JPS62223200A - 新規な生理活性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗ウィルス作用、細胞増殖抑制作用およびＮ
Ｋ細胞粘性増強作用などの生理活性能に愛２また折しい
生理活性ペプチドに関する。更に詳しくは、本発明は次
式（Ｉ）： ＢＣｙｓＸＩ　ＣｙｓＸ２ＣｙｓＸ３−　（［）〔但し
、式中Ｂは水素原子又はメチオニル基、０７日は７ステ
イン残基、Ｘｌは、インロイシルバリルワインルグリシ
ル辷りルロインルグリシン残清から多くとも２個のアミ
ノ酸残基の削除又は付加による該残基窮導本、Ｘ２がチ
ロノン残基、そしてＸ３が次式（ＩＩ） Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＬＩ３ｕ　Ｌｙｓ　Ｌ７
８　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ａ８ｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ
　５ｅｒＡｓｐ　　Ｖａｎ　　Ａ：Ｌａ　　Ａｓｐ　　
Ａｓｎ　　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　
ＬｅＬＩＧｌｙ　工１ｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔ
ｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＡ、ｓｐ　Ａｒ
ｇ　Ｌ７Ｓ工１ｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　
Ｉｌｅ　ＭａｌＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙ
ｓ　Ｌｅｕ　Ｐｎｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＰｈｅＬｙｓ　
Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｌ
ｙｓ　Ｓｅｒ　ＶａｌＧｌｕ　Ｔｈｒ工ｌｅ　Ｌｙｓ　
Ｇｌｕ　ＡＳｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＬｙｓＰｈ
ｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｌ７
Ｓ　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　ＡｓｐＡｓｐ　Ｐｈ
ｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ
　Ｓｅｒ　ＶａｌＴｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖ
ａｌ　Ｇｌｎ　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｌａ工〕θＨｉｓ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｅｕ工ｌｅ　Ｇｌｎ　Ｍａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ
　Ｇｌｕ　ＬｅｕＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌ
ｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＬｙＦ３ＡｒｇＬｙｓＡｒｇ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙ　ＡｒｇＡｒｇＡｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ （但し、式中Ｇｌｎはグルタミン残基、　Ａｓｐはアル
パラギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはテロ
ノン残基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジ／残基、
　Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、
　Ａｓｎはアスパラギン残基、Ｌｅｕはロイノン残恭、
Ｐｈｅはフェニルアラニン残基、Ｇｌｙはグリシン残基
、Ｈｉｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒｔｄ、セリノ残基、
Ｔｈｒｉｄス゛レオニン残基、工１θはイノロイシン残
基、Ｔｒｐはトリプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン
残基、Ｍｅｔはメチオニン残基を表わす） で表わされる残基から多くとも５個のアミノ酸残褪の削
除又はげ加：（よる該残基−４体を表わす〕 で表わされる穎規な生理活性ペプチドに関する。

従来、抗ウィルス剤又は細胞増殖抑制剤とじてば、代ル
１ｆ拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質等が使用されてき
たが、これらは毒性が高く好ましくない。従って、毒性
の低い抗ウィルス剤又は細胞増殖抑制剤の開発が強く望
まれている。

最近、インターフェロン−α（以下「ＩＦ’Ｎ−α」と
称する）及びインターフェロン−β（以下「丁ＦＮ−β
」と称する）が低毒性の抗ウィルス剤として効果的であ
ることから、これらの研究が進んできた。しかし、ＩＦ
Ｎ−α及びＩＦＮ−βの細胞増殖抑制作用は満足できる
ものではない。一方、インターフェロン−γ（以下［Ｆ
Ｎ−ｒＪと称する）の研究は、ｒＦＮ−αおよびｒＦＮ
−βの研究に比較して、あまり進んでいない。

しかしながら、１９８１年１０月アメリカ合衆国サンフ
ランシスコ市で開かれたインターフェロン研究国際会８
二回年会（Ｔｈｅ　５ｅｃｏｎｄ　Ａｎｎｕａｌ　Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｉ
ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）において、
ＩＦＮ−γが単離されたという報告はなかったが、デビ
ット・ブイ・ゲーデル（Ｄａｖｉｄ　Ｖ、　Ｇｏｃｄｄ
ｅｌ　）　（、クエネンテック社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｋ
＋　Ｉｎｃ、）、アメリカ合衆国カリ７オルニア州〕に
よって、ＩＦＮ−γのメツセンジャーＲｓＡ（Ｊ７下「
ｍＲＮＡＪと略称する）の相補的ＤＮＡ（以下「ｃＤＮ
Ａ」と称する）のデオキシヌクレオチドの配列から推定
したプＯｒＦＮ−γ、ｒＦＮ−γ及びＩＦＮ−Ｔ様被プ
チドのアミノ酸配列が発表された。

これらプロＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ｒ及び丁ＦＮ−Ｔ様被
ブチＰのアミノ酸配列については後述する。さらに前述
の会！において、ｒＦＶ−γ様ペプチドの情報を有する
遺伝子含有細胞の培養液は抗ウィルス活性を有するが、
プｏｒＦＮ−Ｔの情報を有する遺伝子含有細胞の培養液
は抗ウィルス活性を有していないことも発表された。一
方、ＩＦＮ−ｒの情報を有する細胞の培養液の製造はい
まだに成功していないＯ 上述の如き現在の状況を鑑み、本発明者らは、抗ウィル
ス活性が高いだけでなく、細胞増殖抑制作用およびＮＫ
細胞増強作用にも優れた生理活性剤を開発すべく鋭意研
究を行なった。その結果、本発明者らは驚くべきことに
、上記の第（Ｉ）式で表されるペプチドが、上述のすべ
ての生理活性に極めて攪れでいるだけでなく、毒性が低
いということを見出し−ｒ’（−ｔ、、本発明はこの宜
しい知見に基ついてなされたものである。

従って、本発明の目的は抗ウィルス活性に優れているだ
けでなく、細胞増殖抑制作用及びＮＫ細胞増強作用にも
優れてｂる生理活性ペプチドを提供することにある。

本発明の他の諸口的及び諸利昏は、特許請求の範囲と共
に以下に記載する詳細な説明から明らかとなろう。

本発明によれば、次式（［）　：　ＢＣ７ＥＩＸＩＣ７
ＳＸ２Ｃ７ＳＸ３で表される倉現な生理活性ペプチド〔
但し、式（１）中、Ｂは、水素原子又はメチオニル基、
Ｃ１０は、システィン残基、ｘｌは、イソロイシルバリ
ルロイシルグリシルセリルロイシルグリノン残基から多
くとも２個のアミノ酸残基の削除又は付加による該残基
訪４体、Ｘ２がチロシン残基、そしてＸ３が次式（川 Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　　
Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｈａ　　Ｇｌｕ　　ＡｓｎＬｅ
ｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌ７Ｂ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ａ８
ｎ　　Ａｌａ　　Ｇ１７　　Ｈｉｓ　　５ｅｒＡｓｐ　
Ｖａｌ　Ａｌａ　　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　
Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ＬｓｕＧｌｙ　１１ｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙ
ｓ　　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　　（）ｌｕ　
５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　　工１ｅ　Ｍｅｔ　Ｇ
ｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　工１ｅ　ＶａｌＳｅｒ　Ｐｈｅ
　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　　
Ｌｙｓ　Ａｓｎ　　ＰｈｅＬｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇ
ｌｎ　Ｓａｒ工１ｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ
Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　　工ｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　Ａｓ
ｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＬｙｓＰｈｅ　　ｒｈｅ
　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　
　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　ＡｓｐＡｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ
　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　
ＶａｌＴｈｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｉ
ｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｈａ　ＩｃｅＨｉｓ　　Ｇｌｕ
　　Ｌｅｕ　　工１ｅ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ
　　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　ＬｅｕＳｅｒ　Ｐｒｏ　　Ａｌ
ａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ
　Ａｒｇ　　ＬｙｓＡｒｇＳｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ　Ｌ
ｅｕ　Ｐｈｅ　ＡｒｇＧｌｙ　Ａｒｇ　ＡｒｇＡｌａ　
　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ （但し、式中Ｇｌｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアル／
ミラギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、　Ｔｙｒはチ
ロシン残基、　Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙａはりジン残
基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基
、Ａ８ｎはアス・Ｑ−７ＪＦ″ン残基、ＬθＵはロイシ
ン残基、Ｐｈｅはフェニルアラニン残基、Ｇｌｙはグリ
シン残基、Ｈｉｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残
基、　Ｔｈ、ｒはスレオニン残基。

１１ｅはインロイシン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残
基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍｅｔはメチオニン残基
を表わす） で表わされる残基から多くとも５個のアミノ酸残基の削
除又は付加による該残基蒋４本を表わす〕が提供きれる
。

プ。ＩＦＮ−γのアミノ酸配列は、上記第（Ｉ＞式で表
される本発明の新規な生理活性ベプチ１（但し、式中Ｂ
は水素原子である）のＮ−末端に１２個のアミノ酸残基
が付加Ｉ７たもののアミノ酸配列の１つに一致する。し
かしながら、本発明の新規な生理活性にプチビが抗ウィ
ルス作用、細胞増殖抑制作用およびＮＫ細胞増強作用に
優れているのに対し、プ１−ＩＩＦＮ−γは、このよう
な作用を示さない。

１１１’Ｎ−γ様イプチｒのアミノ酸配列は、前記第（
１）式で表される本発明の新規な生理活性ベプチＰ（但
し、式中Ｂはメチオニル基である）　ＣｙｓＸｌで表さ
れるペプチド残基（但し、Ｃ７・及びＸ、は前記で定悸
した通りである）を除いたアミノ酸配列の１つに一致す
る。丁ＦＮ−Ｔのアミノ酸配列は、前記第（Ｉ）式で表
される本発明の新規な生理活性ペプチド（但し、式中Ｂ
は水素原子である）のＣｙｓＸｌで表される梨プチド残
基（但し、Ｃｙｓ及びＸｌは前記で定義した通りである
）を除いたアミノ酸配列の１つに一致する。しかしなが
ら、ＩＦＮ−ｒ様ペプチド及びＩＦＮ−ｒは、本発明の
生理活性ペプチドと比較して、抗ウィルス活性が劣るだ
けでなく、細胞増殖抑制作用及びＮＫ細胞増強作用も劣
る。

上述から明らかなように、本発明のペプチドは公知物質
であるプロＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ｒおよびＩＦＮ−γ様
（プチドとはアミノ酸配列が類似しているにもかかわら
ず、生理活性能が全く異なる新規な生理活性にプチドで
ある。

本発明の生理活性ペプチドと上述のプロＩ　Ｆ　Ｎ　７
’　ｒＩＦＮ−’ｒおよびＩＦＮ−Ｔ様ペプチドとの生
理活性能における著しい差違の原因については、まだ完
全には解明されていないが、その原因の１つとして以下
のことが考えられる。即ち、前記ＣＩ）式中ＣｙｓＸＩ
Ｃｒ＊Ｘ２　Ｃｙｓ　（但し、Ｃ７・、ＸｌおよびＸｌ
は前記定義の通シである）で表されるペプチド残基の３
個のシスティン残基が、本発明のペプチドの優れた生理
活性能に重要な役割を果していると考えられる。

そして、Ｃ２・Ｘ、Ｃ，・ｘ２Ｃ、・（但し、Ｃ１・、
ＸＩおよびＸｌは前記定義の通りである）からＣｙＩＸ
Ｉ　（但し、Ｃｙ＋及びＸＩは前記定義の通りである）
で表されるイプチド残基金除くと、生理活性は低下し、
ＣｙｓＸＩ　ＣｙｓＸ２　Ｃｙｓ（１ｕシ、Ｃｙｓ、　
ＸよおよびＸｌは前記定義の通りである）のＮ−末端に
１２個のアミノ酸が付加すると、生理活性が消失すると
考えられる。

前述のように、本発明の新規な生理活性ペプチドは次式
（Ｉｌで表される： ＢＣｙｓＸ４ＣｙｓＸ２ＣｙｓＸ３（［）（但し、式中
Ｂ＋　ＣＦ　”’　＋　Ｘｉ　＋　ｘ２およびＸ３は前
記定義の通りである） 上記（Ｉｌ式で表される本発明のペプチドは、上記（【
）式において特にＸｌがインロインルバリルロイノルグ
リシルセリルロインルグリシン残基かう多くとも２個の
アミノ酸残基の削除又は付加による該残基誘導体、Ｘｌ
がチロシン残基、Ｘ３が次式（■）Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐ
ｒｏ　Ｔｙｒ　Ｍａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌ
ｕ　Ａｓｎ　ＬｅｕＬ７Ｓ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｐ
ｈｅ　　Ａｓｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ　　Ｈｉｓ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｓｐ　　ＶａｌＡ：Ｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　
Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ工］
［ＬｅｕＬｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｒｐ　　Ｌｙｓ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｌ
ｙｓ　　ＩｌｅＭｅｔ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ
　　Ｉｌｅ　　Ｍａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ
　　Ｐｈｅ　　Ｌ＋−５Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　
　Ａｓｎ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　
　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　ｌ１ｅＧｌｎ　　Ｌｙｓ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｍａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　へＬｅｔＡｓｎ　　Ｖａ
ｌ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｓｅ
ｒ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　ＬｙｓＡｒｇ　
　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　
　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　５ｅｒＶ
ａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｖ
ａｌ　　Ｇｉｎ　　人ｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　ｌ
１ｅＨｉｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ
　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ
　　５ｅｒＰｒｏ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　
Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌｙｓ　　ｋｅｇ　　Ｌｙｓ　　
Ａｒｇ　　５ｅｒＧｌｎ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈ
ｅ　　Ａｒｇ　　Ｇｌｙ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｌ
ａ　　Ｓｅｔ　　Ｇｉｎ（但し、Ｑｌｎはグルタミン残
基、Ａｓｐはアス・ξラギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン
残基、Ｔｙｒはチロシン残基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌ
ｙｓはりジン残基、Ｇｌｕはグルタミン酸残基、Ａｌａ
はアラニン残基、Ａ　ｓ　ｎはアスパラぜン残基、Ｌｅ
ｕ　ｆ：ロイシン残＆、Ｐｈｅ　ｌ”ｊフェニルアラニ
ン残基、ａｎｙはグリシン残基、Ｈｉｓはヒスチジン残
基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒはスレオニン残基、Ｉ
ｌｅはイソロイシン残基、Ｔｒｐはトリプトファン残基
、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍ＝ｔはメチオ二ン残基を
表す） で表される残基から多くとも５個のアミノ酸残基の削除
又は付加による該残基誘４体のものである。

一方、インターフェロン研死国際会議第二回年令に分い
て、デビット・ブイ・ゲーデルの発表した前記プ０　工
ＦＮ　−γ、　工ＦＮ　−ｒ　、　工ＦＮ　−ｒ様Ｒプ
チドのアミノ酸配列は次式剃で表される。

式愉旧： Ｊ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ
　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＡｌａ　　Ｇｌｕ　
　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｅ　　Ｔｙｒ　
　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ａコ−ａ　　ＧｌｙＨｉｓ　Ｓ
ｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌ
ｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｇｌｙ工１ｅ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌ
ｕ　５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ工ｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇ
ｌｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　工１ｅ　Ｖａｌ　５ｅｒＰｈｅ
　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　
Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＡｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅ
ｒ工１ｅ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　
Ｔｈｒ工１θＬ７Ｆ３　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ
　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｌ７Ｂ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ
　　ＡＢｎ　　５ｅｒＡｓｎ　ＬｙＳＬｙｓ　Ｌｙｓ　
ＡｒｇＡｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅ
ｕＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　
Ａ［３ｐＬｓｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　ＧｌｎＡｒｇＬｙｅ
　Ａｌａ工１ｅ　Ｈｉｓ　ＧｌｕＬｅｕ工１ｅ　Ｇｌｎ
　Ｖａｌ　ＭｅｔＡｌａ　ＧｌｕＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒ
ｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｂ、ｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙ
ｓＡｒｇ、　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｍｅｔ
　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＡｒｇ　　
Ａ１３　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ〔但し、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、
Ｇｌｎ＋Ａｓｐ＋Ｐｒｏ＋Ｖａｌ＋Ｌｙｓ、Ｇｌｕ。

Ａｌａ　＋Ａｓｎ　＋Ｌｅｕ　＋Ｐｈｅ　＋ＱＩｙ　＋
Ｈｉ　ｓ　＋Ｓｅｒ　＋Ｉｌｅ　＋Ｔｒｐ＋Ａｒｇ＋Ｍ
ｅＬおよびＴｈｒは前記定義と同じ残基；またＪば、プ
ロＩＦＮ−γの場合にはＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈ
ｒＳｅｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　
Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　ｌ１ｅＶａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇ
ｌｙ　３ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙを（但し、Ｍｅｔ　、Ｌ
ｙｓ　＋Ｔｙｒ＋Ｔｈｒ＋Ｓｅｒ＋丁１ｅ＋Ｌｅｕ＋λ
ｌａ＋Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＶａｌは前記定義
と同じ残基である）、ＩＦＮ−ｒの場合には水素原子を
、ＩＦＮ−’ｒ様ペプチドの場合にはメチオニル基を表
す〕 本発明の新規な生理活性ベプチｒは、従来から公知の方
法、即ち、泉屋信夫等著「合成化学シリーズ−ペプチド
合成ｊ　１９７５年丸善株式会社発行；日本生化学会編
「生化学実験講座／タン・ξり質の化学Ｉ　−ＩＶＪ　
１９７７年東京化学同人発行；蛋白質・核酸・酵素臨時
増刊第２６巻４号「遺伝子操作」１９８１年共立出版株
式会社発行；および蛋白質・核酸−酵素別冊第２５号「
インターフェロン研究の進歩Ｊ　１９１３１年共立出版
株式会社発行に記載の方法により製造することができる
。具体的には、本発明の新規な生理活性にプチドを製造
する方法は次の３つに分類できる。即ち、 （１）　　化学合成により被プチドを製造する方法。

（２）　　化学合成により得られた遺伝子を宿主に導入
して、この宿主に４ブチＰを製造させる方法。

（３）生物工学的に得られた遺伝子を宿主【導入して、
この宿主にペプチドを製造させる方法。

゛上記の第１の方法の実施態様の１つとして、固相法に
ついて以下具体的に説明する。α−アミン保護基を有す
るアミノ酸のカルゼン酸基をジビニルベンゼンで架橋し
たポリスチレン樹脂などの支持体に結合させた後、α−
アミン保護基を選択的に除去する。遊離したアミン基に
、α−アミノ保５基を有する２番目のアミノ酸と反応さ
せる。このα−アミノ保護基の除去とα−アミン保護基
を有するアミノ酸の導入をくり返して目的のペプチド鎖
を得る。次にペプチドのＣ−末端アミノ酸のカルゼン酵
基と樹脂との間の共有結合を切断する。

この際、共有結合を切断するのに用いる試薬洗よッテは
、α−アミン保護基や側鎖保護基の除去を共有結合の切
断と同時に行なうことができる。

上述の固相法は、すべての反応が１つの容器で行なえる
のでペプチＰの製造が操作の上で簡単であり、フた得ら
れた生成物は反応に用いた溶媒に可溶であるので、反応
に用いた過量の試薬および副産物を濾過により除去でき
るために、目的の被プチドが短時間でしかも高い収率で
製造できることから、いわゆる液相法より有利な方法で
ある。

第１の方法で用いられる支持体としては、一般にジビニ
ルベンゼンで架橋した架橋度２係のスチレンポリマーで
、２００〜４００メソシニのサイズのものが望ましい。

樹脂をアミノ酸と反応させて結合する前に、樹脂に官能
基を導入し反応性を付与する。一般に、樹脂に官能基を
導入するため江は、Ｓ　ｎ　ＣＡ’２を触媒として用い
るフリーデル・クラフッ反応によりスチレンの芳香環と
クロロメチルメチルエーテルとを反応させ、該スチレン
の芳香環をクロロメチル化する方法がとられる。

第１の方法で用いられるα−アミン保護基としては、支
持体とα−アミン保独基を有するアミノ酸とのカンプリ
ングに際して安定であり、側鎖保護基や纜ブチｒ鎖に悪
影響を与えずに容易に除去でさるものが好ましい。上述
のような好ましいα−アミン保護基としては、第三ブト
ヤシカルＮニル（以下ｒＢｏＪ　と略称する）基が挙げ
られる。

このＢｏｃ基は、ｌＮＨＣｌ！／酢酸混合液、４ＮＨＣ
／／ジオキサン混合液あるいは５０％（ｗ／ｖ）Ｔ「ｏ
Ｈ（テトラフルオロ酢酸）／ＣＨ２Ｃ／２混合液を用い
て容易にペプチド鎖から除去することができる。

側鎖保護基としては、カップリング及びα−アミン保護
基の除去の時に安定であり、且つにプチド合成の段階で
容易に除去できる基が好ましい。

このような好ましい側鎖保護基としては、アルギニンの
側鎖保護用にはＮＯ３又はトシル基が、アス・ξラギン
酸の側鎖保護用にはベンジル基（以下「ｓ＝＋Ｊ　　と
略称する）基が、システィン及びグルタミン酸の側鎖保
護用にばＢｚｌ基又は０−メチルベン、：、フル（以下
１’−ｏＢ、Ｊ　　と略称する）基が、ヒスチジンの側
鎖保護用にばＢｚｌ基、ペン、ジルオヤ７カルボニル（
以下ｒＺＪと略称する）基又はＢｏｃ基が、す、ジンの
側銀保評用にはＺ基、トシル基又ハクインプロビルメチ
ルオキンカルゼニル（以下「ｌ）ｉｐｍｏｃＪ　　と略
称する）基が、メチオニンの側鎖保護用にはスルホキシ
ド基が、そしてセリン、スレオニン及びチロジンの側鎖
保杯用にはＢｚｌ基が挙げられる。

前記の本発明の生理活性ペプチドを得るだめの第２の方
法について以下に説明する。まず、得ようとする本発明
の生理活性ペプチドのアミノ酸配列の各アミノ酸に対応
する遺伝暗号を選び出す。

この選び出した各遺伝暗号を基にして、本発明の生理活
性ペプチドの遺伝情報を有する二重鎖ＤＮＡ断片を化学
合成する。得られた二重鎖ＤＮＡ断片を複製可能な発現
媒体であるベクターに組み込む。

次にＤＮＡ断片を組み込んだベクターを宿主に挿入する
。

ＤＮＡ断片を組み入れた上記ベクターを宿主は挿入する
ことによって、該宿主は形質転換され、その結果形質転
換体が形成される。次に常法により、この形質転換体を
遺伝子発現型の有無により元の宿主から単離する。得ら
れた形質転換体を培養することによって、本発明の生理
活性ベプチＰが製造される。この方法では、本発明の生
理活性ペプチドのｇ　（ＩＪ式中のＢがメチオニル基で
あるペプチド（以下〜【Ｃペプチドと称する）が製造さ
れる。

この〜ＩＣ被ブチＰをアミノペプチダーゼによって部分
的に加水分解することにより、本発明の生理活性ペプチ
ドの第（Ｉ）式中Ｂが水素原子であるペプチド（以下「
Ｈｃ−？プチド」と称する）が得られる。

上記の方法に用いられる宿主としては、微生物、噴孔動
物細胞および植物細胞等が挙げられる。これらの宿主の
内、微生物と補元動物細胞を使用するのが望ましい。望
ましい微生物としては大腸菌、枯草菌、好熱菌等の細菌
類、放線菌類及び酵母が挙げられる。

本発明で用いられる袂製可能な発現媒体即ちベクターは
、前記の宿主に感染し得るものである。

このようなベクターとしては、プラスミド、ファージ、
つ゛イルス等が挙げられる。上記のベクター及び宿主は
、生物から生物工学的に得られた遺伝子からペプチドを
製造する場合にも用いられる。

以下に示す各アミノ酸残基に対応する遺伝暗号が本発明
の生理活性ペプチＰの遺伝子を合成するために用いられ
る（但し、以下に示す遺伝暗号において、人はデオキシ
アデニル酸残基を、Ｇはデオキシグアニル酸残基を、Ｃ
はデオキシアデニル酸残基を、そしてＴはチミ・ジル酸
残基を表し、遺伝暗号の左側は５′−水酸基側を、遣ｆ
ｉ：暗号の右側は３′−水酸基側をそれぞれ表す）： フェニルアラニンに対する遺伝暗合はＴＴＴ又はＴＴＣ
１ロイシンに対する遺伝暗号ばＴＴλ、ＴＴＧ　。

ＣＴＴ、　　ＣＴＣ，ＯＴＡ又はＣＴＧ　、イソロイシ
ンに対する遺伝暗号はＡＴＴＳＡＴＣ又はＡＴ人、メチ
オニンに対する遺伝暗号はλＴＧ、バリンに対する遺伝
暗号はＧＴＴ　、　ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧ　、セリ
ンに対する遺伝暗号ばＴＣＴ、　ＴＣＣ，ＴＣλ、ＴＣ
Ｇ、　ＡＧＴ又はＡＧＣ。

プロリンに対する遺伝暗号１″ｉ：　ｃＣＴ　、　ＣＣ
Ｃ、ＯＣＡ又はＣＣａ　、スレオニンに対する遺伝暗号
はＡＣＴ　。

ＡＣＣ，ＡＣＡ又はＡＣＧ、アラニンに対する遺伝暗号
はＯＣＴ、　　ＧＣＣ，ＧＣＡ又はａｃａ　、チロシン
に対する遺伝暗号はＴＡＴ又はＴＡＣ、ヒスチジンに対
する遺伝暗号は、ＯＡ、Ｔ又はＣＡＣ、グルタミンに対
する遺伝暗号ばＣＡＡ又はＣＡＧ、アス・ξラギンに対
する遺伝暗号は八ＡＴ又はＡ、Ａ、Ｃ、リジンに対する
遺伝暗号はＡＡＡ又はＡ、ＡＧ、アスパラギン酸に対す
る遺伝暗号はＧＡＴ又はＧＡＣ、グルタミン酸に対する
遺伝暗号はＣＡＡ又はＧＡＧ、システィンに対する遺伝
暗号はＴＧＴ又はＴＧＣ、トリプトファンに対する遺伝
暗号はＴＧＧ　、アルギニンに対する遺伝暗号はＣＧＴ
　。

ＣＧＣＸＣＧ人、ＣＧＧ　１ＡＧＡ又はＡＧＧ　、そし
てグリシンに対する遺伝暗号はＣＧＴ　１ＧＧＯ、ＧＣ
Ａ又はＧＧＧが用いられる。また、以上の遺伝暗号の他
に、ＡＴＧはメチオニンの遺伝暗号であると同時に、ペ
プチド合成の開始暗号として用いられ、ＴＡＡ、　ＴＡ
Ｇ及びＴＧＡはペプチド合成の終止暗号として用いられ
る。遺伝子は、前記の４種類のデオキシリボヌクレオシ
ドが、３′部位と５′部位でリン酸、）エステル結合に
よって連結したものである。従って、４プチビの遺伝子
は、保護基と縮合剤を用いて化学合成できる。保護基と
してはデオキシリボヌクレオシドの予しめ決めておいた
位置を選択的に保護できるもので、被ブチｒ合波の反応
中安定であり、ヌクレオチド間の結合を切断することな
く容易洗除去できるものが望ましい。更に、反応中間体
の分離精製も容易に行なわなければならない。以上の理
由から、ペプチドの遺伝子を合成するには以下に述べる
トリエステル法が望ましい。

即ち、アミノ酸暗号に対応するデオキシリゼヌクレオチ
ｒのトリマーブロックと要すればダイマーブロックを初
めに合成する。次いで得られたブロックを縮合して、約
１２〜２３個のヌクレオチド鎖からなるオリゴマーを形
成するこの縮合反応は、ポリマーのような支持体を用い
る固相法により行なうことが望ましい。得られたオリゴ
マーをＤＮＡリガーゼを用いて伸長させることにより、
目的とするペプチドの遺伝子を形成する。

上記のデオキシリボヌクレオシドのアミノ基の保護基と
しては、デ万キシシチ、ジン及びデオキシアデノシンに
はベンゾイル基が、デオキシグアノシンにはインブチル
基が挙げられる。水酸基の保護基としては、トリチル基
、アシル基、・／リル基及びそれらの誘導体基を用いる
ことができる。これらの水酸基の保護基の中では、トリ
チル基の誘導体基が好ましく用いられる。縮合剤として
は、２．４．６−　トＩＪ　インプロピルベンゼンスル
フォニルテトラゾリド（以下しばしば「ＴＰＳＴｅ」と
略称する）のような強力な縮合剤が望ましい。デオキシ
リボヌクレオシドの縮合により得られたオリゴヌクレオ
チドの保５基は以下に述べる方法で除去することができ
る。まず、アミン保護基及びアシル誘導体基などの３′
−水酸基の保護基はアンモニア水洗よって除去し、次い
でトリチル基の誘導体基などの５′−水酸基保護基を８
０容景チの酢酸によって取り除く。

化学合成法による遺伝子の調製の利点は、ペプチドの生
産に使用する宿主の細胞内に大量に存在する遺伝暗号を
用いることによって４プチドの生産性を高めることがで
きるということである。

化学合成した遺伝子をベクターに組み込む方法、該遺伝
子が組み込まれたベクターを宿主に組み入れて宿主を形
質転換する方法および形質転換した宿主を培養して本発
明の新規な生理活性ペプチド。

を製造する方法は、以下に述べる自然の遺伝子を用いる
方法と同じである。

本発明の新規な生理活性ペプチドを製造する第３の方法
を以下に説明する。まず、本発明の新規な生理活婢ペプ
チＰの遺伝情報を有する二重鎖ＤＮＡ断片を生物工学的
に得る。得られたＤＮＡ断片を複製可能な発現媒体であ
る〈フタ−に組み込む。

該ＤＮＡ断片を組み込んだベクターを宿主である単細胞
生物に挿入することにより該単細胞微生物を形質転換し
て形質転換体を得る。該形質転換体を該ＤＮＡ断片を組
み込んだベクターの有する表現型によって、元の単細胞
生物から分離する。分離した該形質転換体を培養して本
発明の生理活性ペプチＰを製造する方法である。

上記の第３の方法では特定の種類のペプチドが製造され
る。即ち、上記の方法では、前記一般式（Ｉ）において
Ｘｌがインロインルノζリルロイシルグリシルセリルロ
イシルクリシン残基、Ｘｌ　カチロソン残基、そしてＸ
３が前記第（［）式で表される特定のペプチド残基であ
る本発明の新規な生理活性にプチドが製造される。更に
、この方法により、前記一般式（Ｉ）においてＸｌ及び
Ｘｌが上述と同じで、前記第（［）式で表されるＸ３の
綬プチド残基のアミノ酸残基のいくつかが、他のアミノ
酸残基に変わったものか削除されたもの、又は他のアミ
ノ酸残基が付加したものが前記の方法によって製造され
る。この第３の方法の実施態様の１例を以下に詳細に説
明する。まず、ヒトの末悄血すンノぞ球をマイトジェン
で刺激して、ｍＲＮＡの生成を誘発させ、次にリンパ球
を変性する。次いで、ｍ　ＲＮＡを含有するＲＮＡを変
性したリンパ球から遠心分離する。次に得られたＲＮＡ
の中からｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを
用いて分離する。得られたｍ　ＲＮＡを鋳型にして、オ
リゴ（デオキシリボシルチミン−燐酸）〔以下しばしば
オリゴ（ｄ　Ｔ　）Ｊと略称する〕、デオキンアデノジ
ン三燐酸（以下しばしば「ｄＡＴＰ」と略称する）、デ
オキノントジン三燐酸（以下しばしば７ｄｃＴｐＪと略
称する）、デオキ／グアノジン三燐酸（以下しばしば「
ｄＧＴＰ」と略称する）及びデオキシリボシルチミン三
燐酸（以下しばしば「ｄＴＴＰ」と略称する）の存在下
、逆転写酵素の作用により、上記ｍＲＮＡと相補的ＤＮ
Ａ（以下しばしば［ｃＤＮａ、Ｊと略称する）との二重
鎖をつくる。このようにして得られたｍＲＮＡ−ｃＤＮ
Ａ二重釦二重鎖アルカリ処理又は熱処理によってｍＲＮ
Ａを除去し、ｃＤＮＡを得る。このｃＤＮＡを鋳型にし
て、ｄＡＴＰ。

ｄＣＴＰ、　ｃＧＴＰ及びｄＴＴＩ’の存在下、逆転写
酵素又はＤＮＡポリメラーゼＩの作用により、一端が連
結した二重鎖ＤＮＡをつくる。このようにして得たＤＮ
Ａの端の連結部分をヌクレアーゼＳ１で切断する。

ｄＡＴＰの存在下、ターミナルトランスフェラーゼの作
用により、オリゴ（デオキシアデノジンー燐酸）〔以下
しばしば［オリゴ（ｄＡ）Ｊと略称する）を上記で得た
二重鎖ＤＮＡの３′−末端に付加させる。

一方、プラスミドＩ）ＢＲ３２２（エフ・ゼリパー等、
「コンストラクション・アンド・キャラクタライゼーン
ヨン・オフ・二ニー・クローニング・グイヒクルス■；
ア・マルチノξ−）ξス・クローニング・システム」、
・ノーン、１１月（１９７７）　［Ｆ、　Ｂｏｌｉｖａ
ｒｅＬ　ａｌ　＋　”　　ｃｏｎｓｊｒａｃ４ｉｏｎ　
ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎ
ｅｗ　ｃｌｏｎｉｎｇｖｅｈｉｃｌｅｓ　ＩＩ　；　Ａ
ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｙｓｔ
ａｍ　”　＋　　Ｇｅｎｅ　ｒＮｏｖｅｍｂｅｒ　（１
９７７）　〕）を制限酵素ＥｃｏＲＩで開裂し、次いで
λ−エキンヌクレアーゼで処理する。続いテ、ｄＴＴＰ
の存在下、ターミナルトランスフェラーゼの作用により
、開裂したプラスミｒ　ｐＢＲ３２２の３′−末端にオ
リゴ（ｄＴ）を付加させる。上記のオリゴ（ｄＡ）の付
加した二重鎖ＤＮ＆とオリゴ（、ｉＴ）の付加した線状
のプラスミドｐＢＲ３２２を混合し、アニーリングする
。アニーリングにより得られたプラスミドを大腸菌ｘ１
７７６株〔アメリカ合衆国メリーランド州ロンクビルの
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ
ＣＣ）寄託番号第３１２４４号）に挿入して、該菌株を
形質転換する。

形質転換された菌株はアンピシリンなどの薬剤耐性で選
択する。一方、前述と同様の方法でマイトジェンで誘発
されたｍＲＮＡを調製し、得られたｍ　ＲＮ　ｉ’−の
５′−末端に、Ｔ４ボリヌクレオチ１キナーゼとＣｒ−
３２ｐ″ＩＡＴＰを用いてラベルする。得られた３２ｐ
でラベルしたｍＲＮＡ（以下しばしばｐ２ｐ−ｍＲＮＡ
Ｊと略称する）に、この”Ｐ−ｍＲＮＡの２００倍の量
のラベルしていないｍ　ＲＮ　Ａを加える。上記のラベ
ルしていないｍ　ＲＮＡはマイト・ツエンによる刺激を
受けていない、従って、本発明の生理活性ペプチドを産
生じていないヒトの末哨血リンノξ球から抽出した。前
記で得たｍＲＮＡの混１合物をプローブとして、コロニ
ーハイブリダイゼーション法により形質転換した菌株を
評価した。この方法によれば、”Ｐ　ｍＲＮＡは本発明
の生理活性ペプチドを産生することのできるマイト・ツ
エンで誘発した細胞中に存在するが、マイトジェンで誘
発されていない細胞中には存在しないｍＲＮＡを鋳型と
して形成したＣＤＮＡと特異的にハイブリッドを形成す
る。上述の３２Ｐ−ｍＲＮＡとハイブリッドを形成する
該ｃＤＮＡを含有する形質転換株は、オートラジオグラ
ム上に陰影として容易に検出できる。上述の３２Ｐ　ｍ
　ＲＮＡと・・イブリッドを形成するｃＤＮＡを含有す
る形質転換株を変性ｌ〜、その形質転換株の細胞中のＤ
ＮＡを回収する。回収して得られたＤＮＡから該ｃＤＮ
Ａ断片を含有するプラスミドＤＮＡを超遠心により分離
する。このようにして得られたプラスミドＤＮＡを制限
酵素Ｐｓ目で切断し、次いで制限酵素ＢｓｔＮＩで部分
的に分解する。続いて、公知の方法（ケイ・イタクラ等
、サイエンス、ｇｔ９ｓ巻、　１０５６頁。

１９７６年（Ｋ、　Ｉ＋ａｋｕｒａ　Ｃｔ　ａｔ　：　
５ｃｉｅｎｃｅ＋　Ｖｏｌ、　１９８　＋　ｐ、１０５
６（１９７６）：］）に従ってつくった以下のオリゴヌ
クレオチ蹟 ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴ人ＴＯ ＧＴＣＣＴＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＴＣ ＴＧＡＣＡＡＴＡ ＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＣ ＴＡＧＧＡＣＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧ （但し、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴは前記定義と同じであり、上
記各式の左側は５′−水酸基側を、右側は３′−水酸基
側を表す） を互いにアニールして、開始トリプレットＡ、Ｔ（４−
有し、Ｅｃ　ｏ　ＲＩ及び３ｓ　ｔＮ［切断端をもつ二
重鎖ＤＮＡオリゴマーを調製する。このようにして調製
した二重鎖ＤＮＡオリゴマーをＴ４ＤＮＡＩＪガーゼの
作用により、制限酵素ＢｓｔＮＩ及びＰｓ　ｔＩで切断
した前記ｃ　ＤＮＡに結合させる。こうして得られたＤ
ＮＡ断片をプラスミドｐＢＲ３２２のＥｃｏＲｆで切断
した部位とＰｓＬＩで切断した部位と間に組み込んだ。

次に、大腸菌のトリプトファンオ被ロンの７’。

モーター、オイレーター及びリゼンーム結合部位を有し
、両端にＥｃｏＲＩ切断端を有する３００塩基対のＤＮ
Ａ断片を、プラスミドｐＢＲ３２２に組み込まれた前記
ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断部位に接続し、該プラスミＰ
に組み込む。

次いで、このようにして得られたプラスミＰを大腸菌の
細胞内に導入する。上述の方法に従えば、該ｃＤＮＡ断
片が前記のプロモーターの後に、ｍＲＮＡへの転写方向
に正しく接続していれば大腸菌の細胞中では、該ｃＤＮ
Ａは前記オにロンのプロモーターの働きでｍ　ＲＮＡに
転写される。更に、転写されたｍ　ＲＮ　Ａは開始トリ
プレット暗号の部分からアミノ酸に翻訳され、目的のに
プチドがつくられる。

このようにして、１ｊの培養液中の培養した大腸菌の細
胞から、目的の被ブチＰを１ｑ抽出することができる。

つぎに、目的の被ブチ１を産生する大腸菌の細胞を培養
後集め、溶菌する。溶菌した細胞を含む溶液中の核酸を
リセヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼで分解
した後、目的の被ブチｒを６５係飽和度の硫酸アンモニ
ウムで堪析する。得られた塩析沈殿画分をコンドロール
ドボアガラスピーズ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｅ
　ｇｌａｓｓ　ｂｅａｄｓ　）を用いて精製する。

不発明の新規な生理活性被ブチｒのアミノ酸配列を決定
する方法は以下の通りである。まず、最初に本発明の新
規な生理活性ペプチドのメチオニル結合をブロモシアン
で切断する。切断して得たペプチド断片をセファデック
スａ−１００（ファーマシア・ファイン・ケミカル社製
、スウェーデン）を用いて分離して、各断片のアミノ酸
配列を公知の高精度アミノ酸配列分析で、各断片のＮ−
末端から順に決定していく。一方、本発明の新規な生理
活性ペプチドをトリプシンで部分分解し、得られたペプ
チド断片をセファデックスＣｒ−１００カラムを用いて
分離する。分離した各断片を上述と同様の方法で、各断
片のアミン配列を各断片のＮ　−末端から順に決定して
いく。ブロモシアンで切断して得られた被ブチ１の各断
片のアミノ酸配列とトリプシンで切断して得られた被ブ
チＰの各断片のアミノ酸配列を比較することによって、
該ペプチドの各断片の配列を決定する。このようＫして
、本発明の新規な生理活性ペプチドのアミノ酸配列を決
定する。

細胞増殖の抑制、例えば悪性腫瘍細胞の増殖抑制を目的
とする場合、本発明のペプチドは一般には静脈内、筋肉
内又は皮下に注射投与することができる。本発明のペプ
チドの１日投与量は、もちろん患者の年令、病状及び体
重により異なるが、通常、成人１人尚りＩ　Ｘ　１０’
〜Ｉ　Ｘ　１０’単位／日の量で注射投与される。

ウィルス性の疾病を治療するために、軟膏剤Ｌｏｇ尚り
本発明のにプチドＩ　Ｘ　１０’〜ｌ　Ｘ　１０ｅ単位
含有する軟膏剤を皮膚に塗布することができる。

従来公知の医薬上許容しうる軟膏三与剤を用いて、本発
明の４プチドを含有する軟膏剤を調製することができる
。本発明のベプチ１を含有する軟膏剤の１日投与量は、
もちろん患者の年令及び病状により異なるが、通常不発
明のペプチド基準でｌＸｌ０’〜Ｉ　Ｘ　１０’単位と
なる量を分割して塗布することができる。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本
発明は以下の実施例に限定されるものではない。

０Ｂｚｌ　　：側鎖保護基の１つであるオルト−メチル
ベンジル基ｄλ　：　デオキシアデノシン ｄＣ゛　デオキジンチノノ ｄＧ　：　デオキシアデシン ｄＴ　：　デオキシリボンルチミン ｄｂｚＡ：デオキシペンジルアデノシンｄｉｂａ：デオ
キシイソブチルグアノシン（ＤＭＴｒ）Ａ　　：　５’
−、ノメトキシトリチルアデノ／ン（ＤＭＴｒ）Ｔ　　
：　　５’−ジメトキシトリチルチミジンａｏ’ｒｐニ
ア’オキシグアノシン三燐酸ｄＡＭＰ：　　デオキシア
デノシン−燐酸ＢＳＡ　　：　牛血清アルブミン ＳＥＡ　　：　　マイトジェンの１種であるスタフイロ
コツカル・エンテロトキシン人 ＥＤＴ人゛　エチレン、ジアミン四酢酸ＳＤＳ　　：　
　ドデシル硫酸ナトリウムＤＴＴ　　：　　、ジチオス
レイトール（クリ−ランドの試薬）実施例１ 工程１（樹脂の洗浄） 樹脂（Ｂｉｏ−Ｂｅ＋ｄ　Ｓ　　Ｘ２．２００〜４００
メツシペ２チジビニルはンゼン架橋スチレンポリマーの
商品名、パイオーラッド社製、アメリカ合衆国）：）１
５０ｇを１どの蒸留ベンゼンに攪拌しながら加える。３
０分後、樹脂をガラスフィルターで戸数し乾燥する。

次に乾燥した樹脂をＩＩ！のメタノール中に攪拌しなが
ら加え、３０分後にガラスフィルターで戸数して乾燥す
る。乾燥して得られる樹脂をメタノール、メタノール／
水及び水で順次洗浄する。洗浄した樹脂を１ｅの１ＮＮ
ａＯＨ水溶液中に加える。得られる混合物を沸騰水浴中
で１時間攪拌した後、樹脂を戸数し、水洗する。次に、
得られる樹脂を１どのＩＮ塩酸水溶液中に加え、沸騰水
浴中で１時間攪拌する。次いで樹脂を戸数し、水洗する
。

水洗して得られる樹脂を４ｇの蒸留水に懸濁した後、静
置する。静置３０分後、浮遊する微細な樹脂をデカンテ
ーションにより除去する。このようにして、樹脂を沈殿
物として得る。沈殿した樹脂はガラスフィルター上に戸
数し、メタノールで洗浄する。洗浄した樹脂を少量のジ
メチルホルムアミド（以下［ＤＭＦｊと略称する）に加
え、３０分間８０℃で攪拌した後、樹脂を戸数してＤ　
Ｍ　Ｆおよびメタノールで洗浄する。更に、樹脂を２１
！のメタノール中で１時間攪拌した後戸数する。得られ
る樹脂を風乾した後、さらに１００℃で２時間真空乾燥
する。

工程２（クロロメチル樹脂の製造） 工程１で得られた樹脂２５ｇと蒸留したクロロメチルメ
チルエーテル１００ｒｒＬＩ！を１ｅの丸底三Ｊフラス
コに入れて、２５℃で静かに１時間攪拌して樹脂を膨潤
させた後、０℃に冷却する。この膨潤した樹脂に１．８
８−の５ｎＣ１４を含有する５０ｒｎｉ！のりロロメチ
ルメチルエーテルを０℃に保ったまま攪拌しながら３０
分間かけて加えた後、さらに３０分間攪拌して反応生成
物を得る。このようにして得られる生成物をガラスフィ
ルターで戸取し、５００−のノオキサンー水（ｌ：１）
、次いで５００ｒｎｌ！のジオキサン−３Ｎ塩酸（３：
　１　）で静かに洗浄する。更に、生成物を水、ジオキ
サン−水及びメタノールで順次洗浄した後、減圧下１ｏ
ｏ℃で乾燥する。

■程３ Ａ、　　　　（ε　−Ｚ　−リ　うり　ン　）１１ｇの
Ｌ−リジン銅環に、ｔｏｇのＮ　ａ　ＨＣ０３と１２ｒ
ｎｌ！のｚ−ｃｅを４分の１ずつ１０分おきに水冷下攪
拌しながら加え、さらに３．５時間攪拌する。

このようにして得られる沈殿物を戸数し、水、エタノー
ルおよびアセトン／エーテルで順次洗浄する。洗浄した
沈殿物を２５０ｍ７！の水に懸濁し、次にこの懸濁液に
４１２ｒｒＬｌの６Ｎ塩酸水溶液を加えることにより上
記沈殿物を溶解させる。次いで、得られる溶液ＫＨ２５
ガスを１〜２時間通気する。その結果生成するＣｕＳを
ハイフロス−ラミーセル（和光紬薬製、日本）を用いて
戸去し、このＣｕＳをＩＮＮ酪酸水溶液洗浄する。上述
の操作で得られる涙液及び洗液を集めて、空気を通しＨ
２Ｓ　を除去する。

その後、この溶液を水冷下溝アンモニア水を加えてｐＨ
６，５Ｋｌ、、冷蔵庫で２時間放置する。その結果得ら
れる沈殿物を戸数し、水、エタノール及びエーテルで順
次洗浄する。このようにして、融点２５４℃のε−ＺＩ
Ｊ、ジン１０ｇが得られる。生成するε−Ｚ−リジンの
収率ば６５係である。得られるε−２ＩＪジンの再結晶
は、希塩酸に溶解した後、アンモニア水で中和して行う
。

Ｂ、（Ｇ−Ｎｏ２−アルギニン） 発煙硝酸１２０−と発煙硫酸７５ｍ１の混合液を氷冷し
、この混合液に１１０ｇのＬ−アルギニンｑ２塩を攪拌
しながら除々に加える。更に、濃硫酸４５ゴを上記の混
合液に加える。得られる混合液を１時間攪拌した後、氷
片中に注ぎ、濃アンモニア水でｐＨ８に調節する。次に
該混合液を酢酸でｐＨ６に調節した後、冷蔵庫内で約４
時間放置する。

その結果生じる沈殿を戸数し、熱水より再結晶する。得
られる結晶をエタノール及び−）臣チルエーテルで順次
洗浄し乾燥する。

との二うにして融点２５１℃のＧ−Ｎｏ２−アルギニン
６０ｇが得られる。Ｇ−ＮＯ２−アルギニンの収率は５
０係である。

Ｃ，（ｉｍＢｚｌ−ヒスチジン） ２０ｇのＬ−ヒスチ・クン塩酸塩Ｈ２０を、　Ｐライア
イス−アセトンの浴中で一３０℃に冷却した２００ｍ１
の液体アンモニアに溶かし、この溶液に金属ナトリウム
の小片を、溶液の青色が消えずに残るようになるまで攪
拌しながら加える。次に少量のヒスチジンを、該溶液の
青色が消えるまで加えた後、塩化ベンジルを該溶液に滴
下する。この混合溶液を３０分間攪拌した後、この混合
溶液中のＮＨ３を室温で大気圧下蒸発させ、次いで水流
ポンプを用いて減圧下ＮＨ３を除去する。ＮＨ，除去後
の残渣を１００ｍＡ！の氷水に注ぎ入れる。得られる混
合液をジエチルエーテルで抽出した後、不溶分は戸去す
る。

得られる溶液に希硫酸を加えてｐＨ８に調節し、冷蔵庫
内で３時間放置する。その結果生じる沈殿物を戸数し、
７０重量％エタノールから再結晶する。

融点２４８℃のｉｍＢｚｌ−ヒスチ・ノン１３ｇが得ら
れる。ｉｍＢｚｌ−ヒスチジンの収率は５０条である。

Ｄ、（０−ＢＺＩ−セリン） ２３７ｇのアセチル−Ｌ−セリンを２３５ｍＡ’の５Ｎ
ＮａＯＨ水溶液に溶かし、ｐ［（を７．３に調節する。

この溶液に４ｇのタカジャスターゼ（三共株式会社製）
を２５−の０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，７、Ｃａ
Ｃｌ２０．０２５Ｍ含有）に溶解して得られる溶液を加
え、更にトルエン数滴を滴下後、得られる混合液を３６
℃で１０日間放置する。生じる沈殿を戸去し、Ｐ′ｒＬ
を濃縮した後、この濃縮Ｐ液にアセトンを加えて結晶を
得る。このようにして１００ｇの０−ＢＺＩ−セリンが
得られる。同様の方法に従って２４０ｇのアセチル−Ｌ
−スレオニンから１００ｇのＯＢｚｌ　−スレオニンが
得られる。

Ｅ、（０−Ｂｚｌ−チロシン） １．８ｇのＬ−チロシンと１．２ｇのＣｕ　Ｓ　０４　
’　５Ｈ２０を５ｒｎｉ！の２ＮＮａＯＨ水溶液と１０
ｍ１の水との溶液に懸濁して２時間攪拌する。この懸濁
液に６０−のメタノールを加え、次いで１．２−の臭化
ベンジル及び０．７−の２ＮＮａＯＨ水溶液を徐々に加
える。１５分後０，３づの臭化ベンジル及び０１８−の
２　Ｎ　ＮａＯＨ水溶液を更に加える。得られる混合液
を１時間攪拌した後、生じる沈殿を戸数し、この沈殿を
メタノール−水（１：３）で洗浄する。このようにして
、２ｇの０−Ｂｚｌ−チロシンの銅塩を得る。この０−
Ｂｚｌ−チロシンの銅塩と２０ｒｎｌ！のＩ　Ｎ　ＥＤ
ＴＡ水溶液とを乳鉢内でこねて得られる混合物から固形
分をＰ取し、この固形分を水洗する。洗浄した生成物を
少量のＥＤＴＡを含有する熱水から再結晶することによ
り、融点２２３℃を有する０−Ｂｚｌ−チロシン１ｇが
得られる。０Ｂｚｌ−チロシンの収率は３０チである。

Ｆ、（ＳＢｚｌ−システィン） １５７ｇのし一システィン塩酸塩を２１！の２ＮＮａＯ
Ｈ水溶液に溶かし、この溶液に２５６ｇの臭化ベンジル
を水冷下激しく攪拌しながら添加後、冷室で５時間攪拌
する。その後、該溶液を酢酸でｐＨ５に調節して沈殿物
を生成させる。生成した沈殿物をＪｉ′取し水洗する。

このようにして、融点２１２℃のＳ　Ｂｚｌ−システィ
ン１６０ｇが得られるＯ　Ｓ　ＢＺＩ−システィンの収
率ば７０％である。

上述と同様の方法で１６０ｇのアス・ξラギン酸から１
５０ｇの０−Ｂｚｌ−アスノξラギン酸が、１６０ｇの
グルタミン酸から１５０ｇの０−ＢＺＩ−グルタミン酸
が得られる。

Ｇ、（Ｂｏａ−アミノ酸） ２９ｇのＬ−プロリンを２５０ｍ１のｌＮＮａＯＨ水溶
液に溶かして得られる溶液に水を加えて４００ｒｒ／！
の溶液とする。この溶液に１５０ｒＩＩｉ！のテトラヒ
ドロフランを添加後、１０℃で激しく攪拌しながら、該
溶液に１００ｄのＢｏｃ−Ｃｌを５分の１ずつ１０分毎
に加える。一方、２ＮＮａＯＨを前記のＢｏａ−Ｃ２を
加えるたびに該溶液に加えて、溶液のｐＥ（をｉ〜９に
保つようにする。２時間後、この混合液をジニチルエー
テルで抽出し、得られる水層を０．５　Ｍクエン酸水溶
液で酸性にし、析出する油状物質を酢酸エチルで抽出す
る。得られる抽出物を少量の水で洗浄しＮ　３２　Ｓ　
０４で乾燥後、減圧下で濃、縮する。濃縮抽出物に石油
エーテルを加えて、冷蔵庫内に放置し結晶を生成させる
。生成結晶を戸数して乾燥する。

このようにして融点７８℃のＢｏａ−／ζリン３０ｇを
得る。Ｂｏｃ−バリンの収率は５５チである。

Ｈ，（その他のＢｏｃ−アミノ酸） 上述と同様の方法を行うことにより、Ｂｏｃ−グリシン
１５ｇ、Ｂｏａ−アラニン１６ｇｑＢｏｃ−ａイシン１
５ｇ５　Ｂｏｃ−インロイシン１５ｇ１Ｂｏｃ−セリン
（Ｂｚｌ）１４　ｇ、　　Ｂｏｃ−スし／オニ７（ｓ、
　＋　）１４ｇ、Ｂｏｃ−システィン（Ｂｚｌ）１５　
ｇＳＢｏａ−メチオニン１５ｇ５　Ｂｏａ−プロリン１
２ｇ、Ｂｏａ−アス、ａラギン酸（ＯＢｚｌ）　　１５
　ｇ、　　Ｂｏｃ−グルタミンｅ（ＯＢｚｌ）　　Ｌ　
５　ｇ、　　Ｂｏｃ−グルタミ７１５ｇ。

Ｂｏａ−ヒスチジン（Ｂｚｌ）　１２　ｇ　、　　Ｂｏ
ｃ　−Ｏイシン（Ｚ）　１３　ｇ、　Ｂｏａ−アルギニ
ン（ＮＯ２）　１５　ｇｌＢｏｃ−フェニルアラニン１
５ｇ１　Ｂｏｃ−チロシン（Ｂｚｌ）’１５　ｇ及びＢ
ｏｃ　　ｈリプトファンＬｏｇがそれぞれ、グリシン３
０ｇ１アラニン３Ｑｇ、。

イシン３０ｇ１インロイシ４ン３０ｇ１セリン（ｓ、＋
）３０　ｇ、スレオニン（ｓｚ＋）３０　ｇ、システィ
ン（ｓｚ＋）３０　ｇｓ　メチオニン３０ｇ１プロリン
３０　ｇ。

アスノξラギン酸（ＯＢｚｌ）　３０　ｇ、グルタミン
酸（ＯＢｚｌ）　３０　ｇ、グルタミ７３０ｇ１　ヒス
チジン（ＢＺＩ）３０　ｇ　１　　リジン（ｚ）、３ｏ
ｇ、アルギニン（ＮＯｘ）　３０　ｇ、　７ｘニルアラ
ニア　３０　ｇ　Ｎチ０シン（Ｂｚｌ）３０　ｇ及びト
リプトファン３０ｇから得られる。

工程４　（Ｂｏｃ−グルタミンと樹脂との結合）２ｇの
クロロメチル樹脂（ｃｌｌ総量１４６９モル、２ミリモ
ルのＢｏａ−Ｌ−グルタミン、１．８ミリモルのトリエ
チルアミン及び１２ｍ１のジメチルボルムアミドの混合
物を室温で２４時間振とぅする。

次にガラスフィルターを用いて上記混合物から固形分を
戸数し、得られる固形生成物をそれぞれ７００ｒｎ！！
のツメチルホルムアミ１、エタノール、酢酸／エタノー
ル及び塩化メチレンで順次洗浄する。

その後生成物を室温で減圧下乾燥する。生成物のアミノ
酸含量を測定するために、該生成物５０■を秤量し、１
２Ｎ塩酸水溶液とジオキサンの１：１容量比の混合物中
に入れて２４時間加、水分解した後、アミノ酸分析計で
測定する。生成物のアミノ酸含量は０．２　ニー　ＩＪ
モル／ｇである。

工程５　（Ｂｏａ−３ｅｒ−Ｃ）Ｉｎ−樹脂）工程４で
得られた２ｇのＢｏｃ−グルタミン（以下「Ｂｏｃ−Ｇ
ｌｎｊと略称する）樹脂を１６０−の酢酸中に入れて室
温で６時間放置する。次にこの混合物をガラスフィルタ
ーで濾過する。得られる固形物を１６０ｍ１の酢酸中に
入れて振とうし、戸数する。

この操作を３回くりかえす。次に上記の固形物を１６０
ｍＡ’のＩＮ塩酸水溶液／酢酸中に入れて室温で３０分
間振とうし、樹脂からＢｏａ基を除去する。

このようにして得られた生成物を戸数し、酢酸、エタノ
ール及びジメチルホルムアミドで、それぞれ３回ずつ順
次洗浄する。洗浄生成物を１６０ｍの１０重量％トリエ
チルアミン／、）メチルホルムアミｌ、ｊ中に入れて１
０分間振とうして中和反応を行なう。その結果、得られ
る生成物を戸数してジメチルホルムアミＰで洗浄し、次
いで塩化メチレンで洗浄する。洗浄生成物を１２−の塩
化メチレンに２ミリモルのＢｏａ−セリン（Ｂ−１）を
溶かした溶液中に入れ、振とうする。１０分後、この混
合物に６０−の塩化メチレンに２０ミリモルのジシクロ
へキシル力ルゼジイミドを溶かした溶液中に加え、室温
で２時間振とうしてカップリングを行なう。その結果得
られる生成物を戸数し、塩化メチレン及びエタノールで
順次洗浄する。

工程６　（Ｂｏａ−ペプチジル樹脂） 工程５と同様の操作を繰り返してアミノ酸を伸長させて
以下のＢｏｃ−ペプチジル樹脂を得る二ＢＯ（−Ｈｃ”
（ｏ）−樹脂、 Ｂｏｃ　ＨＣ”（１２１、−１２６、−１２７、−１３
３、−１３６，−１５０，−１５１）−４脂、Ｂｏ　ｃ
−ＨＣ’　（−１’２１、−１２６、−１２７、−１３
人−１３６）−樹脂、Ｂｏｃ−ＨＣ”（−１５０，１５
１）−４！ｄ脂、Ｂｏａ−ＨＣ”（＋１２１、＋１２６
．＋１２７、＋１３３．　＋１３６、＋ｔｓｏ、　＋ｔ
ｓｔ　）−樹脂、ＢｏｃＨＣ’″（＋１２１、＋１２６
、＋１２７、＋１３３．　＋１３６）４脂、ＢＯＣ−Ｈ
Ｃ”（＋１５０．　＋ｔｓｔ　）−１脂、Ｂ　ｏ　ｃ−
ＭＣ’　（０）−樹脂、 Ｂｏａ−ＭＣ”（１２１、−１２６、−１２７、−１３
３，−１３６，−１５０，−１５１）−樹脂、ＢＯＣ−
ＭＣ”　（−１２１、−１２６、−１２７、−１３３Ｓ
−１３６）−４１１脂、Ｂ　ｏ　ｃ　−ＭＣ”　（１５
０、−１５１）−樹脂、Ｂ　ｏ　ｃ−ｉｓｆｃ４（＋　
１２１、＋１２６、＋１２７、＋１３３．　＋１３６．
　＋１５０、＋１５１）−［脂、Ｂｏｃ−ＭＯ”（＋１
２１、＋１２ｆ３．　＋１２７、＋１３３．−１−ｔ３
６）−樹脂及びＢｏ　ｃ　−ＭＣ”　（−１−１５０，
＋１５１　）−樹脂但し、八（Ｃ”はメチオニルＨＣ”
を表し、ＨＣ”（０）はＣｙｓ　（Ｂｚｌ）　Ｉｌｅ　
”／ａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　（Ｂｚｌ）　Ｌｅ
ｕＧｌｙ　ＣＶＳ　（Ｂｚｌ）　Ｔｙｒ　（Ｂｚｌ）　
Ｃｙｓ　（ＢＺＩ）　Ｇｉｎ　Ａｓｐ（ＯＢｚｌ：）　
Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　（Ｂｚｌ）　Ｖａｔ　Ｌｙｓ　（Ｚ）
　Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　（’０Ｂ
ＺＩ）　　人ｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　（Ｚ）　　
Ｌｙｓ　　（Ｚ）Ｔｙｒ（ＢＺＩ）　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　
Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　（Ｂｚｌ）　Ｓｅｒ　（Ｂｒ
ｌ）Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　
（ＯＢｚｌ）Ａｓｎ　Ｇ−１ｙ　Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）　Ｌ
ｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙ
ｓ　（Ｚ）　ＡｓｎＴｙｐ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｇｌｕ　
（ＯＢｚｌ）　Ｇｌｕ　（ＯＢｚｌ）　Ｓｅｒ　（Ｂｚ
ｌ）、Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）　Ａｒｇ　（ＮＯ２）　Ｌ
ｙｓ　（Ｚ）　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇ１ｎ５ｅｒ　（Ｂｚ
ｌ）　Ｇｉｎ　１．Ｉｅ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　（ＢＺＩ）
　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　
（Ｚ）Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　（Ｚ）Ａｓ＋　
　ＰｈｅＬｙｓ　　（Ｚ）　　人ｓｐ　　（ＯＢｚｌ）
Ａｉｐ　　（ＯＢｚｌ）Ｇ、ｌｒ＋　　Ｓｅｒ　　（Ｂ
ｚｌ）１１ｅ　　Ｇｌｎ　　Ｌｙｓ　　（Ｚ）Ｓ−ｅｒ
　　（ＢＺＩ）Ｖａｔ　　Ｇｌｕ　　（ＯＢｚｌ）Ｔｈ
ｒ　（Ｂｚｌ）　Ｉｌｅ　Ｌｉｙｓ　（Ｚ）　Ｇｌｕ　
（ＯＢｚｌ）　Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）Ｍｅｔ　Ａｓｎ　
Ｖａｔ　Ｌｙｓ　（Ｚ）　Ｐｈｅ　Ｐｈ、ｅ　Ａｓｎ　
５ｅｒ（Ｂｚｌ）Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　（Ｚ）Ｌｙ、ｓ
　　（Ｚ）Ｌｙｓ　　（Ｚ）Ａｒｇ　　（ＮＯ２）Ａｓ
ｐ（ＯＢｚｌ）　　人ｓｐ　　（ＯＢｚｌ）Ｐｈｅ　　
Ｇｌｕ　　（ＯＢｚｌ）Ｌｙｓ　　（Ｚ）Ｌｅｕ　　Ｔ
ｈｒ　　（Ｂｚｌ）　　人ｓｎ　　Ｔｙｒ　　（Ｂｚｌ
）Ｓｅｒ　　（Ｂｚｌ）ＶａｔＴｈｒ　　（Ｂｚｌ）　
Ａｓｐ　　（ＯＢｚｌ）　　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　Ｖａ−
Ｉ　　Ｇｌｎ　　Ａｒ、ｇ（ＮＯ２）　Ｌｙｓ　　（Ｚ
）　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　　（Ｂｚｌ）　Ｇｌｕ
　　（ＯＢｚｌ）Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ　Ｖａｔ
　　Ｍｅｔ　　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　（ＯＢｚｌ）　　Ｌ
ｅｕＳｅｔ　（Ｂｚｌ）　Ｐｒ、ｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　
Ｌｙ、ｓ　　（Ｚ）　Ｔｈｒ　（Ｂｚｌ）Ｇｌｙ　　Ｌ
ｙｓ　　（Ｚ）　Ａｒｇ　（ＮＯ２）　Ｌｙｓ　（Ｚ）
　Ａｒｇ　（ＮＯ２）Ｓｅｒ　　（Ｂｚｌ）　Ｇｌｎ　
Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　（ＮＯ２）　Ｑｌ
ｙＡｒｇ　　（ＮＯ２）　　人ｒｇ　　（ＮＯ２）Ａｌ
ａ　　Ｓｅｒ　　（Ｂｚｌ）Ｇｌｎを表しく但し、記号
は前記において定義したものと同じである）、０円のマ
イナス番号汀ＨＣ”（０）のカルセキシル末端から数え
て、その番号のアミノ酸がＢｏａ−ペプチジル樹脂から
欠除している墨を示し、０内のプラス番号ばＨＣ“（０
）のカルセキシル末端から数えてその番号のアミノ酸の
アミノ基にグリシンが付加していることを示す。

工程７（樹脂からのＨＣとＭＣベブチｒの切断、但しＨ
Ｃ“とＭｅ“ペプチドが保護基を有するのに対しＨＣと
ＭＯは保護基をもたないペプチＰを表す）工程６で得ら
れた１、４ｇのＢｏａ　ＨＣ″′（０）−樹脂と１．＋
７！のアニソールを、ポリテトラフルオロエチレンで力
・ζ−した攪拌子の入った反応浴器に入れて、ドライア
イス−アセトンで冷却しながらフッ化水素２０ｍ１を該
反応浴器に導入し、０℃で１時間攪拌後、０℃の減圧下
反応容器中のフッ化水素を除去する。得られ２残渣に１
重量％酢酸水溶液を加えて攪拌後被プチドを抽出し、抽
出物を分液ロートに入れてエーテルで洗浄して凍結乾燥
する。このようにして保護基を持たないＨｃ（ｏ）−ｅ
プチドを分離する。

上述と同様の操作を行′ない工程６で得られる各Ｂｏａ
−ペプチジル樹脂から以下に示すベプチＰ各々１．５０
ｍりを得る。

ＨＣ（−１２１、−１２６、−１２７、−４３３，−１
３６、−１５０、−ｔＳｔ）、ＨＣ（−１２１、−１２
６，−１２７、−１３３，−１３６）、Ｈｃ（−ｔｓｏ
、−１５１）、 ＨＣ（＋１２１、＋１２６、＋１２７、＋１３戊＋１３
へ＋１５０、＋１５１）、ＨＣ（＋１２１、＋１２へ＋
１２７、＋１３３．　＋１３６）、ＨＣ（＋１５０、＋
ｔｓ’ｔ）、 ＭＯ（０）、 ＭＣ（−１２１、−１２へ−１２７、−１３人−１３６
、−１５０、−ｔＳｔ　）、ＭＣ（−１２１、−１２６
Ｓ−１２７、−１３３、−１３６）、ＭＣ（−ｔｓｏ、
−ＸＳｔ）、 ＭＯ（＋１２Ｌ　＋１２へ＋１２７、＋１３本＋１３６
、＋１５０、＋ｔＳｔ　）、ＭＣ（＋１２１、＋１２６
、＋１２７、＋１３人＋１３６）、及びＭｃ（＋ｔｓｏ
、＋ｔＳｔ） 工程８（合成図プチドの物性） 工程７で得られる各にプチドの分子量、アミノ酸組成及
びアミノ酸配列を測定する。

各ペプチドの分子量はＳＤＳゲル電気泳動到定での移動
度から求める。

アミノ酸組成（モル％）は、一定量の各イプチＰを６Ｎ
塩酸水溶液中で２４時間１１０℃で加水分解し、得られ
る混合物を二次元被−パーク口マトグラフイーに供して
決定する。この方法では、トリプトファン、シスチン及
びシスティンは検出されない。従って、別の一定量の各
ベプチＰを蛋白分解酵素で分解することＫよシ、トリプ
トファン及びシスチン又はシスティンの組成を求める。

なお、グルタミン酸とグルタミン、及びアス”　７　キ
ン酸とアス・ξラギンの区別はつかない。

各ペプチドのアミノ酸配列は、日立製作新製の自動アミ
ノ酸分析機によって分析する。

■、ペプチドＨＣ（０） 分子量：約２０，０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル％）： ヒスチジン（ｈ３））リプト？アン（０，３）リジン（
１３，０）　　アルギニン（５，２）　　アスパラギン
酸／アスノξラギン（１３，０）　　セリン（７，８）
クルタミン酸／クルタミン（１１，６）　　スレオニン
（３，２）　　グリゾン（４，５）　　プロリン（１，
３）アラニン（５２）　ノ々リン（ｓ、５）Ｖ２シスチ
ン（ｚｏ）　　メチオニン（２−６）　　インロイシン
（５，２）　　ロイシンＣ７，８）　　フェニルアラニ
ン（６，ｓ　）　　チロシン（３，３）アミノ酸配列： Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｇ１．ｙ　Ｓｅｒ　
Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ＴｙｒＣｙｓ　　Ｇｌｎ　　
Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　　Ｌｙｓ　　
Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＡｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ａｌ
ａ　　Ｇｌｙ　　ＨｉｓＳｅｒ　　Ａｓｐ　　　Ｖａｌ
　　Ａｌａ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇコｙ　　Ｔｈｒ
　　Ｌｅｕ　　ＰｈｅＬｅｕ　　Ｇｌｙ　　工１ｅ　　
Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｒｐ　　Ｌｙｅ　　
Ｇｌｕ　　ＧｌｕＳｅｒ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｌｙ
ｓ　　工ｌｅ　Ｍｅｔ　　Ｇｌｎ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ
　　工１ｅＶａｌ　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｔｙｒ　、Ｐ
ｈｅ　　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓ
ｎＰｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｎ　
　Ｓｅｒ　　工１ｅ　　Ｇｌｎ　　ＴＪ７８　５ｅｒＶ
ａｌ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　工］、ｅ　　Ｌｙｓ　　
Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ａｓｎ　　ＶａｌＬｙ
ｓ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｓｅｒ　　Ａｓ
ｎ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　ＡｒｇＡｓｐ　
　Ａｓｐ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　
　Ｔｈｒ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　５ｅｒＶａｌ　　Ｔ
ｈｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｖａｌ　　Ｇ
ｌｎ　　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　　Ａｌａ工ｌｅ　　Ｈｌｓ　
　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　　工１ｅ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　
　Ｍｅｔ　　Ａｌａ　　ＧｌｕＬｅｕ　Ｓｅｒ　　Ｐｒ
ｏ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ
　　Ｌｙｓ　　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　　Ｇｉ
ｎ　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　
ＡｒｇＡｒｇ　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ さらに本発明品のＨＣ（ｏ）は次のような性質をもって
いる。

（１）等電点　ＰＨ８，６ （２）紫外吸収スペクトル ２７８ｍμに極大のピークを示す（第１図）。

（３）ＳＤＳ電気泳動 Ｇ　ＤＳ−ＰＡＧＥをＬａｅｍｍｌｉ　、　Ｕ、に、　
（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎ、ｄｏｎ　）２２
７，６８０〜６８５の方法で実施した後、クマシーブリ
リアントプルー（Ｒ）で染色する。

マーカーはＰＯｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　ｂ　（９４ｋ　
）、　ＢＳＡ　（６７ｋ　）　。

Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ　（４３ｋ　）　、　Ｃ！ａｒｂｏ
ｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　（３０ｋ　）　。

５ｏｙｂｅａｎ　Ｔｒｉｐｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
　（２０，１ｋ　）　。

α−Ｌａｃｔａ１．ｂｕｍｉｎ　（１４，４ｋ　）であ
る（第２図）。

２、　　、りプチドＨＣ（−１２１，−１２代−１２７
、−１３３、−１３６、−１５０、−１５１）分子量：
約２０，０００　ｇ１モル アミノ酸組成（モル％）：〔上記ＨＣ（０）ペプチドと
比較して著しく濃度に差のあるアミノ酸のみを示す。以
下のＨＣペプチドについても同じである〕 グリノン（３，４）　　アラニン（３，４）　　　ロイ
シン３　、　　、！！プチドＨＣ（−１２Ｌ−１２６、
−１２７、−１３３、−１３６）分子量　約２ｏ、ｏｏ
ｏｇ１モル アミノ酸組成（モル係）： クリシン（４，０）　　アラニン（３，４）　　ロイシ
ン（７，４）４ｏ　　ベプチ）ｌ’　ＨＣ（−ｔｓｏ、
−ｔｓｔ　）分子量：゛約２０，０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル％）ニ グリシン（３，９）　　ロイシン（７２）５、ペプチド
ＨＣ（＋１２１、＋１２代＋１２７、＋１３人＋１３へ
＋１５へ＋１５１）分子量：約２０・０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル係）ニゲリシン（８，７）６、−！
ブチｌ’　ＨＣ（＋１２１、＋１２６、＋１２７、＋１
３人＋１３６）分子量：約２０，０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル％）ニゲリシン（７，ｓ　）７、ベ
プチ）’　ＨＣ（＋１５０、＋１５１　）分子量：約２
０，０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル係）ニゲリシン（５，８）８、ペプ
チ）４ＭＣ（ｏ） 分子量：約２ｏ、ｏｏｏｇ１モル アミノ酸組成（モル係）： こスチ、／７ン（１，３）ｌ−リプトファン（０，３）
リジン（１２，９）　　アルギニン（５，２）　　アス
ノξラギン酸／アスパラギン（Ｉ　Ｚ９　）　　セソン
（７，７）グルタミン酸／グルタミン（１１，６）　　
スレオニン（３，２）　　グリシン（４，５）　　プロ
リン（１，１）７ラニン（５，２）　　／’１Ｊ７（５
，８）　　’／２’ｉスｆン（１，９）　　メチオニン
（３，２）　　インロイシン（ｓ、　２　）　　ロイシ
ン（７，７）　　フェニルアラニン（６，ｓ　）　　チ
ロシン（３，２）アミノ酸配列： Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＣｙｓＴｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ
　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　
ＡｌａＧｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｙ
ｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ＧｌｙＨｉｓ　Ｓｅｒ　
Ａｓｐ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔ
ｈｒ　ＬｅｕＰｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　
　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｒｐ　　Ｌｙｓ　
　ＧｌｕＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉ
ｌｅ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ１１ｅ　Ｖａｌ
　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｐｈｅ　ＬｙｓＡｓｎ　　Ｐｈｅ　　’Ｌｙｓ　　Ａｓ
ｐ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｎ、Ｓｅｒ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ
　　ＬｙｓＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　
Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　ＡｓｎＶａｌ　Ｌｙ
ｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ
　Ｌｙｓ　ＬｙｓＡｒｇ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ａｓ
ｎ　　ＴｙｒＳｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｖａｔ　　（）Ｉｎ　　Ａｒｇ
　　Ｌｙｓ人１ａ　　ｒｌｅ　　Ｈｉｓ　　Ｃ）Ｉｕ　
　Ｌａｕ　　Ｉｌｅ　　Ｇｉｎ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　
　ＡｌａＧｌｕ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ａ
ｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｌ
ｙｓＡｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ａｒｇ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ
　　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ａｒｇ　　ＧｌｙＡ
、ｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｒ＋ｇ
　、　　ヘフｆ　ｌ’Ｍｃ（−１２１、−１２６，−１
２７、−１３３，−１３６，−１５０，−１５１）分子
量：約２０．０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル係）：〔上記ＭＯ（０）Ｊプチドと
比較して著しく濃度に差のあるアミノ酸のみを示す。以
下のＭＯペプチドについても同じである。〕 クリシン（３，４）　　アラニン（３，４）　　ロイシ
ン（６，８） １０、　　被プチドＭＯ（−１２１、−１２６、−１２
７、−１３人−１３６）分子骨：約２０，０００ｇ１モ
ル アミノ酸組成（モル％）ニ グリシン（４，０）　　アラニン（３，３）　　ロイシ
ン（７，３）１１、　　ペプチドＭＯ（−１５０、−ｔ
ｓｔ）分子量：約２０．０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル％）：グリシ７　（３，９）ロイン
７（７，２） １２、　　ペプｆ　Ｉ’ＭＯ（＋１２１．　＋１２６、
＋１２７、＋１３３、＋１３６、＋１５０．　＋１５１
　）分子量：約２０，０００　ｇ１１モ ルアミノ酸成（モル％）　：　ｆ’）　／７（８，６）
１３、　　ペプチドＭＣ！（＋１２１、＋１２６、＋１
２７、＋１３３、＋１３６）分子量：約２０．０００　
ｇ　１モル アミノ酸組成（モル％）ニゲリシン（７，５）１４、　
　　ペプチドＭｃ（＋１５０、＋１５１　）分子量：約
２０，０００ｇ１モル アミノ酸組成（モル％）ニゲリシン（５，７）上記ペプ
チドはいずれも等電点がｐ＃４８．６、紫外吸収スペク
トル極大が２７８ｍμ、ＳＤＳ電気泳動が約加ｋを示す
。

工程９（抗ウィルス活性の測定） 工程７で得られる各ペプチドの抗ウィルス活性の測定は
、ピー・シー・メリガン著−ヒト新生児皮膚償維芽細胞
の単層とウシ水層性口内炎ウィルスを用いるヒトインタ
ーフェロンのプラーク形成阻害の評価−「細胞媒介免疫
におけるイン・ビトロ法」イー・ディー・ピー・アール
・ブルーム及びピー・アール・グレード編アカデミツク
・プレス社刊、ニューヨーク１９７１年、４８９頁（ｐ
、ｃ。

Ｍｅｒｉｇａｎ　、　Ｐ］、ａｑｕｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ工ｎｔｅｒｆ
ｅｒｏｎＥｍｐｌｏｙｉｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｏｎａ
ｔｅ　　５ｋｉｎ　　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓ＋　Ｍｏｎｏ
ｌａｙｅｒｓ＆　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｖｅｓｔｉｃｕｌａｒ
　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ＋”　　Ｉｎ−ｖ
ｉｔｒｏ　Ｍｅｔｈｏｄｉｎ　Ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔ
ｅｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　”　＋　ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ
　Ｅ、Ｄ、Ｂ、几−Ｂｌｏｏｍｋ　Ｐ、Ｒ，Ｇｒａｄｅ
＋　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＝　Ｎ、Ｙ、　１９
７１　＋　ｐｐ４８９　：］に記載の方法と同様の方法
で測定する。

詳しくは、工程７で得られる各綬プチドを種々に希釈し
て、１０容量チの胎児性小生血清を含有する増殖培地に
入れる。この培地にはＦＳ−４細胞（ヒト新生児皮膚繊
維芽細胞）が単層に培養されている。１８時間後、細胞
当り２０個のプラーク形成能を有する水痘性口内炎ウィ
ルス（ＶＳＶ）を該細胞に感染させ、さらに１時間３７
℃で培養する。次に該細胞を上記の増殖培地で２回洗浄
した後、再び該増殖培地中３７℃で２４時間培養する。

ウィルスが発生したかどうがは、培養後の該細胞を顕微
鏡観察することにょシ検査する。その結果認められる細
胞の損傷はウィルスによるものであ　　する。以下のベ
プチＰが１μｇ／ｍｚの濃度で抗ウィルス活性を示す： Ｉ（Ｃ（Ｑ）、 ＨＣ（−１２１、−１２６Ｓ−１２７、−１３３Ｓ−１
３６、−１５０，−１５１）、ＨＣ（−１２１、−１２
６、−１２７、−１３＼−１３６）、ＨＣ（−１５０、
−１５１）、 ＨＣ（＋１２　ｔ、＋１２ａ、　＋１２７、＋１３３．
　＋１３６、＋１５０．＋１５１）、ＨＣ（＋１２１、
＋１２６、＋１２７、＋１３３Ｓ＋１３６）、ＨＣ（＋
１５０、＋ｔＳｔ）、 Ｍｃ（ｏ）、 ＭＯ（−１２Ｌ　−１２６，−１２７、−１３３，−１
３６，−１５０，−１５１）、ＭＣ（−ｔ２ｔ、−１２
へ−１２７、−１３３、−１３６）、ＭＯ（−１５０、
−１５１）、 ＭＣ（＋１２１、＋１２６．　＋１２７、＋１３３．　
＋１３６、＋ｔｓｏ、＋ｔｓｔ）、ＭＣ（＋１２１、＋
１２６、＋１２７、＋１３人＋１３６）、及び〜ｔｃ（
＋ｔｓｏ、＋１５１）。

工程、１０　（細胞増殖抑制作用の測定）２Ｘ１０５Ｆ
Ｓ−４細胞を直径６ｏＩＩＩＩ１１のシャーレｉ入れだ
工程９で記述した増殖培地に移植する。５寺間後に増殖
培地を除去し、代わりに０．１μｇ／／ＩＩ！の襲度の
工程７で得られるＨＣ（０）ペプチ）″またはｔｖｌｃ
（０）ペプチドを含む新鮮な培地を上記のシャー／に注
ぎ入れて、３７℃で１８時間培養を続ける。

培養後、培地を除去し、５μＣｉ／＋７！の濃度の３Ｈ
−テミ、ジンを含む培地を加え、さらに３７℃で２時間
培養する。培養後、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄した
後、洗浄した細胞に５重量係のトリクロロ酢酸を加える
。その結果得られる沈殿の一定量を乾燥し、液体シンチ
レー／ヨンカウンター（・ξツカード社製、アメリカ合
衆国）を用いて乾燥した！ｆ：殿物の’ｆ（の放射能を
測定する。比較のためにデビソＶ−ブイ・ゲーデル（Ｄ
ａｖｉｄ　Ｖ、　Ｇｏｃｄｄｅｌ　）より解明されたプ
ＯＩＦＮ−ｒＳｒＦＮ−Ｔ及びｒＦＮ−４一様ペプチド
とそれぞれ同じアミノ酸配列を有するペプチドを前記の
固相合成法により調製し、上記の方法で細胞増殖抑制作
用を測定する。結果を以下に示す。

（以下余白） 以上より、本発明の被ブチｒＨＣ（ｏ）及びＳ＋Ｃ（Ｏ
）は細胞増殖抑制作用において非常に効果あるのに比し
て、プ０ＩＦＮ−ｒは細胞増殖抑制能がなく、ｆＦＮ−
ｒ及びＩＦＮ−γ一様ベプチドの細胞増殖抑制、能は低
いということがわかる。

（以下余白） 実施例２ 工程１　（ベンゾイル化またはイノブチル化）ん　ｄｂ
ｚＡ　　の合成 ５０ミリモルのデオキシアデノシン（ｄＡ）　ｔ１５ｏ
ｖｔｌの乾燥したピリジンに懸濁する。次にこの懸濁液
に３００ミリモルのベンゾイルクロリドを水冷下部下し
、得られる混合物を室温にもどして約１時間攪拌して反
応させる。反応の終了したことは、薄層クロマトグラフ
ィー〔展開溶媒：クロロホルム−メタノール（１０：ｔ
）］で確認する。

反応終了後、反応混合物を、５００ｍｇのクロロホルム
、３５０　ｇの氷及び２８ｇの重炭酸水素す）　ＩＪク
ムの混合物中に注ぎ入れる。その結果得られる混合物を
分液ロート中で振り混ぜて静置後、その中のクロロホル
ム層を分取する。水層の方はクロロホルムで２回抽出し
、そのクロロホルム層を分取する。このようにして得ら
れるクロロホルム層を混合して２回水洗する。水洗した
クロロホルム層のクロロホルムを留去し、得られる残渣
に１５０１ｎｌのエタノール及び１００Ｍのピリジンを
加えて均一な溶液を得る。得られた均一溶液をすばや＜
ＯＣニ冷却した後、この均一溶液に２Ｏｆ）ｍｔの２　
Ｎ　Ｎａ１ｌ−（水溶液と２００ｍ１のエタノールの混
合液を攪拌しながら加えて均一な溶液とする。この均一
溶液を室温で５分間攪拌して冷却後、２００　ｍｌの２
Ｎ塩酸水溶液を加え、更に減圧下で半分の容量になるま
でａＭする。次に濃縮溶液にこれと等量の水を加え、得
られる溶液中の安息香酸をエーテルで抽出す／Ｅ）０こ
の結果得られる水層を濃縮し、水と共沸させることによ
りｌ’Ｊ　−Ｓンゾイルデオキシアデノシン（ａｂｚｘ
）が析出する。得られるＮ　−Ｓンゾイルデオキシアデ
／シンに少量のピリジンを加えた混合物を冷蔵庫内で１
夜放置後、この混合物から析出した結晶を戸数する。得
られた結晶を５重量％ピリジン溶液及びエーテルで順に
洗浄する。その結果、３５ミリモルのｄｂＺ＆が得られ
る。ｄｂｚＡの収率は７０％である。

１３、　　ａｂｚＣの合成 １００ミリモルのデオキンシチジン（ｄＣ）−ｉ５００
ゴのピリジンに懸濁する。この′＠：濁液に等量のトリ
エチルアミンを加えて３０分間撹拌後、水冷下６等量の
ペンゾイルクロリｒを加える。次に上記Ａ項と同様の操
作を行なって、ｄＣをベンゾイル化する。ベンゾイル化
反応終了後、クロロホルムを留去して得られた残渣を、
１２５０ｍ１のデトラヒドロフラン、１ｔのメタノール
及び２５０ｍＪの水の混合液中に溶かす。その結果得ら
れる＠液に２５０ｍ１の２　Ｎ　Ｎ　ａ　ＯＨ７に、溶
液を水冷下撹拌しながら加える。

１０分後、得られた混合物を２５０　ｍｌの２Ｎ塩酸水
溶液で中和す６゜以下の操作は上記Ａ項と同じである。

その結果、Ｎ−ベンゾイルデオキシシチジン（ｄｂｚｃ
　）が析出する。

Ｑ、　　ｄｉｂＧの合成 １００ミリモルのデオキシグアノシン（ｄＧ）ヲｓｏｏ
ｍｌのピリジンに懸濁し、この懸濁液に、水冷下６等量
のインブチルクロリドを滴下する。このようにして得ら
れる混合物を、ｏＨで３時間攪拌した後、上記Ｂ項のく
ンゾイル化と同様の方法で処理し、ｄＧのインブチル化
を行なう。インブチル化反応終了後得られるクロロホル
ム層からクロロホルムを留去して得られる残渣をｓｏｏ
ｍｌ！のエタノールに溶かし、次いで、この溶液に５０
０ｍ１の２ＮＮａＯＨ水溶液をＯ′Ｃで加え１５分間攪
拌する。その結果得られる混合物を、１ｔの氷冷したビ
リ・ノニウム型陽イオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ　Ｘ　５
０　Ｘ　２、ダク・ケミカル社製、アメリカ合衆国）に
注ぎ入れ、中和する。このようにして中和した混合物を
、少量の上記の樹脂をつめたカラムに加え、つめた樹脂
の３倍量の１０％（Ｗ／Ｖ）ピリジン溶液で洗浄する。

得られる溶出液と洗浄液を混合し濃縮して生成する残渣
を５００＋＋＋ｔの５％（Ｗ／Ｖ）ビリクン溶液から再
結晶し、ｄｉｄＧが得られる。

工程２（５′−ジメトキシトリチル化）１００ミリモル
のチミジン、１００ミリモルのｄｂｚ４　。

１００ミリモルのｄｂｚｃ及び１００ミリモルのｄｉｂ
Ｇをそれぞれ２００　ｒｕｔ　、　　４００　ｍｌ　％
　　４００　ｒａｔ及び７５０ｍ１のピリジンと混合し
、得られた各混合物に１．１等量のジメトキシトリチル
クロリドを加えて３時間反応させる。反応を５０ｖｔｌ
のメタノールを加えて停止する。得られた各反応溶液を
濃縮し、５０ｍ１のクロロホルムに溶かした後水洗する
。５′−、ノメトキ／トリチルチミノンＣ（Ｄ〜［Ｔｒ
）Ｔ〕を分離するために、チミ・ジンと・ノメトキシク
ａリドの反応混合物の溶媒を留去し、トルエンと共沸し
て得られる残渣を１５００　ｍｌのベンゼンに溶解して
加熱する。

次に、この溶液が白濁するまでｎ−ヘキサンを加え入れ
て、４Ｃになるまで放冷することにより（ＤＭＴｒ）Ｔ
の結晶をｑ％る０　（ＤＭＴｒ）ｄｂｚＡ　％　（ＤＭ
Ｔｒ）ｄｂｚＣ及び（ＤＭＴ　ｒ　）　ｄ　ｉ　ｂＱを
分離するには、ｄｂｚＡ。

ｄｂｚｃ及びｄｉｂＱとジメトキシトリチルクロリドと
の各反応混合物の溶媒を留去し、得られる残渣をクロロ
ホルムに溶かして、１．ｓＫｐの７す力ゲルを用いたカ
ラムクロマトグラフィーに供する。カラムクロマトグラ
フィーの溶離液には３重量％メタノール水を用いる。

工程３　（ダイマーとトリマーの合成）６ミリモルの（
ＤＭＴ　ｒ　）　ｄＧをビリ・ジンと共沸させた後、１
０　ｍｌのピリジンに溶かす。一方、１．５Ｘ２２等量
のトリアゾル、１，５Ｘ２．２等量のトリエチルアミン
及び２０ｍＪの・クオキサンからなる混合物に水冷下撹
拌しながら湿気を避けてｐ−クコロフェニルリン酸ジク
ロリドを滴下する。得られる混合液を室温で１時間攪拌
後、トリエチルアミン塩酸を戸去する。得られた涙液を
上記の（ＤＭＴｒ）ｄＧのピリジン溶液に湿気を避けて
加える。次に得られる溶液の＠媒を約Ｘの量になるまで
留去した後、この溶液を室温で１時間静置する。次いで
、この溶液に４等量の１−メチルイミグゾールと８ミリ
モルのｄ　ｉｂＧを加えて、ピリジンと共沸させる。そ
の結果得られる残渣を６０ｍ１のピリジンに溶解し、こ
のピリジン溶液に９ミリモルのトリイソプロビルベンゼ
ンスルホニルニトロイ’−タフ”Ｊ）’（Ｊ２１下［Ｔ
ＰｌｉＪと略称する）を加える。得られる混合物をＸ量
になるまで濃縮し、３０ｃで一夜放置する。

反応を６　ｍｌの５０重量％のピリジン溶液を加えて停
止させる。反応を停止した混合物の溶媒を留去後、この
混合物を１５０ｇのタイプ６０シリカゲル（和光化薬層
）をつめたカラムに入れて、ピリジン１％を含有するメ
チレンクロリド−メタノ−ル（３０：１）の混合溶媒で
溶出する。次に溶出液を８縮して、濃縮物をローヘキサ
ンに滴下して目的のダイマーを粉末状に析出させる。

このようにして得られるダイマー２ミリモルと前記と同
様の方法でリン酸化して、ピリジンと共沸して残渣を得
る。この残渣を２０ｍ１のピリジンに溶かし、次いで３
　ｍｌのＴＰＳＮ丁を加えて、前記と同様の操作で縮合
反応を行なった。２１時間後、反応を２　ｍｉの５０重
量％のピリジン溶液を加えて停止させる。次に反応溶液
に２０ｍ１のりｏｏホルムを添加後、１５ｍ１の０．Ｉ
Ｍ臭化デトラエチルアンモニクム（以下［ＴＥＡｓ、Ｊ
と略称する）で洗浄する。洗浄後、この反応溶液の溶媒
を留去し、目的のトリマーを６０ｇのシリカゲルをつめ
たカラムを用いて分離する。その結果得られたトリマー
の全収率は６０％である。

工程４　（トリマーがらの保護基の除去）工程３で得ら
れるトリマー２０ｍ９を３　ｒｎｌのピリジンに溶解す
る。得られるピリジン溶液に濃アンモニア水１５ｍ１を
加えて密栓をし、室温で１９時間放置後、この反応液を
５５ｃで５時間加熱して、アンモニアを留去する。次に
２ｏｒｎｌの８０容量％の酢酸を加えた後、酢酸を留去
する。得られる反応混合物をトルエンと共沸し、残渣を
２５ｍ１の０．１〜ｆＴＥＡＢ溶液に溶解後、２５ｍｔ
！のクロロホルムで３回、続いて２５ｍ１のエーテルで
１回洗浄する。その結果得られる溶液から溶媒を留去し
、残渣を２０　ｍＭのトリス−酢酸（ｐＩ（８，０）を
含有する１６ｒｎｌの７Ｍ尿素溶液に溶かす。このよう
にして得られる混合物をＤＥＡＥセルロースをつめたカ
ラムに入れて、０．０５　Ｍ　ＮａＣ７溶液５００ｍ１
と０．４０　ＭＮａＣｊ溶液５００反を用いて塩濃度勾
配のついだ７Ｍ尿素−〇。０２Ｍトリス−酢酸（ｐＨｓ
、ｏ）溶液で溶出する。その結果得られる溶出液のうち
、吸収ピークを有する画分を集めることにより、目的の
トリマーを得る。

工程５　（オリゴヌクレオチドの合成）工程３と同様の
方法により、オリゴヌクレオチドを調製し、得られるオ
リゴヌクレオチドから工程４と同様の方法により保５基
を除去する。このようにして、以下に記載するオリゴヌ
クレオチドを得る。

（１）　　ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＧＴＴ（２）
　　ＴＴＧＧＧＴＴＣＴＴＴＧ （３）　（）ＧＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴ （４）　　ＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＡＣ （ｓ）　　ＧＴＴＡＡ（）ＧＡＡＧＣＴ（６’！　　Ｇ
ＡＡＡＡＣＴＴＧＡ人Ｇ（７）　　　人ＡＧＴＡＣＴＴ
ＴＡＡＯ（８＞　　ＧＯＴＧＧＴＣＡＣＴＣＴ （９）Ｇ　Ａ　ＣＧ　Ｔ　Ｔ　ＯＣＴ　Ｇ　Ａ　Ｃ（１
０１Ａ　Ａ　ＣＧ　Ｇ　Ｔ　Ａ　ＣＴ　Ｔ　Ｔ　Ｇ（１
１）　　ＴＴＴＴＴＧＧＧＴＡＴＣ（１２１ＴＴＧＡＡ
ＧＡＡＣＴＧＧ α３）　　ＡＡＧＧＡＡＧＡＡＴＣＴ α４）　　ＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣ （１５１ｘＴＧｃＡＡＴ＋、ｒｃＡｉ （１６）　　ＡＴＣＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣ１７）　　Ｔ
ＡＣＴＴＴＡＡＧＴＴＧα８）　　ＴＴＴＡＡＧＡＡ、
ＣＴＴＴ（１９１ＡＡＧＧＡｃＧＡＣＣＡＡ の　　ＴＣＴＡＴＣＣＡＡＡＡＧ （２１）　　　ＴＣＴＧＴＴＧＡＡ、ＡＣＴＱ２１　　
　ＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣ（２３）　　　ＡＴＧＡＡ
ＣＧＴＴＡＡＧＩ２七　　ＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴ ｌ）　ＡＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧ （２６１ＡＧＡＧＡＣＧＡＣＴＴＴ （２の　　ＧＡＡＡＡＧＴＴＧＡ、ＣＴ（２８１Ａ　Ａ
　ＣＴ　Ａ　ＣＴ　ＣＴ　ＯＴ　Ｔ０９１　　　Ａ　Ｃ
Ｔ　Ｇ　Ａ　ＣＴ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＧｏｔ　　　Ｇ
ＴＴＣＡＡＡＧＡＡＡＧ（３１）　　　ＧＣＴＡＴＣＣ
ＡＣＧＡＡ■　　ＴＴＣｒＡＴＣＣＡＡＧＴＴ Ｃ’ＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＴＴＧ １３（イ）　　ＴＯＴＣＯＡＧＣＴＣ，ＣＴ器　　ＡＡ
ＧＡＣＴＧＧＴＡＡＧ ■　　ＡＧＡＡＡＧＡＧＡＴＯＴ Ｇ７）　　　ＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴ艶　ＡＧＡＧＧ
ＴＡＧ人ＡＧＡ Ｃ３９１ＧＣＴＴＣＴＣＡＡＴＡＡＧ （４■　　ＴＣＧ人Ｃ’ｒＴＡＴＴＧＡＧＡＡＧＯＴＯ
’Ｌ”ＴＣＴ（４１）　　　ＡＣＣＴＣＴＡＡＡＣＡＡ
（４２１ＣＡＴＴＴＧＡＧＡＴＣＴ （４３）　　　ＣＴ　Ｔ　Ｔ　ＣＴ　ＣＴ　Ｔ　Ａ　Ｃ
Ｃ（４４１ＡＧＴＣＴＴＡＧＣＡＧＣ （４５）　　　ＴＧＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣ（４６１Ａ　
Ｇ　ＣＣＡ　Ｔ　Ａ人ＣＴＴＧ（４７１０人ＴＣ人人Ｔ
ＴＣＧＴＧ （４８）　　　ＧＡ　Ｔ　Ａ、　Ｇ　ＣＣＴ　Ｔ　Ｔ　
ＣＴ（４９１Ｔ　Ｔ　Ｃｘ　Ａ　Ａ　ＣＧ　Ｔ　Ｔ　Ｃ
Ａ　Ａら０１　　　（）ＴＣＡＧＴＡＡＣＡＧＡ（６）
　　ＧＴＡＧＴＴＡＧＴＣＡＡ （財）　　ＣＴＴＴＴＣ人ＡＡＧＴＣ 頓）　　　ＧＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＴ （財）　　ＣＴＴＧＴＴＡＧＡＧＴＴ （ホ）　　ＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＡＣ 国　　ＧＴＴＣＡＴＧＴＣ！ＴＴＣ 閉　　ＣＴ　’ｒ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　
Ｃ（至））　　　ＡＡＣＡＧＡＣＴＴＴＴＧ（至））　
　　ＧＡＴＡＧＡＴＴＧＧＴＣ（川　　ＧＴＣＣＴＴ人
人ＡＧＴＴ 輯）　　ＣＴ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＡ　Ａ　ＣＴ　Ｔ曽
　　λＡＡＧＴＡＡＡＡＡＧＡ （至）　　ＡＡＣＧＡＴＴＴ（）ＡＧＡト→　　ＴＴＧ
ＣＡＴＧＡＴＣＴＴ （至）　　ＴＣＴＧＴＣＡＧＡＴＴＣ 俤Ｉ　　　ＴＴＣＣＴＴＣＣＡＧＴＴ （資）　　ＣＴＴＣＡＡＧＡＴＡＣＣ （（ト）　　ＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＴ（財）　　ＡＣ
ＣＧＴＴ　ＧＴ　ＣＡＧＣ（至）　ＡＡＣＧＴＣＡＧＡ
ＧＴＧ （２）　　ＡＣＣＡＧＣＧＴＴＡＡＡ （至）　　ＧＴＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡ ＠　　　ＧＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＣ （至）　　０ＴＴＡＡＯＧＴＡＴＧＧ （７！１９　　　ＧＴＯＴＴＧＡＣＡＧＴＡ（３）　　
ＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＧＡ 勾　　ＡｃｅＣＡＡＡＡＣＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧ工程６
　　（、？？リスクレオチビの合成）工程５で得られた
オリゴヌクレオチド（１）及び（２）各４０ピコモルと
Ｔ４ＤＮＡキナーゼ６．５単位を、８０ピコモルの（Ｉ
　　”ｐ　）ＡＴＰ　（８Ｃｒ　／ミリモル）、１００
　μＭのス被ルミジン、２０ｉ＋ＭのＤＴＴＸＬＧｍＭ
Ｍ　ｇ　Ｃｔ２．５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ９）及び
０．１ｍＭＥＤＴＡを含有する混合物２５μを中に入れ
る。反応１ｄ３７Ｃで３０分間行ない、上記オリゴヌク
レオチド（１）及び（２）を結合させてオリゴヌクレオ
チド（１）−（２）を得る。この反応）見合物に、２．
５倍量のエタノールを加えて生成したオリゴマーを沈殿
させる。

このオリゴマーを７Ｍ尿素中２０％ポリアクリロアミ１
ゲルを用いて電気泳動にかけて、オリゴマー　（１）　
−（２）を得る。

（１）−（２）ＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣＧＴＴＴ
ＴＧＣ）ＧＴＴＴＴＴＯ 上記と同様の操作を行ない、オリゴヌクレオチド（３）
及び（４）を結合させてオリゴマー（３）−（４）を得
る。

さらに上記で得られる（１）　−（２）及び（３）　−
（４）を結合させて、（１＞　−（２）　−（３＞　−
（４）を得る。以上の操作を繰り返すことにより、以下
に記すＤＮＡが得られる。

（１）−（２）　−（３）　−（４）　−（５）　−（
６）　−（７）　−（ｓ）　−（９）　−（ｔｏ）　−
（ｎ）−（１２）　−（１３）　−（１４）　−（ｔｓ
）　−（１６）　−（１７）　−（１８）　−（１９）
　−（２０）　−（２１）　−（２２）　−（２３）　
−、（２４）　−（２５）　−（２６）　−（２７’）
　−（２８）（３７）　−（３８）　−（３９）　。

（４０）　−（４１）　−（４２）　−（４３）　−（
４４）　−（４５）　−（４６）　−（４７）−（至）
）−（４９）　−（５０）　−（５１）　−（５２）　
−（５３）　−（５４，）　−（５５）　−（５６）　
−上記で得られるＤＮＡ（１）〜（３９）及び（４０）
〜（７７）を５０ｍ１のＴＮＥ緩衝液中に入れて薦合し
、６５Ｔ：：、４５’Ｑ。

３７Ｃ及び２０Ｃでそれぞれ１時間ずつ培養する。

次にこの混合物を、１００ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，
５）、１００　ｍ　Ｍ　ＣａＣＬｚ及びｌ　ＯＱ　ｍ　
Ｍ　ＭｇＣ４２を含む混合物２０μを中に加え、２０分
間氷冷する。

工程７　（クローニング） ニー・ジエー・トライラグら（ルＪ−Ｔｗｉｇｇ　ｅｔ
ａＩ）がネーチャー第２５４巻第３４〜３８頁（１９７
５年）　（Ｎａｔｕｒｅ　、　２５４　、３４〜３８　
（１９７５）］に記載しだ方法に従って、プラスミドｐ
ＡＴ　　１５３を調製する。

このプラスタ）’　ｐＡＴ　１５３から、ミカエル・デ
ィー・エツジら（＋！１ｉｃｈａｅｌ　Ｄ、　Ｅｄｇｅ
　ｅＬ　ａｔ）がネーチャー第２９２巻第７５６〜７６
２頁（１９８１年）　（Ｎａｔｕｒｅ、２９２゜７５６
〜７６２　（１９８１）　）に記載の方法に従って、ラ
クトースオペロンのプロモーター及びオペレーターを有
するプラスタ）’ｐＰＭ５０を調製する。得られるプラ
スタ　ｆ’ｐＰＭ５０のＤＮＡ　４μｇを、１０ｍＭ）
リス−塩酸（ｐＨ７，６）、６　ｍＭ　ＭｇＣｔ２．１
５０　ｍ％ｉ　ＮａＣ１及びＬｍＭＤＤＴ　　の混合物
中に入れ、この混合物を制限酵素ＢａｍＨＩ及び５ａｌ
Ｉと３７Ｃで６０分間反応させることにより、上記の９
２Ｍ５０を開裂する。反応停止後、ＤＮＡをフェノール
−クロロホルム（３：１容量比）の混合溶媒で抽出し、
得られるＤＮＡ断片を、４０　ｒｒｕＭ　）リス−塩酸
（ｐＨ７，８）、６ｍＭ酢酸ナトリウム及び１ｍＭＥＤ
ＴＡの混合物中１％アガコースゲルを用いて電気泳動に
かけて、大きいＤＮＡ断片を回収する。このようにして
得られるＢａｍＨＩ−８ａｌＩ　３．２　ｋｂはフタ−
断片１μｇ及び工程６で得られる化学的に合成した遺伝
子を、２０ｍＭのトリス−塩酸（ｐＨ７６）、１０　ｍ
Ｍ　ＭｇＣＡ２及びｌｏｍＭのＤＴＴの混合物３０μｔ
に０．４単位のＴＡＤＮＡリガーゼを加えた混合物中に
入れて、ｉ２ｃで１６時間反応させる。その結果、工程
６で得られた化学合成した遺伝子を含むＤＮＡが、ラク
トースオペロンのすぐ後に結合したプラスミドが得られ
る。

このようにして得られるプラスミドを大腸菌Ｘ１７７６
株に接触せしめて、大腸菌Ｘ１７７６株を形質転換する
。得られる形質伝株を培養した後、この形質転換株の細
胞中のＤＮＡを分離しで、得られるＤＮＡのデオキシヌ
クレオチド配列を、ニー・エム・マキサムら（んＭ、Ｍ
ａｘａｍ　ｅｔ　ａｌ　）がプロシーディング・ナショ
ナル・アカデミ−・サイエンス・アメリカ、第７４巻第
５６０〜５６４頁（１９７８年）（Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ
、　　人ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、１４．５６０−５
６４（１９７８）’：ｌに記載している方法に従って測
定する。

その結果得られるデオキシヌクレオチド配列は理論的な
配列と一致することが示される。形質ＥＯ株の培養液の
抗ウィルス活性を、ＦＳ、４細胞とぞのＦＳ−細胞を感
作するウィルスとしてＶＳＶを用いで評価する（　ＦＳ
−細胞とＶＳＶは実施例１工程で使用したもの）。その
結果、上記の培養液は抗ウィルス活性を示す。（プラス
ミドを大腸菌Ｘ１７７６株に挿入する操作からは、旭化
成工業株式会社のＰ３レベルの封じ込め施設内で行なわ
れるっ　）実施例３ 工Ｐｉｉ　ｌ　　　（ｍＲＮＡの製造）リンパ球の細胞
故全ｌＸｌ０６細胞／ｍｅに調節したリンフ８球の培＃
ｇｌＯ１に、１　ｒａｇのスタフイロコツカル・エンテ
ロトギ／ンＡ　（ＳＥＡ　）ｔ、ＩＪＤ工、：３７　’
Ｃで２日間回転培養する。培養後、リン・２球を８０（
Ｊ　ｒｐｍの低速度で１０分間遠・（、・する。このよ
うにして集めたリンパ球を、８ｇのＮａＣ６，０，２ｇ
のＫＣｌ、　１．１５　ｇのＮａ２ＨＰＯ４−２Ｈ２０
及び０．２　ｇのＫ　Ｈ２ＰＯ，を含む混合浴液（以下
「ＰＢＰ溶液」と称する）ｌｌ中に入れて再び懸濁する
。この懸濁孜を倣しく攪拌しながら、５０１の分液ロー
！・に入れた２０ｍＭトリス−塩酸（１）Ｈ７，５）及
びｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む混合物（Ｉ・リス塩酸とＫ
ＤＴＡの混合物を以下ＩＴＥＭ？ｆｆｉ液」と称する）
に２％（Ｗ／Ｖ）のドデシル硫酸ナトリクムを加えた混
合物ＬＴｔ中：′ｉ：加え入れる。次に、この混合物に
プロナーゼ（カルビオサム社製、アメリカ合衆国）を２
００μｇ　／　ｍｌのｍＷになるまで加えて、室温で１
時間攪拌する。

更に、上記の混合液の１．／２０量の２Ｍトリス−塩酸
（ｐＨ９）を加える。得られた混合液を、ｔＳｔの再蒸
留フェノールで２０分間、激しく攪拌しながら抽出する
。更に３ｔのクロロホルムを加え１０分間激しく攪拌す
る。このようにして得られる上記混合液の各相が分離す
るように１時間静置後、得られる水相をフェノールとク
ロロホルムで再抽出する。このようにして得られる１８
ｔの水相に６０ＨのＳＤＳを加える。この水相から、そ
の１／１０量の３Ｍ酢酸す）　ＩＪクム（ｐＨ５，５）
及び２倍量のエタノールを加えて混合物中の核酸を沈殿
させる。

以上のように処理した混合物を一２０Ｃで一夜放置後、
上清を注意深く、サイホンを用いて除去する。残った部
分を一２０Ｕで１５分間４０００　ｒｐｍで遠心分離し
て、核酸沈殿物を得る。得られる核酸沈殿物を、５０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ７，ｓ）、１００ｍＭ　Ｎａ　Ｃ
，ｌ−及び５ｍ〜Ｉ　ＥＤＴＡを含む混合液（以下１’
−ＴＮＥＪと略称する）０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを加
えた２００ｍ１の混合物中に入れて攪拌する。さらに３
５０ｍ１のＴＮＥを上記混合物に加えて、線維状の核酸
沈殿物を溶解させる。次に得られた混合物を５００　ｒ
ｐｍで１５分間遠心分離して、沈殿物を集める。集めた
沈殿物は、０５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを有するＴＮＥ　３
５０ｍ１に溶かす。このＴＮＥ＠液と上記の上清ＴＮＥ
溶液を混ぜあわせ、これと等量のフェノールで３回、半
量のエーテルで３回及び等量のエーテルで３回抽出する
。このようにして回収されるＲＮＡを吸光度計を用いて
２６０　ｎｍの波長で定量すると約１００ｍ９であるこ
とがわかる。

上記で得られるＲＮｔ’−含有溶液ｓｏｏｍｌに２１ｇ
のタイプ７オリゴ（ｄＴ）セルロース（カルビオケム社
製、アメリカ合衆国）を加えて、室温で１時間攪拌する
ことにより、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースに吸
着させる。ｔｎＲＮＡの吸着したオリゴ（ｄＴ　）セル
ロースを、１０分間３００Ｏｒｐｍで遠心分離し、得ら
れるオリゴ（ｄＴ）セルロースｆ　５０　ｍｌ及び１５
　ｍｌ　（７）　ＴＮＴ　ｒ：頃に洗浄する。次に、ｍ
ＲＮｒＮを２　ｍｌ！の水で続けて５回洗浄することに
よって、溶出する。吸光度測定により、ｍＲＮＡの収量
は２００μｇであることがわかる。

工程２　（ｃＤＮＡの製造） ４０ｍＭ　　ト　リ　ス　−　塩酸　（ｌ１ｌＨ７，５
）　　、　　３０　ｍＭ　　ＮａＣ１％５　ｍＭ　Ｍｇ
ＣＺ２．０．５ｍＭ　ＤＴＴ　（カルビオケム社製、ア
メ＋）ｔｙ合衆国）、２０ｔｔｚ／ｒｒｒｌオリゴ（ｄ
Ｔ）＋２−＋ｇ　（Ｐ＆Ｌバイオケミカルス社製、アメ
リカ合衆国）、５ｍ＋Ｍ　ｄＧＴＰ（シグマ社製、アメ
リカ合衆国）、５ｍＭ　ｄ　ＣＴ　Ｐ　（シグマ社製、
アメリカ合衆国）、５ｍＭａｒ：Ｔｐ　（シグマ社製、
アメリカ合衆国）、５ｍＭ”Ｐ−ｄＡＴＰ　にニーイン
グランドニュー２フフ社製、アメリカ合衆国）、６０１
１　ｇ　／　ｒｕ１ｍＲＮ人、２８０単位の鳥類骨髄芽
球症フィルス（Ａ　Ｍ　Ｖ　）及び６００単位の逆転写
酵素（ベセスダ・リサーチ・ラゼラトリー製、アメリカ
合衆国）を含有する反応混合液４００μｔを３７Ｃで１
時間培養後、この反応混合液に０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ及
び２０％（Ｗ／Ｖ　）　ＳＤＳを、それぞれ１０ｍＭ及
び０．１％（Ｗ／Ｖ）のａ度になるように加える。この
混合物を等量の再蒸留したフェノールで抽出し、フェノ
ール層を２００＋ｎＭトリスー塩１（ｐＨ７，ｓ）、１
ｍλＩＥＤＴＡ及び０．１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳを含む２
００μｔの溶液で洗浄する。この洗液と前記で得られる
水相とを混合して、この混合液と等量のエーテルで抽出
後、ＴＮｇでつめたセファデックスｅ−１ｏｏ（ファー
マンア社製、スクエーデン）３　ｍｌ容量のカラム（以
下「セファデックスＧ−１００カラム」と称する）を用
いたクロマトグラフィーに供する。カラムから溶出する
両分は０．１　ｒｕｌずつ、０、１　ｍｌ　７分の速度
で集める。各面分のうち放射能を有する両分を混合して
、これに３Ｍ酢酸ナトリウムを０．３Ｍの濃度になるま
で加える。次に、この混合画分を両分の′ＬＳ倍量のエ
タノール中に入れて、核酸を沈殿させる。この混合画分
を、−７０Ｃで１０分間放置後、遠心分離して上清を除
去する。沈殿した核酸を、ｔｏｏｉｇの蒸留水に溶かし
、これに５ｍＮａＯＨを２０μを加える。得られる混合
物を室温で４０分間放置する。次にこの混合物に、５Ｍ
酢酸す）　ＩＪクム１０μｔ１蒸留水５０μを及びエタ
ノール２５０μｔを加えて、−７０Ｃで１０分間冷却後
、析出する沈殿物を、Ｏｒ：で２０分間ｔｏ、ｏＯｏ　
ｘ　ｇで遠心分離すると５μｇのｃ　ＤＮＡが得られる
。

工程３　（二重鎖ｃＤＮＡの製造） 工程２で得られる一本鎖ｃＤＮＡ５μｇを１００μｔの
水に溶解し、２分間１００Ｃに加熱する。加熱後の混合
溶液に、０．ＩＭ熱変性リす酸カリクム緩衝液（ｐＨ６
，９）、１０　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ７２，１０ｍＭ　ＤＴＴ
Ｘｌ　ｍＭ　ｄＡＴＰ（シュワルツ社ｇ　）　、１　ｍ
Ｍ　ｄＧＴＰ　（ンユワルツ社製）、１ｍＭｄＣＴＰ（
シュワルツ社製）、１ｍＭ３Ｈ−ｄＴＴＰ　にューイン
クランＰニュークレ７　ｕ　ＭＡ、アメリカ合衆国）及
び１５０単位／　ｍｌ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１（ベ
ーリンガー・マンハイムｉｆ、西Ｐイツ）を含む混合物
２５０μｔを加える。得られる混合物を１５ｃで６．５
時間培養後、この混合物に、０．５　Ｍ　ＥＤＴＡと２
０％（ｗ／ｖ）ｓＤＳをそれぞれ１０ｍＭ及び０．１％
（Ｗ／Ｖ’）の濃度になるように加える。得られる混合
物を２５０μｔのフェノールで抽出する（以下しばしば
この操作を「フエノ−ル処理」と称する）。フェノール
相をさらに２０ｍＭトリス−塩酸及び１ｍＭＥＤＴＡを
含むＴＥ緩衝液１３０μｔで抽出する。最初に得られる
水相と２番目に得られる水相を合せて、３ｍｌの容量の
セファデックスＧ−１００カラムを用いて分画する。

得られる画分のうち放射能を示す画分を集めて、得られ
る（見合両分に、酢酸ナトリウムのａ度が０、３　Ｍ　
Ｋなるように３Ｍ酢酸ナトリウムを加える。

次にこの混合画分の２−５倍量のエタノールをこの混合
画分に加え、ＤＮＡを沈殿させる。このようにして得ら
れる混合物を遠心分離して、７μｇのＤＮＡが得られる
。次にこのＤＮＡを、０．２　Ｍ　ＮａＣｔ％　５．０
ｍＭ酢酸ナトリクム（＋）Ｈ４，５）及び１０ｍＭ硫酸
亜鉛を含む緩衝液（以下、この緩衝液をｒｓ＋緩衝液」
と称する）１３０μｔに溶解し、３０分間３７Ｃに保型
する。次にこの混合物に、ｏ、　５　Ｍ　ＥＤＴＡと２
０％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳをそれぞれ濃度が５ｍＭ及び０．
１％になるように加える。得られる混合物を１３０μｔ
のフェノールで抽出し、フェノール相は５０μｔのＴＥ
緩衝液で洗浄する。この洗液と上記のフェノール抽出で
得られる水相を合せて、セファデックスＧ−１００カラ
ムを用いて分画して、Ｏ，ｌｖｏ？ずつの両分を得る。

得られる画分のうち放射能を有する両分を集めて４μｇ
の２重鎖ｃＤＮＡが得られる。

工ａ　４　　（ｄＡＭｐ伸長させたｃＤＮＡ、の製造）
工程３で得られる二重鎖ｃＤＮＡ　１５０　ｍｑを、１
ｍ１ＬｆｄＡＴＰ　Ｘｌ　００　ｍＭカコジル酸ナトリ
ウム（ｐＨ７，２）Ｚ　５　ｍＭ　ＣａＣｔｚ、５０　
ａ　ｇ　／　ｍｌ牛血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」と
略称する）及びＤＮＡ　１μｇ肖り３〜６単位の末端デ
オキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（以下「ＴｄＴ
Ｊと略称する）を含有するｄＡＴＰ溶液８μ乙に入れて
２７ｔＺ”で８分間培養後、−７０Ｃで凍結させる。

工程５（ＢｃｏＲＩで開裂し、ｄ　ＴＭＰ伸長させたｐ
ＢＲ３２２の製造） ２０μｇのプラスミドｐＢＲ３２２と１０単位のＥｃｏ
ＲＩ　（ベセスダ・リサーチ・ラダラドリーズ社製、ア
メリカ合衆国）を、１０ｍＭ　ト’Ｊスー塩酸（ｐＨ７
，５）、６ｒｎＭＭｇＣ４２，５０ｍＭ　ＮａＣ１，６
ｍＭ　２−メルカプトエタノール及び２００μｇ／μｔ
　ＢＳＡを含有する混合物１５０μを中に入れて、３７
Ｃで２時間培養する。この混合物を等量のエーテルで抽
出し、エタノールを加えて沈殿を生成させる。次にこの
沈殿を、０．１ｍＭグリシンナトリクム（ｐＨ９，５）
、５　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ７ｚ及びｓｏａｇ／ａｌＢｓｋを
含む混合液１００μｔに溶解する。得られる混合液に１
７単位のλ−エキンヌクレアーゼを加えて３７Ｃで１時
間培養する。培！後、この混合液をフェノール処理し、
更にエタノールを加えて沈殿を生成させる。

得られる沈殿（開裂したｐＢＲ３２２）を、１００ｍＭ
カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）、１０　ｍ　Ｍ　
Ｎａ　２　ＨＰＯａ、５　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ２．１ｍＭ
　ｄＴＴＰ、　５０μｇ／ｍ１ＢｓＡ及びＤＮＡ１μｇ
当り３〜６単位のＴｄＴを含有する３００μｔの反応混
合物に入れて、３７Ｃで２０分間培養する。

培養終了後、反応混合物をフェノール処理し、更にエタ
ノールを加えてプラスミドを回収する。

工程６　　（ｐＢＲ３２２とｃＤＮＡのアニール化）ｄ
ＡＭＰ伸長されたＤＮＡ生成物３ｎｇとＥｃｏＲＩで開
裂してｄＴＭＰ伸長されたプラスタＦ’　ｐＢＲ３２２
２０ｎｇを、５０μｔのＴＨＥ緩衝液に入れて、それぞ
れ６０［，４５？：”、３７Ｃ及び２０ｒ：で１時間ず
つ培養する。次に、培養混合物に１ｏｏｍＭ）’Ｊスス
−酸（ｐＨ７−５）、１００　ｍ　Ｍ　ＣｃＣ６ｚ及び
１００ｍＭ〜ＩｇＣｔｚを含む混合物２０μｔを加え入
れて２０分間氷冷する。

工程７　（大腸菌Ｘ１７７６の形質転換）大腸菌Ｘ１７
７６株（ＡＴＣＣ第３１２４４号）のコロニーを１００
μｇ　／　ｍ１！ｌのジアミノピメリン酸、１０μｇ／
ｍｅナリジキ／ン酸及びＩＯμｇ／ゴのアンピシリンを
補添したトリプトン培地１００ｍｇに接種する。

得られる培養物中で大腸菌Ｘ１７７６株を３７Ｕで培養
し、６５０ｎｍにおける光学層Ｉｆ　（ＯＤ）が０．６
になるまで生育させて３０分間氷冷する。次に培養物を
４００Ｏｒｐｍで１０分間遠心して細胞を沈殿させる。

得られる細胞を５０ｒｎｌの１０　ｍ　Ｍ　ＮａＣｔで
洗浄し、遠心分離する。分離細胞を２０ｍ１の１００ｒ
ｎＭ１００ｒｎに懸濁し、３０分間氷冷する。次に細胞
を遠心分離により粒状にしだ後４　ｍｌ！の１００ｍＭ
　ＣａＣ１ｚに再懸濁して一夜放置する。

以下の実験は、日本の組み換えＤＮＡガイドラインに従
って旭化成工業株式会社の組み換えＤＮＡ安全委員会の
承認の下に旭化成工業株式会社のＰ−３レベルの封じ込
め施設内で行なわれる。

実施例３工程６で得られるアニールしたｐＢＲ３２２（
組み換えＤＮ人分子）をＣａ４″で処理した大腸菌Ｘ１
７７６株を含む１００μｔの上記懸濁液に加え入れて２
０分間水冷後、２０Ｃで１０分間保温する。

次にこの混合物に０．６　ｍｉのトリプトン培地を加え
る。得られる混合物を、１００μｇ　／　ｒｎｌのジア
ミノピメリン酸、１０ｐｇ　／　ｍｌのナジリキシン酸
及び１０ｐｇ　／　ｒｎｌのアンピシリンを補添したト
リプトン培地寒天板て接種する。

次に３７Ｃで４８時間培養後、生じる各コロニーを採取
し、ミクロ測定板の各穴に入れた１００μｔのトリプト
ン培地にそれぞれ懸濁する。このミクロ測定板を３７′
Ｃで一夜培養後、４０％（Ｗ／Ｖ）のグリセリン水溶液
を１００μｔを各穴に加え、このミクロ測定板を一２０
Ｃに保存する。このようにして５０万個の個々の大腸菌
Ｘ１７７６株の形質転換体のクローンを得る。

工程８　　（ｍＲＮＡプローブの製造）実施例３工程１
に記載の方法と同じ方法で、ＳＥＡで誘導したｍ　ＲＮ
　Ａの標品２００μｇを得る。又、ＳＢＡで誘導させる
操作を行わない以外は実施例３工程１と同じ方法で、Ｓ
ＥＡで誘導していないｍＲＮ　Ａの標品２００μｇを得
る。１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ＬｍＭ
（Ｉ−３２Ｐ″ｌ　ＡＴ　Ｐ　、　４０　ｍＭ　トリス
−塩酸（ｐＨ７，５）、３０　ｍ　Ｍ　ＮａＣｔ及び５
ｍＭ　ｉ’ｖ１ｇｃｔ　２を含む溶液１００μｔを１０
ｐｇのＳＢＡで誘導したｍＲＮＡに加えて、３７ｔ？で
１０分間培養する。上記培養物中のキナーゼをフェノー
ル処理てより失活させた後、得られる混合物にＳＥＡで
誘導していないｍＲＮＡ　２００μｇを加える。この混
合物に３　Ｍ酢酸ナトリウムヲ０．３　Ｍの濃度になる
ように加える。

得られる混合物に、この混合物の２−５倍量のエタノー
ルを加えて、５ＦＸＡで誘導した３２ｐ−ラベルｍＲＮ
ＡとＳＥＡで誘導しないｍＲＮＡからなる２００μｇの
沈殿が得られる。得られる沈殿を遠心分離後、−２０Ｃ
で保存する。

工程９’　　（ｅＤＮＡの還別） 実施例３工程７で得られる大腸菌Ｘ１７７６株の形質転
換体を１０ｐｇ／ｍｅのアンピリジンを含むトリプトン
培地寒天平板に接種して３７ｃで一夜培養し、コロニー
を形成させる。次に、ミリポアフィルタ−ＨＡＷＰ　（
ファーマシア社製、スウェーデン）から直径８２朋の円
形フィルターを切り取り、これを１０分開オートクレー
ブ滅菌する。滅菌フィルターを１０ｐｇ　／　ｍｌのア
ンピノリンを含む別のトリプトン培地寒天平板の上に置
く。このフィルターの上に前記で得られた各コロニーを
接種して３７７ｍ’で一夜培養し、フィルター上にコロ
ニーを形成させる。このフィルターを（１５Ｎ　ＮａＯ
Ｈ水溶液に１ｏ分間浸し、その後、０．５　Ｍ　）　Ｉ
Ｊスス−酸（ｐＨ７，５）に５分間浸す。次に、前記フ
ィルターを１．５　Ｍ　ＮａＣ１とＯ，ＳＭ）リス−塩
酸（ｐＨ７，ｓ）を含む混合物に５分間浸す。このフィ
ルターを、さらに０．３　Ｍ　ＮａＣＡと０．０３Ｍク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７）を含む溶液（以下、この溶
液を「２×ＳＳＣ溶液」と称する。ここで、ＳＳＣは０
．１５　Ｍ　ＮａＣｊ及びＯ，０１５Ｍクエン酸ナトリ
ウムを含むｐＨ７の溶液を示す）に５分間浸し、その後
７０Ｃで３時間加熱する。

フィルター１枚当り、５０％（Ｖ／Ｖ　）ホルムアミｌ
’、　４　Ｘ　ＳＳＣ（０，６Ｍ　ＮａＣｊ、及び０．
０６　Ｍ　り’−７峻すｌ−ＩＪクムを含有するｐＨ７
の溶液）及び５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）を含
む溶液１　ｍｌをシャーレに注ぎ入れ、この溶液に実施
例３工程８で得られるｍＲＮＡ混合物（ＳＥＡで誘導し
た３２ｐ−ラベルｍＲＮＡ１０μｇとＳＢＡで誘導して
いないｍＲＮＡ　２００μｇを含む）を溶解させる。前
記のフィルターをこの溶液に浸して４０Ｃで２４時間保
温する。次にフィル、２−をクロロホルムで１５分間ず
つ室温で３回洗浄し、さらに０．６　Ｍ　ＮａＣ１及び
０．０６Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＩ−（７）を含む溶
ｉ（以下、この溶液を「４×ＳＳＣ溶液」と称する）で
１５分間室温で洗浄する。続いて、２×ＳＳＣ溶液で１
５分間ずつ室温で３回洗浄する。つぎに２０　ｍｑ　／
　ＷＬｔ　ＩＪＮヌクレアーゼを含有する２　ｒＩＬｔ
の２ＸＳＳＣ溶液をシャーレに入れ、これに上記の洗浄
したフィルターを入れて室温で３０分間放置後、フィル
ターを２×ＳＳＣ溶液で２回洗浄し、風乾する。このフ
ィルターをオートラジオグラフィーに供する。このよう
にして、５０万個のコロニーのうち７個のコロニーが前
記のｍＲＮ人とハイブリダイズすることが判る。

工程１０（組み換えプラスミドの製造）実施例３工程９
で得られるコロニーの一つを２６の三角フラスコに入れ
た１ｔのトリプトン培地に接種して、培養液の光学濃度
（ＯＤ　）が６５０ｎｍでｏ、　Ｂになるまで３７Ｃで
振とう培養する。次にこの培養液に１ｔのトリプトン培
地を加え、その後クロラムフェニコールを１７０μｇ　
／　ｍｌの濃度ニなるように加えて、３７Ｃで１６時間
培養する。

コノフラスコに２０−のクロロホルムを加え、３７Ｃで
１０分間振とうすることにより培養物を滅菌する。培養
物をクロロホルムから分離後、６０００ｒｐｍ　４　Ｃ
で１５分間遠心して、２ｇの細胞を得る。

細胞は３０ｍ１の２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）
に懸濁する。この懸濁液を５０００　ｒｐｍ　４　ｔ：
’で２０分間遠心し、得られる細胞を３０ｍ１！０５０
ｍＭ）’Ｊスス−酸（１）Ｈ７，５）に再び懸濁する。

この懸濁液に、５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，ｓ）に
１ｏｍｔｐ／ｒｎｌのリゾチームを含むリゾチーム溶液
を、上記の懸濁液のＸ容量加える。得られる混合物をＯ
Ｃで１０分間冷却後、この混合物にこの混合物のＸ容量
の０、３　Ｍ　ＥＤＴＡを静かに攪拌せずに加える。得
られる混合物をＯｃで１０分間放置後、この混合物のＸ
容量の２％（Ｗ／Ｖ）　ト’）　ドアＸ−１００（界面
活性剤、和光紬薬！りを加える。６０分後、この混合物
を１００００　ｒｐｍ　Ｏｃで６０分間遠心する。得ら
れる上清をビーカーに移し、このビーカーに３ＭＮａＯ
Ｈを攪拌しながら加えて、ｐＨを１．Ｌ５に調節する。

この溶液を２０Ｃで１０分間攪拌した後、ｐＨを８．５
に調節する。さらに３分間攪拌後、この溶液のＸ容量の
５　Ｍ　ＮａＣ１及び等容量のフェノールをこの溶液に
加えて５分間激しく攪拌し、１１００００ｒｐ、ＯＣで
１０分間遠心して相分離させる。環状二重鎖ＤＮＡを含
む上清を注意深く一本鎖ＤＮＡを含む培地相から分離す
る。得られだ上清をクロロホルムで３回抽出する。環状
二重鎖ＤＮＡを含む抽出物に、５ｍ９／１１の膵臓リボ
ヌクレアーゼ人を２０ｒｇ　／　ｍｌの濃度になるよう
に加える。得られる混合物を３７ｒで６０分間培養する
。この混合物に、この混合物のＸ容量の５　Ｍ　ＮａＣ
１を加え、その後滅菌した３０％（Ｗ／”、’）、ｔ？
リエチレングリコール６０００　（ユニオンカーパイＰ
社製、アメリカ合衆国）水溶液を７．５％（Ｗ／Ｖ）の
濃度になるように加える。得られる混合物を−ｔＯＣで
１４時間保ち、その後混合物を８０００　ｒｐｍ　、　
Ｏ’Ｃで２０分間遠心して沈殿を集める。この沈殿を０
．０７５　Ｍ　ＮａＣ７及ヒ０．００７５　Ｍクエン酸
ナトリウムを含む溶液に光学濃度（ＯＤ）が６５０ｎｍ
で２０になるように溶解する。次にこのｃ液に２０％（
Ｗ／■）ＳＤＳを０．５％（Ｗ／Ｖ）の濃度になるよう
に加える。さらにこの溶液にプロナーゼを０，５■／ｍ
ｇの濃度になるように加えて、３７ｒで３０分間培養す
る。次忙この溶液を、この溶液と等量のフェノールで３
回抽出し、等量のクロロホルムで２回抽出して、ベック
マン５Ｗ−２７型ローターを用いて２００００　ｒｐｍ
　、　Ｌ　５Ｃで１５時間、ショ糖密度勾配遠心に供す
る。この密度勾配遠心には５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ
７，５）及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む５〜２３％（Ｗ
／Ｖ）のブヨ糖勾配を有する溶液を用いる。その結果得
られる各両分の２６０ｎｍにおける光学ａ妾を測定する
。

ＤＮＡを含む画分を集めて、前記と同様の方法で酢酸ナ
トリウムとエタノールを用いてＤＮＡを沈殿させる。遠
心分離により、５０ｒｇの了髪形二重９Ｑ　ＤＮＡを得
る。

工程１１（プラスミドの開裂） 実施例３工種１０で得られるｊ菰形二重鎖ＤＮ人２０　
μｇを、１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ　Ｈ７，５）、６ｍ
ＭＭｇＣｔＺ、５０ｍＭ　ＮａＣｊ　、　　６ｍＭ　２
−メルカプトエタノール、２００　μｇ　／　ａｔ　Ｂ
ＳＡ及び２０単位の制限＃素Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒｆを含む混
合物１５０μを中に入れ、３７ｃで２時間培養する。次
に、この混合物にプロナーゼ、ＥＤＴＡ及びＳＤＳをそ
れぞれの濃度が０．５　ｍｑ　／　Ｒｅ　％１０’ｍＭ
及びＯ−Ｓ％（Ｗ／Ｖ）になるように加える。

得られる混合物を３７Ｃで３０分間保温後、３０μｔの
フェノール−クロロホルム（１：１容ｉｔ比）の混合溶
媒で抽出する。得られる非水相を２０ｍＭトリス−塩酸
（ｐＨ７，５）及びＬ　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む溶液５０
μｔで洗浄する。洗液及び水相を合せて、エーテルで３
回抽出する。合せた水溶液にＸ容量の３Ｍ酢酸すｌ−Ｉ
Ｊクムと２．５倍容量のエタノールを加えて再び沈殿を
生成させる。次に、この混合物を一７０Ｃで５分間冷却
後、遠心分離して９μｇのＤＮＡを得る。

工程１２（制限酵素ｐｓ　ｒｌによる分解）実施例３工
程１１で得られるＢｅｏＲＪで開裂した５μｇのプラス
ミドを２０μｇの喋形二重鎖ＤＮＡの代わりに用い、ま
た制限酵素ＰｓｔＩを制限酵素ｇｃｏＲＩの代わりに用
いる以外は実施例３工程１１と同様の操作を行なって、
ｐｓ＋１で分解したＤＮＡ断片の混合物を得る。この混
合物を、５０　ｍＭ　）　’）スー酢酸緩衝液（ｐＨ７
，８）中２％（Ｗ／Ｗ）水平アガロースゲル（１０×２
０×０．７ｃ！ｒ１）を用いて電気泳動にかけ分離し、
ＰｓｃＩで分解したＤＮＡ約０．２μｇが得られる。

工程１３（制限酵素ＢＳｔＮＩによる部分分解）工程１
２で得られるｐｓ　＋Ｉ分解ＤＮＡ　Ｏ１２μｇを、１
０ｍＭ　）リス−塩酸（ｐＨ７−５）、６　ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．５０ｍＭＮａＣＡ、　　６ｍＭ　２−メルカプ
トエタノール、２００μｇ／μｔ　ＢＳＡ及び２単位の
制限酵素Ｂｓ＋ＮＩを含む混合溶液１５０μを中に入れ
て３７Ｃで５分間培養して、ＤＮＡを部分分解する。次
に、部分分解したＤＮＡを実施例３工程１１と同様の操
作でフェノール−クロロホルム処理、エタノール処理及
び電気泳動処理することに二Ｆ）　ＢｓｔＮＩ　　部分
分解ＤＮＡ断片１０　ｎｇが得られる。次に、実施例２
工程１〜５と同じ方法により調製した以下に示す式を有
するオリゴデオキ７ヌクンオチド： ＡＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＡＴＣ ＧＴＣＣ！ＴＡＧＧＣＴＣＣＣＴＣ ＧＧＣＴＧＴＴＡＴＴＧＴＯ ＴＧＡＣＡＡＴＡ ＡＣＡＧＣＣＧＡＧＧＧＡＧＯＯ ’ｒＡＧＧＡＣＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧ （但し、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＴは前記定義の通りで、各式の
左端と右端はそれぞれ５′−水酸基側と３′−水酸基側
を表す） 及び上記の部分分解ＤＮＡ断片を実施例２工程６と同じ
方法でＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼを用いて互いにアニールし
て結合する。

工程１４（大腸菌における被プチドの発現）デビット・
ブイ・ゲーデルらがネーチャー、第２８７巻第４１１−
４１６頁１９８０年（ｐａｖｉｄ　Ｖ、　Ｑｏｅｄｄｅ
ｌｅＬ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、　”１０ｆ、　２８７、
ｐｐ、４１１〜［６（１９８０））に記載の方法に従い
前記で得られたＤＮＡをｐＢ几３２２のＥｃｏＲｌとｐ
ｓ　ｔＩで開裂した部分に挿入し、大腸菌のトリプトフ
ァンのプロモーター、大腸菌のトリプトファンのオ被レ
ータ−及びりｙｉ？ソーム結合部位を有する３００塩基
対からなるＢｃｏＲＩ切断断片を作り、この断片を上記
の目的のＤＮＡを有するｐＢＲ３２２に結合させる。こ
のようにして得られるプラスミドを大腸菌Ｘ１７７６櫟
と接触させて、大腸菌Ｘ１７７６株を形質転換する。こ
の形質転換株を培養して得られる培養物から、ベプチ）
’ＨＣ（０）と特異的に結合するモノクローナル抗体を
用いてペプチドを分離する。上記のモノクローナル抗体
はデビット・エスーセッハーらがネーチャー、第２８５
巻第４４６頁１９８０年ＣＤａｖｉｄ　Ｓ、　５ｅｃｈ
ｅｒ　ｅｔ　ａｔ、Ｎａ　ｔｕｐｅ、　Ｖｏ　１．２８
５　ｐ、　４４６　（１９８０）　］に記載の方法に従
って、実施例１で得られるペプチドＨｃ（ｏ）を抗原と
して用いることにより得られる。得られる被プテドをア
ミノ酸配列分析に供した結果、このにプチドのアミノ酸
配列はベプチ）’ＭＯ（０）のアミノ酸配列と一致する
。

実施例４ インターフェロン研究国際会議筒２回年金においてディ
ー・ブイ・ゲーデル（Ｄ、　Ｖ、　Ｇｏｅｄｄｅ　ｌ　
）　　が発表した方法と同じ方法で以下の実験を行なう
。

ＳＶ４０複製起複製全始点囲む）（ｉｎｄｌ−Ｐｖｕ［
［切断断片（アール・エム・マイヤーズ等、プロシーデ
ィング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・アメリ
カ、第７７巻第６４９１頁１９８０年ＣＲ−Ｍ、　Ｍｙ
　ｅ　ｒ　ｓｅ＋　ａ　Ｉ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　
１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、υ、　Ｓ、　Ａ、、　７
７　、６４９１（１９８０））を参照）をＥｃｏＲＩ制
限断片に改造する。

即ち、）（ｉｎｄ［ＩＩ切断端は合成したオリゴヌクレ
オチドを結合することによってＥＣ０ＲＩ切断端にし、
ｐｖｕ■切断端はＤＮＡポリメラーゼＩ〔クレナク断片
（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　））を用いて空い
ているヌクレオチドの部分を埋めてから連結によりＥｃ
ｏＲＩ切断端にする。得られるＳＶ４０起始点全始点る
ＢｃｏＲＩ断片をプラスミドｐＭＬ　−１（ｐＢＲ，３
２２と５ｖ４０）組換えプランスミノドで、アンピシリ
ン耐性マーカーとＥ、Ｃｏ１１ノ複製起始点を有し、ｐ
ｓａ　３２２とＳ　Ｖ　４０の組換え体の複製を阻止す
る配列を有しないもの）（エム・ラフシーら、ネーチャ
ー、第２９３巻第７９頁１９８１年（：Ｍ、　Ｌｕｋｓ
ｙ　ｅｔ　ａｔ　、　Ｎａｔｕｒｅ、　２９３．７９（
１９８１））を参照）のＥｃｏＲＩ切断部位に結合する
。得られる発現遺伝子の中から、ｐＭＬ−１のアンピシ
リン耐性遺伝子から読み始めるようにＳＶ４０後期プロ
モーターが配列されているものを選別する。次に選別し
た断片のアンピシリン耐性遺伝子に最も近いＥｃｏＲＩ
制限部位をＥｃｏＲＪで部分分解し、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ〔フレナラ断片（ｋｌｅｎｏｘｖ　ｆｒａｇｍｅｎ
ｔ）　］埋めて結合させる（ケイ・イタクラら、サイエ
ンス、第１９８巻第１０５６頁１９７７年（Ｋ、　Ｉｔ
ａｋｕｒａ　ｅｔａｌ　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９８
．１０５６（１９７７）　）を参照）。実施例２で得ら
れるプラスミ、０のＰｓ＋　Ｉ切断片にオリゴマーを付
加することにより、ＥｃｏＲＩ制限断片をつくる。この
ＣＤＮＨを含有するＥｃｏＲｒ制限断片を前記で得られ
る発現媒体ｐＭＬ−８Ｖ’４０のＥｃｏＲＩ切断部位に
結合させる。その結果得られるベクター全形質転換した
サルの細胞系Ｃ０８−７（ワイ・グルラマン、セル、第
２３巻第１７５頁１９８１年（Ｙ、　Ｑｌ　ｕ　ｚｍａ
　ｎＱｅ　Ｉ　ｌ　、　２３　、１７５　（１９８１）
）を参照）に感染させる。

００８−７は内生的に５Ｖ−４０５−，７”ｌ’抗原ヲ
発現し、ｐＭＬｌ及び５Ｖ−４０起始点配列を含む組み
換えプラスミドの増殖を容認することを示している。こ
のＣＯ３−７の細胞培養液の中に、実施例２で記載した
ようにインターフェロンが存在するかどうかを日々分析
する。感染後、３〜４日後に１００単位／　ｍｌの収率
のインターフェロンが得うれ、このことはインターフェ
ロンがＣＯ３−７部胞によって培養液中に排泄されると
いうことを示している。

実施例５ アール・エイ・ヒッツェマンらがネーチャー、第２９３
巻第７１７頁１９８１年（Ｒ，Ａ、Ｈｉｔｚｅｍａｎ　
ｅｔａｌ。

Ｎａ　ｔｕｒｅ　２９３　、７１７　（１９８１）　）
に記載の方法に従って以下の実験を行う。ｒｏａｇのＸ
ｈｏＩ開裂ｐＡｃＦ３０Ｌを、２０ＩｌｎＭ）リス−塩
酸（ｐＨ８，ｔ）、１２　ｒｎＭ　ＣａＣ１ｚ、１２　
ｍＭ　ＭｇＣ７２，０，２Ｍ　Ｎａｐｔ、　　１　ｍＭ
　ＥＤＴＡ及び０．１部ｇ／μｔ　Ｂ５Ａ１含む水溶液
中で、０．２単位のＢａ１３１ヌクレアーゼ（ベセスダ
リサーチラゼラトリー製）と共に３０Ｃで１５秒間培養
する。その間に、約５０塩基対のＤＮＡが除去される。

得られるＤＮＡの１部（１部ｇ）をＤＮＡポリメラーゼ
ｒ〔フレナラ断片（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　
）　］とデオキシリゼヌクレオシド三燐酸とともに培養
し、ＤＮＡの両端をデオキシリゼヌクレオチドで満たし
、その後Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ及び合成したＥｃｏＲＩ
　リンカ−（１ｉｎｋｅｒ　）（コラボラディプ・り丈
−チ製、アメリカ合衆国）とともに１４ｃで１２時間培
養する。次に、上記で得られるＤＮＡを制限酵素ｇｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩで切断し、得られるＤＮＡ断片から、
様々に削り取られたＡＤＨ１プロモーメーの塩基配列を
含むＤＮＡ断片の混合物を、１重量％アガロースゲル−
水の調製用電気泳動により分離する。電気泳動の溶出断
片の混合物をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＥ（
Ｉで切断した大きい断片に結合し、個々のクローンで大
１１％　菌ａ　ＲＲＩを形質転換して、この形質転換体
のアンピシリン耐性コロニーを選んで個々のクローンを
選択する。

得られる個々のコロニーからＤＮＡを、クィックースク
リーニング法（エイチ・シー・〕〕ζ−ンゼイら、ニュ
ークレイツク・アシソズ・リサーチ、第７巻、第１５１
３頁１９７９年（Ｈ，０，３ｉｒｎｂｏｉｍ　ｅｔ　ａ
ｔ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、工、　１５１
３　（１９７９）”ｌを参照）により調製する。各削除
部分の長さは、上記で得られる各プラスミドを制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断し、切断して得られるＤＮＡ断片の３
７−末端をＤＮＡポリメラーゼ〔フレナラ断片（ｋｌｅ
ｎｏｗ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　）］と〔α−３２Ｐ　
］　ａＡＴＰ　（！：を用いてラベルし、その後このラ
ベルしたＤＮＡを制限酵素ＡｌｕＩで切断して、得られ
るＤＮＡ断片を尿素−アクリルアミＰゲルを用いて測定
す−る。シラスミドｐＦＲＬ４を、プラスミドＹＲＩ）
７　（プラスミｌ’ＹＲｐ７はケイ−ストールらがプロ
シーディング−ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエ
ンス・アメリカ、第７６巻第１０３５頁第１９７９年（
Ｋ、　５ｔｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　７６　、１０３５　（１９７９
）’）に記載の方法に従ってｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ
部位に＃母遺伝子ＴＲＰＩを含む１．４ｋｂのＥ、Ｃｏ
１１断片を挿入してつくられる。）から次の方法で製造
する（ノー・ンアン・ξ−ら、ジーン、第１０巻第１５
７頁１９８０年（Ｑ、　Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ　ｅｔａｌ
、　Ｇｅｎｅ、　１０．１５７（１９８０）〕を参照）
。プラスミドＹＲｐ７の２つのＥｃｏＲＩ切断部位をＥ
Ｃ０ＲＩで切断し、生じた粘着性の末端をＤＮＡポリメ
ラーゼエ〔フレナラ断片（ｋｌｅｎｏｗ　（Ｉａｍｅｎ
ｔ　）　’）で補充し、生じた純い端同志を連結（ｌｉ
ｇａＬｉｏｎ　）することにより、この２つのＥ　Ｃｏ
　ＲＸ切断部位を削除する。次に、プラスミｌ−″ＹＲ
ｐ７のＩ（ｉｎｄ［Ｉｌ小断片をき換えて、２つのＥ　
Ｃｏ　ＲＩ部位の欠除するプラスミｒのＨｉｎｄ［［［
小断片に置き換える事により１つのＥｃｏＲＩ切断部位
が置き換わり、プラスミドＰＦＲＬ４になる。２０μｇ
のプラスミ）’ｐＦＲＬ４をＢａｒｎＨＩ及びＥｃｏＲ
Ｉで分解し、１重量％アガロースゲル−水を用いて電気
泳動する。その結果得られる大きい断片（５ｏｏｏ塩基
対）をゲルから切り出し、電気溶出し、フェノール−ク
ロロホルムで２回抽出し、エタノールを加えて沈殿させ
る。次に、得られる断片３μｇを別々に、前記で得られ
るＡＤＥ（プロモーターを有するＤＣ’ｌ諸断片と、２
０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、ＩＱ　ｍＭ　ｙｑ
ｃｇ２、ＩＱ　ｔｎＭジチオスレイトール、（１，５ｍ
ＭΔＴｌ）及び０．５単位のＴ　／Ｉ　ＤＮＡ　ｌ）ガ
ーゼを含有する混合物５０／ｌｌ中１５℃で１２時間反
応させることにより結合する。アンピノリン耐性のこの
結合混合物で大腸菌Ｋ　−１２株２９４　（ＡＴｃｃ３
１３５７　）を形質転換し、形質転換した混合物からプ
ラスミｒを留摸する。実施例２で得られるプラスミド５
０μｇをＥｃｏＲｒで分解し１分解断片を１．２重量係
アガロースゲルー水で電気泳動する。ペプチドの遺伝暗
号をもつＤＮＡ断片をゲルから切シ取り、電気浴出し、
フェノール−クロロホルムで２回抽出し、エタノールを
加えて沈殿させる。波プチドの遺伝暗号をもつＤＮＡ断
片を、ＫｃｏＲｒで予じめ切断して細菌アルカリ性ホス
ファターゼで処理したプラスミドｐ　ＦＲＰの唯一のＥ
ｃｏＲｒ部位に結合する。得られるプラスミドをＢｇｌ
　ＩＩ　ｊｔｒ１１限分析によシ分析し、酵母の形質転
換に用する。ベプチＦの遺伝暗号をもつＤＮＡが、Ｔ）
（Ｐ　ｒ遺伝子のための各ＡＤＨプロモーター断片の間
に同方向か反対方向に配置された組み換えプラスミドを
標準的な形質転換法（ニー・ヒネン等、プロソーディン
グ・す／ヨナル・アカデミ−、サイエンス、アメリカ、
第７５巻第１９２９頁１９７８　年（Ａ、　Ｈｉｎｎｅ
ｎ　ｓｔ　ａｌ　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ：Ｌ、　Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ−Ａ。

皿、　１９２９　（＋９７８　）〕を参照）を用いて酵
母に導入する。酵母の受容法ＲＨ２１８（ｔｕｐｌ　）
　（ＡＴＣＣ！４４０７６　）　Ｃサツカロミセス・セ
レビシアエ（Ｓａｃ−ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ　）のトリプトファン要求変異株、ジーミ
オザリら、ジャーナル／ζクテリオノー（Ｊ、　Ｂａｃ
ｔ、　　）第１３４巻第４８頁１９７８年〕のスフエロ
プラスｌ−（エイチ・ディー・アレ等、アストロフィン
カル・ジャーナル、第８６巻第３２５頁１９８１年　（
Ｈ，Ｄ、Ａ１１ｅ　　ａｔ　　ａユ、Ａｓｔｒｏｐｈｙ
、Ｊ、、８６　、　３２５　（１９８１）、１を参照）
を別々に上記のプラスミドＤＮＡと培養し、培碧混合物
をトリプトファンが含まれていない寒天培地に置いて、
形質転換コロニーを選択する。

各コロニーの培養菌を選択的な圧力下、トリプトファン
を含有しない液本培地中で増殖させ、中間対数期に集め
て培養菌の細胞壁を分解し、グアニジン塩酸で溶菌して
細胞抽出物を調製する。ペプチドの遺伝暗号をもつＤＮ
Ａが正しい方向に接続されでいるプラスミドが組み入れ
られているすべての形質転換体においてかなり高い生物
活性がみられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得たＨＣ（ｏ）のペプチドの紫外部
吸収スペクトル、第２図はそのＳＤＳデル電気泳動を示
す。マーカーとしてはオバルブミン（分子量・１３ｋ）
、カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋ）、大豆トリプ
シンインヒビター（２０，１ｋ）とα−ラクトアルブミ
ン（１４，４ｋ）を用いた。 特許出願人　旭化成工業株式会社 波長（ｍ、Ｌｌ） 第２図 精製 ＨＣ（０） マーカー　へプチト オハルブミン　、４３に・

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ）ＢＣｙｓＸ＿１ＣｙｓＸ＿２Ｃｙ
   ｓＸ＿３−（ I ）〔但し、式中Ｂは水素原子又はメチ
   オニル基、Ｃｙｓはシステイン残基、Ｘ＿１はイソロイ
   シルバリルロイシルグリシルセリルロイシルグリシン残
   基から多くとも２個のアミノ酸残基の削除又は付加によ
   る該残基誘導体、Ｘ＿２がチロシン残基そしてＸ＿３が
   次式（II） 【アミノ酸配列があります】 （但し、式中Ｇｌｎはグルタミン残基、Ａｓｐはアルパ
   ラギン酸残基、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｔｙｒはチロシ
   ン残基、Ｖａｌはバリン残基、Ｌｙｓはリジン残基、Ｇ
   ｌｕはグルタミン酸残基、Ａｌａはアラニン残基、Ａｓ
   ｎはアスパラギン残基、Ｌｅｕはロイシン残基、Ｐｈｅ
   はフェニルアラニン残基、Ｇｌｙはグリシン残基、Ｈｉ
   ｓはヒスチジン残基、Ｓｅｒはセリン残基、Ｔｈｒはス
   レオニン残基、Ｉｌｅはイソロイシン残基、Ｔｒｐはト
   リプトファン残基、Ａｒｇはアルギニン残基、Ｍｅｔは
   メチオニン残基を表す） で表される残基から多くとも５個のアミノ酸残基の削除
   又は付加による該残基誘導体を表わす〕で表わされる新
   規な生理活性ペプチド