NO164178B - Plasmid som koder for et ferdigutviklet human leukocyttinterferon. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører plasmider som koder for et ferdigutviklet human leukocyttinterferon, hvorav aminosyresekvensen til dette interferon innbefatter partiellsekvensen

Humant leukocyttinterferon (LelF) ble først oppdaget og frem-

stilt i form av me^et urene fellinger av Isaacs and Lindenmann (Proe. R. Soc. B 147, 258-267 [1957]; U.S.P. 3.699.222).

Forsøk på å rense og karakterisere materialet har pågått

siden den gang, og har ført til fremstilling av relativt homogene leukocyttinterferoner som stammer fra normale eller leukemiske donatorers leukocytter (DOS nr. 2.947.134).

Disse interferoner er en proteinfamilie som er kjent for å

ha den egenskap at de bringer sine målceller i en virus-

resistent tilstand. Dertil kan interferon forhindre celle-

deling og modulere immunitetsreaksjon. Disse egenskaper har forårsaket klinisk bruk av leukocyttinterferon som et terapeutisk middel for behandling av virusinfeksjoner og sykdommer.

Leukocyttinterferoner har blitt renset til hovedsakelig

homogenitet (Rubinstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA

76, 640-644 [1979]; Zoon et al., ibid. 76, 5601-5605 [1979],

og er rapportert å ha molekylvektsområde fra ca. 17 500 til 21 000. Den spesifikke aktiviteten til disse preparatene

8 9

er bemerkelsesverdig høy, 2 x 10 til 1 x 10 enheter/mg

protein, men utbytter fra cellekulturmetoder har vært skuff-ende lave.; Ikke desto mindre har fremskritt i proteinsek-vensteknikker muliggjort bestemmelsen av partielle aminosyresekvenser (Zoon et al., Science 207, 527 [1980]; Levy et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 77» 5102-5104 [1980]). Klarleggelsen av glykosyleringen til forskjellige leukocytt-interf eroner er ennå ikke fullstendig, men det er nå klart at forskjeller.i glykocyleringen blant medlemmer av famili-

en ikke alene er ansvarlig for molekylvektsspekteret som er observert. I stedet varierer leukocyttinterferoner markert i aminosyresammensetning og sekvens, og aminosyrehomologi er i noen tilfeller mindre enn 80 %.

Selv om isolering fra donatorleukocytter har gitt tilstrekkelig materiale for partial karakterisering og begrensede kliniske studier med homogent leukocyttinterferon, er det en helt uegnet kilde for de mengder av interferon som trengs for kliniske forsøk i stor skala og dessuten for bred skala profylak-tisk og/eller terapeutisk anvendelse. Faktisk har tidligere kliniske undersøkelser som anvendte humant leukocytt-avledede interferoner i antitumor- og antivirusforsøk i første rekke vært begrenset til urene (<1 prosent rene) preparater av materialet, og lange fremstillingstider for tilstrekkelige mengder, også på urealistiske prisnivåer, har forsinket kritisk undersøkelsene på en utvidet front.

Med ankomsten av rekombinant DNA-teknologi har imidlertid kontrollert mikrobiell fremstilling av et enormt utvalg nyttige polypeptider blitt mulig. Under kontroll modifiseres bakterier allerede gjennom denne teknologi til å gi produksjon av slike polypeptidprodukter som somatostatin, A-

og B-kjedene av humant insulin og humant veksthormon (Itakura et al., Science 198, 1056-1063 [1977]; Goeddel et... al., Nature 281, 544-548 [1979]). Nylig har rekombinante DNA-teknikker blitt brukt for å frembringe bakteriell produksjon av proinsulin og thymosin alfa 1 og flere forfatt-

ere har beskrevet resultater av DNA-koding for human leukocyttinterferon og resulterende proteiner med leukocyttinter-feronaktiv-i-tet (Nagata et al., Nature 284, 316-320 [1980];

Mantei et al., Gene 10, 1-10 [1980]; Taniguchi et al., Nature 285, 547-549 [1980].

Verktøyet i rekombinant DNA-teknologi er plasmidet, en ikke-kromosomal sløyfe av dobbeltkjedet DNA som finnes hos bakterier og andre mikrober, ofte i flere kopier pr. celle. Innbefattet i informasjonen som er innkodet i plasmid DNA, er den som kreves for å reprodusere plasmidet i datterceller (dvs. et "replikon") og normalt ett eller flere seleksjons-karakteristika så som, i tilfellet bakterier, motstandsevne mot antibiotika, hvilket muliggjør at kloner fra vertscellen som inneholder plasmidet av interesse gjenkjennes og fortrinnsvis dyrkes i selektivt medium. Anvendelsen av plasmidene ligger i at de kan spaltes spesifikt av en eller flere restriksjonsendonukleaser (restriksjonsenzym), som hver finner et forskjellig punkt på det plasmidiske DNA. Deretter kan heterologe gener eller genefragmenter innsettes i plasmidet gjennom endekobling på spaltningspunktet eller på rekonstruerte ender nær spaltningspunktet. DNA-rekom-binasjon utføres utenfor cellen, men det resulterende "rekombinante" plasmid kan innføres i den gjennom en prosess kjent som transformasjon og store mengder av det heterologe genholdige rekombinante plasmidet erholdes ved å dyrke transformanten, hvor genet videre er riktig innsatt i forhold til deler av plasmidet som styrer transkripsjon og overføring av det innkodede DNA budskap, kan den resulterende ekspresjonsbærer brukes for å faktisk produsere polypeptidsekvensen som det innsatte genet koder for, en prosess som kalles ekspresjon.

Ekspresjon påbegynnes i et område som er kjent som promoteren som gjenkjennes og bindes av RNA polymerase. I noen tilfeller, som ved tryptofan eller (trp) promoter, som er foretrukket i praksis i foreliggende oppfinnelse, overlappes promoterregioner av "operator"-regioner og danner en kombinert promoter-operator. Operatorer er DNA-sekvenser som gjenkjennes av såkalte repressorproteiner som tjener til å regulere frekvensen av transkripsjonsinitiering ved en spesiell promoter. Polymerasen går langs DNA'et, transkrib-erer informasjonen som ligger i sekvensen fra dens 5' til 3'-ende til. budbringer-RNA (m-RNA), hvilken igjen overføres i et polypeptid med den aminosyresekvens som DNA koder for. Hver aminosyre er kodet av en nukleotid-triplett ("kodon"). Strukturgenet er den del som koder for aminosyresekvensen til det uttrykte produkt. Etter binding til promoteren, transskriberer RNA-polymerasen først nukleotider som koder for et ribosombindings-

punkt, så en overføringspåbegynnelse eller "start"-signal (ordinært ATG, som i det resulterende budbringer RNA blir AUG), så nukleotidkodonene innenfor selve strukturgenet. Såkalte stoppkodoner transkriberes ved enden av strukturgenet ,hvoretter polymerasen kan danne en ytterligere fre-kvens av en budbringer RNA, som, p.g.a. stoffsignalets, nærvær, vil forbli uoverført av ribosomene. Ribosomer knyttes til bindingspunktet som foreligger på budbringer RNA, i bakterier normalt ettersom mRNA dannes, og produserer selv det kodede polypeptid ved å begynne, med overføringsstart signalet og ende med det forutnevnte stoppsignal. Det ønskede produkt produseres hvis sekvensene som koder .ribosom-bindingspunktet befinner seg riktig i forhold til AUG på-begynnelseskodonet og hvis alle øvrige kodoner følger be-gynnelsens kodonet i fase. Det resulterende produkt kan erholdes ved å spalte vertscellen og isolere produktet gjennom riktig rensning fra annet bakterieprotein.

Det ble bemerket at anvendelse av rekombinant DNA teknologi (dvs. innsetting av interferongener i mikrobielle ekspres-sjonsbærere og deres ekspresjon under kontroll av mikrobielle genereguleringselementer) ville være den mest effektive måte å tilveiebringe store mengder leukocyttinterferon,

hvilken, til tross for at glykosyleringskarakteristika mangler i således fremstilt materiale fra menneskekilder, kunne anvendes klinisk i behandling av et stort spektrum virus og neoplastiske sykdommer.'-

Metoden for åi.oppnå et første leukocytt gen ifølge foreliggende oppfinnelse inneholdt de følgende trinn:

(1) Partielle aminosyresekvenser fra humant leukocyttinterferon, renset frem til homogenitet,ble brukt for å konstruere sett av syntetiske DNA prøver hvis kodoner i aggregatet re-presenterte alle mulige nukleotidkombinasjoner som var i stand til å kode de partielle aminosyresekvenser. (2) Bakterielle kolonibanker ble fremstilt inneholdende komplementært DNA (cDNA) fra indusert budbringer RNA. Annet indusert mRNA som var blitt radioaktivt merket, ble hybridisert til plasmid cDNA fra denne banken. Hybridiserende mRNA ble eluert og undersøkt med hensyn til overføring til interferon i oocyttforsøk. Plasmid DNA fra kolonier som var vist å indusere interferonaktivitet på denne måten, er videre undersøkt med hensyn til hybridisering til prøver fremstilt som beskrevet i (1) ovenfor. (3) Parallelt med metoden i del (2) ovenfor, ble indusert mRNA-avledet cDNA i plasmider brukt til å danne et uavhengig forhold av transformantkolonier. Prøvene fra del (1)

ble brukt til å påvirke syntesen av radioaktivt merket enkelt kjedet cDNA for bruk som hybridiseringsundersøkel-ser. De syntetiske prøver hybridiserte med indusert mRNA som motstykke og ble utvidet ved omvendt transkripsjon til å danne indusert, radioaktivt merket cDNA. Kloner fra koloni-forrådet som hybridiserte til radioaktivt merket cDNA erholdt på denne måte, er undersøkt videre for å bekrefte tilstedeværelsen av et interferongen i full lengde..

Hvilken som helst dellengde av antatt genfragment erholdt i del (1) eller (2), kan i seg selv brukes som en undersøkelse på gen med full lengde. (4) Genet med full lengde som erholdtes ovenfor, ble sammen-satt ved bruk av syntetisk DNA slik at man unngikk enhver ledesekvens som kunne forhindre mikrobiell ekspresjon av det ferdige polypeptid og muliggjøre riktig plassering i en ekspresjonsbærer i forhold til startsignaler og ribosombind-ingspunktet for en mikrobiell promotor, uttrykt interferon ble renset til et punkt som gjorde det mulig å fastslå dets karakter og bestemme dets aktivitet. (5) Interferon-genfragmentet fremstilt på foregående måte ble i seg selv brukt i undersøkelser gjennom hybridisering av andre partielt homologe leukocyttinterferonarter.

Ved å anvende metoder for rekombinant DNA teknologi som beskrevet ovenfor, oppnås mikrobiell fremstilling i høye utbytter og renhet av familien homologe leukocyttinterferoner (uglykosylerte) som ferdige polypeptider, uten den tilsvarende forsekvens eller annen del derav. Disse interferoner ,kan uttrykkes direkte, isoleres og renses til grader som gjør dem egnet for bruk ved behandling av virus og ondartede sykdommer hos mennesker og dyr. Hittil uttrykte interferontyper har vist seg virkningsfulle i in vitro-undersøkelser og, i den første sådanne demonstra-

sjon av sitt slag, også i in vivo-forsøk, idet sistnevnte innbefatter det første ferdige leukocyttinterferon som er fremstilt mikrobielt.

Uttrykket "ferdigutviklet leukocyttinterferon" brukt i sammenheng med foreliggende søknad, angir et mikrobielt

(f.eks. bakterielt) fremstilt interferonmolekyl uten glykosylgrupper. Ferdigutviklet leukocyttinterferon uttrykkes umiddelbart fra et overføringsstartsignal (ATG) akkurat før det første aminosyrekodon av det naturlige produkt. Det "ferdige" polypeptid kan således inneholde, som første aminosyre i sekvensen, metionin (som ATG koder for)

uten særlig å endre sin karakter. På den annen side kan den mikrobielle vert få overføringsproduktet til å fjerne det første metionin. Ferdigutviklet leukocyttinterferon kunne uttrykkes sammen med et konjugert protein forskjellig fra den konvensjonelle leder, idet konjugatet spesifikt er spaltbart i et intra- eller ekstracellulært miljø (se britisk patent nr. 2 007 6 76A). Til slutt kunne det ferdigutviklete interferon fremstilles i sammenheng med et mikrobielt "signal" peptid som transporterer konjugatet til celleveggen, hvor signalet spaltes bort og det ferdige polypeptid utsondres. "Ekspresjon" av ferdig leukocyttinterferon betegner bakteriell eller annen mikrobiell produksjon av et interferonmolekyl som ikke inneholder noen glykosylgrupper

eller en forsekvens som umiddelbart henger sammen med mRNA-overføring av et humant leukocyttinterferon-genom.

Spesielle leukocyttinterferon-proteiner herav er blitt de-finert ved hjelp av fastlagt DNA gen (figur 3 og 8) og de-duktiv aminosyresekvenfastleggelse (figur 4 og 9). For disse spesielle interferoner, faktisk hele familien av leu-kocyttinterf eronproteiner omfattes herunder, eksisterer og opptrer naturlig arvemessige variasjoner fra individ til individ. Disse variasjoner kan påvises ved (en) aminosyre-forskjell(er) i den totale sekvens eller ved utelatelser, substitusjoner, innsetninger, inversjoner eller addisjoner av (en) aminosyre(r) i denne rekkefølgen. For hvert leuko-cyttinterf eronprotein herunder, angår spesielle LelF A til LelF J slike arvemessige variasjoner-

Beskrivelse av tegningene

Figur 1 angir 2 aminosyresekvenser som var, felles for alle interferonarter isolert fra humanleukocytter og renset til homogen tilstand kalt T-l og T-13. Alle potensielle mRNA-sekvenser som koder for disse peptider,er vist samt de tilsvarende DNA sekvenser. Bokstavene A, T, G, C og U betegner henholdsvis nukleotidene som inneholder basene adenin, thymin, guanin, cytosin og uracil. Bokstaven N betegner hvilket som helst av nukleotidene A, G, C og U. Polynukleo-tider er angitt lest fra 5' (venstre) i 3' (høyre) retningen, og hvor dobbeltkjedet ("d.s.") DNA er angitt, oa vice-versa for bunnen eller ikke-kodingskjeden. Figur 2 er et autoradiogram som viser hybridisering av pot-32 ensielle LelF plasmider med P-merket syntetiske deoksyoligonukleotider. Figur 3 viser nukleotidsekvensen (kodekjeder) for 8 genfragmenter isolert som kandidater for bruk i ekspresjon av leukocyttinterferoner, henholdsvis betegnet "A" til "H". ATG overførings-initieringskodonet og avslutningstripletten for hver LelF er understreket. Stoppkodonene eller avslut-ningstriplettene er etterfulgt av 3' ikke-overførte områder. Det innsatte fullstendig for LelF A mangler et kodon som finnes i de andre viste,som angitt i den tredje A linje i fig. 3. 5' ikke-overførte områder går forut for leder-sekvensene. Isolert mangler fragment E den fullstendige presekvens av leder, men inneholder det fullstendige gen for det antatte ferdige LelF E. Fragment G isolert.mangler den fulle kodesekvens. Figur 4 er en1 sammenligning av de 8 LelF proteinsekvens-cr som er bestemt fra nukleotidsekvenser. En-bokstavs-for-kortelsene som anbefales av IUPAC—IUB Commission on Biochem-ieal Nomenclature brukes: A, alanin, C, cystein, D asp-artinsyre, E, glutaminsyre, F, fenylalanin, G, glycin, H, histidin, I, isoleucin, K, lysin, L, leucin, M, metionin, N, aspargin, P, prolin, Q, glutamin, RT arginin., S, serin, T, treonin, V, valin, W, tryptofan og Y, tyrosin. Tallene referer til aminosyreposisjoner (S refererer til signalpeptid). Bindestreken i 165 aminosyre LelF A sekvensen i posisjon 44 er innført for å innrette LelF A sekvensen etter 166 aminosyresekvensen for de andre LelF'er. LelF E sekvensen ble bestemt ved å ignorere det ekstra nukleotid (posisjon 187 i fig. 3) i koderegionen. Pilen angir i-fase-avslutning av codoner. Aminosyrer felles for alle LelF'er (unntatt pseudogene LelF E) er også vist. De understrekede rester er aminosyrer som også er tilstede i human fibro-blastinterferon. Figur 5 viser restriksjonsendonukleasekart for de 8 typer LelF klonet cDNA'er (A til H). Hybrid plasmidene ble konstruert ved dC:dG konstruksjonsmetoden (Goeddel, D.V. et al, Nature 287, 411-416 [1980]. Derfor kan cDNA innsatser utføres ved bruk av Pstl. Linjene ved enden av hver cDNA innsats angir de flankerende homopolymere dC:dG haler. Posisjonene til PvuII, EcoRI og Bglll restriksjonspunkter er angitt. Skyggelagte områder i figuren representerer kodesekvenser for ferdige LelF'er, og de skraverte, områdene angir signalpeptidkodesekvenser, og det åpne området viser -

3' og 5' ikke-kodende sekvenser.

Figur 6 viser skjematisk konstruksjonen av et gen som koder for den direkte mikrobielle syntese av ferdig LelF A. Re-striks jonspunkter og rester er som vist ("Pstl", etc). Uttrykket "b.p." betegner "basepar". Figur 7 (ikke gradert) viser skjematisk et restriksjonskart av to genefragmenter anvendt i uttrykning av ferdig leukocyttinterferon LelF B. Kodonsekvensane som er angitt er kodebåndsavslutningen som følger av nedbrytning med restrik-sjonsenzymet Sau3a i de to viste tilfeller. Figur 8 og 9 gir DNA og aminosyre (se fig. 4 ovenfor med hensyn tii tilsvarende en-bokstavs-forkortelser) sekvenser for fem LelF proteiner herav, inklusive typer I og J. I fig. 9 angir stjernen en avslutningscodon i den tilsvarende DNA sekvens og bindestreken en utelatelse eller hull i sekvensen .

BESKRIVELSE AV FORETRUKNE UTFØRELSESFORMER

A. Anvendte mikroorganismer

Det heri beskrevne arbeid omfattet bruk av 2 mikroorganismer: E. coli x 1776 som beskrevet i U.S.P. 4.190.495 og E. coli K-12 stamme 294 (ende A, thi , hsr , hsm*), som beskrevet i britisk patent nr. 20 55382 A. Hver var blitt deponert hos American Type Culture Collection (ATCC nr. 31537 henholdsvis 31446). Alt rekombinant DNA arbeide ble utført i overensstemmelse med de anvendelige retningslinjer fra National Institutes of Health. ;Ved anvendelse av plasmider ifølge oppfinnelsen, hvilke plasmider er angitt i krav 1's karakteriserende del, for ekspresjon av ferdigutviklet human leukocyttinterferon, brukes fortrinnsvis E. coli, omfattende ikke bare stammene E. coli x 1776 og E. coli K-12 stamme 294 som er angitt ovenfor, men også andre kjente E. coli stammer, så som E. coli B. ;B. Kilde og rensning av LelF mRNA ;LelF mRNA kan fremstilles fra human-leukocytter, normalt sådanne fra pasienter med kronisk ryggmargsleukemi, hvilke leukocyt-ter er blitt indusert til å produseieinterf eron med Sendai eller Newcastle sykdomsvirus som beskrevet i f.eks. DOS nr. ;2947134. En særlig foretrukket kilde, og den som brukes i foreliggende arbeide, er en cellelinje kalt KG-1 fra en pasient med akutt-ryggmargsleukemi. Cellelinjen som er beskrevet av Koeffler, H.P. and Golde, D.W., Science 200, ;1153 (1978), vokser godt i et kulturmedium omfattende RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 pluss 10 % varmeinak-tivert FCS (fatalt kalveserum) , 25 mM HtiPES puffer (N-2-hydroksyetyl-piperazin-N'-2-etan-sulfonsyre) og 50 ;ug/ml gentamicin, og subkultiveres 1 til 3 evt. to ganger om uken. Celler kan fryses fra foran nevnte vekstmedium pluss 10 % dimetylsulfoksyd. KG-1 er deponert hos American Type Culture Collection (ATCC nr. CRL 8031). ;KG-1 celler ble indusert til å produsere leukocyttinterfer- ;on mRNA med Sendai eller Newcastle sykdomvirus etterfulgt ;av den metode som er beskrevet av Rubinstein et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 76, 640-644 [1979]). Celler ble ;høstet 5 timer etter induksjon og RNA ble fremstilt ved guani- ;din tiocyanat-guanidin hydroklorid-metoden (Chirgwin et al. Biochemistry 18, 5294-5299 [1979]). RNA fra ikke-induserte celler ble isolert på samme måten. Oligodeoksytymidin (dT) - cellulosekromatografi og sukrosegradient ultrasentri - fugering ble brukt for å oppnå 12S fraksjonen av poly (A) ;mRNA som beskrevet av Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. ;172, 74-89 [1976] og Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188, 98-104 [1978]). Dette mRNA'et hadde en interfer-onstyrke på 8000-10 000 enheter pr. mikrogram i Xenopus laevis oocytt-bestemmelsen (Cavalieri et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 74, 3287-3291 [1977]). ;C. Fremstilling av kolonibanker inneholdende LelF cDNA ;sekvenser ;5 mRNA ble brukt for fremstilling av dobbeltkjedet cDNA ved standardmetoder (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253. 2483-2495 [1978] og Goeddel et al., Nature 281, 544-548 ;[1979]) . cDNA ble fraksjonert etter størrelse ved elektro-. forese på en 6 % polyakrylamidgel og 230 ng materiale varierende i, størrelse fra 500 til 1500 b.p. ble isolert ved elektroeluering. En 100 ng porsjon av dette cDNA ble påhengt med deoksycytidin (dC) rester som beskrevet av Chang et al. , Nature 275. 617-624 (1978) , og ble behandlet med 470 ng plasmid pBR3 22 som var blitt påhengt deoksyguanosin (dG) rester på Pstl punktet (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 ;[1977]), og brukt for å transformere E. coli x 1776. Omtrent 130 tetracyklinresistente, ampicillinsensitive transformanter ble erholdt pr. ng cDNA. ;I et andre lignende eksperiment erholdes ca. 1000 tetracyklinresistente, ampicillinsensitive E. coli K-12 stamme 294 transformanter pr. ng cDNA. I dette, tilfelle isolertes størrelsesfraksjonert cDNA materiale varierende i størrelse fra 600 til 1300 b.p. ved elektroeluering for dC avslutning. ;D. Fremstilling av syntetiske oligonukleotider og bruk av ;disse ;Kjennskapen til aminosyresekvensen til flere tryptiske fragmenter av humant leukocyttinterferon muliggjorde konstruksjonen av syntetiske deoksyoligonukleotider som var komplementære, til forskjellige regioner hos LelF mRNA. De to tryptiske peptider Tl og T13 ble valgt fordi de hadde aminosyresekvenser som krevet syntese av bare 12 og 4 undekamerer, henholdsvis for å oppfylle alle mulige kodingssekvenser (figur 1). Fire sett deoksyoligonukleotideprøver ble synte- ;tisert for hver sekvens inneholdende enten tre (T-lA, B, C, ;D) eller en (T-13A, B, C, D) oligonukleotider hver. De angitte komplementære deoksyoligonukleotider,11 baser lange, ble syntetisert kjemisk ved fosfotriestermetoden (Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. IS, 5765-5769 [1978]). ;Fire individuelle prøver ble fremstilt i T-13-seriene. ;De tolv T-l-prøvene ble fremstilt i fire forråd på tre prøv-er som vist i fig. 1. ;De fire individuelle prøver av T-13 seriene og de tolv T-l prøver, fremstilt i fire forråd på tre primere liver, ble brukt for å prime syntesen av radioaktivt merket ■ enkeltkjedet cDNA for bruk som hybridiseringsprøver. Tilsvarende mRNA var enten 12S RNA fra Sendai-induserte KG-1 celler (8000 enheter IF aktivitet pr. p. g) eller total poly (A) ;mRNA fra ikke-induserte leukocytter (< 10 enheter pr. ug). ;32 ;P-merket cDNA ble fremstilt fra disse primere ved bruk ;av kjente reaksjonsbetingelser (Noyes et al., Proe. Nati. ;Acad. Sei. U.S.A. 7_6, 1770-1774 [1979]). 60 ;il reaksjonsprøver ble tilsatt i 20 mM Tris-HCl (pH 8.3), 20mM KC1, 8mM MgCl2, 30 mM 13-merkaptoetanol. Reaks j onene omfattet et ug for hver primer (dvs. 12 ;ig totalt for T-l serier, 4 ug totalt for T- ;13 serier), 2. ug for "induserte" 12S fraksjoner mRNA (eller ;10 pg for ikke-induserte poly (A) mRNA), 0.5mM dATP, dCTP, dTTP, 200 uCi (a<32> P)dCTP (.2-3000 Ci/mmol) , oa 60 ;enheter revers transkriptase. Produkt ble ad- ;skilt fra ikke-merket materiale ved qel- ;filtrering på en 10 ml Sephadex® G-50 kolonne behandlet med 0.3N NaOH i 3 0 min. ved 7 0°C for å destruere RNA,og nøy--_ralisert med HC1. Hybridiseringer ble utført som beskrev- ;et av Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 (1979). ;E. Identifisering av kloner pLl- pL30 ;Den hurtige plasmidisoleringsmetoden til Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7 , 1513-1523 (1979), ble brukt for å frem-stille 1 yg plasmid DNA fra hver av 500 individuelle E. ;coli K-12 stamme 294 transformanter (se C). Hver DNA prøve ble denaturert og tilfart tilnitrocellulosefiltere in triplo etterfulgt av metoden til Kafatos et al. (se ovenfor). ;De tre sett nitrocellulosefiltere som inneholdt de 500 plas-midprøver ble hybridisert med ;a) indusert cDNA primet med T-l settet av primere, ;b) T-13 primet indusert cDNA, og ;c) Ikke-indusert cDNA fremstilt ved bruk av begge sett ;primere. Kloner ble betraktet som positive hvis de hybridiserte sterkere til en eller begge de induserte cDNA prøver enn til den totale ikke-induserte prøve. Tfedve "positive" kloner (pLl-pL30) ble utvalgt fra de 500 for videre analyse. ;F. Identifisering av kloner pL31- pL39 ;Isolering av et plasmid ( nr. 104) inneholdende et LelF ;genefragment ;Transformanter av E. coli x 1776 ble undersøkt ved koloni-hybridiseringsmetoden til Grunstein and Hogness (Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 12_, 3961-3965 [1975] ved bruk av <32>P-merket indusert mRNA som prøve (Lillenhaug et al., Biochemistry, 1J5, 1858-1865 [1976]). Ikke-merket mRNA fra ikke-induserte celler ble blandet med prøver i et forhold på 200 til 1 for å konkurrere med ikke-indusert mRNA som ;32 ;var tilstede i det P-merkete preparat. Hybridisering av merket mRNA skulle fortrinnsvis opptre hos kolonier som inneholdt induserte sekvenser. Tre klasser av transformanter erholdtes: ;32 (1) 2-3 % av koloniene hybridiserte meget sterkt til P-mRNA, ;(2) 10 % hybridiserte betydelig mindre enn klasse 1, og ;(3) Resten ga ikke noe påviselig hydridiseringssignal. ;De positive kolonier (klasse (1) og (2)) ble undersøkt med hensyn til nærvær av interferonspesifikke sekvenser gjennom en undersøkelse som avhenger av hybridisering hos interferon mRNA spesifikt til plasmid DNA. Først ble 60 sterke positive kolonier (klasse 1) dyrket individuelt i 100 ml M9 medium tilsatt tetracyklin (20 ug/ml), diaminopimelin- ;syre (100 ug/ml), thymidin (20 ug/ml), og d-biotin (1 ug/ml). M9 mediet inneholdt pr. liter Na2HPC>4 (6g) , KH2P04 (3 g) , ;NaCl (0,5 g) og NH4C1 (1 g). Etter autoklavering tilsattes ;1 ml sterilt IM MgS04 og 10 ml sterilt 0.01 M CaCl2. Ti kulturer ble slått sammen og plasmid DNA isolert fra de seks forråd ("pooler") som beskrevet av Clewell et al., Biochemistry 9, 4428-440 [1970]. Ti ug av hvert plasmid DNA forråd ble spaltet med Hindlll, denaturert og kovalent bundet til DBM (diazobenzyloksymetyl)papir. Et p. g renset mRNA fra induserte celler ble hybridisert til hvert filter. Ikke-hybridisert mRNA ble fjernet ved vask. Det spesifikt hybridiserte mRNA ble eiuert og overført i Xenopus laevis oocytter. I denne prøven var alle 6 forråd negative. 5 forråd på 10 kolonier hver og ett forråd på 9 kolonier hver ble fremstilt fra 59 svakt positive kolonier, (klasse 2) og plasmider ble fremstilt fra forrådene og undersøkt som ovenfor. ;Blant de 6 undersøkte pooler hybridiserte et (K10) til interferon mRNA' på nivåer betydelig høyere enn bakgrunns-nivåene hver gang det ble prøvet. For å identifisere det spesifikke interferon cDNA klon ble plasmid DNA'er frem- ;stilt fra de 9 kolonier av forråd K10 og undersøkt enkelt- ;vis. 2 av de 9 plasmider (nr. 101 og nr. 104) bandt' interferon mRNA godt' over bakgrunnsnivået. Fra plasmid nr. 104 ;ble et unikt Bglll restriksjonsfragment inneholdende 260 ;3 2 ;b.p. isolert, merket med P ved bruk av den metode som er beskrevet av: Taylor et ai., Biochim. Biophys. Acta 44 2, 324-330 (1976), og brukt som prøve for uavhengig å utprøve 4 00 E. coli 294 transformanter ved en in situ koloni-utprøvnings-metode (Grunstein and Hogness, Proe. Nati. Sei. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975]). 9 kolonier (pL31-pL39) som hybridiserte ;i forskjellig grad med-denne prøven, ble identifisert. ;Dertil ble merket 260 b.p. fragment brukt til uavhengig å utprøve 4 000 E. coli 294 transformanter på samme måte. ;50 kolonier ble identifisert som hybridisertei forskjellig grad med denne prøven. En inneholdt LelF G fragmentet, en inneholdt LelF H fragmentet og en inneholdt et fragment kalt ;LelF Hl, en åpenbar allele til LelF H. Hybridplasmidene ;som resulterte kalles "pLelF H", etc. ;G. Isolering og sekvensering av et første full- lengde ;LelF gen ;Plasmid DNA ble fremstilt fra alle 39 potensielle LelF cDNA kloner og utprøvet på nytt medden samme 260 b.p. DNA prøve ved bruk av hybridiseringsmetoden til Katatos et al. (se ovenfor). Tre plasmider (pL4, pL31, pL34) ga meget sterke hybridiseringssignaler, 4 (pLl3, pL30, pL32, pL36) hybridiserte moderat, og 3 (pL6, pL8, pLl4) hybridiserte svakt med prøven. ;De 39 potensielle LelF cDNA rekombinante plasmider ble også ;32 ;utprøvet ved å bruke P merkete syntetiske undekamerer (individuelle T-l primer forråd eller individuelle T-13 primere) direkte som hybridiseringsprøver. Hybridiseringsbe-tingelsene ble valgt slik at perfekt baseparing skulle være nødvendig for påviselige hybridiseringssignaler (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 [1979]). Således ble plasmid DNA fra 39 kloner fremstilt gjennom en standard-isert lysatmetode (Clewell et al., se ovenfor) og renset ved Biorad Agarose A-50 kolonnekromatografi. Prøver (3 ^g) av hvert preparat ble linearisert ved behandling med Eco RI, denaturert i alkali og avsatt på 2 separate nitrocellulosefiltere, 1,5 ^g pr. avsetning (Kafatos et al., se ovenfor). Individuelle syntetiske deoksyoligonukleotid -primere og ;32 ;primerforråd ble fosforylert med ( y P)ATP som følger: ;32 50 pmol oligonukleotid og 100 pmol (y P)ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mmol) ble kombinert i 30 pl 50mM Tris-HCl, 10 mM MgCl^, 15 mM &-merkaptoetanol. 2 enheter T4 polynuk-leotid kinase ble tilsatt,og etter 30 min. ved 37°C ble 32 <32>P-m,erkete primere renset ved kromatografi på 10 ml Sephadex R G-50 kolonner. Hybridiseringer ble foretatt ;med 10^ cpm av primer T-13C eller 3 x IO<6> cpm av primerforråd T-1C. Hybridiseringene ble utført ved 15°C i 14 timer i 6 x SSC [1 x SSC = 0.15 M NaCl, 0,015 M natriumsitrat, pH 7.2], 10 x Denhardfs [0,2 % kvegserumalbumin, 0,2 % poly-polyvinylpyrolidon, 0,2 % Ficoll] oppløsning, som beskrevet ;av Wallace et al^ (se ovenfor). Filtere ble vasket i 5 min. ;(3 ganger) ved 0°C i 6 x SSC, tørket, og eksponert til røntgen-film. Resultatene er vist i fig. 2 for " 32P-primerforråd T-13C og primer T-1C. ;Plasmid DNA fra klon 104 .ble funnet å gi signifikant hybridisering med primerforråd T-1C og primer T-13C, men ingen påviselig hybridisering med de andre undekamerer. Som vist i figur 2»hybridiserte også flere av de 39 potensielle LelF plasmider (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) med begge disse prøver. Imidlertid, viste restriksjonsanalyse at bare en av disse plasmider, pL31, også inneholdt et 260 b.p. inter- ;nt Bglll fragment. Pstl behandling av pL31 viste at størr-elsen til cDNA innsatsen var ca. 1000 b.p. ;Hele Pstl innsatsen av pL31 ble sekvensbestemt ved både Maxam-Gilberts kjemiske metode (Methods Enzymol. 65, 4 99-560 ;[1980] og dideoksykjedeavslutningsmetoden (Smith, Methods Enzymol. 6_5, 560-580 [1980]) etter subkloning av Sau3a fragmenter til en M13 vektor. DNA sekvensen vises ("A") i fig. 3. Den riktige translasjonsrammen kunne forutsies under kontroll fra proteinsekvensinformasjonen, via det kjente området for LelF molekylvekter og den relative forekomst av stopptripletter.i de 3 mulige leserammer, og det muliggjorde igjen å forutsi atLelF aminosyresekvensen innbefattet et pre- eller signalpeptid.1 det første ATG overførings-initieringscodon finnes 60 nukleotider fra 5'enden av sekvensen og følges, 188 codoner senere,av en TGA avslutnings triplett;idet det er 342 ,ikke-overf ørte nukleotider ved 3'enden, etterfulgt av en poly (A) sekvens. Det antatte signalpep- ;tid (antagelig involvert i utskillelsen av ferdige LelF ;fra leukocytter) er 23 aminosyrer langt. De 165 aminosyrer som utgjør det ferdige LelF, har en kalkulert molekylvekt på 19 3 90. LelF, som er kodet med pL31,kalles "LelF A". Man kan se fra sekvensdataene ("A") i fig. 4 at de tryptiske peptider Tl og T13 ,i LelF B tilsvarer aminosyrer 145 - 149 ;og henholdsvis 57 til 61 av LelF A. Den faktiske DNA kod-ingssekvens som finnes i disse 2 regioner,er de som er an-.gitt av primerforråd Tl-C og primer T13-C (se fig. 8). ;H. Direkte ekspresjon av ferdigutviklet leukcxvttinterferon A ;( LelF A) ;1. Generelt ;Den fremgangsmåte som følges for å uttrykke LelF A direkte som et ferdig interferon polypeptid,er en variant av den som tidligere ble anvendt for humane veksthormoner (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]), forsåvidt som den inn - befatter kombinasjonen av syntetiske (N-terminale) og komplementære DNA'er. ;Som vist i fig. 6, lokaliseres et Sau3a restriksjonsendonu-kleasepunkt lett mellom kodonene 1 og 3 i LelF A. 2 syntetiske deoksyoligonuklectider som ble konstruert og som inneholder et ATG overførings-initieringscodon, gjengir codonet for aminosyre 1 (Cystein), og skaper en EcoRI bindende ende. Disse oligomerer ble bundet til et 34 b.p. Sau3a - Avall-fragment av pL31. Det resulterende 45 b.p. produkt ble bundet til 2 ytterligere DNA fragmenter for å konstruere et 865 b.p. syntetisk-naturlig hybridgen som koder for LelF A og som er avgrenset av EcoRI og Pstl restriksjonspunkter. Dette gen ble innsatt i pBR322 mellom EcoRI og Pstl punkter og ga plasmidet pLelF Al. 2. Konstruksjon av tryptofan- kontrollelementet ( inneholdende E. coli trp promotor, operator og trp leder ribo-som- bindingspunkt men mangler en ATG sekvens for initi-ering av overføring)■ ;Plasmid pGMl bærer E. coli tryptofanoperon inneholdende delesjonen &LE1413 (Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 [1978] og uttrykker følgelig et fusjonsprotein inneholdende de første 6 aminosyrer av trp lederen.og ca. den siste tredjedel av trp E polypeptidet (i det følgende henvist til i sammenheng som LE'), samt trp D polypeptidet i sin helhet, alt under kontroll av trp promotor-operator-systemet. Plasmidet, . 20 } iq, ble behandlet med restriksjons-enzymet PvuII som spalter plasmidet på 5 steder. Genfragmenter ble deretter kombinert med EcoRI linkere (bestående av et selvkomplementerende oligonukleotid med sekvensen: pCATGAATTCATG) som ga et EcoRI spaltningspunkt for en senere kloning til et plasmid inneholdende et EcoRI sete. De 2 0 ug DNA fragmenter som erholdtes fra pGMl ble behandlet med 10 enheter T4 DNA ligase i nærvær av 200 pmol 5<1->fosforylert syntetisk oligdnukleotid pCATGAATTCATG og i 20 ul T4 DNA ligasebuffer (20 mM Tris, pH 7.6, 0.5 mM ATP, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol) ved 4°C natten over. Løsnignen ble så oppvarmet 10 min. ved 70°C for å stoppe ligeringen. Kjedene ble spaltet ved EcoRI behandling og fragmentene, nå med EcoRI-ender, ble separert ved bruk av 5 % polyakrylamidgel elektroforese (heretter PAGE), og de 3 største fragmenter, isolert fra gelen ved først behandling med etidiumbromid, lokaliserte fragmentet med ultrafiolett lys, og de interes-sante deler ble skåret fra gelen. Hvert gelfragment sammen med 300 mikroliter 0.1 x TBE, ble plassert i en dialysepose og underkastet elektroforese ved 100 V en time i 0.1 x TBE buffer (TBE buffer inneholder: 10.8 g Tris base, 5,5 g borsyre, 0,09 g Na2EDTA i 1 liter H20). Den vandige løsning ble oppsamlet fra dialyseposen, fenolekstrahert, kloroform-ekstrahert og gjort 0.2 M natriumkloridholdig, og DNA ble isolert i vann etter etanolutfelling. Det trp promoter-operatorholdige gen med EcoRI-bindende ender ble identifisert i den neste beskrevne metode, som omfatter innføring av fragmenter i et tetracyklinsensitivt plasmid som, etter promoter-operator-innsetning blir tetracyklinresistent. ;Plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267-3287 [1979] uttrykker ampicillinresistens og inneholder genet for tetracyklinresistens, men, da det ikke er tilknyttet noen promoter, uttrykker det ikke den resistensen. Plasmidet er følgelig tetracyklinsensitivt. Ved å innføre ;et promoter-operator-system på EcoRI-punktet, kan plasmidet gjøres tetracyklinresistent. ;pBRHI ble behandlet med EcoRI og enzymet fjernet ved fenol-ekstraksjon etterfulgt av kloroformekstraksjbn og isolert i vann etter etanolutfelling. Det resulterende DNA molekyl ble i adskilte reaksjonsblandingér kombinert med hvert av de 3 DNA fragmenter som erholdtes ovenfor og ligert med T4 DNA ligase som forut beskrevet.' Det tilstedeværende DNA i ;reaksjonsblandingen ble brukt for å transformere kompetent E. coli K-12 stamme 294 gjennom standard teknikker (Hersh-field et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 71, 3455-3459 ;[1974]) og bakteriene satt på LB (Luria-Bertani) plater inneholdende 20 ug/ml ampicillin og 5 ug/ml tetracyklin. Flere tetracyklinresistente kolonier ble utvalgt, plasmid DNA isolert og tilstedeværelsen av det ønskede fragment bekreftet ved restriksjonsenzymanalyse. Det resulterende plasmid kalles pBRHtrp. ;Et EcoRI og BamHI behandlingsprodukt av virusgenomet av hepatitt B ble oppnådd med konvensjonelle midler og klonet i EcoRI og BamHI stillingene i plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]) og ga plasmidet pHS32. Plasmid pHS 32 ble spaltet med Xbal, fenolekstrahert, kloroformekstra-hert og etanolutfelt. Det ble så behandlet med 1 ^1 E. coli DNA polymerase I Klenow fragment ;i 30 ul polymerasebuffer (50 mM kaliumfosfat pH 7.4, 7mM MgCl2, 1 mM (3-merkaptoetanol) inneholdende 0.1 mM dTTP og O.lmM dCTP i 30 min. ved 0°C og deretter 2 timer ved 37°C. Denne behandlingen får 2 av de 4 nukleotider som er komplementære til den 5' utstikkende ende av Xbal spaltningssted-et til å fylles inn: ;;2 nukleotider, dC og dT, ble innsatt og ga en ende med 2 ;5' utstikkende nukleotider. Denne lineære rest av plasmid pHS32 (etter fenol- og kloroformekstraksjon og gjenvinning i vann etter etanolutfelling) ble spaltet med EcoRI. Det store plasmidfragmentet ble adskilt fra det mindre EcoRI-Xbal fragment ved PAGE og isolert etter elektroeluering. Dette DNA fragment fra pHS32 (0.2 ug), ble ligert under lignende betingelser som de som er beskrevet ovenfor til EcoRI-Taql fragmentet av tryptof an operon (~0.01 ug), avledet fra pBRHtrp. ;I fremgangsmåten for ligering av fragmentet fra pHS32 til ;EcoRI - Taql fragmentet som beskrevet ovenfor, ligeres Taql utstikkende ende til Xbal gjenværende ende,selv om det ikke er fullstendig Watson-Crick baseparet: ;En del av denne ligeringsreaksjonsblandingen ble overført til E. coli 294 celler, varmebehandlet og satt på LB plater inneholdende ampicillin. 24 kolonier ble utvalgt, dyrket i 3 ml LB (Luria-Bertani) medier, og plasmid isolert. 6 av disse ble funnet å ha Xbal posisjonen regenerert via E. coli katalysert DNA reparasjon og replikasjon: ;Disse plasmider ble også funnet å spalte ;både med EcoRI ;og Hpal og gi de ventede restriksjonsfragmenter. Et plasmid kalt pTrpl4, ble brukt for ekspresjon av heterologe polypeptider som omtalt i det følgende. ;Plasmidet pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979] inneholder et gen for humant veksthormon bygget opp av 2 3 aminosyrecodoner produsert fra syntetiske DNA fragmenter og 163 aminosyrecodoner erholdt fra komplementært DNA fremstilt gjennom revers transkripsjon av humant veksthormon budbringer RNA. Dette genet, selv om det mangler codonene til "pre" sekvensen til humant veksthormon, inneholder et ATG translasjonsinitieringscodon. Genet ble isolert fra 10 ^ug pHGH 107 etter behandling med EcoRI etterfulgt av E. coli DNA polymerase I Klenow fragment og dTTP og dATP som beskrevet ovenfor. Etter fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble plasmidet behandlet med.BamHI. ;Det humane veksthormon (HGH)' geneholdige fragment ble isolert ved PAGE etterfulgt av elektroeluering. Det resulterende DNA fragment inneholder også de første 350 nukleotider av det tetracy.klinresistente strukturgenet," men mangler tet-racyklinpromotor-operatorsystemet, slik at ved påfølgende kloning i et ekspresjonsplasmid, kan plasmidene som inneholder innsatsen lokaliseres ved restaurering av tetracyk-linresistensen..:Fordi EcoRI enden til fragmentet er satt inrt gjennom Klenow polymerase I -metoden, har fragmen- ;tet en butt og en festende ende, hvilket sikrer riktig orientering ved senere innsetting i et ekspresjonsplasmid. ;Ekspresjonsplasmidet pTrpl4 ble så fremstilt for mottagelse av det HGH geneholdige fragment fremstilt ovenfor. Således blepTrpl4 Xbal behandlet og de resulterende festende ender fylt opp ved Klenow polymerase I -metoden ved anvendelse av dATP, dTTP, dGTP og dCTP. Etter fenol- og kloroformekstraksjon og etanolutfelling ble det resulterende DNA behandlet med BamHI og det resulterende store plasmidfragment isolert ved PAGE og elektroeluering. Det pTrpl4-avledede fragment har en butt og en festende ende som muliggjør rekombi-néring med riktig orientering med det HGH geneholdige fragment som forut er beskrevet. ;HGH genefragmentet og pTrpl4 &Xba-BamHI fragmentet ble kombinert og føyet sammen under lignende betingelser som de som er beskrevet ovenfor. De innsatte Xbal og EcoRI ender ligerte sammen ved butt-endeligering og gjenskapte både Xbal og EcoRI punktene. ;Denne konstruksjonen gjenskaper også det tetracyklinresistente gen. Da plasmidet pHGH 107 uttrykker tetracyklinresistens fra en promotor som ligger oppstrøms for HGH genet (lac-promotoren), hvilken konstruksjon kalles pHGH 207, muligggjør dette ekspresjon av genet for tetracyklinresistens under kontroll av tryptofanpromotor-operatoren. Således ble ligeringsblandingen overført i E. coli 294 og kolonier utvalgt på LB plater som inneholdt 5 ug/ml tetracyklin. ;Plasmid pHGH 207 ble EcoRI behandlet og et 300 b.p. fragment inneholdende trp promotoren, operatoren og trp leder-ribosonbindende punkt,men som manglet en ATG sekvens for initi-ering av translasjon,'ble isolert fra PAGE etterfulgt av elektroeluering. Dette DNA fragment ble klonet i EcoRI stillingen til pLelF A. Ekspresjonsplasmider som inneholdt det ovenfor modifiserte trp regulon (E. coli trp operon fra hvilket attenuatorsekvensen er fjernet for kontroller-bart å høyne ekspresjonsnivåer),kan dyrkes til forutbestem-te nivåer i et næringsiffedium som inneholder tryptofan i tilstrekkelige mengder til å undertrykke promotor-operatorsystemet, deretter fratas tryptofan for å på- ;ny slå på systemet og forårsake ekspresjon av det tilsiktede produkt. ;Nærmere bestemt,og under henvisning til fig. 6 ble 250 ug plasmid pL31 behandlet med Pstl og 1000 b.p. innsatsen, isolert ved gelelektroforese på en 6 % polyakrylamidgel. Ca. ;40.ug innsats ble elektroeluert fra gelen og oppdelt i 3 alikvoter for viderebehandling: a) En 16 ug prøve av dette fragmentet ble partielt behandlet med 4 0 enheter Bglll i 45 min. ved 37°C og reaksjonsblandingen renset på en 6 % polyakrylamidgel. Ca."2 ug av det ønskede 670 b.p. fragment ble isolert. b) En annen prøve (8 pg) av 1000 b.p. Pstl innsatsen ble - spaltet med Avall og Bglll. Et pg ;av det angitte 150 b.p. fragment ble isolert etter gelelektroforese. c) ,16 pg av 1000 b.p. stykket ble behandlet med Sau3a og AvalI. Etter elektroforese på en 10 % polyakrylamidgel, ble ca..0.25 pg (10 pmol) av 34 b.p. fragmentet isolert. De to angitte deoksyoligonukleotider, 5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) og 5'-dGATCACACATG (fragment 2) ble syntetisert ved fosfotriestermetoden. Fragment 2 ble ;32 fosforylert som følger. 200 pl (<<v4 0 pmol) av (y P) ATP (5000 Ci/mmol) ble tørket oa reoppslemmet i ;30 pl 60 mM Tris-HCl (pH8), lOmM MgCl2, 15 mM (3-merkaptoetanol, inneholdende 100 pmol DNA fragment og 2 enheter T4 poly-nukleotidkinase. Etter 15 min. ved 37°C ble 1 pl lOmM ATP ;tilsatt og reaksjonen fikk fortsette ytterligere 15 min. Blandingen ble så oppvarmet ved 70°C i 15 min., kombinert med 100 pmol 5'-OH fragment 1 og 10 pmol av 34 b.p. Sau3a - Avall fragmentet. Ligering ble utført i 5 timer ved 4°c i 50 ul 20mM Tris-HCl (pH7.5] lOmM Mg Cl2, 10 mM ditiotreitol, 0.5mM ATP og 10 enheter T4 DNA ligase. Blandingen ble elektroforeset på en 6 % polyakrylamidgel og 4 5 b.p. produktet isolert ved elektroeluering. Ca. 30 ng (1 pmol) av 45 b.p. produktet ble kombinert med 0.5 ug (5 pmol) av 150 b.p. Avall - Bglll fragmentet og 1 pg (2 pmol) av 670 b.p. Bglll - Pstl fragmentet. Ligeringen ble utført ved 20°C i 16 timer ved bruk av 20 enheter T4 DNA ligase. Ligasen ble inaktivert ved oppvarmning til 65°C i 10 min. Blandingen ble så behandlet med EcoRI og Pstl for å fjerne poly-merene fra genet. Blandingen ble renset ved 6 % PAGE. ;Ca. 20 ng (0.04 pmol) av 865 b.p. produkt ble isolert. Halvparten (10ng) av dette ble ligert til pBR322 (0.3 ug) mellom EcoRI og Pstl punktene. Transformering av E. coli 294 ;ga 70 tetracyklinresistente, ampicillinsensitive transformanter. Plasmid DNA isolert fra 18 av disse transformanter , ble behandlet med EcoRI og Pstl. 16 av de 18 plasmider hadde et EcoRI - Pstl fragment 865 b.p. i lengde. En pg av en av disse, pLelF Al, ble behandlet med EcoRI og ligert til 300 b.p. EcoRI fragmentet (0.1 pg) inneholdende E. coli trp promoteren og trp lederribosombindingspunktet, fremstilt som beskrevet ovenfor. Transformanter inneholdende trp promotoren ble fastslå o tt ved å bruke en <32>P-trp prøve i forbindelse med Grunstein-Hogness koloni-utplukk-ingsmetoden. Et asymetrisk plassert Xbal punkt i trp fragmentet muliggjorde bestemmelse av rekombinanter hvori trp promotoren var orientert i retning av LelF A genet. ;I. In vitro og in vivo aktivitet av LelF A ;Ekstrakter ble fremstilt for IF bestemmelse som følger: 1 ml kulturer ble dyrket i L medium inneholdende 5 pg/ml tetracyklin til en A^q verdi på ca. 1.0, så fortynnet til 25 ml M9 medium inneholdende 5 pg/ml tetracyklin. 10 ml prøver ble tatt ut ved sentrifugering når A^q nådde 1.0,og celle-pellets ble oppslemmet i 1 ml 15 % sukrose, 50 mM Tris-HCl ;(pH 8.0), 50 mM EDTA. 1 mg lysozym ble tilsatt, og etter 5 min. ved 0°C ble celler lysert ved ultralyd. Prøvene ble sentrifugert 10 min. (15 000 pmdr./min.) og interferon-aktiviteten i supernantene ble bestemt ved sammenligning med LelF standarder ved den cytopatiske virknings (CPE) inhiberingsmåling. For å bestemme antallet av IF molekyler pr. celle ble det benyttet en LelF spesifikk aktivitet på 4 x loo enheter/mg. ;Som vist i tabell 1, gir klon pLelF A trp 25, hvori trp promotoren var innsatt i den ønskede orientering, høye aktivitetsnivåer (så høye som 2.5 x 10 g enheter/liter). Som vist i tabell .2, virker IF produsert av E. coli K-12 stammen 294/pLeIF A trp 25 likt med autentisk human LelF, og det er stabilt ved behandling ved pH 2 og nøytraliseres av kanin-anti-human-leukocyttantistoffer. Interferonene har en observert molekylvekt på ca. 20 000. ;In vivo-virjcsomheten til interferon krever tilstedeværelse av makrofager og naturlige "killer"(NK) celler,og in vivo-virkningen synes å innbefatte stimulering av disse celler. Således forble det mulig at interferonet som var fremstilt av E. coli 294/pLeIF A 25, samtidig med at det hadde anti-virusaktivitet i cellekulturbestemmelsen, ikke ville være aktivt i infiserte dyr. Videre kunne in vivo antivirusaktiviteten til det bakterielt fremstilte ikke-glykosylerte LelF A være forskjellig fra det glykosylerte LelF fra human "buffy coat" leukocytter. Derfor ble den biologiske aktiviteten til bakterielt syntetisert LelF A (2 % rent) sammen-lignet med buffy coat LelF (8 % rent) i dødeligencefalo-myocarditt (EMC) virusinfeksjonen hos ekornaper (tabell 3). ;<*> 250 000 enheter/ml ekstrakt av E. coli 294/pLeIF A trp 25 beskrevet i tabell 1 ble fortynnet 500 ganger med minimalt essensielt medium som gir en spesifikk aktivitet på 500 enheter/ml. En leukocyttinterferonstandard (Wadley Institute), forut titrert mot NIH leukocyttinterferonstandard,ble også fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 500 U/ml. En ml alikvoter ble justert til pH 2 med IN HC1, inkubert ved 4°C i 52 timer, nøytralisert ved tilsetning av NaOH og IF aktivitet bestemt ved standard CPE inhiberingsmåling. 25 ul alikvoter av 500 enheter/ml prøvene (ubehandlet) ble inkubert' med 25 ul kanin anti-human leukocyttinterferon i 60 min. ved 37°C, sentrifugert ved 12 000 x g i 5 min. og supernantanten målt.

Alle aper var hanner (gjennomsnittsvekt 713 g) og hadde ingen EMC virus-antistoffer før infeksjonen. Apene ble in-fisert intramuskulært med 100 x LD,-,, EMC virus (bestemt i

oU

mus). Kontrollbehandlede aper døde 134, 158 og 164 timer etter infeksjonen. Interferonbehandlinger med 10^ enheter ad intravenøs vei ble foretatt ved-4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 og 240 timer, i forhold til infeksjonen. Det bakterielle leukocyttinterferon, var en kolonnekromatografifraksjon fra et lysat av E. coli 294/pLeIF A 25 med en spesifikk aktivitet på 7.4 x 10^ enheter/mg protein. Kontrollbakterieprotein-ene var en ekvivalent kolonnefraksjon fra et lysat av E. coli 294/pBR322 på 2 ganger total proteinkonsentrasjon. Leukocyttinterferonstandarden var Sendai virus indusert interferon fra normale human "buffy coat" celler, renset kromatografisk til en spesifikk aktivitet på 32 x 10 enheter/mg protein.

Kontrollapene viste tiltagende sløvhet, tap av balanse, slapp paralyse av baklemmene og vann i øynene som begynte ca. 8 timer før, død. Interferonbehandlede aper viste ingen av disse abnormaliteter, og de forble aktive hele tiden og utviklet ingen viremi. Den ene ape i kontrollgruppen som ikke utviklet viremi etter 4 dager døde senest (164 timer etter infeksjon), men viste høye konsentrasjoner av virus

i hjerte og hjerne etter død. De interferonbehandlede aper utviklet ikke antistoffer mot EMC virus ved måling 14 og 21 dager etter infeksjon. Disse resultater viser at antivirus-virkningene til LelF preparatene i de infiserte dyr kan til-skrives interferon alene fordi de medfølgende proteiner er helt forskjellige i de bakterielle og i "buffy coaf-preparatene. Dertil viser disse resultater at glykosylering ikke er nødvendig for in vivo antivirusaktiviteten til LelF A.

J. Isolering av cDNA' er for ytterligere leukocyttinterferoner

DNA fra det fullstendig karakteriserte LelF A cDNA-holdige plasmid ble spaltet ut med Pstl, isolert elektroforetisk og merket med 3 2P. Det resulterende radioaktivt merket DNA ble brukt som en prøve for å utvelge ytterligere E. coli

2 94 transformanter, erholdt identisk som dem i del C, ved in situ koloniutvelgelsesmetoden til Grunstein og Hogness

(se forut). Kolonier ble isolert som hybridiserte i forskjellig grad med prøven. Plasmid DNA fra disse kolonier og de 10 hybridiserende kolonier som er omtalt i del G ovenfor, ble isolert med Pstl spaltning og karakterisert gjennom 3 forskjellige metoder. Først ble disse Pst fragmenter karakterisert ved sine restriksjons-endonukleasebehandlings-mønstere med enzymene Bgl II, Pvu II og Eco RI. Denne ana-lysen muliggjorde klassifisering av minst 8 forskjellige typer (LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF

G og LelF H), vist i figur 5, som omtrentlig angir lokali-teten av forskjellige restriksjonsposisjoner i forhold til de kjente for sekvens og kodesekvens av LelF A. En av disse, LelF D, er av samme type som den som er rapportert av Nagata et al., Nature, 28_4, 316-320 (1980), men har etVal-residium ved posisjon 114, mens det angitt av Nagata har et Ala-residium ved denne posisjon.

For det andre ble visse av DNA'ene prøvet ved hybridiserings-utvalgsbestemmelsen som er beskrevet av Cleveland et al., Cell 20, 95-105 (1980) med hensyn til evnen å selektivt fjerne LelF mRNA fra poly-A-holdige KG-1 celle RNA. LelF A, B, C og F var positive i denne bestemmelse. For det tredje ble sistnevnte Pst fragmenter innsatt i et ekspresjonsplasmid, E. coli 294 overført med plasmidet, og fragmentene ble uttrykt. Ekspresjonsproduktene som ble antatt å være forinterferoner, var alle positive i CPE bestemmelsen for interferonaktivitet, selv om aktiviteten var marginal i tilfellet LelF F fragmentet. I tillegg til det foregående er alle de beskrevne LelF typer sekvensbestemt.

K. Direkte ekspresjon av et andre ferdig leukocyttinterferon ( LelF B)

Sekvensen til det isolerte fragment bestående av genet for ferdig LelF B,viser de første 14 nukleotider av typene A og B som identiske. Følgelig ble et fragment fra pLelF A25 bærende trp-promotor-operator, ribosombindende punkt og starten fra LelF A (=B) genet isolert og kombinert med den gjenværende delen av B-sekvensen i et ekspresjonsplasmid.

De iøynefallende restriksjonskart for Pst fragmentet av pL4

(et plasmid bestående av LelF B Pst-avsluttet gen angitt i fig. 5) og pLelF A25 er henholdsvis vist i fig. 7a og 7b.

For å oppnå det omtrentlige 950; b.p. Sau3a til Pstl fragment fra sekvensen som er vist i fig. 7a, var flere trinn nødvendig fordi ett .eller flere> mellomliggende Sau3a res-triks jonspunkter var tilstede, dvs.:

1. De følgende fragmenter ble' isolert:

a) 110b b.p. fra Sau3a til EcoRI; b) 132 b.p. fra EcoRI til Xba;

c) >700 b.p. fra Xba til Pst.

2. Fragmenter (la) og (lb) ble ligert og delt med Xba og

Bglll for å forhindre selvpolymerisasjon gjennom Sau 3a og Xba endestykker (det relevante Sau3a punkt var innenfor et Bglll punkt; Bglll deler for å levne en Sau3a festende ende). Et 242 b.p. fragment ble isolert.

3. Produktet fra (2) og (lc) ble ligert og delt med Pstl

og Bglll, igjen for å forhindre selvpolymerisasjon. Et omtrentlig 950 b.p. fragment, Sau 3a til Pstl fra fig. 7a, ble isolert. Dette fragment besto av den del av LelF B genet som ikke var felles med LelF A.

4. Et omtrentlig 300 b.p. fragment (Hindlll til Sau3a)

bestående av trp promotor-operator, ribosombindende punkt, ATG startsignal og cysteincodon av LelF A ble isolert fra pLelF A25.

5. Et omtrentlig 3600 b.p. fragment Pstl til Hindlll bla

isolert fra pBR322. Dette omfattet repliconet og innkodet tetracyklin men ikke ampicillinresistens.

6. Fragmentene erholdt i trinnene 3, 4 og 5 ble trippelligert og det resulterende plasmid overført i E. coli K-12 stamme 2 94.'

Transformanter ble utvalgt - (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 1_, 1513-1523 [1979] og plasmidprøver spaltet

med EcoRI. Nedbrytningen ga 3 fragmenter karakteristiske for: 1) EcoRI-EcoRI trp promotorfragment; 2) Det interne EcoRI til EcoRI fragment fra pL4, og 3) proteintranslasjons-startsignal til EcoRI fragment fra pL4.

I CPE bestemmelse viser bakterieekstrakter fra kloner fremstilt på forutgående måte typisk ca. 10 x 10 enheter interferonaktivitet pr. liter ved A55Q =1. Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli 294/pLeIF B trp 7.

L. Direkte ekspresjon av ytterligere ferdirmtyiklete leukocvtt-interferoner ( LelF C, D, F, H, I og J)

Ytterligere full-lengde genfragmenter som omfatter andre LelF typer,kan settes sammen og konstrueres i ekspresjons-bærere for ekspresjon som i tilfellet LelF A. Fullstendig sekvensbestemmelse ved konvensjonelle midler vil klargjøre om et restriksjonspunkt ligger tilstrekkelig nær det første aminosyrekodon i den ferdige interferontype til å. mulig-gjøre lett bruk av den metodikk som er anvendt, i del H' ovenfor til ekspresjonen av ferdig LelF A, dvs. eliminering av forsekvensen ved restriksjonsoppdeling og, erstatning av codoner for N—terminale aminosyrer som er tapt,i forsekvens-elimineringf ved' ligering av et syntetisk DNA fragment. Hvis: dette ikke går kan følgende metode' anvendes. Denne omfatter kort. spalting av det: forsefcvenshoIdige fragment rett- før det" punkt" hvor kode net", faar den første aminosyren av diet ferd!ig;e polypeptid feegyTiiier:,, ved:

1. det dbfebe^lLt"kj'edede DNA overføres til enkeltkjedet DNA

i et område som omgir dette punkt,

2. til det enkeltkjedede området dannet i trinn (a) hybri-diseres en komplementær primerlengde av enkeltkjedet DNA idet 5' enden av primeren ligger motsatt nukleo-tidét som ligger opptil det tilsiktede spaltningspunkt,

3. den del av den andre kjeden som er elimi-nert i trinn 1, og som ligger i 3'-retningen fra primeren ved omsetning med DNA polymerase restaureres i nærvær av adenin, tymin, guanin og cytosin-holdige deok-synukleotidtrifosfater, og

4. den gjenværende enkeltkjedede lengde av DNA som stikker frem forbi det tilsiktede spaltningspunkt nedbrytes.

En kort lengde av syntetisk DNA som slutter på 3•-enden til kodekjeden med translasjonsstartsignalet ATG, kan så ligeres til, dvs. butt endeligering til det resulterende oppbyggede genet for de ferdige interferoner og genet som er innsatt i et ekspresjonsplasmid og brakt under kontroll av en promoter og dens tilhørende ribosombindingspunkt.

På lignende måte som anvendt i del K foran, ble genfragmenter som koder LelF C og LelF D dannet for direkte bakteriell ekspresjon. Ekspresjonsstrategi for disse ytterligere leukocyttinterferoner inneholdt i hvert tilfelle anvendelse av det omtrentlige 3 00 b.p. fragment Hindlll til Sau3a) bestående av trp promoter-operator, ribosombindende punkt ATG startsignal og cysteinkodon av LelF A fra PLelF A25. Til dette kombinertes genfragmenter fra de ytterligere interferongener som koder for sine respektive aminosyresekvenser forbi det første cystein som var felles for alle. Hvert resulterende plasmid ble brukt til å transformere E. coli K-12 stamme 294. Ligeringer for å danne de respektive gener var følgende:

LelF C

Isoler de følgende fragmenter fra pLelF C:

(a) 35 b.p. fra Sau 3a til Sau 96

(b) >900 b.p. Sau 96 til Pst I

(c) Isoler et omtrentlig 300 b.p. fragment (Hind III -

Sau 3a) fra pLelF A-25 som i del K (4) ovenfor.

(d) Isoler det omtrentlig 3600 b.p. fragment fra del

K (5) forut.

Oppbygning:

(1) Liger (a) og (c). Spalt med Bglll, Hindlll og isoler det omtrentlige 335 b.p. produkt. (2) Trlppelliger (1) + (b) + (d) og transformer E. coli med det resulterende plasmid.

Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli K-12 stamme 294/pLeIF C trp 35.

LelF D

Isoler fra pLelF D:

a) 35 b.p. fra Sau3a til Avall

b) 150 b.p. fra Avall til Bglll

c) omtrentlig 700 b.p. fra Bglll til Pstl

Isoler fra pLelF A25:

d) 300 b.p. fra Hindlll til Sau3a

Isoler fra pBR322:

e) omtrentlig 3600 b.p. fra Hindlll til Pstl Oppbygning: (1) Liger (a) + (b), spalt med Bglll og rens et 185 b.p. produkt (1). (2) Liger (1) + (d), spalt med Hindlll, Bglll, og rens det omtrentlige 500 b.p. produkt (2). (3) Liger (2) + (c) + (e) og transformer E. coli med det resulterende plasmid..

Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli

K-12 stamme 294/pLeIF D trp 11.

LelF F

Det LelF F holdige fragment kan oppbygges for direkte ekspresjon gjennom gjenoppbygning som lett foretas helt homo-logt for aminosyre 1-13 av LelF B og LelF F. Et trp promo-terholdig fragment (a) med omtrentlig likeformede ender erholdes fra pHGH207 beskrevet ovenfor via Pst I og Xba I spaltning, etterfulgt av isolering av det ca. 1050 b.p. fragment. Et andre fragment (b) erholdes som det største av fragmentene resulterende fra Pst I og Bglll spaltning av plasmidet pHKY 10. Fragment (a) inneholder ca. halvparten av genet som koder ampicillinresistens; fragment(b) inneholder resten av genet og hele genet for tetracyklinresistens bortsett fra den tilhørende promoter. Fragmentene (a) og (b) kombi-neres via T4 ligase og produktet behandles med Xbal og Bglll for å eliminere dimerisering, og danner et fragment (c) omfattende trp promoter-operatoren og gener for tetracyklin og ampicillinresistens.

Et fragment (d) på omtrent 580 b.p. erholdes ved Avall og Bglll spaltning av pLelF F. Dette omfatter kodoner for aminosyrer 14-166 av LelF F.

Et fragment (e) (49 b.p.) erholdes ved Xbal og Avall spalting av pLelF B. Fragment (e) koder aminosyrer 1-13

av LelF F.

Fragmentene (c), (d) og (e) er trippelligert i nærvær av

T4 ligase. De festende ender av de respektive fragmenter er slik at det sammensatte plasmid sirkulariserer korrekt, bringer tetracyklinresistensgenet under kontroll av trp promotor-operatoren sammen med genet for ferdig LelF F, slik at bakterier transformert med det ønskede plasmid,kan ut-velges på tetracyklinholdige plater. Et representativt klon fremstilt på denne måte er E. coli K-12 stamme 294/ pLelF F trp 1.

LelF H

Det fullstendige LelF H gen kan formes for ekspresjon som

et ferdig leukocyttinterferon som følger:

1. Plasmid pLelF H underkastes Haell og Rsal spalting ved isolering av 816 b.p. fragmentet som går fra signalpep-tidaminosyren 10 til det 3' ikke-kodende området. 2. Fragmentet denaturererss og underkastes reparasjons-syntese med Keinow-fragment av DNA polymerase I (Klenow et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 65, 168 [ 1970], under anvendelse av den syntetiske deoksyribooligonukleotidprimer

5'-dATG TGT AAT CTG TCT.

3. Det resulterende produkt spaltes med Sau3a,og et 452

b.p. fragment bestående av aminosyrer 1 til 150 isoleres.

4. Sau3a og Pstl spalting av pLelF H og isolering av det resulterende 500 b.p. fragment gir et gen som koder aminosyrene 150 til slutten av kodesekvensen. 5. Fragmenter isolert i trinn (3) og (4) ligeres til dannelse av et fragment:

som koder de 166 aminosyrer av LelF H.

6. pLelF A trp 2 5 nedbrytes med Xbal, endeavstumpes med DNA polymerase I og produktet spaltes med Pst I. Det store resulterende fragment kan isoleres og ligeres med

produktet f ra trinn (5) og danner et ekspresjonsplasmid som, etter transformering av E. coli K-12 stamme 294 eller annen vertsbakterie, er i stand til å uttrykke ferdigutviklet LelF H.

LelF I

Fag XCharon 4A rekombinantmaterialet av det humane genom kontruert av Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978), ble gransk-et for leukocyttinterferongener ved fremgangsmåtene beskrevet av Lawn et al. (supra) og Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978). En radioaktiv LelF prøve som stammet fra cDNA klonet LelF A ble brukt for å granske ca. 500 000 plater. 6 LelF genomkloner erholdtes i dette utvalget. Etter reut-valg og platerensning ble en av disse kloner, A.HLeIF2, utvalgt for videre analyse.

Ved å bruke den ovenfor beskrevne metode kan andre prøver med fordel brukes for å isolere ytterligere LelF kloner fra det humane genom. Disse kan igjen anvendes for å frem-stille ytterligere leukocyttinterferonproteiner i henhold til denne oppfinnelse. 1. 2000 b.p. EcoRI fragmentet fra klon \HLeIF2 ble sub-klonet i pBR325 på EcoRI posisjonen. Det resulterende plasmid LelF I ble spaltet med EcoRI7og 2000 b.p. fragmentet isolert. Deoksyoligonukleotidet dAATTCTGCAG (en EcoRI— Pstl konverter) ble ligert til 2000 b.p. EcoRI fragmentet, og det resulterende produkt spaltet med Pstl og ga et 2000 b.p. fragment som inneholdt Pstl ender. Dette ble spaltet med Sau96,og et 1100 b.p. fragment ble isolert som hadde en Pstl og en Sau96 ende. 2. Plasmidet pLelF C trp 35 ble .spaltet med Pstl og Xbal. Det store fragmentet ble isolert. 3. Det lille Xbal - Pstl fragment fra pLelF C trp 35 ble spaltet med Xbal og Sau96. Et 4 0 b.p. Xbal - Sau96 fragment ble isolert. 4. Fragmenter isolert i trinn (1), (2) og (3) ble ligert under dannelse av ekspresjonsplasmid pLelF I trp 1.

LelF J

1. Plasmidet pLelF J inneholder en 3.8 kilobase Hindlll fragment fra humant genomisk DNA som inneholder LelF J gene-sekvensen. Et 760 b.p. Ddel - Rsal fragment ble isolert fra dette plasmidet. 2. Plasmidet pLelF B trp 7 ble spaltet med Hindlll og Ddel og et 340 b.p. Hindlll - Ddel fragment isolert. 3. Plasmidet pBR322 ble spaltet med Pstl, endeavstumpet ved inkubering med DNA polymerase 1 (Klenow fragment), så ned-brutt med Hindlll. Det store (~3600 b.p.) fragment ble isolert. 4. Fragmenter isolert i trinn (1), (2) og (3) ble ligert under dannelse av ekspresjonsplasmidet pLelF J trp 1.

Claims (8)

1. Plasmid som koder for et ferdigutviklet human leukocyttinterferon, hvorav aminosyresekvensen til dette interferon innbefatter partiellsekvensen Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser, karakterisert ved at plasmidet inneholder en første DNA sekvens som koder for et ferdigutviklet. leukocyttinterferon som er operativt forbundet med en andre DNA sekvens som er i stand til å fremskaffe mikrobiell ekspresjon av interferonet.

2. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at interferonet er valgt fra gruppen omfattende human leukocyttinterferon (LelF), A, B, C, D, F, H, I og J.

3. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at første DNA sekvens koder for human leukocyttinterferon A (LelF A).

4. Plasmid ifølge krav 3, karakterisert ved at det er plasmid pLelF A trp 25.

5. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at første DNA sekvens koder for human leukocyttinterferon B (LelF B).

6. Plasmid ifølge krav 5, karakterisert ved at det er plasmid pLelF B trp 7.

7. Plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at første DNA sekvens koder for human leukocyttinterferon D (LelF D).

8. Plasmid ifølge krav 7, karakterisert ved at det er plasmid pLelF D trp 11.