나선영역에 단일 나선 DNA의 상보성 프라이머를

3. 아데닌, 티민, 구아닌 및 사이토신-함유 데옥시뉴클레오-타이드 트리포스페이트 존재하에 DNA 폴리머라제와 반응시켜 프라이머로부터 3' 방향에 위치하는 단계 1에서 제거된 2번째 나선 부분을 회복시키고

4. 목적한 분해 지점 뒤쪽에 뻗어 있는 잔류의 단일 나선 DNA를 소화시킨다.

코드화 나선의 3' 말단에서 종료되는 단선의 합성 DNA는 번역 출발 시그날 ATG와 예를 들어 성숙 인터페론에 대하여 수득되는 테일링 된 유전자에 평활 말단 리게이션시킴으로써 리게이션시킬 수 있고, 상기 유전자를 발현 플라스미드내에 삽입시키고 프로포터 및 관련 리보솜 결합 부위 통제하에 둔다.

상기 K에서 사용된 방법과 유사한 방법에 따라 LeIF C 및 LeIF D를 코드화하는 유전자 단편을 적절히 배열시켜 직접 박테리아 발현이 일어나도록 한다. 이들 추가의 백혈구 인터페론의 발현 방법은 각 경우에 pLeIF A 25로부터 LeIF A trp 프로모터-오퍼레이터, 리보솜 결합부위, ATG 출발 시그날 및 시스테인 코돈으로 구성되는 약 300b.p. 단편(HindⅢ에서 Sau 3a까지)으로 재분류시키는 것이다. 여기에 모든 인터페론에 공통되는 개시 시스테인 뒤의 각 아미노산 서열을 코드화 하는 추가의 인터페론 유전자로 부터 수득된 유전자단편을 결합시킨다. 각기 수득되는 플라스미드를 사용하여 이·콜리 K-12 균주 294를 형질전환시킨다. 각 유전자를 형성시키는 리게이션은 다음과 같이 수행된다.

LeIF C

pLeIF C로부터 하기 단편을 분리시킨다 :

(a) Sau 3a에서 Sau 96까지의 35b.p.

(b) Sau 96에서 PstⅠ까지의

900b.p.

(c) 상기 K(4)에서와 같이 pLeIF A-25로부터 약 300b.p. 단편(HindⅢ - Sau 3a) 분리.

(d) 상기 K(S)의 약 3,600b.p. 단편 분리.

제조 :

(1) (a)와 (c)를 리게이션시킨다. BglⅡ, HindⅢ으로 분해하고 약 335b.p. 생성물을 분리시킨다.

(2) (1)+(b)+(d)로 3중 리게이션시키고 수득되는 플라스미드로 이·콜리를 형질전환시킨다.

상기방법으로 제조된 대표적 클론은 이·콜리 K-12 균주 294/pLeIF C trp 35이다.

LeIF D

pLeIF D로부터의 분리물 :

(a) Sau 3a에서 AvaⅡ까지의 35b.p.

(b) AvaⅡ에서 BglⅡ까지의 150b.p.

(c) BglⅡ에서 PstⅠ까지의

700b.p.

pLeIF A 25부터의 분리물 :

(d) HindⅢ에서 Sau 3a까지의 300b.p. pBR 322로부터의 분리물

(e) HindⅢ에서 PstⅠ까지의 약 3,600b.p.

제조 :

(1) (a)+(b)로 리게이션시키고, BglⅡ로 절단시킨 후 185b.p. 생성물(1)을 정제한다.

(2) (1)+(d)로 리게이션시키고 HindⅢ, BglⅡ로 절단하여 약 500b.p. 생성물 (2)를 정제한다.

(3) (2)+(c)+(e)로 리게이션시키고 수득되는 플라스미드로 이·콜리를 형질전환시킨다.

상기 방법으로 제조된 대표적 클론은 이·콜리 K-12 균주 294/pLeIF D trp11이다.

LeIF F

LeIF F-함유 단편은 직접 발현하도록 LeIF B 및 LeIF F의 아미노산 1 내지 13의 완전 상등으로 쉽게 이루어진 제조합을 통해서 테일링시킬 수 있다. 적절히 배열된 말단을 갖는 trp 프로모터-함유 단편(a)는, 상기한 pHGH 207로부터 PstⅠ및 XbaⅠ소화시킨 후 억 1,050b.p. 단편을 분리시킴으로써 수득된다. 두번째 단편(b)는 플라스미드 pHKY 10의 PstⅠ및 BglⅡ 소화로부터 수득되는 더 큰 단편으로 수득한다. 단편(a)는 악피실린 내성을 코드화하는 유전자 약 반을 함유하고 단편(b)는 상기 유전자의 나머지 및 관련 프로모터가 결여된 테트라사이클린 내성의 전체 유전자를 함유한다. 단편(a) 및 (b)는 T₄리가제로 결합시키고 생성물은 XbaⅠ및 BglⅡ로 처리하여 이합체화를 방지시켜 trp 프로모터-오퍼레이터 및 테트라사이클린 및 암피실린 내성 유전자로 구성되는 단편(c)를 형성시킨다.

약 580b.p.의 단편 (d)는 pLeIF F의 AvaⅡ 및 BglⅡ 소화로 수득한다. 이는 LeIF F의 아미노산 14 내지 166의 코돈으로 구성된다.

단편(e) (49b.p.)는 pLeIF B의 XbaⅠ및 AvaⅡ 소화로 수득한다. 단편(e)는 LeIF F의 아미노산 1 내지 13을 코드화한다.

단편 (c),(d) 및 (e)를 T₄리가제 존재하에 3중 리게이션시킨다. 각 단편의 점성 말단은 복합 플라스미드가 정확히 회전하여 trp 프로모터-오퍼레이터 조절하에 테트라사이클린 내성유전자를 성숙 LeIF F 유전자와 함께 도입되도록 하고 목적한 플라스미드로 형질 전환된 박테리아가 테트라사이클린-함유 판상에서 선택될 수 있도록 한다. 상기 방법으로 제조된 대표적 클론은 이·콜리 K-12 균주 294/pLeIF F trp 1이다.

LeIF H

성숙 백혈구 인터페론으로 발현시키기 위해서 완전 LeIF H 유전자를 다음과 같이 배열할 수 있다 :

1. 플라스미드 pLeIF H를 HaeⅡ 및 RsaⅠ소화시키고 시그날 펩타이드 아미노산 10에서 3' 비코드화 영역까지의 816b.p. 단편을 분리시킨다.

2. 상기 단편을 변질시키고, 합성 데옥시리브올리고 뉴클레오타이드 프라이머 5'-dATG, TGT, AAT, CTG, TCT를 사용하여 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 클레나우 단편으로 회복 합성한다(참조 : Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 65, 168(1970)).

3. 수득되는 생성물을 Sau 3a로 분해시키고 아미노산 1 내지 150의 452b.p. 단편을 분리시킨다.

4. pLeIF H의 Sau 3a 및 PstⅠ소화와 수득되는 500b.p. 단편의 분리로 코드화 서열의 말단을 통해서 아미노산 150을 코드화하는 유전자가 수득된다.

5. 단계(3)과 (4)에서 분리된 단편을 리게이션시켜 LeIF H의 166 아미노산을 코드화하는 하기 단편을 형성시킨다.

1 166

met cys asp 정지

ATG TGT… + …GAT TGA-…-PstI

6. pLeIF A trp 25를 XbaⅠ로 소화시키고 DNA 폴리머라제 Ⅰ로 평활말단시킨 후 생성물을 PstⅠ로 소화시킨다. 수득되는 큰 단편을 분리시키고 단계(5)의 생성물과 리게이션시켜 이·콜리 K-12 균주 294 또는 기타의 숙주 박테리아의 형질전환시 성숙 LeIF H를 발현시킬 수 있는 발현 플라스미드를 형성시킬 수 있다.

LeIF I

하기 문헌에 의해서 구성된 인체 제놈의 파아지入 샤론(Charon) 4A 제조합군에서(참조 : Lawn et al., Cell 15, 1157(1978) 하기 문헌에 기술된 방법에 의해서 백혈구 인터페론 유전자를 선별한다(참조 : Lawn et al.,(상기 참조) 및 Maniatis et al., Cell 15, 687(1978)). cDNA 클론 LeIF A로부터 유도된 방사성 LeIF 프로우브를 사용하여 약 500,000반점을 선별한다. 상기 선별로부터 6개의 LeIF 제놈 클론이 수득된다. 재선별 및 반점 정제를 수행하고 이들 클론중 한 개인入 HLeIF2를 취

상기한 방법을 사용하여 다른 프로우브를 인체 제놈으로부터 추가의 LeIF 클론을 분리시키는데 유리하게 사용할 수 있다. 이들도 또한 본 발명에 따른 추가의 백혈구 인터페론 단백질 제조에 이용될 수 있다.

1. 클론 LeIF2의 2,000b.p. EcoRI 단편을 pBR 325의 EcoRI 부위에 서브클로닝시킨다. 수득되는 플라스미드 LeIF 을 EcoRI로 분해시키고 2,000b.p. 단편을 분리한다. 데옥시올리고뉴클레오타이드 dAATTCTGCAG(EcoRI-PstⅠ전환체)를 2,000b.p. EcoRI 단편에 리게이션시키고 수득되는 생성물을 PstⅠ로 분해하여 PstⅠ말단을 함유하는 2,000b.p. 단편을 수득한다. 이를 Sau 96으로 분해하여 1개의 PstⅠ말단 및 1개의 Sau 96 말단을 지닌 1,100b.p. 단편을 분리시킨다.

2. 플라스미드 pLeIF C trp 35를 PstⅠ및 XbaⅠ로 소화시킨다. 큰 단편을 분리시킨다.

3. pLeIF C trp 35에서 수득한 작은 XbaⅠ- PstⅠ단편을 XbaⅠ및 Sau 96으로 소화시킨다. 40b.p. XbaⅠ- Sau 96 단편을 분리시킨다.

4. 단계 (1),(2) 및 (3)에서 분리시킨 단편을 리게이션시켜 발현 플라스미드 pLeIFⅠtrp 1을 형성시킨다.

LeIF J

1. 플라스미드 pLeIF J는 LeIF J 유전자 서열을 포함하는 인체 제놈 DNA의 3.8킬로베이스(Kilobase) HindⅢ 단편을 함유한다. 이 플라스미드로부터 760b.p. DdeⅠ- Psa 단편을 분리시킨다.

2. 플라스미드 LeIF B trp 7을 HindⅢ 및 DdeⅠ로 분해시키고 340b.p. HindⅢ-DdeⅠ단편을 분리시킨다.

3. 플라스미드 pBR 322를 PstⅠ로 분해시키고 DNA 플리머라제 Ⅰ(클레나우 단편)과 배양시켜 평활말단화시킨 후, HindⅢ으로 소화시킨다. 큰(~3,600b.p.) 단편을 분리시킨다.

4. 단계 (1)(2) 및 (3)에서 분리된 단편들을 리게이션시켜 발현 플라스미드 pLeIF Jtrp 1을 형성시킨다.

M. 정제

박테리아 추출물 중 백혈구 인터페론 함량은 다음과 같은 과정을 연속적으로 수행하여 보강할 수 있다 :

1. 폴리에틸렌-이미 침전, 이때 인터페론을 포함하는 세포상 단백질 대부분이 상등액에 남는다.

2. 황산 암모늄 분획화, 이때 인터포론은 55% 황산 암모늄 포화 용액에서 분획화 된다.

3. 0.06M 인산 칼륨, 10mM 트리스-HCl, pH7.2 중 상기 황산 암모늄 펠렛의 현탁액을 25mM 트리스 HCl, pH7.9에 투석시킨다(인터페론 활성은 용액에 남는다).

4. 상기 상등액을 pH8.5로 조절하고 DEAE-셀룰로즈 컬럼상에서 크로마토그라피한다(선형구배의 25mM 트리스-HCl 중 0 내지 0.2M NaCl(pH8.5)로 용출).

5. 시바크롬 블루-아가로즈(Cibachrome Blue-Agarose) 또는 하이드록실-아파라이트상에 흡수시키고 각기 1.5M KCl 또는 0.2M 포스페이트 용액으로 용출시킨다(

6. 세파덱스^RG-75 칼럼상에서 분자 크기에 따라 분류한다.

7. 25mM 초산 암모늄(pH5.0) 중 CM-셀룰로즈상에서 양이온 교환 크로마토그라피하고 초산 암모늄 구배(0.2M까지의 초산 암모늄)로 전개시킨다.

상기 과정으로부터 순도 95% 이상의 물질을 수득한다.

이 물질은 또한 크기 선별(Size exclusion) 크로마토그라피, 역상(RP-8) 고압 액체크로마토그라피 또는 고정화 항인터페론 항체상의 친화성 크로마토그라피로 정제할 수도 있다.

이와 달리, 상기 단계 4의 물질을 하기 문헌에 기술된 방법으로 제조된 모노클로날 항체칼럼상에 넣고, 0.2M 아세트산, 0.1% 트리톤 및 0.15M NaCl로 용출시킬 수 있다(참조 : Milstein, Scientific American : 243, 66(1980)).

또한 바람직하게는 상기 과정에 의해 제조된 백혈구 인터페론을 다음 단계에 의해 정제한다.

1. 상기 발현된 백혈구 인터페론을 함유하는 동결된 세포 펠렛을 손이나 적절한 분쇄장치로 분쇄한다. 부분적으로 녹은 세포를 pH7.5 내지 8.0의 0.1M 트리스, 10%(W/V) 슈크로즈, 0.2M NaCl, 5mM EDTA, 0.1mM PMSF 및 10 내지 100mM MgCl₂를 함유하는 4용량의 완충액 A에 현탁시킨다.

이 현탁액을 약 6000psi에서 균질화기를 통과시킨 후, 1000psi 미만에서 이차 통과시킨다. 2회 통과에 의해 균질화기로부터의 유출물을 빙욕 중에서 냉각시킨

2. 균질화물에 폴리에틸렌-이민을 약 0.35% 농도로 서서히 첨가하고 약 30분간 방치한다. 원심분리 또는 여과에 의해 고체를 제거한다. 이 단계는 온도를 조절하여 수행하거나, 상등액(여액)의 온도가 10℃ 미만으로 유지될 수 있도록 충분히 신속하게 수행한다. 상등액(여액)은 한외여과하여 원래 용량의 약 1/10로 농축시킨다. 잔류액내의 입상물질이나 운무상 물질은 미세다공성 막과 같은 적절한 여과기로 제거한다.

3. 상기 정화된 용액을 모노클로날 항체 칼럼상에 5 내지 8cm/시간의 유속으로(즉, 2.6cm 직경 칼럼에 25 내지 40ml/시간) 직접 넣는다. 이어서 이 칼럼을 NaCl(0.5M) 및 트리톤Triton) X-100(0.2%) 또는 등가물과 같은 계면활성제를 함유하는 약 10칼럼 용량의 25mM 트리스-HCl(pH7.5 내지 8.5)로 세척한 후 0.15M NaCl 및 트리톤 X-100(0.1%) 또는 등가물과 같은 계면활성제를 함유하는 약 10칼럼 용량의 용액으로 세정한다. 이 칼럼을 트리톤 X-100(0.1%) 또는 등가물과 같은 계면활성제를 함유하는 0.2M 아세트산으로 용출시킨다. 모노클로날 항체 칼럼에서 수득된 단백질 피크(UV 흡광기 또는 기타 편리한 분석법으로 추정) 분획을 모으고 1N NaOH 또는 1.0M 트리스 염기를 사용하여 pH를 약 4.5로 조정한다.

4. 합한 인터페론 피크분획을 pH4.5 초산 암모늄(50mM)과 같은 적절한 완충액으로 평형화한, 와트만(Whatman) CM 52 셀룰로즈 또는 등가물과 같은 양이온 교환기에 넣는다. 이어서 칼럼을 평형화 완충액으로 유출물의 UV 흡광도가 더 피크를 나타내지 않을 때까지 세척하여 칼럼으로부터 소량의 나머지 단백질을 모두 용출시

상기 바람직한 실시 양태에서 사용된 모노클로날 항체는 하기 문헌에 기술된 방법으로 제조할 수 있다(참조 : Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1848~52(1981)). 모노클로날 항체는 다음과 같이 정제하고 에피겔(Affigel)-10에 공유결합시킨다.

복수(腹水)로부터의 모노클로날 항체 제조 및 정제

5마리의 암컷 밸브 (Balb)/C 마우스에게 각기 5 내지 10×10⁶개의 중간 대수기 하이브리도마 세포를 접종한다. 복수종이 있는 마우스로부터 수득한 생윽성 세포 5×10⁶개를 10마리 이상의 마우스에게 복강내 접종한다. 각 마우스로부터 복수를 반복(2 내지 4회) 채취한다. 이러한 전이 및 채취과정을 마우스 한 군에서 다른 군으로 연속적으로 3회 수행할 수 있다. 각 전이시에 채취한 복수를 모은다.

이 복수를 15분간 저속 원심분리시켜(500 내지 1000×g) 세포 및 오물을 제거한다. 이어서 18,000rpm으로 90분간 원심분리시킨다. 상등액은 동결시켜 -20℃에서 보관한다. 이것을 녹인 후, 35,000rpm으로 90분간 원심분리시켜 기타 섬유소 및 입상물질을 제거한다. 각 전이시에 채취한 복수의 배치를 고체상 항체-결합분석법(참조 : Staehelin et al., 상기 참조)에 의해 특이적 항체 활성도를 측정하고 결과가 만족스러우면 이를 모은다.

모은 용액 중의 단백질 농도는 근사치로서, 1mg의 단백질이 통과 길이 1.0cm의 흡수관(cuvette)에서, 280nm에서 1.2의 흡수도를 나타내는 것으로 평가된다. 고농도의 항체를 함유한 복수는 ml당 30 내지 85mg의 단백질을 함유한다. 이것은 ml당 4내지 7mg의 특이적 항체를 함유하는 것과 같다. 이 복수를 PBS(0.01M 인산나트륨, pH7.3, 0.15M NaCl)로 희석시켜 단백질 농도를 10 내지 12㎎/ml로 만든다.

희석용액 각 100ml에 90ml의 실온 황산암모늄 포화용액을 -0℃에서 진탕시키면서 서서히 첨가한다. 이 현탁액을 얼음 중에서 40 내지 60분간 보관한 후, 10,000rpm으로 4℃에서 15분간 원심분리시킨다. 상등액을 경사시키고 잘 배수시킨다. 이 단백질 펠렛을 0.02M의 트리스-HCl(pH7.9)/0.04M의 NaCl(완충액Ⅰ)에 용해시킨다. 이 단백질 용액을 실온에서 100 용량의 완충액 Ⅰ에 대하여 16 내지 18시간 동안, 완충액을 적어도 1회 교환하여 투석시킨다. 이 투석된 용액을 15,000rpm에서 10분간 원심분리시켜 미용해 물질을 제거한다. 복수중의 원래 총 단백질 분량의 30 내지 35%를 회수하고 이는 280nm에서 흡수를 나타낸다. 1ml당 30 내지 40mg의 단백질을 함유하는 용액을, 완충액 Ⅰ로 평형화시킨 DEAE-셀룰로즈 칼럼에 넣는다. 이 단백질 g당 적어도 100ml의 칼럼상(bed) 용량을 사용한다. 0.02M 트리스-HCl(pH7.9) 및 0.04M 내지 0.5M NaCl을 함유하는 선형 NaCl 구배를 사용하여 칼럼으로부터 항체를 용출시킨다. 0.06M 내지 0.1M NaCl로 용출시켜 모은 피크 분획을 동용량의 실온 포화 황산암모늄으로 침전시켜 농축시키고 원심분리한다. 이 단백질 펠렛을 0.2M NaHCO₃(pH 약 8.0)/0.3M NaCl(완충액 Ⅱ)에 용해시킨 후, 실온에서 동

면역흡착제의 의조

애피겔-10 (BioRad Laboratories, Richmond California)를 소결 유리 필터상에서 빙냉 이소프로판올로 3회 세척한 후 빙냉 증류수로 3회 세척한다. 이 겔상 슬러리(냉수중 약 50%)를 플라스틱 튜브에 옮기고 잠시 원심분리시켜 침전시킨다. 상등액을 흡인시킨다. 충진 겔을 동용량의 정제된 항체 용액과 혼합시키고 4℃에서 5시간 동안 회전시킨다. 반응시킨 후에 겔을 원심분리하고 완충액 Ⅲ(0.1M NaHCO₃/0.15M NaCl)으로 2회 세척하여 커플링되지 않은 항체를 제거한다. 합한 세척물을 단백질 측정하면 90% 이상의 항체가 겔에 커플링되었음을 알 수 있다.

미반응 부위를 차단하기 위해서 상기 겔을 동용량의 0.1M 에탄올아민·HCl(pH8)과 혼합시키고 실온에서 60분간 회전시킨다. 이 겔 슬러리를 PBS로 세척하여 반응물을 제거하고 0.02%(W/V)의 나트륨아지드 존재하에 4℃에서 PBS 중에서 보관한다.

N. 비경구 투여

LeIF는 항종양 또는 항바이러스 치료가 요구되는 환자 및 면역억제 상태를 나타내는 환자에게 비경구투여 할 수 있다. 투여용량 및 속도는 인체유도 물질의 임상 연구에서 통상 사용하는 용량, 예를 들어 1일 약(1 내지 10)×10⁶단위이고,⁷

거의 균질한 박테리아 LeIF의 비경기투여 형태로서 적절한 투여 형태의 한 예로서, 특이적 활성도의 3mg LeIF, 즉 2×10⁸단위/mg을 25ml의 5N 인체 혈청 알부민에 용해시키고 이 용액을 박테리아 여과기를 통과시키고 여과된 용액을 무균 상태에서 100개의 바이알에 나누어 담아, 각 바이알에 비경구투여에 적절한 6×10⁶단위의 순수 인터페론이 함유되도록 한 것이다. 이 바이알은 사용전에 냉소(-20℃)에 보관하는 것이 좋다.

본 발명의 화합물은 약제학적으로 유용한 조성물을 제조하는 공지 방법에 의해, 상기 폴리펩타이드를 약제학적으로 무독한 담체 비히클과 혼합하여 제형화 할 수 있다. 적절한 비히클 및 그 제제는 본문에 참조로 들어 있는 하기 문헌에 기술되어 있다(참조 : Remington's Pharmaceutical Sciences by E.W.Martin).

상기 조성물은 숙주에의 효과적 투여에 적절한 약제학적으로 무독한 조성물을 제조하기 위해서 본 발명의 인터페론 단백질 유효량과 적절한 분량의 비히클을 함유할 것이다. 바람직한 투여경로는 비경구투여이다.

Claims (1)

1. 글리코실화되지 않고 어떤 전서열도 수반하지 않는 인체 백혈구 인터페론 A,B,C,D,E,F,H,I 및 J로 이루어진 그룹 중에서 선택된 성숙 인체 백혈구 인터페론을 코드화한 이중 나선 DNA 서열을 플라스미드 내에 삽입시키고, 이 서열을 트립토판 프로모터와 작동적으로 연결시킴을 특징으로 하여 형질전환체 대장균중에서 글리코실화 되지 않고 어떤 전서열도 수반하지 않는 인체 백혈구 인터페론 A,B,C,D,E,F,H,I 및 J로 이루어진 그룹 중에서 선택된 성숙 인체 백혈구 인터페론을 발현시킬 수 있는 플라스미드를 제조하는 방법.

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